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IMPLEMENTACIÓN DE UN ENSAYO PCR MULTIPLEX PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LAS
ENTEROVARIEDADES DE Escherichia coli PATÓGENAS
Autora: Andrea Zambrano Cobos
Directora: BSc. Karina PonceCodirector: Dr. Marcelo Grijalva
Sangolquí - Ecuador2012
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TABLA DE CONTENIDOS TABLA DE CONTENIDOS
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Escherichia coli (Enterobacteriaceae)
CARACTERÍSTICAS:
•Anaerobio facultativo, Gram -•Pared celular rígida y porosa •Flagelos y pilis•Membrana celular (lípidos y proteínas) •Una sola cadena circular de ADN•Aproximadamente 5000 genes
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1. EPEC2. ETEC3. EIEC4. EHEC5. EAEC6. DAEC
CATEGORIAS DIARREOGÉNICAS
•Poseer distintos factores de virulencia•Causar un síndrome diarreico diferente•Presentar distinta epidemiología•Pertenecer a distintos serotipos O:H
Métodos específicos de detección
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MECANISMO DE PATOGENICIDAD MECANISMO DE PATOGENICIDAD
Variabledepende E. coli diarreicas
• Invasividad.
• Adherencia a la superficie de la mucosa.
• Producción de enterotoxinas.
• Producción de citotoxinas
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ETAs
EHEC: La distribución es universal. Los alimentos asociados a brotes son el arroz, carne contaminada, salsa de vainilla.
ETEC: Diarrea del viajero. Países en desarrollo. La transmisión ocurre por la ingesta de alimentos o agua contaminados.
EIEC: Genéticamente igual a Shigella spp. Presentan colitis inflamatoria y disentería.
EPEC: En niños menores de 2 años. Elevadas tasas de morbilidad y mortalidad. Trasmisión por contaminación fecal
EAEC: La causa más frecuente de diarrea persistente en lactantes
DAEC: Predomina en pre-escolares, niños pequeños y lactantes
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VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA
• Países desarrollados y subdesarrollados
• Datos epidemiológicos
• No existen reporte de E. coli patógenas
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DETECCIÓN
1. Propiedades bioquímicas
2. Serotipo (Ciertas variedades)
3. Reacciones inmunoenzimáticas 4. Cultivos celulares
5. PCR
6. Hibridación de sondas
Para estudios epidemiológicos PFGE, MLST
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PCR MÚLTIPLEX
Simple identificación 2 ó más loci en la Rxn
Amplifica
• Diagnóstico rápido
• Alta confiabilidad
• Sensible y específico
Esta correlacionado con la presencia de genes involucrados con la patogenicidad
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Objetivo General
Implementar un ensayo PCR múltiplex para la identificación de las enterovariedades de Escherichia coli patógenas
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
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• Optimizar el sistema según los parámetros: Temperatura de hibridación, concentración de primers, tiempo y ciclos de amplificación
• Identificar los genes eltB y estA de E.coli enterotoxigénica, los genes vt1, vt2 y eaeA de E.coli enterohemorrágica, el gen ipaH de E.coli enteroinvasiva, el gen eaeA de E.coli enteropátogena, el gen aggR de E.coli enteroagregativa, el gen DA de E.coli difusa adherente
• Determinar la sensibilidad analítica del sistema. • Elaborar un protocolo de implementación del ensayo PCR multiplex para la
identificación de las enterovariedades Escherichia coli patógenas.
Objetivos específicos
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MATERIALES Y MÉTODOS
DISEÑO DE TIPO EXPLORATORIO - CONFIRMATORIO
Optimización: [primers], Tº Hibridación, Ciclos y tiempo de amplificación.
Diseño PCR Multiplex
Sensibilidad
Especificidad
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Controles positivos y primers
Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Chile y Dr. James Nataro de la Universidad de Virginia
Cebadores
DAEC EPEC EHEC EIEC EAEC ETEC
eltBestAeae vt1 vt2 ipaH aggRDa
322 pb
147pb
376pb
130pb
298pb
600pb
254pb
750pb
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Extracción ADN genómico
Kit comercial de Promega Wizard Genomic DNA Purification
Temperatura de hibridación
Rango: 56ºC-68ºC
OPTIMIZACIÓN
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Concentración de Primers
0,2 uM - 0,4 uM - 0,5 uM - 0,75 uM - 1uM
DISEÑO DE PCR MULTIPLEX
1. Ensayo PCR: 8 pares primers en una Rxn
2. Ensayo PCR: Combinación de 2 pares de primers con cada DEC
3. Ensayo PCR: 2 PCR multiplex A y B
Tiempos de amplificación
1 min-45 seg- 30 seg
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LÍMITE DE DETECCIÓNCepas de referencia : EHEC y ETEC
ESPECIFICIDAD
Escherichia coli Escherichia coli ATCC 51313Escherichia coli ATCC 25922Klebsiella pneumoniaeSalmonella serotipo EnteritidisVibrio cholerae
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Microbiología
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ADN Genómico
ETEC: 33,6ng/uL
EPEC: 20,2 ng/uL
EIEC: 17,8 ng/uL
EHEC: 17,3 ng/uL
EAEC: 47,5 ng/uL
DAEC: 10,8 ng/uL
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Temperatura de hibridación
M ipaH ipaH ipaH ipaH eae eae eae eae
M eltB eltB eltB eltB aggR aggR aggR aggR
EIE
C-E
PE
CE
TE
C-E
AE
C
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EIE
C-E
CD
A M ipaH ipaH ipaH ipaH Da Da Da Da
M vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 vt2 c-
EH
EC
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Concentración de cebadores
0,4 uM 0,2 uM
vt1 eae eltB aggR Da vt1 eae eltB estA Da Da Da
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Diseño PCR multiplex
Pool DNA
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Primer Ensayo
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Concentración de primers
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Segundo Ensayo
PCR Dúplex
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Tercer Ensayo
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MULTIPLEX A Y B
A: EHEC-EPEC-DAEC
B: ETEC-EIEC-EAEC
B A
Tercer Ensayo
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MULTIPLEX A Y B
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Limite de detección
Multiplex A : EHEC
Multiplex B : ETEC
0,0029 ng/uL
0,011 ng/uL
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ESPECIFICIDAD
M ETEC Salm Vibrio K.pneu C-
Amplifica E. coli patógenas!!!
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Prueba de Campo
M m1 m2 C1+ C1- m1 m2 C2+ C2-
Múltiplex A Múltiplex B
EPEC ETEC
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Conclusiones
Se logro detectar los 8 genes virulentos de la E. coli diarreicas en dos PCR multiplex
Los parámetros que fueron optimizados en la PCR monoplex variaron al momento de diseñar la PCR multiplex.
Las [primers] oscilan entre 0,1 uM a 1,25 uM, la Tº de hibridación optimizada fue de 57ºC, el tiempo de los pasos de la PCR fueron de 45”.
Se dividió en 2 PCR multiplex: A identifica ECEH, ECEP, y ECDA. B identifica a ECET, ECEI, ECEA.
La sensibilidad PCR multiplex A fue de 0,0029 ng/uL y B fue de 0,011 ng/uL.
La especificidad del sistema se evaluó en otros microorganismos, resultando negativo la amplificación
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Recomendaciones
Realizar la técnica directamente desde las muestras de heces o desde la bacteria, aislando el ADN mediante kits comerciales. Antes de diseñar la PCR multiplex
optimizar la temperatura de hibridación de cada cebador y la concentraciones de los mismos.
Usar la PCR múltiplex para investigar un número elevado de microorganismos.
Hacer uso de esta técnica para estudios a mayor escala como es la prevalencia de las diferentes enterovariedades de E. coli, caracterización genotípica, etc.
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AGRADECIMIENTOS