IMPORTANCIA DE LAS BACTERIAS CIDO LCTICAS.Las especies ms usadas para retardar el deterioro y preservar los alimentos en forma natural son las de los gneros Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Lactobacillus y Carnobacterium. Los cuales se han aislado a partir de granos, plantas verdes, productos lcteos y productos crnicos, fermentacin de verduras y las especies mucosas de los animales (Jami, Kneifel, & Domig, 2013)1. Estos microorganismos producen diferentes sustancias con caractersticas antimicrobianas. La capacidad de producir grandes cantidades de cido actico y cido lctico por fermentacin de los carbohidratos presentes y la consecuente cada del pH son los factores primarios en los que se basa la actividad antimicrobiana de las BAL (Martnez Fernndez, 1996)2.Las bacterias cido lcticas (BAL) no slo resultan de importancia por su empleo a nivel de la industria alimentaria en la elaboracin de productos fermentados que en forma genrica son: derivados lcteos, vegetales y frutas fermentadas, salchichas, carnes y pescado fermentado; tambin presentan importancia para la industria farmacutica por la sntesis de sustancias denominas nutracuticos, cuyo consumo aporta un efecto benfico sobre la salud humana, entre los cuales se hallan los exopolisacridos, los cuales adems se emplean en productos comestibles para mejorar su consistencia. Otros fines que tiene el cultivo de bacterias cido lcticas es la obtencin de saborizantes, espesantes, cido lctico y bacteriocinas. En el caso de las bacteriocinas en la actualidad la industria las utiliza en los alimentos como bioconservantes logrando extender la vida til de stos y evitando el agregado de sustancias qumicas para su conservacin, aunque tambin se suele adicionar las bacterias lcticas para que ellas sinteticen las bacteriocinas en los productos. El empleo de bacterias lcticas en la elaboracin de productos lcteos fermentados resulta central por las propiedades caractersticas de aroma, sabor y textura que stas desarrollan, como tambin por la seguridad microbiolgica a causa del bajo pH, presencia de bacteriocinas y otras productos con actividad antimicrobiana, ejemplo el perxido de hidrgeno, resultante de su metabolismo, lo que permite prolongar la vida til del producto. La industria alimentaria tambin ha mostrado inters en el uso de dichos fermentos por el efecto benfico que estos microorganismos tienen sobre la salud del consumidor, dicho efecto puede deberse a productos resultantes de su actividad microbiana, este es el caso de los pptidos bio-activos generados en el proceso de protelisis, o a los microorganismos en s, como ocurre en los alimentos probiticos, productos que proveen microorganismos propios de la flora intestinal, a nivel del cual impiden la instalacin de microorganismos exgenos como los patgenos, gracias a mecanismos como la influencia en el peristaltismo del intestino. Caracteres generales de las bacterias cido lcticas. Las bacterias acido lcticas (BAL) son un grupo de bacterias Gram-positivas, no esporuladas, no pigmentadas, catalasa negativas, mayoritariamente nitrato reductoras negativas y capaces de crecer en el rango de pH entre 4,0 y 4,5; anaerobias facultativas o microaeroflicas, cuyo metabolismo es fermentador y que dependiendo si da como nico producto de fermentacin cido lctico o est acompaado por la generacin de otros compuestos se distinguen en bacterias homolcticas o heterolcticas, respectivamente. Las bacterias lcticas homofermentantivas generan como producto principal de la fermentacin cido lctico, estos microorganismos son todos los miembros del gnero Pediococcus, Streptococcus, Lactococcus y varias especies de Lactobacillus. Con respecto a las bacterias heterolcticas, durante la fermentacin adems de cido lctico producen dixido de carbono, cido actico, cido frmico y etanol. Este tipo de fermentacin ocurre en bacterias del gnero Leuconostoc y Lactobacillus. Las bacterias cido lcticas son microorganismos auxtrofos, es decir, requieren una serie de componentes (aminocidos, pptidos, purinas, pirimidinas y vitaminas tales como la vitamina B, el cido pantotnico, la biotina y el cido flico) que no pueden ser sintetizados por ellos mismos, debido a lo cual deben encontrarse en el medio de crecimiento. El elevado requerimiento nutritivo (mayor al de los seres humanos) y la cantidad de energa que pueden obtener por fermentacin, condicionan los hbitats naturales que son propicios para el desarrollo de estas bacterias, siendo los mismos: la leche y los productos derivados de la misma, el intestino y las mucosas de humanos y animales as como tambin plantas intactas y en descomposicin. Con respecto a las temperaturas en que se desarrollan estos microorganismos, los hay: mesfilos, que crecen entre 25-30C y termfilos, cuyo rango de temperatura se encuentra entre 40-44C. Desde el punto de vista filogentico se han definido doce gneros de bacterias lcticas y estos son: Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, Vagococcus, Enterococcus, Aerococcus, Tetragenococcus, Carnobacterium, Alloicoccus y Weissella. Dichos gneros se ubican taxonomicamente dentro del phylum Firmicutes, en la clase Bacilli, orden Lactobacillales. Gneros de bacterias cido lcticas. Lactococcus spp. El gnero Lactococcus pertenece a la Familia Streptococcaceae y est integrado por seis especies. Desde el punto de vista morfolgico estas bacterias son cocos esfricos u ovoides cuyo dimetro oscila entre 0,5 y 1 m y se los suelen encontrar de a pares, formando cadenas cortas o en forma simple.Los Lactococcus son microorganismos mesfilos, no mviles capaces decrecer a 10C pero no a 45C, estn descriptos como BAL homofermentativas, aunque existen miembros de este gnero que son heterofermentativos, en la fermentacin generan L-cido lctico. El rango de pH ptimo para el crecimiento de este gnero es entre 6,0 y 6,5; algunas especies son capaces de crecer a pH 4,4 pero ninguna a pH 9,6. Lactobacillus spp. Este gnero pertenece a la Familia Lactobacillaceae y en la actualidad est constituido por 116 especies, algunas de las especies actuales son anaerobias estrictas. Morfolgicamente estas bacterias Gram-positivas presentan forma de bastn cuyo tamao vara entre: 0,5 a 1,2 m por 1,0 a 10,0 m; pero tambin pueden encontrarse como cocobacilos, bastones curvados o coriniformes, se suelen disponer en cadenas y de manera simple. Existen algunas especies que son mviles gracias a la presencia de flagelos pertricos, otra excepcin es que ciertos miembros de este gnero pueden ser nitrato reductores. Con respecto a la temperatura ptima de crecimiento los Lactobacillus pueden ser mesfilos o termfilos. Existe variacin a nivel de especie con respecto a la capacidad de crecer a 10 y 45 C. En cuanto a la fermentacin, pueden generar L-cido lctico, D-cido lctico o una mezcla de ambos ismeros, y se los distinguen en tres categoras: homofermentativos estrictos, heterofermentativos estrictos y heterofermentativos facultativos. En referencia al pH ptimo de crecimiento este oscila entre 4,5 y 6,2. Algunas especies pueden crecer a pH 3,2 y otras a pH 9,6. Leuconostoc spp. Taxonmicamente este gnero pertenece a la Familia Leuconostocaceae y est constituido por once especies. Se trata de cocos Gram-positivos, no mviles, de forma esfrica o lenticular que se disponen de a pares y constituyendo cadenas cortas, tambin pueden disponerse solos. De las BAL aisladas de los alimentos representan un grupo minoritario a causa de su lento crecimiento y baja capacidad acidificante. Estos microorganismos no hidrolizan arginina. Con respecto a la temperatura ptima de crecimiento son mesfilos y presentan crecimiento a 8C pero no 45C. En cuanto al pH, requieren que sea mayor a 4,5, hay algunas especies que pueden crecer a pH superior a 9,5. Desde el punto de vista de la 13fermentacin son heterofermentativos y producen D-cido lctico. Pediococcus spp. El gnero Pediococcus forma parte de la Familia Lactobacillaceae y presenta once especies. Estas bacterias Gram-positivas son cocos esfricos, jams ovoides o elongados, tienen 0,5 a 0,8 m de dimetro y no son mviles, se disponen de a pares, pero tambin en ttradas debido a que se dividen en dos planos. Pediococcus spp. est constituido por especies homofermentativas estrictas y heterofermentativas facultativas, que generan L-cido lctico o L-cido lctico y D-cido lctico como producto de la fermentacin. Pueden crecer a pH 5,0, pero no a pH 9,0. Son microorganismos mesfilos, la mayora de las especies pueden crecer a 35C; a 10 y 45C la capacidad de crecimiento vara segn la especie. Streptococcus spp. Este gnero se halla dentro de la Familia Streptococcaceae y est integrado por 67 especies, algunas de ellas patgenas, a diferencia de stas la especie Streptococcus salivarius subsp. thermophilus se considera GRAS, sigla que en ingles significa generalmente reconocido como seguro, ya que ha perdido o se han inactivado los genes caractersticos de las especies patgenas. Morfolgicamente se trata de cocos Gram-positivos ovoides que se disponen de a pares o en cadenas. Con respecto a la fermentacin, son homofermentativos y generan L-cido lctico. Son microorganismos no mviles, mesfilos incapaces de crecer a 10C; algunas especies crecen a 45C, en el caso de Streptococcus salivarius subsp. thermophilus el crecimiento contina hasta los 50C. El pH ptimo para el crecimiento es de 6,5 y no pueden desarrollarse a pH 4,4 ni 9,6. Algunas especies son capaces de hidrolizar la arginina y otras no. Caractersticas deseadas en las bacterias cido lcticas de acuerdo a los productos elaborados.La seleccin de bacterias cido lcticas para formular cultivos iniciadores se hace en base a que stas presenten ciertas propiedades: una capacidad de acidificacin que no sea lenta , correcta produccin de aroma y sabor, habilidad para obtener la textura adecuada , ausencia de patogenecidad , fcil preservacin y propagacin y que sea capaz de prevalecer sobre la microflora competitiva, pues se busca obtener un cultivo iniciador cuya tasa de viabilidad sea adecuada ,que est libre de contaminacin y sea altamente activo en las condiciones de produccin3. TINCION DE GRAMIDENTIFICACIN DE LAS CEPAS Las pruebas bioqumicas son un primer paso para la identificacin microbiana. Se utilizan diferentes pruebas bioqumicas para confirmar o descartar los microorganismos aislados.

Catalasa La catalasa es una enzima que cataliza la reaccin de descomposicin del perxido de hidrgeno H2O2 en oxgeno O2 y agua H2O. El perxido de hidrgeno se encuentra en el metabolismo de muchos organismos vivos como consecuencia del uso de azcares por va oxidativa, y es utilizado, entre otras cosas, como reactivo antimicrobiano. Casi todas las bacteriasaerotolerantes son catalasas positivas, excepto la mayora de las bacterias lcticas.

Material y reactivos Perxido de hidrgeno (H2O2 Portaobjetos de vidrio.

Procedimiento experimental

El procedimiento de la prueba de la catalasa consiste en aadir una gota de agua destilada estril sobre un portaobjetos de vidrio. Posteriormente se obtiene mediante raspado en placa de agar una colonia del cultivo (puro) a analizar y se deposita sobre la gota de agua en el portaobjetos. Mezclando la colonia con el agua, se observa en segundos la aparicin de burbujas de O2. Si aparecen burbujas la prueba resulta positiva, y si no, el resultado ser catalasa negativa

Tincin de Gram

Esta prueba bioqumica es una de las ms importantes dentro de la microbiologa y es ampliamente utilizada para la clasificacin de microorganismos. Debe su nombre al bacterilogo Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Mediante la observacin al microscopio se puede determinar el tipo de microorganismo, bacteria o levadura, su morfologa (coco o bacilo), el tipo de agrupaciones que presenta y las caractersticas de su membrana celular. La diferencia entre bacterias Gram positivas y Gram negativas fue determinada por Woese en 1987, quien concluy que ambas se diferenciaban debido a la capacidad que tienen las Gram positivas de retener los iones de azul violeta en presencia de alcohol. Esto se debe a las diferencias que existen entre ambas pareces celulares As, la membrana de las bacterias Gram positivas es ms gruesa que la de las Gram negativas, y sus composiciones tambin son muy distintas. Las bacterias Gram negativas poseen una membrana celular compuesta principalmente por lipopolisacrios, fosfolpidos, protenas, lipoprotenas y menos del 10% de peptidoglucanos. Sin embargo, las membranas de las bacterias Gram positivas contienen mayoritariamente peptidoglucanos (ms del 30%), polisacridos, cido teicoico o cido teicurnico (o sulfano de mercurio). Como vemos estas ltimas apenas tienen lpidos en sus membranas celulares.

Material y reactivos

Portaobjetos de vidrio Kit de tincin Gram de Merck (1.18855.0001) compuesto por: Azul violeta Lugol Solucin decolorante Safranina Microscopio Laborlux 11. Leitz.

Procedimiento experimental

El procedimiento comienza aadiendo una gota de agua destilada estril a un portaobjetos y recogiendo, mediante asa de siembra, una colonia de una placa de agar con crecimiento puro. Una vez extendida la colonia con la gota de agua, se realiza el secado de la misma y la fijacin de la colonia; con este proceso sobre el mechero, las bacterias mueren y quedan fijas en el portaobjetos. ste se lleva al lugar donde se realiza la tincin. Primero se aade azul violeta encima de la colonia y se deja penetrar durante 1,5 min. Con este tinte todas las bacterias, tanto Gram positivas como negativas se tien de azul prpura. Se enjuaga con abundante agua y se escurre. Posteriormente se aade lugol (solucin de I2+K1Una vez seco el portaobjetos, se le aade una gota de aceite y se mira al microscopio con objetivo de 1000 aumentos. Con concentracin de 150 mg/mL), un mordiente cuya funcin es penetrar en las clulas y formar un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta. Se espera 2 minutos y se enjuaga el lugol. Una vez escurrido se aade la solucin decolorante, se deja reposar de 15 a 20 segundos y se enjuaga con agua nuevamente. Por ltimo, se aade una tincin de contraste como es la safranina que dejar un color rosa-rojo a las bacterias que no han podido retener el azul violeta dentro de su membrana celular; stas son las Gram negativas; se espera 1,5 min y se aclara con abundante agua. Las bacterias que se observen de color azul-violeta corresponden a las Gram positivas, y aquellas que se vean de color rosa-rojizo sern las Gram negativas.4

PRUEBA DE LIAEn el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente fermentada.Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro.Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio5.METODOLOGIAAislamiento Tras el recuento de colonias se seleccionan aquellas que poseen distintas morfologas. Para ello se arrastran con asa de siembra, se inoculan en caldo de cultivo y se incuban a la temperatura ptima para cada grupo microbiano. Una vez crecidas en el medio lquido se siembran en agar nutritivo y se observa el crecimiento tras la incubacin para comprobar que se trata de cultivo puro.

Conservacin de las cepas Revivificacin de las cepas

1 Jami, G. M., Kneifel, W., & Domig, K. J. (2013, Agosto). Antimicrobial activity and partial characterization of bacteriocinas produced by Lactobacilli isalated from Sturgeon fish. Food Control, 32, 375 - 389. 2 Martnez Fernndez, B. (1996). Tesis Doctoral. Bacteriocinas de Lactococcus Lactis Aislados de quesos Asturianos: Nisina Zy Lactococina 972. Oviedo, Espaa: universidad de Oviedo. 3Caracterizacin tecnolgica de cepas de bacterias cido lcticas aisladas de la leche. Publicacin en lnea. Consulta realizada (09-06-14)4 Caracterizacin bioqumica y Tecnolgica de cepas acido lcticas Aisladas de leche cruda de oveja en El proceso de elaboracin de queso Artesano de teruel. (Mayo 2011). Publicacin en lnea. < file:///D:/Downloads/TAZ-PFC-2011-285.unlocked.pdf > Consulta realizada (09-06-14)

5Pruebas-bioqumicas Publicacin en lnea. Consulta realizada (09-06-14)