Universidad de La Salle Universidad de La Salle

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Ingeniería de Alimentos Facultad de Ingeniería

1-1-2016

Incorporación de nisina encapsulada en alginato de calcio y Incorporación de nisina encapsulada en alginato de calcio y

lactosuero en un queso campesino lactosuero en un queso campesino

Adriana Marcela Rodríguez Delgado Universidad de La Salle, Bogotá

Yessica Tatiana Plazas Paredes Universidad de La Salle, Bogotá

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Citación recomendada Citación recomendada Rodríguez Delgado, A. M., & Plazas Paredes, Y. T. (2016). Incorporación de nisina encapsulada en alginato de calcio y lactosuero en un queso campesino. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/ing_alimentos/45

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UNIVERSIDAD DE LA SALLE

FACULTAD DE INGENIERÍA

Programa de Ingeniería de Alimentos

Incorporación de nisina encapsulada en alginato de calcio y lactosuero en un queso

campesino.

Autoras: Adriana Marcela Rodríguez Delgado

Yessica Tatiana Plazas Paredes

Dirigido por: Ángela Marcela Urbano Ramos

Codirector: Alfredo López Molinello

BOGOTÁ D.C

Agosto, 2016

Durante este tiempo ha habido muchas personas que me han ayudado y apoyado a realizar

este trabajo es por eso que quiero expresarles a todos mis agradecimientos.

En primer lugar, quiero agradecer a Dios por guiarme cada día en mi camino e iluminarme y

llenarme de la sabiduría para poder afrontar cada obstáculo de mi vida.

A mi familia por estar a mi lado en cada momento de mi vida siempre he encontrado un

apoyo en cada uno de ustedes. Especialmente a mi madre, a mi padre y a mi hermano quienes no

solo han sido mi ejemplo a seguir y me han brindado todo el amor de la familia a la cual amo,

sino que también desde un principio me han animado a seguir mis sueños y me han dado la

fuerza necesaria para seguir luchando por ellos.

A Camilo quien durante todo este proceso estuvo presente aguantando todos mis estados de

ánimo y me acompaño durante las largas noches de estudio.

A Yessica Plazas por su compromiso y dedicación en la realización de este trabajo.

Este nuevo logro es en gran parte gracias a todos ustedes; he logrado concluir con éxito un

proyecto que en un principio parecía bastante complejo e interminable. Quisiera dedicar mi tesis

a ustedes.

Adriana Rodríguez Delgado

En esta ocasión quiero agradecer

Antes que nada a Dios por permite llegar a este punto, por permitirme culminar una de la

etapas más grandes de mi vida, por guiar cada uno de mis pasos y brindarme la sabiduría

necesaria para llegar hasta acá.

A mis padres quiénes han sido parte esencial en el transcurso de este tiempo.

A mi papá por su dedicación y compromiso.

A mi mamá quién ha sido el ejemplo perfecto de persistencia y fortaleza, por su compañía y

apoyo incondicional, porque aparte de mamá ha sido mi mejor amiga y consejera, por su amor

inmenso amor, el cual me ha impulsado a seguir y nunca desistir.

A mi hermano quien ha sido un gran compañero de vida, por su amor que a su manera

siempre me brindo.

A ellos tres, mis padres y mi hermano por su paciencia ante mi difícil carácter y estresantes

momentos.

A mis tías y especialmente a mi tío quienes con su apoyo contribuyeron a culminar

satisfactoriamente esta etapa de mi vida.

A Adriana Rodríguez por su compromiso, entrega y contribución para llevar a cabo este

trabajo.

Finalmente quiero dedicar este gran logro a mi ángel de la guarda, a mi abuelo Gabino

porque aun, sin estar presente sé que desde donde esta acompaño cada uno de mis pasos dados a

lo largo de este camino.

Gracias a todos ellos y a los que no nombro pero hicieron parte de esta etapa de mi vida y de

este gran logro.

Yessica Plazas Paredes

Finalmente queremos expresar nuestros más sinceros agradecimientos a

A la Universidad de La Salle quien nos abrió las puertas permitiéndonos dar inicio a tan

grande logro que ya culmina.

A nuestra directora Ángela Urbano y codirector Alfredo López, quienes a través de sus

valiosos conocimientos nos permitieron realizar esta tesis, por el tiempo invertido, por su

paciencia y dedicación constante para concluir de manera satisfactoria esta investigación.

Al programa de Ingeniería de Alimentos, los directivos, docentes y todo el personal

administrativo que contribuyo de una u otro forma al desarrollo de este trabajo.

A cada uno de los laboratoristas, por el apoyo y conocimiento transmitido, la paciencia ante las

extensas jornadas de trabajo.

A todos ustedes gracias por su apoyo incondicional.

Adriana Rodríguez Delgado

Yessica Plazas Paredes

TABLA DE CONTENIDO

GLOSARIO

RESUMEN

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

OBJETIVOS

1. MARCO DE REFERENCIA………………………………………………………..……….1

1.1 MARTO TEORICO…………………………………………………………………….….1

1.1.1 Leche y sus características………………………………………………………….…1

1.1.2 Elaboración de quesos frescos………………………………………………………...3

1.1.3 Riesgos microbiológicos de los quesos………………………………………….……4

1.1.3.1 Listeria monocytogenes……………………………………………….….4

1.1.4 Bacteriocinas………………………………………………………………………....6

1.1.4.1 Clasificación………………………………………………………….…..7

1.1.4.2 Nisina como bacteriocina representativa………………………………....9

1.1.5 Encapsulamiento………………………………………………………………….…10

1.1.5.1 Métodos para encapsulación……………………..………………….…12

1.2 Estado del Arte………………………………………………………………………….…15

1.3 Marco Legal………………………………………………………………………….....…19

1.3.1 Decreto 616 de 2006………………………………………………………….………19

1.3.2 Decreto 60 de 2002………………………………………………..………………….20

1.3.3 Resolución 2310 de 1986…………………………………………………………..…20

1.3.4 Resolución 1804 de 1989…………………………………………………………......21

1.3.5 Norma Técnica Colombiana (NTC) 750 Quesos frescos..…………….….………….21

1.3.6 Norma Técnica Colombiana (NTC) 399 Leche Cruda ………..…………………......21

2. METODOLOGIA DE LA EXPERIMENTACIÓN……………………………...……….22

2.1 ETAPA 1: ENCAPSULACIÓN DE LA NISINA EN SOLUCIÓN DE LACTOSUERO Y

ALGINATO DE CALCIO……………………………….……………………………..…….23

2.2 ETAPA 2: ELABORACIÓN DE CAPSULAS POR MEDIO DEL PROCESO DE

LIOFILIZADO…………………………………………………….………….………...…….23

2.3 ETAPA 3: CONCENTRACIÓN Y ELABORACIÓN DE LA CEPA BACTERIANA

Listeria innocua……………………………………………………………….……………...24

2.4 ETAPA 4: ELABORACIÓN DEL QUESO CAMPESINO, INCORPORACIÓN DE

CAPSULAS E INOCULACIÓN DE LA CEPA BACTERIANA…………….…………...…25

2.4.1 Análisis fisicoquímico de la materia prima……….…………….………...….....26

2.4.1.1 Prueba de Reductasa……………………………………...…..…........26

2.4.1.2 Analizador Ultrasónico de leche ECOMILK…………..……….….....26

2.4.2 Elaboración de la cuajada…………….…………………………..…………….26

2.5 ETAPA 5: ELABORACIÓN DE LA PRUEBA SENSORIAL DE LOS DIFERENTES

TRATAMIENTOS ELABORADOS……………………………………………...………….29

2.6 ETAPA 6: SEGUIMIENTO FISICOQUIMICO Y MICROBIOLOGICO DE LOS

DIFERENTES TRATAMIENTOS……………………..…………………….………..……..29

2.6.1 Seguimiento Fisicoquímico………………………………………………….…30

2.6.1.1 Determinación de pH…………………………………………….…….…….30

2.6.1.2 Determinación de Humedad……………………………………………….…30

2.6.1.3 Determinación de Acidez…………………………………………………….31

2.6.1.4 Determinación de Textura…………………………………..……………..…31

2.6.2 Seguimiento Microbiológico……………………………………………….…32

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………………....34

3.1 Caracterización de la leche………………………………………...…………..…34

3.2 Encapsulación de la nisina……………………………………………………….37

3.3 Análisis sensorial del queso campesino…………………………………………….……39

3.4 Seguimiento Fisicoquímico del queso campesino………………………..……...41

3.5 Seguimiento Microbiológico del queso campesino………………………….......49

CONCLUSIONES

RECOMENDACIONES

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

ANEXOS

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Caracterización fisicoquímica de la leche de vaca cruda…………………………..…34

Tabla 2. Caracterización fisicoquímica de la leche de vaca cruda por medio del

ECOMILK……………………………………………………………………………………....35

Tabla 3. Nivel de contaminación de leche cruda, por la prueba de reductasa….………….…..36

Tabla 4. Diámetro promedio de partícula en mm…………………………………………..…..38

Tabla 5. Promedio de calificaciones por atributos sensoriales evaluados y sus

comparaciones……………………………………………..………………………………...….39

Tabla 6. Promedio de los parámetros fisicoquímicos evaluados y sus comparaciones………...42

Tabla 7. Promedio del perfil TPA y sus comparaciones……………..…………………...….....45

Tabla 8. Reporte final de UFC/g en cada tratamiento. ………………………………………...50

Tabla 9. Reporte final de UFC/g en logaritmos para cada tratamiento………………………..50

Tabla 10. Porcentaje de reducción de la flora microbiana respecto a cada tratamiento con base a

la muestra patrón………………………………………………………………………………..51

Tabla 11. Promedio de porcentaje de reducción de la flora microbiana para cada tratamiento con

respecto a la muestra patrón (P)…………………………………………………………………52

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Diagrama de flujo para la elaboración de queso campesino…………………………..3

Figura 2. Clases de materiales de recubrimiento utilizados en el proceso de

encapsulación……………………………………………………………………………….…...12

Figura 3. Producto (cápsulas) obtenido luego del proceso de liofilizado……………….…......24

Figura 4. Producto (cápsulas) obtenido luego del proceso de esterilización……………...……24

Figura 5. Densicheck Biometrix Plus……………………………………………………….….25

Figura 6. Concentración de bacteria obtenida en escala Mc Farland………………………......25

Figura 7. Queso campesino patrón…………………………………………………………..…28

Figura 8. Queso campesino con la incorporación de nisina en forma directa………….………28

Figura 9. T2, Queso campesino con la incorporación de capsulas de nisina (1:1)……….……28

Figura 10. T3, Queso campesino con la incorporación de capsulas de nisina (1:4)…...........…28

Figura 11. Tamaño de partícula T2 vista en microscopio cámara de Neubauer objetivo

X4………………………………………………………………………………………..……..38

Figura 12. Tamaño de partícula T2 vista en microscopio cámara de Neubauer objetivo

X10………………………………………………………………………………………..…….38

Figura 13. Tamaño de partícula T3 vista en microscopio cámara de Neubauer objetivo

X4…………………………………………………………………………………………..…...39

Figura 14. Tamaño de partícula T3 vista en microscopio cámara de Neubauer objetivo

X10……………………………………………………………………………………….…….39

Figura 15. Representación en gráfica radial de los atributos sensoriales evaluados…………..40

Figura 16. Comportamiento del porcentaje de humedad a través del tiempo………………….43

Figura 17. Comportamiento del pH a través del tiempo………………………………….….....44

Figura 18. Comportamiento del porcentaje de acidez a través del tiempo…………………..…44

Figura 19. Comportamiento de la dureza a través del tiempo……………………………..…...46

Figura 20. Comportamiento de la rigidez a través del tiempo………………………...…..…...47

Figura 21. Comportamiento de la cohesividad a través del tiempo………………….………..48

Figura 22. Comportamiento de la fuerza de fractura a través del tiempo…………….………..48

Figura 23. Comportamiento de la elasticidad a través del tiempo……………….………...…..49

Figura 24. Curva de inactivación de la Listeria innocua en los primeros 5 días……………....52

Figura 25. Curva de inactivación de la Listeria innocua a partir del día 5 al 35………………53

INDICE DE ANEXOS

Anexo A. Cuadrado de Pearson para calcular la adición de ácido láctico requerido para la

acidificación del lactosuero………………………………………………………………………69

Anexo B. Ficha Técnica de la Nisina…………………………….………………………………69

Anexo C. Ficha Técnica de la Listeria innocua Seeliger……..………………………………….70

Anexo D. Escala de Mc Farland………………………………………………………………….71

Anexo E. Formato implementado en la prueba sensorial………………….……….……………71

Anexo F. Mediciones del tamaño promedio de las capsulas en mm..……………………..…….72

Anexo G. Resultados obtenidos de la evaluación realizada por el panel sensorial…………..…..73

Anexo H. Resultados obtenidos de la prueba de humedad…………………………………..…..76

Anexo I. Resultados obtenidos de la prueba de pH………………………..…………………….76

Anexo J. Resultados obtenidos de la prueba de acidez……………………………………….…77

Anexo K. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de dureza………….……77

Anexo L. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de cohesividad………….78

Anexo M. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de elasticidad……..…...78

Anexo N. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de gomosidad………….79

Anexo O. Comportamiento de gomosidad a través del tiempo……………….…………….…..79

Anexo P. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de masticabilidad………79

Anexo Q. Comportamiento de masticabilidad a través del tiempo………………………………80

Anexo R. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de fuerza de

fractura………………………………………………………………………………..............…..80

Anexo S. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de adhesividad………….81

Anexo T. Comportamiento de adhesividad a través del tiempo…………………………………81

Anexo U. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de rigidez…………....….81

Anexo V. Resultados obtenido del seguimiento microbiológico………………..………..…..….82

Anexo W. Seguimiento fotográfico del queso a través del tiempo………………………..…..…84

GLOSARIO

Alginato de Calcio: Es la sal de calcio de ácido algínico, que es un carbohidrato natural extraído

por medio alcalino de algas marinas (Avendaño, López, & Palou, 2013). Es un polvo blanco a

amarillento. Es inodora e insípida, insoluble en agua y más orgánica disolvente, difícilmente

soluble en alcohol etílico, se disuelven lentamente en la solución de polifosfato de sodio, carbonato

de sodio y compuesto de calcio.

Bacteriocina: Son polipéptidos antimicrobianos sintetizados ribosómicamente por algunas

bacterias ácido lácticas que pueden ser Gram positivas o Gram negativas, como proteínas

bactericidas activas frente a microorganismos muy relacionados taxonómicamente con la especie

productora, también están las bacteriocinas producidas por las bacterias Gram-positivas,

constituyendo un grupo estructural y función muy heterogéneo y presentando, en general, un rango

de inhibición más amplio.

Encapsulación: Proceso utilizado para la preservación o protección de numerosos ingredientes

comerciales, no solo alimenticios, sino también farmacéuticos químicos y cosméticos.

Listeria monocytogenes: Es un bacilo Gram-positivo, catalasa positiva, anaerobio facultativo,

móvil y no formador de esporas.

Nisina: Grupo de polipéptidos estrechamente relacionados compuesto por 34 aminoácidos, es

producido por ciertas cepas de la bacteria Lactococcus lactis, en la industria alimentaria se conoce

como un conservante, donde su cantidad máxima permitida al ser añadida de forma directa es de

12.5 mg por cada Kg de queso (NTC 750. Productos lácteos:Queso , 2000).

Queso: Es el producto higienizado por coagulación de leche, de la crema de leche, de la crema de

suero, del suero, de la mantequilla, o de la mezcla de algunos o todos estos productos, por la acción

del cuajo u otros coagulantes aprobados.

Queso fresco: Producto higienizado sin madura que después de su fabricación está listo para el

consumo.

Queso madurado: Producto que después de fabricación, permanece un tiempo determinado en

condiciones ambientales apropiadas para que se produzcan los cambios bioquímicos y físicos

característicos de este tipo de quesos.

Queso semimadurado: Producto higienizado que después de su fabricación, se mantiene un

mínimo de 10 días, en condiciones ambientales apropiadas para que produzca los cambios

bioquímicos y físicos característicos de este tipo de quesos.

Suero lácteo: Es el producto residual obtenido a partir de la leche en la elaboración del queso o

la mantequilla.

RESUMEN

La implementación de la tecnología de encapsulación en la elaboración de quesos frescos podría

permitir evaluar la prolongación del efecto de las bacteriocinas como aditivo alimentario buscando

su acción específica sobre la bacteria patógena Listeria monocytogenes. Se propone el uso del suero

lácteo como material encapsulante, permitiendo así aprovechar este subproducto de la industria,

disminuir costos de proceso y minimizar el impacto ambiental que se genera al desecharlo por su

alta Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO) y Demanda Química de Oxígeno (DQO).

Para evaluar la acción antimicrobiana frente Listeria innocua Seeliger, se usó una nisina comercial

como bacteriocina, disponiendo a su vez de suero lácteo acidificado, el cual proporciono las

condiciones adecuadas a la nisina. Se diseñaron 3 tratamientos diferentes; P correspondió al queso

campesino patrón, T1 correspondió al queso con la adición de nisina en forma directa, T2 y T3 a

la elaboración de queso con la adición de nisina encapsulada en alginato de calcio en proporciones

1:1 y 1:4 (nisina- alginato de calcio) respectivamente.

Analizando estadísticamente los datos obtenidos, sensorialmente se presentaron diferencias

significativas en color, sabor y aroma a causa del método de esterilización empleado para las

cápsulas de nisina, sin embargo, no se afecta la textura del queso. Posteriormente el seguimiento

fisicoquímico arrojo una humedad promedio de 55,24%, un pH de 5,48, y una acidez de 0,71% de

ácido láctico, los cuales están dentro de los parámetros normales de un queso fresco. En el perfil

de textura se evaluaron características como dureza, rigidez, cohesividad, fuerza de fractura,

gomosidad, y masticabilidad las cuales reflejaron un comportamiento ascendente a diferencia de la

elasticidad y adhesividad que presentaron comportamiento descendente. En el crecimiento de L.

innocua se produce una reducción de ciclos logarítmicos en comparación con el patrón de 0,22 en

T1, 0,51 en T2 y 0,60 en T3, demostrando la eficiencia de la nisina como agente bactericida e

identificando que el tiempo de acción depende de su concentración.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Hoy en día en la industria alimentaria, existe cada vez más interés por la fabricación de productos

de buena calidad y por ende la aplicación de métodos que nos permitan ofrecer productos

totalmente inocuos y que prolonguen la vida útil de los alimentos, como lo es el caso de la

encapsulación de sustancias activas. La encapsulación es uno de los métodos más estudiados por

sus buenos resultados, no obstante a ello, su efectividad dependerá de su forma de aplicación y de

los diferentes materiales encapsulante utilizados y la disponibilidad de los mismos.

Dentro de las sustancias o componentes activos con nivel alto de interés encontramos algunas

bacteriocinas, como la pediocina y la nisina siendo la nisina la más estudiada por los exitosos

resultados obtenidos ante diferentes cepas bacterianas tales como Clostridium, Salmonella,

Listeria, entre otras. En la industria láctea una de las bacterias patógenas es la Listeria

monocytogenes, conociéndose algunos casos de Listeriosis a causa del consumo de quesos frescos,

por esto se quiso evaluar dentro de la matriz de queso campesino la acción antimicrobiana de la

nisina siendo encapsulada en alginato de calcio y lactosuero. Por razones de seguridad y posible

contaminación cruzada se trabajará con L. innocua un émulo no patógeno de L. monocytogenes.

Las principales áreas de producción de queso campesino en Colombia se centran en pequeñas

empresas que carecen de infraestructura adecuada para su producción, no cumplen en su gran

mayoría con las condiciones de temperatura y humedad adecuadas impidiendo su conservación y

a su vez recortando el tiempo de vida útil de este producto, generando pérdidas económicas

significativas, a causa de las condiciones anteriormente nombradas en muchos casos los productos

llegan a su destino de comercialización no aptos para consumo, generando pérdidas tanto al

productor como al comercializador. Es por esta razón que la implementación de una nueva técnica

que impida la proliferación de microorganismos en los quesos frescos disminuiría las pérdidas

económicas tanto para productores como para comercializadores, logrando garantizar un producto

de buena calidad.

Con esta investigación se busca apoyar el criterio de “Uso de combinaciones de compuestos

sinérgicos y nisina para la conservación de derivados lácteos” (Trujillo, 2008) identificado como

uno de los factores competitivos para promover el desarrollo de la cadena láctea en Colombia y así

conservar mejor el queso campesino, mediante el uso de bacteriocinas encapsuladas, aprovechando

el lactosuero, subproducto de la elaboración del queso campesino.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la incorporación de nisina encapsulada en una matriz de alginato de calcio y lactosuero en

queso campesino.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Evaluar la efectividad del método de encapsulación

Identificar el efecto sensorial de la incorporación de la bacteriocina encapsulada en el

queso campesino.

Determinar las modificaciones que se presentan durante el periodo de almacenamiento del

queso patrón y los tratamientos propuestos.

Establecer cuál es el mejor tratamiento de acuerdo a las variables de respuesta,

fisicoquímicas y microbiológicas del queso.

1

1. MARCO DE REFERENCIA

Existen diferentes maneras de preservar un alimento, y todas tienen como fin alargar la vida útil,

esta se define como “el periodo de tiempo durante el cual resulta deseable el consumo de un

producto alimenticio elaborado” (Bello, 2000) es decir que se determina mediante el lapso durante

el cual el alimento ha sido preparado, envasado y almacenado hasta el momento en que este se

vuelve inaceptable, lo que implica un riesgo para la salud del consumidor, debido a que sus

propiedades físico-químicas, microbiológicas, funcionales y/o sensoriales no son aptas para el

consumo, como consecuencia el producto es rechazado (Riveros & Baquero, 2004)

Para poder prolongar la vida útil de un alimento se hace necesario conocerlo, desde la materia

prima que lo conforma, ya que posee componentes biológicos, lo cuales tienden a deteriorarse.

Dicho deterioro no puede ser completamente detenido, pero si existen procesos que se realizan para

ralentizarlo, como son la formulación, el procesamiento, el empaque, el almacenamiento y la

manipulación (Stelle, 2004) cuyo objetivo es garantizar la inocuidad y la calidad del producto.

1.1.1 Leche y sus características.

La leche como producto de consumo es una de las más apetecidas por el consumidor, su

variedad depende únicamente de la especie animal productora, las vacas, búfalos, cabras, ovejas y

camellos se describen como las cinco especies dominantes de la producción mundial de leche,

donde el 85% de dicha producción corresponde a la vaca (FAO, Portal lácteo, 2015)

2

Por su alto contenido de agua, su pH y la gran variedad de nutrientes que posee, la leche resulta

ser un excelente medio para el crecimiento de microorganismos, la microbiota que este producto

adquiere inicia desde su paso por la ubre, el contacto con el pezón, la piel del animal y el equipo

de ordeño, así mismo como en el almacenamiento y transporte, dicho crecimiento microbiano

incluye tanto microorganismos benéficos, saprofitos como patógenos para el hombre. (Orobón,

2003)

Las características de la leche tienden a cambiar de acuerdo al manejo que se le proporcione

desde su ordeño. Se sabe que no se puede fabricar un producto lácteo de buena calidad sino se parte

de leche en la misma condición, por lo que es necesario conocer los parámetros de calidad de la

leche cruda para obtener un queso de óptimas características fisicoquímicas y organolépticas,

reduciendo así las posibilidades de deterioro que se puedan presentar dentro del proceso de

fabricación (Scholz, 1995).

La calidad de la leche resulta siendo la suma de características que la definen (nutritivas,

composicionales, higiénicas, microbiológicas, sensoriales, etc.) las cuales proporcionan una mayor

o menor satisfacción al usuario (Villegas & Santos, 2011). La leche cruda de buena calidad “no

debe contener residuos ni sedimentos, no debe ser insípida ni tener color y olor anormales; debe

tener un contenido de bacterias bajo; no debe contener sustancias químicas (por ejemplo,

antibióticos y detergentes), y debe tener una composición y acidez normales.” (FAO, 2015).

3

1.1.2 Elaboración de los quesos frescos

El proceso general que se realiza para la fabricación del queso se puede observar en la figura

1. (Urbano, 2014) donde las étapas de salado y maduración son de acuerdo al tipo de queso

(madurados y no madurados, o duros, semiduros y blandos, etc), quienes poseen características

fisicoquímicas sumamente variables (García, Quintero, & López, 1993). Para que se dé la

formación del queso, un paso esencial dentro del proceso, es la coagulación de la caseína, esta se

da a causa de la acción combinada de enzimas proteolíticas y del calcio (Lopéz & Vélez, 2012).

Figura 1 Diagrama de flujo para la elaboración de queso campesino. Recuperada de Urbano, (2014) Pruebas de

Plataforma y Composicionales de Leche Cruda. Universidad de La Salle, Bogotá, Colombia

4

1.1.3 Riesgos microbiológicos de los quesos

Para la obtención de un queso de calidad, es necesario que la leche provenga de animales sanos y

libres de enfermedades, ya que la leche fresca proveniente de estos contiene diferentes tipos de

microorganismos. La fase de pasteurización es de suma importancia, debido a que la leche posee

un alto número de microorganismos patógenos: “El bacilo tuberculosos, (Mycobacterium

tuberculosis) tanto del bovino como del humano; las salmonelas, especialmente el S. thyphi; las

brucelas, Brucella abortus, de la vaca y Brucella melitensis de las cabras; mastitis (Streptococcus

piógenes) y algunos coliformes, además de bacterias no patógenos, como: Stretococcus lactis y S.

cremosis, que siempre están presentes en la leche” (Liangiari, 1991).

1.1.3.1 Listeria monocytogenes

El género Listeria incluye las especies L. monocytogenes, L. innocua, L. welshimeri, L.

seeligeri, L. ivanovii, L. rocourtiae, L. marthii y L. gravi. Esta última especie es la más distante

evolutivamente dentro del género. L. ivanovii y L. monocytogenes son considerados patógenos en

mamíferos (Camacho, 2011).

“Listeria monocytogenes es un bacilo Gram positivo, que crece a temperaturas de 1 a 45 °C,

con temperatura óptima de 30 a 37°C; tiene la habilidad de soportar temperaturas de refrigeración

y es capaz de desarrollarse a pH de 4,4 a 9,6. Así mismo, crece en concentraciones altas de cloruro

de sodio (15 %).” (Muñoz, Vargas, Otero, Díaz, & Guzman, 2011), debido a sus características, si

no se tiene una buena manipulación al momento de elaborar los quesos, dicha bacteria puede

presentarse. Su supervivencia en alimentos y plantas procesadoras durante largos periodos de

5

tiempo ha hecho de este microorganismo el principal problema de la industria agroalimentaria

durante los últimos años (Rocourt & Cossart, 1997). En la actualidad cuando se hace referencia al

genero Listeria se incluyen seis especies, entre las cuales se encuentra la L. innocua, siendo uno de

los generos no patógenos (Bolivar. Z et, al 2008) y a su vez el que mayor similud presenta con L.

monocytogenes ya que como lo cita Von Both (1999) en Torres Kirvis et, al (2005)

L.monocytogenes y L. innocua luego de ser secuenciadas presentaron un cromosoma con un

contenido promedio de G + C igual al 39% y 37% respectivamente, presentando un alto grado de

homología en la secuencia ribosomal 16s (RNAr 16s) siendo así las de mayor cercania taxonómica.

La presencia de bacterias patógenas en alimentos suelen ser causales de un sin número de

enfermedades, las cuales reciben el nombre de enfermedades trasnmitidas por alimentos, (ETA),

conociendose como el síndrome originado por la ingestión de alimentos y/o agua, que contengan

agentes etiológicos en cantidades tales que afecten la salud del consumidor a nivel individual o

grupos de población. (Salud, Protocolo de Vigilancia en Salud Publica , 2016).

Entre las enfermedades de mayor relevancia que son trasmitidas por alimentos se encuentra la

listeriosis, cuyo agente etiológico es Listeria monocytogenes, debido al impacto social y económico

que tiene por la gravedad de su cuadro clínico, (Muñoz, Vargas, Otero, Díaz, & Guzman, 2011)

debido a que puede desarrollar septicemia (infección en la sangre) o meningitis (inflamación de las

membranas que cubren el cerebro) (Quality, 2015). Listeria monocytogenes catalogada como una

bacteria patógena es capaz de producir una enfermedad invasiva, la cual puede causar afecciones

en el Sistema Nervioso Central, dejando secuelas neurológicas y en casos extremos la muerte, la

forma no invasiva de dicha bacteria puede causar síndrome gastrointestinal. La tasa de mortalidad

de la Listeriosis oscila entre 20 y 30%, las manifestaciones más comunes, indicadoras del

6

padecimiento de dicha enfermedad son la meningitis, la meningoencefalitis, septicemia, aborto,

infección prenatal y gastroenteritis. Una gran variedad de alimentos han servido como vehículo de

transmisión, entre estos están la leche, el queso, la mantequilla, el pate, la carne, los vegetales, los

productos de mar y particularmente los productos listos para consumo (Gallegos. J., et., al, 2007).

1.1.4 Bacteriocinas

Según Sahl (1985) las bacteriocinas son péptidos antimicrobianos sintetizados ribosómicamente,

las cuales en los últimos años han experimentado avances extraordinarios. Como lo describe

Orobón (2003), las bacteriocinas producidas por bacterias lácteas fueron inicialmente descritas por

Rogers (1928) al observar la actividad antimicrobiana de Lc. Lactis frente a Lb. Bulgaricus, debido

a un compuesto proteico y termoestable, presentando así un alto nivel de interés sobre las

bacteriocinas de bacterias lácticas en la industria alimentaria como lo refiere Yang & Ray (1994)

debido a su potencial para inhibir microorganismos patógenos y alterantes de alimentos.

La genética de las bacteriocinas puede estar en los cromosomas o en plásmidos (Klaenhammer,

1993; de Vuyst y Vandame, 1994; Jack et al., 1995) o bien también puede estar repartidos entre el

cromosoma y los plásmidos (Quadri et al., 1994). La producción de una misma bacteriocina no

dependerá de un único género, como es el caso de pediocina AcH o PA 1.0 la cual es producida

por P. acidilactici H y PAC-1.0 y por Lb. Plantarum WHE 92 (Ennahar et al., 1996). Según Quadri

(1994) una misma cepa puede contener varios plásmidos que codifiquen distintas bacteriocinas y

una bacteriocina puede ser producida por un único microorganismo como lo observo Van Belkum

(1991) en Lc. lactis subsp. Cremoris 9B4 citado en Oborón 2003.

7

1.1.4.1 Clasificación

Como lo describen Dosta, Monroy, Barrera, Perrino & Reyes, (2009) diversos investigadores han

buscado clasificar las bacteriocinas acorde a sus características tanto genéticas como químicas,

presentando la clasificación propuesta por Kemperman et al, (2003).

Clase I: lantibióticos

Péptidos pequeños activos a nivel de membrana y que contienen algunos aminoácidos poco

comunes formados debido a las modificaciones luego del proceso de traducción tales como; la

lantionina, b-metil-lantioninay dihidroalaninaque.

Este tipo de bacteriocinas a su vez se divide en dos tipos:

Ia: Estos péptidos actúan a nivel de membrana, se caracterizan por ser elongados y

catiónicos, englobando tanto lantibióticos de un solo péptido como los que requieren la

presencia de dos péptidos que le permitan ejercer su actividad antimicrobiana total.

Ib: Estos péptidos actúan como inhibidores enzimáticos y se caracterizan por ser globulares

e hidrófobos.

8

Clase II: No Lantibióticos

Se caracterizan por ser bacteriocinas lineales y no modificadas luego de la traducción, son péptidos

que actúan a nivel de la membrana plasmídica, son de pequeño tamaño y termoestables, siendo la

pediocina PA-1 la más representativa de este grupo, a su vez estos no lantibióticos se dividen en:

IIa: en este tipo se encuentran los péptidos activos contra Listeria, teniendo como

representantes característicos la pediocina PA-1 y la sakacina P.

IIb: Son formadores complejos para la formación de poros que consisten de dos péptidos

diferentes, los cuales son igual de necesarios para una mejor actividad antimicrobiana, aquí

podemos encontrar la lactococcina G y las plantaricinas EF y JK.

IIc: Se caracterizan por ser péptidos termoestables, no modificados y pequeños,

transportados mediante péptidos libres, encontrando aquí como representativos a la

divergicina A y acidocina B.

Clase III

Estas bacteriocinas suelen ser termolábiles y de elevado tamaño, siendo la helveticina J. V,

acidofilicinaa A y lactacinas A y B las más conocidas.

9

Clase IV

Estas bacteriocinas suelen ser más complejas debido a la incorporación de una parte proteica y una

o más fracciones lipídicas o glucidicas en los péptidos, las cuales resultan ser necesarias para su

actividad biológica, reconociendo como principales a las glicoproteínas (lactocina S) o

lipoproteínas (mesenterocina 52).

Clase V

Estas bacteriocinas se caracterizan por tener forma circular y no ser modificadas luego de la

traducción, aquí identificamos a la enterocina AS-48 y la gasericina A como principales.

1.1.4.2 Nisina como bacteriocina representativa

Descrita en 1928, la nisina fue la primer bacteriocina aislada a partir de la bacteria ácido láctica

Lactococcus lactis subs. Lactis. Hasta la fecha es la bactericina mejor caracterizada y usada

ampliamente en la industria alimentaria como conservador, adicional a ello es la única reconocida

por la FDA con la categoría GRAS (Generally Recognized As Safe) (Dosta, Monroy, Barrera,

Perrino, & Reyes, 2009)

La nisina está conformada por 34 aminoácidos de bajo peso molecular, su síntesis suele ser

compleja requiriendo de procesos de transcripción, secreción, procesamiento y señales de

transducción, la nisina la podemos encontrar de dos tipos A y Z donde el aminoácido de la posición

27 es la histadina para la nisna tipo A y la asparagina para la nisina tipo Z. (Sangroris & Garcia,

10

2007), la nisina por naturaleza es ácida y por ende suele ser más efectiva en medios ácidos y su

acción suele ser más efectiva, como lo es la solubilidad, la cual aumenta en cuanto disminuye el

pH y aumenta la temperatura del medio al que esta expuesto. Esta bactericina se produce de forma

natural en algunos productos lácteos, siendo usada en la producción de alimentos y como un aditivo

en productos lácteos con la finalidad de prevenir el deterioro ocasionado por las bacterias Gram-

positivas, especialmente Clostridium, Staphylococcus, Bacillus y Listeria (Maldonado & Llancas,

2007)

1.1.5 Encapsulamiento

La encapsulación está definida como la técnica que comprende la incorporación de

ingredientes alimenticios, enzimas, células y otros materiales en pequeñas cápsulas (Gibbs,

Kermasha, Alli, & Mulligan, 1999), es la técnica por la cual gotas líquidas, partículas sólidas o

gaseosas, son cubiertas con una película polimérica porosa conteniendo una sustancia activa

(Araneda & Valenzuela, 2011). La aplicación de esta técnica se ha venido incrementando debido

a que logra aumentar la vida útil de los productos alimenticios sin alterar su calidad organoléptica,

además los compuestos encapsulados son menos vulnerables a los factores ambientales y se limita

su interacción con otros ingredientes (Sandoval, Rodríguez, & Ayala, 2004).

Para una mayor protección de los materiales de interés alimenticios, se ha llegado a

implementar la microencapsulación, la cual se basa en incorporar una matriz polimérica, creando

un microambiente capaz de controlar las interacciones entre la parte interna y externa. La inclusión

de esta técnica dentro de la industria alimentaria ha permitido la adición de ingredientes funcionales

preservándolos de una mejor manera (Borgogna, Bellich, Zorzin, Lapasin, & Cesàro, 2010).

11

Según Lopez (2012), la aplicación de la encapsulación en la industria de alimentos tiene como

objetivos:

Proteger el compuesto activo de la degradación producida por el ambiente (calor, aire, luz,

humedad, etc)

Liberar controladamente el compuesto activo desde la matriz encapsulante bajo

condiciones específicas (pH, temperatura, etc).

Modificar las características físicas del material original y hacer más fácil su manipulación.

Por ejemplo, reducir la higroscopia, modificar su densidad, distribuir el material

uniformemente en una muestra, conventir materiales líquidos en polvos, entre otros.

Enmascarar sabores desagradables.

Separa componentes con el fin de que estos no reaccionen.

Sandoval, Rodriguez y Ayala (2004), recomiendan ciertas características para el material

protector a utilizar, las cuales podrían permitir una encapsulación exitosa, dichas carcaterísticas

son:

Baja viscosidad a altas concentraciones

Baja higroscopisidad para facilitar su manipulación y evitar aglomeración.

Capacidad de emulsificar y estabilizar el material central

Insoluble y no reactivo con el material central. El recubrimiento es soluble en los solventes

alimenticios comunes, o en el producto alimenticio final.

Proporcionar máxima protección al material central contra condiciones adversas como pH,

oxígeno, la humedad y otros ingredientes reactivos.

12

Permitir la liberación completa de solventes y otros materiales usados durante el proceso

de encapsulación.

Sabor insípido.

Poseer bajo costo.

Dentro de los materiales utilizados se encuentran especificados en la Figura 2.

Clases de Material de

Recubrimiento Tipos Específicos de Recubrimiento

Gomas Goma arábiga, agar, alginato de sodio, carragenina

Carbohidratos Almidón, Maltodextrinas, sacarosa, jarabe de maíz, ciclodextrinas.

Celulosas Carboximetil celulosa, metil celulosa, etil celulosa, nitrocelulosa,

acetilcelulosa

Lípidos Cera, parafina, triestarina, ácido esteárico, monogliceridos, digliceridos,

cera de abejas, aceites, grasas.

Materiales inorgánicos Sulfato de calcio, silicato.

Proteínas Gluteína, caseína, gelatina, albúmina.

Figura 2. Clases de materiales de recubrimiento utilizados en el proceso de encapsulación (Sandoval,

Rodríguez, & Ayala, 2004).

1.1.5.1 Métodos para Encapsulación

Secado por atomización

Es el más conocido en el ámbito de los ingredientes alimenticios (Guevara & Jimenez, 2008),

hace referencia a la transformación de un material líquido en un sólido, generando partículas que

protegen el material activo en matrices formadas generalmente por polímeros. Dicha técnica es

realizada en tres procedimientos: primero se prepara la emulsión o dispersión, segundo se

homogeniza dicha emulsión y tercero se atomiza en la cámara de secado (Dziezak, 1988).

13

Secado con lecho fluidizado

En este método reinan condiciones óptimas para un constante intercambio de calor y transferencia

de masas. Las partículas que se encuentran como lecho de sólidos en estado de reposo, son fluizadas

comúnmente con aire, haciendo que las partículas se mezclen en el fondo para formar un lecho

fluidizado. (Neotec, 2013)

Coacervación

La coacervación es un método químico que hace referencia a la separación de fases líquido-líquido

de forma espontánea que puede ocurrir al mezclar polielectrólitos de cargas opuestas en un medio

acuoso. La coacervación puede ser simple o compleja; simple, en la que se implementa un solo

tipo de polímero y la adición de agentes fuertemente hidrofílicos a la solución coloidal, mientras

en la coacervación compleja, se usan dos o más tipos de polímeros (Guevara & Jimenez,2008). La

coacervación puede ser iniciada por diferentes formas: cambios de pH, temperatura, adición de

alguna sal iónica (Madene, Jacquot, Sher, & Desobry, 2006).

Polimerización Interfacial

En la polimeracion interfacial se forma una membrana por la cual se produce la

polimerización de un monómero en la interface de sustancias inmiscibles, dando lugar a la pared

de la microcápsulas. Según Parra (2010), este proceso se lleva a cabo en tres pasos: primero,

dispersión de una solución acuosa de un reactante soluble en agua, en una fase orgánica para

producir una emulsión de agua en aceite; segundo, la formación de una membrana polimérica

14

iniciada por la adición de un complejo soluble en aceite a la emulsión anterior; y por último,

separación de las microcápsulas de la fase orgánica y su transferencia en agua para dar una

suspensión acuosa. Según Villena, Morales, Lara, & Martínez, (2009), la selección del método de

encapsulación dependera de una seria de factores, como lo pueden ser: el tamaño medio de partícula

requerida, las propiedades físicas del agente encapsulante, de la sustancia a encapsular, las

aplicaciones del material encapsulado propuesto y el mecanismo de liberación deseado y

finalmente del costo.

Gelificación Iónica

Existen dos tipos de gelificación iónica, interna y externa. La gelificación interna consiste en

la liberación controlada del ión Calcio desde una fuente interna de sal de calcio insoluble o

parcialmente soluble dispersa en la solución de alginato de calcio (Helgerud, Gaserod, & Larsen,

2010). Y la gelificación externa, que ocurre con la difusión del ión calcio desde una fuente que

rodea al hidrocoloide hacia la solución de alginato de pH neutro. Se inicia la formación del gel en

la interface y se avanza hacia el interior a medida que la superficie se encuentra saturada de iones

calcio, generando como consecuencia que el ión sodio proveniente de la sal de alginato sea

desplazado por el catión divalente solubilizado en agua. (Lupo, Gonzalez, & Maestro, 2012).

15

1.2 ESTADO DEL ARTE

Se han realizado variadas investigaciones sobre la aplicación de encapsulación en alimentos con

fines de mejora y mantenimiento de las características de productos lácteos tanto en nuestro país

como en el mundo. En este segmento se focalizan especialmente los estudios realizados a nivel

nacional e internacional sobre quesos, encapsulación y bacteriocinas debido a la importancia de

estos productos en la mejora de la vida útil en productos derivados lácteos y su relación con la

salud pública y el bienestar del consumidor.

Según Mojica, Trujillo Cabezas, & Bernal, (2007) debido a la globalización que se va

generando con el tiempo, Colombia cada vez más va adquiriendo cabida en los negocios

internacionales, pero no obstante a ello se observa una gran debilidad a causa de la baja

producción de algunos sectores agroalimentarios, entre los cuales se encuentra la industria

láctea, atribuyendo esta baja productividad al bajo nivel de planeación, el desarrollo

tecnológico y la falta de transferencia de tecnología, la dependencia tecnológica de

multinacionales y la carencia de una proyección seria hacia el mercado global, impidiendo

así avanzar en una mayor competitividad del sector lácteo.

Mundialmente Colombia ocupa un modesto lugar en los principales países productores de

leche estando en la posición 21, posición que si es comparada con tan solo los países

latinoamericanos nos arroja una gran oportunidad de exportación de productos lácteos,

siendo superados por Brasil, Argentina y México. Como se cita en este mismo estudio,

según la FAO para el año 2007 la producción de leche aumento en un 2.84% a nivel

mundial, indicando por ende un aumento en la producción de quesos de todo tipo del 2%

16

entre los años 1993 y 2002, este crecimiento se atribuye a al crecimiento poblacional de las

zonas urbanas y por ende a la demanda de los productos lácteos, no obstante a este

crecimiento productivo y demanda de productos lácteos la cantidad de leche destinada a la

elaboración de quesos en Colombia es baja destinando tan solo un 8% a la producción de

este producto, del cual un 37.49% y un 41.79% corresponden a la producción de queso

crema y queso campesino respectivamente. Es importante resaltar que la mayor parte de

quesos frescos producidos en Colombia proviene de pequeñas empresas o artesanales, las

cuales en su mayoría carecen de la infraestructura adecuada para la fabricación y posterior

almacenamiento de productos lácteos, por ejemplo la ausencia de infraestructura eléctrica

o difíciles vías de acceso generando efectos negativos en los rendimientos de su actividad

económica, ya sea por el tiempo como por la dificultad en la entrega del producto, situación

que muchas veces empeora debido a los medios de transporte destinados para la

comercialización de estos productos, ya que no brindan la temperatura adecuada para su

almacenamiento, disminuyendo el tiempo de vida útil del producto, por lo que sea hace

importante no solo el proporcionar infraestructura, insumos y maquinaria adecuada sino de

nuevas tecnologías que permitan alargar la vida de los productos lácteos en su mayoría de

quesos frescos, los cuales presentan la vida útil más corta como se describe en la Resolución

2310 de 1986.

La Listeriosis es una de las enfermedades más importantes, donde el 99% de los casos se adquiriere

por la ingesta de alimentos contaminados por Listeria monocytogenes, agente causal de dicha

enfermedad, la cual puede ser invasiva y no invasiva, produciendo la primera de estas la tasa más

alta de hospitalización y mortalidad y la segunda produce gastroenteritis con una menor tasa de

hospitalización y mortalidad (Carrascal Camacho , y otros, 2011). En los últimos diez años el queso

17

ha sido el principal producto involucrado en brotes de Listeriosis, el primero de estos se dio en

Estados Unidos por el consumo de queso “tipo mexicano”, con una tasa de mortalidad de 34%

(Linnan, y otros, 1988). El segundo en Suiza por el consumo de queso “Vacherin Mont d’Or-

type”, con una tasa de mortalidad del 27% y los dos últimos en Francia por el consumo de queso

Brie de Meaux (Goulet , Hedberg , Monnier , & Valk, 2008)

Actualmente el queso fresco es considerado como integrante básico de la canasta familiar, es

preocupante la carencia de la implementación de Buenas Prácticas de Manufactura en la

producción de quesos frescos ya que desde mucho tiempo atrás, hasta la fecha su elaboración sigue

siendo de forma industrial y artesanal, aumentando así el riesgo de contaminación con L.

monocytogenes, siendo en su orden el queso campesino, el queso doble crema y la cuajada los

quesos frescos con mayor prevalencia de L. monocytogenes. (Carrascal Camacho , y otros, 2011)

Según Ruminot Moraga, (2005) en su estudio de “ Encapsulación de bacterias lácticas en geles de

alginato para la producción de bacteriocinas e inhibición de Listeria monocytogenes” resalta el

aumento de los estudios sobre las bacterias ácido lácticas (BAL), debido a su producción de

bacteriocinas, toxinas proteicas que permiten inhibir el crecimiento de bacterias similares o cepas

cercanas, como lo es Listeria monocytogenes, como se pudo corroborar con los resultados arrojados

en dicho estudio donde, la encapsulación de cepas lácticas bioatrapadas permitió una inhibición de

L. monocytogenes efectiva, indicando la alta barrera que provee la cápsula de alginato, impidiendo

el ingreso de algunas sustancias, como lo son las bacteriocinas y el ácido láctico.

Para la preservación de alimentos se han implementado diferentes técnicas una de ellas ha sido el

uso de BAL, debido a su alta capacidad para al producción de sustancias antimicrobianas

18

(Salminen & Wright, 1998), entre estas sustancias producidas la más conocida y estudiada es la

nisina, bacteriosina proveniente de una BAL la cual a sido usada como preservante de alimentos

durante varias décadas (Chen & Hoover, 2003) la eficacia de la nisina se ha podido comprobar en

diferentes alimentos tales como; el queso tipo cottage, riccota, quesos fundidos y helados de crema,

no obstante a ello también se ha podido identificar problemas en la implementación de esta

sustancia, ya que luego de actuar eficazmente tiene la capacidad de activar células que ya habían

sido inhibidas, volviéndolas resistentes a esta bacteriocina, por lo que se presenta la solución de

trabajar con bacteriocinas combinadas con cultivos protectores según Hanlin et al., (1993) y Riler-

Wertz (2002) razón por la cúal Schillinger et al., (2001) implementaron esta opción, comprobando

que se lograba una inhibición efectiva de L. monocytogenes con bajas concentraciones de nisina en

combinación con cultivos protectores, como el listeriofago.

Dentro de las diferentes técnicas que se han desarrollado para la inhibición de L. monocytogenes

está la encapsulación de nisina en liposomas, técnica que resultó tener una mayor efectividad que

al adicionar la nisina de forma directa Were et al., (2004) además según Wan et al., (1997) se ha

comprobado una efectividad entre el 93 y 97% de la encapsulación de compuestos antimicrobianos

como es el caso de la nisina en geles de alginato.

Según un estudio realizado por Wan, et., al, (1996) donde se evalúa encapsulación de nisina en

micropartículas de alginato de calcio realizando tres tratamientos; 1:1, 1:4 y 1:9 donde se varió la

proporción de nisina y de alginato de calcio respectivamente, fue posible determinar que el mayor

efecto antimicrobiano ante Lactobacilus curvatus se presentó en la formulación 1:4 con una

eficiencia del 93%, esta tecnología con la implementación de este método arrojó una eficiencia

antibacterial en general de un 83% a un 97%, lo que nos permite determinar una eficiencia alta y

19

más a comparación del encapsulamiento realizado por Degnan & Luchansky, (1992), como lo

señala en este mismo estudio, quien encapsuló pediocinas en liposomas, lo cual arrojó una

eficiencia del 18%, la cual es significativamente menor a la obtenida en la encapsulacion de nisina.

En este estudio también se pudo determinar que la metodología implementada para la formación

de las capsulas fue adecuada permitiendo la formación de micro-partículas, dicha metodología

consistió básicamente en una mezcla de las diferentes proporciones de nisina y alginato de sodio,

para luego adicionar una solución de cloruro de calcio, sometiendo esta mezcla final a 2 horas de

agitación constante, para luego ser expuesta a una temperatura de 50°C por 16h con la finalidad de

remover el CaCl2 y finalmente el material seco obtenido se molió con ayuda de un mortero para

luego pasarlo por un tamiz de 150 micrómetros.

1.3 Marco Legal

El marco legal con el cual se sustenta el proyecto está basado en la reglamentación sanitaria

vigente expedida por el Ministerio de la Protección Social y en las normas técnicas colombianas.

1.3.1 Decreto 616 de 2006

Por medio de la implantación de este decreto se expide el reglamento Técnico sobre los

requisitos que debe cumplir la leche para el consumo humano que se obtenga, procese, envase,

transporte, comercialice, expenda, importe o exporte en el país. En este decreto se reglamentan las

normas que se deben tener en cuenta para la obtención de leche en la producción primaria, desde

las instalaciones e infraestructura, el manejo posterior al ordeño de la leche, sus especificaciones

técnicas, entre otros parametros a tener en cuenta para la producción de leche a lo largo de la

cadena.

20

1.3.2 Decreto 60 de 2002

Según el decreto 60 de 2002, del por inocuidad alimentaria se considera, todo alimento que

garantice no ser la causal de daño al consumidor cuando se preparen y/o consuman de acuerdo con

el uso a que estén destinados. Por lo anterior se hace de suma importancia la implementación del

plan HACCP, el cual debe ser tenido en cuenta en toda industria alimenticia, con la finalidad de

garantizar la producción de alimentos totalmente inocuos.

1.3.3 Resolucion 2310 de 1986

Por la cual se reglamenta parcialmente el Titulo V de la Ley 09 de 1979, en lo referente a

procesameinto, composición, requisitos, transporte y comercialización de los derivados lácteos. En

el titulo VII de dicha resolución se tiene para quesos en general las condiciones en que se debe

encontrar un queso para salir al mercado despues de su proceso de elaboración.

1.3.4 Resolución 1804 de 1989

Por la cual se modifica la resolución 2310 de 1986, estableciendo las características

fisicoquímicas permitidas que deben contener los quesos, en cuanto a su materia grasa mínima

permitido y su contenido de humedad.

21

1.3.5 Norma Técnica Colombiana 750 – Quesos frescos

La cual establece los límites máximos y mínimos microbiológicos en que se puede encontrar

un queso tipo fresco, asociados a estos microorganismos; Coliformes, mohos y levaduras,

Estafilococos coagulasa positiva, Salmonella y Listeria monocytogenes.

1.3.6 Norma Técnica Colombiana 399 - Leche cruda

Esta norma se impone con el objetivo de establecer los requerimientos que debe cumplir la

leche cruda como materia prima para su industrialización. La leche cruda se define como aquel

producto que no ha sido sometido a ningun tipo de calentamiento, entendiendose por una

temperatura no mayor a 40°C. Esta norma establece las características fisicoquímicas adecuadas

para que la leche pueda ser aceptada como materia prima para un posterior proceso de producción.

La leche cruda debe presentar un aspecto normal, estar limpia y libre de calostro, preservativos,

colorantes, materias extrañas y objetos extraños. Dichas características fisicoquímicas que se tienen

en cuenta en dicha norma son; densidad, materia grasa, sólidos totales, sólidos no grasos, acidez,

índice crioscópico, proteinas, índice lactométrico, presencia de conservantes, adulterantes y

neutralizantes.

22

2. METODOLOGIA DE LA EXPERIMENTACIÓN

Se plantea un diseño experimental con un patrón y 3 tratamientos con adición de Listeria

innocua y de la nisina encapsulada de la siguiente manera:

Patrón (P): Queso campesino sin ninguna adición.

Tratamiento 1 (T1): Adición de nisina a queso campesino de forma directa.

Tratamiento 2 (T2): Adición de nisina encapsulada a una proporción de 1:1 v/v nisina/alginato.

Tratamiento 3 (T3): Adición de nisina encapsulada a una proporción de 1:4 v/v nisina/alginato.

Dicho diseño experimental fue desarrollado en las instalaciones de la Universidad de La Salle

en la sede Floresta, haciendo uso de la planta de lácteos, el laboratorio de nutrición animal, el

Laboratorio Instrumental de Alta Complejidad (LIAC) y el Laboratorio de Cereales pertenecientes

a los programas de Zootecnia e Ingeniería de Alimentos respectivamente y en la Sede Candelaria

el uso del laboratorio de Biología 2, en la ciudad de Bogotá, ejecutando dicha experimentación en

6 etapas:

ETAPA 1: Encapsulación de la Nisina en solución de Lactosuero y Alginato de Calcio.

ETAPA 2: Elaboración de capsulas por medio del proceso de liofilización.

ETAPA 3: Determinación de la concentración de la cepa bacteriana, Listeria innocua.

ETAPA 4: Elaboración del queso campesino, incorporación de capsulas e inoculación de cepa

bacteriana a los diferentes tratamientos.

ETAPA 5: Elaboración de la prueba sensorial de los diferentes tratamientos elaborados.

ETAPA 6: Seguimiento fisicoquímico y microbiológico de los diferentes tratamientos.

23

2.1 ETAPA 1: ENCAPSULACIÓN DE LA NISINA EN SOLUCIÓN DE

LACTOSUERO Y ALGINATO DE CALCIO

Para la encapsulación de nisina inicialmente se dispuso 10,8 lt de suero lácteo fresco utilizando

dicho volumen para los tratamientos 2 y 3, destinando 5,4 lt para cada uno de ellos. Teniendo en

cuenta que el pH inicial del suero fue 6,5 era necesario adicionar 17,3 gramos de ácido láctico al

85% para cada 5,4 lt de suero y así lograr una disminución en el pH hasta 3,49 (Anexo A, Cuadrado

de Pearson para calcular la adición de ácido lácteo requerido).

Para la encapsulación de la bacteriocina, suministrada por la industria CIMPA S.A, (Anexo

B, Ficha técnica de la nisina), se dispuso de dos frascos de vidrio estériles para poder obtener T2

y T3 a cada uno se le adicionó 5,4 lt de suero lácteo acidificado, posteriormente se incorporaron

42,2 mg de nisina junto con 42,2 mg de alginato de calcio para T2 y, 42,2 mg de nisina junto con

169,2 mg de alginato de calcio T3, para luego llevarlos a agitación constante durante 2 horas con

ayuda de un agitador magnético. Finalmente, las soluciones obtenidas de cada tratamiento se

envasaron en bolsas ziploc, adicionando 500 gramos aproximadamente por cada bolsa.

2.2 ETAPA 2: ELABORACIÓN DE CAPSULAS POR MEDIO DEL PROCESO DE

LIOFILIZACIÓN.

Las soluciones contenidas en las bolsas ziploc se llevaron a congelación durante 4 días,

garantizando una temperatura final de -18°C, posteriormente se sometió a un proceso de

liofilización a una temperatura de -80°C durante 8 días. Transcurrido este periodo el producto

obtenido fue extraído de los frascos del liofilizador, para luego macerarlo manualmente. Debido al

contenido de solidos del lactosuero se formaron costras al realizar la liofilización (figura 3), y por

la maceración efectuada, para garantizar la esterilización de las cápsulas se llevaron a una

24

temperatura de 115°C durante 15 minutos, presentándose un oscurecimiento de color que se puede

observar en la figura 4.

Figura 3. Producto (cápsulas) obtenido luego del

producto liofilizado.

Figura 4. Producto (cápsulas) obtenido luego del

proceso de esterilización.

Para identificar la efectividad de la encapsulación obtenida en T2 y T3 se determinó el

tamaño de partícula por medio del uso de un microscopio colocando las muestras en la

cámara de Neubauer, para tomar fotografías en objetivos x4 y x10 para luego procesar las

imágenes por medio del software Image Measurement

2.3 ETAPA 3: DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE LA CEPA

BACTERIANA, Listeria innocua.

Para concentrar la cepa bacteriana, Listeria innocua Seeliger, CMPUJ 437 adquirida en

la Pontificia Universidad Javeriana, (Anexo C. Ficha técnica de Listeria innocua Seeliger),

se utilizó el equipo Densicheck Biomérieux Plus (figura 5). Se inoculó con una muestra de

la bacteria un tubo de ensayo estéril 3 ml de solución salina al 0,45%, se introdujo en el

equipo marcando la concentración de la solución ajustándola para obtener un valor igual a 4

McF (figura 6), equivalente a una concentración de 1,2x109 según la escala de Mc Farland

(Anexo D. Escala de Mc Farland)

25

Figura 5. Densicheck Biometrix Plus.

Figura 6. Concentración de bacteria obtenida en

escala Mc Farland.

2.4 ETAPA 4: ELABORACIÓN DEL QUESO CAMPESINO, INCORPORACIÓN

DE CAPSULAS E INOCULACIÓN DE CEPA BACTERIANA A LOS

DIFERENTES TRATAMIENTOS.

2.4.1.1 Análisis Fisicoquímico de la Materia Prima

Para la elaboración del queso campesino se utilizó leche de vaca cruda obtenida de la

Planta de Lácteos “Alimentos de Madrid S.A” localizada en el municipio de Madrid. Para

esta etapa se tuvo en cuenta inicialmente un proceso de filtración de la leche con la finalidad

de eliminar todas aquellas partículas macroscópicas que pudiera contener, posteriormente se

realizaron las pruebas de plataforma tales como; reductasa, determinación de densidad

(AOAC 925.22, 1990), acidez cuantitativa (AOAC, 947.05 1990), determinación de pH

(AOAC 943.21, 1990), y cuantificación de la materia grasa por método de Gerber (AOAC

945, 02, 1990), complementando estas pruebas se corrió por triplicado un análisis por

ultrasonido utilizando el equipo EKOMILK (Standar milk analyser – EON trading INC) con

las cuales se aseguró el buen estado de la materia prima, para entrar a proceso.

26

2.4.1.1 Prueba de Reductasa

Esta prueba cualitativa permitió determinar la calidad microbiológica de la leche y su

posterior calidad, dicha prueba consistió en el uso de un tubo de ensayo estéril al cual se

adicionó 5ml me muestra (leche cruda) y seguido de ello 0,1 ml de azul de metileno, la

solución elaborada y homogenizada se llevó a baño materia de 37°C durante 8h, realizando

revisiones cada media hora, con la finalidad de determinar el tiempo que tarda la solución en

decolorarse.

2.4.1.2 Analizador Ultrasónico de Leche (EKOMILK)

Este equipo existente en la Planta Piloto de la Universidad de la Salle, se empleó para

determinar Grasa, sólidos no grasos, proteína, densidad, punto crioscópico y agua adicionada.

Este procedimiento se realizó mediante el análisis de una muestra de 20ml de leche, ajustada

a una temperatura de 20°C.

2.4.2 Elaboración de la cuajada

La leche de vaca se pasteurizó a una temperatura de 65°C durante 30 minutos, en seguida

se disminuyó la temperatura a 40°C para adicionar el cloruro de calcio en solución, 15

minutos después se adicionó la solución de cuajo y se mantuvo la temperatura de 37°C

durante 45 minutos para favorecer la coagulación. La cuajada obtenida fue cortada y

desuerada, para luego amasarse y se le adicionó la sal al 1,3% con base al peso total de

cuajada obtenida.

27

Luego del amasado la cantidad total de cuajada obtenida se dividió en cuatro partes

iguales, para cada tratamiento obteniendo así un rendimiento total de 11.2%, posteriormente

se procedió a incorporar la nisina en forma directa y las capsulas de nisina a la cuajada, así:

P: 2809 g de cuajada

T1: 2800 g de cuajada + 25 mg de nisina

T2: 2800 g de cuajada + 97.2 g de cápsulas

T3: 2800 g de cuajada + 125 g de cápsulas

DETERMINACIÓN DE LA CANTIDAD DE NISINA Y CÁPSULAS A ADICIONAR

Para la determinación de las cantidades de nisina y capsulas a adicionar a cada

tratamiento se partió de las cantidades iniciales en la solución de lactosuero, teniendo así:

Tratamiento 2 Proporción 1:1 Tratamiento 3 Proporción 1:4

5400 ml de S. L

42.2 mg de N

5400 ml de S. L

42.2 mg de N

42.2 mg de A.C 169.2 mg de A.C

Densidad del Lactosuero = 1.022 g/ml

Peso Final de Sln = 5519.0844 g

Peso Final de Sln = 5519.2114 g

Cantidad de producto liofilizado

recuperado (Compuesto)

122 g

Cantidad de producto liofilizado

recuperado (Compuesto)

150 g

Concentración de Nisina en Solución 42.2 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑁

5400 𝑚𝑙 𝐿. 𝑆 = 7.8 𝑚𝑔/𝑚𝑙

28

42.2 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑁

122 𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

= 0.35 𝑚𝑔 𝑁𝑖𝑠𝑖𝑛𝑎

𝑔 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜⁄

42.2 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑁

150 𝑔 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

= 0.28 𝑚𝑔 𝑁𝑖𝑠𝑖𝑛𝑎

𝑔 𝐶𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜⁄

Total cuajada obtenida = 2800 g

Nisina permitida por Kg de cuajada = 12.5 mg

2800 g * 12.5 mg * 1𝑔

1000 𝑚𝑔= 35 𝑚𝑔 de N

35 mg de N * 𝑔 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

0.35 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑁=

97.2 𝑔 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 𝑝𝑎𝑟𝑎 2800 𝑔 𝑑𝑒 𝑞𝑢𝑒𝑠𝑜

2800 g * 12.5 mg * 1𝑔

1000 𝑚𝑔= 35 𝑚𝑔 de N

35 mg de N * 𝑔 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜

0.28 𝑚𝑔 𝑑𝑒 𝑁=

125 𝑔 𝑐𝑜𝑚𝑝𝑢𝑒𝑠𝑡𝑜 𝑝𝑎𝑟𝑎 2800 𝑔 𝑑𝑒 𝑞𝑢𝑒𝑠𝑜

Después de incorporar los componentes de cada tratamiento, estos se llevaron a moldes

y se sometieron a prensa por 40 minutos, luego de transcurrido dicho lapso de tiempo se

obtuvieron cuatros tipos de queso campesino prensado, como se observan en las figuras 7 a

10.

Figura 7. Queso Campesino patrón.

Figura 8. T1, Queso Campesino con la

incorporación de nisina directa.

Figura 9. T2, Queso Campesino con la

incorporación de capsulas de nisina (1:1).

Figura 10. T3, Queso Campesino con la

incorporación de capsulas de nisina (1:4).

29

2.5 ETAPA 5: ELABORACIÓN DE LA PRUEBA SENSORIAL DE LOS

DIFERENTES TRATAMIENTOS ELABORADOS.

La prueba sensorial se llevó a cabo en las instalaciones de La universidad de La Salle,

contando con un panel sensorial no entrenado de 52 personas, el cual evaluó los atributos de

color, sabor, textura y aroma, por medio de una prueba descriptiva, donde se realizó una

comparación entre las cuatro muestras elaboradas, las cuales estaban libres de Listeria

innocua. Para desarrollar la prueba sensorial se diseñó el formato que se puede observar en

el Anexo E. (Formato para panelistas prueba sensorial), en el cual los panelistas debían situar

una pequeña línea en sentido vertical sobre las líneas horizontales encontradas en el formato

para cada atributo de las diferentes muestras, cabe destacar que dicha evaluación se realizó

sobre una longitud de la línea horizontal dispuesta igual a 10cm. Posteriormente los datos

obtenidos fueron analizados bajo la herramienta estadística MINITAB corriendo la prueba

no paramétrica de Kruskal Wallis.

2.6 ETAPA 6: SEGUIMIENTO FISICOQUÍMICO Y MICROBIOLÓGICO DE

LOS DIFERENTES TRATAMIENTOS.

El seguimiento fisicoquímico se llevó a cabo en las instalaciones de La Universidad de

La Salle, realizando pruebas por triplicado para cada una de las muestras (P, T1, T2 y T3)

cada cinco días partiendo del día cero, el cual corresponde a la fecha de elaboración de las

diferentes muestras y así completar un periodo total de análisis igual a 35 días.

El seguimiento microbiológico se llevó a cabo durante el mismo periodo de tiempo del

seguimiento fisicoquímico, con la diferencia que en este era importante conocer el

comportamiento diario de la Listeria innocua, realizando un seguimiento inicial en los cinco

30

primeros días y posteriormente continuar con la misma frecuencia del seguimiento

fisicoquímico.

2.6.1 SEGUIMIENTO FISICOQUIMICO

2.6.1.1 DETERMINACIÓN DE pH

En un beaker se adicionaron 10g de muestra previamente macerada junto con 1,5ml de

agua destilada. La determinación de pH, se realizó mediante el empleo de un pH metro,

previamente calibrado por medio de soluciones buffers de pH (4.0 y 7.0 respectivamente),

siguiendo el procedimiento de la AOAC 943.21 (1990).

2.6.1.2 DETERMINACIÓN DE HUMEDAD

La humedad fue determinada mediante el método AOAC, 926.08 (2000), por diferencia

de pesos, para lo cual se usaron 5 gr de muestra previamente macerada, el contenido de

humedad final se determinó mediante la ecuación 1.

%Humedad =(Pcápsula+varilla+arena)−(Pcápsula+varilla+arena+muestra humeda)

(Pcápsula+varilla+arena)−(Pcápsula+varilla+arena+muestra seca)x 100

(Ec. 1)

31

2.6.1.3 DETERMINACIÓN DE ACIDEZ

La acidez se determinó mediante el método AOAC 947.05 (1990), para lo cual se

utilizaron 10 gr de muestra previamente macerada y aforada a 100ml con agua destilada. L

expresión de porcentaje de acidez se calculó por medio de la ecuación 2.

%𝑎𝑐𝑖𝑑𝑜 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑖𝑐𝑜 = 𝑚𝑙 𝑁𝑎𝑂𝐻∗0,009

𝑚𝑙 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑥 100 (Ec. 2)

Dónde:

0,009 = Miliequivalente del ácido láctico

2.6.1.4 DETERMINACIÓN DE TEXTURA

La textura se determinó mediante un perfil TPA (Bourne, 1966) en la planta piloto de la

sede norte de la Universidad de La Salle, haciendo uso de la prueba de compresión (TA-XT2,

Quality Control). Cada muestra analizada se mantuvo a temperatura ambiente durante una

hora antes de ser sometidas a la prueba de compresión, cada muestra tenía una forma

cilíndrica con alturas y diámetros igual a 2cm. La compresión de sometimiento fue igual a

un 80% y una velocidad de 2cm/min, obteniendo así la fuerza necesaria para fracturar el

material expuesto en el tiempo y la cohesividad (sin dimensión), por cada una de las muestras

(P, T1, T2 y T3) se realizó un muestreo por triplicado.

32

2.6.2 SEGUIMIENTO MICROBIOLOGICO

Para el seguimiento microbiológico se procedió inicialmente a preparar el agar, para lo

cual se llevó a cabo el siguiente proceso:

Preparación de la base CHROMagar – Listeria Base (B)

En 1 litro de agua purificada se diluyo y homogenizo 51,5 g de base de polvo.

La solución previamente preparada se llevó a autoclave (121°C/ 15min) para luego

disminuir su temperatura a 47°C.

Preparación del CHROMagar - Listeria Suplemento (S)

En 40ml de agua purificada estéril se diluyo y homogenizo 9g de Listeria

Suplemento.

La solución previamente preparada se sometió a agitación con ayuda de una barra

magnética durante 30 minutos.

Preparación del agar final

El CHROMagar base se sometió a agitación suave manteniendo una temperatura de

47°C.

El CHROMagar suplemento se adiciono al CHROMagar base sin abandonar la

agitación y temperatura al que este último estaba sometido, durante 2 minutos.

Finalmente, la mezcla final obtenida (agar) fue vertida en cajas de petri previamente

esterilizadas.

33

Las cajas de petri se dejaron enfriar y secar, para luego almacenarlas bajo

refrigeración, con la precaución de una vida útil igual a dos semanas bajo estas

condiciones.

Luego de la preparación del agar se tomaron 25g de cada muestra (por triplicado), las

cuales se diluyeron en 225ml de agua peptona al 1% y posteriormente se homogenizaron con

ayuda de una licuadora la cual se encontraba totalmente estéril, realizando toques de 3

segundos hasta conseguir una solución totalmente homogénea, con la solución obtenida se

realizaron diluciones hasta 10-5 para luego realizar siembras por triplicado de las diluciones

10-4 y 10-5, las cuales fueron incubadas a 37°C durante 48h, para finalmente realizar el conteo

en placa.

34

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 CARACTERIZACIÓN DE LA LECHE

La calidad es uno de los temas más discutidos en la comercialización de la leche, el

concepto de calidad de la leche se maneja desde cuatro variables: calidad composicional,

calidad higiénica, calidad sanitaria y calidad sensorial dentro de los que se evalúan varios

aspectos, tales como su composición, propiedades físico-químicas, higiene, condiciones

sanitarias y propiedades sensoriales; estas propiedades influyen sobre su valor nutricional y

rendimiento industrial (Martínez & Goméz, 2013), con el fin de asegurar la calidad de la

leche utilizada dentro del proceso se realizaron pruebas fisicoquímicas, los resultados

obtenidos que se observan en la tabla 1.

Tabla 1.

Caracterización fisicoquímica de la leche de vaca cruda.

Parámetros Fisicoquímicos Método Utilizado Resultado

Densidad (g/ml) Lactodensimétrico 1.030

Acidez (% ácido láctico) Acidez Titulable 0.13

Acidez °Th Acidez Titulable 13

pH pH metro 6.5

Grasa (%) Gerber 3.4

Reductasa Reductasa 8 horas

Para corroborar los resultados anteriores se utilizó un equipo de análisis rápido por

ultrasonido, EKOMILK (Standar milk analyser – EON trading INC) los resultados

adquiridos se encuentran en la tabla 2.

35

Tabla 2. Caracterización fisicoquímica de la leche de vaca cruda por medio del ECOMILK.

Grasa SNP Densidad

3.42 7.95 27.7

Agua Proteína

0.00 2.78

La leche analizada se encontró dentro de un rango de densidad de leche normal, lo que

indica que esta no ha sido sometida a un proceso de aguado o desnatado previamente, ya que

cumple con las características fisicoquímicas de la leche cruda entera de Colombia,

establecida por el Decreto 2437 (1983), densidad (1,030 a 1,032 g/ml).

Tras el desarrollo metódico de la acidez titulable se obtuvo un valor de 0.13% expresada

en ácido láctico, lo que indica que la calidad de la leche era aceptable, ya que se encontró

entre los parámetros de aceptabilidad (0.13-0.18 % representado en ácido láctico) según la

NTC 399 (2002).

Según Gil (2010)el valor del pH en la leche fresca está entre 6.5 y 6.8. En esta prueba

se obtuvo un promedio de pH igual a 6.5, lo que permite determinar que la leche cruda

utilizada en el proceso se encontraba en buen estado de calidad.

Teniendo en cuenta la medición realizada de grasa por el método de Gerber, el cual

genera un resultado directo y en comparación con la NTC 399 (2002) en el que se registra un

valor mínimo para grasa del 3%, fue posible determinar que la leche utilizada cumplía con

lo establecido por la norma anteriormente descrita, a su vez esta prueba permitió corroborar

36

el dato obtenido por el equipo del contenido graso obtenido por el analizador ultrasónico de

leche (ECOMILK).

El principio de la prueba de reductasa es el potencial de óxido-reducción (Eh) de la leche

fresca aireada es de +0,35 a +0,40 voltios, el cual se debe principalmente al contenido de

oxígeno disuelto en el producto. Si por cualquier causa ese oxigeno es separado, el Eh

disminuye. Esto ocurre cuando los microorganismos crecen en la leche y consumen el

oxígeno (Universidad de Zulia, 2003). El tiempo de cambio de coloración determina la

rápidez con la cual el oxígeno está siendo consumido por lo tanto acorde a esto y a la tabla

3, podemos establecer que la cantidad de microorganismos presentes en la leche analizada es

mínima, pues el cambio se produjo a las 8 horas, y por ende está se considera de excelente

calidad, lo cual resultaría siendo coherente por lo establecido en el decreto 2437 (1983) el

cual establece que para aceptación de la leche esta prueba debe ser de mínimo 7 horas.

Tabla 3. Nivel de contaminación en leche cruda, por la prueba de reductasa.

Calidad Contaminación Tiempo de decoloración

Muy mala Muy alta < 15 minutos

Mala Alta 15-60 minutos

Regular Media 1-3 horas

Buena Poca 3-5 horas

Muy buena Muy poca > 5 horas

Fuente: Rivera, J. 1995 citado en Urbano, (2014) Pruebas de Plataforma y Composicionales de Leche Cruda.

Universidad de La Salle, Bogotá, Colombia

Se identificó que era una leche que cumplía con los parámetros, deduciendo que era una

leche entera, con una pureza estándar a la que no se le habían realizado procesos de

descremado y por lo tanto se utilizó para la elaboración del queso.

37

3.2 ENCAPSULACION DE LA NISINA

Con el objetivo de corroborar la efectividad de la encapsulación se seleccionaron de

forma aleatoria cápsulas obtenidas en la etapa de liofilizado, las cuales fueron registradas en

las fotografías tomadas en la observación al microscopio a objetivos x4 y x10 (figuras 12 a

15) usando la cámara de Neubauer para determinar el tamaño medio de partícula realizando

96 mediciones aleatorias por medio del programa Image Measurement (2016) (Anexo F.

Mediciones del tamaño de las cápsulas en mm), ya que es uno de los parámetros más

importantes a considerar puesto que permite conocer el rango sobre el cual se encuentran

distribuidas la mayoría de las partículas y de este modo clasificarlas bien sea como

micropartículas o como nanopartículas, además de relacionar el efecto sobre el tamaño de las

micropartículas de los componentes de la formulación y del método de preparación

seleccionado (Aldemar, 2013). Acorde al método de liofilización implementado para la

encapsulación de la nisina y el tamaño de partícula obtenido se formaron costras debido al

contenido de sólidos del lactosuero, y fue necesario realizar una maceración, luego se evaluó

el tamaño de partícula obtenido, los cuales arrojaron un tamaño de partícula promedio de

0,49 mm para T2 y 0,88 mm para T3 (Tabla 4). Teniendo en cuenta que el tamaño de las

microcápsulas oscila entre 2x10-4 a 5 mm (Pedroza, 2002) se concluye que con el método de

liofilización y maceración aplicado a las soluciones en combinación 1:1 y 1:4 (nisina-

alginato de calcio) se obtienen microcápsulas.

38

Tabla 4. Diámetro promedio de partícula en mm

Objetivo T2 T3

x 4 0,54 0,84

x 10 0,44 0,92

Promedio 0,49 0,88

Al observar las microcápsulas en el microscopio, se evidencia que en ambos

tratamientos se presentan formas irregulares y con una distribución aleatoria (Figuras 11 a

14), sin embargo, las cápsulas de T2 se encuentran bastante dispersas a diferencia de las de

T3 que están mejor distribuidas ocupando un mayor espacio y conservando más la forma

esférica. Dichos resultados corroboran que la nisina y el alginato de calcio manejadas en

proporción 1:4 permiten una mejor difusión del agente dentro de la matriz favoreciendo el

encapsulamiento mejorando la actividad antimicrobiana, como lo indica el estudio realizado

por Ruminot (2005) quien obtuvo cápsulas usando alginato al 2% con un equipo de

bioencapsulador y determinó el efecto de la concentración de alginato en el tamaño de las

cápsulas, señalando que a medida que se incrementa el porcentaje de este, incrementa la

viscosidad obteniendo cápsulas de mayor tamaño, lo que conllevaría a mejorar la difusión de

la bacteriocina desde las cápsulas, por el menor tamaño de poro formado.

Figura 11. Tamaño de partícula T2 vista en

microscopio con cámara de Neubauer objetivo x4.

Figura 12. Tamaño de partícula T2 vista en

microscopio con cámara de Neubauer objetivox10.

39

Figura 13. Tamaño de partícula T3 vista en

microscopio con cámara de Neubauer objetivo x4.

Figura 14. Tamaño de partícula T3 vista en

microscopio con cámara de Neubauer objetivox10.

3.3 ANALISIS SENSORIAL DEL QUESO CAMPESINO

Los resultados de la valoración del panel sensorial se encuentran en el anexo G

y el promedio de las calificaciones obtenidas por atributo se pueden observar en la

tabla 5.

Tabla 5. Promedio de calificaciones por atributos sensoriales evaluados y sus comparaciones.

Tratamiento Color Sabor Aroma Textura

P 8,04A 7,77A 7,39A 4,55A

1 7,79A 7,35A 7,38A 4,76A

2 3,04B 5,54B 5,94B 5,72A

3 2,94B 4,88B 5,31B 5,19A

Valor P 0,000 0,000 0,000 0,211

Las letras diferentes en la misma columna denotan diferencias estadísticamente significativas

El oscurecimiento presentado en las microcápsulas debido a la esterilización fue

observado a simple vista por los panelistas, lo que causa una diferencia significativa entre los

tratamientos para este atributo evaluado; por lo tanto se invalida el análisis del color de los

resultados obtenidos en el análisis sensorial.

40

Al analizar estadísticamente los datos obtenidos en el panel sensorial, para los atributos

de sabor y aroma se obtuvo por Kruskal- Wallis un valor P igual a 0,000 < 0,05 por lo cual

se rechaza la hipótesis nula, y permite concluir que hay diferencias significativas entre los

tratamientos. En la figura 15, muestra la representación gráfica de la comparación de los

atributos evaluados, que fueron sometidos al análisis de Tukey (Tabla 5.), y donde

encontramos que, para los parámetros de color, sabor y aroma los tratamientos P y T1

comparten la letra “A” y T2 con T3 comparten la letra “B”, lo que nos indicaría que entre P

y T1 no hay diferencia significativa al igual que entre T2 y T3, sin embargo entre los dos

grupos de tratamientos si la hay. Por el contrario, en la textura percibida por los panelistas

no se encontró diferencia significativa entre ninguna de las muestras. Con el valor de las

medias de cada tratamiento se concluye que respecto a los atributos evaluados es más

agradable para los panelistas T1, corroborando que la adición directa de nisina no afecta los

parámetros sensoriales, como ocurrió con el queso “telita” en el estudio de Sangronis y

García (2007).

Figura 15. Representación en gráfica radial de los atributos sensoriales evaluados.

En cuanto a los atributos de sabor y aroma de T2 y T3, se presentaron diferencias debido

a que estos no poseían el color habitual del queso, pudiendo atribuir ello a lo sugestivo que

41

puede resultar para el panelista el color de las cápsulas y así tener influencia sobre la

percepción de los demás atributos, pues el color influye en la mente que hasta puede

confundir el gusto, ya que si un alimento no posee el color habitual, no se identifica

correctamente ni el sabor ni el aroma del mismo, esto es debido a la asociación que solemos

generar entre los colores, gustos y sabores con colores específicos (Katz, 2013).

Al presentarse el cambio en el color de las cápsulas se propone analizar un método

diferente de esterilización, como podría ser el uso de una cámara de radiaciones U.V, ya que

este es un método que maneja longitudes de onda entre 240 a 280 nm, lo cual afecta

principalmente los ácidos nucleicos de los microorganismos, impidiendo así el desarrollo de

los mismos (Rojas, 2014), sin afectar el color de las cápsulas.

En el atributo de textura se pidió al panelista evaluar la muestra específicamente sobre

una percepción granulosa de los diferentes tratamientos, arrojando una diferencia no

significativa entre todas las muestras, con una media total de 5,054, lo que indica que las

cápsulas incorporadas no afectaron la textura del queso.

3.4 SEGUIMIENTO FISICOQUÍMICO DEL QUESO CAMPESINO

Dentro de las características fisicoquímicas del queso campesino se encuentra una

humedad entre 54% y 56%, un pH de 5,4 a 5,8 (UNAD, 2013), y una acidez de 0,68 a 0,82

% de ácido láctico (UNAL, 1982). En la tabla 6 se muestran los resultados de los análisis

fisicoquímicos durante el seguimiento de los tratamientos, donde se obtuvo una humedad

promedio de 55,24%, un pH de 5,48, y una acidez de 0,71% de ácido láctico, los cuales están

42

dentro de los parámetros normales de un queso fresco, concluyendo que la adición de nisina

directa o encapsulada genera cambios que causan diferencias significativas entre

tratamientos, pero sin alterar las características fisicoquímicas del queso campesino. Los

resultados completos de las pruebas fisicoquímicas se encuentran en los anexos H, I y J

Tabla 6. Promedio de los parámetros fisicoquímicos evaluados y sus comparaciones.

Tratamiento Humedad pH Acidez

P 55,53A 5,46A 0,73A

1 55,22B 5,48B 0,71B

2 55,14C 5,49C B 0,71C

3 55,06C 5,51C 0,71C

Las letras diferentes en la misma columna denotan diferencias estadísticamente significativas

Los datos fisicoquímicos se sometieron al análisis de Tukey, permitiendo apreciar que

para los parámetros de humedad y acidez se presentan diferencias significativas entre los

tratamientos, sin embargo, el comportamiento de T2 y T3 presenta semejanzas, en cuanto a

pH al igual que entre T1 y. Lo anterior indica un comportamiento similar que tienen los

tratamientos con la nisina encapsulada.

El queso fresco se caracteriza por un alto contenido de humedad, un sabor suave y un

periodo de vida de anaquel corto (Ramírez & Vélez, 2012). En la figura 16 se puede observar

el comportamiento descendente que posee este parámetro, esto se debe a que el queso es un

sistema dinámico y poroso permitiendo el proceso de sinéresis que es causado por la

acomodación continua de la red proteica, que forman las micelas de caseína, causando la

expulsión del lactosuero (Guzmán, Tejada, De la Ossa, & Rivera, 2015), reflejándose en el

43

perfil de textura dando como resultado un queso más firme ya que esta depende de la relación

proteína/agua, lo cual se analiza más adelante.

Figura 16. Comportamiento del porcentaje humedad a través del tiempo.

Como se mencionó anteriormente la humedad promedio fue de 55,24% que de acuerdo

a este resultado la NTC 750 (ICONTEC, 2000) indica que se obtuvo un queso

firme/semiduro, esta característica también se atribuye al pH obtenido el cual fue mayor a

5,2 dando como resultado una textura gomosa, si hubiese sido menor a 5 la corteza del queso

tiende a ser quebradiza. El pH es el que determina que tan elástica o quebradiza es la textura

del queso, debido a que en cuanto más bajo sea el pH, mayor es la contracción de la cuajada

y por ende la expulsión de suero es mayor (UNAD, 2013), y como se observa en la figura

17, este fue disminuyendo.

44

Figura 17. Comportamiento del pH a través del tiempo

Figura 18. Comportamiento del porcentaje de acidez a través del tiempo

La aplicación de nisina como conservante indicaría un retraso en el descenso del pH y

en el aumento de la acidez a comparación de la muestra patrón, cabe resaltar que la relación

inversamente proporcional entre el pH y la acidez como se muestra en las figuras 17 y 18 ,

se debe a que la acidez de una solución se mide observando la concentración de iones de

hidrogeno en la solución, y el pH determinaron Vasudevan, Sreekumari, & Vaidyanathan

(2012) que se expresa como la concentración H+ como el logaritmo negativo de la

concentración de iones de hidrogeno, así el valor de pH es inversamente proporcional a la

acidez y de acuerdo a estos atributos se determina que el queso presento un incremento de la

acidez a lo largo del tiempo, debido al posible crecimiento de microorganismos (Reinheimer

& Zalazar, 2006).

45

En las gráficas de seguimiento se puede observar que los tratamientos tienen un

comportamiento similar las tres primeras semanas después de la elaboración marcándose un

descenso del pH y un incremento de la acidez después del día 15, corroborando las

diferencias significativas entre los tratamientos para estos dos parámetros fisicoquímicos.

Esto permite identificar que el uso de nisina encapsulada ejerce un efecto conservador

manteniendo más estable las características fisicoquímicas.

Aunque como se observó anteriormente la acidez del queso mantuvo una tendencia

ascendente lo cual termina siendo congruente con el descenso de pH, permitiendo el

crecimiento a bacterias acidofilas las cuales como se citó anteriormente no suelen ser

patógenas

La textura es un factor determinante en la selección y preferencia de los alimentos, al

aplicar un esfuerzo sobre un alimento, es factible medir de forma instrumental las

características mecánicas, por medio de una prueba de doble compresión en el análisis de

perfil de textura (TPA) (INIAP, 2004) prueba que se realizó a cada una de las muestras para

determinar su comportamiento, en la tabla 7 se encuentran los resultados promedios del

estudio de seguimiento, y los resultados completos se encuentran en los anexos de la K a la

U.

Tabla 7.

Promedio del perfil TPA y sus comparaciones.

Tratamiento Dureza Cohesividad Elasticidad Gomosidad

P 3,80A 0,37A 6,58A 1,20A

1 3,67A B 0,34A B 6,44A 1,10A B

2 3,38A B 0,31B C 5,79A B 0,90B C

3 3,00B 0,28C 5,49B 0,77C

46

Masticabilidad Fuerza de

fractura

Adhesividad Rigidez

P 67,40A 2,83A 0,15A 0,92A

1 62,56A 2,35A B 0,11A 0,78A B

2 60,50A 1,87A B 0,10A 0,67B

3 52,78A 1,35B 0,08A 0,59B

Las letras diferentes en la misma columna denotan diferencias estadísticamente significativas

En las figuras de la 19 a la 22 se puede observar que se presenta un comportamiento

ascendente para las características de dureza, rigidez, cohesividad y fuerza de fractura al

igual que en los anexos O y Q donde se encuentra gomosidad y masticabilidad, caso contrario

para la elasticidad (figura 23) y la adhesividad (anexo T) que presentan un comportamiento

descendente.

Figura 19. Comportamiento de la dureza a través del tiempo.

De acuerdo al análisis estadístico de dureza indica que hay diferencia significativa entre

el patrón y T3, esto se debe a que el aumento que tiene T3 es progresivo en comparación del

patrón. En el estudio realizado por Guzmán, et al., (2015) donde realizan una comparación

de perfiles de textura de quesos frescos de leche de cabra y de vaca, obtienen un aumento de

la dureza en los quesos durante un seguimiento de 18 días, atribuyendo este comportamiento

a la sinéresis ya que durante este proceso la capa externa de la cuajada es la que más se

47

contrae, dando la expulsión del lacto suero, por ende la capa externa tiene mayor

concentración de sólidos y menor permeabilidad al flujo de lactosuero. Lo que indica que a

medida que los tratamientos fueron expulsando el lactosuero su dureza fue aumentando y en

consecuencia la rigidez, como se aprecia en la figura 20, además, la sinéresis se incrementa

con el descenso de pH (Romero & Mestres, 2004) proceso que favoreció este

comportamiento como evidenció anteriormente.

Figura 20. Comportamiento de rigidez de los productos elaborados a través del tiempo.

En las figuras 21 y 22 se evidencia el comportamiento que tienen las características de

cohesividad y fuerza de fractura son ascendentes. La cohesividad es la fortaleza que mantiene

unidos los enlaces internos que existen entre las partículas que integran un alimento (Bello,

2000), es decir que es el punto límite de deformación del alimento antes de romperse, en el

estudio realizado por Osorio, Ciro, & Mejía (2004) donde realizan la caracterización textural

y fisicoquímica del queso Edam, aprecia que la cohesión va aumentando a medida del tiempo

de maduración del queso, lo mismo que ocurre en la figura 21,es decir que sus partículas

están más unidas por lo cual la desintegración del producto disminuye.

48

Figura 21. Comportamiento de la cohesividad a través del tiempo.

Figura 22. Comportamiento de la fuerza de fractura a través del tiempo.

La fuerza de fractura, es la fuerza aplicada hasta originar la ruptura estructural (Castro,

et al., 2014) debido a que la dureza y la cohesividad aumentan, también aumenta la fuerza de

fractura para poder desmoronar el queso.

49

Figura 23. Comportamiento de la elasticidad a través del tiempo

La elasticidad indica el comportamiento del producto del producto luego de la

compresión que se lleva en la prueba como este trata de regresar a su forma original con el

tiempo (Chacón & Lourdes, 2009), como se puede apreciar en la figura 23, el

comportamiento que posee la elasticidad es inversamente proporcional a la dureza, ya que si

la dureza aumenta indica que la elasticidad disminuye, es por esto que se asocia los quesos

duros con poco elásticos.

3.5 SEGUIMIENTO MICROBIOLÓGICO DEL QUESO CAMPESINO

El seguimiento microbiológico, se pueden ver los resultados obtenidos del resultado del

conteo en placa en el anexo V, se realizó para valorar la carga microbiana y de esta manera

poder observar el efecto antimicrobiano en la matriz alimentaria propuesta sobre la Listeria

innocua en el queso, en la tabla 8 se encuentran el reporte final de UFC/g.

50

Tabla 8. Reporte final de UFC/g en cada tratamiento.

día P T1 T2 T3

1 3848485 2303030 1181818 969697

2 59727273 28181818 28303030 13363636

3 80060606 44727273 35484848 18212121

4 87878788 66060606 38939394 31121212

5 116333333 68393939 70636364 68303030

14 207363636 155575758 145666667 137030303

21 180757576 150151515 118757576 63666667

28 134757576 99939394 78121212 59818182

35 255030303 223515152 216696970 107484848

Para poder apreciar de forma más clara los resultados, es necesario representar la

concentración bacteriana en unidades logarítmicas como se muestran en la tabla 9.

Tabla 9. Reporte final de UFC/g en logaritmos para cada tratamiento.

Día P T1 T2 T3

1 6,59 6,36 6,07 5,99

2 7,78 7,45 7,45 7,13

3 7,90 7,65 7,55 7,26

4 7,94 7,82 7,59 7,49

5 8,07 7,84 7,85 7,83

14 8,32 8,19 8,16 8,14

21 8,26 8,18 8,07 7,80

28 8,13 8,00 7,89 7,78

35 8,41 8,35 8,34 8,03

En la tabla 9, se puede observar que a partir del primer día se produce una reducción de

ciclos logarítmicos en comparación con el patrón de 0,22 en T1, 0,51 en T2 y 0,60 en T3, y

en promedio se obtuvo una reducción de ciclos logarítmicos en comparación con el patrón

de 0,17 en T1, 0,27 en T2 y 0,44 en T3, demostrando la eficiencia de nisina como agente

ralentizador e identificando el tiempo de acción de la nisina es rápido dependiendo de su

concentración, porque a pesar de que el crecimiento sigue aumentando, siempre es menor en

51

comparación con el patrón, esto se debe a que la nisina actúa sobre la membrana

citoplasmática de las bacterias dando como resultado la reducción en los ciclos logarítmico

(Bari, et al., 2005). En el estudio realizado por López (2010) se muestra el efecto bactericida

de la nisina aplicada en diferentes concentraciones; 200, 300, 400 y 500 mg de nisina por kg

de cuajada, arrojando una mayor reducción de ciclos logarítmicos en el tratamiento que

contenía la mayor concentración (500mg de nisina/kg de cuajada), con un porcentaje de

reducción igual a 98,83%, calculado por medio de la siguiente ecuación:

% Reducción = 100−(𝑅𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜∗100)

𝑅𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑡𝑜 sin 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 (Ecuación 3)

Al implementar la ecuación, sobre los datos obtenidos en el presente estudio se obtienen

los porcentajes de reducción que se aprecian en la tabla 10, el promedio de estos porcentajes

se observa en la tabla 11, determinando un bajo porcentaje de reducción de la flora

microbiana, en comparación con el estudio mencionado anteriormente, ya que las

concentraciones de nisina utilizadas son significativamente más altas que la usada en esta

investigación con un valor igual a 12,5mg de nisina/ kg de cuajada.

Tabla 10.

Porcentaje de reducción de la flora microbiana respecto a cada tratamiento

con base a la muestra patrón (P).

Día Porcentaje de

Reducción en T1

Porcentaje de

Reducción en T2

Porcentaje de

Reducción en T3

1 18,7 23,1 24,3

2 17,1 17,1 21,2

3 15,8 17,1 20,8

4 14,1 17,0 18,3

5 15,2 15,1 15,4

52

14 13,6 13,9 14,2

21 13,1 14,4 17,7

28 13,9 15,3 16,6

35 12,6 12,7 16,4

Tabla 11. Promedio de porcentaje de reducción de la flora microbiana respecto a cada

tratamiento con base a la muestra patrón (P).

Tratamiento % de reducción

1 14,9A

2 16,19AB

3 18,32B

Valor P 0,048

Las letras diferentes en la misma columna denotan diferencias estadísticamente significativas

Según los porcentajes de reducción obtenidos es posible identificar una diferencia

significativa entre entre los tratamiento T1 y T3, sin embargo, T2 posee cercanía a ambos

tratamientos, se evidencia que los tratamientos T2 y T3 conllevan a una mayor disminución

por lo que podríamos determinar una mejor eficiencia bactericida por parte de ambos

tratamientos, indicando así que el material encapsulante permite la liberación de nisina de

forma más progresiva y en consecuencia una mayor reducción de la flora microbiana presente

hasta el último día de análisis.

Figura 24. Curva de inactivación de la Listeria innocua durante los cinco primeros días

53

Figura 25. Curva de inactivación de la Listeria innocua a partir del día 5 al 35.

De acuerdo al estudio de Al-Holy, et al., (2005), donde investigaron el efecto de

inhibición de la nisina en combinación con el calor y con tratamientos químicos

antimicrobianos, determinaron que esta posee un mejor efecto de inhibición en combinación

con otra barrera antimicrobiana, debido a que la actividad inicial de la nisina no se mantiene

por largos periodos de tiempo como se observa en el caso de T1, donde la acción

antimicrobiana fue mínimo en comparación T2 y T3 donde se logró una mayor reducción

gracias a que la nisina se encontraba encapsulada. Como se puede observar en las figuras 24

y 25, la curva de inactivación de Listeria innocua, donde se evidencia que T3 en comparación

con los demás tratamientos detiene por mayor tiempo el crecimiento de la bacteria,

corroborando que las cápsulas en concentración 1:4 (nisina- alginato de calcio) prolongan

más el efecto de la nisina en el queso, esta misma concentración fue la que en el estudio

realizado por Wan et al., (1997) presentó mayor efecto antimicrobiano ante Lactobacilus

curvatus.

Se puede observar que los tratamientos presentaron una disminución de la población de

L. innocua, sin embargo al pasar el tiempo está continua creciendo, de acuerdo a este

comportamiento se concluye que la nisina en las concentraciones manejadas no tiene un

54

efecto letal sobre L. innocua, y se debe tener en cuenta que el efecto depende de las cepas de

Listeria utilizada y de las condiciones a las que se someta, además la acción de la nisina

requiere de otro factor que mantenga constante su inhibición inicial, ya que en caso contrario

se presentara el desarrollo de una resistencia que hará que la población de sobrevivientes se

recupere (Schmidt, 2007), como ocurrió en el presente estudio. Así mismo, se recomienda

realizar no solamente la encapsulación de la nisina sino también trabajarla junto con otros

antimicrobianos como lo son el ácido acético, el ácido láctico y el benzoato de potasio

quienes estando solos no alcanzan una gran reducción de L. monocytogenes, pero en

combinación con nisina, logran una fuerte inhibición inicial, y un sostenimiento del número

de células en el tiempo como lo señala Geonaras et al., (2005) en su estudio.

Como se observó anteriormente el pH que se obtuvo fue bajo y existen microorganismos

patógenos capaces de resistir estas condiciones como lo es la Listeria monocytogenes, tal

como lo señala Iranzo et al., (2013) indicando una supervivencia a un pH entre 4,3 y 9,6, la

supervivencia de dicha bacteria patógena se debe a que esta posee una toxina citolítica y

hemolítica, llamada listeriolisina O, la cual actúa como un importante factor de virulencia,

(Oteo & Álos, 2001).

El comportamiento durante la vida útil de los tratamientos, se ve representado por el

efecto de la nisina encapsulada como se observa en las fotografías del anexo W, a medida

que transcurre el tiempo, el cambio en las características fisicoquímicas del queso campesino

van favoreciendo el desarrollo de un hongo contaminante superficial, que se dio en diferentes

lapsos de tiempo para cada uno de los tratamientos, para P en el día 14 ya se evidencia la

presencia de un hongo con betas verdes, para T1 comienza la aparición de una levadura betas

rosadas a partir del día 21, en T2 aparece en el día 28 y para T3 se evidenció el crecimiento

55

del hongo el día 35. De acuerdo a Schmidt (2007) indica que la nisina no actúa en contra de

bacterias gram negativas, u hongos, sin embargo, se puede apreciar que ralentiza el desarrollo

de los mismos.

El pH como propiedad fisicoquímica suele ser un determinante para el desarrollo de

microorganismos fúngicos, puesto que estos crecen mejor en medios ácidos (García,

Quintero, & López, 2004), característica que con el pasar del tiempo mostró una tendencia

descendente como se observó en la figura 17, permitiendo así el crecimiento de

microorganismos, en este caso acidófilos, los cuales no suelen ser patógenos, esta tendencia

descendente suele ser coherente con la actividad de las BAL la cual es ejercida como

resultado de la competencia por nutrientes, por su capacidad de producir ácidos orgánicos y

ácido láctico, (Albornoz & Colmenares, 2008) Aunque no se realizó un análisis del

comportamiento de las bacterias lácticas, el comportamiento del pH durante el seguimiento

evidencia el efecto de inhibición de la actividad de la bacteriocina sobre los microorganismos

acidofilos presentándose un descenso más marcado en el queso patrón que no contenía nisina

y un descenso progresivo en los tratamientos que no la contenían, ya que un pH más alto

indicaría una menor presencia de microorganismos y un pH bajo un aumento de los mismos.

La aparición progresiva de microorganismos contaminantes permite corroborar que el

proceso de descomposición se inicia más rápidamente en el queso sin nisina, continua con el

queso que tiene nisina en forma directa ya que se encuentra más expuesta en la matriz al

contacto directo con los microorganismos a comparación con los tratamientos T2 y T3 donde

la bacteriocina está protegida por el encapsulamiento.

56

Se debe resaltar que el día 28 los quesos ya presentaban un olor desagradable, indicando

que el producto se encuentra en etapa de descomposición, y por ende se forman amoniaco y

ácido sulfhídrico (Academia de Área de Plantas Pilotos de Alimentos, 2004). Dichos

comportamientos corroboran que la nisina encapsulada permite alargar la vida útil del queso

en un promedio de 13 días, e identificar que T3 es el tratamiento que mejor funciona debido

a que prolonga la vida útil ralentizando el crecimiento de hongos y bacterias.

Se comprueba el efecto de inhibición que posee la nisina debido a que redujo

significativamente el crecimiento de Listeria innocua, sin embargo, para obtener un producto

final de buena calidad es necesario partir de materia prima optima (Gil, 2010) y dentro de los

procesos aplicar BPM. Además se recomienda utilizar un envase primario, como lo es la

bolsa de vacío, que permite contener el producto y protegerlo de contaminantes. En

conclusión, se obtuvo que la adición de nisina fue efectiva, no obstante, como indican los

resultados se requiere otro proceso que mantenga constante su inhibición inicial, como lo es

la encapsulación, debido a que en caso contrario se presentara el desarrollo de una resistencia

que hará que la población de sobrevivientes se recupere (Schmidt, 2007).

57

CONCLUSIONES

Teniendo en cuenta que el tamaño conseguido de las microcápsulas oscila entre 0,49 y

0,88 mm se concluye que con el método de liofilización y maceración aplicado a las

soluciones en combinación 1:1 y 1:4 (nisina- alginato de calcio) permite obtener

microcápsulas.

Los resultados obtenidos en el análisis sensorial permitieron concluir que respecto a los

atributos evaluados es más agradable para los panelistas T1, corroborando que la adición

directa de nisina no afecta los parámetros sensoriales. Al analizar estadísticamente los

datos obtenidos en el panel sensorial se presentan diferencias significativas en los

atributos de color, sabor y aroma a causa del método de esterilización empleado para las

cápsulas de nisina, sin embargo, no se afecta la textura del queso.

Los análisis fisicoquímicos durante el seguimiento de los tratamientos, muestran una

humedad promedio de 55,24% y de acuerdo a la NTC 750 (ICONTEC, 2000) se puede

clasificar como un queso firme/semiduro, un pH de 5,48, y una acidez de 0,71% de ácido

láctico, los cuales están dentro de los parámetros característicos de un queso fresco,

concluyendo que la adición de nisina directa o encapsulada genera cambios que causan

diferencias significativas entre tratamientos pero sin alterar las características

fisicoquímicas del queso fresco.

En el crecimiento de L. innocua se produce una reducción de ciclos logarítmicos en

comparación con el patrón de 0,17 en T1, 0,27 en T2 y 0,44 en T3, demostrando la

eficiencia de nisina como agente ralentizador e identificando que el tiempo de acción de

la nisina es rápido dependiendo de su concentración

58

En el comportamiento del crecimiento de L. innocua se evidencia que T3 en comparación

con los demás tratamientos detiene por mayor tiempo el crecimiento de la bacteria,

corroborando que la nisina encapsulada en proporción 1:4 (nisina- alginato de calcio)

prolongan el efecto de la bacteriocina.

Se puede observar que los tratamientos presentaron una disminución de la población de

L. innocua, sin embargo, al pasar el tiempo está continúa creciendo, lo que permite

concluir que la nisina en las concentraciones manejadas no tiene un efecto letal sobre L.

innocua

59

RECOMENDACIONES

Al presentarse el cambio en el color de las cápsulas se propone analizar un método

diferente de esterilización, como podría ser el uso de una cámara de radiaciones U.V, ya

que este es un método que maneja longitudes de onda entre 240 a 280 nm, impidiendo

así el desarrollo de los mismos y no afectaría el color de las cápsulas. De igual manera es

recomendable realizar la prueba sensorial en comparación con un queso comercial para

poder evidenciar si al adicionar nisina directa o encapsulada se presentan o no diferencias

significativas.

La implementación de un estudio de vida útil medio predictivo, permitiría calcular con

mayor exactitud el periodo de tiempo que se amplía la caducidad del queso, permitiendo

así complementar esta investigación.

Se recomienda realizar no solamente la encapsulación de la nisina sino también trabajarla

junto con otros antimicrobianos como lo son el ácido acético, el ácido láctico y el

benzoato de potasio quienes estando solos no alcanzan una gran reducción de L.

monocytogenes, pero en combinación con nisina, logran una fuerte inhibición inicial, y

una consecuente mantención del número de células en el tiempo.

La determinación de la concentración final de nisina en el producto elaborado podría

indicar la efectividad del método de encapsulación implementado con respecto a la

conservación de la concentración inicial de la bacteriocina.

60

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69

ANEXOS

Anexo A. Cuadrado de Pearson para calcular la adición de ácido lácteo requerido en la

acidificación del lactosuero.

A B – C

C

B A – C

𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑆𝑢𝑒𝑟𝑜 𝐿á𝑐𝑡𝑒𝑜 𝑥 𝐴 − 𝐶

𝐵 − 𝐶= 𝑚𝑙 𝐴. 𝑙á𝑐𝑡𝑖𝑐𝑜 𝑟𝑒𝑞𝑢𝑒𝑟𝑖𝑑𝑜

Donde

A= % Acidez en el Suero Lácteo

B= % Acidez en el Ácido Láctico

C= % Acidez deseada

Anexo B. Ficha técnica de la Nisina

70

Anexo C. Ficha técnica de Listeria innocua Seeliger

71

Anexo D. Escala de Mc Farland.

Anexo E. Formato implementado en prueba sensorial

72

Anexo F. Mediciones obtenidas del tamaño promedio de las cápsulas en mm

Tratamiento 2 Tratamiento 3

Objetivo x4 D

medición Objetivo x10

D

medición Objetivo x4

D

medición Objetivo x10

D

medición

Imágenes 48

0,6613

Imágenes 48

1,0261

Imágenes 48

1,0705

Imágenes 48

1,2715

0,3838 0,7516 1,2884 0,6856

0,3838 0,2866 1,0571 0,8882

0,674 0,4953 1,3908 1,0896

1,1022 0,7119 0,8349 0,6232

0,3577 0,3656 0,5705 0,989

0,6769 0,4989 0,5743 1,0649

0,4175 0,5201 1,2912 0,7759

0,4748 0,6195 0,9238 0,6941

0,4822 0,3162 0,8503 0,9983

0,42 0,4105 1,0842 1,072

0,598 0,3203 1,7197 0,796

0,5475 0,4259 0,7005 1,3462

0,6669 0,2954 0,4257 1,213

0,5019 0,3186 0,5993 0,9982

0,3489 0,4174 0,678 0,9799

0,5511 0,3978 0,9023 1,0151

0,4609 0,2261 0,883 0,9658

0,4692 0,4006 0,7442 0,9831

0,6397 0,438 0,5234 0,9899

0,5315 0,3152 0,69 0,45

0,7592 0,5749 0,6252 0,5199

0,6593 0,317 1,172 1,3384

0,7752 0,2947 0,8348 0,813

1,0065 0,2788 0,6218 0,7399

0,5133 0,298 1,1216 0,9469

0,9205 0,315 0,9874 1,2196

0,3687 0,5767 0,6514 1,2749

0,3736 0,4765 0,8075 0,9099

0,5164 0,2908 0,7037 1,1781

0,5034 0,9696 0,4704 1,3315

0,7518 0,9295 0,8241 0,7388

0,4232 0,8197 0,4712 0,8999

0,4912 0,7708 1,1002 0,8812

73

0,8379 0,4901 0,5778 0,5899

0,4609 0,4108 0,6958 0,9134

0,4984 0,3833 1,1263 0,8212

0,4428 0,1976 0,683 0,9179

0,6476 0,202 0,7097 0,8699

0,5117 0,263 0,5681 0,7868

0,5233 0,2767 0,912 0,501

0,3825 0,5488 0,6217 0,6866

0,2603 0,5813 0,5141 0,9238

0,492 0,3091 1,0519 0,7899

0,4832 0,3557 1,2136 0,7999

0,4042 0,247 1,0733 1,0832

0,3561 0,247 0,6441 0,5933

0,374 0,275 0,4964 1,0599

PROMEDI

O 0,54

PROMEDI

O 0,44

PROMEDI

O 0,84

PROMEDI

O 0,92

Anexos G. Resultados obtenidos de la evaluación realizada por el panel sensorial

Color P T1 T2 T3 Sabor P T1 T2 T3

1 8,9 9 3,6 9,2 1 8 9,5 8,5 9

2 9,5 9,5 9,5 0,1 2 9,5 6,5 3,5 0,4

3 9,1 9,5 9 9 3 9,4 9,4 9,5 9,1

4 8,7 6,3 2 1,5 4 8 7 5 5,3

5 9,6 9,6 0,3 0 5 9,5 10 0,4 0

6 7,8 7,3 2 2,4 6 8 6,1 2,1 4,5

7 8 9 0,3 2,5 7 6 7,8 8,3 7,8

8 8,3 8,2 2 2,5 8 8 8,1 7,8 2,6

9 8,5 8,7 2,5 4,7 9 6,7 4,9 8 4,4

10 6,7 7,8 1,5 3,3 10 4,5 7 7,6 8

11 3,8 7,4 2 1,6 11 5,7 3,6 6,3 3,5

12 10 10 5,5 6,6 12 8,9 9,2 5,3 8,2

13 8,3 7,9 3,8 3,2 13 8,4 8,4 7,9 7,2

14 8 5 2,1 1,4 14 6,4 7,1 3,7 2,3

15 9,4 9,4 0,9 0,9 15 9,2 9,2 8,6 8,9

16 8,6 7,5 1,8 1,9 16 8,6 7,4 3,2 4,9

17 9,6 9,3 0 1,5 17 9 8,8 8,5 7,2

18 6,9 6,7 7,8 3,1 18 7,3 5,8 4,3 2,6

19 9,5 9,4 0,6 0,7 19 9,5 9,5 0,6 0,9

74

20 9,5 9,3 0,5 1,1 20 9,3 5,5 9 0,9

21 9,5 7,7 2,5 0,5 21 7,4 7,4 9,5 7,4

22 5,7 5,1 2,5 3,1 22 5,6 5 5,1 5

23 9,5 9,5 2,4 2,4 23 9 9,2 3,5 7

24 9,5 7,6 5,7 4,8 24 9,4 7,6 5,6 4,8

25 6,1 6,4 0,8 0,8 25 7,5 7,5 6,7 4,8

26 6,7 7,5 2 1,9 26 6,7 7,5 9,2 6,8

27 7,4 8,3 0,8 1,8 27 9,7 9,4 7,6 7,4

28 6,9 7,1 2,6 2,3 28 6,5 8 3,8 3,7

29 8,1 7,9 3,7 3,3 29 7,5 8 6,3 4,1

30 6,6 9,2 2,5 4,8 30 6,6 9 2,4 5,2

31 8,2 8,5 2,5 2,5 31 7,7 8,3 7,4 4,3

32 8,9 9,1 6,7 6,1 32 8,9 9 10 10

33 7,4 8,3 1,8 0,4 33 5 8 5,9 6,6

34 9,5 9,4 0,5 0,7 34 9,3 0,3 0,4 0,9

35 5,1 4,1 0,6 0,7 35 6 1,2 4,4 0,7

36 9,7 9,8 0,9 1,2 36 10 9,4 4 5

37 7,3 7,2 9,5 3,4 37 6,2 7,6 8,6 3,7

38 7,3 6,6 4,3 5,8 38 7,1 5,8 4,3 4,9

39 7,4 0,4 6 1.5 39 7,9 7,5 8,4 5,4

40 4,6 9,1 5 8,5 40 9,6 8 1,6 8,7

41 6,5 4,8 2,2 3,8 41 6,1 7,8 2,2 3,7

42 7,3 7,3 1,7 1,8 42 7,2 7 2,1 2,3

43 7,6 8,2 4,1 5,9 43 7,5 8,1 3 6,4

44 7,7 1 5,9 3 44 8,3 0,6 6,9 2,4

45 8,8 9,1 1,5 0,9 45 8,6 8,8 5,3 4,9

46 8,5 6,7 3,6 5,3 46 5,5 5 3,5 6,2

47 6,5 8,6 3,3 0,9 47 7,1 9,4 3,6 0,4

48 9,1 8,8 1 2,9 48 7,6 8,6 0,6 0,9

49 9 9,1 1.3 1,1 49 7 9 6,3 2,7

50 10 10 5,4 4,5 50 9,9 10 7 7,1

51 9 9,1 4,1 6 51 9,1 9,3 8,9 9,1

52 8,1 6,9 3,2 3,3 52 6,8 4,3 5,7 3,5

Textura P T1 T2 T3 Aroma P T1 T2 T3

1 5 3,2 4 9 1 8,5 9 4,3 8,5

2 4,5 9,2 7,5 1 2 9,7 9,1 9,2 1,2

3 0,8 0,8 0,6 0,9 3 9,2 9 9 9,2

4 2 3,4 7,8 6,3 4 6,2 6,1 4,3 5,2

5 5,4 2,6 8,6 5,6 5 9 7,8 6,6 0

75

6 4,1 3,5 7,7 5,5 6 8,5 4 6,5 6,3

7 0,7 1,2 0,8 1,3 7 7,1 8,1 8,7 7,8

8 2,1 2,2 2,3 8 8 7,6 8 8,1 2

9 1,3 5 8 1 9 8,1 5 5,8 4,5

10 4,3 3,7 5,5 1,5 10 5,2 4,5 4,5 4,5

11 5,1 5,1 4,7 5,7 11 7 6,1 2,3 4

12 6,7 8,5 10 8,7 12 7,8 9 5,4 7,2

13 8,1 4,3 5,8 4,4 13 8,5 7,4 7,6 7,2

14 5,5 6,6 6,4 3,6 14 4,8 5,6 3 1,7

15 0,5 1 3,3 6,5 15 8,8 8,8 8,5 8,5

16 8,7 4,5 10 7,2 16 5,8 5,2 5,6 5,4

17 0,7 0,6 8 7,2 17 9,1 9,4 1 1,2

18 1,5 1,8 5,3 2,9 18 8,2 7,4 7 4,2

19 0,7 1,1 9 9 19 8,9 8,9 1,2 0,8

20 5 7 8,9 9 20 5 5,3 9,2 9

21 2,8 7 8,8 8,5 21 7,7 9 9,5 8

22 3,2 3,4 6 5,2 22 5,5 5,1 4,4 4,5

23 1,4 0,2 1,1 0,9 23 9,2 9,2 7,5 7,4

24 1,4 1,6 5,7 0,9 24 7,8 7,8 10 7,4

25 3,1 3,2 5,3 4 25 7,1 8,5 4,1 3,2

26 8,3 9,1 8,4 8,6 26 5,4 6,4 5,2 5,1

27 5,6 7,6 5,6 7,2 27 7,2 9,4 5,5 8

28 6,9 6,1 2,5 3,9 28 5,9 7 4,5 5,3

29 8,8 6,1 4,6 5,9 29 7,4 7,4 5,6 4,5

30 7,8 9 4,8 1,7 30 6,8 8,9 5,3 5,4

31 0 4,9 4,3 7,9 31 7,6 7,7 7,4 7,9

32 6,4 0 9 10 32 10 10 9,2 10

33 0,5 8 4,2 7,6 33 5 8,1 5,1 5,2

34 7,7 9,2 9,2 1 34 1 9,1 0,7 1,1

35 7,2 4,8 2,3 1 35 9,2 9,2 1,2 8,8

36 8,2 9,5 6,9 8 36 10 9,8 8,8 9

37 7,2 7,7 9,2 6,9 37 9,4 2 8,5 9,2

38 7,1 5,3 3,7 5,6 38 6,3 6,5 6,5 5,1

39 2 5,2 7,5 4,1 39 4,5 4,6 5,2 2,5

40 0,5 1,2 8,5 4,6 40 5 4,8 8,2 5,7

41 4,2 6,5 2,2 6,2 41 5,1 3,7 2,2 3,4

42 4,1 6,6 7,4 7 42 5,5 6,7 2,2 2,4

43 1 1 6,6 3,3 43 7,6 8 5,9 4,1

44 0 4,5 0 6,6 44 7,9 0,9 7,1 0,4

45 8,7 8,7 5,4 8,9 45 8,7 8,6 9,1 9

76

46 4 7,8 7,8 6,2 46 6,3 7,4 8,2 8,1

47 8 2,1 4,5 3,6 47 6,6 8,9 6 2,6

48 9,3 8,9 0,4 0,5 48 9,5 8,7 0,9 3,6

49 8 1,4 5,1 3,2 49 9 9,1 2,3 2,9

50 10 1,8 3,9 4,6 50 10 10 9,8 3,7

51 9,3 9,5 7,7 9,2 51 9,4 9,6 9,2 9,3

52 1,3 4,3 4,5 2,6 52 7,9 7,9 6 4,7

Anexo H. Resultados obtenidos en la prueba de humedad

Tratamiento/

Día 1 5 14 21 28 35

P

56,25 56,1 55,94 55,95 54,74 54,37

56,01 55,97 55,83 55,81 54,95 54,38

56,31 56,08 55,9 55,7 54,92 54,36

1

55,95 55,65 55,51 55,45 54,75 54,37

55,83 55,49 55,36 55,28 54,53 54,42

55,83 55,63 55,42 55,23 54,79 54,38

2

55,91 55,63 55,32 55,26 54,62 54,38

55,81 55,48 55,15 55,15 54,73 54,32

55,77 55,63 55,22 55,07 54,63 54,35

3

55,76 55,43 55,15 54,92 54,73 54,39

55,68 55,49 55,02 55,06 54,59 54,28

55,72 55,61 55,22 55,05 54,6 54,35

Anexo I. Resultados obtenidos de la prueba de pH

Tratamiento/

Día 1 5 14 21 28 35

P

5,59 5,53 5,53 5,45 5,42 5,36

5,52 5,52 5,5 5,41 5,38 5,33

5,55 5,53 5,49 5,42 5,41 5,32

1

5,57 5,54 5,49 5,47 5,41 5,40

5,56 5,53 5,52 5,46 5,42 5,40

5,56 5,54 5,51 5,46 5,43 5,39

2

5,56 5,51 5,51 5,52 5,43 5,44

5,54 5,55 5,53 5,45 5,45 5,39

5,53 5,54 5,52 5,50 5,46 5,42

3

5,58 5,58 5,53 5,51 5,47 5,45

5,56 5,54 5,53 5,48 5,46 5,42

5,55 5,53 5,52 5,50 5,46 5,43

77

Anexo J. Resultados obtenidos de la prueba de acidez

Tratamiento/

Día 1 5 14 21 28 35

P

0,688 0,693 0,699 0,728 0,760 0,785

0,691 0,692 0,696 0,729 0,758 0,784

0,687 0,693 0,697 0,733 0,761 0,787

1

0,684 0,687 0,694 0,712 0,736 0,746

0,682 0,686 0,692 0,712 0,735 0,750

0,681 0,687 0,693 0,711 0,737 0,748

2

0,685 0,692 0,696 0,714 0,727 0,730

0,686 0,691 0,698 0,713 0,728 0,734

0,686 0,692 0,695 0,715 0,727 0,732

3

0,685 0,695 0,697 0,715 0,723 0,729

0,685 0,694 0,700 0,715 0,722 0,732

0,686 0,691 0,699 0,714 0,724 0,734

Anexo K. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de dureza

Tratamiento/día 1 5 14 21 28 35

P

2,359 2,504 2,928 3,584 4,371 7,896

2,057 2,235 3,058 4,048 4,099 6,551

1,695 2,515 3,424 4,145 3,565 7,351

1

1,442 2,180 3,237 3,320 4,947 7,994

2,109 2,566 2,860 3,537 2,927 7,354

2,113 2,133 3,275 4,120 4,153 5,787

2

1,390 1,695 1,897 3,131 3,163 8,230

1,319 2,072 2,769 3,476 3,326 4,433

1,359 2,719 3,053 3,543 5,363 7,963

3

1,866 2,525 2,778 2,350 3,970 7,099

1,309 1,979 2,199 3,280 4,217 3,078

2,252 1,788 2,512 2,520 3,154 5,081

78

Anexo L. Resultados obtenidos en l aprueba de textura en el atributo de Cohesividad

Tratamiento/día 1 5 14 21 28 35

P

0,150 0,371 0,378 0,425 0,445 0,455

0,134 0,328 0,358 0,374 0,412 0,430

0,113 0,310 0,330 0,355 0,365 0,379

1

0,069 0,271 0,307 0,338 0,350 0,366

0,150 0,371 0,378 0,425 0,445 0,455

0,134 0,328 0,358 0,374 0,412 0,430

2

0,113 0,310 0,330 0,355 0,365 0,379

0,069 0,271 0,307 0,338 0,350 0,366

0,150 0,371 0,378 0,425 0,445 0,455

3

0,134 0,328 0,358 0,374 0,412 0,430

0,113 0,310 0,330 0,355 0,365 0,379

0,069 0,271 0,307 0,338 0,350 0,366

Anexo M. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de Elasticidad

Tratamiento/día 1 5 14 21 28 35

P

13,758 7,898 5,518 4,484 5,189 4,727

11,026 7,823 5,755 4,570 5,286 4,925

5,897 7,511 5,773 7,597 5,160 5,480

1

10,192 7,893 5,533 3,801 4,944 5,001

10,206 7,187 5,680 6,859 5,125 5,096

10,169 6,893 5,803 5,631 5,071 4,812

2

7,736 6,844 5,857 6,559 4,828 4,474

8,248 5,702 5,396 4,560 5,461 4,931

7,240 6,099 5,377 5,107 4,831 5,038

3

6,415 5,387 5,542 5,558 4,784 5,060

7,363 6,883 5,505 3,959 4,900 3,722

7,631 5,503 5,447 5,167 4,965 4,963

79

Anexo N. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de Gomosidad

Tratamiento/día 1 5 14 21 28 35

P

0,721 0,813 1,042 1,152 1,455 1,548

0,902 1,090 1,022 1,455 1,648 1,460

0,899 0,996 1,063 1,405 1,351 1,489

1

0,580 0,859 1,092 1,396 1,249 1,372

0,839 1,573 0,902 1,451 1,340 1,580

1,054 0,142 0,786 0,909 1,400 1,338

2

0,682 0,899 0,390 0,502 1,196 0,879

0,555 0,825 1,657 0,942 0,945 1,323

0,782 0,624 0,377 1,252 1,078 1,309

3

0,471 0,272 0,758 0,612 1,254 1,926

0,525 0,213 0,521 0,714 0,850 0,489

0,446 0,994 0,810 0,999 1,001 1,068

Anexo O. Comportamiento de la gomosidad a través del tiempo.

Anexo P. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de masticabilidad

Tratamiento/día 1 5 14 21 28 35

P

44,100 22,814 105,033 66,010 78,950 97,448

41,264 48,011 19,003 90,516 91,824 105,477

29,470 55,158 54,149 75,600 76,912 111,445

1

37,606 26,890 28,857 62,354 97,068 104,170

19,018 40,518 49,864 82,149 59,962 102,276

39,430 56,635 66,028 79,574 67,692 106,040

80

2

11,986 31,646 39,439 80,302 68,690 106,329

9,532 43,652 54,796 52,852 127,234 121,262

74,058 44,445 49,568 64,497 10,119 98,589

3

22,088 43,877 55,581 41,636 75,894 52,655

25,234 24,806 46,759 70,880 78,354 179,175

21,706 39,178 39,764 62,013 48,565 21,808

Anexo Q. Comportamiento de la masticabilidad a través del tiempo.

Anexo R. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de Fuerza de fractura

Tratamiento/día 1 5 14 21 28 35

P

1,593 2,525 2,359 2,928 3,131 6,960

0,006 1,979 1,706 2,681 3,177 6,551

0,011 0,026 1,414 2,966 3,543 7,351

1

0,260 0,026 2,474 3,113 3,173 7,994

0,197 0,023 0,004 3,291 2,807 6,846

0,027 2,719 2,219 -0,009 3,208 3,846

2

0,072 1,772 0,059 1,442 1,344 5,090

0,092 0,105 2,055 1,589 2,497 7,099

0,063 0,015 2,194 2,113 3,053 3,078

3

0,052 -0,004 0,019 0,021 0,004 3,510

0,078 0,008 3,326 3,900 2,965 3,579

0,061 1,287 0,097 0,035 2,252 3,163

81

Anexo S. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de Adhesividad

Tratamiento/día 1 5 14 21 28 35

P

0,396 0,196 0,103 0,057 0,019 0,009

0,393 0,034 0,092 0,089 0,035 0,025

0,397 0,554 0,136 0,089 0,024 0,026

1

0,094 0,127 0,096 0,027 0,033 0,008

0,760 0,222 0,112 0,034 0,013 0,010

0,110 0,210 0,087 0,054 0,013 0,006

2

0,190 0,289 0,058 0,035 0,017 0,003

0,447 0,118 0,057 0,009 0,022 0,005

0,204 0,129 0,084 0,076 0,022 0,002

3

0,260 0,085 0,050 0,038 0,010 0,000

0,275 0,104 0,041 0,041 0,017 0,000

0,225 0,126 0,051 0,037 0,012 0,003

Anexo T. Comportamiento de la adhesividad a través del tiempo.

Anexo U. Resultados obtenidos de la prueba de textura en el atributo de Rigidez

Tratamiento/día 1 5 14 21 28 35

P

0,523 0,854 0,984 0,832 1,071 2,140

0,553 0,411 0,587 0,795 1,003 1,028

0,641 0,598 0,475 0,876 0,847 2,278

1 0,570 0,555 0,477 0,796 0,725 1,887

0,379 0,529 0,565 0,684 0,822 1,811

82

0,381 0,506 0,681 0,729 0,863 1,052

2

0,438 0,467 0,481 0,693 0,825 1,080

0,332 0,450 0,597 0,479 0,947 0,742

0,503 0,470 0,465 0,830 0,446 1,776

3

0,472 0,396 0,481 0,723 0,524 0,920

0,325 0,517 0,425 0,564 0,706 1,157

0,236 0,448 0,460 0,690 0,848 0,661

Anexo V. Resultados obtenidos en el seguimiento microbiológico.

T Repetición Dilución Semana 1 Día

14

Día

21

Día

28

Día

35 Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5

P

1

10^4

14 297 398 397 565 925 809 572 1038

18 286 384 405 580 916 798 579 1032

2 20 305 392 429 568 930 793 583 1050

14 281 401 421 574 915 825 567 1010

3 15 303 395 458 573 924 810 575 1029

16 285 405 438 575 928 817 578 1021

1

10^5

6 37 48 68 62 222 185 165 368

3 38 39 52 63 214 189 158 370

2 10 31 38 48 76 215 192 172 358

2 41 51 69 61 219 177 158 385

3 4 32 42 62 78 220 180 171 376

5 35 49 53 64 215 190 169 379

1

1

10^4

11 49 210 339 331 689 693 471 945

10 120 227 313 327 700 698 469 935

2 9 119 220 301 319 704 677 470 950

11 137 208 346 340 692 706 475 939

3 8 279 200 318 326 706 685 478 955

10 62 217 325 330 698 689 475 942

1

10^5

3 27 36 37 53 156 133 81 290

2 25 31 38 41 149 135 71 275

2 4 26 28 33 46 163 129 87 288

2 31 37 47 50 149 140 67 284

3 3 32 32 41 52 165 131 79 291

3 23 30 42 42 163 139 75 282

2

1

10^4

7 135 168 185 350 657 567 369 952

4 150 177 178 347 662 556 378 933

2 6 145 184 189 351 654 551 363 943

5 137 160 175 346 673 563 381 936

83

3 7 137 175 187 360 658 543 376 938

5 146 164 181 344 679 565 370 942

1

10^5

1 13 24 24 36 135 89 59 250

1 8 22 45 37 145 95 60 248

2 1 17 29 30 33 133 91 61 254

0 12 19 31 45 143 98 53 249

3 1 32 23 35 43 132 103 50 251

1 2 26 25 39 136 98 58 255

3

1

10^4

7 67 83 159 321 675 319 309 479

3 65 88 110 342 655 318 307 482

2 4 63 91 143 331 673 307 298 476

6 67 84 156 329 656 324 314 478

3 3 75 85 158 330 672 310 297 485

5 51 93 168 323 657 312 302 471

1

10^5

1 8 12 25 44 95 31 22 120

0 10 13 13 41 93 38 28 105

2 0 11 9 21 51 91 40 31 110

1 8 17 24 42 88 31 23 116

3 1 9 11 30 47 85 39 25 126

1 7 15 20 53 82 32 18 99

84

Anexo W. Seguimiento fotográfico del queso a través del tiempo.