INFORME DE LABORATORIO

MICROBIOLOGÍA

Regina Gutiérrez Villegas ID 00027312

Luis Javier Rojas García ID 000297039

Juan Carlos Pino Vallecilla ID 000

Laura Marcela Trujillo Vargas

DOCENTE

PROGRAMA MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA

UNIVERSIDAD PONTIFICIA BOLIVARIANA

MEDELLÍN COLOMBIA

2015

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos en general tienen la posibilidad de crecer en los más

diversos ambientes, dado el potencial metabólico y la capacidad respiratoria.

En esta práctica de laboratorio se trabajó con la levadura Sacchharomyces

cerevisiae, la cual es capaz de asimilar una gran variedad de monosacáridos.

También puede hidrolizar y consumir algunos carbohidratos mayores, como la

sacarosa, maltosa, rafinosa, maltotriosa y pectina, pero carece de las enzimas

necesarias para utilizar la lactosa, el glucan y el almidón. Los carbohidratos

asimilados son degradados y oxidados durante el catabolismo a través del ciclo de

la Glucólisis (o vía Embden-Meyerhof-Parnas). La levadura aprovecha la energía

liberada de cada mol de glucosa: para formar dos moles de ATP y la usa en la

etapa anabólica. (Madigan, et al)

Para medir su actividad frente a los diferentes sustratos de la levadura se emplea

un equipo para determinar la biodegradabilidad de sustancias nutritivas,

impurezas, contaminantes o residuos mediante la actividad microbiana, se realizan

a menudo las denominadas mediciones de la respiración (= mediciones del

agotamiento). En estas pruebas se determina en condiciones definidas la

respiración de los organismos, medida como absorción de oxígeno o generación

de dióxido de carbono. Las mediciones se realizan mediante sistemas cerrados

con OxiTop®-C y el Controlador OC 110.

Por otro lado se realizó la determinación de proteína en muestras de tusa de

maíz inoculadas con el hongo Pleurotus Pulmonaris correspondientes a 0 dias , 5

días, 10 días , 12 días , 15 días y a 20 días , de inoculación, se realizó una curva

de calibración.

Se llevaron a cabo dos practicas más que fueron una tinción de gram y un

aislamiento microbiológico en medios: agar nutritivo y agar PDA, solo como

practicas demostrativas para aprender el procedimiento.

METODOLOGIA

Practica Nᵒ 1

Materiales y equipos

Levadura Saccharomyces cervisiae Agua destilada Azúcar Jugo de mango criollo Jugo de uva Equipo Oxitop NaOH Magnetos Balanza electrónica Beaker

Probeta

Fundamento

Como se dijo en la introducción se va a realizar una prueba que consiste en

observar el crecimiento de la Sacaromyces cereviciae en varios tipos de sustrato,

empleando para esto el equipo del OXITOP, el cual permite determina en

condiciones definidas, la respiración de los organismos medida como absorción

de oxígeno o generación de dióxido de carbono, este última será la que

emplearemos.

Se preparan 5 muestras así:

Levadura activada 22 ml + agua 200 ml + azúcar 5 grs azucar

Levadura activada 22 ml + agua 200 ml

Levadura activada 22 ml + jugo de uva 200 ml

Levadura activada 22 ml+ jugo de mango 200 ml

Levadura activada 22 ml + jugo de mango 200 ml + azúcar 5 grs

Las muestras preparadas son llevadas a los frascos correspondientes previamente

marcados.

Se introduce 200 ml de la cantidad de muestra problema más 22 mililitros del

levadura activada ( se activa en 100 ml de agua , 5 grs de azúcar y 1 grs de

levadura la cual se activa a una temperatura de 30 ᵒC), el inoculo en la solución

debe tener una concentración del 10% en porcentaje V/V y como se tienen 200mL

de cada medio de cultivo, por medio de un análisis de conversión se realiza un

cálculo obteniendo que se debe adicionar 22 mL de inoculo (Levadura activada)

en cada medio de cultivo a cada una de las muestras y se introducen en botellas

ámbar. Dentro de la botella ámbar se introduce magneto para que realice

agitación constante.

El orden en que se introducen es el siguiente:

1. Muestra problema

2. Inoculo de la levadura activada

3. El magneto en el fondo de la botella, verificar que esté funcionando

perfectamente

4. Al chupón negro se le agregan 3 pastillas de NaOH

5. Cerrar con el cabezote

Una vez montadas las muestras en las botellas se procede a la programación del

controlador. Una vez programadas se llevan a la Plataforma de agitación a una

temperatura de 25° - 35°C, asegurándose que esté en continua agitación. Para

que registre la actividad dentro de las botellas durante siete días.

FOTOS DE MONTAJE DEL ENSAYO EN EL OXITOP

Botellas listas con la muestra problema y marcadas

Programación del cabezote de cada botella

Incubación de las muestras por 7 días

Practica Nᵒ2

Determinación de proteína por el método de Biuret

Fundamento

El nombre de la reacción procede del compuesto coloreado formado por la

condensación de dos moléculas de urea con eliminación de amoníaco. Reacción

del Biuret

Si una solución fuertemente alcalina de sulfato cúprico (CuSO4) se añade a una

solución de proteína se forma una complejo entre el ion cúprico y los enlaces

peptídicos, con aparición de una coloración violeta-púrpura, que presenta un

máximo de absorción a 540 nm.

Las características más importantes de la reacción son:

La reacción del Biuret se aplica, a partir de los tetrapéptidos, a todos los

péptidos y proteínas.

Su rango de determinación es de 1 a 6 mg/ml.

No depende de la composición de aminoácidos. · Algunos compuestos

(NH4 + , Tris, etc.) dan la reacción

Violeta-púrpura Complejo proteína-Cu(II)

Consultado en (Bradford MM 1976)

MATERIALES Y EQUIPOS

Cultivos de PLeurotus pulmonarius de 0 dias , 5 dias, 10 dias , 12 dias , 15 dias y a 20 dias

Buffer FOSFATO – NaCl pH=8.5mM. (Frio) Balanza electrónica. Erlenmeyer. Agitador. Filtro de papel. Embudo de filtración. Soporte metálico para montaje de filtración. Beaker pequeño. Reactivo de Biuret. Micropipetas y puntas. Pipetas y bomba de succión. Albumina Suero bovino: solución 10g/l. Tubos de ensayo con tapas. Espectrofotómetro (Shimadzu UV – 1601PC.). Computador.

PASOS

A. Extracción de la proteína

a. Para llevar a cabo la extracción de la proteína se procede a emplear un Buffer ( fosfato – NaCl, pH=8 ,50 mM, debe estar frio para obtener mejores resultados)

b. Se pesa 1,5 grs de la muestra( cultivo del hongo Pleurotus Pulmonaris en tusa de maíz a (nosotros nos tocó la muestra de 15 días de incubación) Se le adicionan 20 ml de buffer frio y se deja macerar agitando por 60 minutos a 150rpm ( en la plataforma de agitación), también se puede macerar la muestra con un mortero., y luego se agita

c. Filtrar la muestrad. Guardar el filtrado para hacer la lectura por el método de Biuret

FOTOS DEL MONTAJE DE LA PRUEBA DE DETERMINACION DE PROTEINAS ( METODO BIURET)

Muestras del cultivo del hongo Pleurotus Pulmonaris en tusa de maíz

Frascos en los que se llevo a cabo la extracción de la proteína antes de Adicionar el buffer

Muestras en agitación para extraer la proteina

Filtración de la muestra para obtener el buffer con la proteina

Filtrados obtenidos

B. Determinación de la proteína por método colorimétrico

Esta prueba se realiza en dos partes:1. Obtener la proteína del cultivo del hongo ( ya se realizó en el

paso A)2. Realizar una curva de calibración

Para este método se empleó el reactivo de Biuret el cual se prepara así:

a. Solución estándar de Biuret (reactivo A) se prepara con

CuSO4 . 5 H2O ( Carlo Erba) 1,5 grsEDAT (MOL LABS) 6,0grsKL ( Carlo Erba) 1,0grsNa(OH) (2.5 N )( Merck) 300 ml

b. Solución de Albumina de suero bovino ( 10g/lit para la curva de calibración. (Reactivo B)

La curva de calibración

Número del tubo ReactivosTubo 1 8 ml de A

2 ml de B0 ml de H2O

Tubo 2 8 ml de A1.6 ml de B0,4 ml de H2O

Tubo 3 8 ml de A1.2 ml de B0,8 ml de H2O

Tubo 4 8 ml de A0,8 ml de B1,2 ml de H2O

Tubo 5 8 ml de A0,4 ml de B1,6 ml de H2O

Tubo 6 8 ml de A0.2 ml de B1,8 ml de H2O

Tubo 7 8 ml de A0 ml de B2 ml de H2O

FOTOS DE LA PREPARACION Y LECTURA DE LA

CURVA DE CALIBRACION

PREPARACION DE LAS MUESTRAS

Las muestras se preparan adicionando 8 ml del reactivo de Biuret y 2 mil de muestra que contiene el extracto proteico se deja reposar media hora para leerlo en el espectrofotometro

Luego de prepararlos se mezclan bien con el Vortex y se dejan reposar por 30 minutos en el Shaker.

Muestras listas para la lectura

Aquí se evidencia el momento de la lectura

En este momento se ve en el computador como se genera la curva de calibración.

RESULTADOS PRACTICA CRECIMIENTO MICROBIANO

El OXITOP hace alrededor de 199 determinaciones de CO2, con cuyos datos se construye la curva de crecimiento. Por lo que la tabla de datos no se anexa en el caso de las curvas de crecimiento

CASO 1 GRAFICA DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CON AGUA DESTILADA

Se observa una gráfica en la cual el crecimiento de la levadura se da de forma inmediata sin pasar por la fase lag , pasa a la fase logarítmica o cremiento acelerado hasta las 53,48 horas ( 2 días aproximados) de fermentación , con una concentración de CO2 de 400, luego la concentración de CO2 tiene una caída leve disminuyendo a 377 ppm a las 73,888 horas osea a los 3,07 días aproximadamente, la concentración de CO2 nuevamente se incrementa a 400 ppm, en ese mismo día osea a las 89,44 horas que corresponde a ( 3,78 días) de fermentación para ser más precisos y continua aumentando sin presentar fase estacionaria , continua entonces su proceso fermentativo hasta los 6,44 días en

que se detiene la

fermentación para realizar las lecturas correspondientes , con una concentración de CO2 final de 515 ppm

CASO 2 GRAFICA DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CON AGUA DESTILADA MAS AZUCAR

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000

100

200

300

400

500

600 Levadura sin Azúcar

Tiempo

Conc

entr

ació

n CO

2

C

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000

100

200

300

400

500

600Levadura + Azúcar

Tiempo

Conc

entr

ació

n CO

2

Se observa una gráfica en la cual el crecimiento de la levadura se evidencia en forma inmediata ya que a los 46 minutos ya observa una concentración de CO2 de 5,6 ppm, sin embargo a las 9,33 horas aproximadamente hasta las 10,88 horas se detiene su crecimiento, esto se evidencia en que la concentración de CO2 este tiempo se mantiene en 59,1 ppm, el crecimiento continua en forma lenta y se normaliza a las 18,66 horas con una concentración de 78,8 ppm, a partir de este momento crece en forma acelerada y a las 56,44 horas alcanza una concentración de CO2 de 400ppm , sin embargo entre estos instantes y las 70,77 horas , la levadura sufre una leve esta de crecimiento que sin ser estacionaria , es muy lento temiendo a veces lecturas en la concentración de CO2 , de disminución y aumento en forma muy leve, luego se normaliza y reinicia una fase de crecimiento acelerado hasta obtener a los 6,44 días una concentración final de CO2 , de 537 ppm

CASO 3

GRAFICA DE CRECIMIENTO DE LA LEVADURA CON JUGO DE MORA

0 20 40 60 80 100 120 140 1600

50

100

150

200

250

300

350

Jugo de mora y levadura

Tiempo

Conc

entr

ació

n CO

2

En esta grafica se observa que la levadura inicia su crecimiento en forma inmediata osea sin pasar por la fase lag llegando al máximo de producción de CO2

que fue de 301 ppm a los 5,08 días y a los 6,44 día inicia fase de decrecimiento o muerte celular

RESULTADOS PRACTICA DETERMINACION DE PROTEINA

Datos iniciales

Concentración inicial (C1)= 10 g/L

Volumen inicial (V1)= 2 ml =0.002 L

Volumen final (V2)= 10 ml = 0.01 L

Se debe hallar la concentración final (C2) para cada una de ellas, y se hizo la siguiente operación:

C1.V1 = C2 X V2

Despejamos la concentración final que es la que no conocemos y nos quedó:

C2= C1 X V1/ V2f

Reemplazamos los valores y se obtiene el resultado para cada una de ellas.

Se leyó en el espectrofotómetro (Shimadzu UV- 1601PC)(a una longitud de onda de 540 nm). Se realizó la curva de absorbancia Vs concentración.

0 50 100 150 200 2500

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

f(x) = 0.00233029010238908 x + 0.168745733788396R² = 0.954805385737726

Concentración (ppm)

Abs

Curva de calibración

En el eje X se anotan los datos de la concentración de proteína En el eje Y se anota la absorbancia (ppm).

DATOS CURVA DE CALIBRACION

CONCENTRACION (PPM) ABS

200 0,616160 0,52120 0,503

80 0,34240 0,293

20 0,2390 0,113

Volumenes C2

2 200

1,6 160

1,2 120

0,8 80

0,4 40

0,2 20

0 0

0 5 10 15 20 250

10

20

30

40

50

60

Contenido proteina Pleurotus P + Tusa Maiz

Dias

Canti

dad

de P

rote

ina

DATOS LECTURA DE LAS MUESTRAS CON Peorotus. ps.

C1 1000 ppmV2 10 ml

DIAS CONCENTRACION

0 21,8695652

5 19,6956522

10 28,826087

12 41,8695652

15 52,7391304

20 56,6521739

ANALISIS DE RESULTADOS

PRACTICA 1 CRECIMIENTO MICROBIANO EVALUADO CON EL OXITOP

Las fuentes de carbono utilizadas por las levaduras varían desde los carbohidratos

hasta los aminoácidos. Además, la capacidad de utilizar ciertos tipos de azúcares

ha sido tradicionalmente empleada para la caracterización de las distintas razas

que esta especie presenta. Entre los azúcares que puede utilizar están

monosacaridos como la glucosa, fructosa, manosa y galactosa, entre otros.

También son capaces de utilizar disacáridos como la maltosa y la sacarosa y

trisacáridos como la rafinosa. Uno de los azúcares que no puede metabolizar es

la lactosa, utilizándose este azúcar para distinguir esta especie de Kluyveromyces

lactis. También es capaz de utilizar otras fuentes de carbono distintas a

carbohidratos y aminoácidos. Entre las más destacadas se encuentra la capacidad

de utilizar tanto etanol como glicerol. Por norma general, las levaduras mantienen

dos tipos de metabolismo muy bien diferenciados. Por una parte, en condiciones

en las que existen altas concentraciones de glucosa, fructosa o maltosa, la

tendencia es a realizar una fermentación alcohólica de estos, es decir, se realiza

la glucólisis y posteriormente se forma etanol. Una vez que estos azúcares

escasean, se produce la respiración del etanol, vía ciclo de Krebs. Evolutivamente

esto es un proceso que, a priori, no es ventajoso por ser energéticamente

desfavorable para la reproducción del organismo, dado que se obtiene mucha

menos energía en el primer proceso que en el segundo. No obstante, la gran

mayoría de los organismos son muy sensibles al etanol, por lo que se ha

entendido como un proceso de competencia por sustrato. Las levaduras, además

de necesitar una fuente de carbono, necesitan tanto fuentes de nitrógeno —como

podrían ser el amonio, la urea o distintos tipos de aminoácidos— como fuentes de

fósforo. Además, son necesarias vitaminas como la Biotina, también

llamada Vitamina H, y distintos elementos traza (Feldmann G.J., 2005 )

CASO 1

En la gráfica que representa el crecimiento de la S. cereviciae en agua destilada ,

se observa un crecimiento que no es coherente con el medio de cultivo en el que

se encuentra la levadura, obviamente el inoculo de levadura viene con azúcar

blanca osea sacarosa, con esta azúcar se activa la levadura , pero ingresa a un

medio sin ningún nutriente ni minerales ( agua destilada) , no debería presentar un

crecimiento como el que muestra, este fenómeno se podría explicar desde el

punto de vista de que como tantos participamos en la preparación de la prueba

pudo incurrirse en un error y se le adiciono azúcar en más poca cantidad o la

levadura con el azúcar del inoculo tuvo suficiente para crecer y dar la gráfica que

se presenta en este momento.

CASO 2

En la gráfica del crecimiento de la levadura con agua destilada y azúcar se

observa un crecimiento coherente con los nutrientes del medio , también se

observa que la levadura no pasa por la fase lag , esto quizás se deba a que ya

viene acondicionada al sustrato ya que se activó en un sustrato similar y continua

su crecimiento hasta agotar los nutrientes que trae al ser inoculada en el medio ,

una vez los finaliza continua con la sacarosa del medio para lo cual debe iniciar

con desdoblar esta molécula para poder reiniciar su proceso de crecimiento, de

ahí esa pequeña parte de la curva que semeja una fase lag , este mismo

fenómeno parece ocurrir en la gráfica del caso 1 ( levadura con agua) , pero no tan

pronunciada .

CASO 3

En la gráfica del crecimiento con jugo de mora se observa un crecimiento normal

de la levadura en el jugo de mora, es importante recordar que la mora posee

varios azucares como se pueden (ver en la tabla) con un crecimiento acelerado sin

pasar por la fase lag ya que venía al igual que en los otros dos casos analizados,

activada, los azucares de la mora son fácilmente metabolizados por levadura de

allí su crecimiento tan acelerado , entra en fase estacionaria y de muerte a una

concentración de 300ppm , debido quizás a :

Disminución de los nutrientes

Metabolitos tóxicos de su proceso metabólico concentrados en el medio de

cultivo

Cambio de ph del medio por la fermentación

La siguiente tabla muestra una lista de la cantidad de hidratos de carbono simples de la mora:

Nutriente Cantidad Nutriente CantidadAzúcar 6,24 g. Lactosa 0 g.Fructosa 3,11 g. Maltosa 0 g.Galactosa 0 g. Oligosacaridos 0 g.Glucosa 2,96 g. Sacarosa 0,17 g.

Fuente: On line http://alimentos.org.es/calorias-mora

ANALISIS GRAFICA RECUENTO DE PROTEINA METODO BIURET

TABLA DE CALIBRACION

El error presentado por la curva de calibración, se debió a que muchos

colaboramos en elaborar la muestras problema de allí que el factor de error

humano fuese tan alto.

Al analizar los resultados de las muestras con Pleorotus p, desde los cero días

hasta los 10 observamos que, el Pleorotus p, encuentra en una fase lag , de ahí

en adelante sigue con su proceso de crecimiento presentado la fase logarítmica no

se evidencia que hubiese llegado ya a la fase estacionaria o de muerte celular,

con las muestras analizadas

CONCLUSIONES

Sería interesante evaluar como es el crecimiento de la levadura en

ausencia de nutrientes

De los tres medios evaluados se evidencia mejor crecimiento de la levadura

en presencia de agua con azúcar.

Para el trabajo con curvas de calibración es importante minimizar al máximo

el número de personas que realizan el montaje de las muestras y la lectura

de los resultados, de esta forma se maneja un margen de error menor.

La tusa de maíz , parece ser un sustrato bueno para el crecimiento de

Pleorotus p, aun que es necesario hacer más evaluaciones.

BIBLIOGRAFIA

Ugarte M. V., Tesis para maestría obtención y caracterización de cepas de

Saccharomyces cerevisiae superproductoras de glutatión

Willey, J.M., Sherwood, L.M., Woolverton C. J. (2008) Microbiologia 7ma

edicion, la curva de crecimiento pag 123

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2015

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http://www.biotek.com/assets/tech_resources/SynergyH1_Yeast_Growth_A

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Saccharomyces cerevisiae. On line 2015 :

http://www.genetics.org/content/190/4/1157.full 3)

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cerevisiae: The Yin and Yang of trehalose. On line 2015 .

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2015 :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19246112 5)

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del 2013. Disponible on-line en:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1213157

Madigan T., Michael, Martinko M., Jhon, Parker, Jack. Brock Biología de los

microorganismos. Pearson Prentice Hall. Décima edición. p: 957-985

Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of

microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.

Anal Biochem. 72: 248-254.

Feldmann G.J., 2005. Levaduras y biotecnología pag 26-44