LABORATORIO DE INMUNOLOGIA CLÍNICAManejo de animales e inmunizaciones

Profesores: QFB María de las Mercedes Zamudio Duran QFB Francisco Javier Parada García Mtra. Yolanda Flores Cabrera Dr. Osvaldo Daniel Castelán Martínez

Integrantes del equipo: Grupo: 1802Villa Reyes Odra Berenisse Equipo: 3Valle Medina Antonio

Herrera López Ema Elvira

Torres Jiménez Ramón

Universidad Nacional Autónoma de MéxicoFacultad de Estudios Superiores Zaragoza

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ÍndiceIntroducción......................................................................................................................................3

Bioética..............................................................................................................................................4

Bioterio.............................................................................................................................................. 4

BIOTERIO DE PRODUCCIÓN...........................................................................................4

BIOTERIO DE EXPERIMENTACIÓN.................................................................................5

Animales singenicos........................................................................................................................5

Antígeno:........................................................................................................................................... 6Hapteno..............................................................................................................................................6

Inmunógeno.......................................................................................................................................6

Determinante antigénico..................................................................................................................6

VÍAS DE INMUNIZACIÓN..................................................................................................................6

Volúmenes de seguridad..................................................................................................................8

ANIMALES MÁS UTILIZADOS..........................................................................................................9

NECESIDADES DE ANESTESIA.....................................................................................................10

TIPOS DE INMUNÓGENOS Y VIAS DE INMUNIZACIÓN...............................................................10

Sangrado de animal........................................................................................................................14

ADYUVANTE....................................................................................................................................16

TIPOS DE ADYUVANTES................................................................................................................17

INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA............................................................................................18

INMUNIDAD INNATA..........................................................................................................20

LIMITE EXTERIOR DEL ORGANISMO...........................................................................20

1.1.1.2. FAGOCITOS: MACRÓFAGOS Y NEUTRÓFILOS.............................................20

1.1.1.3. NATURAL KILLER (NK).....................................................................................21

1.1.1.4. PROTEÍNAS DE FASE ÁGUDA.........................................................................21

1.1.1.5. TOLL-LIKE RECEPTORES (TLRS): RECEPTORES SOBRE CÉLULAS INFLAMATORIAS............................................................................................................21

INFLAMACIÓN.................................................................................................................23

INMUNIDAD ADAPTATIVA O ESPECÍFICA.........................................................................26

1.2.1. TIPOS DE INMUNIDAD ESPECÍFICA......................................................................27

1.2.4. DETERMINANTE ANTIGÉNICO O EPITOPE...........................................................27

1.2.6. MOLÉCULAS QUE PARTICIPAN EN EL RECONOCIMIENTO DEL ANTÍGENO.. .28

1.2.7. SELECCIÓN CLONAL..............................................................................................28

1.3. CAVIDADES Y MEDIO EXTERNO..................................................................................29

1.4. FASES DE LA RESPUESTA INMUNITARIA..................................................................30

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Introducción.

En el presente trabajo se hablara de la importancia de los animales como reactivos biológicos en la

investigación biomédica se consolidó la ciencia del animal de experimentación. Está persigue la

obtención de animales biológicamente estandarizados mediante la selección colectiva de

características anatómicas, fisiológicas, ecológicas y sanitarias. Además de esto, se requiere de un

buen manejo del animal acoplando al pie de la letra lo que es la ley y la humanidad sobre ellos y un

manejo correcto para tener resultados confiables. En el área de inmunología son usados para la

prueba de nuevas vacunas y el desarrollo de enfermedades, en el caso de las vacunas es óptimo

lograr una buena inoculación y una buena toma de la muestra para así lograr un resultado

confiable, pero esto no se puede lograr sin un manejo óptimo de los animales. La búsqueda de

nuevas sustancias con actividad adyuvante/inmunopotenciadora constituye una de las tendencias

más importantes en la investigación inmunológica actual.

En la docencia e investigación del tipo biológica y biomédica; en el desarrollo, producción y control

de medicamentos alimentos y otros insumos importantes para la salud humana; requieren la

utilización de animales de laboratorio, los cuales se han usado desde siglos atrás cuando se

realizaron los primeros estudios anatómicos comparativos, hasta en la actualidad con su utilización

como “reactivo biológico”. El hombre tiene necesidad de utilizar el animal en la búsqueda del

conocimiento igual que para alimentarse, vestirse y trabajar, de ahí, el deber de respetar a estos

seres vivos. Por estas razones y aunado al elevado costo económico de su reproducción,

mantenimiento y uso, los estudios con animales de laboratorio son un factor importante de que

contribuyan al avance del conocimiento que resultará eventualmente en mejorar la salud del

hombre, de los animales y de las plantas.

En países que han desarrollados la tecnología de los animales de laboratorio han adquirido un alto

grado de sofisticación y con ello los científicos, pueden disponer de múltiples modelos de origen

genético, de calidad sanitaria; lo cual garantiza la validez y la eficiencia de las pruebas y la

producción biológica.

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Bioética El término fue acuñado por Fritz Jahr en 1927, quien lo definió como la ética de las

relaciones de los seres humanos con los animales y la naturaleza. Para la Comisión Nacional de Bioética se trata de una extensión de la ética reflexiona,

delibera y hace planteamientos normativos de políticas públicas, para regular y resolver conflictos en la vida social.

Los investigadores que trabajen y experimenten con animales estánmoralmente obligados a manifestarles tres tipos de actitudes: respeto, afecto y gratitud.

Respeto: por tratarse de seres vivos y sensibles, que están experimentando sufrimiento y podrían terminar perdiendo la vida, tratárseles con todas las consideraciones que el caso merece.

Afecto: considerándolos partícipes con nosotros. Gratitud: reconocimiento por la importante ayuda al constituirse nuestros más íntimos

colaboradores. Seguir el principio de las tres R de la experimentación humanizada para con los animales,

propuesta por William Russell (zoólogo y psicólogo) y Rex Burch (microbiólogo) en 1959: Reducir, al máximo el número de ellos y, por ende, el total de animales utilizados en

investigación. Reemplazar, siempre que sea posible el animal de experimentación por otro modelo

experimental, cuando no resulte imprescindible el uso de animales. Refiar, los métodos y técnicas utilizados de modo que produzcan al animal el menor

sufrimiento.

BioterioLa palabra bioterio viene del griego “bios” que significa vida y “teiron” que significa conservar por tan el bioterio se define como: El lugar destinado a la cría y control de los animales de laboratorio empleados como reactivos biológicos en protocolos experimentales. El diseño de unas buenas instalaciones no solo se justifica desde el punto de vista experimental sino además desde el punto de vista moral ya que son seres vivos y por tanto merecen respeto. Debido a que las condiciones de infraestructura, desarrollo y consolidación del bioterio son variables, es necesario expresar las normas mínimas que se deben tener en cuenta para el diseño, para brindar bienestar y seguridad al personal y animales que allí habitan.

BIOTERIO DE PRODUCCIÓN

Estructura física y organizacional especialmente diseñada para la cría y mantenimiento de animales de laboratorio. Son de ubicación exclusiva, fueradel alcance de peligros sanitarios.El objetivo principal es asegurar la procedencia de animales sanos para que no interfieran en los trabajos científicos de las diferentes áreas de investigación, fabricación de vacunas, antígenos y su control.Los determinantes de un bioterio para un buen desempeño son:

1. Aspecto de infraestructura.

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2. Animales definidos. 3. Personal capacitado

BIOTERIO DE EXPERIMENTACIÓN

Destinado solamente para alojar animales durante el tiempo que dure un estudio o una investigación.Se debe tener en cuenta que existan instalaciones con barreras sanitarias establecidas para la protección de las personas así como de los animales, con el equipamiento necesario y los procedimientos normativos operacionales correspondientes para dichos fines.

Animales singenicos La isogenicidad, o igualdad genética, es sin dudas la característica más importante de estas

líneas. El hecho de que todos los individuos pertenecientes a una línea sean idénticos genéticamente, facilita el intercambio de tejidos, como ser células del sistema inmune o células tumorales (en términos de histocompatibilidad se habla de animales singeneicos).

En el caso del ratón, el alto porcentaje de homocigosis (mayor al 98%) es otro rasgo particular de estos animales. Por lo tanto, los individuos que pertenecen a una línea consanguínea no son equivalentes a una colección de gemelos idénticos (monocigóticos), ni tampoco a un grupo de animales clonados. La asociación de los caracteres fijados en cada línea particular genera una individualidad con respecto a sus cualidades, rasgo que habrá que tener en cuenta a la hora de la elección de una línea para un trabajo de investigación.

La sensibilidad a ciertas enfermedades infecciosas, la tendencia a desarrollar enfermedades autoinmunes (como el lupus y la diabetes) y la susceptibilidad a los carcinógenos son sólo algunos ejemplos de la gran utilidad de estas líneas como animales de laboratorio de uso particular.

Cada línea consanguínea tiene entonces su rango particular de características, incluyendo el tipo de tumores espontáneos, la habilidad para aprender, la vida media, la producción de leche, la agresividad y la susceptibilidad a los agentes infecciosos. Por esto mismo, la selección de la línea más apropiada es una parte crítica del diseño y la planificación de un experimento.

Dado que se trata de animales genéticamente idénticos, la uniformidad fenotípica de las líneas consanguíneas es otro rasgo importante que nos permite afirmar que la variabilidad en los parámetros experimentales se debe exclusivamente a factores no genéticos (ambientales o metodológicos). Esta uniformidad nos permite lograr precisión estadística con muchos menos animales que los necesarios al trabajar con grupos no consanguíneos. Finalmente, la uniformidad hace posible la comparación de resultados experimentales entre animales de diferentes laboratorios y además, debido a su relativa estabilidad genética, a lo largo del tiempo. El número de líneas consanguíneas censadas es actualmente 478 para el ratón y 234 para la rata, lo que da una idea de la enorme cantidad de información y bibliografía que se maneja.

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Antígeno: Sustancia INMUNÓGENA CON ESPECIFICIDAD ANTIGÉNICA: es toda molécula capaz de generar una respuesta del SI cuando penetra en el organismo y de reaccionar específicamente con los productos desarrollados en dicha respuesta. Son proteínas o polisacáridos.

M HaptenoSustancia NO INMUNÓGENA con ESPECIFICIDAD ANTIGÉNICA: moléculas de bajo peso molecular (menos 1000 daltons) capaces de reaccionar con un Ac (especificidad antigénica), pero incapaz de desencadenar por si mismas su producción en el animal (no inmunógena). Son determinantes antigénicos aislados.Puede hacerse inmunógena uniéndose a proteínas transportadoras (CARRIER).

InmunógenoSustancia ajena o propia de un organismo que puede desencadenar una respuesta inmunológica pero a diferencia de un antígeno depende de la especie, vía de inoculación y concentración. Un inmunógeno es cualquier sustancia que induce una repuesta inmunitaria. Todo los inmunógenos son antígenos pero no todos los antígenos son inmunógenos. Aquellos antígenos que no son capaces por si solos de causar una repuesta inmunitaria se denominan haptenos, son moléculas de bajo peso molecular y deben conjugarse con una molécula “portadora” o “carrier” que proporcione epitopes reconocibles por las células de sistema inmunitario.

Determinante antigénicoEs la región del antígeno a quien van dirigidos los anticuerpos. Sitio donde se reconocen los anticuerpos.

VÍAS DE INMUNIZACIÓN La elección de la vía de inmunización va a depender de varios factores: cantidad que ha

de administrarse, solución en la que a re suspenderse o diluirse el inmunógeno y qué otros

Vías de inoculación

intravenosa

Conejos Ratas y cobayos Ratón

Intraperitoneal

Ratón

Subcutánea

Rata Ratón

Con sonda gástrica

Oral

Rata

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componentes se han asociado (por ejemplo la B. pertussis no puede inocularse por vía intravenosa) y la rapidez o velocidad a la cual el inmunógeno debe ser liberado a los vasos linfáticos y a la circulación.

Las principales vías de inmunización son:

• Subcutánea o hipodérmica: es muy fácil de realizar y permite inocular volúmenes

grandes, pueden administrarse en sucesivas veces.

• Intramuscular: el antígeno se libera lentamente, el volumen a inocular varía en función

del tamaño del animal.

• Intradérmica: es más difícil de realizar y permite inyectar volúmenes reducidos.

• Intravenosa: no efectiva para inmunizaciones primarias, permite una liberación rápida

del antígeno en el ratón, la inyección se suele realizar en la vena caudal (vena de la cola)

• Nódulos linfoides: empleada principalmente en el campo de la investigación, se realiza

en raras ocasiones.

• Intraperitoneal: se utiliza frecuentemente en animales pequeños (cobaya, ratón, rata,

hámster, etc.) permite inocular una grandes volúmenes en ratones, no está recomendada

para conejos

Tabla 2. Calibre de agujas para la obtención de sangre en animales.

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Tabla 3. Vías de administración de fluidos y sustancias

Volúmenes de seguridadTabla 5. Vías de administración y volúmenes recomendados (mL/Kg corporal) en diferentes especies

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ANIMALES MÁS UTILIZADOS La experimentación animal es uno de los pilares más importante de las investigaciones

científicas. El trabajo con animales permite obtener modelos experimentales fidedignos y económicos, pero éticamente obliga al investigador a evitar la producción de dolor innecesario en el animal. Las principales especies animales que se utilizan en la experimentación son:

• Conejos: sobre todo para producir anticuerpos policlonales.

• Ratones: son animales de fácil manejo y son muy buenos para producir anticuerpos

monoclonales.

• Ratas: muy buenos para anticuerpos monoclonales.

• Hámster: sobre todo para anticuerpos policlonales cuando tenemos poco antígeno.

• Cobayas (Guinea pigs): son animales bastantes pacíficos y sobre todo se utilizan para

producir anticuerpos policlonales.

• Pollos: sobre todo para obtener respuesta frente a antígenos de mamíferos muy

conservados.

• Cabras: sobre todo para obtener grandes cantidades de anticuerpos policlonales.

• Humanos: éticamente discutible, peligroso.

Dado que la respuesta de los animales va a ser diferente, deben de inmunizarse varios

individuos. En caso de los conejos se debe inmunizar al menos dos, siendo mejor 3 ó 4. En el caso de los roedores se deben usar entre 3 a 6 animales.

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NECESIDADES DE ANESTESIA Tanto para la seguridad de los animales y de las personas que los manejan, como por

razones éticas, en todos los casos para la administración y la toma de muestras se debe sujetar e inmovilizar a los animales correctamente y si es necesario, se debe de administrar anestesia siempre que exista resistencia al manejo o suponga dolor a la administración de un producto o la toma de muestras. En todos los casos debe de evitarse, en la medida de lo posible, producir estrés o sufrimiento innecesario a los animales.

Antes de administrar un anestésico a un animal debe de tenerse en cuenta la especie, el estado fisiológico, la duración de la inmovilización y la vía de administración. La anestesia pretende producir un estado inconsciencia o hipnosis, acompañada de analgesia, relajación muscular y equilibrio de las constantes vitales, además de deprimir el centro termorregulador e induce estado de hipotermia que es muy peligroso en especies de pequeño tamaño. Los principales anestésicos que se utilizan son: Dióxido de carbono (inhalación 1-2 min.), Pentobarbitona sódica (inyección), Fluanisona (en caso de cirugía mayor), Droperidol (se usa en combinación con la fluanisona en caso de cirugía mayor) y Diethyl ether (inhalación)

TIPOS DE INMUNÓGENOS Y VIAS DE INMUNIZACIÓN Excepto inmunógenos particulares (tipo virus, hongos, bacterias, etc.) que sólo deben

inyectarse vía subcutánea, intramuscular o intradérmica, el resto (proteína solubles, insolubles, carbohidratos y ácidos nucleicos) pueden inyectarse de forma intravenosa además de las vías anteriores.

Intravenosa en conejos.

Antes

Se coloca al conejo en la caja especial de sujeciónSe localiza la vena marginalSe rasura la oreja Se dilata la vena, frotándola un poco.Se limpia donde se hará la punción con etOH al 70%

Durante

Se realiza con una aguja hipodérmica de 26 x ½” Con el bisel hacia arriba Siguiendo la trayectoria de la aguja

Después

Se extrae la aguja suavementeAplicar una torunda con alcohol, con presión suave.

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Sangrado de animal

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ADYUVANTE.Sustancia que intensifica inespecíficamente la respuesta inmunitaria frente a un Ag.

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TIPOS DE ADYUVANTES El antígeno libre suele dispersarse con rapidez desde los tejidos locales que drenan el sitio de la inyección y una importante función de los adyuvantes es contrarrestar esto al proporcionar un reservorio antigénico duradero, ya sea en una localización extracelular o dentro de los macrófagos. Los principales adyuvantes son:

• ADYUVANTE INCOMPLETO DE FREUND: es una emulsión estabilizada de aceite

no metabolizable en agua. Las emulsiones tienden a producir concentraciones más

altas y duraderas de anticuerpos.

• ADYUVANTE COMPLETO DE FREUND: es igual que el incompleto pero contiene

bacterias atenuadas de Mycobacterium tuberculosis. Este produce granulomas y es

muy irritante, por lo que no está indicado para su uso en el ser humano.

• ALUMN: compuesto de aluminio (fosfato o hidróxidos) y es el más utilizado en el

hombre. Para incrementar la estimulación no específica, se asocia en ocasiones a

bacterias muertas de Bordetella pertussis. Si se emplea estas bacterias no se puede

inyectar por vía intravenosa, pero si por el resto de las vías de inmunización.

I. PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DEL ADYUVANTE INCOMPLETO DE FREUND:

1. Resuspender el adyuvante de Freund incompleto por agitación. 2. Preparar 200 µl del BSA en solución salina a una concentración final de 2 mg/ml.

(Concentración del antígeno 200 mg/ml) 3. Añadir en un tubo eppendorf 100 µl del adyuvante incompleto de Freund. Mientras se

agita el adyuvante, ir añadiendo gota a gota la solución antigénica (100 µl) Mezclar bien

hasta que se vea una emulsión pastosa.

4. La emulsión ahora es espesa. Guardar en nevera a 4ºC. ¿A qué concentración tenemos la emulsión?

Inyección: La concentración habitual para inyectar en una rata o ratón es de 50 a 100 µg. Para un conejo la concentración varía entre 50 y 1000 µg. Antes de inyectarlo se debe diluir el precipitado en salino con un volumen final de 250 µL.

Queremos inmunizar a un ratón con 100µg de BSA

II. PROTOCOLO DE PREPARACIÓN DEL ADYUVANTE ALUMN:

Se requiere:

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• Preparar 10 ml de una solución al 5% de Alluminium potassium sulphate (sulfato de potasio y aluminio) [KAl (S04)2.12 H20] en agua destilada estéril. Se conoce como ALUMN.

1. Preparar 1 ml de antígeno (BSA) diluido a una concentración de 1 mg/ml en agua

destilada en un tubo Falcon de 15 ml.

2. Añadir 1 ml de la solución 5 % ALUMN. Ajustar el pH a 6.5 añadiendo lentamente 4N

NaOH. Normalmente requiere varias alícuotas de 30 µl, aunque esto varía de acuerdo al

pH del agua. Medir el pH con papel indicador.

3. Centrifugar la muestra 5 minutos a máxima centrifugación en una centrífuga (13.000

r.p.m) Eliminar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.

4. Resuspender el precipitado en 1 ml de salino estéril (concentración final de 1 mg/ml)

Mantener a 4 ºC. Si se quisiera guardar muchos días (al menos 14), resuspender en

salino/merthiolate 1: 10.000.

Inyección: La cantidad habitual para una rata o ratón es de 50-100 µg. Para un conejo

entre 50 - 1000 µg. Tomar la cantidad de antígeno necesario y añadir 109 unidades de B. pertussis (el preparado comercial inactivado por calor, contiene 20 x 10 9 unidades en 0.5 ml) e inyectar al animal en un volumen final de 250 µl en salino.

INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVAEl sistema inmunitario (SI) puede dividirse desde el punto de vista funcional en dos niveles:

a) Inmunidad innata: primera línea de defensa frente a agentes infecciosos; la mayoría de los agentes patógenos pueden controlarse antes de que se produzca una infección declarada.b) Inmunidad adaptativa :  entra en acción cuando falla la inmunidad innata. Elabora una respuesta específica para cada agente infeccioso y guarda memoria de él (puede impedir la reinfección).Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Cátedra de Inmunología, Universidad de la República; Montevideo-Uruguay.

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Componentes Inmunidad innataInmunidad adaptativa

Factores solubles

Lisozima, complemento, proteínas de fase aguda, moco, espermina del semen, acidosis del estómago, gérmenes de la vagina, piel e intestino Anticuerpos

CélulasFagocitos mononucleares, neutrófilos, NK Linfocitos T y B

Barreras físico-químicas

Piel y mucosas (glándulas sebáceas), cilios de la tráquea

Sistema inmunitario cutáneo y mucosa

Citosinas IFN a y b , TNF, IL-1, IL-6IFN-g, IL-2, IL-3,……

CaracterísticasResistencia no mejorada por la reinfección

Resistencia mejorada por la reinfección

Otra división de la respuesta inmune:

– Inmunidad humoral: es la inmunidad que se transfiere mediante el plasma o suero de la sangre.– Inmunidad celular: es la inmunidad que se transfiere mediante células de la sangre, timo, bazo, ganglios linfáticos, etc.

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INMUNIDAD INNATA.– Conjunto de mecanismos de defensa de vertebrados que incluye mecanismos ancianos presentes en invertebrados

– Involucra células (ej: fagocitos) y moléculas solubles (ej: opsoninas) innatos o inducidos tempranamente en la infección

– Ejerce un control permanente -sistema de vigilancia – que responde en forma inmediata a la agresión provocada por patógenos

– Provee un conjunto de señales indispensables para la activación de la inmunidad adaptativa: instrucción

LIMITE EXTERIOR DEL ORGANISMO.El límite exterior de nuestro cuerpo suele ser una barrera efectiva para detener los microorganismos patógenos. Esta barrera está compuesta por:

a) Piel :  está queratinizada y contiene microorganismos comensales que impiden el crecimiento de patógenos. Además, las glándulas sebáceas secretan AG que tienen acción bactericida.b) Lisozima (de la mayoría de las secreciones externas): hidroliza la pared celular de las bacterias Gram (+), rompiendo la unión entre el N-acetilmurámico y la N-acetilglucosamina del peptidoglicano.c) Moco de los epitelios de recubrimiento externo que bloquea el paso de los microorganismos.d) Tapizado ciliar de la traquea que arrastra a los microorganismos.e) pH ácido del estómago, piel y vagina.f) Espermina del semen.g) Gérmenes comensales del intestino, piel y vagina que ocupan un nicho ecológico.Los quemados pierden la barrera de protección y aumenta el riesgo de infecciones.

1.1.1.2. FAGOCITOS: MACRÓFAGOS Y NEUTRÓFILOS.Son la primera barrera de defensa y su función es fagocitar y destruir partículas patógenas. Está compuesto por:

a) Células del sistema mononuclear fagocítico:– Macrófagos de los alvéolos, bazo, recirculantes y residentes en los ganglios linfáticos.

– Monocitos sanguíneos.– Células A.– Células de Kupffer del hígado.– Células microgliales del SNC.– Fagocitos mesangiales renales.– Células de Kupffer.– Macrófagos esplénicos.– Histiocitos: macrófagos de los tejidos.– Osteoclastos del hueso.b) Granulocitos (PMN): neutrófilos, eosinófilos.Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Cátedra de Inmunología, Universidad de la República; Montevideo-Uruguay.

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1.1.1.3. NATURAL KILLER (NK).Las NK son leucocitos (linfocitos granulares grandes o LGL) que pueden reconocer los cambios de la superficie celular que se producen en algunas células infectadas por virus y ciertas células tumorales. Las NK se unen a estas células diana y las destruyen (reacción citotóxica).

1.1.1.4. PROTEÍNAS DE FASE ÁGUDA.La concentración sérica de las proteínas de fase aguda aumenta rápidamente durante la infección y permanece elevada durante ésta. Por ejemplo:

a) La proteína C reactiva (PCR) que reconoce y se une por un mecanismo dependiente de calcio, a los grupos moleculares existentes en una gran variedad de bacterias y hongos. En particular, se une a la mitad fosforilcolina de la pared del neumococo y actúa como opsonina, activando el complemento.b) El sistema de complemento es un grupo de 20 proteínas séricas cuya función global es controlar la inflamación. Se activan por una cascada de reacciones enzimáticas que conducen a:– Opsonización de microorganismos.

– Quimiotaxis y fagocitos.

– Aumento de flujo sanguíneo e incremento de la permeabilidad en la zona.

– Lesión de la membrana plasmática de virus, bacterias y células que hayan inducido la activación.

c) Los interferones (IFN) son un grupo de proteínas importantes en la infección vírica.1.1.1.5. TOLL-LIKE RECEPTORES (TLRS): RECEPTORES SOBRE CÉLULAS INFLAMATORIAS.Estos receptores, conservados a lo largo de la escala evolutiva, constituyen un puente entre la inmunidad natural y adaptativa, y un sistema ancestral de reconocimiento de los microorganismos y de “señales de riesgo” endógenas, como restos de células necróticas y proteínas HSP. Se identificados en Drosophila como moléculas involucradas en el desarrollo embrionario; luego se constató su papel en la defensa contra microorganismos

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Hoy hablamos de una familia de proteínas; se han identificado 10 TLRs en mamíferos. Los diversos TLRs reconocen distintos patrones de moléculas de bacterias y virus (LPS, flagelina, lipoproteínas, glicolípidos, secuencias de nuclótidos CpG), y transmiten señales que llevan a la activación del NFkB y de genes de citocinas y moléculas coestimuladoras. Aunque se encuentran en diversos tipos celulares, su papel es más significativo en las células presentadoras de antígenos, tales como monocitos, macrófagos y células dendríticas.Respecto a su estructura:

– Su dominio extracelular une al ligando

– incluye un motivo rico en Leu (18-31aa, LRRs)

– diverge entre diferentes TLRs y entre TLR homólogos de diferentes especies

– Su dominio citoplasmatico une proteínas citosólicas

– Activa vías de señalización – dominio activador –

– está altamente conservado

Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Cátedra de Inmunología, Universidad de la República; Montevideo-Uruguay.

La activación de TLRs en insectos conduce a la producción de péptidos antibacterianos denominados cecropinas. Las Células inflamatorias de mamíferos -neutrófilos y monocitos- secretan péptidos similares denominados defensinas en respuesta a estímulos (por ejemplo IL-1). En general se caracterizan por ser peptidos antipáticos que destruyen la continuidad de la pared/ membrana bacteriana (forman poros?). No afectan células eucariotas.Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Cátedra de Inmunología, Universidad de la República; Montevideo-Uruguay.

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La inflamación inducida a través de la activación de TLR recluta células que participan en la eliminación del patógeno, por ejemplo neutrófilos. Las células activadas -a través de los TLRs- viajan al ganglio linfático “preparadas para su encuentro con los linfocitos “con los mecanismos de la respuesta adaptativa activados

INFLAMACIÓN.El inicio de la respuesta innata involucra la activación celular o de sistemas enzimáticos (complemento y vía de activación por contacto). La activación celular implica el reconocimiento de estructuras conservadas en patógenos (patrón molecular asociado a patógenos, PAMP) por receptores expresados en la superficie de células residentes en el tejido como macrófagos y dendríticas.Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Cátedra de Inmunología, Universidad de la República; Montevideo-Uruguay.

Tras la activación celular y de sistemas enzimáticos se desencadenan mecanismos efectores destinados a eliminar al patógeno. Las células fagocíticas pueden ingerir y degradar patógenos extracelulares. El complemento puede conducir a la lisis de bacterias. Tanto la activación celular como la activación del complemento generan mediadores de la inflamación.

En el inicio de una respuesta el principal sistema enzimático involucrado es el complemento trás la activación de la vía alterna. El mecanismo involucrado en la activación de la vía alterna se muestra en las figuras siguientes. La activación del complemento también puede ocurrir por unión de una proteína soluble MBL (lectina que une mananos) a carbohidratos presentes en patógenos, a través

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de un mecanismo conocido como vía de las lectinas. Los niveles basales de MBL en los tejidos son muy bajos, por lo cual es dudoso en qué medida esta vía podría activarse en forma inmediata al ingreso de un patógeno. Sin embargo como la MBL es una proteína de fase aguda (sintetizada por los hepatocitos en respuesta a IL-1 y IL-6) es posible que la vía de las lectinas permita amplificar la respuesta inflamatoria innata.

Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Cátedra de Inmunología, Universidad de la República; Montevideo-Uruguay.

C3a, C4a y C5a tienen actividad anafiláctica (promueve localmente dilatación y aumento de la permeabilidad de los vasos sanguíneos), quimiotáctica (dirige el tránsito de leucocitos desde la sangre al tejido, a favor de su gradiente de concentración) y son capaces de activar una variedad de tipos celulares.

Es la respuesta típica de la inmunidad natural frente a los agentes agresores. Se producen tres acontecimientos que se manifiestan en forma de inflamación:

a) Aumento del riego sanguíneo (hiperhemia).– A nivel de los capilares se pierde la capa de músculo liso que rodea al endotelio de las arterias y arteriolas. Esto permite la extravasación celular a la altura de la red capilar.

– Los mediadores proinflamatorios contribuyen al aumento del flujo sanguíneo, a la vasodilatación y al aumento de la permeabilidad de los vasos. Estos dos últimos fenómenos se asocian con la contracción de la célula endotelial (observar la figura superior de la izquierda): las células se achican aumentando el espacio entre ellas y permitiendo el aumento del diámetro del vaso.

– Los mediadores inflamatorios también contribuyen a la detención de las células sanguíneas en la zona porque inducen la expresión de moléculas de adhesión en el endotelio.

Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Cátedra de Inmunología, Universidad de la República; Montevideo-Uruguay.

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b) Aumento de la permeabilidad capilar y formación del exudado inflamatorio por retracción de las células endoteliales que permite la salida de elementos del sistema inmunitario (SI) hacia el lugar de la infección. El aumento de líquido en la zona inflamada conduce al aumento de la presión local. Esta presión dirige el tránsito de las células, a través de la linfa, desde el sitio de inflamación a los ganglios linfáticos próximos, sitios en donde se encuentran las células, linfocitos B y T, capaces de reconocer específicamente componentes extraños. Así la respuesta inflamatoria resulta fundamental para conectar los componentes de la inmunidad innata y adaptativa.Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Cátedra de Inmunología, Universidad de la República; Montevideo-Uruguay.

c) Quimiotaxis de los leucocitos hacia el lugar de la infección. Los fagocitos responden a un gradiente de concentración de ciertas moléculas como C5a y C3a. Los pasos son:– Pavimentación del endotelio capilar.

– Diapedesis o paso del endotelio capilar por seudopodos.

– Movimiento ameboide por el tejido intersticial.

– Aumento de la fagocitosis inespecífica mediada por opsoninas como C3b

Fuente de la figurua: Dr. Ana M. Ferreira; Cátedra de Inmunología, Universidad de la República; Montevideo-Uruguay.

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Además, Como consecuencia de la unión de varias citoquinas (IL-1, TNF-alfa), C3a y C5a a receptores en la membrana de las células endoteliales, se induce un aumento de la expresión de moléculas de adhesión (selectina P) sobre la célula endotelial. Además, estas moléculas también conducen al aumento de la expresión de moléculas de adhesión celular sobre neutrófilos y monocitos. En conjunto, estos cambios favorecen la detención de las células sobre el endotelio vascular en la zona inflamada y su posterior extravasación.

Tras la inflamación aguda puede ocurrir lo siguiente:

– Resolución con retorno a una estructura y función normales.

– Supuración con formación de abcesos.

– Hinchazón con regeneración de tejido especializado o fibroso formando una cicatriz.

– Persistencia del agente causante, haciendo el proceso crónico (semanas, meses, años).

INMUNIDAD ADAPTATIVA O ESPECÍFICA.El sistema inmune adaptativo se caracteriza por una fina especificidad, que se adapta al reconocimiento del patógeno o célula tumoral que aparece como un desafío para la homeostasis del individuo. Este reconocimiento específico permite dirigir poderosos mecanismos efectores contra el agente agresor. El sistema inmune adaptativo se caracteriza además por contar con un mecanismo de memoria por el cual, ante un segundo encuentro con el mismo desafío, la

respuesta es más rápida y más eficiente.

La división del Sistema Inmune en Innato y Adaptativo facilita el abordaje del estudio del Sistema Inmune, pero es una división artificial. Ambas ramas del sistema inmune funcionan cooperativamente potenciandose mutuamente.

El sistema inmune innato reconoce lo no-propio a través de receptores seleccionados durante el curso de

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la evolución de la especie, los cuales reconocen estructuras comunes y altamente conservadas en los patógenos (llamados patrones asociados a patógenos). Todas las células pertenecientes a un mismo tipo celular (ej. macrófagos, neutrófilos) presentan idénticos receptores. Dicho patrón de receptores permanece invariable durante la vida del individuo.

Por el contrario, el sistema inmune adaptativo funciona sobre la base de una distribución clonal de los receptores vinculados al reconocimiento específico. ¿Qué significa esto?: Que en el proceso de maduración de los linfocitos se genera en forma aleatoria un receptor de membrana con una determinada especificidad, es decir la capacidad de reaccionar con una única estructura química. De modo que en cada célula hay una única especificidad. Luego opera un mecanismo de selección clonal por el cual los clones con especificidad por componentes propios son eliminados, mientras que los clones con especificidad por componentes no-propios o alterados (como los de las células tumorales) son estimulados por el antígeno para proliferar (aumento de número) y diferenciarse (cambios fenotípicos). Como consecuencia, aparecen en el clon seleccionado propiedades efectoras que permiten contribuir a eliminar el patógeno o las células tumorales.1.2.1. TIPOS DE INMUNIDAD ESPECÍFICA.La inmunidad se puede conseguir por dos mecanismos:

a) Inmunización activa: introducción de un antígeno que induce una respuesta por el sistema inmunitario específico.b) Inmunización pasiva: transferencia de componentes de un organismo a otro que no lo está. Este sistema se usa para bloquear un antígeno urgentemente. Es estas ocasiones se transfieren Ac producidos en otro individuo para neutralizar el veneno.1.2.4. DETERMINANTE ANTIGÉNICO O EPITOPE.Zona del Ag en la que reside la antigenicidad: conformación molecular de la superficie del Ag capaz de combinarse específicamente con una zona complementaría que existe en el Ac.Los Ac son específicos para un Ag, pero un Ag puede tener varios Ac específicos. Cada Ac se acopla a una zona del Ag llamada determinante antigénico o epitopo; son formas moleculares reconocidas por los Ac y las células del SI adaptativo específico. Un Ag puede tener varios epitopos diferentes o idénticos. Los Ac son específicos para los epitopos y no para el Ag en su conjunto.

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1.2.6. MOLÉCULAS QUE PARTICIPAN EN EL RECONOCIMIENTO DEL ANTÍGENO.En el sistema inmune adaptativo hay tres tipos de moléculas que intervienen en el reconocimiento del antígeno.

– Los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) que se presentan como receptores de membrana en los linfocitos B, o son secretados por estos una vez que se han transformado en plasmocitos.– El receptor T (TCR) de los linfocitos T, que según el tipo de cadena que lo forme puede ser ba o dg. La función de estos últimos es todavía confusa, mientras que el papel del receptor ba está bien establecida, y se vincula con el reconocimiento de péptidos unidos a receptores denominados moléculas del complejo mayor de compatibilidad (MHC)– Las moléculas de MHC son el tercer tipo de estructura que participan en el reconocimiento del antígeno. Pero, mientras que el reconocimiento en el caso de las Igs y los TCRs es de muy alta especificidad, las moléculas de MHC interactúan con el antígeno con baja especificidad. Existen dos tipos de receptores MHC, de clase I y clase II. Mientras que los primeros están presentes en todas las células nucleadas, los últimos están restringidos a un número limitado de células del sistema inmune.

1.2.7. SELECCIÓN CLONAL.Las células protagonistas del sistema inmune adaptativo son el linfocito B y el linfocito T y su especificidad se basa en la especificidad de los Ac, receptor del linfocito B (BCR) y receptor de linfocito T (TCR). La cantidad de Ags que pueden ser reconocidos es alta porque hay linfocitos reconocedores de cualquier Ag en un porcentaje muy bajo. Cuando estas células reconocen el Ag, se induce una proliferación hasta conseguir células suficientes para desarrollar una respuesta adecuada.

El Ag selecciona los clones celulares capaces de fijarlo específicamente:

a) Las células B están preparadas para producir un sólo tipo de Ac específico de un Ag, que se sitúa en la superficie celular como Rc del Ag. La función principal del linfocito B es la secreción de anticuerpos. Los anticuerpos o inmunoglobulinas son glicoproteínas que tienen sitios de unión al antígeno y una región constante vinculada a las funciones efectoras de los mismos. A través de su unión los anticuerpos a) bloquean o neutralizan directamente al antígeno que reconocen, b) reclutan células efectoras (como macrofagos, neutrófilos, células NK, etc) debido a la existencia de receptores que se unen a su región constante, o c) disparan la vía clásica del complemento.El Ag se une al BCR y provoca la proliferación de las células B para producir:– Células plasmáticas productoras de Ac.

– Células de memoria de larga vida que no producen Ac.

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b) Los linfocitos T   tiene una función central en la regulación de la respuesta inmune y participan además directamente en la destrucción de los agentes agresores. Reconocen al antígeno a través de su receptor de membrana (TCR) que no se secreta. Hay dos tipos de receptores ba y dg. La función de los linfocitos T que tienen receptores dg es poco comprendida y nuestro conocimiento principal es sobre los linfocitos T con receptores ba. A diferencia de las inmunoglobulinas que pueden unirse a un amplio espectro de estructuras químicas, los linfocitos T con receptores ba solo reconocen péptidos asociados a receptores de membrana (denominadas moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad, MHC) presentes en células propias del individuo. Cuando un linfocito T virgen reconoce a su antígeno (si se cumplen una serie de condiciones) es estimulado a proliferar y diferenciarse. Esta diferenciación puede dar lugar a tres tipos de células efectoras: a) linfocitos T citotóxicos (CTL) que actúan por ej. En las infecciones virales destruyendo la célula infectada, b) linfocitos T inflamatorios (TH1) que colaboran con el macrófago aumentando su capacidad de destruir los patógenos fagocitados, c) linfocitos T colaboradores (TH2) que colaboran con el los linfocitos B en la producción de anticuerpos, favoreciendo los procesos de maduración de la afinidad, cambio de clase y generación de linfocitos B de memoria.

El sistema inmune produce Ac que pueden reconocer Ags antes de ponerse en contacto con él. Se producen tantos Ac que la mayoría no son reclamados nunca; pero este mecanismo se mantiene porque los microorganismos mutan continuamente sus Ags.

1.3. CAVIDADES Y MEDIO EXTERNO.

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Cavidades

Medio interno

Protección externa Mucosas Pile

Secreciones

Mucosidad, pH, saliva, bilis

Lisozima, lípidos, sudor

Inmunoglobulinas

IgA polimérica

IgG, IgM, IgE, IgA, monomérica

Receptor de celulas T

Cadenas g, d

Cadenas a, b

Mastocitos

Dependientes de celulas T

Independientes de celulas T

1.4. FASES DE LA RESPUESTA INMUNITARIA.El objetivo final de la respuesta inmune es la eliminación del antígeno, y para ello tiene que reconocerlo por medio de Rc específicos que hay en la superficie de os linfocitos T y B. Los linfocitos B son los encargados de la inmunidad humoral y los linfocitos T de la celular.Tras el reconocimiento viene la fase de activación en la que los linfocitos experimentan una serie de modificaciones. Las fases en las que se produce son:– Proliferación: expansión de los clones específicos del antígeno que estimula.

– Diferenciación: hace que las células cuya función inicial era reconocer pasen a células efectoras con los mecanismos necesarios para eliminar los antígenos extraños.

Estos procesos requieren numerosos mecanismos de amplificación compuestos con otros tipos celulares que interaccionan célula a célula y a través de moléculas solubles con acción autocrina, paracrina o endocrina. Además, los linfocitos migran a los lugares donde se encuentra el antígeno y donde se produce la respuesta inmunitaria.

La siguiente fase es la efectora: los linfocitos que han sido activados son capaces de eliminar el Ag.

En 1975 Köler y Milstein desarrollaron la técnica de hibridación de células somáticas que permitió la obtención de anticuerpos monoclonales. Esta técnica consiste en tres etapas:

I. Inmunización del animal con un antígeno : Se realiza una primera inmunización y luego se

realizan varias inmunizaciones de recuerdo. El número y la frecuencia de las inmunizaciones

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es variable. Por último se da una inmunización de refuerzo (booster) tres días antes de

sacrificar al animal. Las vías de inmunización pueden ser subcutánea, intraperitoneal, y en

ocasiones, intravenosa. Si tenemos poco antígeno o es poco inmunogénico se puede

inmunizar directamente en el bazo o en los nódulos linfáticos.

II. Fusión celular : se va a realizar entre los linfocitos del bazo del animal inmunizado (aporta la

especificidad del anticuerpo) y una línea celular tumoral (mieloma) que aporta la

inmortalidad. El mieloma no debe de producir inmunoglobulinas propias, debe de ser capaz

de inducir la fusión con alta eficacia y poseer los marcadores necesarios para seleccionar las

células fusionadas (gen HGPRT deficiente) en el medio HAT (hipoxantina-aminopterina-

timidina). La fusión celular se ve favorecida por el polietilenglicol (PEG).

III. Ensayos de especificidad frente al antígeno : la detección de los anticuerpos específicos, en

el medio de cultivo donde crecen los hibridomas, es uno de los puntos más críticos en la

estrategia de producción de anticuerpos monoclonales. Las técnicas empleadas deben ser

sensibles para detectar µg de anticuerpo por ml, deben ser rápidas para evitar el

sobrecrecimiento; simples y lo más automatizadas posibles. Las técnicas más utilizadas son

las enzimoinmunométricas. Los cultivos que den positivo deben ser clonados lo más

rápidamente posible para establecer clones productores de anticuerpos monoclonales. Esto

se realiza principalmente por el método de dilución límite en medio líquido o en agar.

Técnica nº2.A Extracción de sangre de Seno Retro-orbital

Anestesia: Obligatoria

Material: Capilares tratados con anticoagulante (EDTA, heparina…)

Restricciones: Esta técnica debe ser llevada a cabo únicamente cuando no exista método alternativo y siempre por personal cualificado debido al elevado riesgo de dañar estructuras adyacentes al globo ocular, lo que puede originar infecciones severas, ceguera etc…

Volumen de extracción: Consultar Tabla I

Descripción de la técnica:

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1. Una vez anestesiado el ratón y comprobado que se ha alcanzado el plano quirúrgico, sujetar al ratón estirando la piel del cuello hacia atrás asegurándose de no dificultar la respiración

2. Insertar el capilar en el ángulo externo del ojo (2 mm aprox) y girar suavemente hasta que la sangre fluya por el mismo.

3. Recoger la muestra y retirar el capilar.4. Oprimir ligeramente la zona de punción con una gasa o papel para detener

la hemorragia.5. Aplicar pomada oftálmica (Lubrifilm) al ojo.6. Comprobar que la recuperación de la anestesia se produce

adecuadamente aportando las medidas que se consideren necesarias para ello (i.e , aporte de calor )

7. Observar al animal los días posteriores al sangrado para detectar la aparición de posibles complicaciones: protrusión de tejido adyacente al ojo, infecciones, hemorragias…

Fig. 1

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Anexo 1

Tabla I. Volúmenes de extracción de sangre.

Tabla I.A. Volúmenes de extracción referidos a Vc (volumen circulante)

Extracción única Extracciones múltiples

% Vc extraído Período de recuperación

% Vc extraído

en 24h

Período de

recuperación

7.5 % 1 semana 7.5 % 1 semana

10 % 2 semanas 10 % 2 semanas

15 % 4 semanas 15 % 3 semanas

Vc: Volumen circulante

Vc ratón: 72 ml/kg

Vc rata: 68 ml/kg

Tabla I.B. Volúmenes de extracción referidos a Vt (Volumen total)

Extracción de sangre

V t (ml)7.5 %

(ml)

10 %

(ml)

15 %

(ml)

20 %

(ml)

Ratón

(25g)1.8 0.1 0.2 0.3 0.4

Rata

(250g)16 1.2 1.6 2.4 3.2

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Vt: Volumen total: aprox. 6% del peso (en ml)

Tabla II. Volúmenes de inoculación.

Rutas y volúmenes de administración

(ml/kg excepto *ml/sitio)

oral SC IP IMIV

Bolus

IV

Perf.

Ratón 10 (50) 10 (40) 20 (80)0.05*

(0.1)*5 (25)

Rata10

(40)

5

(10)

10

(20)

0.1*

(0.2)*5 (20)

() Volúmenes máximos

- No más de 2 inoculaciones IM por día

- No más de 2 ó 3 inoculaciones SC por día

- IV: no exceder 4% volumen circulante (bolus) o 4 ml/kg/h en perfusión

Anexo 2

Se recomienda un rango de pH de trabajo de 4,5-8 (Waynforth and Flecknell, 1992) teniendo en cuenta que el grado de tolerancia de pH para las diferentes vías de administración es:

Vía oral > Vía intravenosa > Vía intraperitoneal > Vía intramuscular > Vía subcutánea ≥ Vía intradérmica

El pH, por sí solo, no es un indicador suficiente del potencial irritante ya que la irritabilidad depende también de la concentración y del punto de ionización (pK) del compuesto. Estos factores, así como la solubilidad, biocompatibilidad, viscosidad y esterilidad, deberán ser valorados antes de proceder a la inoculación del compuesto en cuestión por cualquiera de las vías mencionadas.

Referencias

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1. Karl-Heinz Diehl, Robin Hull. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. AALAS [internet]. 2001 [citado 31 ago 2015]; 35:1-41. Disponible en: http://labanimals.stanford.edu/Guidelines

2. D.B. Mortom, M. Jennings, A. Beckwell, R. Ewbank, C. Godfrey, B. Holgayte, I. Inglis, R. James. Refining procedures for the administration of substances. AALAS [internet]. 2006 [citado 31 ago 2015]; 35:1-41 Disponible en: http://www.aalas.org

3. Crepaz, N., Passin, W.F., Herbst, J.H., y cols. Meta-Analysis of Cognitive-BehavioralInterventions on HIV-Positive Persons’ Mental Health and Immune Functioning. HealthPsychology [Internet] 2008 [citado 31 ag 2015]; 27, 4-14. Disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2835810/

4. Miller, G.E., Cohen, S.). Psychological interventions and the immune system: A meta- analytic review and critique. Health Psychology [internet] 2001 [citado 31 ag 2015]; 20, 47-63. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11199066

5. Trakhtenberg; E. The effects of guided imagery on the immune system: A criticalreview. IJ of Neuroscience [Internet], 2008 [Citado 31 ago 2015]; 118, 839–855.Disponible en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11199066

6. conbioetica-mexico.salud.gob.[Internet]. México: Centro del conocimiento bioético [actualizado Lunes 27 de enero del 2014]. Disponible en: http://www.conbioetica-mexico.salud.gob.mx/interior/queeslabioetica.html

7. NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999, Especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio.