UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS-ESPEDEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA Y LA AGRICULTURAINGENIERA EN BIOTECNOLOGAENZIMOLOGA

INTEGRANTES: NRC: 3268 Acosta Jonathan Ceracapa Sandy

FECHA DE REALIZACIN: 02/06/2014FECHA DE ENTREGA: 13/06/2014

INFORME DE LABORATORIO

PRCTICA N 3

1. TEMA: Identificacin la actividad enzimtica y accin inhibitoria sobre la -amilasa mediante el empleo del inhibidor proveniente del extracto de Physalis peruviana (Uvilla)

2. OBJETIVOS:2.1. Objetivo General: Identificar la actividad enzimtica y accin inhibitoria sobre la -amilasa mediante el empleo del inhibidor provenientes del extracto de Physalis peruviana (Uvilla) en tiempos de 5,10 y 15 minutos.2.2. Objetivos Especficos: Calcular la velocidad mxima (Vmax) y la constante de Michaelis-Menten Km para las reacciones enzimticas en funcin de la alfa amilasa Determinar el tipo de inhibicin presente en la reaccin enzimtica mediante el uso del modelo de Doble Inversos.

3. MARCO TERICO

Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de los polisacridos, tales como amilopectina, amilosa, glucgenos y sus productos parcialmente hidrolizados. La - amilasa (a-1,4-glucan-4-glucanohidrolasa, E.C.3.2.1.1) se halla presente en los tejidos y lquidos de animales. Son metaloenzimas que contienen un mnimo de un tomo de calcio por molcula y necesitan este metal para expresar sus actividades catalticas (Biolinker, 2008). En el hombre la -amilasa est presente en el pncreas (aproximadamente 200 mg/kg), glndulas salivales, hgado, msculo, tejido adiposo, saliva, sangre, orina, heces, leche, semen, rin, cerebro, pulmn, trompas de falopio, intestino, bazo y rin (Biolinker,2008). Los inhibidores de la - amilasa se encuentra en algunas variedades de plantas como en el frjol (Phaseolus vulgaris) , siendo parte de su composicin natural. Por esta razn muchas plantas con similares componentes son utilizadas como inhibidores, siendo complementos en los tratamientos contra la diabetes y la obesidad. El mecanismo de accin del inhibidor de la alfa amilasa se basa en la disminucin de la digestin del almidn, mediante un bloqueo del sitio activo de la enzima (Rodrguez, 2012). 4. Datosa.- Determinacin de la curva de calibracin

Cuadro 1: Datos para la curva de calibracin[S] (%)Absorbancia (=540nm)

0.10.002

0.250.004

0.50.032

0.750.037

10.042

Lecturas de absorbancia obtenidas a una longitud de 540 nm (columna derecha) para las concentraciones de 0.1 ,0.25, 0.75 y 1 % de almidn (columna derecha).

Grfico 1: Curva de calibracin para las concentraciones de 0.1 ,0.25, 0.75 y 1 % almidn. Grfico y ajuste realizado en Microsoft Excel

b.- Determinacin de las velocidades iniciales sin inhibidor

Cuadro 2: Absorbancias medidas sin inhibidor Tiempo (min)Concentracin de sustrato [S] (%)

0.10.250.50.751

50.150.2080.2920.3820.479

100.2440.3340.3990.4970.59

150.310.4450.60.7240.829

Absorbancias medidas a partir de la solucin de enzima y las diferentes concentraciones de sustrato (0.1, 0.25, 0.5, 0.75 y 1) a diferentes tiempos de incubacin (5 ,10 y 15)

Cuadro 3: Concentraciones Residuales Tiempo(min)Concentraciones de [0.1](g/ml)Concentraciones de[0.25] (g/ml)Concentraciones de [0.5](g/ml)Concentraciones de [0.75](g/ml)Concentraciones de [1](g/ml)

53.0614.2455.9597.7969.776

104.9806.8168.14310.14312.041

156.3279.08212.24514.77616.918

Las concentraciones de los residuales se calcularon a partir de la Ley de Beer a= [c]*E*l, donde a= absorbancia, E= coeficiente de extincin molar, l = espesor de la cuba (1 cm) y [c]= concentracin del residual; en este caso como no se tena conocimiento del coeficiente de extincin molar se tomo a la pendiente de la de la curva de calibracin como tal, E=0.049 (g-1*cm-1) ()

Grfica 2: Las pendientes de las rectas generados por la linealizacion en la grfica concentracin residual vs el tiempo de incubacin determinan las velocidades iniciales para la reaccin catalizada por la enzima(segun). Grfico y ajuste realizado en Microsoft Excel

[S] (%)V(g/min)

0.10.327

0.250.484

0.50.629

0.750.698

10.714

Cuadro 4: Velocidades iniciales para la reaccin sin inhibidor (Io)

Las velocidades iniciales (columna derecha) son las pendientes de las rectas generadas por la linealizacin de la concentracin residual vs tiempo de incubacin, en la columna izquierda se presentan las concentraciones de almidn (0.1, 0.25, 0.5, 0.75 y 1)

c.- Determinacin de las velocidades iniciales con inhibidor al 25% (I1)

Cuadro5: Absorbancias medidas con inhibidor al 25% (I1)Tiempo (s)Concentracin de sustrato [S] (%)

0.10.250.50.751

50,6920,810,8590,9031,068

100,7930,8430,9891,1841,218

150,8351,0361,1411,2311,401

Absorbancias medidas a partir de la solucin de enzima, sustrato (0.1, 0.25, 0.5, 0.75 , 1) e inhibidor (25%) a diferentes tiempos de incubacin (5 ,10 , 15)

Cuadro 6: Concentraciones Residuales Tiempo(min)Concentraciones de [0.1](g/ml)Concentraciones de[0.25] (g/ml)Concentraciones de [0.5](g/ml)Concentraciones de [0.75](g/ml)Concentraciones de [1](g/ml)

514,12244916,530612217,530612218,428571421,7959184

1016,183673517,204081620,183673524,163265324,8571429

1517,040816321,142857123,285714325,12244928,5918367

Las concentraciones de los residuales se calcularon a partir de la Ley de Beer a= [c]*E*l, donde a= absorbancia, E= coeficiente de extincin molar, l = espesor de la cuba (1 cm) y [c]= concentracin del residual; en este caso como no se tena conocimiento del coeficiente de extincin molar se tomo a la pendiente de la de la curva de calibracin como tal, E=0.049 (g-1*cm-1) ()

Grfica 3: Las pendientes de las rectas generados por la linealizacion en la grfica concentracin residual vs el tiempo de incubacin determinan las velocidades iniciales para la reaccin catalizada por la enzima (segun). Grfico y ajuste realizado en Microsoft Excel

Cuadro 7: Velocidades iniciales para la reaccin con inhibidor (I1)

[S] (%)V(g/min)

0.10,291

0.250,46

0.50,58

0.750,67

10,68

Las velocidades iniciales (columna derecha) son las pendientes de las rectas generadas por la linealizacin de la concentracin residual vs tiempo de incubacin, en la columna izquierda se presentan las concentraciones de almidn (0.1, 0.25, 0.5, 0.75 y 1)

d.- Determinacin de las velocidades iniciales con inhibidor al 50% (I2)

Cuadro 8: Absorbancias medidas con inhibidor 50%( I2)Tiempo (s)Concentracin almidn [S]

0.10.250.50.751

50,7820,9891,241,4081,53

100,8321,121,421,591,767

150,9051,1941,5051,721,859

Absorbancias medidas a partir de la solucin de enzima, sustrato (0.1, 0.25, 0.5, 0.75, 1) e inhibidor (50%) a diferentes tiempos de incubacin (5, 10, 15)

Cuadro 9: Concentraciones Residuales

Tiempo(min)Concentraciones de [0.1](g/ml)Concentraciones de[0.25] (g/ml)Concentraciones de [0.5](g/ml)Concentraciones de [0.75](g/ml)Concentraciones de [1](g/ml)

515,95920,18425,30628,73531,224

1016,98022,85728,98032,44936,061

1518,46924,36730,71435,10237,939

Las concentraciones de los residuales se calcularon a partir de la Ley de Beer a= [c]*E*l, donde a= absorbancia, E= coeficiente de extincin molar, l = espesor de la cuba (1 cm) y [c]= concentracin del residual; en este caso como no se tena conocimiento del coeficiente de extincin molar se tomo a la pendiente de la de la curva de calibracin como tal, E=0.049 (g-1*cm-1) ()

Grfica 4: Las pendientes de las rectas generados por la linealizacin en la grfica concentracin residual vs el tiempo de incubacin determinan las velocidades iniciales para la reaccin catalizada por la enzima (segun). Grfico y ajuste realizado en Microsoft Excel

Cuadro 10: Velocidades iniciales para la reaccin con inhibidor (I2)

[S] (%)V(g/min)

0.10.251

0.250.418

0.50.540

0.750.6367

10.671

Las velocidades iniciales (columna derecha) son las pendientes de las rectas generadas por la linealizacin de la concentracin residual vs tiempo de incubacin, en la columna izquierda se presentan las concentraciones de almidn (0.1, 0.25, 0.5, 0.75 y 1)

Cuadro 11: velocidades iniciales para las reacciones enzimticas

[S]V-IoV-I1V-I2

0,10,330,2910,251

0,250,480,460,42

0,50,630,580,54

0,750,70,670,64

10,710,680,67

Las velocidades inciales para cada tratamiento dependientes de la concentracin de sustrato se resumen en el cuadro 11

Grfico 5: Curva de progresin de la actividad enzimtica, cuyos datos se muestran en el cuadro 11, como se observa la actividad enzimtica de cada tratamiento va disminuyendo a partir de la curva sin inhibidor (Io- azul) ,seguida de la reaccin con inhibidor al 25% (I1-tomate) y finalmente la curva con inhibidor al 50% (I2-gris)

e.- Determinacin de parmetro cinticos Vmax y Km mediante el mtodo de Dobles Inversos

Cuadro12: Valores inversos de la concentracin de sustrato y velocidades 1/[S]1/V-Io1/V-I11/V-I2

10,0003,0303,4363,984

4,0002,0832,1742,381

2,0001,5871,7241,852

1,3331,4291,4931,563

1,0001,4081,4711,493

Se presenta los valores inversos de la concentracin de sustrato y las velocidades iniciales para cada uno de los tratamientos planteados: sin inhibidor (Io), con inhibidor al 25%(I1) y con inhibidor al 50% (I2)

Grfico 6: Linealizacion por el mtodo de doble inversos para cada tratamiento planteado: sin inhibidor (Io-azul), con inhibidor al 25%(I1-tomate) y con inhibidor al 50% (I2-gris).

Cuadro 13: Ecuaciones LinealesTratamientoEcuacin lineal

I0Y1 = 0,1827x + 1,2376

I1Y2 = 0,2198x + 1,2536

I2Y3 = 0,2756x + 1,2437

Ecuaciones lineales para cada tratamiento planteado: sin inhibidor (Io-azul), con inhibidor al 25%(I1-tomate) y con inhibidor al 50% (I2-gris).

Y1 = 0,1827x + 1,2376

0.1476 Y2 = 0,2198x + 1,2536

0.1753

Y3 = 0,2756x + 1,2437

0.2215

Como Vmax es constante y Km aumenta se deduce que la inhibicin es competitiva

1. DISCUCIN

En la presente prctica se utilizo una muestra de Uvilla (Physalis peruviana), planta que segn Rodriguez(2012) posee una sustancia que actua como inhibidor de la alfa amilasa presente en la saliva. La prctica mostro resultados coherentes que concuerdan con una inhibicin competitiva ya que el km de cada uno de los ensayos aumento mientras que la velocidad mxima se mantuvo constante, concordando con Munim (2012) que apunta la presencia de inhibidores competitivos en plantas de este tipo. Aunque los datos obtenidos en la ecuaciones no fueron exactos, variando en decimales, lo cual segn lo consultado en el Boletn de producto qumico(2014) puede deberse a la exactitud con la que se tomo el tiempo o fallas humanas a la hora de calcular el inhibidor o la enzima.Segn Rodriguez(2012), son los fenoles presentes en la planta los que actan como inhibidores, hecho que no pudimos comprobar en nuestro ensayo, ya que aunque se demostr que el extracto posee capacidad inhibitoria, para determinar el tipo de sustancias se necesitaran otras pruebas como por ejemplo la prueba de cloruro ferrico para determinar la presencia de fenoles. 2. CONCLUSIONES La velocidad mxima calculada para los 3 ensayos fue de 0,80 gr/min, mientras que los km obtenidos fueron para I0=0.14, I2=0.17 y I3=0.22 gr/ml. El extracto obtenido de la planta muestra una inhibicin competitiva, lo que se pudo demostrar al realizar los clculos que indican un aumento en el km pero una velocidad mxima constante

3. RECOMENDACIONES Se deben obtener plantas frescas para realizar el ensayo, debido a que el mal almacenamiento de la misma puede arrojar resultados confusos. En el caso de almacenar las muestras, estn deben ser maceradas en agua o etanol para despus mantenerse en refrigeracin para evitar la oxidacin de las muestras4. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Munim, A(2013). Screeaninf of Glucosidase inhibitory activity of some Indonesian medicinal plants. University of Indonesia. West Java.Indonesia Rodrigez, M.(2012).Extraccin y purificacin de la alfa amilasa de diferentes variedades mejoradas de frijol .Universidad Autnoma de Queretaro, Mxico Df, Mxico. Recuperado el 05/06/2014 dehttp://ri.uaq.mx/bitstream/123456789/653/1/RI000266.pdf Recuperado el 05/06/2014 de http://www.revistaciencia.uat.edu.mx/index.php/CienciaUat/article/view/6/9 Grupo Alere. Boletn de producto qumico (2014). Biolinker. Recuperado el 05/06/2014 de: http://www.alere.com.ar/productos/PDF_BIO/boletines/boletin-05-amilasa.pdf Recuperado el 05/06/2014 de http://www.slideshare.net/yuricomartinez/determinacion-cuantitativa-de-la-actividad-enzimatica-del-preparado Espectrofotometro:http://www4.ujaen.es/~pedrajas/Espectrofotometria.swfUniversidad de jaen.

Universidad del pas Vascohttp://www.uprm.edu/biology/profs/velez/cinetica.htm determinacin de velocidades

Tesis sobre la inhibicon a la alfa amilasa y sus inbibidores en frejol http://ri.uaq.mx/bitstream/123456789/653/1/RI000266.pdf