ISSN 0373-580 XBol. Soc. Argent. Bot. 38 (3-4): 295 - 300. 2003

IMPREGNACIóN ARGéNTICA EN SECCIONES DE

GUCOLMETACRILATO PARA LA DEMOSTRACIóN DE NORS EN áPICES

RADICALES DE ALLIUMCEPA (ALLIACEAE)

MARÍA C. LABRAGA1, ADRIANA N. PEREZ2, VIVIANA TRAVERSO3 y VICTQR H. TOMASI4

Summary: Silver staining to glicolmethacrilate sections for demonstration of NORs in root tips of Alliumcepa (Alliaceae). Nucleolar organizer regions (NORs) are loops of DNA, which are transcribed intoribosomal RNA. NORs can be demonstrated by silver staining techniques, since NOR-associated proteinsare argyrophilic, producing structures termed “AgNOR”. The AgNOR methods, currently available toparaffin-embedded samples, are not entirely satisfactory when applied in order to semithinglycolmetacrylate sections, as unspecific silver precipitates readily from in the sections. In the presentstudy, we report ah AgNOR staining procedure to demonstrate NORs in glycolmethacrilate-embeddedroot meristem cells of Allium cepa L, “onion”. The technique involves the use of microwave pretreatmentof tissue sections before incubation in silver developer solution to optimize the specificity of the method.

Key words: glycolmethacrilate, silver staining, NORs, microwaves treatment, plant anatomy.

Resumen: Las regiones organizadoras del nucléolo (NORs) son bucles de ADN, los cuales transcribenpara la síntesis de ARN ribosomal. Los NORs se pueden demostrar con técnicas de plata, ya que lasproteínas asociadas a los ÑOR son argirófilas y originan estructuras denominadas “AgNOR”. Losmétodos de AgNOR empleados en la rutina de muestras incluidas en parafina dan resultados insatisfac¬torios cuando se los aplican en cortes semifinos de glicolmetacrilato, debido a los precipitados inespecíficosproducidos. Informamos, aquí un procedimiento de impregnación con plata para NORs de célulasmeristemáticas de ápices radicales de Allium cepa L. (cebolla). Para ello, antes de colorear los NORscon la solución coloidal de plata, se realiza un pretratamiento en un homo de microondas a fin deoptimizar la especificidad del método.

Palabras clave: glicolmetacrilato, impregnación argéntica, NORs, tratamiento con microondas, anatomíavegetal.

INTRODUCCIóN '1995; Medina et al., 1995a; Olszewska et al., 1997;Arkhipchuk & Garanko, 2002;Marcano et al., 2002).

Los NORs son porciones de ADN que contienengenes que codifican para la síntesis de ARNribosomal. Los NORs transcripcionalmente activosestán asociados a proteínas ácidas específicas,argirófilas, no’histonas, que pueden ser visualizadoscomo pequeños puntos marrón oscuro con técnicasde plata y son denominados AgNOR (Derenzini &

Ploton, 1991).

Muchos métodos de AgNOR han sido aplicadosenmuestrasbiológicas.En 1963,Das & Alfert utiliza¬ron este método en preparaciones “squash” de célu¬las meristemáticas. Goodpasture & Bloom(1975) de¬sarrollaronuna técnicapara cortes deparafina a 70°C

y fueronlosprimeros endescribir lapropiedad tintóreaespecífica de losNORs. Howell& Black (1980) modi-

La técnica de AgNOR para la “tinción” de regio¬nes organizadoras del nucléolo (NORs) en tejidosvegetales ha sido empleada como uno de los méto¬dos para evaluar hiperactividad celular en diferentescondiciones experimentales (Maszewski &

Kwiatkowska, 1984; Sato, 1985; VázquezNin et al.,1986;Moreno etal., 1988: Dolezel etal., 1989; Zhang,

’Servicio de Analomía Patológica, Hospital de Pediatría JuanP. Garrahan. Combate de los Pozos 1881, C.P. 1252. BsAs.Email: mlabraga@garrahan.gov.arinstituto Multidisciplinario de Biología Vegetal (UNC-CONICET). C.C. 495. Córdoba. 3Cátedra de Histotecnología,Facultad de Ciencias Médicas (UNC). C.P. 5000. Córdoba.4Cátedra de Anatomía Patológica, Facultad de Odontología(UBA), CONICET. Email: vht@cap.odon.uba.ar

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ficaron esta técnica de dos pasos, al emplear una so- les de etanol 96° y Glicolmetacrilato (GMA)lución coloidal de gelatina-ácido fórmico-nitrato de (Historesin®,Leica) e incluyeron enGMA nuevo, si-plata en un solo reactivo “colorante”. Desde enton- guiendo las instrucciones delkit comercial. Se reali¬ces, diferentesmodificaciones delmétodo “AgNOR” zaron cortes seriados de 3 pm de espesor conhan sido realizadas en muestras incluidas en parafi- micrótomo de rotación (Leica®) y navaja de vidrio,na, a fin de obtener “coloraciones” de elevado con- los cuales se pegaron sobre portaobjetos silanizadostraste y evitar la formación de precipitados (ICN, Cat.: 154766). Tras estirar sobre Platinainespecíficos de plata metálica. Estas modificaciones termostatizada a 50°C, los cortes se secaron enEstu-metodológicas se ajustaron al procesamiento y carac- fa a 60°C durante 24 horas.terísticas delamuestra,grado depurezade losreactivosutilizados, técnica y tiempo de fijación, concentración solución acuosa 12 mM de ácido cítrico (Anedra) a

del“colorante”,temperaturade “coloración”,tratamien- pH 6.0, contenida en una caja de Koplin. El pH se

tosprevios a la“tinción”y masa de inclusión. (Hizume ajustó con hidróxido de sodio en perlasetal.,1980;Plotoneta/.,1986;Cromiee/u/.,1988;LiQ (Mallindckrodt). Se colocaron en un Horno deet al., 1995; Medina et al., 1995b; Other et al., 1995; Microondas BGH® de 1100W con bandeja giratoriaJuntes, 1996;Orreaetal.,2001).

Enmicrotécnica vegetal, el método deHowell& de 5 minutos cadauno. Se dejaron enfriar hasta tem-

Black (1980) ha sido ampliamente aceptado para la peratura ambiente y lavaronconagua destilada.Lue-“tinción” de NORs en secciones de parafina y resi- go, las preparaciones se colocaron durante 30 minu-nasplásticas de origenepoxídico o acrílico (Schubert, tos en otra caja de Koplin limpia conteniendo el1984; Sato, 1985;Khuong& Schubert, 1985;Dolezel reactivo de plata, en cámara oscura y a temperatura <

etal., 1989;Moreno etal., 1985, 1988; Medina etal. ambiente.Elreactivo de impregnación se preparó en

1995b). Sinembargo, se observó que laaplicaciónde elmomento de usar, mezclando 2 partes deuna sobr¬está técnica en cortes semifinos de ápices radicales ción acuosa de nitrato de plata al 25% y 1 parte dede Allium cepa L.(cebolla) Alliaceae incluidos en una solución acuosa de gelatina al 2% (ambasglicolmetacrilato mostró precipitados de plata Mallindckrodt),adicionadacon 1mide ácido fórmicoinespecíficos y “tinción” de fondo inadecuados para puro (Anedra). Tras la “tinción”, las secciones se

el estudio de losNORs de célulasmeristemáticas. De lavaron con 3 cambios de agua destilada, se

estamanera,elpropósito delpresente trabajo fue ajus- deshidrataron con alcohol etílico, clarificaron con 2tar el método de AgNOR en secciones semifinas de cambios de xilol y montaron con Entellán (Merck).glicolmetacrilato para la demostración de NORs en Paralelamente, se realizaronpruebas con 3 ciclos demeristemas de ápices radicales de cebolla, a fin de irradiación de 3 y 10 minutos cada uno en elmismoobtener preparaciones histológicas de alto contraste ácido y a igual temperatura (60°C). Otro set de cortes

y sin precipitados inespecífico.

Las secciones histológicas se sumergierón enuna

(Potencia al 30% a 60°C) y se irradiaron con 3 ciclos

histológicos adyacentes fue “coloreado” de acuerdoal método de rutina de Howell & Black (1980), em¬

pleando el mismo reactivo de plata a 70°C, sinpretratamiento con ácido cítrico nimicroondas.

Las fotografías fueron obtenidas con un

fotomicroscopio AxioskopMOT-2 C. ZeissMATERIALES Y MéTODOS

Cinco fragmentos de 5 mm de longitud de ápicesradicales de Allium cepa (2n= 16) desarrollados a RESULTADOSpartir de bulbos colocados en agua común a 25°Cdurante 48 horas fueron fijados enFAA(formaldehídopuro, etanol 96°, ácido acético 1:4:1) a temperatura. Los preparados histológicos irradiados con 3 ci-

ambiente durante 24 horas. Tras lavar con agua co- clos de 5 minutos cada uno enHomo de Microondas

múnacorrientecontinuadurante 30minutos, lasmués- (potenciaal 30%a60°C), sumergidos enácido cítrico

tras se deshidrataron en una serie de alcohol etílico apH 6.0,mostraron los mejores resultados de «colo¬

en graduación creciente hasta etanol 96° (15 minutos ración» (Fig. 1A). En las muestras analizadas se ob-

en cada uno). Posteriormente, las muestras se colo- servaron claramente losNORs de colormarrónoscu-

caron durante 12 horas en una mezcla a partes igua- ro sobreunamatriznuclear de tonalidadamarilla.Es-

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tos resultados de “tinción” fueron de elevado con- dos en lamatriznuclear (Treré,2000).LosNORspre¬traste y no presentaron precipitados inespecíficos. sentan fragmentos de ADNque codificanpara la sín-

Laspreparaciones que fueron irradiadas con 3 ci- tesis de ARNribosomal.Las variaciones en elpatrónclos de 3 minutos cada uno mostraron “coloración” normal de los AgNORs indican cambios cualitativosdébil de losNORs (Fig. IB).Lospreparados que fue- y cuantitativos en la síntesis de proteínas. Un incre-ron coloreados con la técnica de Howell & Black mentoenelnúmerodeAgNORsreflejahiperactividadcelu-mostraron“coloración”marrónoscuro de losnúcleos lar,loqueasuvez indica,endiferentescondicionesexperi-al igualque losNORsyprecipitados inespecíficos de mentales,unincremento enelrango deproliferacióncelu-plata metálica depositados sobre la matriz lar, cambios en los procesos de diferenciacióny actividadcitoplasmática. Si bien los NORs se colorearon más secretora(Wachtler etal.,1986;Treré,2000).intensamente, el contraste con la matriz nuclear fue En microtécnica vegetal, diferentes trabajos haninsuficiente (Fig. 1C). Las prepáraciones que se irra- sido desarrollados con el propósito de determinardiaron durante 10 minutos por cada ciclo mostraron cambios morfológicos y cuantitativos de los NORs,desprendimiento del corte histológico a partir del provocados tras la aplicación de substancias talesportaobjeto silanizado. como 6-benzilaminopurina y 24-epibrassidolina

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Fig. 1. Tinción de AgNOR de ápices radicales de Allium cepa en secciones de Glicolmetacrilato. A: Pretratamiento -con ácidocítrico e irradiación de 3 ciclos de 5 minutos cada uno, x 200. El «inset» ilustra detalles de los NORs sobre la matriz nuclear,x 500. B: Pretratamiento con 3 ciclds de 3 minutos de irradiación, x 200. C: Método de AgNOR de rutina, x 200.

(Fatkhutdinovaetal.,2002),mercurio(II),metolachlory 4-nitroquinilina-N-óxido (Arkhipchuk & Garanko,2002),5-azacitodina(Olszewskaetal.,1997), clorurode cadmio o aluminio (Zhang, 1995; Marcano etal.,2002). Otros autores caracterizaron la organización

son selectivamente coloreadas por métodos dé plata, funcionalde losNORs a finderelacionarlaconmeca-Tras la tinción, los AgNORs pueden ser fácilmente nismos de.proliferación celular y análisis de ploidíaidentificados como puntos marrón oscuro localiza- en condiciones normales de crecimiento (Maszewski

DISCUSIóN Y CONCLUSIONES

LosNORs son componentes nucleolares que con¬

tienen una serie de proteínas argirófilas, las cuales

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&Kwiatkowska, 1984;Moreno et al., 1988;Dolezel vos de los AgNORs, especialmente, cuando el estu-

etal., 1989;Medina et al.,1995a; Zurita et al., 1998; diohistomorfométrico serealizaconunanalizador deMedina et al., 2000). En estos trabajos se utilizó la imágenes asistido por computadora (Rüschoff et al.,técnica de plata de rutina con resultados satisfacto- 1990; Bõcking & Rüschoff, 1999). En este sentido,ríos de “tinción”. Sin embargo, la aplicación de este acordamos conCromie etal. (1988), quienes informa-método en secciones semifinas de GMA mostró “co¬ ran que los precipitados inespecíficos podrían origi-loración” argéntica inespecíficaque dificultó la iden- narse por la presencia de residuos aldehídicos libres,tificación de losNORs. los cuales quedan en el tejido tras la fijación con

De esta manera y de acuerdo a los resultados ob- formalina. Alrespecto, se sabe que la formalina esuntenidos, concluimos que el pretratamiento con ácido agente reductor muy empleado en “tinciones”cítrico 12 mM en microondas durante,3 ciclos de 5 argénticaspararevelar laplatacatiónica(Ag+) aplataminutos cada uno, mejora substancialmente la metálica.(Ag°) (García del Moral, 1993). La mezcla“tinción” de los NORs de ápices radicales de Allium fijadorautilizadarutinariamente enhistología vegetalcepa incluidos englicolmetacrilato,ya que losNORs contiene formalina y, por tanto, sería posible que di-se colorean de marrón oscuro sobre una matriz nu- chos residuos de formalinapresentes en el tejidopre-clear amarilla que permite obtener imágenes cipiten la plata sobre el corte histológico de manerahistológicas de elevado contraste y sin precipitados inespecífica, a menos que se neutralice la actividadinespecíficos. Tiempos menores a 5 minutos de reductora del residuo aldehídico en unpaso previo apretratamientopor ciclo de irradiación fueron insufi- la coloración. De esta manera y como sucede concientes para obtener resultados de “tinción” adecúa- otros agentes químicos tales como glicina,dos y, al respecto, acordamos con Horobin (2002) hexacianoferrato de potasio y ácido nítrico (Cromiequien enfatizó que los tiempos de pretratamiento y et al., 1988; LiQ et al., 1995; Orrea et al., 2001), el“coloración” de secciones semifinas de GMA deben pretratamiento con ácido cítrico podríaneutralizar laser prolongados. La aplicación de tiempos mayores acciónreductora de la formalina, evitando laprecipi-produjo pérdida del corte histológico debido a la ex- tacióninespecífica (Ofner etal., 1995;Juntes, 1996).

El GMA ha sido ampliamente utilizado paraSi bien las impregnaciones argénticas se produ- microscopía de luz, debido a que las imágenes

cen por mecanismos predominantemente físico-quí- histológicas que se obtienen con este medio de in¬micos, donde determinadas estructuras tisulares elusion son de excelente calidad cuando se las com¬

posición excesiva de calor y microondas.

electronegativas atraen iones de plata cargados po-. paran con las deparafina.El grado de dureza de esta

sitivamentepor unmecanismo electrostático (García resina acrílica permite incluir y seccionar muestras

del Moral, 1993), los fenómenos por los cuales se vegetales duras, asegurando la obtención de cortes

producen estas “tinciones” son aún poco entendi- con imágenes más nítidas. Moreno et al. (1988) em-

dos. En este contexto, no obstante, elpretratamiento plearon la tinción de AgNOR en cortes semifinos de

ácido cítrico permitiría desenmascarar los teJidos vegetales incluidos enLowicryl.Esteproduc¬to comercial esmíaresinaacrílicaquepolimerizabajola acciónde luzultravioleta. Sinembargo, estameto¬

dología es muy costosa, ya que precisa un sistemade polimerización poco común en un laboratorio derutina. En este sentido, el método propuesto aquí ensecciones vegetales incluidos en glicolmetacrilato es

,sencillo, rápido y proporciona preparacioneshistológicas de elevado contraste y sin precipitadosinespecíficos. Además, el bloque de GMA presentala ventaja adicional de no mostrar cambios

diluida (12mM) e irradiación moderada con volumétricos durante el corte con micrótomo, comomicroondas mejoró la calidad de las imágenes lo hace eldeparafina. Estopermite larealizacióndecor-histológicas en secciones de GMA.

Por otra parte, los precipitados inespecíficos de importanciaenestudioscuantitativos.Deestamanera,esteplatametálica sobre elcorte histológico es uno de lqs método de AgNOR, en combinación con ácido cítrico yproblemas más importantes que se presenta durante microondaspara secciones de glicolmetacrilato,presenta-

. el análisis de parámetros morfológicos y cuantitati- ría ventajas para el desarrollo de estudios sobre

con

aminoácidos acídicos concentrados en los dominiosterminales aminos de lanucleolina,responsable de la

coloraciónespecíficade losNORs(Õfher etal.,1995).Esta reacción estaría aceleradapor la irradiación con

microondas que actúa como co-factor aumentandola temperatura. Sibien la irradiaciónconmicroondashasido empleadaparala“tinción”argénticadeNORsen cortes de parafina (Medina et al., 1995b; Juntes,1996),elpretratamiento conácido cítrico ensolución

tes seriados de igual espesor, lo cual adquiere especial

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cuantificación deNORs en muestras vegetales, especial¬mentesidichosestudios sehanderealizarconanalizadores

deimágenesasistidosporcomputadoras(Õfheretal.,1995;Booking&Rüschoff, 1999).

AGRADECIMIENTOS

AlaDra.MaríaTeresaGarcía deDávilapor sucons¬

tante apoyo ypor permitimos eluso de los equipos del

Servicio a su cargo, pertenecientes al Hospital de Pe¬

diatría Dr. Juan P. Garrahan,BuenosAires. Asimismo,

agradecemos a la firma Luis Marsán, representante de

Leica Histological Products, por el apoyo económico

brindado para la realización de este trabajo.

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