implementación en el banco nacional de...

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Implementación en el Banco Nacional de

Germoplasma del INIAP de una Unidad de

Crioconservación de Germoplasma Vegetal.

Documentación escrita de los protocolos básicos a aplicar.

Informes técnicos del proyecto.

Prof. Dr. César F. Pérez Ruiz

Investigador Prometeo INIAP

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INDICE

CONTEXTO…………………………………………………………………. Página 3

APARATOS Y EQUIPOS

NECESARIOS……………………………………………………………… Página 7

LISTADO DE PRODUCTOS Y MATERIAL FUNGIBLE DE LABORATORIO NECESARIO….……………………………………..… Página 10

PROTOCOLOS DE

CRIOCONSERVACIÓN………………………………………………….. Página 15

SECUENCIA LÓGICA DE LOS PROCESOS E INDICADORES

DE ÉXITO………………………………………………………….………. Página 27

CONTROL DE SEGURIDAD Y CALIDAD………….………………….. Página 33

BIBLOGRAFÍA RECOMENDADA………………………………………. Página 36

DISTRIBUCIÓN DE LOS EQUIPOS DE CRIOCONSERVACIÓN

Y CONSERVACIÓN IN VITRO…….………………………………….... Página 42

DISTRIBUCIÓN DEL MATERIAL FUNGIBLE

PARA CRIOCONSERVACIÓN Y CONSERVACIÓN IN VITRO…….. Página 46

PLANO DE DISTRIBUCIÓN……………..……………………………… Página 52

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CONTEXTO

Ecuador es uno de los países más ricos en biodiversidad en todo el mundo. Su

ubicación geográfica, sus orígenes geológicos, la presencia de la cordillera de

los Andes, la influencia de corrientes marinas, los vientos amazónicos y la

existencia de innumerables hábitats húmedos determinan que sea un país

megadiverso con una gran cantidad de bosques y microclimas (Tapia et al.

2008).

En el país existe un elevado número de especies de plantas por unidad de área.

La flora comprende de 22 000 a 25 000 especies de plantas vasculares, con un

endemismo estimado de 32.25 %. Las diversas regiones geográficas del país

son muy ricas en parientes silvestres de las especies cultivadas. Por ejemplo,

los materiales silvestres de papa, frijol, tomate y frutales tropicales y

subtropicales, así como los parientes silvestres de especies como el aguacate

(Persea spp.) y la papaya (Carica spp.), reflejan el gran potencial de la

agrobiodiversidad ecuatoriana (Tapia et al. 2008).

Frente a la riqueza botánica que presenta el Ecuador, es de vital importancia su

conservación in situ y ex situ. El Sistema Nacional de Áreas Protegidas cuenta

con 40 reservas que abarcan aproximadamente 96 000 km2, en las cuales se

realizan grandes esfuerzos para manejar adecuadamente ecosistemas que

albergan gran parte de nuestra biodiversidad. En cuanto a las estrategias de

conservación ex situ, es importante resaltar que con el apoyo de organismos

nacionales e internacionales en el país se han realizado actividades de

recolección y conservación de material vegetal. El banco de germoplasma en

que se conserva el mayor número de especies es el del Instituto Nacional

Autónomo de Investigaciones Agropecuarias (INIAP).

El Departamento Nacional de Recursos Fitogenéticos (DENAREF) del INIAP

conserva alrededor de 13 711 muestras de semillas pertenecientes a 170

géneros de cultivos y 4209 muestras en campo o duplicadas en colecciones in

vitro pertenecientes a 399 especies forestales, alimenticias, medicinales y

forrajeras, lo que suma un total de 17 920 accesiones de especies de plantas

que se conservan en varias estaciones experimentales (Tapia et al. 2008).

Dentro de las accesiones conservadas caben destacar las siguientes especies:

papa (Solanum tuberosum), ajíes y pimientos (Capsicum annuum), quinua

(Chenopodium quinoa), oca (Oxalis tuberosa), melloco (Ullucus tuberosus), fréjol

(Phaseolus vulgaris), amaranto (Amaranthus spp.), granadilla silvestre

(Passiflora spp.), uvilla (Physalis peruviana), maní (Arachis hypogaea), arroz

(Oryza sativa), sorgo (Sorghum bicolor), chocho (Lupinus sp.), cucurbita

(Cucurbita ficifolia), tortas (Phaseolus lunatus), haba (Vicia faba), arveja (Pisum

sativum), maíz (Zea mays), mashua (Tropaeolum tuberosum), zanahoria blanca

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(Arracacia xanthorrhiza), jícama (Smallanthus sonchifolius) y cacao (Theobroma

cacao). Además de conservar ese material vegetal, se han realizado estudios de

diversidad genética y de los patógenos que afectan esas especies, así como

actividades de regeneración del 40 % de las accesiones mantenidas (Tapia et

al. 2008).

El germoplasma vegetal es el material genético del que se pueden regenerar

nuevas plantas. Se puede entender como un "recurso genético vivo" conservado

para el mejoramiento, conservación e investigación de plantas. El germoplasma

es el componente fundamental en todos los programas de fitomejoramiento. La

conservación del germoplasma es, por lo tanto, imprescindible para la obtención

de futuras plantas cultivables capaces de crecer bajo condiciones ambientales

cambiantes, utilizar recursos, como el agua, de manera más eficaz, y producir

más alimentos para una población mundial creciente. La conservación del

germoplasma vegetal preserva la diversidad genética, que es el mayor número

posible de genes presentes en un cultivo en particular, y en cualquier especie

relacionada, de modo que puedan utilizarse en el futuro, en cualquier momento

y lugar.

El germoplasma se conserva "convencionalmente" en forma de semillas, que

pueden almacenarse en seco, a temperatura ambiente. Sin embargo, el

almacenamiento convencional tiene muchas limitaciones, por ejemplo, la

existencia de semillas de corta vida, la presencia de enfermedades en las

semillas y los altos costos asociados con el espacio de almacenamiento y

mantenimiento. Mientras que las semillas almacenadas a temperatura ambiente

tienen a menudo una vida de almacenamiento limitada, niveles bajos de

humedad de las semillas combinados con almacenamiento a temperaturas bajas

(-18 ° C a -20 ° C) o ultrabajas (-135 ° C a -196 ° C), reducen la actividad

metabólica de las semillas para que puedan permanecer viables por mucho más

tiempo.

Si bien el almacenamiento a baja temperatura puede ser un medio eficaz para

almacenar germoplasma, el método definitivo para el almacenamiento a largo

plazo y el único eficaz y económico para algunas plantas, como las plantas con

semillas recalcitrantes, las propagadas clonalmente o las plantas que no

producen semillas viables es la crioconservación. La crioconservación es un

conjunto de técnicas versátiles que implican el almacenamiento de

germoplasma, en forma de semillas, polen, brotes latentes, ápices, embriones,

células o tejidos vegetales aislados, en nitrógeno líquido (LN) a -196 ° C, o en la

fase de vapor de LN a -140° C.

La crioconservación tiene aplicaciones relevantes no sólo para el

almacenamiento a largo plazo de especies de semillas no ortodoxas, sino

también para las semillas ortodoxas, como lo demuestran varios resultados de

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investigación (Engelmann & Rao, 2012; Harding, 2004). Pritchard (1995) sugirió

que la longevidad de la semilla a -196 ºC podría ser aproximadamente 175 veces

mayor que la obtenida a -18ºC, es decir, la temperatura utilizada para el

almacenamiento de semillas en las colecciones de base.

El material vegetal es pre-acondicionado, utilizando tratamientos químicos y

físicos, de manera que se mantiene viable cuando se congela y durante el

almacenamiento a temperaturas ultrabajas. Una ventaja importante de la

crioconservación sobre el almacenamiento ambiental o a bajas temperaturas, es

que, una vez enfriadas a temperaturas del LN, las muestras viables pueden, en

teoría, conservarse indefinidamente, ya que no hay actividad metabólica a dichas

temperaturas.

Después de la descongelación, las semillas y los embriones pueden germinar,

los brotes o brotes pueden ser inducidos a crecer, y pueden regenerarse las

plantas completas a partir de células o tejidos crioconservados, utilizando

técnicas de cultivo in vitro. Estas técnicas de cultivo in vitro de plantas también

permiten producir un gran número de plantas clonales a partir de muestras de

tejido muy pequeñas.

Las técnicas de la crioconservación de plantas comenzaron con la congelación

de brotes de mora en LN en 1965 (Sakai, 1965). Desde entonces, se han

desarrollado, y se desarrollan actualmente, métodos para la crioconservación de

una amplia gama de especies vegetales. Hoy en día cultivos importantes, como

el trigo, la papa y varios árboles frutales y forestales, pueden ser

crioconservados, descongelados y luego crecer hasta convertirse en plantas

completas (Williams, 1991; Day et al., 2008).

A diferencia de las colecciones de semillas convencionales o de las colecciones

de plantas en campo, que requieren mantenimiento, el único costo asociado con

el crio-almacenamiento de los materiales vegetales, a menudo llamado

"cryobanking", es la adición a los recipientes de almacenamiento de una

pequeña cantidad de LN cada semana. El cryobanking se está convirtiendo

actualmente en un método muy rentable para la conservación a largo plazo de

los recursos fitogenéticos, permitiendo el almacenamiento prolongado de

grandes cantidades de material vegetal genéticamente diverso, en un espacio

relativamente pequeño, durante largos períodos de tiempo (Kaczmarczyk et al.,

2011; Pritchard, et al 2013). Por ejemplo, un recipiente de almacenamiento de

tamaño mediano puede almacenar de 5.000 a 10.000 muestras de plantas

individuales en LN.

Otra ventaja de la crioconservación sobre las técnicas convencionales de

almacenamiento es que, durante el almacenamiento criogénico, prácticamente

no hay riesgo de contaminación microbiana nueva y el desarrollo enfermedades.

De hecho, se ha demostrado que la "crioterapia" es una herramienta eficaz para

producir plantas libres de virus, fitoplasma y bacterias (Wang et al., 2009). La

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crioterapia se puede utilizar para producir plantas libres de enfermedades y

puede eliminar el riesgo de enfermedades transmitidas por semillas, y, por lo

tanto, reducir los obstáculos asociados con el transporte de germoplasma de

plantas a través de fronteras nacionales e internacionales.

La Dirección del DENAREF considera que la crioconservación es un medio muy

eficiente para almacenar el germoplasma vegetal en poco espacio y durante

tiempo indefinido. Que para utilizar adecuadamente y conservar la rica

biodiversidad que existe en el Ecuador es de suma importancia impulsar el

desarrollo de proyectos de investigación en el campo de la crioconservación de

especies vegetales, e implementar en el Banco Nacional de Germoplasma del

Ecuador un criobanco dotado de unas instalaciones y métodos eficientes. Esto,

sin duda, contribuirá a reforzar las estrategias nacionales de desarrollo agrícola,

forestal, florícola y económico.

La crioconservación aún constituye un campo poco explorado en el Ecuador por

lo que se solicitó, a través del Programa Prometeo, la colaboración del Dr. César

Pérez, Catedrático de la Universidad Politécnica de Madrid y Director del Banco

de Germoplasma de esta Institución, especialista en estas técnicas, para la

implementación del mencionado criobanco.

Referencias:

Day, J. G.; Harding, K. C.; Nadarajan, J. and Benson, E. E. (2008).

“Cryopreservation, Conservation of Bioresources at Ultra Low Temperatures,” in

J. M. Walker and R. Rapley (eds), Molecular Biomethods Handbook (Totowa,

NJ.: Humana Press), 917-47.

Engelmann, F. and Rao, V. R. (2012) “Major Research Challenges and

Directions for Future Research,” In: M. N. Normah, H. F. Chin and B. M. Reed,

Eds., Conservation of Tropical Plant Species, Springer Verlag, Berlin.

Harding, K. (2004) Genetic Integrity of Cryopreserved Plant Cells: A Review.

Cryoletters, Vol. 25, No. 1, pp. 3-22.

Kaczmarczyk, A.; Turner, S.R.; Bunn, E.; Mancera, R.L. and Dixon, K.W. (2011)

“Cryopreservation of threatened native Australian species—what have we

learned and where to from here?” In Vitro Cellular and Developmental Biology-

Plant. 47:17-25.

Pritchard HW (1995) Cryopreservation of seeds. In: Day JG, McLellan MR (eds)

Cryopreservation and freeze-drying protocols, vol 38. Humana Press Inc.,

Totowa, pp 133–144.

Pritchard, H.W.; Stuppy, W. and Nadarajan, J. (2013) “How many species of

higher plants need conserving by cryopreservation?” Abstract of the 2nd

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International Symposium on Plant Cryopreservation (Fort Collins,Colorado, USA)

15.

Sakai, A. (1965) “Survival of plant tissue at super-low temperatures III. Relation

between effective prefreezing temperatures and the degree of frost hardiness,”

Plant Physiology, 40:882-7.

Tapia, C; Zambrano, E; Monteros, Á. (2008). Estado de los recursos fitogenéticos

para la agricultura y la alimentación en Ecuador. Quito, EC, INIAP.

Wang, Q.C.; Panis, B.; Engelmann, F.; Lambardi, M. and Valkonen, J.P.T. (2009)

“Cryotherapy of shoot tips: a technique for pathogen eradication to produce

healthy planting materials and prepare healthy plant genetic resources for

cryopreservation,” Annals of Applied Biology, 154:35-63.

Williams, J.T. (1991) “Plant Genetic Resources: Some New Directions,”

Advances in Agronomy, 45:61-91.

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APARATOS Y EQUIPOS NECESARIOS

• Sistema de purificación de agua. Resistividad de, al menos, 200,000 ohms/cm y conductividad de 5.0 micromhos/cm.

• Balanza analítica (0.01 g de resolución; 200 g capacidad mínima).

• Balanza de precisión desde 5 Kg/0,001 g.

• pH metro (rango 0-14 +/- 0.01; compensación automática de temperatura 0-60º C; dos puntos de calibración).

• Agitador magnético con placa calefactada. Temperatura regulable hasta 350ºC. (velocidad variable 50-150 rpm; resistente a reactivos).

• Refrigerador capaz de mantener una temperatura de 2-6º C y con una temperatura en el congelador de –20º C.

• Cabina de flujo laminar horizontal con filtro HEPA que retenga partículas mayores de 0.3μm; zona de trabajo Clase 10 definida según las normas U.S. Fed Std 209 y B.S. 5295.; que mantenga un flujo de 90 fpm +/- 20% a una presión estática de 0.6-1.2.

• Autoclave; control de procesos por microprocesador. Sistema de secado y purgado. Para temperaturas regulables desde 105 °C hasta 134 °C (0,21 a 2 bar). Modelo vertical de, al menos, 80 litros.

• Lavavajillas industrial. Capacidad de carga: 120 frascos de laboratorio. Acero inoxidable (AE). Panel de control táctil en acero inoxidable con display incorporado. Programas. Trazabilidad de procesos. Sistema de filtrado de 4 niveles. AutoClose- cierre automático de la puerta.Indicación óptica y acústica de fin de programa. Bomba propulsora de alto rendimiento. Descalcificador de agua. Condensador de vapor. Sistema antifugas.

• Esterilizador para instrumental en cabina de flujo laminar, por calor seco con bolas de cristal o cerámica.

• Una fuente de luz fría regulable sin etapas, que no modifique los colores

y que disponga de una lámpara reflectora halógena de larga duración.

Potencia de la lámpara reflectora halógena: 150W (15V). Flujo de Luz:

600 lm. Intensidad regulable por ajuste eléctrico estabilizado (continuo 0-

100%) y mecánico, Diámetro guía de luz: Máximo Ø9mm. Alimentación:

220-240V aprox.50/60Hz.

• Lupa Binocular (Estereomicroscopio) 20/40x. Cabeza binocular inclinado

45º. Con distancia interpupilar variable de 55 - 75 mm. Portaocular con

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ajuste de dioptrías ± 5 D. Par oculares gWF10x20 mm. Objetivos de 2x y

4x en torreta giratoria. Distancia de trabajo de 80 mm. Aumentos totales

40x. Iluminación incidente y transmitida 12v/10w.

• Baño termostatizado. Medidas internas útiles: 300 x 170 x 120 mm de prof. o

300 x 170 x 170 mm de profundidad. Termostato: Hidráulico. Precisión:

Más/menos 0.5ºC. Rango de temperatura: ambiente + 5ºC hasta 100º C.

Uniformidad de la temperatura: Más/menos 0,25ºC. Resistencia Blindada de

inmersión: 1000 W. Aislación de lana de vidrio: 25 mm de espesor. Gradillas

para: 39 tubos de 12 mm de diámetro. 33 tubos de 16 mm de diámetro. 24 tubos

de 18 / 20 mm de diám. 16 tubos de 25 mm de diámetro. Presentación: Dos, tres,

cuatro, cinco y seis, ocho, diez y doce gradillas. Interruptor principal y luz piloto.

• Horno Microondas Industrial con 2 magnetrones de alta calidad que cumple

normas sanitarias. Bandeja intermedia de cerámica extraíble. Programable.

Interior y exterior en acero inoxidable. Temporizador: 99 min. Volumen interior:

30 l.

• Cámara de crecimiento: Rango de temperatura de 7º a 35ºC. Estabilidad

±1.0°C. Uniformidad ±1.0°C. Lectura digital resolución 0.1ºC. Regulación

electrónica de temperatura. Flujo de aire: del techo a las paredes y retorno

al pasillo central a través de las estanterías. Max. velocidad entre

estanterías 0.5 m s-1. Intercambio de aire fresco por hora: 4 volúmenes.

Iluminación con fluorescentes o leds hasta un mínimo de 12000 lux;

Máxima radiación fotosintética activa (500 mol m-2 s-1). Distancia a las

lámparas: Min 30 cm. Tipo de lámparas fluorescentes T8/HF/58W/840

Potencia 58W. Suplementarias dos lámparas de 60W tungsteno.

Programador horario de fotoperiodo y termoperiodo. Termostato de

seguridad contra fallos de temperatura. Alarma óptica y acústica.

• Cámaras frías. Se cuenta con las instalaciones del Banco para semillas

ortodoxas (-18ºC) y la cámara para conservación in vitro (desde 5ºC).

• Congelador –40ºC. Temperatura de trabajo de -40 °C a -20°C.

Controlador de temperatura con pantalla digital. Controlador protegido por

llave. Sonda de temperatura, resolución 0,1 °C. Alarmas: acústica y visual

para temperatura máxima y mínima, así como fallo de tensión;

alimentadas por batería.Indicador para puerta abierta, con alarma. Puerta

con dispositivo de cierre de fácil apertura, incorpora cerradura con llave.

Control digital de la temperatura con panel táctil integrado. Interruptor

principal protegido por llave. Aislamiento de 110 mm, fabricado en

poliuretano inyectado de alta densidad. Gas refrigerante, libre de CFC y

HCFC, biodegradables. Sistema de evaporador envolvente. Compresor

hermético muy silencioso montado sobre amortiguadores para disminuir

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el ruido <48 dB. Sello magnético perimetral doble, marco de la puerta

calefactado, evita la formación de hielo en las juntas; asegurando la

estanqueidad. Cámara interior construida en acero inoxidable. Estantes

en varilla de acero plastificado. Estructura exterior en acero con

recubrimiento epoxi. Sistema soporte con 4 ruedas, facilita el movimiento.

Tratamiento tropicalizado que permite trabajar con temperatura ambiente

hasta 32 °C y un 85-90% de H.R.

• Tanques de NL de 120 l con capacidad para 4000 crioviales de 2 ml.

Base con ruedas para el tanque. Sistema de almacenamiento de cajas

criogénicas de fácil recuperación. Métodos manuales de manejo de

registro de inventarios. Aislamiento de vacío avanzado que minimice las

pérdidas de nitrógeno por evaporación que asegure una temperatura de

–190°C, aun cuando solo quede unos 5 cm de nitrógeno líquido

remanente en el tanque. Sistema de bloqueo para prevenir manipulación

no autorizada de muestras.

• Tanque de reserva de nitrógeno líquido de 35 litros.

• Crioconservador Crioplus. Capacidad para 22.100 a 24.000 viales.

Cierre bajo llave y ruedecillas en estándar. Impresora térmica en opción

sobre Crioplus. Presión de llegada máxima de nitrógeno: 1,5 bar. Relleno

automático. Testigos de relleno. Control automático de las funciones.

Control de nivel por termistancias. Indicación del nivel de nitrógeno líquido

o vapor. Indicación de la temperatura sobre pantalla. Salvaguarda de los

programas. Llave de acceso al programa. Puerto RS 232. Alarma visual

y sonora.

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LISTADO DE PRODUCTOS Y MATERIAL FUNGIBLE DE

LABORATORIO NECESARIO

• Pinzas 23 cm para cultivo in vitro (4 unidades en stock)

• Soporte acero inoxidable (2 unidades en stock)

• Mango bisturí 12,5 cm nº3 (4 unidades en stock)

• Mango bisturí 14cm nº3 (4 unidades en stock)

• Hojas de bisturí nº 11 no estériles 100 u (2 unidades en stock)

• Hojas de bisturí nº 22 100 u (2 unidades en stock)

• Agujas enmangadas para disección (2 unidades en stock)

• Espátulas para pesado (2 unidades en stock)

• Cinta indicadora de esterilización en autoclave (2 unidades en stock)

• Varilla magnética 6x10mm (2 unidades en stock)



• Papel Parafilm 10cmx75m (2 unidades en stock)

• Resma papel filtro 42x52cm (5 unidades en stock)

• Guantes látex t/mediana 100u (2 unidades en stock)

• Frascos lavadores de 500 ml (2 unidades en stock)

• Bidón de plástico con grifo de 10 l (1 unidad en stock)

• Guantes protectores de quemado (2 pares en stock)

• Micropipetas graduables 100- 1000 l (mínimo 4 en stock)

• Puntas de pipeta bolsa de 500 puntas (2 unidades en stock)

• Pesa substancias (4 unidades en stock)

• Frascos lavadores (4 unidades en stock)

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• Tarro de vidrio de 38 cl para cultivo in vitro (al menos 400 unidades en

stock)

• Tapa de polipropileno 82mm p/tarros (al menos 400 unidades en stock)

• Placas Petri de 90 mm (al menos 400 unidades en stock)

• Matraces Erlenmeyer:

o 100 ml (4 unidades en stock)




• Pipetas pasteur 50 mm con chupete (20 unidades en stock)

• Pipetas graduadas:

o 0,1 ml (2 unidades en stock)








• Probetas graduadas (pueden ser de plástico)






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• Vasos de precipitados forma baja (pueden ser de plástico)








• Murashige & Skoog Medium Macro, Micro y Vitaminas (5 unidades en

stock)

• Sucrose double-crystallized (Sacarosa) 5Kg (2 unidades en stock)

• Phyto Agar 1Kg (4 unidades en stock)

• Sodio hipoclorito sol 10% P/V 1000ml (2 unidades en stock)

• Ácido alfa-naftalenacético ANA 25g (1 unidad en stock)

• indole-3-butyric acid IBA 25 g (1 unidad en stock)

• 6-benzilaminopurina BAP 5g (1 unidad en stock)

• Thidiazuron 250 mg (1 unidad en stock)

• Alcohol etílico 96 10 l (1 unidad en stock)

• Ácido clorhídrico 1N 1000 ml (1 unidad en stock)

• Hidróxido sódico 1N 1000 ml (1 unidad en stock)

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• Solución antibiótica-antimicótica estabilizada para PTC (mínimo 100 ml

en stock)

• Ácido Ascórbico (500 g en stock)

• Prolina (100g en stock)

• Melatonina (2 g en stock)

• Desferroxiamina (5 ml en stock)

• Tampones de calibración de pHmetro

• Glicerol (mínimo 2Kg en stock)

• Etilenglicol (mínimo 1 Kg en stock)

• Dimetilulfóxido (mínimo 1l en stock)

• Sacarosa (mínimo 1 Kg en stock)

• Alginato de sodio (400g en stock)

• Cloruro de calcio (500 g en stock)

• Papel de aluminio 50m (2 unidades en stock)

• Gel de sílice naranja (2,5 Kg en stock)

• Crioviales 2 ml (500 unidades en stock)

• Termo para nitrógeno líquido 500 ml

• Cuatro bastidores para 10 cajas de 100 crioviales de 2 ml

• Cajas para 100 crioviales de 2 ml (10 unidades en stock)

• Guantes crioprotectores (2 pares en stock)

• Gafas crioprotectoras (2 unidades en stock)

• Sustrato

• Macetas

• Fertilizante

• Plaguicidas

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• Lejía

• Detergente

• Suministro permanente de NL. Calcular para una tasa de evaporación de

0,6 l/día

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PROTOCOLOS DE CRIOCONSERVACIÓN

Recomendaciones para seleccionar un método adecuado (+) para la

crioconservación de diferentes formas de cultivo in vitro de plantas (Según

González-Arnao y Engelmann, 2013, modificado).

Método Suspensiones celulares y

callos

Ápices y meristemos

Embriones cigóticos y somáticos

Semillas

Congelación gradual programada

+++ + - -

Encapsulación-deshidratación

- +++ ++ -

Vitrificación y derivados: gota-vitrificación,

encapsulación/vitrificación y crio-placa

- +++ ++ -

Precultivo-Desecación - - ++ -

Desecación - - - ++

PROTOCOLOS (Según González-Arnao y Engelmann, 2013, modificado):

Congelación gradual programada:

Procedimiento

1. Colocar el material vegetal (células y/o callos) en crioviales de 2 ml, en baño

con hielo aproximadamente a 0oC.

2. Adicionar la solución crioprotectora fría a los crioviales con las muestras y

mantenerlos durante una hora a 0oC.

3. Colocar los crioviales con las muestras en el congelador programable

(temperatura inicial de 0oC).

4. Disminuir la temperatura para inducir la nucleación heterogénea (2oC-3oC

inferiores al “punto de congelación” de la solución crioprotectora).

5. Mantener a la temperatura de inducción de la nucleación (ejemplo: a -10oC,

10 minutos) y continuar con el programa de enfriamiento de disminución gradual

de la temperatura hasta la precongelación a -40oC.

6. Realizar una inmersión rápida de las muestras en NL.

7. Mantener las muestras almacenadas a -196 oC.

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8. Llevar a cabo una descongelación rápida (40oC).

9. Eliminar los crioprotectores colocando las muestras sobre papel filtro en placas

de Petri.

10. Cultivo de recuperación en oscuridad, si son células y callos. Cultivo al menos

la primera semana en la oscuridad, si son estructuras organizadas.

ESQUEMA DE PROTOCOLO CON CONGELADOR PROGRAMABLE SEGÚN

KAMI (2012).

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ESQUEMA DE PROTOCOLO CON CONGELACIÓN ESCALONADA SEGÚN

KAMI (2012).

Encapsulación-deshidratación

1. Disección del tejido (meristemos, ápices o embriones) en condiciones

asépticas: Utilizar un estereomicroscopio (40X) en campana de flujo laminar.

2. Recuperación del tejido: Colocar el material extraído 24 horas sobre el medio

de cultivo sólido estándar o medio suplementado con sacarosa (por ejemplo, con

0.3 M de sacarosa).

1. Preparación para la encapsulación:

a) Preparar la solución de alginato de sodio al 3 %, en medio de cultivo que

contiene los macros y micronutrientes, pero desprovisto de calcio; luego ajustar

el pH de la solución a 5,7 y esterilizarla bajo las mismas condiciones del medio

de cultivo.

b) Preparar una solución de cloruro de calcio a 0.1 M, ajustar el pH (a 5,7) de la

solución y esterilizarla bajo las mismas condiciones del medio de cultivo.

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c) Preparar puntas de micropipetas estériles con el extremo inferior cortado a un

diámetro aproximado de 4-5 mm.

2. Encapsulación:

a) Colocar los tejidos en la solución de alginato de sodio.

b) Succionar los tejidos embebidos en el alginato y gotearlos progresivamente

sobre abundante solución de cloruro de calcio. Preferiblemente, sobre agitador

orbital.

c) Mantener las gotas en la solución de calcio por 20 minutos después de la

última gota, para lograr un buen grado de gelificación durante la formación de las

cápsulas de alginato de calcio.

d) Decantar la solución de calcio y transferir las cápsulas a una caja de Petri

sobre papel filtro para la siguiente manipulación.

3. Precultivo: Transferir el tejido encapsulado a un erlenmeyer que contiene

medio de cultivo líquido suplementado con sacarosa (por ejemplo, 0.5, 0.75 o 1

M de concentración de sacarosa por 24 h).

4. Desecación: Decantar el medio líquido de precultivo y secar superficialmente

las cápsulas colocándolas en cajas de Petri sobre papel filtro. Seguidamente

exponerlas en cajas destapadas a la corriente de aire de la campana del flujo

laminar o en desecadores que contienen gel de sílice. Determinar con antelación

el tiempo de desecación requerido, para garantizar la reducción del contenido de

humedad en las cápsulas hasta alrededor de 20-25 %.

5. Congelación: Transferir las muestras encapsuladas a crioviales (hasta 10

cápsulas por criovial), y realizar la inmersión directa en nitrógeno líquido.

6. Descongelación: La descongelación puede ser rápida, para lo cual se

sumergen los crioviales, cerrados, con las muestras en agua a +40ºC, o lento

(más usual), para lo cual se extraen las muestras del criovial y se exponen a la

corriente de aire del flujo laminar de dos a tres minutos.

7. Cultivo de recuperación: Transferir el material encapsulado a los recipientes de cultivo, colocando las cápsulas sobre el medio sólido y manteniendo las muestras la primera semana en oscuridad con el posterior pase a las condiciones de fotoperiodo establecidas para cada caso.

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ESQUEMA DE PROTOCOLO DE ENCAPSULOCIÓN-DESHIDRATACIÓN

SEGÚN KAMI (2012).

Método de vitrificación

1. Disección del tejido (ápices o embriones) en condiciones asépticas: Utilizar un estereomicroscopio dentro de una campana de flujo laminar.

2. Recuperación del tejido: Colocar el material extraído 24 horas sobre medio de cultivo solido estándar o medio suplementado con sacarosa (por ejemplo, con 0.3 M de sacarosa). 3. Tratamiento de carga: Colocar los tejidos sobre papel filtro en una caja de Petri que contiene la solución de carga a temperatura ambiente y durante 20-30 minutos (Solución de carga: 0.4 M de sacarosa + 2 M de glicerol).

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4. Exposición a la solución vitrificadora (PVS) después del tratamiento de carga: Transferir los tejidos a una caja de Petri que contiene la solución vitrificadora para establecer diferentes tiempos de exposición o colocar los tejidos directamente en crioviales que contienen 1 o 2 ml de la PVS (por ejemplo, PVS3: 50 % de glicerol + 50 % de sacarosa; PVS2: 30 % de glicerol + 15 % de etilenglicol + 15 % DMSO en medio de cultivo con 0.4 M de sacarosa). Los tratamientos se realizarán a 0 °C por periodos a establecer en cada caso, pero nunca superiores a una hora. 5. Congelación: Realizar la inmersión rápida de los crioviales con las muestras al nitrógeno líquido. 6. Descongelación: Extraer los crioviales del nitrógeno líquido y sumergirlos en agua a +40 °C de dos a tres minutos. 7. Lavado de crioprotectores: Extraer la solución vitrificadora y adicionar la solución de lavado durante 20 minutos (Solución de lavado: medio de cultivo liquido suplementado con 1.2 M de sacarosa). 8. Cultivo de recuperación: Secar superficialmente los tejidos lavados sobre papel filtro en una caja de Petri y luego transferirlos al medio de cultivo sólido. Mantener las muestras durante la primera semana a la oscuridad y transferirlas posteriormente a las condiciones de fotoperiodo establecidas para cada caso.

22

ESQUEMA DE PROTOCOLO DE VITRIFICACIÓN SEGÚN KAMI (2012).

Gota-vitrificación

1. Disección del tejido (ápices o embriones) en condiciones asépticas: Utilizar un estereomicroscopio dentro de una campana de flujo laminar. 2. Recuperación del tejido: Colocar el material extraído 24 horas sobre el medio de cultivo solido estándar o el medio suplementado con 0.3 M sacarosa. 3. Tratamiento de carga: Colocar los tejidos durante 20-30 minutos sobre papel filtro en una caja de Petri que contiene la solución de carga (Solución de carga: 0.4 M de sacarosa + 2 M de glicerol). 4. Exposición a la solución vitrificadora (PVS) después del tratamiento de carga: Transferir los tejidos a una caja de Petri que contiene la solución vitrificadora para estudiar diferentes tiempos de exposición o colocar los tejidos directamente sobre gotas de PVS (por ejemplo, PVS3: 50 % de glicerol + 50 % de sacarosa; PVS2: 30 % de glicerol + 15 % de etilenglicol + 15 % DMSO en medio de cultivo

23

con 0.4 M sacarosa). Los tratamientos se realizan generalmente a temperatura ambiente. 5. Preparación de las láminas con las gotas: a) Recortar láminas de papel de aluminio de aproximadamente 20 x 7 mm. b) Colocar gotas de la PVS de aproximadamente 15 μl por cada lamina. c) Colocar los tejidos en las gotas. 6. Congelación: Realizar la inmersión rápida de las láminas de papel de aluminio con las muestras directamente al nitrógeno líquido. 7. Descongelación: Extraer las láminas del nitrógeno líquido y sumergirlas directamente en abundante medio de cultivo liquido suplementado con 1.2 M de sacarosa a temperatura ambiente durante 15-30 minutos. 8. Cultivo de recuperación: Secar superficialmente los tejidos lavados sobre papel filtro en una caja de Petri y luego transferirlos al medio de cultivo sólido. Mantener las muestras durante la primera semana a la oscuridad y transferirlas posteriormente a las condiciones de fotoperiodo establecidas.

24

ESQUEMA DE PROTOCOLO DE GOTA-VITRIFICACIÓN SEGÚN KAMI (2012).

25

ESQUEMA DE PROTOCOLO DE ENCAPSULACIÓN VITRIFICACIÓN SEGÚN

KAMI (2012).

Precultivo-desecación 1. Realizar el precultivo de los embriones en medio sólido suplementado con azúcares como agente crioprotector. 2. Efectuar la desecación mediante la exposición de los embriones a corriente de aire en una campana de flujo laminar o a cantidades definidas de gel de sílice en contenedores herméticamente cerrados. 3. Realizar el enfriamiento rápido de las muestras, previamente introducidas en crioviales, mediante inmersión directa en nitrógeno líquido. 4. Llevar a cabo la descongelación rápida, para lo cual los crioviales cerrados se sumergen en agua a 40oC.

26

5. Realizar la recuperación en el medio de cultivo normal, la primera semana a la oscuridad, y luego en las condiciones de fotoperiodo establecidas. ESQUEMA DE PROTOCOLO DE DESECACIÓN SEGÚN KAMI (2012).

ESQUEMA DE PROTOCOLO DE DESECACIÓN SEGÚN KAMI (2012). Algunas recomendaciones adicionales para la crioconservación de germoplasma vegetal Selección del material • Para la congelación de suspensiones celulares, las células deben tomarse cuando se encuentran en la fase exponencial de crecimiento. • Para la congelación de callos y estructuras organizadas, el material generalmente se toma después de 15 días del último subcultivo en medio fresco. En el caso de las especies de crecimiento lento (por ejemplo, algunas especies de orquídeas), lo importante es que el material de partida refleje un estado vigoroso.

27

• Los embriones cigóticos inmaduros y los somáticos (globular-torpedo-corazón) son más tolerantes a la congelación que otras fases más tardías de desarrollo. • El material proveniente de cultivos in vitro (por ejemplo, ápices aislados de vitroplántulas) es más homogéneo y permite estandarizar mejor las condiciones de crioconservación que el material obtenido de plantas in vivo. Protección y crioconservación de germoplasma • Los tratamientos con soluciones crioprotectoras muy concentradas son menos tóxicos si se realizan a 0ºC. • En la utilización de protocolos de congelación gradual, es muy importante inducir la nucleación heterogénea en una etapa temprana del enfriamiento dependiendo del punto de congelación de la solución crioprotectora. • La descongelación rápida es la más apropiada, sobre todo si el material no está suficientemente deshidratado. • La crioconservación de ápices de especies de propagación vegetativa asegura el mantenimiento de la estabilidad genética y la manipulación del material libre de virus; además, puede ser una estrategia apropiada para el saneamiento por crioterapia. • Para la crioconservacion de ápices, después de la disección los tejidos deben recuperarse en un medio de cultivo al menos de un día para otro, a fin de que superen el estrés del corte. • Temperaturas muy superiores (por ejemplo, de entre -20 oC y -70 oC) a la temperatura del nitrógeno líquido (-196 oC) con el transcurso del tiempo provocan el deterioro del material biológico almacenado. • Después de la crioconservacion, el material debe recuperarse en la oscuridad durante, al menos, una semana, con el fin de evitar la fotoxidación. • Las pruebas colorimétricas de supervivencia pueden falsear los resultados. La verdadera forma de medir la supervivencia y recuperación del material crioconservado es mediante la regeneración de nuevos brotes y/o de plantas. REFERENCIAS: González, M., & Engelmann, F. (2013). Crioconservación de plantas en América Latina y el Caribe (No. IICA F30 52). IICA, San José (Costa Rica). Kami, D. (2012). Cryopreservation of plant genetic resources. INTECH Open Access Publisher.

28

SECUENCIA LÓGICA DE LOS PROCESOS E INDICADORES DE

ÉXITO

Etapa 1.- Material de partida (Material vegetativo)

Selección de los genotipos a crioconservar

Por sus características agronómicas

Por su riesgo de desaparición

Selección de plantas vigorosas

Plantas en crecimiento activo

Buenas condiciones sanitarias

Toma de estaquillas, esquejes, plantones o planta entera

Selección de material vegetal con yemas en buen estado

Preparación de los materiales para el traslado al DENAREF

Adaptación al invernadero del DENAREF

Selección de sustrato

Selección de riego

Tratamientos fitosanitarios

Fertilización

Indicador de éxito: Al menos 10 plantas y/o estaquillas de cada genotipo se

adaptan a las condiciones del invernadero del DENAREF y presentan un

aspecto saludable y un crecimiento vigoroso de las yemas

Etapa 2.- Material de partida (Material in vitro)

Selección de los cultivos in vitro previamente cultivados o almacenados

Por sus características agronómicas

Por su adaptación al cultivo in vitro

Por su capacidad embriogénica

Mantenimiento in vitro de las líneas en los laboratorios

29

Subcultivo en medios definidos para cada especie o variedad

Mantenimiento en las condiciones de temperatura e iluminación

definidos para cada especie o cultivar

Repicado periódico de los cultivos

Indicador de éxito: Se mantienen con crecimiento vigoroso y libres de

contaminación los cultivos in vitro. Si se trata de embrioides, se detectan

las distintas etapas de desarrollo: globular, corazón, torpedo y cotiledonar.

Si son callos o suspensiones celulares, proliferan y aumenta su biomasa.

Si son meristemos, ápices o yemas, se desarrollan.

Etapa 3.- Introducción in vitro (ápices caulinares)

Método de asepsia.

Tratamiento previo de los explantos

Fungicidas

Antioxidantes

Desinfección de los explantos

Tamaño de las yemas

Concentración de Hipoclorito de sodio y detergente

Tiempo de contacto con la solución desinfectante

Tratamiento posterior con alcohol

Establecimiento del medio de cultivo

Medio Base

Se ensayarán diluciones del medio MS u otro específico

caso de ser necesario.

Se ensayará el agente gelificante: agar y fitagel

Reguladores de crecimiento

Se probarán combinaciones de auxinas y citoquininas

Antioxidantes

Se probará el efecto del ácido ascórbico, prolina y

melatonina en el medio de cultivo

30

Establecimiento de las condiciones de cultivo

Temperatura

Se ensayarán dos temperaturas de cultivo

Fotoperiodo

Se ensayarán dos fotoperíodos

Indicador de éxito: Se establecen las condiciones de cultivo in vitro

adecuadas para que los ápices caulinares de todos los genotipos broten in

vitro, libres de contaminación, y continúen su desarrollo. Se cuantificará,

para cada ensayo, el % de contaminación, el % de supervivencia, % de

brotación, longitud media de los brotes, nº medio de entrenudos por brote

y nº medio de hojas por tallo.

Etapa 4.- Selección de los explantos a crioconservar.

Obtención de ápices culinares con crecimiento vigoroso in vitro.

Determinación del tamaño adecuado de los ápices

Se establecerán tres rangos o categorías de tamaños

Se correlacionarán los tamaños con el número de hojas y

primordios foliares recubriendo el meristemo

Determinación del explanto embriogénico adecuado

Se seleccionarán células en distinta fase de crecimiento y/o callos

de diferentes tamaños

Se seleccionarán embrioides en diferentes estados de desarrollo

Indicador de éxito: Se dispone de un número adecuado de explantos de

cada tipo (al menos 20), con crecimiento adecuado, para la realización de

los ensayos posteriores. Esto será un proceso secuencial que se realizará,

a partir del material mantenido in vitro tras la etapa 3, tantas veces como

sea necesario para la realización de los ensayos.

Etapa 5.- Tratamientos crioprotectores y congelación

Se aplicarán los métodos descritos en el capítulo anterior. Para la

selección del protocolo se seguirá, en principio lo indicado en la tabla.

31

Indicador de éxito: en esta etapa no se pueden establecerse los indicadores

de éxito (supervivencia y desarrollo de los explantos crioconservados)

hasta que no se complete la etapa 6)

Etapa 6.- Descongelación y recuperación de los explantos

Descongelación

Descongelación rápida en agua a 40ºC

Descongelación lenta en CFL a 25 ºC

Descarga

Lavado con medio de cultivo

Lavado con solución de sacarosa

Cultivo in vitro en medio de recuperación

Período de oscuridad (días)

Paso a condiciones de fotoperíodo 12-12

Composición del medio

MS distintas diluciones

Reguladores de crecimiento BAP, NAA Distintas

combinaciones)

Evaluación cada dos días de parámetros de supervivencia y desarrollo

de los explantos.

Indicador de éxito: Al menos con uno de los tratamientos secuenciales de

las etapas 5 y 6 se consigue la supervivencia de más de un 30% de los

explantos de todos los genotipos ensayados. Si esto no se consigue, habrá

que pasar a la etapa 7

Etapa 7.- Mejora de los protocolos establecidos.

Ensayo del tratamiento con agentes reductores del estrés oxidativo

32

En la fase de precultivo

Prolina

Melatonina

Triptófano

Ácido ascórbico

Desferroxiamina

En la fase de recuperación post descongelación

Prolina

Melatonina

Triptófano

Ácido ascórbico

Desferroxiamina

Indicador de éxito: Se consiguen mejorar (al menos en un 10%) con alguno

de estos tratamientos los resultados del mejor de los protocolos

establecidos en las etapas anteriores.

Etapa 8.- Estudio de la estabilidad genética de las plantas procedentes de

crioconservación.

Estudio con marcadores de ADN en los explantos previa

crioconservación

SSR

ISSR

Genes funcionales

Estudio con marcadores de ADN en las plántulas obtenidas a partir de

los explantos crioconservados

SSR

ISSR

33

Genes funcionales

Indicador de éxito: No se detectan diferencias entre los patrones de los

marcadores del material vegetal antes y después de la crioconservación

Etapa 9.- Establecimiento de un banco permanente crioconservado para una

especie concreta

Se ensayará con, al menos 10 genotipos distintos, el protocolo que dio

mejores resultados en las etapas anteriores.

Se evaluarán los % de supervivencia y recuperación delos

explantos crioconservados de todos los genotipos.

Se evaluará, como en la etapa 8, la estabilidad genética de todos

los genotipos tras la crioconservación-descongelación.

Indicador de éxito: El método establecido, permite la supervivencia y

desarrollo de, al menos, un 30 % de los explantos de todos los genotipos.

No se detecta variación somaclonal, en ninguno de los genotipos, como

consecuencia de la crioconservación.

INDICADOR DE ÉXITO GENERAL: Se consigue aplicar una metodología

que permite establecer un banco de material crioconservado de las

especies seleccionadas, lo que simplifica y abarata sensiblemente el

proceso de conservación del germoplasma.

34

CONTROL DE SEGURIDAD Y CALIDAD

Este apartado describe las directrices de seguridad a seguir cuando se utiliza

nitrógeno líquido, así como información sobre la instalación y las operaciones

que ayudan a asegurar un equipo adecuado, su instalación y pruebas.

SEGURIDAD DEL NITRÓGENO LÍQUIDO

El almacenamiento a baja temperatura de materiales biológicos presenta

peligros de seguridad significativos. Es necesario un poco de sentido común para

manejar nitrógeno líquido, que desplaza al oxígeno durante la evaporación. El

gas nitrógeno es incoloro, inodoro e insípido, por lo que no puede ser detectado

por los sentidos humanos y es respirado como si fuera aire. Respirar una

atmósfera que contenga menos del 18% de oxígeno puede causar mareos y

conducir rápidamente a la inconsciencia y la muerte.

EXPLOSIÓN

El nitrógeno líquido es un criógeno con un punto de ebullición de -196ºC. Cuando

se extraen de una atmósfera de nitrógeno líquido, los recipientes

incorrectamente sellados pueden explotar. La colocación de los recipientes en

fase de vapor de nitrógeno durante varias horas antes de sumergirlos en

nitrógeno líquido minimiza el riesgo de explosión.

CONTAMINACIÓN

Si el recipiente que está sumergido en nitrógeno líquido contiene materiales

biológicos peligrosos, el recipiente debe descongelarse y abrirse en una cabina

de seguridad biológica. Los contenedores rotos dentro de los congeladores de

almacenamiento pueden ser un riesgo debido a la supervivencia de los

contaminantes. Los protocolos para la descontaminación deben ser aplicados

para una acción correctiva inmediata si se produce contaminación.

ROPA PROTECTORA

Una máscara protectora de la cara, guantes aislados y ropa de manga larga

ayudan a prevenir la exposición innecesaria al nitrógeno líquido.

RECOMENDACIONES DE SEGURIDAD

Siempre considerar lo siguiente cuando se trabaje con nitrógeno líquido:

• Utilizar sólo recipientes diseñados para líquidos a baja temperatura.

• No sellar ni evitar que el nitrógeno líquido salga.

• Utilizar barras sólidas (nunca huecas) como barras de medición.

• Usar solamente nitrógeno líquido en áreas bien ventiladas.

• No llenar demasiado los envases.

35

CALIFICACIÓN DE LA INSTALACIÓN

Se trata de cerciorarse que el equipo está instalado correctamente.

Consideraciones importantes para determinar esta calificación son las

siguientes:

• Características de diseño del equipo (construcción, limpieza, etc.)

• Condiciones de instalación (cableado, utilidades, funcionalidad, etc.)

• Calibración, mantenimiento preventivo y limpiezas

• Características de seguridad

• Documentación del proveedor, impresiones, dibujos y manuales

• Documentación de software

• Lista de piezas de repuesto

• Condiciones ambientales (temperatura ambiente, requisitos de

escape/suministro de oxígeno)

A veces las actividades de control de calidad se llevan a cabo en las

instalaciones del fabricante antes de que el equipo sea enviado. Por ejemplo, los

fabricantes de equipos pueden realizar ensayos en sus instalaciones y analizar

los resultados para determinar si el equipo está listo para ser entregado. Estos

estudios pueden utilizarse como guías para obtener datos básicos y

complementar la calificación de la instalación.

CALIFICACION OPERATIVA

Los parámetros del proceso se ponen a prueba para asegurar un resultado

correcto.

Deben considerarse:

• Límites de control del proceso (tiempo, temperatura, presión, velocidad de

línea, condiciones de configuración, etc.)

• Software

• Especificaciones de las materias primas

• Procedimientos de operación

• Procedimientos de control

• Mantenimiento preventivo

• Entrenamiento

• Limpieza

• Calibración

• Evaluaciones para los modos de falla potencial y las condiciones del peor caso

posible.

36

Una calificación de la instalación ayuda a asegurar que el equipo se instala de

manera segura y apropiada.

Una calificación operativa garantiza el correcto uso y mantenimiento del equipo.

37

BIBLOGRAFÍA RECOMENDADA

• Ashmore SE (1997) Status report on the development and application of

in vitro techniques for the conservation and use of plant genetic resources.

IPGRI, Rome

• Bajaj YPS (1987) Cryopreservation of pollen and pollen embryos, and the

establishment of pollen banks. Int Rev Cytol 107:397–420

• Bajaj YPS (1995) Cryopreservation of germplasm of medicinal and

aromatic plants. In: Bajaj YPS (ed) Biotechnology in agriculture and

forestry, vol 32, Cryopreservation of plant germplasm I. Springer, Berlin,

pp 419–434

• Benson EE (1990) Free radical damage in stored plant germplasm. Int Board Plant Genet Res, Rome

• Benson EE (2004) Cryoconserving algal and plant diversity: historical perspectives and future challenges. In: Fuller BJ, Lane N, Benson E (eds) Life in the frozen state. CRC Press, Boca Raton, pp 299–328

• Benson EE (2008) Cryopreservation of phytodiversity: a critical appraisal of theory & practice. Crit Rev Plant Sci 27:141–219

• Benson EE, Bremner D (2004) Oxidative stress in the frozen plant: a free radical point of view. In: Fuller BJ, Lane N, Benson EE (eds) Life in the frozen state. CRC Press, Boca Raton, pp 205–241

• Benson EE, Johnston J, Muthusamy J, Harding K (2006) Physical and engineering perspectives of in vitro plant cryopreservation. In: Gupta S, Ibaraki Y (eds) Plant tissue culture engineering, vol 6. Springer, Berlin, pp 441–476

• Berjak P, Walker M, Mycock DJ, Wesley-Smith J, Watt P, Pammenter NW (2000) Cryopreservation of recalcitrant zygotic embryos. In: Engelmann F, Takagi H (eds) Cryopreservation of tropical plant germplasm: current research progress and application. Proceedings of an international workshop, Tsukuba, Japan, October 1998, International Plant Genetic Resources Institute, Rome, pp 140–155

• Chaudhury R (2000) Cryopreservation of seeds, embryos, embryonic axes and pollen at National Cryobank of NBPGR. In: Engelmann F, Takagi H (eds) Cryopreservation of tropical plant germplasm: current research progress and application. Proceedings of an international workshop,

38

Tsukuba, Japan, October 1998, International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI), Rome, pp 457–459

• Cruz-Cruz CA, González-Arnao MT, Engelmann F (2013) Biotechnology and conservation of plant biodiversity. Resources 2:73–95

• Dixit S, Ahuja S, Narula A, Srivastava PS (2004) Cryopreservation: a potential tool for long-term conservation of medicinal plants. In: Srivastava PS, Narula A, Srivastava S (eds) Plant biotechnology and molecular markers. Anamaya Publ, New Delhi, pp 278–288

• Engelmann F (1991) In vitro conservation of tropical plant germplasm-a review. Euphytica 57:227–243

• Engelmann F (1992) Cryopreservation of embryos. In: Dattée Y, Dumas C, Gallais A (eds) Reproductive biology and plant breeding. Springer, Berlin, pp 281–290

• Engelmann F (1997) In vitro conservation methods. In: Callow JA, Ford-Lloyd BV, Newbury HJ (eds) Biotechnology and Plant Genetic Resources, CAB International, Oxford, UK, p 119–161

• Engelmann F (2000) Importance of cryopreservation for the conservation of plant genetic resources. In: Engelmann F, Takagi H (eds) Cryopreservation of tropical plant germplasm—current research progress and applications. JIRCAS, Tsukuba, pp 8–20

• Engelmann F (2004) Plant cryopreservation: progress and prospects. In Vitro Cell Dev Biol Plant 40:427–433.

• Engelmann, F.,2009. Encapsulation-dehydration: past, present and future. Acta Hortic.908,165–171.

• Engelmann F (2011) Use of biotechnologies for the conservation of plant Biodiversity. In Vitro Cell Dev Biol Plant 47:5–16

• Engelmann F (2014) Cryopreservation of clonal crops: a review of key parameters. Acta Hort 1039:31–39

• Engelmann F, Dussert S (2013) Cryopreservation. In: Normah MN, Chin HF, Reed BM (eds) Conservation of tropical plant species. Springer, New York, pp 107–119

• Engelmann F, Engels JMM (2002) Technologies and strategies for ex situ conservation. In: Engels JMM, Rao VR, Brown AHD, Jackson MT (eds) Managing plant genetic diversity. CAB International, Wallingford, pp 89–104

39

• Engelmann F, Gonzalez-Arnao MT, Wu Y, Escobar R (2008) Development of encapsulation dehydration. In: Reed BM (ed) Plant cryopreservation: a practical guide. Springer, New York, pp 59–75

• Engelmann F, Takagi H (eds) (2000) Cryopreservation of tropical plant germplasm: current research progress and applications. JIRCAS/IPGRI, Rome

• FAO (2014) Genebank standards for plant genetic resources for food

and agriculture. Rev. ed. Rome.

http://www.fao.org/docrep/019/i3704e/i3704e.pdf

• Gonzalez-Arnao MT, Engelmann F (2006) Cryopreservation of plant

germplasm using the encapsulation- dehydration technique: review and

case study on sugarcane. Cryo Letters 27:155–168

• González-Arnao MT, & Engelmann, F. (2013). Crioconservación de

plantas en América Latina y el Caribe (No. IICA F30 52). IICA, San José

(Costa Rica).

• Gonzalez-Arnao MT, Panta A, Roca WM, Escobar RH, Engelmann F

(2008) Development and large scale application of cryopreservation

techniques for shoot and somatic embryo cultures of tropical crops. Plant

Cell Tissue Organ Cult 92:1–13

• Gonzalez-Arnao, M. T., Martinez-Montero, M. E., Cruz-Cruz, C. A., &

Engelmann, F. (2014). Advances in cryogenic techniques for the long-term

preservation of plant biodiversity. In Biotechnology and biodiversity (pp.

129-170). Springer International Publishing.

• Gupta S (2014) Cryopreservation of germplasm through encapsulation-

dehydration technique. Acta Hort 1039:147–153

• Harding K (2004) Genetic integrity of cryopreserved plant cells: a review.

Cryo Lett 25:3–22.

• Kaczmarczyk, A., Menon, A., Al-Hanbali, A., Funnekotter, B., Bunn, E.,

Phang, P. Y., & Mancera, R. L. (2012). Current issues in plant

cryopreservation. INTECH Open Access Publisher.

http://www.fao.org/docrep/019/i3704e/i3704e.pdf

40

• Kami, D. (2012). Cryopreservation of plant genetic resources. INTECH

Open Access Publisher.

• Kim HH, Lee YG, Ko HC, Park SU, Gwag JG, Cho EG, Engelmann F

(2009a) Development of alternative loading solutions in droplet-vitrification

procedures. Cryo Letters 30:291–299

• Kim HH, Lee YG, Shin DJ, Kim T, Cho EG, Engelmann F (2009b)

Development of alternative plant vitrification solutions in droplet-

vitrification procedures. Cryo Letters 30:320–334

• Matsumoto T, Niino T (2014) The development of plant vitrifi cation

solution 2 and recent PVS2- based vitrifi cation protocols. Acta Hort

1039:21–28

• Matsumoto T, Sakai A (1995) An approach to enhance dehydration

tolerance of alginate-coated dried meristems cooled to −196°C. Cryo Lett

16:299–306

• Matsumoto T, Sakai A, Yamada K (1995) Cryopreservation of in vitro -

grown apical meristems of lily by vitrifi cation. Plant Cell Tiss Org Cult

41:237–241

• Mazur P (2004) Principles of cryobiology. In: Fuller B, Lane N, Benson EE

(eds) Life in the frozen state. CRC Press, London, pp 4–65

• Panis B, Lambardi M (2006) Status of cryopreservation technologies in

plants (crops and forest trees). In: Ruane J, Sonnino A (eds) The role of

biotechnology in exploring and protecting agricultural genetic resources.

Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome, pp 61–78

• Pammenter, N. W., & Berjak, P. (2013). Physiology of desiccation-

sensitive (recalcitrant) seeds and the implications for cryopreservation.

International Journal of Plant Sciences, 175(1), 21-28.

• Pence VC (1995) Cryopreservation of recalcitrant seeds. In: Bajaj YPS

(ed) Biotechnology in agriculture and forestry, vol 32, Cryopreservation of

plant germplasm I. Springer Verlag, Berlin, pp 29–52

• Pence VC (2011) Evaluating costs for the in vitro propagation and

preservation of endangered plants. In Vitro Cell Dev Biol Plant 47:176–

187

41

• Popova, E., Shukla, M., Kim, H. H., & Saxena, P. K. (2015). Plant

Cryopreservation for Biotechnology and Breeding. In Advances in Plant

Breeding Strategies: Breeding, Biotechnology and Molecular Tools (pp.

63-93). Springer International Publishing.

• Pritchard HW (1995) Cryopreservation of seeds. In: Day JG, McLellan MR

(eds) Methods in molecular biology, vol 38, Cryopreservation and freeze-

drying protocols. Humana, Totowa, pp 133–144

• Pritchard HW (2007) Cryopreservation of desiccation-tolerant seeds. In:

Day JG, Stacey GN (eds) Methods in molecular biology, vol 368, 2nd edn,

Cryopreservation and freeze-drying protocols. Humana Press Inc, Totowa,

pp 185–201

• Pritchard HW, Nadarajan J (2008) Cryopreservation of orthodox

(desiccation tolerant) seeds. In:Reed BM (ed) Plant cryopreservation: a

practical guide. Springer, Berlin, pp 485–501

• Reed BM (2001) Implementing cryogenic storage of clonally propagated

plants. Cryo Lett 22:97–104

• Reed BM (ed) (2008) Plant cryopreservation: a practical guide. Springer,

New York.

• Sakai A, Engelmann F (2007) Vitrification, encapsulation-vitrification and

droplet-vitrification: a review. Cryo Lett 28:151–172

• Sakai A, Matsumoto T, Hirai D, Niino T (2000) Newly developed

encapsulation-dehydration protocol for plant cryopreservation. Cryo Lett

21:53–62

• Sakai A, Hirai D, Niino T (2008) Development of PVS-based vitrification

and encapsulation vitrification protocols. In: Reed BM (ed) Plant

cryopreservation: a practical guide. Springer,Berlin, pp 33–58

• Towill LE, Bajaj YPS (2002) Cryopreservation of plant germplasm II.

Biotechnology in agriculture and forestry, vol 50. Springer, Berlin

• Towill LE, Bonnart R (2003) Cracking in a vitrifi cation solution during

cooling or warming does not affect growth of cryopreserved mint shoot

tips. Cryo Lett 24:341–346

42

• Volk GM, Walters C (2006) Plant vitrifi cation solution 2 lowers water

content and alters freezing behavior in shoot tips during cryoprotection.

Cryobiology 52:48–61

• Volk GM, Henk AD, Bonnart RM et al (2014a) Plant shoot tip response to

treatment with plant vitrification solution #2. Acta Hort 1039:81–84

• Volk GM, Shepherd A, Borrart RM (2014b) Strategies for improved effi

ciency when implementing plant vitrifi cation techniques. Acta Hort

1039:85–89

• Walters C, Wheeler L, Stanwood PC (2004) Longevity of cryogenically

stored seeds. Cryobiology 48:229–244

• Walters, C., Wheeler, L. M., & Grotenhuis, J. M. (2005). Longevity of seeds

stored in a genebank: species characteristics. Seed Science Research,

15(01), 1-20.

• Wang ZC, Deng XX (2004) Cryopreservation of shoot-tips of citrus using

vitrification: effect of reduced form of glutathione. Cryo Letters 25:43–50

• Wang QC, Valkonen JPT (2009) Cryotherapy of shoot tips: novel

pathogen eradication method. Trends Plant Sci 14:199–122

• Wang QC, Panis B, Engelmann F et al (2009) Cryotherapy of shoot tips:

a technique for pathogen eradication to produce healthy planting materials

and prepare healthy plant genetic resources for cryopreservation. Ann

Appl Biol 154:351–363

• Wang QC, Wang RR, Li BQ, Cui ZH (2012) Cryopreservation: a strategy

technique for safe preservation of genetically transformed plant materials.

Adv Genet Eng Biotechnol 1:1–2

• Wang B, Wang RR, Cui ZH et al (2014) Potential applications of cryogenic

technologies to plant genetic improvement and pathogen eradication.

Biotech Adv 32:583–595

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DISTRIBUCIÓN DE LOS EQUIPOS DE CRIOCONSERVACIÓN Y

CONSERVACIÓN IN VITRO

1.- SALA PREPARACIÓN DE MEDIOS:

• Sistema de purificación de agua. Resistividad de, al menos, 200,000 ohms/cm y conductividad de 5.0 micromhos/cm.

• Balanza analítica (0.01 g de resolución; 200 g capacidad mínima).

• Balanza de precisión desde 5 Kg/0,001 g.

• pH metro (rango 0-14 +/- 0.01; compensación automática de temperatura 0-60º C; dos puntos de calibración).

• Agitador magnético con placa calefactada. Temperatura regulable hasta 350ºC. (velocidad variable 50-150 rpm; resistente a reactivos).


• Autoclave; control de procesos por microprocesador. Sistema de secado y purgado. Para temperaturas regulables desde 105 °C hasta 134 °C (0,21 a 2 bar). Modelo vertical de, al menos, 80 litros

• Lavavajillas industrial. Capacidad de carga: 120 frascos de laboratorio. Acero inoxidable (AE). Panel de control táctil en acero inoxidable con

display incorporado. Programas. Trazabilidad de procesos. Sistema de

filtrado de 4 niveles. AutoClose- cierre automático de la puerta.Indicación

óptica y acústica de fin de programa. Bomba propulsora de alto

rendimiento. Descalcificador de agua. Condensador de vapor. Sistema

antifugas.

2. LABORATORIO POLIVALENTE

• Una fuente de luz fría regulable sin etapas, que no modifique los colores

y que disponga de una lámpara reflectora halógena de larga duración.

Potencia de la lámpara reflectora halógena: 150W (15V). Flujo de Luz:

600 lm. Intensidad regulable por ajuste eléctrico estabilizado (continuo 0-

100%) y mecánico, Diámetro guía de luz: Máximo Ø9mm. Alimentación:

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220-240V aprox.50/60Hz.

• Lupa Binocular (Estereomicroscopio) 20/40x. Cabeza binocular inclinado

45º. Con distancia interpupilar variable de 55 - 75 mm. Portaocular con

ajuste de dioptrías ± 5 D. Par oculares gWF10x20 mm. Objetivos de 2x y

4x en torreta giratoria. Distancia de trabajo de 80 mm. Aumentos totales

40x. Iluminación incidente y transmitida 12v/10w.

• Baño termostatizado. Medidas internas útiles: 300 x 170 x 120 mm de prof. o

300 x 170 x 170 mm de profundidad. Termostato: Hidráulico. Precisión:

Más/menos 0.5ºC. Rango de temperatura: ambiente + 5ºC hasta 100º C.

Uniformidad de la temperatura: Más/menos 0,25ºC. Resistencia Blindada de

inmersión: 1000 W. Aislación de lana de vidrio: 25 mm de espesor. Gradillas

para: 39 tubos de 12 mm de diámetro. 33 tubos de 16 mm de diámetro. 24 tubos

de 18 / 20 mm de diám. 16 tubos de 25 mm de diámetro. Presentación: Dos, tres,

cuatro, cinco y seis, ocho, diez y doce gradillas. Interruptor principal y luz piloto.

• Horno Microondas Industrial con 2 magnetrones de alta calidad que cumple

normas sanitarias. Bandeja intermedia de cerámica extraíble. Programable.

Interior y exterior en acero inoxidable. Temporizador: 99 min. Volumen interior:

30 l.


3. SALA CÁMARA DE FLUJO LAMINAR

• Cabina de flujo laminar horizontal con filtro HEPA que retenga partículas mayores de 0.3μm; zona de trabajo Clase 10 definida según las normas U.S. Fed Std 209 y B.S. 5295.; que mantenga un flujo de 90 fpm +/- 20% a una presión estática de 0.6-1.2.

.

• Esterilizador para instrumental en cabina de flujo laminar, por calor seco con bolas de cristal o cerámica.

5. SALA CRIOCONSERVACIÓN

• Congelador –40ºC. Temperatura de trabajo de -40 °C a -20°C.

Controlador de temperatura con pantalla digital. Controlador protegido por

llave. Sonda de temperatura, resolución 0,1 °C. Alarmas: acústica y visual

45

para temperatura máxima y mínima, así como fallo de tensión;

alimentadas por batería.Indicador para puerta abierta, con alarma. Puerta

con dispositivo de cierre de fácil apertura, incorpora cerradura con llave.

Control digital de la temperatura con panel táctil integrado. Interruptor

principal protegido por llave. Aislamiento de 110 mm, fabricado en

poliuretano inyectado de alta densidad. Gas refrigerante, libre de CFC y

HCFC, biodegradables. Sistema de evaporador envolvente. Compresor

hermético muy silencioso montado sobre amortiguadores para disminuir

el ruido <48 dB. Sello magnético perimetral doble, marco de la puerta

calefactado, evita la formación de hielo en las juntas; asegurando la

estanqueidad. Cámara interior construida en acero inoxidable. Estantes

en varilla de acero plastificado. Estructura exterior en acero con

recubrimiento epoxi. Sistema soporte con 4 ruedas, facilita el movimiento.

Tratamiento tropicalizado que permite trabajar con temperatura ambiente

hasta 32 °C y un 85-90% de H.R.

• Crioconservador Crioplus. Capacidad para 22.100 a 24.000 viales.

Cierre bajo llave y ruedecillas en estándar. Impresora térmica en opción

sobre Crioplus. Presión de llegada máxima de nitrógeno: 1,5 bar. Relleno

automático. Testigos de relleno. Control automático de las funciones.

Control de nivel por termistancias. Indicación del nivel de nitrógeno líquido

o vapor. Indicación de la temperatura sobre pantalla. Salvaguarda de los

programas. Llave de acceso al programa. Puerto RS 232. Alarma visual

y sonora.

6. SALA BANCO BASE

• Tanques de NL de 120 l con capacidad para 4000 crioviales de 2 ml.

Base con ruedas para el tanque. Sistema de almacenamiento de cajas

criogénicas de fácil recuperación. Métodos manuales de manejo de

registro de inventarios. Aislamiento de vacío avanzado que minimice las

pérdidas de nitrógeno por evaporación que asegure una temperatura de

–190°C, aun cuando solo quede unos 5 cm de nitrógeno líquido

remanente en el tanque. Sistema de bloqueo para prevenir manipulación

no autorizada de muestras.

• Tanque de reserva de nitrógeno líquido de 35 litros. Aislamiento de vacío

avanzado que minimice las pérdidas de nitrógeno por evaporación que

asegure una temperatura de –190°C

• Estanterías y equipos del banco de base de semillas del DENAREF

46

7.- CÁMARA DE CONSERVACIÓN IN VITRO

• Cámara de crecimiento: Rango de temperatura de 7º a 35ºC. Estabilidad

±1.0°C. Uniformidad ±1.0°C. Lectura digital resolución 0.1ºC. Regulación

electrónica de temperatura. Flujo de aire: del techo a las paredes y retorno

al pasillo central a través de las estanterías. Max. velocidad entre

estanterías 0.5 m s-1. Intercambio de aire fresco por hora: 4 volúmenes.

Iluminación con fluorescentes o leds hasta un mínimo de 12000 lux;

Máxima radiación fotosintética activa (500 mol m-2 s-1). Distancia a las

lámparas: Min 30 cm. Tipo de lámparas fluorescentes T8/HF/58W/840

Potencia 58W. Suplementarias dos lámparas de 60W tungsteno.

Programador horario de fotoperiodo y termoperiodo. Termostato de

seguridad contra fallos de temperatura. Alarma óptica y acústica.

8.- LABORATORIO PARA ENSAYOS DE GERMINACIÓN

• Germinadores existentes en el DENAREF

9. SALA DE PROCESAMIENTO DE SEMILLAS

• Equipos existentes en el DENAREF

11. CUARTO DE SECADO

• Equipos existentes en el DENAREF

13.- BANCO ACTIVO

• Estanterías y equipos del banco activo de semillas del DENAREF

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DISTRIBUCIÓN DEL MATERIAL FUNGIBLE PARA

CRIOCONSERVACIÓN Y CONSERVACIÓN IN VITRO

1. SALA PREPARACIÓN DE MEDIOS








• Papel Parafilm 10cmx75m (2 unidades en stock)

• Resma papel filtro 42x52cm (5 unidades en stock)

• Guantes látex t/mediana 100u (2 unidades en stock)

• Frascos lavadores de 500 ml (2 unidades en stock)

• Bidón de plástico con grifo de 10 l (1 unidad en stock)

• Guantes protectores de quemado (2 pares en stock)

• Tarro de vidrio de 38 cl para cultivo in vitro (al menos 400 unidades en

stock)

• Tapa de polipropileno 82mm p/tarros (al menos 400 unidades en stock)






48




o 0,1 ml

o 0,2 ml

o 0,5 ml

o 1,0 ml

o 2,0 ml

o 5,0 ml

o 10,0 ml

o 20,0 ml


o 5 ml

o 10 ml

o 25 ml

o 50 ml

o 100 ml

o 250 ml

o 500 ml

o 1000 ml

o 2000 ml


o 25 ml

o 50 ml

o 100 ml

49

o 250 ml

o 500 ml

o 1000 ml

o 2000 ml

• Murashige & Skoog Medium Macro, Micro y Vitaminas (5 unidades en

stock)

• Sucrose double-crystallized (Sacarosa) 5Kg (2 unidades en stock)

• Phyto Agar 1Kg (4 unidades en stock)

• Sodio hipoclorito sol 10% P/V 1000ml (2 unidades en stock)

• Ácido alfa-naftalenacético ANA 25g (1 unidad en stock)

• indole-3-butyric acid IBA 25 g (1 unidad en stock)

• 6-benzilaminopurina BAP 5g (1 unidad en stock)

• Thidiazuron 250 mg (1 unidad en stock)

• Solución antibiótica-antimicótica estabilizada para PTC (mínimo 100 ml

en stock)

• Ácido Ascórbico (500 g en stock)

• Prolina (100g en stock)

• Melatonina (2 g en stock)

• Desferroxiamina (5 ml en stock)

• Tampones de calibración de pHmetro

2.- LABORATORIO POLIVALENTE




50






o 0,1 ml

o 0,2 ml

o 0,5 ml

o 1,0 ml

o 2,0 ml

o 5,0 ml

o 10,0 ml

o 20,0 ml


o 5 ml

o 10 ml

o 25 ml

o 50 ml

o 100 ml

o 250 ml

o 500 ml

o 1000 ml

o 2000 ml


o 25 ml

51

o 50 ml

o 100 ml

o 250 ml

o 500 ml

o 1000 ml

o 2000 ml

• Micropipetas graduables 100- 1000 l (mínimo 4 en stock)

• Puntas de pipeta bolsa de 500 puntas (2 unidades en stock)

• Glicerol (mínimo 2Kg en stock)

• Etilenglicol (mínimo 1 Kg en stock)

• Dimetilulfóxido (mínimo 1l en stock)

• Sacarosa (mínimo 1 Kg en stock)

• Alginato de sodio (400g en stock)

• Cloruro de calcio (500 g en stock)

• Papel de aluminio 50m (2 unidades en stock)

• Gel de sílice naranja (2,5 Kg en stock)

• Crioviales 2 ml (500 unidades en stock)

• Termo para nitrógeno líquido 500 ml

• Cuatro bastidores para 10 cajas de 100 crioviales de 2 ml

• Cajas para 100 crioviales de 2 ml (10 unidades en stock)

• Guantes crioprotectores (2 pares en stock)

• Gafas crioprotectoras (2 unidades en stock)

3. SALA CÁMARA FLUJO LAMINAR

• Alcohol etílico 96 10 l (1 unidad en stock)

• Lejía

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• Detergente








5. SALA CRIOCONSERVACIÓN

• Suministro permanente de NL. Calcular para una tasa de evaporación de

0,6 l/día

Preparaciónde medios

Cámarasde flujo laminar

Cámara de conservación

in vitro

Recepción de muestras

Rec

epci

ón d

e m

uest

ras

Procesamientode semillas

Oficina

Monitoreo

Pruebas de germinación

Laboratoriopolivalente

Crioconservación

Banco Base

Banco Activo

Cuartode secado

Sala de Máquinas

implementación en el banco nacional de...

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