inhibidores

1. INTRODUCCIÓN

La actividad de las enzimas puede inhibirse. Las moléculas que reducen la actividad de una enzima, denominadas inhibidores, incluyen muchos fármacos, antibióticos, conservantes alimentarios y venenos. Las investigaciones de la inhibición enzimática y de los inhibidores llevadas a cabo por los bioquímicos son importantes por varias razones. En primer lugar y la razón mas importante, en los seres vivos la inhibición enzimática es un medio importante para regular las rutas metabólicas, actualmente para modular las velocidades de las reacciones enzimáticas específicas, se emplean pequeñas biomoléculas, de forma que satisfagan las necesidades del organismo. En segundo lugar, numerosos tratamientos clínicos se fundamentan en la inhibición enzimática. Por ejemplo, muchos antibióticos y fármacos reducen la actividad de enzimas específicas. Actualmente, el tratamiento más eficaz contra el SIDA utiliza varios fármacos que incluyen inhibidores de proteasas, moléculas que incapacitado a una enzima vírica que se requiere para formar virus nuevos.

Finalmente, las investigaciones de la inhibición enzimática han permitido a los bioquímicos diseñar técnicas que se utilizan para demostrar la arquitectura física y química, así como las propiedades funcionales de las enzimas.

En el presente trabajo se estudian los tipos de inhibición enzimática así como las ecuaciones de velocidad (proporcionadas por Michaelis—Menten) correspondientes a cada una. Además se presenta un caso resuelto aplicando dichos conceptos.

2. DESARROLLO

2.1 Inhibición enzimática

Con frecuencia, las velocidades de las reacciones enzimáticas son afectadas por sustancias que no son sustratos; cuando un compuesto reduce la velocidad de reacción, se dice que es un inhibidor. El efecto opuesto es el aumento en la velocidad de una reacción por un activador. En el manejo de inhibidores, es importante distinguir entre los efectos que se observan experimentalmente y los mecanismos (modelos) propuestos para explicarlos.

Existen tres tipos básicos de inhibición. Estos se definen en recuerdo grado de inhibición i, el cual se define como:

i=v0−v iv0

Donde v0 y v i son las velocidades iniciales de reacción no inhibida e inhibida, respectivamente.

1. Se dice que existe una inhibición no competitiva pura si i no es afectada por la concentración del sustrato.

2. Existe inhibición competitiva si i disminuye a medida que aumenta la concentración del sustrato.

3. Existe inhibición anti o no competitiva si i aumenta a medida que se incrementa la concede el sustrato.

Además de lo anterior, existe una inhibición mixta, la cual ocurre si i aumenta o disminuye con el aumento de la concentración del sustrato, pero no en la misma magnitud que en los casos de antagonismo competitivo puro o competitivo, respectivamente. De hecho puede mostrarse mecánicamente que la inhibición no competitiva es un caso especial de la inhibición mixta; sin embargo, como se define aquí, operacionalmente la inhibición mixta es una combinación de dos de los tres tipos básicos.

2.2 Método Gráfico

a) Inhibición Competitiva

Con frecuencia el sustrato y el inhibidor compiten por el mismo lugar en la enzima. Los inhibidores competitivos se unen de forma reversible a la enzima libre, y no al complejo ES, para formar un complejo enzima— inhibidor (EI).

Ecuación 1

Las representaciones de 1/v frente a 1/[S] en presencia de varias concentraciones del inhibidor cortan en el mismo punto sobre el vertical 1/Vmax.

b) Inhibición Acompetitiva

En la inhibición acompetitiva, el inhibidor sólo se une al complejo enzima-sustrato, y no a la enzima libre.

Km y Vmáx disminuyen

K3

El inhibidor se une solamente al complejo Enzima-Sustrato, disminuye la velocidad máxima por el factor (1+I/Ki) y, paradójicamente, disminuye la Km por el mismo valor obteniéndose una Kmap Menor.

C) No competitiva

En este tipo de inhibidores, la molécula se une a la enzima como al complejo ES. (El inhibidor se une a un lugar diferente del lugar activo).

2.3 Bases mecanísticas de la ecuación de Michaelis-Menten

Para explicar sus resultados de la conversión de sacarosa en glucosa y fructuosa por la enzima invertasa, Michaelis y Menten propusieron en 1913 el siguiente esquema de reacciones:

E + S ES E + P

Ellos supusieron que K1 y K−1eran mucho mayores que K2; por lo tanto, la primera parte de la reacción podría ser descrita por la constante de equilibrio para la disociación del complejo enzima-sustrato: K2= [E ] [S ] / [ES ]. Las concentraciones de S y E en cualquier tiempo se derivan de las condiciones iniciales conocidas.

K-1

K1

Ecuación 2

Tabla 1. Ecuaciones de velocidad para los cuatros tipos de inhibición enzimática

v=vmax [S ]

(Km+ [S ] )(1+ [ I ]K I )

v=vmax [S ]

K m(1+ [ I ]K I

)+ [S ]

i=[ I ]

(K I+ [ I ] ) i=Km

[ I ]K I

Km(1+ [ I ]K I )+ [S ]

v=vmax [S ]

K m(1+ IK I)+ [S ]

v=vmax

K m(1+ IK I)+(1+ [ I ]

K ' I ) [S ]

i=[S ] [ I ]K I

Km(1+ [ I ]K I )+ [S ]

i=

[ I ] {KmK I

+[S ]K ' I }

Km(1+ [ I ]K I )+(1+ [ I ]

K ' I ) [S ]

2.4 Caso 2 La celulosa puede convertirse en azúcar mediante el siguiente ataque enzimático:

Celulosa Azúcar

Esta conversión se ve afectada por la presencia de celubiosa y glucosa, las cuales inhiben el proceso. Para estudiar la cinética de esta reacción se realizaron una serie de corridas en un reactor de mezcla completa, manteniendo una temperatura de 50C y utilizando como alimentación celulosa finamente dividida (CAo=25 kg/m3), enzima (CEo=0.01 kg/m3 para todas las corridas) y varios inhibidores. Los resultados son los siguientes:

Corrida Corriente de salidaCA (kg/m3)

Sin inhibidor (min)

Con celubiosaCBo= 5 kg/m3

(min)

Con glucosaCGo=10 kg/m3

(min)

1 1.5 587 940 1020

2 4.5 279 387 433

3 9.0 171 213 250

4 21.0 36 40 30

MixtaAnticompetitiva

Competitiva puraNo competitiva pura

Celulasa

A partir de estos datos realice lo siguiente:

a) Encuentre una ecuación de velocidad que represente la ruptura de celulosa por medio de la celulasa en ausencia de inhibidores.

b) Cuál es el papel de la celubiosa en la ruptura de celulosa (encuentre el tipo de inhibición y la ecuación de velocidad)

c) Cuál es el papel de la glucosa en la ruptura de celulosa (encuentre el tipo de inhibición y la ecuación de velocidad)

Se analizaron los datos proporcionados y se calcularon las velocidades, así como las inhibiciones correspondientes:

Tabla 2.2 Datos correspondientes a la celulosa

Corrida

Concentración del sustrato(CAo-Cazucar)

Tiempo min (sin inhibidor)

Velocidad de enzima (SIN inhibidor) (Kg/m3.min)

1 23.5 587 0.040034072 20.5 279 0.07347673 16 171 0.093567254 4 36 0.11111111

Tabla 2.3 Datos correspondientes al inhibidor Celubiosa

corrida corriente de salida

Tiempo mins (con celubiosa)

Velocidad (Celubiosa

) Kg/m3.min

INHIBICIÓN i=(Vo-Vi)/Vo

(Kuchel y Ralston, 1994)

1 5 940 0.00531915 0.867134452 5 387 0.0129199 0.824163363 5 213 0.02347418 0.749119724 5 40 0.125 -0.125

Tabla 2.4 Datos correspondientes al inhibidor Glucosa

corrida

corriente de salida

Tiempo mins (con Glucosa)

Velocidad (con inhibidor Glucosa)

Kg/m3.min

INHIBICIÓN i=(Vo-Vi)/Vo

(Kuchel y Ralston, 1994)

1 10 1020 0.00980392 0.755110552 10 433 0.02309469 0.68568693

3 10 250 0.04 0.57254 10 30 0.33333333 -2

A continuación se calcularon los recíprocos del sustrato y las velocidades correspondientes:

Tabla 2.4 Recíprocos del sustrato y velocidades

1/[S]1/vsin

inhibidor

1/vCelubiosa

1/vGlucosa

0.04255319

24.9787234

188 102

0.04878049

13.6097561

77.4 43.3

0.0625 10.6875 42.6 250.25 9 8 3

Una vez obtenidos los recíprocos, se procedió realizar el gráfico de Lineweaver-Burk:

Figura 1.4 Gráfico de Lineweaver-Burk

Con los modelos obtenidos de la gráfica anterior, se calculan Km y Vmáx:

Sin inhibidor:

Modelo : y=−41.53 x+18.762

Donde:

b= 1V máx

=18.762 y m=KmV má x

=−41.53

Como:

18.762= 1V má x

Se despeja V má x

V má x=1

18.762=0.0532

Como:

41.53=K m

V má x

Se despeja Km

(−41.53 ) (V máx )=Km

Se sustituye el valor de V má x calculado

Km=(−41.53 ) (0.0532 )=−2.2135

Inhibidor celubiosa:

Modelo : y=−518.5x+131.35

Donde:

b= 1V máx


=−518.5

Como:

131.35= 1V m áx

Se despeja V má x

V má x=1

131.35=0.00761

Como:

−518.5=KmV m áx

Se despeja Km

(−518.5 ) (V má x )=Km


Km=(−518.5 ) (0.00761 )=−3.947

Con glucosa:

Modelo : y=−292.73x+72.878

Donde:

b= 1V máx


=−292.73

Como:

72.878= 1V m áx

Se despeja V má x

V má x=1

72.878=0.0137

Como:

−292.73=KmV máx

Se despeja Km

(−292.73 ) (V m áx )=K m


Km=(−292.73 ) (0.0137 )=4.0167

Así mismo se decidió graficar la inhibición calculada con la ecuación 2 para observar el comportamiento de cada inhibidor.

0 5 10 15 20 25

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

Inibición-Celubiosa

[S]

Inhi

bició

n

Figura 1.5 Inhibición de la Celubiosa

Se observa que la inibición aumenta a medida que incrementa la concentración del sustrato, esto es un comportamiento anti o no competitivo.

0 5 10 15 20 25

-2.5

-2

-1.5

-1

-0.5

0

0.5

1

Inibición-Glucosa

[S]

Inhi

bició

n

Figura 1.5 Inhibición de la Glucosa

Se observa que la inibición de la glucosa también aumenta a medida que incrementa la concentración del sustrato, esto es un comportamiento anti o no competitivo.

3. RESULTADOS

a) El modelo cinético más característico de una reacción bioquímica es el modelo de Michaelis-Menten para cinética enzimática. Todas las reacciones bioquímicas, así sean llevadas a cabo en un bioreactor industrial, dentro de una célula o fuera de ella, dentro de nuestro cuerpo o en un tejido animal o vegetal, son mediadas por enzimas, la reacción estudiada en este caso no sale de dicho contexto. Por todo lo anterior la ecuación de velocidad que representa la ruptura de celulosa por medio de la celulasa en ausencia de inhibidores es la proporcionada por Michaelis-Menten:

v=V máx [S ][S ]+Km

b) Se determinó que la celubiosa tiene un papel acompetitivo con el sustrato, ya que Km disminuyó con respecto a Km sin inhibidor, además de que su inhibición incrementó con el incremento en la concentración del sustrato. De acuerdo a Michelis-Menten la ecuación de velocidad correspondiente a ese tipo de inibición es la siguiente:

v=vmax [S ]

K m(1+ IK I)+ [S ]

c) Así mismo se determinó que la celubiosa también tiene un papel acompetitivo con el sustrato, ya que Km disminuyó con respecto a Km sin inhibidor, además de que su inhibición incrementó con el incremento en la concentración del sustrato. De acuerdo a Michelis-Menten la ecuación de velocidad correspondiente a ese tipo de inibición es la siguiente:

v=vmax [S ]

K m(1+ IK I)+ [S ]

4. CONCLUSIÓN

En base a los modelos obtenidos a partir del gráfico de Lineweaver-Burk, se determinó que tanto la celulosa como la celubiosa tienen un papel acompetitivo (anti o no competitivo), es decir, que estos inhibidores esperan a que se forme el complejo ES para entrar en acción.

Bibliografía

Kuchel, P. y Ralston, G. 1994.Bioquimica General. McGraw Hill. México. Navas, J. “Enzimas. Biología Molecular”. Disponible en URL:

Http://ocw.unican.es/ciencias-de-la-salud/bioqumica/material-de-clase-1/Tema6_Enzimas.pdf Universidad de Alcalá. 2014. Inhibición enzimática. Disponible en URL:

http://www2.uah.es/bioquimica/ Villegas, G. Bioquímica inhibición competitiva y no competitiva. Disponible en URL:

http://es.slideshare.net/glenderv/bioquimica-inhibicion-y-no-competitiva-20763548

inhibidores

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