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TESIS DOCTORAL
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS COILED-COIL ESPECÍFICAS DE PLANTAS EN EL NÚCLEOESQUELETO
DE Allium cepa L. var. francesa
Mª CANDELARIA CLARA PÉREZ MUNIVE
Madrid, junio de
2011
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Departamento de Genética
TESIS DOCTORAL
IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS COILED COIL ESPECÍFICAS DE PLANTAS EN EL NÚCLEOESQUELETO DE Allium cepa L. var. francesa
Mª CANDELARIA CLARA PÉREZ MUNIVE
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Departamento de Genética
VºBº Directora de tesis VºBº Tutora CIB-CSIC Departamento de Genética
Dra. Susana Moreno Díaz de la Espina Dra. Mª Jesús Puertas Gallego
Madrid, junio de 2011
AGRADECIMIENTOS
A la directora de la Tesis Dra. Susana Moreno Díaz de la Espina, le
agradezco el haberme transmitido parte de su amplia experiencia profesional en
la investigación científica de la organización del núcleoesqueleto en plantas. Su
invaluable dirección académica ha sido fundamental para la producción y edición
de este trabajo de tesis cuyos resultados han sido presentados en la etapa de
investigación para la obtención del Diploma de Estudios Avanzados (DEA), en
cinco congresos nacionales e internacionales y publicados en dos revistas
internacionales (una en proceso).
Agradezco su convocatoria abierta hacia los estudiantes de posgrado, su
gentileza y apoyo administrativo para la obtención de recursos económicos ante
las instituciones mexicanas para mis estudios de doctorado, y sobre todo su
amistad y confianza durante mi estancia en su laboratorio del Centro de
Investigaciones Biológicas (CIB) del CSIC en donde formé parte del desarrollo y la
vida académica cotidiana.
A la Dra. Mª. María Jesús Puertas Gallego tutora del Departamento de
Genética de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Complutense de
Madrid, le agradezco su disposición y sugerencias académicas y administrativas
durante la etapa académica y de investigación del programa de doctorado.
También expreso mi agradecimiento a la plantilla de profesores que impartieron
los cursos de la etapa académica y al honorable consejo de profesores que
forman el tribunal.
Agradezco especialmente a las Instituciones de México: Benemérita
Universidad Autónoma de Puebla (BUAP), Programa de Mejoramiento del Profesorado (PROMEP) de la Secretaría de Educación Pública, y Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el permiso laboral para la superación académica y apoyo económico otorgados para la realización de mis estudios de posgrado en el extranjero, en el cumplimiento de los objetivos planteados por las instituciones educativas de México para el desarrollo, fortalecimiento e innovación de las actividades de investigación científicas y tecnológicas, y para la formación de recursos humanos de alto nivel que el país requiere.
Agradezco muy atentamente la invaluable ayuda proporcionada para la
realización de este trabajo:
A los compañeros de los laboratorios de Matriz Nuclear y Regulación de la
Organización y Funcionamiento Nuclear del Departamento de Proliferación
Celular y Diferenciación del CIB-CSIC. Especialmente a Mercedes Carnota
Romero por su apoyo en el tratamiento de las muestras para microscopía
electrónica y en las tareas generales del laboratorio, así como también a
Malgorzata Ciska excelente becaria de doctorado incorporada también al
proyecto de proteínas estructurales del núcleoesqueleto en plantas.
Un agradecimiento fraternal a Sara González Camacho, compañera de los
cursos del doctorado por sus sugerencias y experiencias compartidas durante el
desarrollo experimental de la tesis.
A todos los integrantes del Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC
por todos los recursos puestos a la disposición para la realización de este trabajo
de tesis. Especialmente al personal de servicios, estudiantes e investigadores que
gentilmente contestaron a mis solicitudes a través de la intranet del CIB. A los
servicios de Microscopía Confocal (Mª Teresa Domínguez S.), Microscopía
Electrónica, Proteómica (Francisco García T. y Mª Iluminada Fernández),
Biblioteca (Olvido Partearroyo L. y Nieves Fonturbel C.) e Informática (Mario
García L. y Ramón Toro M.).
Í N D I C E
Página
ABREVIATURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
RESUMEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
ABSTRACT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
INTRODUCCIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1. ORGANIZACIÓN NUCLEAR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14
2. NÚCLEOESQUELETO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17
2.1. Lámina nuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18
2.1.1 Laminas períféricas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.1.2. Proteínas de unión a laminas (LBPs) periféricas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2. Endoesqueleto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25
2.2.1. Laminas intranucleares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27
2.2.2. Proteínas del endoesqueleto implicadas en la mitosis y ensamblaje nuclear . . . . 27
2.2.3. Actina nuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
2.2.4. Espectrinas nucleares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32
3. NÚCLEOESQUETO EN PLANTAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
3.1. Organización y componentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33
3.2. Lámina nuclear y proteínas específicas de plantas similares a las laminas y a
filamentos intermedios (FIs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.3. Actina nuclear en plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39
4. PROTEÍNAS COILED-COIL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
4.1. Estructura y función . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
4.2. Proteínas coiled-coil del NSK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43
4.3. Proteínas coiled-coil del NSK de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44
4.3.1. Proteínas similares a FIs específicas de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.3.2. Proteínas similares a laminas específicas de plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45
4.3.3. Proteínas tipo filamentos intermedios nucleares (NIFs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
5. FAMILIA DE PROTEÍNAS ESPECTRINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
5.1. Estructura y función . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46
5.2. Espectrinas nucleares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
5.3. Espectrina en plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51
5.3.1. Proteínas vegetales inmunológicamente relacionadas con espectrina . . . . . . . . . 51
5.3.2. Proteínas nucleares semejantes a espectrina en plantas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53
OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
MATERIAL Y MÉTODOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
I. Material . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
1. Material biológico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
1.1. Métodos de cultivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .57
1.1.1. Cultivo de bulbos de Allium cepa L. var. francesa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
1.1.2. Germinación de semillas de Pisum sativum L. var. dédicace . . . . . . . . . . . . . . . . .57
1.2. Anticuerpos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
II. Métodos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58
1. Recolección de meristemos apicales radiculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .58
2. Obtención y purificación de núcleos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
3. Extracción de matrices nucleares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .59
4. Análisis de proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60
4.1. Preparación de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .60
4.2. Cuantificación de la concentración de proteínas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4.3. Electroforesis monodimensional en geles de poliacrilamida y dodecil sulfato
sódico (SDS-PAGE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
4.4. Lisis nuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .62
4.5. Electroforesis bidimensional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
4.6. Inmunodetección en membrana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .63
4.7. Inmunoprecipitación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .65
4.8. Identificación de proteínas mediante mapeo de masas peptídicas por
espectrometría de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
5. Inmunodetección in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
5.1. Inmunofluorescencia indirecta para microscopia confocal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .67
5.2. Inmunomarcado indirecto con oro para microscopía electrónica . . . . . . . . . . . . . . . .69
RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
1. Detección y caracterización de las proteínas semejantes a espectrina en el
núcleo y NSK de Allium cepa L. var. francesa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .71
1.1. Proteínas reconocidas por los anticuerpos S1390 y 1622 en núcleos de
Allium cepa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
1.1.1. Análisis mediante inmunodetección en membrana de geles
mono-dimensionales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72
1.1.2. Análisis de las proteínas nucleares inmunoprecipitadas con el anticuerpo
S1390 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
1.1.3. Análisis mediante inmunodetección en membrana de geles bidimensionales . . . .75
1.2. Localización topológica de las proteínas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .77
1.2.1. Análisis mediante inmunofluorescencia confocal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
1.2.2. Localización mediante microscopía electrónica con inmunomarcado con oro . . . .79
1.3. Asociación de las proteínas reconocidas por los anticuerpos S1390 y 1622
con el núcleoesqueleto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .80
1.3.1. Análisis mediante extracción diferencial e inmunodetección en membrana . . . . . .80
1.3.2. Localización topológica mediante inmunofluorescencia confocal e
inmunomarcado con oro para microscopía electrónica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
1.4. Análisis de las secuencias de péptidos de la proteína de 60 kDa mediante
espectroscopía de masas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .83
1.5. Asociación de las proteínas nucleares semejantes a espectrina con la actina
nuclear . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
1.5.1. Co-inmunoprecipitación de las proteínas nucleares semejantes a espectrina
y actina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .85
1.5.2. Co-localización mediante inmunofluorescencia confocal de las proteínas
nucleares semejantes a espectrina y actina en el núcleo y en el NSK . . . . . . . . . . . . . . .86
2. Detección y caracterización de los filamentos intermedios nucleares (NIFs)
en el núcleo y NSK de Allium cepa L. var. francesa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
2.1. Proteínas reconocidas por los anticuerpos PL1, PL3 y PL4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
2.1.1. Análisis mediante inmunodetección en membrana de geles
mono-dimensionales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
2.1.2. Análisis mediante inmunodetección en membrana de geles bidimensionales. . . . 89
2.2. Localización topológica de la proteína de 65 kDa de tipo NIF . . . . . . . . . . . . . . . . . .90
2.2.1. Análisis mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal . . . . . . . . . . . . . .90
2.2.2. Análisis mediante microscopía electrónica con inmunomarcado con oro . . . . . . . .92
2.3. Asociación de la proteína de p65 NIF con el NSK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .93
2.3.1 Análisis mediante extracción secuencial e inmunodetección en membrana . . . . . .93
2.3.2. Análisis mediante inmunofluorescencia confocal e inmunomarcado con oro
para microscopía electrónica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
2.4. Asociación de la proteína p65 NIF con proteínas estructurales del NSK . . . . . . . . . 96
DISCUSIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
1. Caracterización de proteínas semejantes a espectrina en el núcleo de
Allium cepa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
1.1. Proteínas semejantes a espectrina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
1.2. Distribución intranuclear de las proteínas semejantes a espectrina . . . . . . . . . . . . 104
1.3. Asociación de las proteínas semejantes a espectrina con el NSK de células
meristemáticas de Allium cepa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .106
1.4. Asociación de las proteínas similares a espectrina con actina en el núcleo de
Allium cepa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
2. Filamentos intermedios nucleares (NIFs) en el núcleo y NSK de plantas . . . . . .109
2.1. Caracterización de proteínas de tipo NIF en el núcleo de Allium cepa . . . . . . . . . . 111
2.2. p65 NIF es un componente estructural del NSK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
2.3. Asociación de p65 NIF con proteínas semejantes a espectrina constituyentes
del NSK de Allium cepa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
2.4. Comparación de las proteínas de tipo NIF y proteínas semejantes a las
laminas en Allium cepa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .115
CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .119
BIBLIOGRAFÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
Abreviaturas
1
ABREVIATURAS
ABPs (Actin Binding Proteins): proteínas de unión a actina ac: anticuerpo ADF (Actin Depolimerization Factor): Factor de despolimerización de actina ADN: Acido DesoxirriboNucleico ARN: Ácido RiboNucleico ARNm: ARN mensajero ARPs (Actin Related Proteins): proteínas relacionadas con actina BAF (Barrier-to-Autointegration Factor): factor barrera contra autointegración BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): herramienta de búsqueda de
alineamiento local básico Bpag 1 (Bullous penphigoid antigen 1): antígeno Bullous penphigoid 1 CB: Cuerpo de Cajal Ce-lamina: lamina de Caenorhabditis elegans CH (Calponin Homology): homología tipo calponina CK2 (Casein Kinase II): caseína kinasa II CDK1 (Cyclin-Dependent Kinase 1): kinasa 1 dependiente de ciclina cm: centímetro CP60 (Centrosomal Protein 60): proteína centrosómica 60 CSK (Cytoskeleton): citoesqueleto DAPI: 4’ 6-diamino-2-fenilindol DEPEC: Dietil-pirocarbonato DIC (Differential Interference Contrast): contraste interferencial diferencial 2D-PAGE (Bi-Dimensional PoliAcrilamide Gel Electrophoresis): electroforesis
bidimensional en gel de poliacrilamida DTT: Ditiotreitol E: Eritrocito EDTA: Ácido etilendiamino tetracético EN: Envoltura Nuclear FIs: Filamentos Intermedios FPPs (Filament-like Plant Proteins): proteínas de plantas semejantes a filamentos g: gramo h: hora hnRNP (heterogeneus nuclear RiboNucleoProtein): ribonucleoproteína
heterogénea nuclear HP1 (Heterochromatin Protein1): proteína 1 de la heterocromatina I: Intensidad de fluorescencia IEF: Isoelectroenfoque IP: Inmunoprecipitación kV: kiloVoltio kDa: kiloDalton KPa: Kilopascal LAPs (Lamin Asociated Proteins): proteínas asociadas a laminas LAP1 (Lamin Associated Peptid 1): péptido 1 asociado a lamina LAP2 (Lamin Associated Peptid 2): péptido 2 asociado a lamina LBPs (Lamin Binding Proteins): proteínas de unión a laminas LBR (Lamin B Receptor): receptor de la lamina B LINC1 (Little Nuclei 1): núcleo pequeño 1
Abreviaturas
2
LINC (Linker Nucleoskeleton and Cytoskeleton): conector del núcleoesqueleto y citoesqueleto
LINT-25 (LAP2α Interactor-25): proteína 25 de interacción con LAP2 M: Molar MAF1 (MFP-Associated Factor1): factor 1 asociado a MFP MAN: Medio de Aislamiento de Núcleos MAPs (Microtubule Associated Proteins): proteínas asociadas a microtúbulos MARs (Matrix Attachment Regions): regiones de unión a la matriz MACF (Microtubule Actin Crosslinking Factor): factor de entrecruzamiento actina-microtúbulo MC: Microscopía Confocal McCAP (McCDPK Adapter Protein 1): proteína 1 adaptadora de la proteína kinasa
dependiente de calcio de Mesembryanthemum crystallinum ME: Microscopía Electrónica de transmisión MFP1 (MAR Binding Filament-like Protein 1); proteína 1 semejante a filamento de unión a MAR
g: microgramo min: minuto
m: micrómetro mm: milímetro mM: miliMolar MN: Matriz Nuclear MNE: Membrana Nuclear Externa MNI: Membrana Nuclear Interna MTs: Microtúbulos MTOCs (Microtubule Organizating Centers): Centros Organizadores de los Microtúbulos Mtor: Megator m/z: masa/carga N: Núcleos NET (Nuclear Envelope Transmembrane): transmembra de la envoltura nuclear NIFs (Nuclear Intermediate Filaments): filamentos intermedios nucleares nL: nanolitros NLS (Nuclear Localizing Signal): señal de localización nuclear nm: nanómetro NMI (Nuclear Myosin 1): miosina 1 nuclear NMCP1 (Nuclear Matrix Constituent Protein1): proteína 1 constituyente de la
matriz nuclear MS (Mass Spectrometry): espectometría de masas NSK (Nucleoskeleton): núcleoesqueleto NUANCE (NUcleus and ActiN Connecting Element): elemento conector de actina
y núcleo NuMA (Nuclear Mitotic Apparatus Protein): proteína nuclear y del aparato mitótico PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen): antígeno nuclear de proliferación celular PAGE (Poliacrilamide Gel Electrophoresis): electroforesis en gel de poliacrilamida PBS (Phosphate-Buffered Saline): tampón fosfato salino PBS-T: PBS suplementado con Tween-20 pH: potencial de Hidrógeno pI: punto isoeléctrico
Abreviaturas
3
PFA: Paraformaldehído PNC: Poro Nuclear Complejo PML (Promyelocitic Leukaemia): leucemia promielocítica PMSF: Fluoruro de fenil metil sulfonilo pRb: proteína Retinoblastoma rpm: revoluciones por minuto RP-HPLC (Reversed Phase High-Performance Liquid Chromatography): cromatografía líquida de alta resolución de fase reversa S: segundo SDS: Dodecil Sulfato de Sodio SH: Solución de heparina SLH: Solución de lisis hipotónica SMC (Structural Mantaining Chromosome): mantenimiento estructural del cromosoma snRNP (small nuclear RiboNucleoProtein): ribonucloproteína nuclear pequeña snoRNP (small nucleolar RiboNucleoProtein): ribonucleoproteína nucleolar
pequeña
SPBs (Spindle Pole Bodies): cuerpos polares del huso SpR (Spectrin Repeat): repetición de espectrina TC: Tampón de Citoesqueleto TCE: Tampón de corrimiento electroforético TCA: Ácido Tricloro Acético TCP: Tampón para Cuantificación de Proteínas TD: Tampón de Digestión
TE: Tampón de Equilibrio TL: Tampón de Lisis TM: Tampón de muestra Tris: Hidroximetil-aminometano Trp (Transient receptor protein): proteína de la familia de receptores potenciales transitorios TRP TT: tampón de transferencia
-TuRC (γ-Tubulin Ring Complexes): complejos del anillo de -tubulina v/v: volumen/volumen V: Voltio
Abreviaturas
4
Resumen
5
RESUMEN
Las proteínas de tipo coiled coil son los componentes mayoritarios del
núcleoesqueleto (NSK) de metazoos cuya principal familia son las laminas. Las
plantas carecen de ortólogos de los genes que codifican para estas proteínas
aunque tienen proteínas que son reconocidas por anticuerpos contra ellas,
demostrando la conservación de epítopos. Esto nos llevó a formular la hipótesis
de que las plantas podrían tener proteínas estructurales del NSK específicas con
dominios conservados con las proteínas animales pero con similitud de secuencia
muy baja, que constituirían homólogos funcionales de las mismas. El objetivo de
esta Tesis Doctoral era investigar las proteínas estructurales de tipo coiled coil en
el NSK de células meristemáticas de la planta monocotiledónea Allium cepa, un
sistema en el que se conocen abundantes datos sobre su NSK. Se han analizado
dos tipos de proteínas con estructura coiled-coil: espectrinas y filamentos
intermedios nucleares (NIFs).
Las plantas carecen de ortólogos claros de las proteínas de la superfamilia
de espectrina pero tienen secuencias que podrían ser homólogos funcionales, así
como proteínas que son reconocidas por los anticuerpos antiespectrinas. En este
trabajo hemos utilizado anticuerpos contra las cadenas α y β de espectrina
eritrocítica de pollo y espectrina no eritrocítica de mamíferos que han
demostrado la presencia de proteínas inmunológicamente relacionadas con ellas
en el núcleo de Allium cepa y han permitido su caracterización. El análisis
inmunoquímico ha revelado dos bandas con movilidad electroforética semejante a
las espectrinas α y β (240 y 220 kDa), aunque la más abundante es una banda de
60 kDa con varias formas isoeléctricas con valores entre 5,1 y 5,7 de pI, así como
bandas intermedias que corresponden probablemente a productos de
degradación proteolítica. Los resultados de inmunofluorescencia e
inmunomarcado con oro para ME demostraron una distribución de las proteínas
en diferentes dominios nucleares: envoltura nuclear, retículo intercromatínico y
pericromatínico, nucleolo y focos nucleares, sugiriendo su implicación en diversas
funciones nucleares. La extracción secuencial de los núcleos ha demostrado que
Resumen
6
estas proteínas son componentes estructurales del NSK subyacente. Mediante
inmunoprecipitación hemos revelado la asociación de las proteínas semejantes a
espectrina nucleares con actina, demostrando que son proteínas de unión a
actina (ABPs) nucleares estructurales en este sistema. Los datos de co-
localización mediante inmunofluorescencia confirman que esta asociación ocurre
también in situ en el retículo intranuclear y en focos nucleares. El análisis
preliminar de secuencias de péptidos de la banda de 60 kDa mediante
espectrometría de masas no ha revelado similitud alta con ninguna de las
proteínas de la familia de la espectrina aunque mostró similaridad baja con la
nesprina-1 humana, una proteína del NSK que contiene repeticiones de
espectrina.
Aunque las plantas carecen de genes para las proteínas de tipo filamentos
intermedios incluídas las laminas, poseen proteínas inmunológicamente
relacionadas con ellos. Los NIFs son proteínas nucleares específicas de plantas
descritas en Pisum sativum que presentan reacción cruzada con el anticuerpo
general contra filamentos intermedios IFA y varios anti-laminas, y se ha propuesto
que podrían realizar el papel funcional de las laminas en plantas. El objetivo de
nuestro estudio era investigar la conservación y características de las NIFs en la
monocotiledónea Allium cepa y compararlas con las proteínas semejantes a
laminas descritas previamente en esta especie. Para ello hemos utilizado varios
anticuerpos contra una de las NIFs de Pisum sativum (p65). Todos ellos
reconocen un doblete de 65-60 kDa en el núcleo de Allium cepa. Mediante
inmunodetección en membranas bidimensionales se resolvieron claramente dos
manchas de 65 kDa con pI 5,4 y 5,6 y otras dos de 60 kDa con pIs menos
acídicos de 6,5 y 6,6. Los resultados de inmunofluorescencia e inmunomarcado
con oro para ME han demostrado la localización de las proteínas en la envoltura
nuclear y una delicada red intranuclear coincidente con los dominios
pericromatínicos. La extracción secuencial de los núcleos demostró que las
proteínas forman parte del NSK. Los datos de movilidad electroforética, pI,
distribución nuclear y asociación al NSK son similares a los de algunas de las
proteínas previamente descritas como laminas en Allium cepa y sugieren que
podría tratarse de las mismas proteínas.
Resumen
7
Hemos demostrado mediante co-inmunoprecipitación y co-localización que
los dos tipos de proteínas estructurales analizadas, las proteínas semejantes a
espectrina y NIFs, interaccionan y co-localizan en una red intranuclear y en focos
nucleares, demostrando que ambos componentes están asociados en el complejo
multiproteico del endoesqueleto.
Resumen
8
Abstract
9
ABSTRACT
Coiled coil proteins are major components of the nucleoskeleton (NSK) in
metazoan whose main family is that of lamins. Plant lack orthologs of the genes
coding for these proteins although they have proteins that cross react with them,
demonstrating the conservation of epitopes. These facts led us to formulate the
hypothesis that plants could have specific nucleoskeletal structural proteins having
conserved domains with the corresponding animal proteins but very low sequence
similarity that would constitute functional homologs of them. The goal of this
doctoral Thesis was to investigate the structural coiled coil proteins of the NSK of
meristematic cells of the monocot plant Allium cepa, a system with abundant
information about its NSK. We have analyzed two different types of coiled coil
proteins: spectrins and Nuclear Intermediate Filaments (NIFs).
Plants lack clear orthologs of the proteins of the spectrin superfamily but
have sequences that could be functional homologs and also proteins recognized
by the anti-spectrin antibodies. In this work we used antibodies against the α and β
chains of chicken erythroid and mammalian non erythroid cells that have
demonstrated the presence of related proteins in the nucleus of Allium cepa and
have allowed their characterization. The immunochemical analysis has revealed
two bands with similar electrophoretic mobility to α and β spectrins (240 and 220
kDa) although the most abundant is a 60 kDa band with several isoelectric forms
between 5,1 and 5,7 pI values, as well as intermediate bands that probably
correspond to products of proteolytic degradation. The results of
immunofluorescence and immunogold EM demonstrated a distribution of the
proteins in different nuclear domains: nuclear envelope, interchromatin and
perichromatin networks, nucleolus and nuclear foci, suggesting their implication in
different nuclear functions. Sequential extraction of nuclei has demonstrated that
these proteins are structural components of the underlying NSK. Co-
immunoprecipitation analysis revealed the association of the nuclear spectrin-like
proteins with actin demonstrating that they are nuclear structural Actin Binding
Proteins (ABPs) in this system. Immunofluorescent co-localization confirms that
Abstract
10
the proteins also associate in situ in the intranuclear network and nuclear foci.
Preliminary peptide sequence analysis of the 60 kDa band by mass spectroscopy
does not revealed high sequence similarity with the proteins of the spectrin
superfamily although it shows low similarity with human nesprin-1, a
nucleoskeletal protein containing spectrin repeats belonging to this family.
Although plants lack genes for intermediate filament proteins including
lamins, they have proteins cross-reacting with them. Nuclear intermediate
filaments are plant specific nuclear proteins described in Pisum sativum that cross
react with the general antibody against intermediate filament proteins IFA and with
several anti-lamin antibodies that have been proposed as candidates to play the
functional role of lamins in plants. The goal of our study was to investigate the
conservation and features of NIFs in the monocot Allium cepa and to compare
them with the lamin-like proteins previously described in this species. For this we
used several antibodies against one of the Pisum sativum NIFs (p65). All of them
recognized a doublet at 65-60 kDa in Allium cepa nuclei. Bi-dimensional western
blot analysis resolved two spots at 65 kDa with pI of 5,4 and 5,6 and other two at
60 kDa with pI of 6,5 and 6,6. The immunofluorescence and immunogold EM
results revealed the localization of the proteins in the nuclear envelope and a
delicate intranuclear network corresponding with the perichromatin domains.
Sequential extraction of nuclei demonstrated that NFIs are a part of the NSK. The
features of the characterized NIF such as electrophoretic mobility, pI, nuclear
distribution and association with the NSK are similar to those of some of the
proteins previously described as lamins in Allium cepa what suggest that they
could correspond to the same proteins.
By co-immunoprecipitation and co-localization we have evidenced that the
two types of proteins analyzed, spectrin-like proteins and NIFs, interact and co-
localize in an intranuclear network and in nuclear foci, demonstrating that both
components are associated in the multiprotein complex forming the NSK.
Introducción
11
INTRODUCCIÓN
El núcleo es el orgánulo en donde se llevan a cabo un gran número de
procesos fundamentales tales como la organización y replicación de los
cromosomas; la regulación de la expresión genética; y la integración de las
múltiples actividades requeridas para el funcionamiento celular. En organismos
eucariotas consiste en un ambiente tridimensional heterogéneo rodeado por una
membrana nuclear compleja. Estructuralmente está organizado en
compartimentos y dominios funcionales con organización y composición proteica
propia. Su arquitectura tridimensional está determinada no solo por los dominios
subnucleares como el nucleolo, regiones intercromatínicas, territorios
cromosómicos y envoltura nuclear (EN), sino también por dominios de menor
tamaño tales como, las factorías de transcripción, replicación y reparación del
ADN, que se forman en respuesta a funciones específicas (Lenser et al., 2010).
La naturaleza estable y dinámica de sus dominios funcionales está determinada
por una plataforma estructural basal dinámica, llamada núcleoesqueleto (NSK) o
matriz nuclear (MN). El NSK está formado por una red intrincada de filamentos
estructurales que interaccionan entre sí y sobre los cuales se organizan los
compartimentos y se coordinan espacialmente los factores y componentes de los
procesos nucleares esenciales como la replicación del ADN, transcripción y
procesamiento del ARN, remodelación de la cromatina, transporte nuclear, y
señalización (Nickerson, 2001; Berezney, 2002; Elcock y Bridger, 2008; Nakka y
Chattopadhyay, 2010).
El NSK contiene una lámina nuclear periférica y un endoesqueleto que
están compuestos principalmente por las laminas A, B y C. Las laminas son
proteínas pertenecientes a la familia de los filamentos intermedios (FIs) que son
los principales elementos del citoesqueleto (CSK) de las células de metazoos. Se
caracterizan por presentar un dominio varilla central -hélice que contiene
repeticiones de siete residuos de aminóacidos hidrofóbicos y polares, típicas de
las estructuras coiled-coil e implicadas en la formación de homo y
heteropolímeros (Stuurman et al. 1998; Kim y Coulombe, 2007; Golberg el al.,
2008; Dechat et al., 2008; Parnaick, 2008; Ben-Harush et al., 2009; Prokocimer et
Introducción
12
al., 2009; Dechat et al., 2010a; Rackham, et al., 2010). Las laminas proveen
estabilidad mecánica; regulan la forma del núcleo y el posicionamiento y
organización de la cromatina; y están implicadas en la replicación, reparación y
transcripción de los genes, y en señalización (Gruenbaum et al., 2000; Goldman
et al., 2002; Shumaker et al., 2003; Hutchinson y Worman, 2004; Gruenbaum et
al., 2005; Mattout et al., 2006; Dechat et al., 2008; Golberg et al., 2008; Parnick,
2008; Shimi et al., 2008; Chen et al., 2009; Dauer y Worman, 2009; Worman et
al., 2009; Andrés y González, 2009; Prokocimer et al., 2009; Dechat et al., 2010a).
Otras proteínas que forman parte de la lámina nuclear son proteínas integrales de
la membrana nuclear interna (MNI) que se unen con las laminas y las unen con la
EN como el receptor de la lamina B (LBR), el péptido 2 asociado a laminas
(LAP2), emerina y MAN1, así como las proteínas con dominios SUN que se unen
a las nesprinas de la membrana nuclear externa (MNE) para conectar las laminas
al CSK. En el interior del núcleo existen otros adaptadores para que las laminas
interaccionen indirectamente con otros componentes y regulen la organización de
la cromatina y otros procesos (Östlund y Worman, 2004; Wilson y Foisner, 2010).
Otras proteínas estructurales del NSK como la actina, espectrina, titina,
nesprina, proteínas con dominios SUN (Sad1p and UNC-84) o KASH (Klarsicht,
ANC-1 and Syne/Nesprin homology) que unen el NSK con el CSK; proteína 4.1;
NuMA (Nuclear Mitotic Apparatus); EAST (Enhanced Adult Sensory threshold);
Megator (Mtor); Esqueletor y Chromator están localizadas en subdominios
funcionales específicos en la envoltura o en el interior nuclear e interaccionan
estable o dinámicamente con diversas proteínas, confiriendo al NSK diversidad
funcional, resiliencia mecánica y conexión con el CSK (Nickerson, 2001;
Berezney, 2002; Gieni y Hendzel, 2009; Graumann et al., 2010b).
Los genes de las laminas han sido identificados en metazoos, pero están
ausentes en el genoma de plantas y organismos unicelulares (Meier, 2007; Melcer
et al., 2007). Asimismo, las plantas carecen de homólogos de las principales
proteínas de unión con laminas de animales (LBR, LAP2, emerina, MAN1) (Mans
et al., 2004; Meier, 2007; Wilson y Berk, 2010; Kubben et al., 2010). Pero esto no
significa que las plantas carezcan de las funciones que realizan tanto las laminas
como sus proteínas asociadas, que son funciones esenciales que están presentes
y son similares en vertebrados y en plantas.
Introducción
13
En plantas, la composición del proteoma del NSK y de sus complejos
proteicos asociados es poco conocida (Moreno Díaz de la Espina, 2009).
Las plantas tienen una lámina nuclear similar a la de vertebrados, que ha
sido revelada mediante microscopia electrónica (ME) convencional (Moreno Díaz
de la Espina et al., 1991; Moreno Díaz de la Espina, 1995; Moreno Díaz de la
Espina, 2009) y de emisión de campo (Fiserova et al., 2010). Además el uso de
anticuerpos anti-lamina ha demostrado la existencia de proteínas
inmunológicamente relacionadas con laminas en varias especies de plantas (Li y
Roux, 1992; McNulty y Saunders, 1992; Mínguez y Moreno Díaz de la Espina,
1993; Moreno Díaz de la Espina, 1995; Blumenthal et al., 2004). Estas proteínas
podrían ser homólogos funcionales de las laminas (Moreno Díaz de la Espina,
2009). Se ha demostrado que las células BY2 de tabaco transformadas con el
LBR de mamíferos son capaces de usar la secuencia N-terminal de LBR para
dirigir la proteína a la EN, de la misma forma que el patrón de localización celular
animal. Además algunas proteínas se asocian débilmente a ella, demostrando la
conservación del mecanismo de translocación de LBR de células animales en
plantas (Irons et al., 2003; Graumann et al., 2007).
Arabidopsis contiene proteínas con similaridad moderada con las
secuencias del dominio varilla -hélice de las laminas (Meier, 2007), que podrían
tener conservadas las funciones esenciales de las laminas. También, se ha
especulado que otras proteínas específicas del NSK de plantas pueden ser
homólogos funcionales de las laminas, como la proteína MFP1 de unión a MARs
(Meier et al., 1996; Guindullis et al., 1999; Guindullis y Meier, 1999); las proteínas
constituyente de la matriz nuclear 1 (NMCP1: Nuclear Matrix Constituent Protein
1) (Masuda et al., 1997; Dittmer et al., 2007; Dittmer y Richard, 2008; Kimura et
al., 2010) y los filamentos intermedios nucleares (NIFs) (Blumenthal et al., 2004).
En este trabajo identificamos y caracterizamos parcialmente dos proteínas
estructurales en núcleos y NSK de células del meristemo radical de la planta
monocotiledónea Allium cepa L. var. francesa: las proteínas NIF (nuclear
intermediate filament) y espectrina.
Introducción
14
1. ORGANIZACIÓN NUCLEAR
El núcleo de células eucariotas esta consitituído por los compartimentos
principales: cromatina, complejos intranucleares no enlazados a la membrana y la
EN (Schneider y Grosschedl, 2007; Verstraeten et al., 2007). La EN esta
constituida por la MNI, MNE, PNCs y la lámina nuclear (Dechat et al., 2009). El
interior del núcleo está estructuralmente organizado en dominios funcionales con
organización y composición proteica propia llamados cuerpos nucleares que son
esenciales para almacenar, propagar, mantener, y expresar el material genético,
mediante procesos tales como la compactación, descompactación, segregación,
replicación y reparación del ADN, y transcripción y procesamiento del ARN (Albiez
et al., 2006; Trinkle-Mulcahy y Lamond, 2008; Geyer et al., 2011).
La biogénesis y mantenimiento de los cuerpos nucleares se desconoce,
aunque recientes estudios han determinado que los ARN nacientes juegan un
papel importante para el reclutamiento de las proteínas de los cuerpos nucleares,
funcionando como una plataforma estructural transitoria (Carmo-Fonseca y Rino,
2011; Shevtsov y Dundr, 2011). El nucleolo es el cuerpo nuclear más prominente
y se organiza alrededor de las regiones de cromatina que contienen genes
ribosomales (Carmo-Fonseca et al., 2000; Raska, 2006); similarmente el cuerpo
de histonas se ensambla alrededor de los genes activos de histonas (Marzluff et
al., 2008). Los paraspeckles que están implicados en el almacenamiento de
ARNm hipereditado (Clemson et al., 2009; Fox, 2010) y los cuerpos de estrés
nuclear (Valgardsdottir et al., 2008) dependen de RNA no codificante para su
integridad.
Otros cuerpos nucleares son los cuerpos de Cajal (CB) (Morris, 2008);
speckles; cuerpos PML (Lallemand-Breitenbach y De Thé, 2010); cuerpos
nucleares huérfanos (Heun, 2007; Carmo-Fonseca, 2010); compartimento
perinucleolar (Pollock, 2009); y complejos de multiproteínas, como factorías de
replicación, transcripción, y PNCs (Spector, 2006; Zhao et al., 2009; Wente y
Rout, 2010; Onischenko y Weis, 2011).
En el núcleo los cromosomas individuales ocupan distintos territorios.
Durante la interfase la cromatina formada por ADN, histonas, proteínas no
Introducción
15
histónicas y ARN presenta diferentes órdenes de empaquetamiento y
organización: la heterocromatina (orden superior de empaquetamiento)
frecuentemente localizada en focos nucleoplasmáticos, en la periferia nuclear y
alrededor del nucleolo, y la eucromatina (orden menor de empaquetamiento)
localizada mayoritariamente en focos dispersos nucleoplasmáticos, coincidiendo
Figura 1. Diagrama de la organización de los dominios nucleares en plantas
Los componentes de la envoltura nuclear incluyen: membrana nuclear interna y externa (periferia punteada),
poros nucleares complejos (cilindros siena) y la lámina nuclear (periferia gris).
El nucleolo presenta los tres componentes típicos: centros fibrilares (círculos blancos), rodeados por el
componente fibrilar denso (masas con gránulos gris obscuro) y el componente granular (fondo granular gris
bajo) conteniendo partículas pre-ribosomales; y la cavidad nucleolar (laguna blanca).
El interior del núcleo está organizado en territorios cromosómicos (lagunas azules) que incluyen las zonas de
heterocromatina (azul oscuro) y de cromatina descondensada o eucromatina (azul claro) circundantes. Estas
últimas solapan con los dominios intercromosómicos (fondo azul claro) en los que se localizan los
componentes del núcleoesqueleto (ramificaciones grises del fondo). La red de ribonucleoproteínas no
nucleolares está representada por los gránulos pericromatínicos (círculos rojos) ubicados en la periferia de la
heterocromatina y por gránulos intercromatínicos (círculos negros) asociados con la red fibrilar intranuclear o
matriz nuclear interna del núcleoesqueleto. Otros dominios nucleares son los cuerpos de Cajal (círculos
verdes) y los speckles (círculos amarillos) conteniendo factores del procesamiento del ARN.
Figura basada en: Moreno-Díaz de la Espina, S. (1995). "Nuclear matrix isolated from plants cells." Int. Rev. Cytol. 162B: 75-139; Shaw, P. J., y Brown, J. W. S. (2004). "Plant nuclear bodies." Curr. Opin. Plant Biol. 7: 614-620.
Introducción
16
con los sitios de transcripción activa. Aunque, ciertos loci de genes localizados
dentro de regiones de heterocromatina pueden transcribir activamente, y loci de
genes localizados dentro de regiones de eucromatina pueden permanecer
silenciados (Albiez et al., 2006, Trinkle-Mulcahy y Lamond, 2008; Geyer et al.,
2011).
En plantas se ha explorado la composición de algunos cuerpos nucleares
(Figuras 1 y 5A) como el nucleolo (Beven et al., 1996; Shaw, et al., 1998; Brown y
Shaw, 1998; Sáez-Vásquez y Medina, 2008; Shaw, 2010), los cuerpos de Cajal
(Beven et al., 1995; Boudonck et al., 1998 y 1999; Acevedo et al., 2002; Cui y
Figura 2. Diagrama del núcleoesqueleto (NSK) o matriz nuclear de plantas, representando sus
principales componentes estructurales
La matriz nuclear está compuesta por la lámina nuclear (periferia gris), poros nucleares residuales (cilindros
siena), la red fibrilar de la matriz interna (red ramificada negra) con gránulos intercromatínicos asociados
(puntos negros), cuerpos de Cajal (círculos verdes) y la matriz nucleolar formada por la red fibrilar (fondo
blanco central) y los centros fibrilares (círculos blancos).
Figura basada en: Moreno Díaz de la Espina, S. (1995). "Nuclear matrix isolated from plants cells." Int. Rev. Cytol. 162B: 75-139.
Introducción
17
Moreno Díaz de la Espina, 2003; Shaw y Brown, 2004; Collier et al., 2006),
gránulos intercromatínicos (Medina et al., 1989; Moreno Díaz de la Espina et al.,
1993), la EN (Meier y Brkljacica, 2010; Graumann y Evans, 2011) y el NSK
(Moreno Díaz de la Espina, 2005 y 2009) (Figura 2).
2. NÚCLEOESQUELETO (NSK)
El NSK es una plataforma estructural dinámica sobre la cual se organizan
los compartimentos y se coordinan espacialmente los factores y componentes del
núcleo. El NSK forma la lámina nuclear periférica, pero también se extiende por
todo el interior del núcleo formando el NSK interno o endoesqueleto. Los
componentes del NSK asocian asas del ADN con los sitios en donde se
encuentran asociados los complejos macromoleculares implicados en la
regulación de la replicación del ADN, transcripción y procesamiento del ARN,
remodelación de la cromatina, transporte nuclear, señalización, formación de
elementos estructurales, asociaciones virales, etc. (Nickerson, 2001; Berezney,
2002; Shumaker et al., 2003; Elcock y Bridger, 2008; Moreno Díaz de la Espina,
2009; Nakka y Chattopadhyay, 2010). Las proteínas del NSK se organizan en
dominios estructurales y funcionales de asociación con la cromatina y
ribonucleoproteínas formando focos de replicación, transcripción, cuerpos de
Cajal, PML y spleckes (Nakka y Chattopadhyay, 2010).
El NSK interno in situ, está formado por una estructura fibrogranular
localizada en las regiones intercromatínicas (Nickerson, 2001; Barboro et al.,
2003). El NSK aislado contiene del 20 al 25 % de las proteínas totales del núcleo
y además ADN y ARN fuertemente unidos. El NSK constituye la fracción de
proteínas insolubles no histónicas aisladas después de la extracción del núcleo
con detergente y sal para la eliminación de los lípidos y de las proteínas solubles
(Moreno Díaz de la Espina, 1995 y 2009; Kubben et al., 2010).
EL NSK presenta una arquitectura similar en mamíferos y plantas (Figura 2
y 5B) (Shumaker et al., 2003; Moreno Díaz de la Espina, 2009), y conserva los
dominios principales del núcleo original. Los términos, NKS, MN y plataforma
nuclear se refieren a la misma red intranuclear sin cromatina observada en células
Introducción
18
fijadas, núcleos residuales extraídos y también in vivo (Moreno Díaz de la Espina,
1995; Nickerson, 2001; Barboro et al., 2003).
2.1. Lámina nuclear
La lámina nuclear es una red compleja de filamentos ortogonales que
miden aproximadamente 10 nm (Stuurman et al., 1998; Golberg el al., 2008;
Dechat et al., 2008; Parnaick 2008; Prokocimer et al., 2009; Ben-Harush et al.,
2009; Dechat et al., 2010a). Está localizada subyacente a la MNI, asociada con
los PNCs y cromatina, y se despolimeriza durante la mitosis en respuesta a
señales de fosforilación (Parnaick, 2008). Está implicada en un amplio rango de
funciones nucleares incluyendo el anclaje de la cromatina a la EN; ensamblaje,
estabilidad mecánica y elasticidad de la EN; organización de la cromatina;
replicación y reparación del ADN; regulación transcripcional; regulación del ciclo
celular; diferenciación y desarrollo celular; migración nuclear, y apoptosis
(Goldman et al., 2002; Holaska et al., 2002; Berezney, 2002; Chubb y Bickmore,
2003; Gruenbaum et al., 2003 y 2005; Spector y Gasser, 2003; Parnick, 2008;
Deniaud y Bickmore, 2009; Zaho et al., 2009, Towbin et al., 2009; Worman et al.,
2009; Kubben et al., 2010; Malik et al., 2010). La lámina provee sitios de anclaje
en la periferia nuclear, esenciales para la arquitectura e integridad nuclear (Cohen
et al., 2008).
La lámina está constituida mayoritariamente por FIs del tipo laminas, éstas
limitan el lado interno de la membrana nuclear en donde proveen una estructura
para la unión de proteínas y cromatina y estabilidad mecánica (Dittmer y Misteli,
2011). También forman la lámina proteínas asociadas a las laminas (LBPs)
(Östlund y Worman, 2004) que incluyen: 1) proteínas integrales de la MNI como el
LBR, LAPs (LAP1 y LAP2), emerina, MAN1 y proteínas SUN que se unen con
laminas y mediante su dominio SUN se asocian con proteínas de la MNE que
contienen dominios KASH como las nesprinas gigantes, formando el complejo
LINC (Linker Nucleoskeleton and Cytoskeleton) que une el NSK con el CSK. De
esta forma las laminas se conectan mecánicamente con el CSK (Wilson y Foisner,
2010; Graumann et al., 2010a); y 2) proteínas no integrales de la MNI (que
interaccionan con las laminas o con sus proteínas asociadas), como proteínas
Introducción
19
que anclan u organizan a los cromosomas en interfase (Galiova et al., 2008). La
interacción de las laminas con la cromatina podría ser mediada por su unión con
HP1, desacetilasa 3 de histonas, regiones de ADN específicas para su unión a
matriz (MARs), o con reguladores transcripcionales y proteínas estructurales
(Luderus et al., 1992 y 1994; Taniura et al., 1995; Baricheva et al., 1996; Goldberg
et al., 1999; Mattout et al., 2007; Wilson y Foisner, 2010; Kubben et al., 2010;
Nakka y Chattopadhyay, 2010) (Figura 4).
Las laminas están presentes también en el núcleoplasma, donde forman
complejos estables con proteínas específicas nucleoplásmicas que funcionan en
la mayoría de actividades nucleares (Wilson y Foisner, 2010).
Las laminas polimerizan en filamentos que forman redes ortogonales
(Dechat et al., 2008) sobre las que se asocian las proteínas y complejos de la MNI
y la cromatina. Además hay evidencias de que las laminas regulan la organización
de la cromatina y la expresión genética, e influyen en la señalización (Gruenbaum
et al., 2005; Dechat et al., 2008, Reddy et al., 2008; Dittmer y Misteli, 2011). Estas
funciones involucran un amplio espectro de interacciones bioquímicas entre las
laminas, cromatina, y sus proteínas asociadas, incluyendo proteínas reguladoras
que responden a señales intrínsecas (Razafsky y Hodzic, 2009).
2.1.1 Laminas períféricas
En el NSK la lámina conserva su localización en la periferia del núcleo
residual. Las laminas junto con las LBPs (Östlud y Worman, 2004; Wilson y
Foisner, 2010): proteínas integrales de la MNI (LBR, LAP1 y LAP2, emerina,
MAN1), reguladores transcripcionales, histonas, y modificadores de la cromatina,
forman el complejo multimérico de la lámina nuclear (Melcer et al., Krohne, 2007).
Los cromosomas y la cromatina también se asocian con las laminas (Guelen et
al., 2008).
Las laminas nucleares constituyen la subfamilia V de la familia de los FIs
definida en base a su estructura proteica y secuencia de nucleótidos (Stuurman et
al., 1998; Krohne et al., 2005; Melcer et al., 2007; Golberg el al., 2008; Dechat et
al., 2008; Parnaick, 2008; Ben-Harush et al., 2009; Prokocimer et al., 2009;
Dechat et al., 2010a; Dittmer y Mistelli, 2011). Éstas se clasifican en tipos A, B y C
Introducción
20
(Gruenbaum et al., 2000; Golberg et al., 2008; Shimi et al., 2008; Douer y
Worman, 2009; Worman et al., 2009; Andrés y González, 2009; Dechat et al.,
2010a; Dittmer y Misteli, 2011).
Las laminas son los constituyentes mayoritarios de la lámina nuclear de
metazoos y no se han identificado homólogos obvios en los genomas
secuenciados completamente de algunos eucariotes inferiores, Arabidopsis
thaliana, Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe (Mier, 2007;
Melcer et al., 2007).
En mamíferos, las laminas tipo B (laminas B1 y B2) son proteínas
esenciales para la viabilidad, codificadas por dos genes (LMNB1 y LMNB2) y
están presentes en todos los metazoos (Höger et al., 1990; Biamonti et al., 1992;
Lin y Worman, 1995). Las laminas tipo A (laminas A y C) son el producto del
procesamiento de un solo gen (LMNA en humano). Este gen ha sido identificado
solamente en los metazoos más complejos, es expresado principalmente en
células diferenciadas (Östlund y Worman, 2004; Mattout, 2006; Dechat et al.,
2010a).
Las laminas tipo A tienen un punto isoeléctrico neutro, y las laminas tipo B
acídico; y ambas presentan una rango de masa molecular entre 66 y 78 kDa (Kim
y Coulombe, 2007). Las laminas presentan una estructura molecular tripartita
como todos los FIs: un dominio central varilla -hélice flanqueado por los
dominios globular “cabeza” amino terminal y “cola” carboxilo terminal (Figura 3).
Los dominios cola de las laminas A, B1 y B2 presentan un motivo caja-CAAX que
funciona como un sustrato para farnesilación postraduccional y se sugiere que la
porción farnesilada hidrofóbica facilita su localización y retención en la EN
(Östlund y Worman, 2004; Stewart et al., 2007; Prokocimer et al., 2009). La
lamina A humana presenta una secuencia de localización nuclear (NLS) en el
dominio cola y un sitio de sumoilación en el dominio central probablemente
involucrado en su localización subnuclear (Zhang y Sarge, 2008). En las laminas
del tipo A de humano se conocen más de 30 sitios de fosforilación conservados y
las kinasas CDC2, PKC y PKA modifican y modulan sus actividades. La kinasa
mitótica CDC2 induce la despolimerización de la lamina mediante fosforilación de
los residuos conservados en los dominios cabeza y coiled-coil 2B (Peter et al.,
1990). La lamina de invertebrado presenta en el dominio cabeza un sitio de
Introducción
21
Figura 3. Representación esquemática de las proteínas laminas.
(A) Monómero de lamina. La lamina está dividida en tres dominios cabeza, varilla y una cola globular. El
dominio varilla está compuesto por cuatro regiones coiled-coil (1A, 1B, 2A, 2B) unidas por tres conectores
cortos (L1, L12, L2). Sobre el esquema se marcan el dominio globular similar a Ig en la cola y el stutter (stu:
una discontinuidad de la repetición heptada) en la hélice 2B. También se presentan por código de color las
posiciones del sitio de reconocimiento para CDK-1 (ausente en Ce-lamina), el sitio de sumoilación en la
lamina A de humano, la señal de localización nuclear (NLS) y el motivo CAAX. (B) Un modelo de dímeros
de lamina. Un par de varillas coiled-coil paralelas forman el dímero de lamina (amarillo). Los dominios
cabeza y cola no helicoidales están de color en verde y rosa, respectivamente. Los subdominios diferentes
son indicados. En la región 2B el stutter (stu) lleva a un desenrollamiento.
Figura tomada de: Prokocimer, M., Davidovich, M., Nissim-Rafinia, M., Wiesel-Motiuk, N., Bar, D. Z. Barkan,
R., Meshorer, E., y Gruenbaum, Y. (2009). "Nuclear lamins: key regulators of nuclear structure and activities."
J. Cell. Mol. Med. 13: 1059-1085.
fosforilación mitótica reconocido por CDK1 (ausente en Ce-lamina) y en el
dominio cola una secuencia de localización nuclear (NLS), una caja CAAX y un
dominio plegado, similar a inmunoglobulina (Ig) que media diversas interacciones
proteína-proteína y proteína-ligando (Coulombe et al., 2001; Dhe-Paganon et al.,
2002; Strelkov et al., 2003, Herrmann et al., 2007; Prokocimer et al., 2009).
El dominio central -hélice abarca casi la mitad de la molécula de la lamina,
conteniendo cerca de 352 residuos de aminoácidos (conservado en todos los FIs
los cuales contienen 319 residuos), y consiste en 4 segmentos -hélices llamados
1A, 1B, 2A y 2B que contienen repeticiones de 7 residuos de aminoácidos
Introducción
22
características de las proteínas coiled-coil, conectados por los subdominios cortos
L1, L12 y L2. El dominio central -hélice es esencial para la polimerización de las
laminas en filamentos con alto orden de organización que llegan a medir entre 10
y 12 nm de diámetro (Kim y Coulombe, 2007; Dauer y Worman, 2009; Herrmann
et al., 2009).
Las laminas nucleares tipos A y B, no solamente proveen una red
estructural para el núcleo, formando el andamiaje que soporta la MNI y la
conectan a la cromatina (Herrmann, 2007), sino que también son esenciales para
otras funciones, tales como regulación epigenética; ensamblaje de la EN;
organización de la cromatina; replicación y reparación del ADN; transcripción y
apoptosis. Además hay evidencias que apoyan su papel en las infecciones virales
(Dechat, 2008).
2.1.2. Proteínas de unión a laminas (LBPs) periféricas
Un gran número de proteínas LBPs interaccionan con las laminas, lo cual
hace que la lámina nuclear sea una estructura compleja. Las LBPs incluyen
proteínas integrales de la MNI y proteínas nucleoplásmicas.
Las principales proteínas integrales específicas de la MNI son el LBR,
LAP1 y LAP2, emerina, MAN1, Nurima, NET, LEM, Sun y LUMA. Algunas de ellas
como LBR, LAPs, emerina y MAN1 (Figura 4) interaccionan con las laminas y
cromatina (Shumaker, 2001; Östlund y Worman, 2004; Akhtar y Gasser, 2007;
Cohen et al., 2007, Dorner et al., 2007; Schirmer y Foisner, 2007; Holaska y
Wilson, 2007).
Las LBPs mejor caracterizadas son las proteínas integrales de la MNI:
LBR, LAPs, emerina y MAN1.
El receptor LBR tiene un segmento con ocho dominios transmembrana en
el dominio C-terminal y un dominio nucleoplásmico N-terminal que interacciona
con la proteína HP1, cromatina y laminas de tipo B in vitro (Ye y Worman, 1994 y
1996).
Las proteínas emerina, LAPs y MAN1 poseen un motivo plegado de 40
aminoácidos llamado dominio LEM (LAP, Emerin y MAN1) que se asocia
directamente con la proteína BAF, una proteína conservada que se une con ADN
Introducción
23
Figura 4. Representación esquemática de las asociaciones proteínicas de la envoltura nuclear, lámina
y cromatina en células animales.
La membrana nuclear interna (MNI) y la membrana nuclear externa (MNE) están unidas en los poros
nucleares complejos (PNCs) y separadas por el lumen nuclear.
Las laminas (tipos A y B) se presentan como filamentos naranja; más gruesos en la periferia nuclear y más
delgados en el nucleoplasma. Sin embargo, la naturaleza filamentosa de las laminas, especialmente en el
interior del núcleo, permanece como hipótesis. También se representan proteínas específicas de la MNI
incluyendo proteínas con dominios LEM y SUN, LAP-1, Nurina y LBR. Estas proteínas representan solamente
una fracción pequeña de proteínas de MNI. También se presentan algunos ejemplos de proteínas no
integrales que interaccionan con las laminas o con sus proteínas asociadas, incluyendo actina, HP1, HA95,
GCL y BAF. Las laminas nucleoplásmicas también forman complejos proteicos específicos (no se presentan).
Las proteínas con dominio SUN de la MNI interaccionan con proteínas con el dominio KASH de la MNE,
conectando el citoesqueleto con el núcleoesqueleto, actina (verde), tubulina (amarilla), redes de filamentos
intermedios (no representadas) y centrosoma (MTOC).
Figura tomada de: Prokocimer, M., Davidovich, M., Nissim-Rafinia, M., Wiesel-Motiuk, N., Bar, D. Z. Barkan,
R., Meshorer, E., y Gruenbaum, Y. (2009). "Nuclear lamins: key regulators of nuclear structure and activities."
J. Cell. Mol. Med. 13: 1059-1085.
y está involucrada en la organización de la cromatina importante para el
ensamblaje nuclear (Wagner y Krohne, 2007; Zastrow et al., 2004).
La emerina interacciona específicamente con las laminas tipo A y BAF en
la periferia nuclear (Lee et al. 2001). La emerina y la lamina C dependen de la
lamina A para su localización en la EN (Sullivan et al., 1999; Vaughan et al.,
2001).
Introducción
24
Las proteínas LAPs contienen de 1 a 4 copias del dominio PDZ en el
extremo C-terminal y repeticiones con abundantes leucinas (LRRs) en el extremo
N-terminal, ambos dominios funcionan principalmente en la asociación con otras
proteínas (Bryant y Huwe, 2000). Las proteínas LAP1A y LAP1B interaccionan
con las laminas A, C, y B1. LAP1C se ancla a la EN como parte de un complejo
multimérico que incluye LAP1A y laminas tipo B. Existen seis isoformas de la
proteína LAP2, todas excepto LAP2 son proteínas integrales de membrana tipo
II. LAP2 se une específicamente con la lamina B1, cromatina y BAF (Shumaker
et al., 2001). LAP2 carece de un dominio transmembrana pero tiene una
secuencia NLS conteniendo un dominio nucleoplásmico. LAP2, no es una
proteína de membrana y no se une con la lámina periférica sino que está
distribuída en el nucleoplasma y asociada con la cromatina y la lamina A
intranuclear (Dechat et al., 2000; Markiewicz et al., 2002). LAP2 también se
asocia con retinoblastoma (pRb) y su asociación es importante para la regulación
celular (Markiewicz et al., 2002; Pekovic et al., 2007). La proteína LINT-25 se une
con LAP2 y está involucrada en la salida de ciclo celular (Naetar et al., 2007).
La proteína MAN1 también llamada LEMD3 es retenida en la MNI mediante
la interacción de su dominio N-terminal nucleoplásmico con emerina y laminas
(Paulin-Levasseur et al., 1996; Lin et al., 2000; Mansharamani y Wilson, 2005).
MAN1 media la señalización a través de los reguladores transcripcionales Smads.
La proteína LEM2 relacionada con MAN1 también está asociada con las laminas
A/C, las cuales la dirigen a la MNI (Brachner et al., 2005). Las movilidades de
emerina y MAN1 están incrementadas en células carentes de laminas A/C,
demostrando el papel de las laminas A/C en la retención de estas proteínas en la
MNI (Östlund et al., 2006).
Las proteínas SUN ya citadas anteriormente como componentes de la MNI
y del complejo LINC (que une el citoesqueleto con el núcleoesqueleto), contienen
un motivo SUN conservado en el extremo C-terminal localizado en el lumen de la
NE, que se asocia al dominio KASH de las nesprinas (Crisp et al., 2006; Haque et
al., 2006; Padmakumar et al., 2005; Tzur et al., 2006) y que fue inicialmente
descubierto en la proteína UNC-84 de C. elegans y en la proteína Sad1 de
Schizosaccharomyces pombe (Malone et al., 1999). Mediante su extremo N-
terminal localizado en el nucleoplasma se unen directamente con los filamentos
Introducción
25
de laminas. Funcionan como dímeros y la mayoría de ellas contienen múltiples
dominios transmembrana. Los dominios N-terminal de las proteínas SUN-1 y
SUN-2 se unen directamente con laminas tipo A. Las proteínas SUN1 y SUN2
unidas con las nesprinas gigantes constituyen el puente de unión de la actina del
CSK con laminas y otros componentes del interior del núcleo (Hodzic et al., 2004;
Crisp et al., 2006; Tzur et al., 2006). En mamíferos están codificadas por los
genes SUN1, 2, 3 y SPAG4.
Las nesprinas como la nesprina-1 y nesprina-2 se unen directamente con
laminas tipo A y emerina, y son dependientes de la lamina A para su localización
en la EN (Libotte et al. 2005; Mislow et al., 2002a, b). Las isoformas grandes de la
nesprina-1 y nesprina-2 están localizadas en la MNI, al igual que algunas de las
isoformas pequeñas (Zhang et al., 2005). Como se describe en la Figura 4, las
nesprinas tienen un dominio KASH y un segmento transmembrana conservados
en el dominio C-terminal. En mamíferos, dos genes codifican para las multiples
isoformas de la nesprina-1 y nesprina-2. La proteína ANC-1 de C. elegans es un
ortólogo de las nesprinas (Starr y Han, 2002).
La mayoría de las LBPs tienen un papel dual, como proteínas estructurales
de la EN y como reguladoras de la transcripción y de la organización de la
cromatina (Östlund y Worman, 2004).
2.2. Endoesqueleto
Aunque la composición y las funciones del endoesqueleto no están
completamente definidas hay evidencias de una red estructural intranuclear
(Hozak et al., 1995; Vlcek et al., 2001; Barboro et al., 2002). El NSK interno junto
con la lamina periférica forman una plataforma que está involucrada en la
organización de la cromatina y en la progresión espacio-temporal de los procesos
nucleares tales como la replicación y transcripción del ADN (Bridger et al., 2007;
Dechat et al., 2008; Dorner et al., 2007).
Los principales componentes del endoesqueleto son las laminas nucleares
(Shumaker et al., 2003) que se localizan en los dominios intercromatínicos junto
con otras proteínas intranucleares que también forman el endoesqueleto, tales
como LBPs; proteínas implicadas en la mitosis y en el ensamblaje nuclear
Introducción
26
(proteínas gigantes con dominios coiled-coil largos que forman una red expandible
en los dominios intercromatínicos) como Megator (Mtor) y EAST; proteínas
asociadas con la cromatina y cromosomas como chromator y esqueletor; NuMA;
actina nuclear (Gieni y Hendzel, 2009); algunas proteínas relacionadas con
actina (ARPs); ABPs nucleares; proteína 4.1; nesprinas y titinas. Todas ellas tiene
una o más funciones importantes en el núcleo (Tabla 1), principalmente en la
organización y remodelación de la cromatina; transcripción y procesamiento del
ARN; transporte intranuclear; y algunas también forman parte de los complejos
macromoleculares que forman la matriz del huso mitótico (Fabian et al., 2007;
Zhen y Tsai, 2006; Tsai et al., 2006; Zhong et al., 2010). La mayoría de estas
proteínas no laminas del endoesqueleto le confieren propiedades mecánicas
complementarias al NSK.
Tabla 1. Proteínas estructurales no laminas en el núcleo y sus proteínas asociadas
Proteínas
estructurales
Proteínas asociadas Funciones
Actina Proteínas con dominio CH: II-espectrina, actinina-4, II-espectrina,
filamina A, distrofina, vav, nesprina-2, L-plastina; Complejos
remodeladores de la cromatina: BAF, SWI-SNF, BAP NuA4, TIP60, PBAF,
p400, SWR1, complejos INO80; Proteínas de complejos
ribonucleoproteicos: hrp36, hrp65, DBP40; Otras proteínas: emerina,
titina, proteína 4.1, lamina A, MAL, profilina, capG, exportina-6, zixina,
miopodina, Nrf2, NDHII, DNasa I
NSK,
remodelación de
la cromatina,
transcripción y
procesamiento
del RNA, expor-
tación nuclear
II-espectrina Proteínas estructurales: actina, proteína 4.1, SpIV5, lamina A, emerina;
Proteínas de reparación del DNA : hHR23B, XPA, RPA32, RPA70, XPB,
XPD, XPG, XPF, ERCC1, actina, FANCA, BRG1, hBRM, CSB; Proteínas
anemia fanconi: FANCA, FANCC FANCD2, FANCF, FANCG, FANCJ;
Proteínas del procesamiento y transcripción del RNA: p40, PML
(hnRNP) A2/B1
Reparación del
DNA, anemia
fanconi, NSK
Titina Lamina A, lamina B, actina, miosina I nuclear Matriz del huso
Nesprina Lamina A, lamina B, actina, emerina, proteínas SUN Complejo LINC
Proteína 4.1 Actina, II-espectrina, NuMA, U2AF, SC35, lamina A , emerina NSK, matriz del
huso
NuMA Dineína, dinactina, proteína 4.1, laminas, Arp1, GAS41, INI1, LGN, tubulina endoesqueleto,
huso mitótico
EAST Actina, CP60, megator Matriz del huso
Megator EAST Matriz del huso
Esqueletor Chromator Matriz del huso
Chromator Esqueletor Matriz del huso
Tabla tomada de: Zhong, Z., Katherine L. Wilson, K. L., y Dahl, K. N. (2010). "Beyond lamins: other structural components of the nucleoskeleton." Methods Cell Biol. 98: 97-119, con algunas adiciones.
Introducción
27
2.2.1. Laminas intranucleares
Las laminas forman una red intranuclear interactiva constituida por
complejos proteicos involucrados en funciones nucleares tales como la
organización de la cromatina, replicación del DNA, transcripción, apoptosis, etc.
(Dorner et al., 2007; Shimi et al., 2008; Dechat, et al., 2008; Parnaik et al., 2008;
Andres y González, 2009; Dechat et al., 2009; Boban et al., 2010, Dechat et al.,
2010b). Las laminas de tipo A se ensamblan en focos intranucleares y forman una
plataforma dependiente de ARN asociada con NuMA (Barboro et al., 2002; Dorner
et al., 2007). La lamina A y LAP2α forman complejos estables en focos
intranucleares que contienen también LAPs específicas y reguladores de la
transcripción (Bridger et al., 2007). La proteína LAP2α tiene un dominio LEM
nucleoplásmico que interacciona directamente con ADN y BAF (implicada en el
ensamblaje nuclear, organización de la cromatina y expresión de genes) (Margalit
et al., 2007). BAF regula la interacción de LAP2α con la cromatina para promover
la formación de heterocromatina. La interacción de LAP2α con LINT-25 forma
complejos implicados en la regulación del ciclo celular (Naetar et al., 2007). Los
complejos lamina A/C-LAP2α interaccionan también con las proteínas
retinoblastoma (pRb) y actina. Éstos complejos podrían tener funciones
potenciales en la organización de la cromatina, expresión de genes y regulación
del ciclo celular en diferentes vías mediadas por sus diferentes interacciones
(Dorner et al., 2007).
2.2.2. Proteínas del endoesqueleto implicadas en la mitosis y ensamblaje
nuclear
Algunos componentes del endoesqueleto se integran en la matriz del huso
mitótico independientemente de la polimerización de los microtúbulos (MTs),
jugando un papel importante en el ensamblaje y función del huso mitótico. Entre
ellos están las proteínas EAST, Mtor y NuMA; las proteínas asociadas a los
cromosomas (esqueletor y chromator); titina y una subfracción pequeña de la
lamina B (Wasser y Chia, 2007; Zheng y Tsai, 2006; Fabian et al., 2007).
Introducción
28
La lamina B y otras proteínas del NSK como la titina se localizan en la
matriz del huso durante la mitosis (Tsai et al., 2006; Fabian et al., 2007). En
inmunofluorescencia, la titina colocaliza con los MTs y con otras proteínas
constituyentes de la matriz del huso, como EAST con esqueletor, Mtor y
chromator en Drosophila (Fabian et al., 2007).
La Titina es una proteína gigante expandible cuyas isoformas tienen una
masa molecular mayor de 1 MDa. Interacciona con las laminas A y B
nucleoplásmicas en células Hela. Contiene múltiples dominios Ig plegados,
dominios tipo 3 de fibronectina y un dominio PEVK esencial para la condensación
y segregación de los cromosomas. La Titina podría unir las laminas con la
cromatina y actina nuclear durante la interfase. Su separación de las laminas
podría inducir la condensación de los cromosomas y el desensamblaje nuclear
(Zastrow et al., 2006).
EAST es un componente del dominio intercromosómico nuclear expandible
de Drosophila. Tiene una masa molecular de 253 kDa, siete señales NLS y doce
secuencias PEST [prolina (P), ácido glutamico (E), serina (S) y treonina (T)]
proteolíticas (Wasser y Chia, 2000). Forma una red ramificada por todo el núcleo.
Co-localiza con actina; promueve el depósito específico de actina y CP60 en el
nucleoplasma, y modula la organización espacial de los cromosomas (Wasser y
Chia 2000 y 2003).
Mtor es un ortólogo de Trp (componente del PNC de mamíferos) (Qi et al.,
2005). Es una proteína esencial de 260 kDa. Su dominio coiled-coil largo N-
terminal está implicado en su propio ensamblaje y polimerización. Su dominio C-
terminal está involucrado en la formación de la matriz del huso, dirección y
localización nuclear. En interfase Mtor y EAST interaccionan para formar un
endoesqueleto nuclear (Qi et al., 2004 y 2005).
Durante la interfase Mtor rodea a los cromosomas y se detecta
mayoritariamente en la EN, mientras que las proteínas esqueletor y chromator
(unidas directamente entre sí) se localizan en los cromosomas. Durante la mitosis,
estas tres proteínas forman una “matriz del huso” que subyace al huso de
microtúbulos (Walker et al., 2000; Rath et al., 2004; Qi et al., 2005).
Esqueletor es una proteína esencial de 81 kDa que contiene una NLS
bipartita y regiones con abundantes residuos de histidina y serina. No es un
Introducción
29
componente estructural pero forma parte del complejo multiproteico e inteacciona
directamente con chromator.
Chromator es una proteína cromodominio esencial de 130 kDa. El complejo
chromator–esqueletor tiene dos funciones diferentes, una asociada con la matriz
del huso y otra asociada con la cromatina nuclear en interfase. Chromator tiene
un papel funcional en la organización de la cromatina y en la segregación de los
cromosomas en interfase (Walker et al., 2000; Rath et al., 2004 y 2006). En
interfase ambas proteínas se localizan en los cromosomas y en la cromatina,
aunque esqueletor está presente también en el nucleolo.
NuMA es un componente abundante del núcleo interfásico y es esencial en
el ensamblaje y mantenimiento del huso mitótico. Se asocia con dineína
citoplasmática y ancla a los MTs con los polos del huso. NuMA y sus homólogos
en invertebrados juegan un papel de anclaje en la corteza celular mediando las
divisiones asimétricas esenciales durante el desarrollo. Su papel en interfase no
ha sido establecido pero por sus propiedades ha sido implicada como un
componente central del NSK (Radulescu y Cleveland, 2010).
NuMA es una proteína coiled-coil larga de 200-240 kDa. Fue primeramente
identificada como un componente de unión a los MTs del aparato mitótico nuclear
(Zeng et al., 1994; Dionne et al., 1999). Está conservada en vertebrados y no se
han identificado ortólogos en invertebrados (Abad et al., 2004), aunque existe un
parálogo con dominios similares en Drosophila (Bowman et al., 2006). NuMA
contiene un dominio central coiled-coil -hélice largo implicado en la dimerización;
un dominio de homología de calponina (CH) en el extremo N-terminal; un extremo
C-terminal globular conteniendo la secuencia NLS; sitios de unión para LGN,
tubulina y proteína 4.1; algunos sitios consenso para diferentes proteínas kinasas;
y múltiples sitios de procesamiento alternativo (Harborth et al., 2000; Abad et al.,
2007). Su dominio C-terminal controla la oligomerización de dímeros en brazos
oligomericos por autoensamblaje, mientras que el dominio N-terminal controla el
ensamblaje de los brazos oligoméricos en redes, probablemente mediante
modificaciones post-tranduccionales en donde se involucran kinasas, fosfatasas,
co-factores y proteínas de unión específicas (Harborth et al., 1999).
Las funciones de NuMA en la interfase no están completamente claras, sin
embargo se conoce que NuMA interacciona con proteínas (estructurales y
Introducción
30
reguladoras de complejos multiproteicos) como las laminas; el factor de
transcripción AS41; la proteína 4.1 que estabiliza su interacción con actina; MTs y
el complejo INI1 remodelador de cromatina que contiene ARPs. Esto sugiere que
NuMA es un componente del NSK y está implicada en la organización de la
cromatina (Mattagajasingh et al., 1999; Barboro et al., 2002). En el
endoesqueleto, miniredes de NuMA se asocian con laminas internas dependiendo
de ARN (Barboro et al., 2002), aportando estabilidad mecánica y
compartimentalización. Por su flexibilidad y habilidad para formar redes (asociada
con diferentes proteínas reguladoras y estructurales, secuencias MAR y
secuencias de filamentos estructurales del endoesqueleto) NuMA está implicada
en la organización estructural del núcleo. Y por su rigidez mecánica tiene un papel
activo en la reformación del núcleo postmitótico (Barboro et al., 2003).
En Xenopus, NuMA interacciona con algunas proteínas de complejos
multiproteicos del huso mitótico como Arp1 que media la asociación de NuMA con
el complejo de proteínas motor dineína-dinactina en los centrosomas (para el
anclaje de los MTs del huso mitótico con los polos y LGN, homóloga de Pins de
mamíferos que juega un papel en la organización polar del huso y tubulina
(Dionne et al., 1999; Du et al., 2002). Su interacción con GAS41 involucra a NuMA
en la regulación de la expresión de genes, probablemente proporcionando una
base estructural para la transcripción (Harborth et al., 2000). NuMA además de
estar implicada en la organización de la cromatina también está implicada en la
diferenciación celular y apoptosis (Abad et al., 2007).
2.2.3. Actina nuclear
La actina es un componente principal del CSK que se intercambia
activamente entre el núcleo y el citoplasma (Pederson y Aebi, 2005). En el núcleo,
la actina no polimeriza como F actina (detectable con faloidina) sino que se
encuentra como monómeros, oligómeros y polímeros cortos con conformaciones
no convencionales (Pederson y Aebi, 2002; Bettinger et al., 2004; Schonenberger
et al. 2005; Jockusch et al., 2006; McDonald et al., 2006; Vartiainen, 2008), que
están involucrados en múltiples funciones nucleares como la transcripción,
procesamiento y exportación del ARNm; remodelación de la cromatina; transporte
Introducción
31
y transducción de señales entre el núcleo y el citoplasma; estructura nuclear, etc.
(Bettinger et al., 2004; Hofmann, 2009; Visa y Percipalle, 2010).
La actina interacciona funcionalmente con los complejos formados por las
laminas. La emerina se une directamente con las laminas e induce la
polimerización de la actina in vitro. Esta observación junto con las evidencias que
demuestran las asociaciones entre la emerina, miosina 1 nuclear (NM1), y
espectrina han llevado a la propuesta de que la EN al igual que la membrana de
los eritrocitos, podría estar estructurada sobre una red “cortical” de espectrina y
filamentos de actina anclados a la emerina de la MNI (Gruenbaum et al., 2005;
Holaska y Wilson, 2007). La actina también se une con la lamina A directamente
mediante dos sitios localizados en el dominio cola de ésta (Sasseville y Langelier,
1998; Zastrow et al., 2004; Simon et al., 2010). La lamina B se une débilmente
con actina, y la lamina A puede unirse con F-actina in vitro (Simon et al., 2010).
La actina juega un papel integral en la función nuclear y está asociada con
el NSK. Muchas proteínas nucleares estructurales tienen dominios CH de unión a
actina. Las ABPs tales como la NM1, profilina, cofilina, emerina, lamina A,
proteína 4.1, nesprinas y exportina 6 controlan la dinámica de actina en el núcleo
(Blessing et al., 2004; Vartiainen, 2008). La actina es un componente integral de
algunos complejos macromoleculares nucleares como son los complejos de
remodelación de cromatina; replicación y reparación de ADN; transcripción y
procesamiento del ARN; transporte intranucleoplásmico; y arquitectura nuclear
(Castano et al., 2010).
En los complejos de transcripción la actina es esencial para la formación de
los complejos de preiniciación de las tres ARN polimerasas, y durante la
elongación del transcrito la actina polimérica actúa como un motor molecular
(junto con la NM1) necesario para el mantenimiento de la transcripción activa. La
actina está también involucrada en el procesamiento del ARN y se asocia con las
hnRNPs. Los complejos actina-profilina son componentes funcionales del
procesamiento del ARNm. La actina co-localiza con las proteínas Sm y SR en las
speckles y cuerpos de Cajal, y está también involucrada en la exportación de
snRNP a través del PNC (Percipalle et al., 2001; Hofmann et al., 2004; Fomproix y
Percipalle, 2004; Philimonenko et al., 2004; Ye et al., 2008; Castano et al., 2010;
Visa y Percipalle, 2010).
Introducción
32
La actina y ARPs son componentes centrales de los complejos de
remodelación de la cromatina SWI/SNF (switch mating type/sucrose non-
fermenting) (Olave et al., 2002; Castano et al., 2010). En los complejos de
remodelación de cromatina y de acetil transferasa de histonas (HAT) (DeFraia y
Mou, 2011), la actina monomérica funciona en los módulos actina/Arp que
interaccionan con la cromatina y otras proteínas. En ellos la solubilidad de las
proteínas que modifican a la cromatina depende del estado de polimerización de
la actina (Blessing et al., 2004; Chen y Shen, 2007). Heterodímeros de ARPs y
actina se asocian con una subunidad grande de helicasa y forman un complejo
central esencial para el ensamblaje y la función de la mayoría de las maquinarias
de modificación y remodeción de la cromatina (Meagher et al., 2010).
Como un componente del NSK la actina se asocia con la lamina A,
emerina, proteína 4.1, y nesprinas. Estas últimas tienen la habilidad de unirse
tanto con lamina A como con actina y podrían ser elementos de enlace entre los
dos tipos importantes de componentes del NSK: la lamina y el endoesqueleto,
contribuyendo a la formación de una red estructural con alto nivel de organización
conteniendo actina en el núcleo (Shumaker et al., 2003; Kiseleva et al., 2004). La
actina nuclear y la proteína 4.1 co-localizan en los filamentos intranucleares que
son necesarios para el ensamblaje nuclear in vitro (Krauss et al., 2003). La
identificación de más proteínas de unión con actina y ARPs suministraría
información importante acerca del papel de la actina en la arquitectura nuclear y
de las interconexiones de los procesos de remodelación de cromatina,
transcripción y procesamiento del ARN con el NSK.
2.2.4. Espectrinas nucleares
Se han identificado varias espectrinas nucleares en el núcleo de
mamíferos, entre ellas -espectrina II y una forma truncada de -espectrina IV5
(ver apartado 7.1.1).
La II-spectrina nuclear está relacionada con la anemia de Fanconi, provee
una plataforma estructural que ayuda a reclutar proteínas al sitio del ADN dañado
para su reparación (McMahon et al., 1999 y 2001).
Introducción
33
Entre las proteínas nucleares que coimmunoprecipitan con la II-espectrina
están la actina, proteína 4.1B, -espectrina (SpIV-5), lamina A, y emerina
(Sridharan et al., 2006). En núcleos de células Hela la purificación cromatográfica
de los complejos conteniendo emerina reveló un complejo de 1.5 MDa que incluía
emerina, II-espectrina, actina, NMI, laminas, y SUN2 (Holaska y Wilson, 2007).
Estos hallazgos implican a las espectrinas como componentes importantes del
NSK. Además de las proteínas estructurales también co-inmunoprecipitan con la
II-espectrina proteínas asociadas con la anemia de Fanconi (FANCA, FANCC,
FANCD2); involucradas en la reparación del ADN (XPA, XPB, XPF, ERCC1);
remodelación de la cromatina (actina, BRG1, hBRM, y CSB); y transcripción y
procesamiento del ARN (P40, hnRNP A2/B1, PML) (Sridharan et al., 2006). Estos
hallazgos sugieren que la II-espectrina tiene funciones múltiples en el núcleo,
tanto en el NSK periférico como en estructuras internas.
3. NÚCLEOESQUETO EN PLANTAS
3.1. Organización y componentes
El NSK de las plantas está formado por una red fibrogranular conectada al
CSK, conservando la morfología, tamaño y dominios principales del núcleo in situ
(Figuras 1, 2 y 5A y B). Contiene la lámina, endoesqueleto, matriz nucleolar y
cuerpos nucleares residuales. En microscopía electrónica de cortes sin resina
presenta dos clases de filamentos: 1) filamentos básicos de 15-25 nm de
organización periódica similar a los FIs y 2) filamentos más gruesos, algunas
veces formados por filamentos básicos enrollados unos con otros (Figura 5C y
C1) (Yu y Moreno Díaz de la Espina, 1999; Moreno Díaz de la Espina, 2009).
Aunque la organización ultraestuctural del NSK de plantas está bien
establecida, existe poca información acerca de sus componentes proteicos. Los
genomas de las plantas carecen de ortólogos de las principales proteínas del NSK
animal, y no se han identificado proteínas homólogas en plantas mediante
espectroscopía de masas. El proteoma del NSK de Arabidopsis está constituido
por más de 300 manchas de las cuales 36 han sido identificadas y corresponden
Introducción
34
Figura 5. Microfotografías electrónicas del núcleo y núcleoesqueleto de células meristemáticas de
Allium cepa
(A) Núcleo aislado conservando la organización estructural y morfológica del núcleo in situ: Envoltura nuclear
(flecha roja); territorios cromosómicos (flecha azul); dominios intercromatínicos con abundantes estructuras
granulares densas (flecha amarilla) y nucleolo (flecha verde) con sus tres componentes ultraestructurales
básicos: fibrilar denso (f), granular (g) y centros fibrilares (flecha blanca). La barra representa 1 m.
(B) Núcleoesqueleto extraído por tratamiento secuencial de los núcleos con tritón X-100 0.5%, MgCl2 0,25
mM, nucleasas y NaCl 2 M. Endoesqueleto (flecha amarilla) asociado con la lámina (flecha roja) y con el
nucleolo residual (nu) (flecha verde) que conserva algunos centros fibrilares (flecha blanca). La barra
representa 1 m.
(C) Porción del núcleoesqueleto observado mediante ME de cortes sin resina. El endoesqueleto, está
formado por filamentos de estructura arrosariada (flechas) y otros más gruesos cubiertos por estructuras
globulares (flechas dobles) que forman una red anastomosada. Los agregados densos (da) no proporcionan
información de sus estructuras internas.
C1) Alto aumento de una sección sin resina de un filamento básico de la matriz interna mostrando su
organización con estructuras globulares de 25 ± 2,5 nm (punta de flecha) separados por 15 ± 2 nm (flechas).
La barra corresponde a 0,1 m.
(D) Porción del núcleoesqueleto obtenido mediante ME convencional. El esqueleto nucleolar (nom) presenta
una organización laxa formada por una red fina de filamentos. El endoesqueleto está formado por una red de
filamentos finos (flecha) asociados con gránulos (flechas delgadas) los cuales algunas veces forman
agregados. Los agregados densos (da) similares a los cuerpos nucleares observados in situ también forman
parte del endoesqueleto. La barra corresponde a 1 m.
Figuras tomadas de: Moreno Díaz de la Espina, S., Barthellemy, I., y Cerezuela, M. A. (1991). "Isolation and ultrastructural characterization of the residual nuclear matrix in a plant cell system." Chromosoma 100: 110-117; Yu, W., y Moreno-Díaz de la Espina, S. (1999). "The plant nucleoskeleton: ultrastructural organization and identification of NuMA homologues in the nuclear matrix and mitotic spindle of plant cells." Exp. Cell Res. 246: 516-526.
Introducción
35
en su mayoría a proteínas del dominio nucleolar (Calikowsky et al., 2003).
Mediante el uso de sueros contra proteínas del NSK de animales, se han
detectado proteínas inmunológicamente relacionadas con laminas en núcleos de
plantas (Beven et al., 1991; Li y Roux, 1992; McNulty y Saunders, 1992; Mínguez
y Moreno Díaz de la Espina, 1993; Ivanchenko et al., 1993; Moreno Díaz de la
Espina, 1995); NuMA (Yu y Moreno Díaz de la Espina, 1999; Moreno Díaz de la
Espina et al., 2003), actina (Cruz et al., 2008 y 2009), nucleolina (Mínguez y
Moreno Díaz de la Espina, 1996) y espectrina (De Ruijter et al., 2000).
El análisis de 2D-PAGE del NSK de cebolla ha revelado más de 200
manchas distintas (Moreno Díaz de la Espina, 1995). Algunas de estas proteínas
han sido caracterizadas y presentan una distribución específica en el núcleo y
NSK y son componentes de las maquinarias nucleares implicadas en la
replicación como PCNA (Samaniego et al., 2001) y TOPOII (Moreno Díaz de la
Espina, 1995); la transcripción y procesamiento del ARN como las proteínas Sm
(Cui y Moreno Díaz de la Espina, 2003), y síntesis y ensamblaje de los ribosomas
como la nucleolina (Mínguez y Moreno Díaz de la Espina, 1996), TOPO I,
fibrilarina, UBF, ASE-1 y SURF-6 (Moreno Díaz de la Espina, 1995 y 2009).
3.2. Lámina nuclear y proteínas específicas de plantas similares a las
laminas y a filamentos intermedios (FIs).
Aunque las proteínas de la MNI de unión con las laminas y cromatina como
LBR y proteínas con el dominio LEM (LAPs, emerina y MAN1) de vertebrados
están activamente involucradas en procesos esenciales como la organización de
la cromatina, transcripción, maduración de ADN y señalización (Graumann et al.,
2005; Worman y Gundersen, 2006; Stewart et al., 2007; Ruault et al., 2008; Starr,
2009), está bien documentado que éstos marcadores nativos y las laminas están
ausentes en plantas (Graumann y Evans, 2011). Los genes ortólogos de las
laminas no se han detectado en los genomas de plantas que han sido
completamente secuenciados (Meier, 2007; Melcer et al., 2007). Asimismo, no se
han detectado proteínas homólogas a laminas (Irons et al., 2003; Rose et al.,
2004a; Graumann et al., 2007; Moreno Díaz de la Espina, 2008).
Introducción
36
Se ha demostrado que el LBR es dirigido exitosamente a la EN en células
BY2 de tabaco transformadas con esta proteína que también tienen proteínas que
se unen débilmente al receptor, sugiriendo que el mecanismo de translocación del
LBR está conservado en plantas (Graumann et al., 2007).
También se ha revelado mediante estudios de ME convencional que las
plantas contienen una lámina ultraestructuralmente similar a la de los vertebrados,
que contiene los PNCs y está asociada con la MNI y endoesqueleto (Figura 5B y
6A) (Galcheva, 1988; Moreno Díaz de la Espina et al., 1991; Masuda et al., 1993 y
1997; Mínguez y Moreno Díaz de la Espina, 1993; Moreno Díaz de la Espina,
1995 y 2009).
Mediante microscopía electrónica de barrido de emisión de campo se ha
revelado que el núcleo de tabaco tiene una red de filamentos ortogonales
asociados con la EN (Figura 6A) (Fiserova et al., 2009). Esta red tiene una
estructura similar a la de la lámina de animales (Figura 6B). Está constituida por
filamentos delgados y gruesos interconectados con el PNC, y sus proteínas
constituyentes podrían ser proteínas filamentosas nucleares específicas de
plantas homólogas funcionales de las laminas animales cuya identidad no está
determinada (Figura 6D y C). Entre ellas se encuentran las proteínas
constituyentes de la matriz nuclear NMCP1 y NMCP2 de zanahoria y apio y sus
homógos LINC1 y LINC2 de Arabidopsis (Masuda et al., 1997; Dittmer et al.,
2007; Kimura et al., 2010). Estas proteínas están localizadas en la capa interna de
la EN, tienen dominios coiled-coil largos y están implicadas en la organización
estructural del núcleo y heterocromatina (Masuda et al., 1997; Dittmer et al., 2007;
Dittmer y Richard, 2008; Kimura et al., 2010). Por su localización y función en el
núcleo y heterocromatina se ha sugerido que estas proteínas podrían ser
homólogos funcionales de laminas.
Aunque las proteínas LINC no tienen similaridad de secuencias significativa
con las laminas A/C y B2 y carecen de los dominios específicos de la caja CAAX
carboxilo terminal, presentan una organización tripartita como las laminas con una
región varilla central en α-hélice y dominios amino y carboxilo terminales (Ditmer
et al., 2007).
Estas proteínas, específicas de plantas y similares en su organización
estructural, localización y función a las laminas de animales podrían haber
Introducción
37
Figure 6. Estructura filamentosa subyacente a la MNI en plantas
(A y B) Imágenes de microscopía electrónica de barrido de emisión de campo. Vistas nucleoplasmáticas de
la EN de células BY-2 de tabaco (A) y Xenopus laevis (B). Los PNCs están enmarcados con círculos, y los
filamentos de la lámina están señalados con flechas. Las barras corresponden a 100 nm.
(C y D) Esquemas comparativos de la organización de la lámina en células animales y vegetales. En ambos
la EN está asociada con estructuras del NSK y CSK. En animales la lámina está conectada con las proteínas
intrínsecas de la MNI como LBR, Lap1, Man1 y proteínas con dominio SUN, que están unidas a la cromatina.
Las proteínas con dominio KASH como nesprinas se unen a las proteínas con dominios SUN y las conectan
con elementos del CSK tales como actina y centros organizadores de los MTs (MTOC). En plantas se
propone que la red semejante a la lámina consistiría de proteínas filamentosas tales como NMCP1/2 y
LINC1/2. Se desconoce cómo se asocian estas proteínas con la EN pero AtSUN1 y AtSUN2 son las
candidatas de anclaje putativas. La actina y el complejo -TURC (γ-Tubulin Ring Complexes) se asocian con
el lado citoplasmático de la EN de la planta aunque no se conocen sus mecanismos de anclaje.
Figuras tomada de: Fiserova, J., Kiseleva, E., y Goldberg, M. W. (2009). Nuclear envelope and nuclear pore
complex structure and organization in tobacco BY-2 cells." The Plant J. 59: 243-255; Evans, D. E.,
Shvedunova, M., y Graumann, K. (2011). "The nuclear envelope in the plant cell cycle: structure, function and
regulation." Ann. Bot. 107: 1111-1118.
Introducción
38
conservado los dominios para las funciones esenciales de éstas y ser homólogos
funcionales más que estructurales de las laminas. Esto mismo ocurre con la
coilina (proteína oganizadora de los CBs) de Arabidopsis la cual está codificada
por un homólogo distante de coilina que presenta homología limitada con las
proteínas de los vertebrados pero tiene la misma localización y funcionalidad
nuclear (Collier et al., 2006).
Por otro lado, también hay evidencia de la existencia de proteínas
específicas de plantas que tienen epítopos similares a los de las laminas y FIs de
animales; y podrían ser también homólogos funcionales. Utilizando anticuerpos
contra laminas de vertebrados y FIs se ha demostrado la existencia de proteínas
que comparten epítopos con laminas en el núcleo de varias especies de plantas
monocotiledóneas y dicotiledóneas (Beven et al., 1991; Frederick et al., 1992; Li y
Roux, 1992; McNulty y Saunders, 1992; Ivanchenko et al., 1993; Mínguez y
Moreno Díaz de la Espina, 1993; Moreno Díaz de la Espina, 1995; Moreno Díaz
de la Espina, 2009). Estas proteínas que comparten determinantes antigénicos
con las laminas de vertebrados tienen valores conservados de masa molecular y
pI y tienen una distribución nuclear similar tanto en la lámina como en el NSK
interno (McNulty y Saunders, 1992; Mínguez y Moreno Díaz de la Espina, 1993), y
son degradadas específicamente mediante apoptosis (Chen et al., 2000), pero su
secuencias no están disponibles.
La lámina nuclear de guisante contiene proteínas de tipo FIs y proteínas
antigénicamente relacionadas con FIs y láminas, denominadas filamentos
intermedios nucleares (NIFs) (Blumenthal et al., 2004). Se han caracterizado
bioquímica e inmunológicamente proteínas NIFs presentes en las fracciones
nucleares correspondientes a la matriz-envoltura nuclear (NEM) y laminas (L1) del
núcleo de plúmulas de guisante. El análisis de secuencias peptídicas de una ellas
ha demostrado que presenta cierta similaridad de secuencia con regiones cortas
de aminoácidos de laminas y queratinas de animales, y con algunas proteínas de
plantas que contienen dominios coiled-coil localizadas en el núcleo y en algunas
ocasiones sólo en la periferia nuclear (Blumenthal et al., 2004).
Utilizando el algoritmo PROSEARCH se han detectado recientemente
homólogos putativos de laminas y keratinas y se ha sugerido que las familias de
proteínas coiled-coil AtFPP y AtMAP70 podrían estar relacionadas y funcionar
Introducción
39
como laminas y/o filamentos intermedios (Gardiner et al., 2011).
En Arabidopsis y maíz se han identificados ortólogos de las proteínas SUN
de levaduras, animales y hongos. Las proteínas AtSUN1 y AtSUN2, y ZmSUN1 y
ZmSUN2 son proteínas intrínsecas de la MNI que contienen varios dominios: SUN
(altamente conservados en el extremo C-terminal), transmembrana, coiled-coil, y
NLS (Graumann et al., 2010a; Murphy et al., 2010).
En maíz además de las proteínas SUN canónicas se ha demostrado una
subfamilia de estas proteínas denominada PM3 (plant-prevalent mid-SUN 3
transmembrane) cuyas proteínas ZmSUN3, ZmSUN6 y ZmSUN5 tienen el
dominio SUN en posición central y dominios transmembrana en ambos extremos
de su estructura. Las secuencias de estas proteínas parecen estar conservadas
en otras plantas (Murphy et al., 2010).
La presencia de proteínas con dominio SUN en plantas sugiere que en
ellas podrían existir las estructuras similares a los complejos LINC que forman el
puente NSK-CSK de animales y levaduras, pero debido a la ausencia de
proteínas homólogas con dominio KASH y laminas en plantas, los complejos LINC
de éstas podrían variar en su composición (Meier, 2007; Graumann y Evans,
2010a,b; Graumann et al., 2010a).
Todo lo anterior evidencia la existencia en plantas de proteínas similares a
las de la envoltura nuclear interna de animales como las proteínas SUN, y
además otras proteínas específicas de plantas que podrían ser componentes
estructurales de la lámina, como NMCP1 y NIFs, inmunológicamente relacionadas
con laminas.
3.3. Actina nuclear en plantas
La actina es una proteína altamente conservada y uno de los componentes
principales del citoplasma y del núcleo en células eucariotas. En el núcleo existe
un equilibrio dinámico de las diferentes estructuras y/o conformaciones de actina y
su distribución varía en respuesta a señales externas. Se ha demostrado que las
funciones de la actina en el núcleo son versátiles, complejas e interconectadas
(Vartiainen, 2008).
Introducción
40
En el núcleo la actina está implicada en diversos procesos que incluyen:
remodelación de la cromatina; transcripción; transporte nuclear; y mantenimiento
de la estructura nuclear (Vartiainen, 2008; Hofmann, 2009; Zheng et al., 2009,
Gieni y Hendzel, 2009; Visa y Percipalle, 2010). La actina en cada uno de estos
procesos actúa acoplada con ABPs nucleares, muchas de las cuales han sido
identificadas (Hofman, 2009; Castano et al., 2010). Algunas ABPs nucleares se
unen con actina mediante dominios compuestos por dos regiones calponina CH1
y CH2, como por ejemplo -actinina, -espectrina II, -espectrina II, Filamina A,
Distrofina, Vav y Nesprina-2 (Uribe y Jay, 2009).
En plantas, la presencia de actina nuclear se demostró por primera vez en
células proliferantes de Allium cepa, mediante inmunodetección en membrana e
inmunomarcado para MC y ME, usando diversos anticuerpos contra actina
humana algunos de ellos específicos de configuración. Se detectaron formas de
actina nuclear con diferentes solubilidades y localizaciones subnucleares, así
como también fue detectada su proteína asociada NM1. Ambas proteínas forman
parte de los complejos de transcripción y del NSK (Cruz et al., 2008; Cruz y
Moreno Díaz de la Espina, 2009). Recientemente, en Arabidopsis se ha
demostrado la presencia y localización diferencial en el núcleo de dos clases
ancestrales de actinas: las actinas ACT2 y ACT8 de la subclase 1 y la variante
ACT7 de la subclase 2 utilizando mutantes de las mismas. Todas ellas se
encuentran distribuídas en el nucleoplasma. ACT7 está más concentrada en las
speckles nucleares y nucleolo que las variantes de la subclase 1 (Kandasamy et
al., 2010).
Se han detectado hasta ahora tres proteínas de unión con actina nuclear
en plantas: miosina nuclear I (Cruz y Moreno Díaz de la Espina, 2009), profilina
(Kandasamy et al., 2002) y cofilina (Ruzicka et al., 2007) y se sabe que las
plantas carecen de genes para las principales ABPs nucleares estructurales
animales como laminas, LBR, etc.
Introducción
41
4. PROTEÍNAS “COILED-COIL”
Las proteínas coiled-coil son moléculas versátiles involucradas en las
funciones esenciales de todos los organismos. En ellas los dominios coiled-coil
largos forman fibras y plataformas dinámicas que funcionan como velcros,
cremalleras, adaptadores, espaciadores, y motores en las estructuras
macromoleculares involucradas en varias funciones incluyendo transporte celular,
motilidad, diferenciación y división celular, transcripción y síntesis de proteínas,
plegado y estabilización de proteínas, transporte y dirección de proteínas,
respuesta a señales, etc. (Rose y Meier, 2004; Rose et al., 2005 y 2007; Kellie et
al., 2007).
4.1. Estructura y función
El motivo coiled-coil esta formado por dos o más -hélices enrolladas
(hacia la izquierda) unas con otras formando un dominio superenrollado de
oligomerización, que es una de las características principales de las proteínas
oligoméricas. Este dominio está caracterizado por la repetición de siete
aminoácidos en la secuencia primaria, que facilita la predicción computacional de
los dominios coiled-coil (Rose et al., 2007). El patrón heptapéptido repetido
consiste en la localización de residuos de aminoácidos hidrofóbicos en las
posiciones primera y cuarta, y en la localización de residuos de aminoácidos
cargados o polares en la quinta y séptima posición, generando una cadena
peptídica -hélice (Figura 7). Dos o más-hélices enrolladas entre sí pueden
forman estructuras superenrolladas en forma de manojos helicoidales compactos
(varillas); estructuras extendidas similares a una cuerda, o ensamblajes más
complejos (Lupas, 1996; Rose et al., 2007; Grigoryan y Keating, 2008; Parry et al,.
2008; Rackham et al., 2010).
Las proteínas coiled-coil pueden ser agrupadas en dos clases generales. 1)
Proteínas que contienen dominios coiled-coil cortos, de 6 o 7 heptapéptidos
repetidos llamados dominios “cremallera” de leucina, establecidos frecuentemente
en el dominio de homo y heterodimerización en factores de transcripción. Se han
Introducción
42
Figura 7. La estructura y secuencia superenrollada coiled-coil.
(a) Diagrama de cintas presentando dos hélices de un superenrollamiento coiled-coil dimérico paralelo.
(b) Vista ortogonal de eje coiled-coil.
(c) La típica repetición heptada abcdefg de la secuencia coiled-coil forma las hélices. Los residuos
hidrofóbicos tienden a ocupar los sitios a y d; éstos caen sobre la misma cara de la hélice permitiendo la
asociación de las hélices.
Figura tomada de: Rackham, O. J. L., Madera, M., Armstrong, C. T., Vincent, T. L., Woolfson, D. N., y Gough, J. (2010). "The evolution and structure prediction of coiled coils across all genomes." J. Mol. Biol. 403: 480-493.
identificado dominios similares en complejos macromoleculares de señalización,
canales de iones, y en otros componentes de transducción de señales, donde
median interacciones específicas proteína-proteína. 2) Proteínas que contienen
dominios coiled-coil largos, constituidos por algunos cientos de aminoácidos que
usualmente forman las estructuras terciarias tipo “varilla” y pueden estar
combinados con dominios funcionales característicos. Las proteínas con este tipo
de dominios coiled-coil pueden realizar diversas funciones celulares, como las
proteínas estructurales del CSK (FIs, lamininas); proteínas motores (miosina,
kinesinas y dineínas); complejos proteicos funcionales que se anclan al aparato
de Golgi (las golginas forman un andamiaje para las estructura de membrana),
proteínas del cinetocoro, centrosomas y centrómeros; proteínas de la EN (PNC) e
involucradas en el reconocimiento molecular, etc. (Burkhard et al., 2001; Rose et
al., 2007; Rackham et al., 2010).
En metazoos, las proteínas con dominios coiled-coil juegan papeles
importantes en la organización y función del CSK, formando parte de los FIs,
Introducción
43
proteínas de unión a actina, y MAPs. Algunos ejemplos son las proteínas motores
(kinesina, dineína, dinactina, miosina), componentes del PNC y la lámina
(laminas), proteínas SMC, y proteínas de unión membrana-CSK y de andamiaje
como espectrina (Rose et al., 2005).
En plantas se han identificado subfamilias de kinesinas específicas de
plantas (Gardiner et al., 2011). FIs semejantes a queratina han sido
reensamblados in vitro. Estos filamentos de 10 nm de diámetro estaban
compuestos de protofilamentos de 3 nm de diámetro, con una repetición periódica
de 25 nm (Min et al., 1999). A partir de un extracto de proteínas de zanahoria
fueron reconstituidos filamentos de 10 nm y manojos largos de filamentos. Los
componentes principales de los filamentos reconstituidos fueron proteínas de
entre 58 y 62 kDa que también fueron inmunodetectados con anticuerpos contra
FIs (Hargreaves et al., 1989). Mediante análisis computacional se ha sugerido que
McCAP1 (M. crystallinum CDPK adapter protein 1) Mesembryantheum
crystallinum puede ser un FI (Patharkar y Cushman, 2006).
4.2. Proteínas coiled-coil del NSK
Además de las laminas que tienen en su dominio varilla cuatro regiones
coiled-coil (1A, 1B, 2A, 2B) (ver apartado 2.1.1 y Figura 3), NuMA involucrada en
la arquitectura nuclear es otra proteína que contiene dominios coiled-coil. NuMA
es un componente del NSK, similar a los FIs. Se caracteriza por: (i) contener un
dominio coiled-coil largo que facilita su ensamblaje en filamentos; (ii) formar
dímeros coiled-coil paralelos mediados por los extremos C-terminal, tanto in vivo
como in vitro; (iii) formar estructuras multibrazos de alto orden de organización;
(iv) ocupar la mayor parte del volumen nuclear; y (v) no detectarse en núcleos no
esféricos. Mediante ME con inmunomarcado con oro, NuMA se ha localizado en
un tipo de filamentos nucleares básicos en secciones sin resina de núcleos
extraídos (Zeng et al., 1994). Estas características hacen que NuMA sea un
candidato como componente esencial del NSK del núcleo post-mitótico, además
de su función en el ensamblaje y mantenimiento del huso mitótico (Rose y Meier,
2004; Radulescu y Cleveland, 2010).
Introducción
44
4.3. Proteínas coiled-coil del NSK de plantas
4.3.1. Proteínas similares a FIs específicas de plantas
Aunque los genes de laminas y NuMA de vertebrados no se han
encontrado en los genomas de Arabidopsis y arroz que están completamente
secuenciados (Rose y Meier, 2004; Rose et al., 2005), las células vegetales
parecen haber desarrollado proteínas específicas que constituyen sus NSKs, tales
como NIFs, NMCP1 y MFP1. Estas proteínas poseen dominios funcionales
similares a los FIs de animales y serían homólogos funcionales de las proteínas
correspondientes de vertebrados. En el NSK de células meristemáticas
radiculares de Allium se ha evidenciado una red de filamentos arrosariados y
ramificados, constituidos por una proteína inmunológicamente relacionada con
NuMA, una proteína coiled-coil relacionada con FIs (Moreno Díaz de la Espina,
1995; Yu y Moreno Díaz de la Espina, 1999; Moreno Díaz de la Espina y De la
Torre, 2008; Moreno Díaz de la Espina, 2009).
NMCP1 (descrita en el apartado 3.2).
MFP1 es otra proteína coiled-coil larga, conservada, específica de plantas,
que se localiza en el núcleo y cloroplasto (Samaniego et al., 2001; Samaniego et
al., 2006a,b; Samaniego et al., 2008). Esta proteína contiene un dominio N-
terminal con dos dominios hidrofóbicos conservados, un dominio varilla central
coiled-coil y un extremo C-terminal con un dominio de unión a ADN y una señal
NLS. Contiene además varios motivos para CK2 (Meier et al., 1996). La proteína
AcMFP1 es una fosfoproteína básica que se distribuye en la zona límite entre la
cromatina condensada y los dominios intercromatínicos. Su asociación con el
NSK está regulada por CK2. Su distribución, expresión y la modulación de su
unión con el NSK sugiere que MFP1 no es un componente básico del NSK
expandible sino que probablemente esté involucrada en la unión con la cromatina
(Samaniego et al., 2006a).
Proteínas semejantes a los FIs (con una masa molecular similar a la de
laminas animales) han sido localizadas en el núcleo (núcleoplasma y periferia),
matriz nuclear de zanahoria y en preparaciones nucleares de haba y guisante.
Para su identificación se ha usado el anticuerpo monoclonal IFA que reconoce a
Introducción
45
un epítopo presente en la mayor parte de los FIs de vertebrados e invertebrados
(Frederick, 1992), que es esencial para su dimerización (Herrmann et al., 2002).
4.3.2. Proteínas similares a laminas específicas de plantas
NMCP1 (revisar el apartado 3.2) ha sido descrita por primera vez en
Daucus carota, tiene una masa molecular de 134 kDa y un dominio coiled-coil
central, largo, semejante al de los FIs. Esta proteína está localizada en la periferia
nuclear, forma parte del NSK y migra hacia los polos del huso en células en
división, de forma similar a algunas proteínas coiled-coil de animales implicadas
en la organización del huso (Masuda et al., 1997; Kimura et al., 2010). En
Arabidopsis se ha descrito una familia génica (LINC) que muestra similaridad con
NMCP1, sus genes codifican proteínas que contienen dominios coiled-coil largos
conservados; dominios correspondientes a los extremos terminales globulares; y
dominios del extremo C-terminal muy conservado (con una señal NLS y motivos
de reconocimiento para proteínas kinasas). Sus mutaciones afectan al tamaño y
morfología nuclear, y a la distribución de la heterocromatina. Existen homólogos
de las proteínas LINC en Arabidopsis, Oryza, Populus y Physcomistrella.
Arabidopsis contiene dos homólogos de NMCP1: LINC1 y LINC2. Estos
resultados sugieren que las proteínas coiled-coil LINC son determinantes en la
estructura nuclear de las plantas (Dittmer et al., 2007). Los estudios en curso en
nuestro laboratorio han demostrado la existencia en Allium de una proteína
AcNMCP1 que presenta estructura coiled-coil y similaridad de secuencia con la
proteína de arroz aunque su tamaño es mayor. Se localiza en la EN e interior del
núcleo y es altamente insoluble formando parte del NSK. Su expresión está
regulada en los diferentes tejidos de la raíz siendo más abundante en células
meristemáticas (Ciska et al., 2011; y resultados sin publicar).
A partir de MNs aisladas de células meristemáticas de Allium se han
caracterizado proteínas que reaccionan con anticuerpos antilaminas de Xenopus
y pollo. Estas proteínas presentan valores de pI y masa molecular (60-65 kDa), y
distribución nuclear (periferia e interior nuclear, lámina y matriz interna) similares a
los de las laminas de vertebrados. Son reconocidas por IFA pero no por
anticuerpos contra FIs de plantas como AFB, anti-vimentina y MAC322
Introducción
46
(anticuerpo monoclonal anti-citoesqueleto de zanahoria, que reconoce a un
epítopo de citoqueratina 8 compartido por plantas superiores y animales)
(Mínguez y Moreno Díaz de la Espina, 1993; Moreno Díaz de la Espina, 1995). A
partir de MNs aisladas de células germinales de maíz se han caracterizado
proteínas parecidas a IFs del grupo laminas, una de ellas semejante a lamina C
de animales (Ivanchenko et al., 1993) (ver también el apartado 3.2).
4.3.3. Proteínas tipo filamentos intermedios nucleares (NIFs)
El núcleo de plantas además de las proteínas similares a las laminas
contiene otras proteínas semejantes a FIs específicas de plantas que podrían ser
componentes estructurales de la lámina como los NIFs (Blumenthal et al., 2004).
Al menos tres NIFs que comparten determinantes antigénicos con las laminas de
pollo, queratinas humanas y FIs han sido detectados en el NSK de Pisum sativum
L. (Blumenthal et al., 2004). Ellos tienen valores de masa molecular de 57, 60 y 65
kDa y presentan múltiples formas isoeléctricas con valores de pI entre 4,8 y 6,0.
El análisis de secuencias de péptidos demostró regiones cortas con similaridad
con laminas B y A que podrían explicar su reactividad cruzada con las queratinas
y con proteínas de Arabidopsis conteniendo dominios coiled-coils largos, tales
como NAC, FPP3 y MFP1 (Blumenthal et al., 2004), aunque estas proteínas
tienen valores de masas moleculares mayores a las de los NIFs de guisante. Los
NIFs purificados forman filamentos de 6-12 nm de diámetro in vitro. In situ se
distribuyen en el núcleo, tanto en la periferia como en el interior. Por ello se ha
postulado que los NIFs de las plantas aunque diferentes de las laminas animales
podrían contener regiones similares a las laminas y ser homólogos funcionales.
5. FAMILIA DE PROTEÍNAS ESPECTRINA
5.1. Estructura y función
La espectrina es el miembro prototípico de una superfamilia de proteínas
de unión a actina la cual incluye α-actinina, distrofina y utropina (Bennet y Baines,
Introducción
47
2001). El protómero de la espectrina es un αβ heterodímero muy largo, con dos
cadenas asociadas en forma antiparalela. Ambas cadenas están compuestas
predominantemente por repeticiones de espectrina (SpR) que son una sucesión
de secuencias repetidas homólogas de cerca de 106 aminoácidos y que tienen
una conformación parecida a manojos de tres hélices (Figura 8) (Djinovic-Carujo
et al., 2002; Li et al., 2008). En el extremo de la molécula dimérica
correspondiente al C-terminal de la cadena y N-terminal de la cadena hay
dominios no homólogos que contienen sitios de unión, inter alia, para oligómeros
Figura 8. Diagrama esquemático de la estructura del heterodímero de espectrina.
A. El heterodímero de espectrina se forma por la unión de la cadena de 240 kDa y la cadena de 220 kDa.
Ambas cadenas son flexibles y se enrollan entre sí antiparalelamente. Presentan un dominio central
homólogo compuesto por unidades repetidas de aproximadamente 106 aminoácidos conocidas como
repeticiones de espectrina (SpRs) y dominios no homólogos en los extremos. El tetrámero se forma por la
unión de dos dímeros mediante un C-terminal fosforilado de la cadena , y el N-terminal de la cadena , mide
entre 200 y 260 nm de longitud y entre 3 y 6 nm de ancho. B. Esquema de la estructura coiled-coil de las
repeticiones de espectrina SpRs. Se muestra un grupo de tres -hélices superenrolladas de las repeticiones
1, 2 y 3 con sus hélices individuales anidadas, según el modelo de repetidos anidados 3D, basado en el
modelo de Speicher y Marchesi. Las letras A, B, C, A’, B’, C’, A’’, B’’, y C’’ representan las hélices de cada
repetición individual a lo largo de la región coiled-coil. C. Diagrama de cinta de las repeticiones R2, R3, y R4
de -actinina alineadas con el esquema de arriba, demostrando que la estructura concuerda con el modelo.
Figuras tomadas de: Bennett, V., y Baines, A. J. (2001). "Spectrin and ankyrin-based pathways: metazoan
inventions for integrating cells into tissues." Physiol. Rev. 81: 1353-1392; Broderick, M. J. F., y Winder, S. J.
(2002). "Towards a complete atomic structure of spectrin family proteins." J. Struc. Biol. 137: 184-193.
Introducción
48
de actina y la proteína 4.1R. En el extremo opuesto hay motivos de las
repeticiones incompletos y complementarios, los cuales pueden asociarse con
otros para formar un tetrámero lineal que es el miembro estructural coiled-coil de
la red, responsable de la estabilidad y elasticidad de la membrana del eritrocito
(Zhang et al., 2001).
La cadena tiene una masa molecular de 281 kDa y 20 SpRs y la cadena
de 246 kDa y 17 SpRs. Las funciones que han sido atribuidas a los dominios
SpRs incluyen: 1) autoasociación; 2) asociación con varias proteínas estructurales
(actina, FIs) o reguladoras; 3) dirección hacia la membrana nuclear o hacia los
cuerpos PML; 4) regulación del transporte activo al interior del núcleo mediante la
secuencia NLS; y (5) soporte y estabilización molecular (Zhang et al., 2001).
Generalmente las proteínas con SpRs contienen en el extremo amino un
dominio de unión a actina del tipo CH (Li et al., 2008) que está compuesto por dos
dominios (CH1, CH2). Además estas proteínas también comparten otras regiones
conocidas como EF-hands, que son generalmente estructuras globulares,
involucradas en la coordinación de dos cationes divalentes, usualmente calcio y
ocasionalmente magnesio. Sin embargo, la evolución divergente ha llevado a la
generación de subseries de EF-hands que no quelan calcio, sino que tienen una
función alternativa, como ocurre en isoformas de -actinina en donde sirven
además para regular la unión con actina. Las espectrinas eritroides no se unen a
calcio directamente y su unión con actina es independiente de calcio, mientras
que algunas espectrinas no eritroides ligan calcio y su capacidad de unión con
actina es modulada por calcio (Broderick y Winder, 2002).
La región C-terminal de las proteínas con SpRs puede contener dominios
variados, tales como secuencias de localización de membrana tipo KASH
(syne/nesprina), secuencias de unión a -distroglicano (distrofina y utropina),
secuencias de unión a FIs (plectina, Bpag 1e y desmoplaquina), o secuencias de
unión a MTs (Bpag 1a/b y MACF). Las características estructurales de las
proteínas constituidas por SpRs son consistentes con su papel importante en la
regulación de la organización del CSK y como proteínas de unión a estructuras de
membrana (Young y Kothary, 2005).
La espectrina en eritrocito forma la red del CSK de membrana fundamental
para la organización y mantenimiento de la integridad estructural de la membrana
Introducción
49
y de la forma celular. En células no eritroides tiene funciones más complejas;
además de proveer soporte a la membrana está implicada en el agrupamiento de
proteínas, tráfico de vesículas y orgánulos, generación de neuritas y liberación de
neurotransmisores (Bennett y Baines, 2001). Recientemente se ha investigado la
interacción de la espectrina con un motivo del receptor de laminina (Lu/BCAM),
interacción que estaría involucrada en la formación de fibras de estrés en donde
la espectrina actúa como una señal entre la laminina y la actina, involucrada en la
dinámica de actina (Collec et al., 2011).
Las espectrinas son los componentes principales del CSK de la membrana
de eritrocito. Las espectrinas en mamíferos son codificadas por siete genes, dos
codifican -espectrinas (I y II) y cinco codifican -espectrinas (de I a V)
(Bennett y Baines, 2001). Las espectrinas forman una estructura única de
tetrámeros (II)2 en eritrocitos. El gen de I-espectrina es expresado en
eritrocitos y el de II-espectrina es mayoritariamente expresado en las células
nucleadas de vertebrados (Cianci et al., 1999; Young y Kothary, 2005).
Las proteínas de la familia de las espectrinas están presentes en el CSK de
células eucariotas, comprenden principalmente -actinina, espectrina, distrofina,
sus homólogos e isoformas. Estas proteínas están involucradas en la
organización del esqueleto de actina; arquitectura del CSK de membranas;
adhesión celular, y organización del CKS de la membrana del eritrocito. También
existen en células no eritroides, tanto en vertebrados como en invertebrados, y en
núcleos de células de mamífero (Sridharan et al., 2006).
5.2. Espectrinas nucleares
Aunque la superfamilia de proteínas constituidas por SpRs (por ejemplo,
distrofina, -actinina y la misma espectrina), están asociadas al CSK e
involucradas en el establecimiento y mantenimiento de la estructura celular,
algunas de estas proteínas han sido identificadas en el núcleo y EN. Por su gran
tamaño y potencialidad para interaccionar con proteínas variadas y con la
cromatina, las espectrinas representan posibles candidatas como proteínas
organizadoras nucleares (Young y Kothary, 2005).
Introducción
50
Se han identificado varios miembros de la superfamilia de las espectrinas
en el núcleo de mamíferos. La -espectrina detectada en la EN y en gránulos
intranucleares. La -espectrina II (-SpecII) nuclear que se asocia con las
proteínas Smad y de esta manera se transportan hacia el núcleo. La isoforma
SpIV5 (forma truncada de la -espectrinaIV1) está constituida casi
exclusivamente de dominios SpRs y está asociada con los cuerpos PML y la
matriz nuclear (Tse et al., 2001, Young y Kothary, 2005).
La -espectrina II no eritroide (-SpII) está involucrada en la reparación
del ADN, posiblemente formando parte del NSK, actuando como plataforma para
las proteínas de reparación del ADN. Se ha demostrado la interacción de esta
proteína con múltiples proteínas nucleares de células humanas, clasificadas en
cinco grupos funcionales: proteínas estructurales [lamina A, actina, emerina,
proteína 4.1, -espectrina (SpIV-5)]; proteínas implicadas en la reparación del
ADN (XPA, XPB, XPF, ERCC1); proteínas implicadas en la remodelación de la
cromatina (actina, BRG1, hBRM, y CSB); proteínas de la anemia de Fanconi
(FANCA, FANCC, FANCD2); y proteínas que juegan un papel importante en la
transcripción y procesamiento del ARN (P40, hnRNP A2/B1, PML) (Sridharan et
al., 2006). Estos resultados sugieren que la -espectrina II además de formar una
red extensa en el núcleo (en asociación con otras proteínas) también está
implicada en los procesos de remodelación de la cromatina, reparación del ADN y
transcripción y procesamiento del ARN.
Otras proteínas que contiene SpRs y sitios de unión a calcio son las
nesprinas (Zhang et al., 2001 y 2002), cuyas funciones exactas se desconocen,
pero parecen jugar un papel en la organización e integridad nuclear (Zhong et al.,
2010). Se asocian con la MNI y MNE, y están involucradas en el anclaje del
núcleo a la actina del CSK, mediante su unión a las proteínas con dominios SUN
de la MNI y forman el complejo LINC que une al CSK con el NSK (Crisp, 2006;
Tzur, 2006; Dahl, 2008, Starr y Fridolfsson, 2010; Mellad et al., 2011). La
Nesprina-1, Nesprina-2, y Nesprina-3, han sido detectadas en mamíferos (Lüke et
al., 2008) y en el pez cebra (Danio rerio) (Postel et al., 2011).
Introducción
51
5.3. Espectrina en plantas
En los genomas de Saccharomyces cerevisiae y Arabidopsis thaliana no
existen genes de espectrina, así como tampoco en secuencias genómicas de Zea
mays. Esta proteína podría haber evolucionado en los metazoos simples después
de la divergencia de las plantas y hongos (Bennett y Baines, 2001).
Aunque en la base de datos del genoma de Arabidopsis significativamente
se han detectado secuencias de proteínas con dominios SpR y CH en el dominio
N-terminal, relacionadas con los miembros de la superfamilia de proteínas
calponina-espectrina, ninguna de ellas son ortólogos claros (Meagher y
Fechheimer, 2003; Young y Kothary, 2005 ). Sin embargo, se han detectado
proteínas inmunológicamente relacionadas con espectrina en varias especies y
tejidos de plantas (Michaud et al., 1991; De Ruijter et al., 1998). En el núcleo de
guisante se han detectado proteínas similares a espectrina de 220-240 y 60 kDa
(De Ruijter et al., 2000) mediante inmunomarcado.
5.3.1. Proteínas vegetales inmunológicamente relacionadas con espectrina
Existen numerosos estudios de localización de proteínas semejantes a
espectrina en el citoplasma de células vegetales.
En el alga Chlamydomonas reinhardhi se han encontrado péptidos que
reaccionan con anticuerpos anti-cadenas y de espectrina de eritrocito,
mediante análisis de inmunodetección en membrana y microscopía de
inmunofluorescencia (Bisikirsha et al., 1995). También, se ha demostrado la
presencia de proteínas similares a espectrina en desmidiáceas. En las algas
verdes Micrasterias denticulata, Closterium lunula, y Euastrum oblongum,
mediante detección inmunoquímica usando anticuerpos anti-espectrina de
eritrocito de pollo y humano, se detectó reactividad cruzada en bandas proteicas
con diferentes masas moleculares: 220 kDa, 120 kDa y 70 kDa. Usando el
anticuerpo anti--actinina (proteína pequeña de la superfamilia espectrina) de
pollo, se reconocieron bandas de 90 kDa y 70 kDa. El inmunomarcado con oro de
los antígenos espectrina y -actinina demostró tinción especialmente en las
membranas de diferentes poblaciones de vesículas secretoras, dictiosomas, y
Introducción
52
membrana plasmática (Holzinger et al., 1999).
El análisis electroforético de extractos de hojas de tomate, obtenidos en
condiciones de baja fuerza iónica reveló la presencia de dos proteínas de masa
molecular de 240 kDa y 220 kDa que co-migraron con las subunidades - y -
espectrina purificadas de eritrocito humano. Por análisis inmunoquímico con un
anticuerpo policlonal contra -espectrina de eritocito humano se detectó una
proteína de 220 kDa en las células vegetales. La microscopía de
inmunofluorescencia indicó que el anticuerpo anti--espectrina reconocía a un
antígeno restringido principalmente a las áreas periféricas de las células. Estos
datos sugieren que las plantas superiores contienen polipéptidos relacionados con
proteínas de la familia espectrina, reforzando la propuesta de que las células
vegetales poseen un esqueleto de membrana, que podría ser estructuralmente y
quizá funcionalmente análogo al de las células animales (Michaud et al., 1991).
Los estudios para investigar la presencia de un esqueleto de membrana en
plantas superiores revelaron un polipéptido similar a espectrina, en una fracción
enriquecida en membranas plasmáticas de células de raíz de arroz. El análisis de
la fracción mediante PAGE-SDS reveló polipéptidos de masa molecular mayor de
100 kDa y uno de 230 kDa fue reconocido específicamente por anticuerpos
policlonales contra espectrina de eritrocito humano (Michaud et al., 1991).
En varios tejidos y estados de desarrollo de varias especies de plantas
(protoplastos de patata, embriones somáticos de zanahoria, embriones cigóticos
de maíz y puntas de raíz de maíz y haba) se ha detectado espectrina mediante
inmunocitoquímica, usando dos anticuerpos policlonales producidos contra
eritrocitos de pollo y humano. La reactividad era débil con el anticuerpo en las
bandas proteicas de 220 kDa, pero fuerte en las bandas de 85 kDa, cuyo punto
isoeléctrico era similar al de la espectrina animal purificada. En la mayoría de las
células el marcado fue localizado predominantemente en la membrana
plasmática, especialmente en células de pared delgada. El marcado fue
observado también en la periferia de una clase particular de orgánulos,
probablemente plastidios. El marcado fue específico de tejido en embriones
somáticos de maíz. Dependiendo del estado de desarrollo, durante la
embriogénesis somática de zanahoria se observó marcado citoplasmático.
Introducción
53
Muchas células con marcado citoplasmático también tenían los núcleos teñidos
(De Ruijter et al., 2000).
Para investigar si la espectrina es un componente del esqueleto de la
membrana de células vegetales se ha estudiado en guisante la capacidad de
interacción de las proteínas semejantes a espectrina de plantas (reconocidas
mediante reacción cruzada con anticuerpos dirigidos contra - y -espectrina) con
otras proteínas constituyentes del esqueleto de membrana como anquirina, F-
actina y calmodulina. Los resultados demostraron que un polipéptido de masa
molecular alto fue reactivo con el anticuerpo anti--espectrina y se une con
calmodulina de una manera dependiente de calcio. Otros complejos proteicos
interaccionaron con F-actina muscular (co-sedimentación) y con anquirina (ELISA)
(Bisikirsha y Sikorski, 1997).
En células vivas de cebolla se ha efectuado co-visualización de proteínas
similares a integrina, espectrina, actina, IFs y otras proteínas en la membrana
celular y endomembranas (Reuzeau et al., 1997).
5.3.2. Proteínas nucleares semejantes a espectrina en plantas
En 1993 De Ruitjer y Emons obtuvieron datos preliminares acerca de la
presencia y localización de epítopos similares a espectrina, en núcleos de plantas
(De Ruitjer y Emons, 1993). Posteriormente el mismo grupo (De Ruijter et al.,
2000) analizó la presencia y localización de proteínas similares a espectrina en
núcleos de varios tejidos de guisante, usando varios anticuerpos anti-espectrina
de eritrocito. Mediante separación de proteínas por PAGE-SDS los núcleos
presentaron un par de bandas proteicas de 220-240 kDa, típicas de la espectrina
de eritrocito humano, que reaccionaron con los anticuerpos, y una banda proteica
prominente de 60 kDa. La inmunolocalización mediante microscopia de barrido
laser confocal en células enteras reveló proteínas similares a espectrina en el
núcleo, matriz nuclear, periferia nuclear, pero no en el nucleolo.
Introducción
54
Objetivos
55
OBJETIVOS
El objetivo principal de esta tesis doctoral es la identificación y
caracterización de proteínas coiled-coil en el núcleoesqueleto de la planta
monocotiledónea Allium cepa L. var. francesa, concretamente proteínas
semejantes a espectrina y a filamentos intermedios nucleares (NIFs). Para ello se
establecieron los siguientes objetivos concretos:
1. Identificación y caracterización de las proteínas semejantes a espectrina en el
núcleo de Allium cepa.
2. Análisis de la distribución nuclear de las proteínas semejantes a espectrina en
Allium cepa.
3. Determinación de la asociación de las proteínas semejantes a espectrina con el
NSK.
4. Análisis de las secuencias peptídicas de las proteínas nucleares semejantes a
espectrina de Allium cepa y de su conservación en relación con las proteínas de
la superfamilia de espectrinas mediante espectroscopía de masas.
5. Investigación de la capacidad de asociación de las proteínas nucleares
semejantes a espectrina con actina en el núcleo de Allium cepa.
6. Identificación y caracterización de proteínas homólogas a p65 NIFs de Pisum
sativum en el núcleo de Allium cepa mediante sueros específicos contra esta
proteína.
7. Análisis de la distribución nuclear de la proteína p65 NIF en Allium cepa.
8. Investigación de la asociación de la proteína p65 NIF con el NSK en Allium
cepa.
Objetivos
56
9. Comparación de la proteína p65 NIF de Allium cepa con las láminas
previamente descritas en este sistema.
10. Análisis de la interacción entre las proteínas semejantes a espectrina y p65
NIF en el núcleo de Allium cepa.
Material y métodos
57
MATERIAL Y MÉTODOS
I. Material
1. Material biológico
Se utilizaron células del meristemo radicular de bulbos de Allium cepa L var.
francesa. Como control en el análisis de las proteínas NIF se usaron células
meristemáticas de raíces de semillas de Pisum sativum L. var. dédicace. Como
control en los estudios de la espectrina se usaron eritrocitos de sangre de conejo
Albino Neozelandés.
1.1. Métodos de cultivo
1.1.1. Cultivo de bulbos de Allium cepa L. var. francesa.
100 bulbos de Allium cepa L. var. Francesa desprovistos de las capas protectoras
y de los residuos de raíces secas fueron lavados bajo el flujo de agua de grifo
durante 20 min y colocados en tubos de vidrio cilíndricos (3,5x11 cm) con la
corona radicular inmersa en agua de grifo a temperatura ambiente durante 72 h.
El agua fue renovada cada 24 h.
1.1.2. Germinación de semillas de Pisum sativum L. var. dédicace
200 gr de semillas de Pisum sativum L. var. dédicace lavadas con agua de grifo
fueron remojadas durante 16 h y mantenidas dentro de cajas de petri de vidrio
(200X30 mm) sobre discos de papel Whatman (3MM Chr 3030917) humedecidos
durante 48 h a temperatura ambiente.
1.2. Anticuerpos
1. Anticuerpos policlonales (IgG de ratón) PL1, PL2, PL3, y PL4 producidos contra
Material y métodos
58
una proteína de tipo filamento intermedio nuclear (NIF) de 65 kDa de Pisum
sativum L., cv. Early Alaska. Estos anticuerpos fueron proporcionados por la Dra.
Sonal S. D. Blumenthal de la Molecular Cell and Development Biology Section,
School of Biologycal Sciences. University of Texas, Austin. USA. Al igual que los
sueros preinmunes correspondientes (Blumenthal et al., 2004).
2.- Anticuerpo monoclonal IFA que es un anticuerpo que reconoce a un epítopo
muy conservado presente en la mayor parte de las proteínas de tipo FIs de
vertebrados e invertebrados esencial para su polimerización (Pruss, 1985;
Hermann et al., 2000) proporcionado por el Dr. D. Fairbairn del John Innes Centre
(JIC). Reino Unido.
3. Anticuerpo policlonal (IgG de conejo) S1390 (Sigma), producido contra la
espectrina de pollo, que reconoce las cadenas y de la espectrina de eritrocitos
de pollo (Sigma S1390) y es reactivo en plantas (De Ruijter et al., 2000).
4. Anticuerpo monoclonal (IgG1 de ratón) MAB1622 (Chemicon, International)
específico para la -espectrina no eritrocítica de mamíferos y pollo, que reconoce
la -espectrina nuclear (Sridharan et al., 2006).
5. Anticuerpos anti-actina que reconocen la actina nuclear en Allium cepa:
5.1. Anticuerpo monoclonal (IgG1 de ratón) AC-15 producido contra el péptido N-
terminal (ligeramente modificado) de -actina citoplasmática humana (Sigma),
reactivo en Allium cepa (Cruz y Moreno Díaz de la Espina, 2009).
5.2. Anticuerpo monoclonal (IgG2b de ratón) ACTB21-M (Alpha Diagnostic
International) que reconoce todas las formas vegetativas de actina en
Arabidopsis.
II. MÉTODOS
1. Recolección de meristemos apicales radiculares
Cuando las raíces de los bulbos cultivados alcanzaron los 2-3 cm de largo fueron
cortados los segmentos de 2-3 mm correspondientes a los meristemos, los cuales
fueron recolectados en una caja de petri colocada sobre hielo y conteniendo 5 ml
de medio de aislamiento de núcleos [MAN: Goma arábiga (Sigma G9752) 2%,
Material y métodos
59
Ficoll PM 400 (Sigma 4375) 1,25%, Dextran (Sigma 31387) 2,5%, EDTA disódico
0,5 mM, Tris/HCl 25 mM (pH 7,8), acetato de magnesio 50 mM, n-octanol 4 mM,
DEPEC 6,8 mM, glicerol 30%] suplementado con -mercaptoetanol 8 mM, PMSF
1,2 mM, DTT 20 mM y 33 l de cóctel inhibidor de proteasas (Sigma P9599) por
gramo de meristemos. Los meristemos fueron troceados y perfundidos con medio
nuevo desgasificado bajo presión de 80 KPa en una cámara de vacío durante 30
min.
2. Obtención y purificación de núcleos
Las células de los meristemos radiculares fueron rotas mecánicamente usando un
homogenizador Ultra-Turrax IKA T25 digital con dispersor (IKA S25-10G) y
velocidad del pistón de 18.000 rpm. Se aplicaron tres pulsos de 10 s con
intervalos de 10 s en baño de hielo. El homogenizado fue filtrado a través de
cuatro membranas de nylon con diferentes tamaños de poro (dos de 100 m, una
de 50 m y una de 30 m). El filtrado fue centrifugado a 2.500 rpm en una
centrifuga refrigerada Universal 32R (Hettich) durante 15 min a 4ºC. El sedimento
de núcleos fue lavado con medio MAN hasta la obtención de un sobrenadante
transparente. La limpieza e integridad de los núcleos teñidos con verde de metilo
(Sigma M 6776) se controló al microscopio hasta que aparecieron libres de
desechos celulares (Samaniego et al., 2006, Figura 9). Una vez conseguido el
grado de pureza óptimo los núcleos aislados se utilizaron inmediatamente para la
obtención de otras fracciones, se procesaron para el análisis de proteínas,
microscopía, o se conservaron a -28ºC en medio MAN conteniendo 30% de
glicerol.
3. Extracción de matrices nucleares
Se utilizó el procedimiento habitual del laboratorio con ligeras modificaciones
(Samaniego et al., 2006a; Pérez-Munive y Moreno Díaz de la Espina, 2011). Las
proteínas nucleares fueron extraídas secuencialmente con Tritón X-100 0,5%,
Benzonasa 20 U, (NH4)2SO4 1M y NaCl 2M, obteniendo las fracciones proteicas
solubles S1, S2 y S3 respectivas, y las fracciones proteicas de los núcleos
Material y métodos
60
residuales F1, F2 y F3 (Tabla 2). La fracción F3 contiene las proteínas insolubles
que forman el NSK o MN. El sobrenadante S3 contiene las proteínas unidas
fuertemente al NSK, S2 las proteínas asociadas con ácidos nucleicos y S1 las
proteínas solubles y asociadas con la membrana nuclear.
Tabla 2. Fraccionamiento proteico nuclear por solubilización diferencial para la obtención
de matrices nucleares
Proceso de extracción Fracción nuclear
Resuspender 0,06 gr de Ns en 600 l de TC
suplementado con Tritón X-100 0,5%, DTT 20 mM, PMSF
1,2 mM, 2 l de cóctel antiproteasas. Incubar 15 min/4ºC.
Centrifugar a 2.500 rpm/10 min/4ºC.
S1: sobrenadante conteniendo proteínas
solubles y asociadas con membrana.
F1: sedimento conteniendo proteínas de Ns
residuales sin las proteínas de S1.
Resuspender F1 en 600 l de TD suplementado con DTT
20 mM, PMSF 1,2 mM y Benzonasa 20 U. Incubar 30
min/4ºC. Extraer con (NH4)2SO4 0,25 M, 15 min/4ºC.
Centrifugar a 3.000 rpm/10 min/4ºC.
S2: sobrenadante conteniendo proteínas
asociadas con ácidos nucleicos
F2: sedimento conteniendo proteínas de Ns
residuales sin las proteínas de S1 y S2.
Resuspender F2 en 400 l de TD suplementado con DTT
20 mM, PMSF 1,2 mM. Extraer con NaCl 2M, 15 min/4ºC.
Centrifugar a 3.500 rpm/10 min/4ºC.
S3: sobrenadante conteniendo proteínas
fuertemente asociadas al NSK
F3: sedimento conteniendo proteínas del
NSK sin las proteínas de S1, S2 y S3.
Ns: núcleos
TC (Tampón de CSK): 10 mM PIPES (pH 6,8), 100 mM KCl, 300 mM sacarosa, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA
TD (Tampón de digestión): 10 mM PIPES (pH 6,8), 50 mM KCl, 50 mM NaCl, 300 mM sacarosa, 3 mM MgCl2, 1 mM
EGTA
Los protocolos usados para la recolección de meristemos, obtención y purificación
de núcleos, y extracción de matrices de Pisum sativum L. var. dédicace fueron los
mismos que fueron usados para Allium cepa.
4. Análisis de proteínas
4.1. Preparación de las muestras
Las proteínas de los sobrenadantes S1, S2 y S3 fueron precipitadas con ácido
tricloroacético (TCA), se añadió el TCA necesario para obtener una concentración
final del 10% y se dejó precipitar durante 30 min en hielo. El sedimento
precipitado fue centrifugado a 11.000 rpm, 5 minutos a 4ºC. Para la eliminación
del TCA residual el sedimento se lavó 3 veces (incubando 5 min en hielo) con una
Material y métodos
61
solución de etanol-eter 1:1 (v/v) preenfriado a -20ºC.
Las proteínas precipitadas al igual que las proteínas de las fracciones F1, F2 y F3,
y de los núcleos íntegros fueron disueltas en tampón de muestra (TM) 2X (Tris-
HCl 0,125 M (pH 6,8), SDS 4%, 2-mercaptoetanol 10%, glicerol 20%, azul de
bromofenol 0,002%). Las muestras mantenidas en baño de hielo fueron
disgregadas con 3 pulsos de 5 seg cada uno (e intervalos de 5 seg) y 40 Watts de
fuerza ultrasónica usando un sonicador Branson Sonifier 150 y una micropunta de
alta intensidad de 3,2 mm de diámetro. Las proteínas de las muestras fueron
desnaturalizadas calentando a 95ºC durante 5 min. Después las muestras fueron
atemperadas y centrifugadas a 11.000 rpm durante 1 min a temperatura
ambiente. Los sobrenadantes fueron usados para electroforesis desnaturalizante
(SDS-PAGE) monodimensional. Para la cuantificación de la concentración de
proteínas totales, alícuotas de las proteínas precipitadas de las fracciones S1, S2,
y S3; de los sedimentos de las fracciones F1, F2 y F3; y de núcleos íntegros
fueron disgregadas y desnaturalizadas de la misma forma pero usando el tampón
para cuantificación de proteínas [TCP: Tris HCl 0,05 M (pH 7,4), NaCl 0,05 M,
EDTA 0,001 M, Triton X-100 1%, SDS 0,1%].
4.2. Cuantificación de la concentración de proteínas
La cantidad de proteínas totales de las muestras fue cuantificada por el método
de Bradford.
Se elaboró una curva estándar de concentración de proteínas [graficando
concentraciones de albúmina sérica bovina (Sigma A1516) en un rango de 20 a
400 g/ml versus absorbancia]. 20 l de cada una de las soluciones de albúmina
y 20 l de NaCl 0,15 M (usado como “blanco” de la curva estándar) fueron
mezclados con 980 l de reactivo de Bradford diluido 5 veces (Bradford Protein
Assay Reagent 5X concentrate Bio Rad 500-0006) e incubados durante 5 min. La
absorvancia fue medida en un espectrofotómetro Spectronic 2000 (Bausch &
Lomb) a 595 nm de longitud de onda, calibrando el aparato a cero con el blanco.
Posteriormente 5 l de las muestras y 5 l del tampón TCP (usado como “blanco”
de las muestras) fueron mezclados con 995 l de reactivo de Bradford e
incubados durante 5 min, midiendo la absorbancia a 595 nm de longitud de onda,
Material y métodos
62
calibrando a cero con el blanco. La cantidad de proteínas totales de las muestras
fue calculada interceptando su absorbancia en la curva estándar de concentración
de proteínas.
4.3. Electroforesis monodimensional en geles de poliacrilamida y dodecil
sulfato sódico (SDS-PAGE)
La electroforesis desnaturalizante con SDS y geles de poliacrilamida se realizó en
una cubeta Mini-Protean II (BioRad) para geles verticales (11 cm de largo X 7,5
cm de ancho). Una concentración promedio de 20 g de proteínas totales
(disueltas en TM 2X) de las muestras de núcleos o de las fracciones nucleares
fueron depositadas en los pocillos del gel de concentración (4% de poliacriamida)
usando puntas para electroforesis (Bio-Rad, 223-9915). También fueron
depositados en otro pocillo 8 l de solución de proteínas de masa molecular
conocida (Estándares de masa molecular, BioRad 161-0374). Las proteínas
fueron separadas en función de su tamaño en el gel de separación (7% de
poliacrilamida), utilizando el tampón de corrimiento electroforético (TCE: Tris
0,025 M, Glicina 0,192 M, SDS 0,1%) y aplicando un voltaje constante de 60 V
durante 30 min para el corrimiento a través del gel de concentración y 120 V
durante 90 min para el corrimiento a través del gel de separación, a temperatura
ambiente.
4.4. Lisis nuclear
Para la obtención de un extracto crudo nuclear utilizado para el análisis de
proteínas por electroforesis bidimensional e inmunoprecipitación, los núcleos
(0,06 grs) fueron resuspendidos en 500 l de tampón de lisis de baja fuerza iónica
[TL: Tris HCl 0,05 M, (pH 7,4), NaCl 0,05 M, EDTA 0,001 M, Triton X-100 1%,
SDS 0.1%, glicerol 10%, conteniendo DTT 0,001 M y 2 μl del cóctel inhibidor de
proteasas (Sigma P9599)] e incubados 15 min en agitación (10 rpm) usando un
Rotator SB3 (Stuart) a 4ºC. El lisado nuclear libre de núcleos fue incubado con 20
U de Benzonasa (Sigma Aldrich 1014) durante 30 min a 4ºC y centrifugado a
10.000 rpm durante 1 min a 4ºC. La cantidad de proteínas totales del lisado
Material y métodos
63
nuclear fue cuantificada por el método de Bradford como se describe en el
apartado 4.2.
4.5. Electroforesis bidimensional
Las proteínas de los extractos proteicos nucleares fueron precipitadas por el
método de cloroformo-metanol (Wessel y Flügge, 1984) y resuspendidas en 140
l de tampón de rehidratación [TR: urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS 4%, DTT 18,2
mM y azul de bromofenol 3 μg/ml, y anfolitos 0.5% pH 3,5-10 (Bio-Rad)].
Las proteínas fueron separadas en la primera dimensión o isoelectroenfoque (IEF)
mediante un sistema Protean-IEF Cell (Bio-Rad) usando tiras de poliacrilamida
con gradientes de pH 4-7 inmovilizados (IPGs) (Bio-Rad) de 4 cm de largo. Las
tiras fueron cargadas con la muestra proteica, y rehidratadas activamente con 50
V durante 12 h a 20ºC. El IEF se desarrolló a una temperatura constante de 20ºC,
aplicando 250 V durante 15 min; 1.000 V durante 1 h; 8.000 V durante 1 hora; y
12.000 V durante 1 h.
Tras el IEF las tiras se equilibraron en 2 ml de tampón de equilibrio [TE: Tris-HCl
50 mM (pH 8,8), urea 6 M; SDS 2%; glicerol 30%; conteniendo DTT 50 mM]
durante 15 min, y luego en 2 ml de TE conteniendo iodoacetamina 130 mM
durante 15 min. Las tiras se colocaron sobre geles de poliacrilamida al 7% junto
con los mismos marcadores de masas moleculares, y el corrimiento
electroforético desnaturalizante fue realizado mediante SDS-PAGE estándar.
Tras el corrimiento de las proteínas en segunda dimensión, éstas fueron
transferidas a membranas para inmunodetección o fijadas con una solución de
50% de etanol y 30% de ácido acético, y teñidas con SYPRO-Ruby (Bio-Rad)
siguiendo las especificaciones del fabricante.
4.6. Inmunodetección en membrana
Para la caracterización inmunológica de las proteínas y la determinación de sus
masas moleculares, éstas después de su separación mediante SDS-PAGE fueron
unidas (mediante interacciones electroestáticas e hidrofóbicas) a membranas de
nitrocelulosa (Whatman, Protan 0,45 mm) previamente remojadas en agua y
Material y métodos
64
equilibradas en tampón de transferencia (TT: Tris 0,05 M, glicina 0,2 M, SDS
0,1%, metanol 20%). La transferencia se realizó en un módulo de transferencia
MiniTrans-Blot en una cubeta Mini-Protean II (BioRad) para geles de 7,5 X 10 cm,
aplicando un voltaje constante de 100 V durante 1 h a 4ºC. La transferencia de las
bandas proteicas a la membrana fue controlada tiñendo las bandas
reversiblemente con rojo Ponceau-S (Sigma P7170).
Las membranas fueron lavadas con agua bidestilada y equilibradas con tampón
PBS-T (Tampón PBS: NaCl 0,14 M, KCl 0,0027 M, KH2PO4 0,00176 M, Na2HPO4
0,01 M, ajustado a pH 7,4 con NaOH, suplementado con 0,05% de Tween-20)
durante 10 min, con agitación de 60 rpm en un Roker 25 (Labnet International,
Inc.). Después fueron bloqueadas con leche en polvo desnatada disuelta al 5% en
PBS-T e incubadas 1 h a temperatura ambiente o toda la noche a 4ºC con
agitación. Tras eliminar la solución de bloqueo fueron lavadas dos veces con
PBS-T durante 5 min a temperatura ambiente con agitación. Las membranas
fueron incubadas con el anticuerpo primario (diluido en PBS-T) durante 2 h a
temperatura ambiente en agitación y lavadas 3 veces con PBS-T durante 10 min
con agitación. Los anticuerpos primarios usados fueron: anticuerpo policlonal IgG
de conejo S1390 (34 μg/ml), anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón MAB1622 (2
g/ml), anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón ACTB21 (1,25 μg/ml), anticuerpo
policlonal IgG de ratón PL3 (1:8.000) y anticuerpo policlonal IgG de ratón PL4
(1:8.000). Los anticuerpos primarios unidos a las proteínas de la membrana
fueron identificados incubando la membrana con anticuerpos secundarios
(conjugados con peroxidasa) específicos contra la clase de inmunoglobulina y
especie animal del anticuerpo primario. Los anticuerpos secundarios usados
fueron: el anticuerpo IgG de oveja anti-IgG de ratón (Amersham) y el anticuerpo
IgG de asno anti-IgG de conejo (Amersham). Las membranas fueron incubadas
con el anticuerpo secundario (diluido 1:5.000 en PBS-T) durante 1 h a
temperatura ambiente en agitación y lavadas 3 veces con PBS-T durante 10 min
en agitación. La peroxidasa (conjugada a los anticuerpos secundarios) en
presencia de H2O2 y en condiciones alcalinas cataliza la oxidación del luminol, el
luminol al decaer del estado excitado al basal emite luz que es aumentada por el
sistema de detección de quimioluminiscencia (ECL Amersham). Para ello las
membranas fueron incubadas con una solución de los reactivos ECL mezclados
Material y métodos
65
1:1 (v/v) durante 1 min a temperatura ambiente en oscuridad. Después de eliminar
el exceso de reactivos ECL las membranas fueron cubiertas con plástico
transparente y con una película autoradiográfica (Kodak XAR-5 853 2665) durante
períodos cortos de tiempo (5-30 seg o 1-5 min).
Fueron realizados controles de reactividad negativa de los anticuerpos
secundarios contra las proteínas de las muestras, incubando las membranas con
los anticuerpos secundarios, sin los primarios o con los sueros preinmunes en su
caso.
Los valores de las masas moleculares de las bandas proteicas inmunodetectadas
fueron calculados usando 6 o 7 estándares de masa molecular conocida (250,
150, 100, 75, 50, 37 y 25 kDa, BioRad 161-9915) y el programa Quantity One 1-D
Analysis Software (Bio-Rad), seleccionando el método de regresión de Elder-
Southern y realizando al menos tres experimentos distintos.
4.7. Inmunoprecipitación
Para la formación de un complejo inmune, 500 l de lisado nuclear (350 g de
proteínas totales) y 2 μl de anti- espectrina S1390 (272 g) y/o 200 l de anti-
espectrina MAB1622 (20 g) fueron incubados durante 2 h en agitación de 60 rpm
en un Roker 25 (Labnet International, Inc.) a 4ºC.
Las proteínas del lisado reconocidas por los anticuerpos que pudieran estar
interaccionando con una o más proteínas formando un complejo proteico fueron
precipitadas con 25 μl de una suspensión de proteína A inmovilizada en agarosa
(Roche 11719408001) que previamente fue centrifugada a 6.000 rpm durante 20
seg y el sedimento fue lavado y resuspendido en TL. La mezcla fue incubada
durante 2 h en agitación a 4ºC y posteriormente centrifugada a 12.000 rpm
durante 1 min a 4ºC. El complejo inmunoprecipitado fue lavado tres veces con TL
(sin SDS, DTT y cóctel inhibidor de proteasas) y resuspendido en 150 l de TM
2X. La suspensión fue calentada 5 min a 95ºC, atemperada y centrifugada a
12.000 rpm durante 1 min. El sobrenadante fue usado para el análisis de
inmunodetección con los anticuerpos primarios S1390 (34 μg/ml), 1622 (2 g/ml),
ACTB21 (1,25 μg/ml), PL3 (1:8.000) y PL4 (1:8.000). Fueron realizados controles
Material y métodos
66
omitiendo el anticuerpo usado para la inmunoprecipitación o usando 5 g de IgG
(de conejo o ratón) purificada para la inmunoprecipitación.
La espectrina también fue inmunoprecipitada a partir de eritrocitos de conejo
Albino Neozelandés. 10 ml de sangre fueron diluidos con solución de heparina
(SH: heparina 0,01%, HEPES 5 mM, Cloruro de colina, pH 7,1) y centrifugados a
3.500 rpm, durante 5 min a 4ºC. Los eritrocitos fueron lavados 5 veces con SH sin
heparina, a 4ºC y resuspendidos en solución de lisis hipotónica [SLH: Tris-HCl
0,005 M (pH 7,5), NaN3 0,005 M, MgCl2 0,005 M, EGTA 0,001 M, DTT 0,001 M,
PMSF 0,005 M]. El lisado fue centrifugado a 10.000 rpm durante 5 min a 4ºC y el
sedimento fue lavado 3 veces con 10 volúmenes de SLH y pasado a través de
una aguja hipodérmica del número 23 doblada en forma de Z. Después de
centrifugar a 3.500 rpm durante 15 min se recuperó el sobrenadante conteniendo
proteínas solubles y fragmentos de membranas (la fase intermedia con
estructuras no fragmentadas fue pasada nuevamente a través de la aguja)
(Granger et al., 1982). Todos los sobrenadantes fueron juntados, mantenidos a
4ºC y usados para la determinación de la concentración de proteínas proteínas e
inmunoprecipitación de espectrina.
4.8. Identificación de proteínas mediante mapeo de masas peptídicas por
espectrometría de masas
Las bandas peptídicas separadas por SDS-PAGE fueron analizadas usando un
sistema de separación por cromatografía de líquido de alta resolución de fase
reversa (RP-HPLC) acoplado a un sistema de espectrometría de masas (MS) LTQ
Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific).
Las bandas proteicas en los geles fueron cortadas. Las proteínas fueron digeridas
con tripsina y los péptidos fueron extraídos y posteriormente separados usando
un sistema RP-HPLC y un sistema de nanoflujo LC-MS/MS. Los péptidos fueron
corridos en una columna de fase reversa (Easy-Column C18, Proxeon) y luego
eluidos con un gradiente lineal de acetonitrilo (2 a 90%) en solución acuosa de
ácido fórmico al 0,1%. El gradiente fue liberado a los 180 min a una velocidad de
flujo de 300 nL/min, usando un capilar de sílice de 75 μm × 10 cm (C18 HPLC
Easy-Column, Proxeon) fusionado a un nanodispersor de acero inoxidable
Material y métodos
67
(Proxeon). En esta etapa los péptidos se separan en función de su tiempo de
retención, siendo mayor para las moléculas de naturaleza apolar y menor para las
moléculas de naturaleza polar. Posteriormente las moléculas son ionizadas para
generar moléculas cargadas positiva o negativamente y separadas en función de
su masa y carga (m/z). Las señales son registradas, amplificadas y procesadas
en forma de espectros de masas que es la representación gráfica de los iones
separados por sus valores de m/z, que se utilizaron para la identificación de
proteínas en las bases de datos.
Para la búsqueda de secuencias similares se usaron los programas: Proteome
Discoverer (versión 1.1) Thermo Fisher Scientific y BLAST
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov.
5. Inmunodetección in situ
5.1. Inmunofluorescencia indirecta para microscopía confocal
Los núcleos (o las MNs) (0,01 gr) fueron fijados (para conservar la distribución del
antígeno original y la morfología nuclear) y permeabilizados (para asegurar el
acceso de los anticuerpos hacia el epítopo) con 200 l de una solución fresca de
formaldehído [disolver 2% de paraformaldehído (PFA) en PBS, calentar a 60C y
filtrar con filtro de 4 m] suplementado con 0,5% de Triton X-100, incubando
durante 30 min a temperatura ambiente. La solución de fijación y permeabilización
fue eliminada centrifugando a 3.500 rpm durante 15 min a 4ºC y los núcleos (o las
MNs) fueron lavados con PBS durante 15 min a 4ºC en agitación. El fondo
inespecífico fue bloqueado incubando los núcleos (o las MNs) con glicina 20 mM
(disuelta en PBS) durante 15 min a 4ºC en agitación. La solución de glicina fue
eliminada centrifugando a 3.500 rpm durante 15 min a 4ºC y lavando con PBS-T
(0,05% de Tween 20 en PBS) durante 10 min a 4ºC y centrifugando a 3.500 rpm
durante 15 min a 4ºC. Los núcleos (o las MNs) fueron resuspendidos e incubados
en 100 l de solución de bloqueo (2% de BSA disuelta en PBS-T) durante 30 min
a 4ºC en agitación. En esta misma solución se adicionó el anticuerpo primario
[S1390 (68 g) o 1622 (4 g) o ACTB21 (2 g) o PL3 (1 l) o PL4 (1 l)],
incubando 1 h a 4ºC en agitación. El anticuerpo no unido al antígeno fue
Material y métodos
68
eliminado lavando 2 veces con PBS-T, durante 15 min a 4ºC y agitación. El
anticuerpo unido fue marcado con el anticuerpo secundario [anticuerpo IgG de
cabra anti-IgG de ratón (Molecular probes) o anticuerpo IgG de cabra anti-IgG de
conejo (Molecular probes)] marcado con el fluoróforo Alexa 488 verde o Alexa 546
rojo) y diluido 1:100 en PBS, incubando 2 h a 4 ºC, agitación y ausencia de luz.
Los núcleos (o las MNs) fueron lavados 2 veces con PBS-T durante 15 min a 4ºC,
agitación y ausencia de luz. En el caso de los núcleos fueron adicionados 0,4
g/ml de DAPI (Serva 18890) en el primer lavado. Finalmente los núcleos (o las
MNs) resuspendidos en 1 ml de PBS y 10 l fueron depositados en cada pozo de
un portaobjetos multipozos (30-966H-BLACK-CE24 Thermo Scientific)
previamente tratados con solución de poli-L-lisina al 0,01% (Sigma P 8920) para
favorecer la adherencia. Las muestras fueron protegidas de la luz, secadas al aire
y cubiertas con 10 l de medio preservador de fluorescencia Vectashield (Vector
Laboratories, Inc. H-100) y con un cubreobjeto (24x50 mm). Ambos portaobjeto y
cubreobjeto fueron sellados con barniz. Las preparaciones fueron conservadas a
4ºC en la oscuridad hasta su observación usando un microscopio confocal
ultraespectral (Leica TCS-SP2-AOBS) con un objetivo HCXPLAPO 63X11 4-0, 40.
Se utilizaron los softwares Leica confocal y Adobe Photoshop para el
procesamiento de las imágenes.
Los controles negativos se efectuaron incubando con los correspondientes sueros
preinmunes u omitiendo el anticuerpo primario en la primera incubación.
Para la detección simultánea de dos antígenos se usaron dos anticuerpos
primarios producidos en especies diferentes que reconocen a los distintos
epítopos que pueden ser reconocidos independientemente por los anticuerpos
secundarios contra las inmunoglobulinas de las especies correspondientes,
marcados con fluoróforos con distintas longitudes de onda de excitación y de
emisión. El protocolo usado fue el mismo que para la detección de un antígeno
pero usando dos anticuerpos primarios y dos secundarios simultáneamente.
Los perfiles de colocalización en los experimentos de doble marcado se
determinaron usando el software Simulator (Leica).
Material y métodos
69
5.2 Inmunomarcado indirecto con oro para microscopía electrónica
Los meristemos de raíces y los sedimentos de matrices nucleares fueron fijados
en una solución recién preparada de formaldehífo (PFA al 2% en PBS), durante
1h/4ºC, lavados en PBS (3X10 min), deshidratados progresivamente en
soluciones de etanol en concentración ascendente (30-100%), infiltrados en
mezclas de resina-etanol (1:2, 2:1, 1:0) e incluidos en resina LR White en
cápsulas tapadas y polimerizadas a 60ºC durante 22 h, según el protocolo del
laboratorio (Samaniego et al, 2006a). Las zonas de interés de los bloques se
seleccionaron en cortes semifinos en contraste de fase y se tallaron las pirámides
correspondientes en un Pyramitome LKB 11800 (Samaniego et al., 2006a). Los
cortes ultrafinos (de 80 a 100 nm) obtenidos con una cuchilla de diamante
(Drukker International) en un ultratomo (Reichert Ultracut) se depositaron en
rejillas de níquel de 100 cuadrículas recubiertas con una película de formvard al
0,5% en dicloroetileno (TABB). Las rejillas fueron incubadas en glicina 20 mM en
PBS y lavadas en solución de lavado PBS-T (PBS y 0,05% de Tween 20) durante
10 min. Posteriormente se incubaron en solución de bloqueo (PBS-T y 2% de
BSA) durante 30 min, y fueron incubadas con los anticuerpos primarios [S1390
(68 g) o PL3 (1 l) o PL4 (1 l)/100 l] en solución de bloqueo durante 2 h a
temperatura ambiente y lavadas en solución de lavado 3 veces durante 10 min.
Luego fueron incubadas con los anticuerpos secundarios [anticuerpo anti-IgG de
ratón o de conejo (Sigma)] conjugados con oro de 10 nm diluidos 1:100 en
solución de bloqueo durante 1 h, se lavaron en solución de lavado 3 veces
durante 10 min y posteriormente en agua bidestilada y se secaron al aire. Las
muestras fueron contrastadas con una solución al 5% de acetato de uranilo en
agua y examinadas en un microscopio Jeol 1230 equipado con una cámara digital
CMOS, TemCam-F416 TVIPS a 100 kV. Los controles negativos se efectuaron
incubando con los sueros preinmunes correspondientes u omitiendo el anticuerpo
primario en la primera incubación.
Material y métodos
70
Resultados
71
RESULTADOS
1. Detección y caracterización de las proteínas semejantes a espectrina en el
núcleo y NSK de Allium cepa L. var. francesa
1.1. Proteínas reconocidas mediante los anticuerpos S1390 y 1622 en los
núcleos
Los núcleos de células meristemáticas de raíz de Allium cepa L. var.
francesa (Figura 9) fueron aislados y lisados según el procedimiento descrito en el
apartado de material y métodos.
Figura 9. Núcleos aislados de Allium cepa L. var. francesa.
Núcleos aislados en medio MAN teñidos con verde de metilo y observados mediante contraste interferencial
diferencial a 60 X.
Para la detección inmunológica de las proteínas semejantes a espectrina
en Allium cepa se usaron los anticuerpos S1390 [anti-cadenas (240 kDa) y
(220 kDa) de espectrina de pollo] y 1622 (anti-cadena de espectrina de células
no eritroides de mamíferos).
Resultados
72
1.1.1. Análisis mediante inmunodetección en membrana de geles mono-
dimensionales
Las proteínas nucleares totales fueron separadas en geles mono-
dimensionales y transferidas a membranas para la detección de las proteínas
reconocidas inmunológicamente por los anticuerpos anti-espectrina S1390 y
1622. Usando el anticuerpo S1390 se detectaron bandas peptídicas de 240, 220,
120 y 100 kDa y una muy intensa de 60 kDa (Figura 10A, N1). Cuando se usó el
anticuerpo 1622 se detectaron bandas tenues de 240, 185, 96 kDa y otras bandas
intensas de 195, 104 y 96 kDa (Figura 10A, N2). Los perfiles de las movilidades
electroforéticas de las proteínas reconocidas por ambos anticuerpos fueron
diferentes, excepto las bandas de 240 y 100 kDa que fueron detectadas con los
dos anticuerpos. Se realizó un control positivo del anticuerpo S1390 usando
Figura 10. Detección y caracterización de las proteínas nucleares semejantes a espectrina mediante
inmunodetección en membrana con los anticuerpos S1390 y 1622
(A) Bandas de proteínas nucleares reconocidas por los anticuerpos anti-espectrina S1390 (N1) y 1622 (N2).
(B) Control positivo del reconocimiento de espectrina (E1) y de sus bandas de degradación (E2) en eritrocito
de conejo mediante el anticuerpo S1390. (C) Controles negativos de la reactividad de los anticuerpos
secundarios anti-IgG de conejo [(-) 1] y anti-IgG de ratón [(-) 2] con las proteínas nucleares, incubado sin los
anticuerpos primarios S1390 y 1622 respectivamente. La concentración de las proteínas totales de extracto
nuclear de Allium cepa y de las proteínas solubles de membrana de eritrocitos de conejo depositadas en cada
pocillo fue de 0,8 g/l.
Resultados
73
eritrocitos de conejo; que evidenció las bandas de las cadenas y de espectrina
con masas moleculares de 240 y 220 kDa (Figura 10B, E1) y también mostró
como éstas se degradan en bandas de 100 y 60 kDa en algunos experimentos
(Figura 10B, E2). Teniendo en cuenta este control, las bandas de 240 y 220 kDa
detectadas en Allium cepa con el anticuerpo S1390 se podrían degradar a
péptidos de menor masa molecular como las bandas de 100 y 60 kDa. También
se realizaron controles negativos de la reactividad de los anticuerpos secundarios
con las proteínas nucleares incubando las membranas con los anticuerpos
secundarios sin los anticuerpos primarios y no hubo evidencia de bandas
proteicas reconocidas por los anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo [Figura
10C, (-)1] y de ratón [Figura 10C, (-)2] usados.
1.1.2. Análisis de las proteínas nucleares inmunoprecipitadas con el
anticuerpo S1390
Para el aislamiento de las proteínas semejantes a espectrina y de sus
proteínas asociadas, las proteínas de los extractos nucleares totales de Allium
cepa fueron incubadas con el anticuerpo S1390 según el procedimiento descrito
en el apartado 4.7 de Métodos. Las proteínas inmunoprecipitadas fueron
separadas mediante SDS-PAGE y transferidas a membrana. Usando el
anticuerpo S1390 como sonda se detectaron varias bandas peptídicas
inmunoprecipitadas con masas moleculares entre 190 y 75 kDa y una banda de
60 kDa muy intensa (Figura 11, IPN). Además se detectó una banda más intensa
de 55 kDa que corresponde a la cadena pesada de la IgG del anticuerpo S1390
(Figura 11, IP-N, asterisco). Como control de las bandas inmunoprecipitadas se
corrieron proteínas del extracto nuclear total sin inmunoprecipitar que mostraron
las mismas bandas reactivas (Figura 11, N). Se realizaron varios controles de la
inmunoprecipitación: un control negativo de la reactividad de la proteína A
(conjugada con sefarosa) con las proteínas nucleares de Allium cepa, incubando
en ausencia del anticuerpo S1390 [Figura 11, ac (-)]; un control de reactividad del
anticuerpo S1390 con las proteínas nucleares de Allium cepa, incubando con IgG
de conejo en lugar del anticuerpo (Figura 11, IgG); un control de pureza de la
Resultados
74
Figura 11. Inmunoprecipitación de las proteínas nucleares de Allium cepa con el anticuerpo S1390.
Proteínas del extracto nuclear total de Allium cepa inmunoprecipitadas con el anticuerpo anti-espectrina
S1390, separadas mediante PAGE-SDS y transferidas a membrana de nitrocelulosa para su
inmunodetección con el mismo anticuerpo.
En las proteínas nucleares inmunoprecipitadas (IP-N) se detectaron varias bandas proteicas entre 190 y 75
kDa siendo mayoritaria la banda de 60 kDa (◄). La banda muy intensa de 55 kDa corresponde a las cadenas
pesadas del anticuerpo S1390 (*). Como control se corrieron proteínas del extracto nuclear total sin
inmunoprecipitar (N). Los controles de la inmunoprecipitación realizados fueron: un control negativo de la
reactividad de la proteína A (conjugada con sefarosa) con las proteínas nucleares de Allium cepa en ausencia
del anticuerpo S1390 [ac (-)] en el que no se observan bandas; un control de la reactividad del anticuerpo
S1390 con las proteínas nucleares de Allium cepa, incubando con IgG de conejo en lugar del anticuerpo
S1390 (IgG) en el que sólo se observa la banda correspondiente a la cadena pesada de la IgG; un control de
pureza de la proteína A (conjugada con sefarosa), incubando sin anticuerpo y extracto nuclear, que no
muestra bandas [ac.N (- -)]; y un control negativo de reactividad del anticuerpo con la proteína A (conjugada
con sefarosa), incubando sin el extracto nuclear [N(-)] en el que sólo se observa la cadena pesada de la IgG.
En todos los casos se cargaron 0,8 g/l de proteína por pocillo.
IP-E es el control de inmunoprecipitación con el anticuerpo S1390 usando un extracto de proteínas de
eritrocito de conejo. Se identificaron bandas mayoritarias de 240, 220 y 60 kDa además de la banda de 55
kDa de las cadenas pesadas del anticuerpo. Como control se corrieron las proteínas del extracto de
eritrocitos de conejo sin inmunoprecipitar (E). En estas muestras se cargaron 0,5 g/l de proteína por pocillo.
proteína A (conjugada con sefarosa), incubando sin anticuerpo y sin extracto
nuclear [Figura 11, ac,N (- -)] y un control negativo de reactividad del anticuerpo
con la proteína A (conjugada con sefarosa), incubando sin el extracto nuclear
[Figura 11, N(-)]. Ninguno de los controles mostró bandas reactivas a excepción
de la cadena pesada de la IgG o del anticuerpo S1390. Como control positivo de
la inmunoprecipitación de la espectrina con el anticuerpo S1390 se incubó éste
anticuerpo con un extracto de proteínas solubles de la membrana de eritrocitos de
conejo. Las proteínas mayoritarias inmunoprecipitadas en este control fueron las
bandas de 240, 220 y la banda más intensa de 60 kDa, observándose una más
Resultados
75
tenue de 75 kDa (Figura 11, IP-E). Como control de la movilidad de estas bandas
se corrieron las proteínas solubles de la membrana de eritrocitos de conejo sin
inmunoprecipitar (Figura 11, E).
1.1.3. Análisis mediante inmunodetección en membrana de geles bi-
dimensionales
Una vez determinadas las masas moleculares de los péptidos reactivos con
los anticuerpos antiespectrina en geles monodimensionales se realizaron geles
bidimensionales para determinar sus valores de pI.
Cuando las membranas conteniendo las proteínas nucleares separadas
mediante geles bi-dimensionales se incubaron con el anticuerpo S1390 y se
expusieron durante 20 seg se detectó solamente una proteína de 60 kDa
constituida por múltiples formas isoeléctricas con un rango de valores de pIs
acídicos entre 5,1 y 5,7 similares a los de la espectrina (Figura 12A y A1).
Además, se detectó una mancha con la misma masa molecular detenida en el
extremo del gel con valores de pI 7 o básicos, indicando la existencia de una
fracción de la muestra con proteínas con esos valores. Cuando la exposición se
prolongó hasta 60 seg, además de la mancha de 60 kDa se observaron otras
manchas con valores de masas moleculares diversos y de pIs en los rangos: 1)
entre 4,2 y 4,4 (manchas de 240, 190, 120, y 96 kDa) (Figura 12A2, elipses
verdes); 2) entre 5,6 y 5,7 (manchas de 120, 100, 93 y 90 kDa) (Figura 12A2,
elipses rojas); y 3) entre 6,0 y 6,4 (manchas de 240, 190 y 100 kDa) (Figura 12A2,
elipses azules). Se detectan también dos manchas de 60 kDa en ambos extremos
del gel (Figura 12A2, elipses rosa y amarilla).
Cuando se usó el anticuerpo 1622 se detectaron dos grupos de múltiples
formas isoeléctricas con masas moleculares de 190 kDa y valores de pI de 4,6 a
5,0 (Figura 12B, elipse verde) y 6,3 a 6,6 (Figura 12B, elipse azul), semejantes a
las múltiples formas isoeléctricas con masas moleculares de 190 kDa detectadas
con el anticuerpo anti-espectrina S1390, pero no se observaron las manchas de
60 kDa.
Resultados
76
Resultados
77
Figura 12. Caracterización de las proteínas semejantes a espectrina mediante inmunodetección en
membranas de geles bidimensionales con los anticuerpos S1390 y 1622.
(A) Inmunodetección en membrana de gel bidimensional con el anticuerpo S1390 de múltiples formas
isoeléctricas de la proteína de 60 kDa. La membrana fue expuesta 20 seg. (A1) Ampliación del fragmento
rectangular de A en donde se observan claramente ocho manchas de las formas isoeléctricas con valores de
pI entre 5,1 y 5,7. (A2) Al exponer la membrana durante 60 seg aparecen manchas menos intensas, con
diferentes valores de masas moleculares y de pIs: 1) entre 4,2 y 4,4 (manchas de 240, 190, 120, y 96 kDa)
(elipses verdes); 2) entre 5,6 y 5,7 (manchas de 120, 100, 93 y 90 kDa) (elipses rojas); y 3) entre de 6,0 y 6,4
(manchas de 240, 190 y 100 kDa) (elipses azules). Además de las isoformas de la proteína de 60 kDa
sobreexpuesta se observaron manchas del mismo tamaño en ambos extremos del gel (elipses rosa y
amarilla). (B) Inmunodetección con el anticuerpo 1622 presentando manchas con masa molecular de 190
kDa de múltiples formas isoeléctricas y valores de pI de 4,6 a 5,0 (elipses verdes) y de 6,3 a 6,6 (elipses
azules).
1.2. Localización topológica de las proteínas
1.2.1. Análisis mediante inmunofluorescencia confocal con los anticuerpos
S1390 y 1622
La distribución topológica de las proteínas reconocidas por los anticuerpos
S1390 y 1622 se estudió mediante inmunofluorescencia confocal de fracciones
nucleares meristemáticas.
Los núcleos incubados con el anticuerpo S1390 y un anticuerpo secundario
anti IgG de conejo marcado con el fluoróforo Alexa Fluor 488 mostraron una
tinción generalizada de la envoltura nuclear mientras que la distribución
intranuclear del marcado fue heterogénea apareciendo como un retículo
intercromatínico, en focos nucleares y en ciertos casos en el nucleolo (Figura
13A1 y A2). La cuantificación del marcado demostró que en un 8% de los núcleos
sólo la periferia nuclear y a veces la periferia nucleolar aparecieron marcados
(Figura 13B1 y C1). En un 26% de los núcleos además de la periferia nuclear las
proteínas aparecieron distribuidas en la red intercromatínica (Figura 13D1),
mientras que en el 66% de los núcleos además de la periferia las proteínas se
detectaron acumuladas en abundantes focos intranucleares (Figura 13F1). Las
proteínas presentaron una asociación transitoria con el nucleolo. Los nucleolos
mostraron tinción difusa o intensa en un 70% de los núcleos (Figura 13E1 y F1),
mientras que en un 30% no aparecieron contrastados, aunque sí su periferia
(Figura 13D1). Los núcleos del control negativo de la reactividad de los
Resultados
78
anticuerpos secundarios incubados en las mismas condiciones pero omitiendo el
anticuerpo primario no mostraron tinción (Figura 13G1).
Figura 13. Distribución intranuclear de las proteínas semejantes a espectrina mediante microscopia
confocal.
Secciones confocales de fracciones de núcleos incubados con el anticuerpo S1390 marcado con el
anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado con el fluoróforo Alexa Fluor 488 (verde) (A1, B1, C1, D1, E1 y F1) y
teñidos con DAPI (A3, B2, C2, D2, E2 y F2) revelando diferentes patrones de distribución de las proteínas
semejantes a espectrina en una población de núcleos meristemáticos (A1); en la periferia nuclear (B1); en la
periferia nuclear y nucleolar (C1); en los dominios intercromatínicos (D1), formando redes intercromatínicas
que conectan a la periferia nuclear con los nucleolos teñidos (E1) o no (D1) y la más frecuente en la periferia
nuclear, nucleolo y numerosos focos intranucleares (F1). (A2) Superposición de las imágenes de
inmunofluorescencia (verde) y DAPI. (G1) Control negativo de la reactividad del anticuerpo secundario anti-
IgG de conejo marcado con el fluorocromo Alexa Fluor 488 (verde). Los núcleos fueron incubados con el
anticuerpo secundario en ausencia del primario y teñidos con DAPI (G2).
Secciones confocales de fracciones de núcleos incubados con el anticuerpo 1622 marcado con el anticuerpo
anti-IgG de ratón conjugado con el fluoróforo alexa 488 (verde) (H1) y teñidos con DAPI (H3) revelando
tinción en la membrana nuclear, nucleolo y en numerosos focos intranucleares. (H2) Superposición de las
imágenes de inmunofluorescencia y DAPI. (I1) Control negativo de la reactividad del anticuerpo secundario
anti-IgG de ratón marcado con el fluorocromo Alexa Fluor 488 (verde). Los núcleos fueron incubados con el
anticuerpo secundario en ausencia del primario y teñidos con DAPI (I2).
Resultados
79
Los núcleos incubados con el anticuerpo 1622 mostraron un modelo de
distribución más uniforme de las proteínas (Figura 13H1 y H2). Éstas se
distribuyeron en la periferia nuclear, nucleolo y en numerosos focos
intranucleares. Como en el caso anterior los núcleos del control negativo de la
reactividad de los anticuerpos secundarios incubados en las mismas condiciones
pero omitiendo el anticuerpo primario no mostraron tinción (Figura 13I1).
1.2.2. Localización mediante microscopía electrónica con inmunomarcado
con oro
El inmunomarcado de los cortes ultrafinos de células meristemáticas de
raíz incubados con el anticuerpo S1390 y anticuerpos secundarios antiratón
conjugados con oro de 10 nm visualizado en alta resolución confirmó los análisis
de inmunofluorescencia y además reveló la asociación de las proteínas similares
a espectrina con diferentes dominios y estructuras nucleares. En secciones de
núcleos meristemáticos, las partículas de oro se encontraron asociadas con la
envoltura nuclear, el nucleolo y los dominios pericromatínicos y menos
frecuentemente con los dominios intercromatínicos (Figura 14A, B y C). A altos
aumentos se observó claramente la asociación de las proteínas similares a
espectrina con las membranas nucleares interna y externa (Figura 14B). En el
nucleolo, las partículas de oro aparecieron dispersas a lo largo del cuerpo
nucleolar o frecuentemente asociadas con el componente granular nucleolar
periférico (Figura 14C), de acuerdo con los resultados de inmunofluorescencia.
Los controles negativos procesados en las mismas condiciones pero omitiendo el
anticuerpo primario e incubando sólo con el anticuerpo secundario anti-IgG de
conejo marcado con oro no presentaron marcado (Figura 14D).
Resultados
80
Figura 14. Localización de las proteínas semejantes a espectrina en núcleos de Allium cepa mediante
microscopía electrónica de alta resolución
Las partículas de oro se señalan con flechas de diferentes colores según su localización: envoltura nuclear
(verde), dominios inter y pericromatínicos (rojo), y nucleolo (amarillo). (A) Fragmento del núcleo presentando
el marcado nucleoplásmico principalmente en los dominios pericromatínicos. Las zonas oscuras
corresponden a la heterocromatina. (B) Alto aumento mostrando la asociación de las proteínas semejantes a
espectrina con las membranas interna y externa de la envoltura nuclear (ne). La espectrina citoplásmica
(flecha negra) también fue detectada con el anticuerpo. (C) Fragmento de un nucleolo presentando
abundantes partículas de oro principalmente sobre el componente granular. El marcado es escaso sobre el
componente fibrilar denso y los centros fibrilares claros. (D) Control negativo obtenido omitiendo el anticuerpo
primario e incubando la muestra sólo con el anticuerpo secundario. No se observan partículas de oro.
1.3. Asociación de las proteínas reconocidas por los anticuerpos S1390 y
1622 con el núcleoesqueleto
1.3.1. Análisis mediante extracción diferencial e inmunodetección en
membrana
Los componentes proteicos del núcleoesqueleto son resistentes a la
Resultados
81
solubilización con altas concentraciones de sales y detergentes, esta
característica fue usada para separarlos de otros componentes nucleares. Se
analizaron las fracciones nucleares obtenidas después de que sus proteínas se
sometieran a solubilización diferencial mediante extracción con Tritón X-100 al
0,05%, nucleasas y (NH4)2SO4 2,5 M, y NaCl 2M (Tabla 2) (Figura 15).
La inmunodetección en membrana de proteínas de las diferentes
fracciones nucleares S1, S2, S3, F2 y F3 usando el anticuerpo S1390 como
sonda reveló proteínas semejantes a espectrina con diferentes solubilidades
(Figura 15). Una alta proporción de la proteína mayoritaria de 60 kDa fue extraída
del núcleo mediante el detergente como demuestra su recuperación en el
sobrenadante S1. Por tanto esta banda contiene una fracción de proteínas
semejantes a espectrina soluble o asociada con la membrana nuclear (Figura
15A, S1). La digestión con nucleasas y extracción posterior con (NH4)2SO4 extrajo
una alta proporción de la banda residual de 60 kDa presente en la fracción S2 y
también la banda de 100 kDa así como una fracción residual de la banda de 125
kDa sugiriendo que estas proteínas podrían estar asociadas con cromatina
(Figura 15A, S2). Los componentes principales de la fracción nuclear residual
después de esta extracción fueron la banda de 60 kDa que aparece como un
doblete, así como bandas menores de 240, 220, 140 y 125 kDa (Figura15A, F2).
La extracción posterior con NaCl extrajo una pequeña cantidad de la banda
superior pero no la inferior del doblete de 60 kDa (Figura 15A, S3). El perfil de las
bandas de proteínas semejantes a espectrina de la matriz nuclear final (F3) fue
muy semejante al de los núcleos digeridos con nucleasa (F2). La proteína
semejante a espectrina mayoritaria en el NSK es el doblete de 60 kDa. Además
de ésta se detectaron bandas minoritarias pero bien definidas de 240-220 kDa e
intermedias de 140, y 125 kDa (Figura 15A, F3).
La incubación de las diferentes fracciones nucleares con el anticuerpo 1622
reveló que las bandas reactivas estaban fuertemente asociadas a la matriz
nuclear y no se extrajeron con detergente, nucleasa y (NH4)2SO4 ni NaCl 2 M. Las
bandas mayoritarias del NSK fueron un doblete de 190-170 kDa y una banda de
100 kDa y bandas menores de 90 y 75 kDa (Figura 15 B).
Resultados
82
Figura 15. Asociación de las proteínas semejantes a espectrina con el núcleoesqueleto
Inmunodetección en membrana de las proteínas nucleares de Allium cepa y de las fracciones insolubles (F2 y
F3) y solubles (S1, S2 y S3) obtenidas por solubilización diferencial para la obtención de matrices nucleares
según el procedimiento descrito en el apatado 3 de Métodos (Tabla 2) e incubadas con los anticuerpos S1390
y 1622. (A) Incubación con el anticuerpo S1390. El componente mayoritario de la matriz nuclear MN (F3) es
un doblete de aproximadamente 60 kDa, mientras que las bandas de 240, 220, 140 y 125 kDa son
componentes minoritarios de la misma. (B) Incubación con el anticuerpo 1622. Las bandas mayoritarias de la
MN (F3) son un doblete de 190-170 kDa y una banda de 100 kDa. Se detectaron también otras bandas
minoritarias de 90 y 75 kDa. Las fracciones solubles no presentan bandas reactivas con el anticuerpo.
1.3.2. Localización topológica mediante inmunofluorescencia confocal e
inmunomarcado con oro para microscopia electrónica
Usando microscopía de inmunofluorescencia confocal y los anticuerpos
S1390 (Figura 16A) y 1622 (Figura 16B) marcados con anticuerpos conjugados
con fluoróforos se confirmó la asociación de las proteínas semejantes a
espectrina con el NSK. Su distribución en esta estructura es diferente de la que
muestran en el núcleo, ya que aparecen homogéneamente distribuidas en el
retículo de la matriz nuclear y acumuladas en focos más brillantes (Figura 16A y
B).
El inmunomarcado con oro y microscopía electrónica de alta resolución
evidenció la asociación de las proteínas similares a espectrina con la red de la
matriz nuclear interna y con la lámina periférica (Figura 16C).
Resultados
83
Figura 16. Asociación de las proteínas semejantes a espectrina con el núcleoesqueleto
(A) Sección confocal de matrices nucleares incubadas con el anticuerpo S1390 y el fluoróforo Alexa F 488
mostrando la asociación de las proteínas semejantes a espectrina con esta estructura. (B) Sección confocal
de una matriz nuclear tras incubación con el anticuerpo 1622 y el secundario correspondiente.
(A1 y B1) Imágenes DIC (contraste interferencial diferencial) de los mismos campos mostrados en A1 y B1.
(C) Imagen de inmunomarcado con oro para microscopía electrónica de una zona de la matriz nuclear
revelando la asociación de las partículas de oro con la lámina (flechas) y con la red de la matriz interna
(flecha doble).
1.4. Análisis de las secuencias de péptidos de la proteína de 60 kDa
mediante espectroscopía de masas
Para investigar la secuencia peptídica de una de las proteínas semejantes a
espectrina se realizó un análisis de las secuencias peptídicas de la banda de 60
kDa (cortada de geles mono-dimensionales) mediante espectroscopía de masas.
La banda proteica de 60 kDa fue digerida con tripsina, los péptidos fueron
separados mediante RP-HPLC y los fragmentos peptídicos fueron secuenciados
por espectroscopía de masas. La similaridad de las secuencias peptídicas
semejantes a espectrina fue investigada en las bases de datos de secuencias de
proteínas registradas usando el programa BLAST.
El cromatograma obtenido al analizar los tiempos de retención de los
péptidos fragmentados (Figura 17) presentó una mayor absorbancia relativa de
péptidos y variedad de picos entre 18 y 50 min, aunque la elución de los péptidos
de interés podría estar fuera de este período de tiempo.
Resultados
84
Figura 17. Cromatograma representativo obtenido de la mezcla peptídica de la banda de 60 kDa
digerida.
Los péptidos fueron digeridos con tripsina, corridos en una columna de fase reversa (Easy-Column C18) y
eluidos con un gradiente lineal de acetonitrilo (2 a 90%) en una solución acuosa de ácido fórmico al 0,1%. El
gradiente fue liberado a 180 min y velocidad de flujo de 300 nL/min. La gráfica muestra en el eje Y la
intensidad de los picos relativa a la intensidad base del solvente usado como “blanco”, y en el eje X el tiempo
de retención en min.
Después de la separación de los péptidos por RP-HPLC, éstos fueron
separados por espectroscopía de masas. El análisis de los péptidos separados
mediante sus valores de la relación masa y carga reveló las secuencias de
aminoácidos. Mediante búsqueda del alineamiento de las secuencias de péptidos
con las secuencias registradas en las bases de datos usando los programas
Proteome Discoverer, version 1.1 (ThermoFisher Scientific) y BLAST se encontró
una similaridad alta (score de 134,21) con la proteína nucleolar Nop56 expresada
en Oryza sativa subsp. Japonica. (número de acceso Q10LF8, pI de 8.53 y masa
molecular de 61,3 kDa). Las secuencias de aminoácidos cPASTLQILGEK y
IVNDNYIYAK fueron emparejadas con alta similaridad con la proteína nucleolar
Nop56 y fueron encontradas 17 veces en el patrón peptídico del espectro de
masas de las secuencias peptídicas de la proteína de 60 kDa de Allium cepa.
La proteína mostró una similaridad baja (score de 24) con la nesprina-1 de
Homo sapiens (número de acceso CAI42284.1), una proteína de la envoltura
nuclear que contiene repeticiones de espectrina.
Resultados
85
1.5. Asociación de las proteínas nucleares semejantes a espectrina con la
actina nuclear.
Una característica de las espectrinas es su capacidad de unirse con la
actina, por ello investigamos si las proteínas semejantes a espectrina de Allium
cepa también tienen esta característica.
El análisis de la asociación de las proteínas semejantes a espectrina con la
actina nuclear en Allium cepa fue realizado mediante co-inmunoprecipitación y co-
localización por inmunofluorescencia.
1.5.1. Co-inmunoprecipitación de las proteínas nucleares semejantes a
espectrina y actina nuclear
Las proteínas de los extractos nucleares totales de Allium cepa fueron
inmunoprecipitadas con los anticuerpos S1390 o 1622 (Figura 18).
Figura 18. Asociación de las proteínas semejantes a espectrina con actina nuclear
(A y B). Co-inmunoprecipitación de las proteínas semejantes a espectrina con actina después de la
inmunoprecipitación de las proteínas nucleares con los anticuerpos S1390 (A) y 1622 (B). En ambos casos se
detectó una banda de 43 kDa (◄) con el anticuerpo antiactina ACTB21. La banda de 55 kDa observada en
las inmunoprecipitaciones corresponde a las cadenas pesadas de los anticuerpos S1390 y 1622 (*). Como
control se muestran las bandas de actina detectadas en el extracto total nuclear (N) en cada caso. En A y B
las muestras de N e IP fueron cargadas en una concentración de proteínas de 0,5 g/l.
La incubación de las membranas (que contenían los complejos proteicos
recuperados por inmunoprecipitación con los anticuerpos S1390 y 1622) con el
Resultados
86
anticuerpo anti-actina ACTB21 reveló la presencia de actina en ambos casos
(Figura 18A y B, flecha). Como controles se detectaron las bandas de actina en
preparaciones de núcleos incubados con los mismos anticuerpos (Figura 18A y
B).
1.5.2. Co-localización mediante inmunofluorescencia confocal de las
proteínas nucleares semejantes a espectrina y actina en el núcleo y en el
núcleoesqueleto
Para comprobar la asociación de las proteínas semejantes a espectrina con
actina in situ realizamos experimentos de colocalización mediante
inmunofluorescencia confocal con doble marcado usando los anticuerpos anti-
actina AC15 o ACTB21 y anti-espectrina S1390 marcados con anticuerpos
secundarios conjugados con dos fluoróforos distintos. La superposición de las
imágenes obtenidas en los diferentes canales evidenció la co-localización de
ambas proteínas en la red intercromatínica, en algunos focos intra-nucleares y
peri-nucleolares (Figura 19A1, A’1 y B).
Para investigar la asociación de ambas proteínas en el NSK se realizó el
experimento de co-localización inmunofluorescente con doble marcado en
matrices nucleares, usando los anticuerpos anti-actina ACTB21 y anti-espectrina
S1390. Las imágenes de superposición de los canales rojo y verde demuestran
que existe co-localización en el retículo de la matriz interna y en focos (Figura
20A1 y B1).
Figura 19. Co-localización de la proteínas nucleares semejantes a espectrina y actina in situ
Los núcleos meristemáticos de Allium cepa fueron incubados con los anticuerpos primarios anti-espectrina
S1390 y anti-actina AC15 y con los anticuerpos secundarios anti-IgG de conejo Alexa F 546 (rojo) y anti-IgG
de ratón Alexa F 488 (verde) y teñidos después con DAPI. (A1) Superposición de las imágenes en el canal
rojo y verde de una sección confocal de un grupo de núcleos incubados con los anticuerpos S1390 marcado
con Alexa F 546 (rojo) (A2) y AC15 marcado con Alexa F 488 (verde) (A3). Tinción con DAPI (A4). La
superposición de las imágenes evidencia la co-localización de ambas proteínas en la red intercromatínica y
en algunos focos intra-nucleares y peri-nucleolares (A1). (A’1, A’2 y A’3) Aumentos de una parte de las
imágenes anteriores en las que se observan claramente el marcado y los sitios de co-localización. (B) Los
perfiles de intensidad de los canales rojo y verde a lo largo de la línea seleccionada de 16,36 m en A’1
demuestran la co-localización en algunos focos (intensidad alrededor de 200) pero no en otros que contienen
principalmente actina, así como en la red intercromatínica (intensidad alrededor de 75).
Resultados
87
Figura 20. Co-localización de las proteínas nucleares semejantes a espectrina y actina en el
núcleoesqueleto
Imágenes confocales de matrices nucleares de Allium cepa incubadas con los anticuerpos primarios anti-
espectrina S1390 y anti-actina ACTB21 y con los anticuerpos secundario anti-IgG de conejo o ratón
marcados con los fluoróforos Alexa F 546 (rojo) y 488 (verde) respectivamente. (A1 y B1) Superposición de
las imágenes confocales en el canal rojo y verde de las matrices nucleares incubadas con los anticuerpos
S1390 marcado con Alexa F 546 (rojo) (A2 y B2) y ACTB21 marcado con Alexa F 488 (verde) (A3 y B3). La
imágenes superpuestas evidencian co-localización en la red intercromatínica y en focos de la matriz interna.
(A4 y B4) Imágenes DIC (contraste interferencial diferencial) de los mismos campos de matrices nucleares.
Resultados
88
Continuando con la exploración de la composición de las proteínas
constituyentes del NSK de Allium cepa analizamos la presencia de proteínas de
tipo NIF en este sistema.
2. Detección y caracterización de los filamentos intermedios nucleares
(NIFs) en el núcleo y NSK de Allium cepa L. var. francesa.
2.1. Proteínas reconocidas por los anticuerpos PL1, PL3 y PL4.
Para la detección inmunológica de las proteínas de tipo NIFs se utilizaron
los anticuerpos policlonales PL1, PL3 y PL4 producidos contra una proteína de
tipo filamento intermedio nuclear (NIF) de 65 kDa de Pisum sativum L. var.
dédicace.
2.1.1. Análisis mediante inmunodetección en membrana de geles mono-
dimensionales
Las proteínas de los núcleos de meristemos radiculares de Allium cepa
fueron separadas mediante SDS-PAGE mono-dimensionales y transferidas a
membranas para la inmunodetección usando los anticuerpos PL3 y PL4. En
ambos casos se detectó una banda peptídica de 65 kDa (que en ocasiones se
observa como un doblete) (Figura 21), la cual no es una de las bandas
mayoritarias teñidas con Coomasie en el gel de poliacrilamida (Figura 21, A1).
Esta banda también fue reconocida por el anticuerpo IFA que reconoce a la
mayoría de los filamentos intermedios (Figura 21, A4). Como control de la
detección de la banda NIF de 65 kDa con los anticuerpos PL3 y PL4 se incubó la
membrana conteniendo proteínas totales de núcleos de Pisum sativum L. var.
dédicace con el anticuerpo PL3. Estos controles revelaron una banda de
movilidad semejante (Figura 21, P). No se detectó ninguna banda en los controles
negativos de reactividad obtenidos incubando las membranas conteniendo las
proteínas totales de Allium cepa con los sueros pre-inmunes 3 y 4 (Figura 21, A5
Resultados
89
y A6), así como tampoco en el control negativo de la reactividad del anticuerpo
secundario (Figura 21, A7).
Figura 21. Detección de una proteína nuclear de tipo filamento intermedio nuclear (NIF) en Allium cepa
L. var. francesa
(A1) Proteínas totales nucleares de meristemos radiculares de Allium cepa separadas mediante SDS-PAGE.
La banda de 65 kDa reconocida por los anticuerpos no es mayoritaria en esta fracción. (A2 a A7) Proteínas
nucleares de Allium cepa transferidas a membranas de nitrocelulosa. (A2 y A3) Los anticuerpos PL3 y PL4
reconocen a una banda proteica nuclear de 65 kDa de Allium cepa que a veces aparece como un doblete.
(A4) La banda de 65 kDa es también reconocida por el anticuerpo IFA. (P) Control positivo de la detección de
NIF obtenido incubando una membrana conteniendo las proteínas totales nucleares de meristemos
radiculares de Pisum sativum L. var. dédicace con el anticuerpo PL3. Se observa la banda de 65 kDa como
un doblete. (A5 y A6) Controles negativos de la reactividad de los sueros pre-inmunes de los ratones 3 y 4
obtenidos incubando las membranas (conteniendo las proteínas nucleares totales de Allium cepa) con los
correspondientes sueros preinmunes. (A7) control negativo omitiendo la incubación con el anticuerpo
primario. Las concentraciones de las proteínas totales (de los extractos nucleares de Allium cepa y Pisum
sativum) depositadas en cada pocillo fueron de 0,8 g/l.
2.1.2. Análisis mediante inmunodetección en membranas de geles
bidimensionales
Mediante inmunodetección en membrana conteniendo las proteínas
nucleares totales de Allium cepa separadas en geles bi-dimensionales se
detectaron dos manchas de 65 kDa con valores de pI acídicos de 5,4 y 5,5, y dos
de 60 kDa menos acídicas con pIs de 6,5 y 6,6 que corresponderían al doblete
Resultados
90
observado en membranas monodimensionales (Figura 22), sin observarse
manchas en otras regiones de la membrana.
Figura 22. Caracterización de las proteínas de tipo semejantes a filamento intermedio nuclear (NIF)
mediante inmunodetección en membrana bidimensional.
Usando el anticuerpo PL4 como sonda en una membrana transferida de un gel bidimensional conteniendo las
proteínas nucleares totales de Allium cepa se detectaron dos manchas mayoritarias de 65 kDa con valores de
pI de 5,4 y 5,5, y otras dos de 60 kDa menos acídicas con valores de 6,5 y 6,6.
2.2. Localización topológica de la proteína de 65 kDa de tipo NIF
2.2.1. Análisis mediante inmunofluorescencia y microscopía confocal
Los núcleos de Allium cepa incubados con cada uno de los anticuerpos PL1,
PL3 y PL4 y examinados mediante microscopía confocal revelaron en todos los
casos la misma distribución de la proteína p65 NIF, en la periferia nuclear y en una
delicada red intranuclear en donde son evidentes algunos focos brillantes, pero no
se observó tinción en el nucleolo (Figura 23). Estos resultados son similares a los
descritos previamente para la distribución de las proteínas semejantes a laminas en
el núcleo de Allium cepa (Mínguez y Moreno Díaz de la Espina, 1993). La
acumulación de la proteína p65 NIFs alrededor del nucleolo fue observada en
Resultados
91
muchos casos (Figura 23). Los controles negativos procesados de la misma
manera pero incubados con los sueros pre-inmunes u omitiendo los anticuerpos
primarios e incubando sólo con el anticuerpo secundario antiratón Alexa F 488
fueron siempre negativos (Figura 23).
Figura 23. Distribución intranuclear de la proteína p65 NIF en Allium cepa
Secciones confocales de núcleos de meristemos radiculares de Allium cepa después de su incubación con
los anticuerpos PL3 (A), PL1 (B) y PL4 (C). La proteína p65 NIF aparece asociada con la periferia nuclear,
una red delicada intranuclear y algunos focos brillantes más abundantes alrededor del nucleolo (A, B y C). La
tinción con DAPI de los campos correspondientes (A1, B1 y C1) muestra el nucleolo oscuro. Las
superposiciones de las tinciones con los anticuerpos y DAPI muestran claramente la acumulación perinuclear
y perinucleolar de la proteína (A2, B2 y C2). (D) Sección confocal de núcleos incubados con el suero
preinmune 3. (D1) Tinción DAPI del campo correspondiente. (E) Control negativo incubado solamente con el
anticuerpo secundario anti-ratón Alexa 488. (E1) Superposición de los campos del control negativo en E y de
la tinción con DAPI.
Resultados
92
2.2.2. Análisis mediante microscopía electrónica con inmunomarcado con
oro
El inmunomarcado con oro obtenido incubando cortes ultrafinos de células
meristemáticas de raíz con el anticuerpo PL4 y el anticuerpo secundario antiratón
conjugado con oro de 10 nm visualizado a alta resolución evidenció un marcado
compatible con los resultados de inmunofluorescencia para microscopía confocal
Resultados
93
Figura 24. Localización ultraestructural de la proteína p65 NIFs en los diferentes dominios nucleares
mediante inmunomarcado con oro.
(A) Las partículas de oro aparecieron asociadas con la envoltura nuclear (en), principalmente con las
estructuras fibrilares que conectan a los complejos del poro nuclear (flechas delgadas). La mayoría del
marcado fue localizado en la periferia de los dominios de cromatina condensada (dc) (flechas). El nucleolo y
los grupos de gránulos intercromatínicos (gi) no presentaron marcado. Citoplasma (cit). (B) Control negativo
omitiendo la incubación con el anticuerpo primario que no presenta marcado.
e incluso aclaró aún más la distribución de la proteína p65 NIF. Las partículas de
oro aparecieron claramente asociadas con la envoltura nuclear principalmente con
la estructura filamentosa que conecta a los poros nucleares, y con las zonas
periféricas de las masas de cromatina condensada más que con las regiones
intercromatínicas. El nucleolo y la red de gránulos intercromatínicos no
aparecieron marcados (Figura 24A). No se observó marcado después de la
incubación con el anticuerpo secundario cuando se omitió el anticuerpo primario
en los controles negativos (Figura 24B).
2.3. Asociación de la proteína p65 NIF con el núcleoesqueleto
2.3.1 Análisis mediante extracción secuencial e inmunodetección en
membrana
Las proteínas nucleares de Allium cepa fueron extraídas secuencialmente
con detergentes no iónicos y tampones con baja y alta concentración de sales
después de la digestión con nucleasas para la obtención de matrices nucleares
(ver tabla 2). Mediante inmunodetección en membrana de las diferentes
fracciones proteicas solubles e insolubles obtenidas después de cada una de las
extracciones e incubando con los anticuerpos PL3 y PL4 se evidenció que las
proteínas de tipo NIF presentan diferentes solubilidades (Figura 25). Una cantidad
insignificante de la proteína de 65 kDa fue solubilizada con detergente y
recuperada en el sobrenadante S1, sugiriendo que la banda de 65 kDa no
corresponde a una proteína soluble o asociada a membranas. Mediante digestión
con nucleasas y extracción con (NH4)2SO4 2,5 M se recuperó una cierta cantidad
de la proteína de 65 kDa en el sobrenadante S2, sugiriendo que una pequeña
Resultados
94
Figura 25. Asociación de las proteínas p65 NIF con el núcleoesqueleto
Las proteínas nucleares totales (N) y las fracciones de las proteínas solubles (S1, S2, S3) e insolubles
correspondientes a la matriz nuclear (F3) fueron analizadas mediante inmunodetección en membrana
incubando con los anticuerpos PL3 (A) y PL4 (B). Sólo una proporción prácticamente indetectable de la
banda de 65 kDa fue extraída con detergente y recuperada en la fracción soluble (S1). El tratamiento con
nucleasas y tampón de baja concentración salina extrajo también una proporción baja de la banda (S2). La
banda fue mayoritariamente extraída con tampón de alta concentración salina (S3). La banda de 65 kDa es
abundante en la matriz nuclear (F3). La concentración de proteínas totales depositadas en cada pocillo fue de
0,8 g/l.
fracción de esta proteína se asocia probablemente con la cromatina. Aunque la
posterior extracción con NaCl 2 M solubilizó una fracción importante de la proteína
(S3), la banda de 65 kDa aparece en la fracción insoluble final correspondiente a
la matriz nuclear (F3) revelando que una proporción significativa de la proteína de
65 kDa de tipo NIFs es muy insoluble y no es extraída con detergente, nucleasas,
o tampones de alta y baja concentración salina, formando parte de la matriz
nuclear o NSK (Figura 25A y B, F3).
2.3.2. Análisis mediante inmunofluorescencia confocal e inmunomarcado
con oro para microscopía electrónica
Usando microscopía de inmunofluorescencia confocal y los anticuerpos
PL1 a PL4 con el anticuerpo secundario antiratón Alexa 488 se confirmó la
asociación de la proteína p65 NIF con la fracción insoluble residual F3 o matriz
nuclear. La tinción apareció distribuida homogéneamente en la red de la matriz
Resultados
95
nuclear y también concentrada en algunos focos aunque el nucleolo residual no
aparece marcado (Figura 26). Estos resultados concuerdan con los resultados
previamente reportados para las proteínas semejantes a laminas en este sistema
(Mínguez y Moreno Díaz de la Espina, 1993).
Usando inmunomarcado con oro y microscopía de alta resolución y el
antisuero PL4 conjugado con oro de 10 nm también se evidenció la asociación de
la proteína con las estructuras de la matriz nuclear. Las partículas de oro se
Figura 26. Asociación de la proteína p65 NIF con el núcleoesqueleto
(A, B y C) Secciones confocales de matrices nucleares después de incubación con los anticuerpos PL4 (A) y
PL3 (B y C) y el anticuerpo antiratón Alexa 488. La proteína p65 NIF aparece distribuida homogéneamente en
la red de la matriz nuclear (B), concentrada en algunos focos (C) y en la periferia del nucleolo (A), pero no en
el nucleolo residual (A y B). (A1, B1 y C1) Imágenes DIC (contraste interferencial diferencial) de los mismos
campos de matrices nucleares (D) Imagen de inmunomarcado con oro para microscopia electrónica de una
zona de la matriz nuclear. La incubación con el antisuero PL4 muestra partículas de oro asociadas con la
lámina (flechas delgadas) y con la red de la matriz nuclear frecuentemente formando grupos (flechas
gruesas).
localizaron en la lámina y en la red de la matriz interna en donde se observaron
grupos de partículas (Figura 26). No se detectó marcado incubando con el
anticuerpo secundario omitiendo el primario (datos no presentados).
Resultados
96
2.4. Asociación de la proteína p65 NIF con proteínas estructurales del
núcleoesqueleto
Se analizó la interacción de la proteína p65 NIF con otras proteínas
estructurales que forman el complejo multiproteico de la matriz nuclear, en
concreto las proteínas semejantes a espectrina que hemos demostrado que son
proteínas estructurales constituyentes de la matriz nuclear en Allium cepa (Pérez
Munive y Moreno Díaz de la Espina, 2011).
Se investigó mediante co-inmunoprecipitación si la proteína p65 NIF está
asociada con las proteínas semejantes a espectrina en Allium cepa. Para ello, las
proteínas nucleares totales fueron inmunoprecipitadas con el anticuerpo anti-
espectrina S1390 y la presencia de la proteína p65 NIF en los complejos
inmunoprecipitados fue revelada mediante inmunodetección en membrana
incubando con los antisueros PL3 y PL4. Los resultados ponen en evidencia que
la proteína de p65 NIF está presente en el complejo proteíco inmunoprecipitado
(Figura 27A y B) demostrando la asociación de ambas proteínas en el núcleo.
Figura 27. Asociación de la proteína p65 NIF con las proteínas nucleares semejantes a espectrina en
Allium cepa.
(A y B) Co-inmunoprecipitación de proteínas semejantes a espectrina y p65 NIF. Una clara banda de 65 kDa
fue detectada en el complejo proteico inmunoprecipitado con el anticuerpo anti-espectrina S1390 (IP-1390)
mediante inmunodetección en membrana usando los antisueros PL3 (A) y PL4 (B) (◄). La banda de 55 kDa
corresponde a las cadenas pesadas del anticuerpo S1390 (*). Como control se muestra la proteína de 65 kDa
de la fracción total nuclear (N). Se depositaron en cada pocillo del gel 0.5 g/l de proteínas totales.
Resultados
97
Además, se realizó doble marcado por inmunofluorescencia confocal
usando los anticuerpos S1390 y PL3 para comprobar si las proteínas semejantes
a espectrina y p65 NIF co-localizan in situ. La imagen obtenida demostró que
ambas proteínas co-localizan principalmente en la red intranuclear, en focos, y
alrededor del nucleolo confirmando los datos de inmunoprecipitación (Figura 28).
Figura 28. Co-localización de la proteína p65 NIF y las proteínas semejantes a espectrina
(A1 y A2) Secciones confocales de un grupo de núcleos mostrando la distribución de la proteína p65 NIF y
las proteínas semejantes a espectrina después de la incubación simultánea con los anticuerpos PL3 (verde,
A1) y S1390 (rojo, A2). (A3) Superposición de los canales verde y rojo presentando colocalización de las
tinciones de S1390 y PL3 en la red intranuclear y alrededor del nucleolo. (A4) Tinción con DAPI del mismo
campo. (B1 y B2) Secciones confocales de un núcleo mostrando a mayor aumento de la distribución de las
proteínas semejantes a espectrina y la p65 después de incubación con los anticuerpos PL4 (verde, B1) y
S1390 (rojo, B2). (B3) Superposición de los canales rojo y verde mostrando la colocalización (amarillo) en la
red intranuclear y alrededor del nucleolo. (B4) Perfiles de intensidad de los canales verde y rojo a través de la
línea seleccionada de 19,7 m demostrando la colocalización de ambas proteínas.
Resultados
98
Discusión
99
DISCUSIÓN
1.- Caracterización de proteínas semejantes a espectrina en el núcleo de
Allium cepa
1.1. Proteínas semejantes a espectrina
Hemos identificado varias bandas proteicas inmunológicamente
relacionadas con espectrina en el núcleo de la monocotiledónea Allium cepa
utilizando anticuerpos que reconocen las espectrinas y de pollo y humano y
que habían sido utilizados previamente para la identificación de espectrinas
nucleares en animales (Sridharan et al., 2006) y plantas (de Ruijter et al., 2000).
Hemos descartado que las bandas detectadas se deban a una
contaminación de las fracciones con espectrinas citoplasmáticas que han sido
detectadas inmunológicamente en varias especies de plantas como tomate
(Michaud et al., 1991), arroz (Faraday y Spanswick, 1993), Vicia sativa (De Ruijter
et al., 1998), zanahoria (De Ruijter y Emons, 1993), Allium (Reuzeau et al., 1997),
Lillium (Yan et al., 1999; Zhang et al., 2004), y guisante (Bisikirsha y Sikorski,
1997), ya que la incubación de las fracciones de proteínas nucleares con un
anticuerpos contra un marcador citoplasmático como -tubulina (datos no
mostrados) dió siempre resultados negativos. Además los datos de la
inmunofluorescencia e inmunomarcado con oro demuestran la reactividad de los
anticuerpos con epítopos nucleares.
Los resultados inmunoquímicos con el anticuerpo S1390 revelan que los
núcleos de Allium cepa contienen una banda reactiva mayoritaria de 60 kDa y un
doblete de 240-220 kDa mucho menos abundante cuya movilidad es semejante a
la de las espectrinas y animales. Estas bandas de alta masa molecular son
muy sensibles a la degradación proteolítica durante la extracción nuclear y la
preparación de muestras, como también ocurre con las espectrinas y de
eritrocitos de conejo utilizados como control.
Las bandas reactivas cuyas movilidades electroforéticas varían entre 195 y
100 kDa y cuyas intensidades aumentan a medida que las intensidades de las
Discusión
100
bandas de 240-220 kDa disminuyen podrían corresponder a fragmentos
proteolíticos de éstas. El rompimiento proteolítico de las bandas de 240-220 kDa
semejantes a y -espectrina inmunodetectadas con el mismo anticuerpo se ha
reportado también en extractos nucleares de la dicotiledónea Pisum sativum. Una
banda prominente de 60 kDa también se detecta como producto del rompimiento
proteolítico de espectrina pura (Ruijter et al., 2000); y después de extraer la
proteína en animales (Burridge et al., 1982; Bachs et al., 1990) y plantas (De
Ruijter y Emons, 1993; Holzinger et al., 1999).
Usando el anticuerpo 1622 que reconoce la cadena espectrina no
eritrocítica de células de mamíferos y de pollo se detectó una banda tenue de 240
kDa que también podría romperse proteolíticamente y producir las bandas
peptídicas tenues de 185 y 96 kDa y las intensas de 195, 104 y 93 kDa. La II-
espectrina produce fragmentos péptidos de 145 y 150 kDa (Goll et al., 2003;
Morrow et al., 1980) que se rompen en péptidos de menor tamaño (Yoshida et al.,
1995).
Bandas proteicas de 220 kDa y sus probables fragmentos proteolíticos de
120 y 70 kDa se han identificado en algas verdes tales como Micrasterias
denticulata, Closterium lunula, y Euastrum oblongum con el uso de anticuerpos
anti-espectrina de eritrocitos de pollo y humano (Holzinger et al., 1999).
Las masas moleculares de las bandas peptídicas que sugerimos como
productos proteolíticos no coinciden exactamente con las de los fragmentos
peptídicos producidos por la digestión de isoformas de espectrina tal como II-
espectrina, cuya digestión con calpaína produce fragmentos de 125 y 165 kDa
(Goll et al., 2003; Morrow et al., 1980); 190 kDa en presencia de calmodulina; y
58, 62, 145, 150 y 166 kDa en presencia de calmodulina y calcio (Glantz et al.,
2007). Esto sugiere que las proteínas semejantes a y -espectrina que hemos
inmunodetectado en Allium cepa podrían presentar un mapa proteolítico
específico de plantas que podrían estar conservadas en mono y dicotiledóneas.
Pero algunas de estas bandas podrían corresponder a otras proteínas
relacionadas. La banda de 100 kDa podría ser una proteína semejante a -
actininas perteneciente a la familia de las espectrinas y que tienen masas
moleculares entre 93 y 103 kDa. El genoma de Arabidopsis contiene genes de la
superfamilia de -actinina (Kovar et al., 2000 y 2001). Las -actininas no se han
Discusión
101
identificado en NSK y se ha sugerido que son proteínas ancestrales de las
espectrinas (Baines, 2009; Virel y Backman, 2007) ya que proteínas semejantes a
ellas se han caracterizado en hongos, protozoos (Virel y Backman, 2004 y 2007) y
algas verde azuladas (Holzinger et al., 1999). Bandas proteicas de 90 y 70 kDa
han sido detectadas con un anticuerpo contra -actinina de pollo en algas verdes
tales como Micrasterias denticulata, Closterium lunula, y Euastrum oblongum
(Holzinger et al., 1999). La presencia de proteínas semejantes a -actinina en
Allium cepa confirmaría la presencia de proteínas ancestrales conservadas
evolutivamente en plantas (Li y Yen, 2001).
Aunque los genes de espectrina en plantas no han sido caracterizados el
genoma de Arabidopsis thaliana contiene al menos tres regiones que codifican
proteínas con SpRs identificables mediante análisis SMART e InterProScan
(ALIG1580, AY0599765 y ATF5E19). Los EST (Expressed Sequence Tags)
correspondientes a cada una de ellas también existen sugiriendo que estas
secuencias se transcriben (Young y Kotary, 2005). Se han clonado y secuenciado
los genes de un polipéptido similar a fimbrina en Arabidopsis thaliana L. y trigo
(Cruz-Ortega et al., 1997; Kovar et al., 2000 y 2001). La fimbrina y espectrina son
proteínas de unión a actina, de la familia de genes de espectrina en especies
animales, y se ha sugerido la presencia de esta familia de proteínas en plantas
(De Ruijter et al., 2000).
La banda mayoritaria de 60 kDa no es reconocida mediante el anticuerpo
contra la -espectrina por tanto no contiene el epítopo reconocido por este
anticuerpo. La banda podría corresponder a una proteína truncada como es el
caso de la -espectrina IV5 de 70 kDa de la matriz nuclear de células animales
(Young y Kothary, 2005), o corresponder a uno de los fragmentos proteolíticos de
las espectrinas de masa molecular mayor ya que en condiciones extremas de
degradación de las proteínas, sólo esta banda es evidente en las membranas
incubadas con el anticuerpo S1390 (datos no mostrados), lo mismo que ocurre en
las preparaciones de eritrocitos. Una banda similar se ha observado en la
dicotiledónea Pisum sativum usando el mismo anticuerpo (DeRuijter et al., 2000).
Nuestros resultados están de acuerdo con los de De Ruijter et al., 2000,
obtenidos en la dicotiledónea Pisum sativum no solo en cuanto a la presencia de
proteínas semejantes a espectrina en el núcleo de plantas sino también al tamaño
Discusión
102
de las bandas detectadas con un claro doblete de 240-220 kDa y una banda
mayoritaria de 60 kDa. En conjunto ambos resultados demuestran la conservación
de varias proteínas semejantes a espectrina con masas moleculares similares a
las espectrinas de células animales en plantas monocotiledóneas y
dicotiledóneas.
Los estudios preliminares de secuencias de péptidos de la banda de 60
kDa mediante espectroscopía de masas no revelaron homología significativa con
las y espectrinas ni con dominios específicos de estas proteínas como las
repeticiones de espectrina y dominios de calponina, aunque mostró homología
baja (score: 23,9) con la nesprina humana 1 (CAI4284) una proteína del NSK
animal con muchas repeticiones de espectrina que pertenece a la familia de
proteínas de espectrinas, sugiriendo que la proteína de 60 kDa podría compartir
algunos dominios con ella (Pérez-Munive y Moreno Díaz de la Espina, 2011).
La banda de 60 kDa tiene homología alta (score: 134,21) con la proteína de
arroz Os03g0352300 Nop56, una proteína nucleolar de 61 kDa implicada en la
maduración de las ribonucleoproteínas nucleolares de pequeño tamaño
(snoRNPs) que ha sido descrita también como una proteína de unión a
secuencias MAR asociada a la matriz nuclear (Hatton y Gray, 1999; Phelan, 2001;
Calikowsky et al., 2003).
El análisis de proteínas constituyentes del NSK de plantas ha revelado un
alto enriquecimiento en las proteínas MARBP-1 y MARBP-2 de unión a MAR
identificadas en el NSK de Pisum (Hatton y Gray, 1999; Kalikowsky et al., 2003),
significativamente homólogas a Nop58p y Nop56p de levaduras que forman parte
del núcleo de las snoRNPs funcionales (Brown et al., 2003). Esta proteínas
contienen un dominio coiled-coil de 4 y 5 -hélices involucrado en la
autodimerización de Nop56/58 in vitro, e importante para la metilación
nucleotídica (Zhang et al., 2006). En Arabidopsis los homólogos potenciales de
NOP58 son At3g05060 y At5g27120 y de NOP56 son At1g56110 y At3g12860
(Rodor et al., 2010).
Sin embargo en nuestro caso, y debido a que la asociación de la proteína
con el nucleolo no es constante, como hemos visto mediante
inmunofluorescencia, pensamos que este péptido corresponde a una
contaminación de la banda de 60 kDa cortada de los geles imposible de evitar en
Discusión
103
geles monodimensionales. Por último una reacción cruzada de la proteína Nop56
con el anticuerpo S1390 tampoco puede descartarse, aunque no parece probable.
Trabajos en el laboratorio actualmente en curso están dirigidos a la
secuenciación de las formas isoleléctricas de 60 kDa escindidas a partir de un gel
bidimensional en aras de encontrar similaridad con las repeticiones SpRs de -
actinina un miembro de la superfamilia de espectrinas que entrecruza la actina en
haces y redes, y que ha sido propuesta como el ancestro de las espectrinas, o
con las espectrinas II y II que representan el linaje que ha evolucionado con los
animales primitivos (I surge en la evolución de vertebrados y I en la de
mamíferos) (An et al., 2011). Se buscarán secuencias relacionadas con
modificaciones postranscripcionales y dominios individuales tales como CH, lin,
anquirina, PH, RhoGAP, IQ, Ig_FLMN, SpRs y EF hand, cuyos genes existieron
probablemente en la evolución temprana antes de las plantas, hongos y animales,
ya que cuando se examinan proteínas multidominios en Arabidopsis,
Dictyostelium y Homo sapiens se detectan varias combinaciones de estos
dominios. En plantas y hongos se han incorporado dominios CH sencillos en vez
de dobletes. No se han identificado -actinina, distrofina o filamina, aunque
bloques individuales como dominios de espectrina o IgFLMN están en el genoma
de Arabidopsis.
En plantas se han descrito 8 proteínas multidominios y solamente una de
ellas, la fibrina contiene dominios CH (Friedberg, 2011). En A. thaliana y S.
cerevisae las proteínas multidominios conteniendo dominios CH surgieron a partir
de dominios individuales de proteínas pequeñas en un estado de evolución
temprano existentes antes de la ramificación en plantas y animales.
Evidentemente, la formación de la mayoría de las proteínas multidominio
específicas surgieron después, probablemente mediante la producción de genes
multidominios por transposición (Friedberg, 2011).
La familia de espectrinas fue considerada por algún tiempo exclusiva del
eritrocito (Baines, 2009) sin embargo mediante análisis inmunológico, purificación
de proteínas, clonación de genes y análisis del genoma se ha revelado que esta
proteína está presente en los eumetazoos, además, el análisis genético de
invertebrados ha indicado que es esencial para su vida normal (Bennet y Bainnes,
2001). La primera aparición de la espectrina parece haber sido en los
Discusión
104
choanoflagellates tales como Monosiga brevicollis que en su genoma revela
genes de espectrina (King et al., 2008). Los vertebrados tienen 4 genes
convencionales -espectrina (I-IV) y los genomas de los mamíferos contienen
dos genes -espectrina, uno de ellos, el II-espectrina es muy similar a la -
espectrina ancestral (Baines, 2009). Por esto último sería interesante secuenciar
las proteínas de las bandas peptídicas de 240, 195, 185, 104, 96 y 93 kDa
detectadas con el anticuerpo contra -espectrina no eritrocítica para demostrar su
similaridad con -espectrinas ancestrales en Allium cepa.
1.2. Distribución intranuclear de las proteínas semejantes a espectrina
La localización subcelular de las proteínas es un indicador muy adecuado
para predecir su función. Analizamos la distribución intranuclear de las proteínas
semejantes a espectrina con dos abordajes complementarios: tinción con
inmunofluorescencia que nos permite analizar grandes poblaciones celulares e
inmuno oro para microscopía electrónica que permite hacer una adscripción de la
proteína a estructuras o dominios nucleares concretos.
La tinción con inmunofluorescencia demostró que las proteínas semejantes
a espectrina presentan una distribución heterogénea en núcleos de células
meristemáticas asincrónicas de Allium cepa. Todas las células presentan una
asociación constante de las proteínas semejantes a espectrina con la periferia
nuclear reflejando su asociación con la EN y no una contaminación con espectrina
citoplasmática, como lo demuestran los datos de inmunomarcado para ME que
detectan claramente las proteínas en la MNI. Esta asociación sugiere un papel
para las proteínas semejantes a espectrina de plantas en la estabilización de la
red periférica nuclear como se ha propuesto para células animales (Sridharan et
al., 2006). En células animales esta estabilización se cree que ocurre a través de
la interacción de espectrina con proteínas estructurales de la EN como laminas,
emerina y proteína 4.1 (Sridharan et al., 2006). Sin embargo estas proteínas no
están conservadas en plantas y por tanto las proteínas que interaccionan con
espectrina en esta estructura están sin determinar (Moreno Díaz de la Espina,
2009; Graumann y Evans, 2011).
Discusión
105
Esta distribución periférica de antígenos semejantes a espectrina se ha
detectado también en células meristemáticas de embriones somáticos de
zanahoria (De Ruijter y Emons, 1993); así como en células vivas de epidermis de
Allium (Reuzean et al., 1997), y en células corticales de raíz de Vicia y Pisum, y
en plúmulas de Pisum (De Ruijter et al., 2000)
En la mayor parte de los núcleos las proteínas nucleares semejantes a
espectrina de Allium cepa tienen además una distribución en focos nucleares
similar a la reportada en células animales (Tse et al., 2001; Young y Kothary,
2005), lo que sugiere que estas proteínas podrían estar implicadas en funciones
conservadas en animales y plantas como la reparación y remodelación de
cromatina, transcripción y procesamiento de ARN que también se organizan en
focos nucleares (Young y Kothary, 2005; Sridharan et al., 2006).
Además una pequeña fracción de núcleos presentaron distribución
reticulada en la red de los dominios intercromatínicos que rodea al nucleolo y que
se conecta a la EN. Esta distribución dual también acontece con otras proteínas
nucleares en Allium cepa, tal como la proteína AcMFP1 de unión a ADN
(Samaniego et al., 2008) y la proteína NMI de unión a actina (Cruz y Moreno Díaz
de la Espina, 2009). El análisis de células meristemáticas sincronizadas reveló
que la distribución reticulada de AcMFP1 corresponde a las células en G2,
mientras que las células en G1 y S presentan distribución en focos (Samaniego et
al., 2008). Esta distribución transitoria de las proteínas semejantes a espectrina
también ha sido descrita en Pisum sativum, en donde hay evidencia de la
distribución en focos nucleoplásmicos, periferia nuclear, y retículo nucleoplásmico
(de Ruijter et al., 2000). Esta distribución podría ser típica de plantas como A.
cepa y P. sativum que tienen una organización nuclear reticulada.
Aunque la tinción de IF sugiere que las proteínas semejantes a espectrina
están asociadas con los dominios intercromatínicos, el inmunomarcado de alta
resolución para ME reveló una asociación preferencial con los dominios
pericromatínicos, por lo que estas proteínas podrían estar involucradas en las
funciones asociadas a estos dominios, como la organización y remodelación de la
cromatina, transcripción, etc. (Nunez et al., 2009).
En contraste con la dicotiledónea P. sativum (De Ruijter et al., 2000),
nosotros observamos que en Allium cepa las proteínas semejantes a espectrina
Discusión
106
también están asociadas al nucleolo, lo que fue confirmado tanto por
inmunomarcado para IF como por inmunomarcado con oro para ME. Esta
localización ocurre también en el núcleo humano (Dingova et al., 2009) y en
oocitos de Xenopus (Carotenuto et al., 1997).
La distribución heterogénea de los epítopos de espectrina que nosotros
detectamos en el núcleo de células meristemáticas asincrónicas sugiere que las
proteínas semejantes a espectrina nucleares podrían estar involucradas en
múltiples procesos nucleares. Esto concuerda con la capacidad de la espectrina
nuclear de asociarse con diferentes proteínas implicadas con la organización
estructural, reparación del ADN, remodelación de la cromatina, transcripción y
procesamiento del ARN (Sridharan et al., 2006). Además estas actividades
variadas posiblemente asociadas a las proteínas semejantes a espectrina están
de acuerdo con su localización en los dominios pericromatínicos nucleares en
donde estos procesos se llevan a cabo (Nunez et al., 2009).
1.3. Asociación de las proteínas semejantes a espectrina con el NSK de
células meristemáticas de Allium cepa
La extracción secuencial de los núcleos para obtener el NSK o matriz
nuclear reveló que las proteínas semejantes a espectrina son muy insolubles a
excepción de una banda de 100 kDa que estaría asociada a la cromatina y la
banda de 60 kDa que presenta fracciones con diferente solubilidad. A pesar de
esto la banda de 60 kDa es un componente mayoritario del NSK mientras que las
de 240 y 220 kDa y las de masas moleculares intermedias son componentes
minoritarios del mismo. Aunque no se puede excluir una proteólisis de las
proteínas de 240 y 220 kDa durante la extracción secuencial, la existencia de una
-espectrina truncada de 70 kDa (Tse et al., 2001) en la matriz nuclear de células
de mamíferos que se asocia con la -espectrina nuclear (Sridharan et al., 2006)
sugeriría que la isoforma de 60 kDa podría ser la proteína semejante a espectrina
mayoritaria de la matriz nuclear de Allium cepa.
En la matriz nuclear de la dicotiledónea Pisum sativum las bandas de 240 y
220 no fueron detectadas probablemente por un problema de sensibilidad en el
Discusión
107
método de detección, pero sí la banda de 60 kDa confirmando que sería un
componente conservado en esta fracción en plantas (de Ruijter et al., 2000).
Los datos de detección in situ de estas proteínas mediante
inmunofluorescencia e inmunomarcado con oro para ME confirman que las
proteínas semejantes a espectrinas son componentes estructurales del retículo de
la matriz interna y de la lámina periférica, de acuerdo con los datos obtenidos en
Pisum sativum (de Ruijter et al., 2000)
Estos datos sugieren que las proteínas semejantes a espectrina serían
proteínas estructurales involucradas en la organización de los complejos
multiméricos proteicos del NSK de plantas, actuando como proteínas de conexión
en estas estructuras, de forma similar a lo que ocurre en núcleos animales, en
donde la espectrina se asocia con diversos componentes del NSK, tales como la
lamina A y emerina (Sridharan et al., 2006). Aunque estas proteínas que se unen
con espectrina en animales no están conservadas en plantas (Moreno Díaz de la
Espina, 2009) y no se conocen todavía las proteínas que se asocian con las
proteínas semejantes a espectrina en ellas.
Nuestros resultados de colocalización y co-inmunoprecipición demuestran
una asociación de las proteínas semejantes a espectrina con los filamentos
intermedios nucleares (NIFs) que son proteínas estructurales del núcleo de
plantas (Blumenthal et al., 2004) como discutimos más adelante. De esta forma
demostramos la asociación de las proteínas semejantes a espectrina con
proteínas estructurales específicas del núcleo de plantas.
1.4. Asociación de las proteínas similares a espectrina con actina en el
núcleo de Allium cepa
La actina nuclear está implicada en funciones nucleares fundamentales
como ultraestructura, organización, remodelación y movimiento de la cromatina,
transcripción, transducción de señales entre el núcleo y el citoplasma, etc., y
además se asocia con diferentes tipos de proteínas que regulan su función y la
conectan con otros componentes (Visa y Percipalle, 2010). Para la realización de
estas funciones la actina nuclear se encuentra en su mayor parte formando
complejos multiméricos con otras proteínas nucleares. Se ha demostrado que la
Discusión
108
actina forma parte de muchos complejos proteicos nucleares que van desde los
complejos de remodelación de cromatina que son muy dinámicos, a complejos
estructurales de la matriz nuclear más estables en asociación con proteínas
estructurales de unión a actina (ABPs) (Castano et al., 2010).
En células animales se han descrito varias proteínas nucleares que
constituyen ABPs estructurales como -espectrina, -espectrina IV5, nesprinas,
proteína 4.1, lamina A y emerina (Sridharan et al., 2006; Castano et al., 2010).
Ninguna de ellas está conservada en plantas ni existen los genes ortólogos en los
genomas secuenciados (Moreno Díaz de la Espina, 2009), aunque en ellas se ha
demostrado claramente la presencia y funcionalidad de la actina nuclear (Cruz y
Moreno Díaz de Espina, 2009; Kandasamy et al., 2010). De hecho solo se habían
descrito hasta el presente tres ABPs en el núcleo de plantas: profilina (de 14 kDa)
implicada en la regulación de la fracción de actina monomérica (Gibbon y Staiger,
2000; Kandasamy et al., 2002; Vartiainen et al., 2008), el factor de
despolimerización de actina (ADF) (Ruzicka et al., 2007), y la proteína motor
miosina nuclear I (NMI) (Cruz y Moreno Díaz de la Espina, 2009), y ninguna de
ellas es una proteína estructural del núcleo. Por este motivo decidimos investigar
si las proteínas semejantes a espectrina detectadas en el núcleo de Allium cepa
que forman parte del NSK podrían constituir ABPs estructurales nucleares.
Nuestros resultados de inmunoprecipitación demuestran que las proteínas
semejantes a espectrina del núcleo de plantas interaccionan con actina y son por
tanto ABPs. Estos resultados demuestran una funcionalidad semejante de las
proteínas nucleares semejantes a espectrina de plantas y las espectrinas
animales que también se asocian con actina y son ABPs estructurales (Sridharan
et al., 2006; Dingová et al., 2009; Castano et al., 2010), indicando que las
proteínas semejantes a espectrina estarían también implicadas en funciones
esenciales conservadas del núcleo eucariótico.
Esta es la primera vez que se describe una ABP estructural en los núcleos
de plantas. Los resultados de co-localización de ambas proteínas demuestran
además que la asociación entre ambas proteínas ocurre también in situ, y no solo
en la red intercromatínica que correspondería al NSK con una función estructural,
sino también en focos nucleares en los que ambas proteínas estarían
Discusión
109
involucradas en otras funciones como podrían ser transcripción o remodelación de
cromatina.
2. Filamentos intermedios nucleares (NIFs) en el núcleo y NSK de plantas
Las laminas, que constituyen las proteínas del tipo V de la familia de los FIs
son los componentes principales del NSK animal. Forman distintas redes de
filamentos que se concentran en la lámina nuclear aunque se encuentran también
en el NSK interno. Aunque los análisis de secuencias sugieren que las plantas
carecen de genes que codifiquen las proteínas de tipo filamentos intermedios, las
evidencias inmunológicas demuestran que el núcleo vegetal contiene proteínas
que tienen reacción cruzada con ellas y comparten por tanto epítopos. Este es el
caso del anticuerpo IFA que es un anticuerpo general contra los filamentos
intermedios (Pruss, 1981; Hermann et al., 2000; Frederick et al., 1992; Li y Roux,
1992) y los anticuerpos contra laminas de diferentes tipos y orígenes que
reconocen proteínas nucleares relacionadas con valores conservados de masa
molecular, pI y distribución nuclear en varias especies de plantas (Frederick et al.,
1992; Li y Roux, 1992; McNulty y Saunders, 1992; Mínguez y Moreno Díaz de la
Espina, 1993; Ivanchenko et al., 1993; Moreno Díaz de la Espina, 1995 y 2009).
En los análisis de búsquedas de homologías utlizando el algoritmo
PROSEARCH que permite efectuar predicciones de homología con identidades
de secuencia por debajo del 25%, se han identificado 13 proteínas con homología
con diversas laminas en Arabidopsis, en concreto con las laminas LI, LII y L3 de
Xenopus laevis, lamina A de ratón, lamina B2 de pollo y laminas Dm 0 y C de
Drosophila melanogaster (Gardiner et al., 2011). Dos de ellas (AtFPP2 y AtFPP3)
son miembros de la familia FPP de proteínas semejantes a filamentos específica
de plantas (Gindullis et al., 2002)
En plantas se ha acumulado información sobre la existencia de estructuras
nucleares similares a la lámina y sus proteínas constituyentes. Los resultados
incluyen la observación de una red filamentosa adyacente a la EN que
interconecta los PNCs (Moreno Díaz de la Espina et al., 1991; Moreno Díaz de la
Espina, 1995 y 2009; Fiserova et al., 2009); la identificación inmunológica de
Discusión
110
proteínas semejantes a laminas (Mínguez y Moreno Díaz de la Espina, 1993; Li y
Roux, 1992; McNulty y Saunders, 1992, Moreno Díaz de la Espina, 1995); y la
presencia de proteínas filamentosas específicas de plantas en la periferia nuclear,
como las proteínas constituyentes de la matriz nuclear (NMCP1 y NMCP2) de
Daucus carota y Apium graveolens (Masuda et al., 1997; Kimura et al., 2010) y
sus homólogas LINC1 y LINC2 en Arabidopsis thaliana (Dittmer et al., 2007).
El estudio de las proteínas semejantes a laminas se ha realizado en varias
especies de plantas tales como Daucus carota, Vicia faba y Pisum sativum
(Frederick et al., 1992), maíz (Ivanchenco et al., 1993) y Allium cepa L. (Mínguez
y Moreno Díaz de la Espina, 1993; Moreno Díaz de la Espina, 1995). En
preparaciones nucleares de estas plantas se ha identificado un patrón similar en
los valores de las masas moleculares de estas proteínas, con dos bandas
proteicas de 60 y 65 kDa detectadas con los anticuerpos IFA y diversos anti-
laminas de animales; así como en los valores de pI; y en la distribución de
epítopos en el núcleo y NSK mediante inmunomarcado para microscopía confocal
y electrónica in situ.
Posteriormente las proteínas NIFs con masas moleculares de 54, 60 y 65
kDa (p54, p60 y p65) se han descrito en las fracciones correspondientes al NSK y
lámina nuclear de Pisum sativum, estas proteínas presentan reactividad cruzada
con las laminas de pollo y forman filamentos de 6-12 nm de diámetro in vitro. El
análisis de péptidos de p65 y p60 reveló que éstas tienen secuencias similares
con las laminas animales, queratinas y otras proteínas de plantas que contienen
dominios coiled-coil como NAG y FPP3 (Blumenthal et al., 2004). No se han
encontrado en el genoma de Arabidopsis secuencias que correspondan
exactamente a p65 y p60, sin embargo dos proteínas: AtNAC1 y AtFPP3
muestran similaridad alta con varios de los péptidos de p65 y p60. Además las
proteínas nucleares de Arabidopsis muestran reacción cruzada con los
anticuerpos anti-p65NIF reconociendo tres bandas, la mayoritaria de 65 kDa
(Blumenthal et al., 2004).
En plantas las proteínas inmunológicamente semejantes a las laminas y los
NIFs comparten epítopos y características bioquímicas, por ésto y por el
interesante papel que podrían tener como proteínas específicas del NSK y como
homólogos funcionales de las laminas animales (Mínguez y Moreno Díaz de la
Discusión
111
Espina, 1993; Blumenthal et al., 2004; Moreno Díaz de la Espina, 2009) nos
planteamos de manera prioritaria la identificación y caracterización de los NIFs en
Allium cepa y su relación con las proteínas semejantes a las laminas previamente
caracterizadas en este sistema.
2.1. Caracterización de proteínas de tipo NIF en el núcleo de Allium cepa
Los resultados de las inmunodetecciones en membranas usando los tres
sueros policlonales producidos contra la proteína p65 de guisante, demuestran
consistentemente dos bandas reactivas en núcleos de Allium cepa con las
mismas masas moleculares de estos NIFs de Pisum sativum (Blumenthal et al.,
2004). Bandas similares de 65 y 60 kDa han sido detectadas también en núcleos
de tres dicotiledóneas (Daucus carota, Vicia faba, y Pisum sativum) con el
anticuerpo IFA general contra filamentos intermedios (Frederick et al., 1992) que
reconoce también los NIFs de Pisum sativum (Blumenthal et al., 2004), sugiriendo
que los NIFs son componentes habituales del núcleo y NSK de dicotiledóneas.
Datos previos en geles bidimensionales de núcleos de Allium cepa también
demostraron varias manchas entre 65 y 60 kDa con un rango de pIs entre 5 y 7
después de incubación con IFA sugiriendo que estas proteínas están también
conservadas en monocotiledóneas (Mínguez y Moreno Díaz de la Espina, 1993;
Moreno Díaz de la Espina, 1995).
Nuestros presentes resultados usando sueros específicos demuestran por
primera vez la existencia de NIFs en monocotiledóneas apuntando a una
conservación generalizada de estas proteínas en plantas superiores.
La reacción en geles bidimensionales demuestra que ambos NIFs
presentan dos isoformas con valores de 5,4 y 5,5 para p65 y más básicos (6,5 y
6,6) para p60. En el caso de p65 los pIs son similares a los del p65 NIF de Pisum
sativum aunque en el caso de p60 son más básicos (Blumenthal et al., 2004),
sugiriendo que ambas proteínas presentarían diferentes modificaciones que
afectan a su pI. La banda de 60 kDa podría corresponder a una modificación de la
p65 que variaría ligeramente su masa molecular y también su pI.
Las imágenes de inmunomicroscopía confocal de los núcleos de Allium
cepa usando los anticuerpos contra p65 NIF muestran muy claramente la
Discusión
112
distribución de la proteína en la periferia del núcleo y una red intranuclear, con
algunos focos de acumulación más abundantes alrededor del nucleolo, y es
compatible con lo reportado en células de plúmulas de Pisum sativum usando el
mismo anticuerpo y microscrospía confocal, aunque las imágenes en este último
caso presentan una resolución mucho menor (Blumenthal et al., 2004).
Los resultados de la localización ultraestructural de la proteína p65 NIF en
Allium cepa mediante inmunomarcado con oro para ME confirman que los NIFs se
asocian con filamentos que conectan a los PNCs que corresponderían a los
filamentos constituyentes de la lámina nuclear (Fiserova et al., 2009), confirmando
que estas proteínas forman parte de la lámina y podrían realizar funciones de
laminas. El marcado intranuclear abundante en la periferia de los dominios
pericromatínicos sugiere que esta proteína está involucrada en las funciones que
se realizan en estos dominios, tales como la organización y remodelación de la
cromatina, y transcripción (Nuñez et al., 2009) en las que están involucradas las
laminas (Dechat et al., 2008 y 2009).
Todos estos datos demuestran la conservación de la proteína p65 NIF de la
dicotiledónea Pisum sativum en los núcleos de las células meristemáticas
radiculares de la monocotiledónea Allium cepa, sugiriendo que los NIFs serían
componentes nucleares de plantas superiores con una funcionalidad conservada
2.2. p65 NIF es un componente estructural del NSK
Aunque la proteína p65 NIF presenta fracciones con diferente solubilidad,
principalmente en alta fuerza iónica, está enriquecida en la fracción de proteínas
insolubles correspondientes al NSK demostrando que se trata de una proteína
estructural al igual que la proteína homóloga de Pisum sativum (Blumenthal et al.,
2004). Los análisis mediante inmunofluorescencia confocal e inmunomarcado con
oro para ME demuestran además que la proteína p65 de Allium cepa es una
proteína estructural implicada en la organización de la lámina y el retículo de la
matriz interna, similar a las laminas descritas previamente en este sistema
(Mínguez y Moreno Díaz de la Espina, 1993; Moreno Díaz de la Espina, 1995) y a
las laminas animales (Barboro et al., 2010)
Discusión
113
El NIF p65 de Allium cepa presenta muchas similaridades con las laminas
animales como son el tamaño y los valores de pI, localización en la lámina y
matriz interna (Barboro et al., 2010) y asociación con la cromatina (Dechat et al.,
2009). Además los sueros PLs producidos contra el NIF p65 de Pisum sativum
presentan reacción cruzada con laminas animales, y los péptidos obtenidos de
p65 muestran similitud con regiones cortas de las laminas animales (Blumenthal
et al., 2004).
Todas estas evidencias sugieren que el NIF p65 de Allium cepa sería un
componente estructural del NSK que podría estar implicado en la organización de
la lámina y NKS interno y que podría corresponder a un homólogo funcional
distante de las laminas animales como se ha propuesto en Allium cepa y que
analizaremos a continuación (Pérez-Munive et al., 2011, en revisión).
Sin embargo los NIFs y las proteínas semejantes a laminas no serían los
únicos componentes coiled-coil del NSK en plantas ya que se ha demostrado que
existen otras proteínas estructurales de la lámina y NKS interno específicas de
plantas denominadas NMCPs o LINC con un tamaño mayor que el de los NIFs
que estarían implicadas en la organización del núcleo y cromatina (Masuda et al.,
1997; Dittmer et al., 2007).
Trabajos en curso en el laboratorio han demostrado los homólogos de
estas proteínas en Allium cepa. AcNMCP1 es altamente insoluble, tiene una masa
molecular mayor que en dicotiledóneas y su distribución nuclear es semejante a la
de los NIFs aunque se acumula preferentemente en la periferia nuclear. Las
secuencias peptídicas de AcNMCP1 están conservadas con respecto a las
proteínas de Arabidopsis y Daucus carota pero no tienen ninguna semejanza con
las de los NIFs de Pisum (Ciska et al., 2011). Estos datos demuestran la
existencia de al menos dos familias de proteínas coiled-coil estructurales en el
núcleo de Allium cepa, NIFs y NMCPs con distinta secuencia y tamaño pero con
localización semejante en el núcleo y NSK.
Discusión
114
2.3. Asociación de p65 NIF con proteínas semejantes a espectrina
constituyentes del NSK de Allium cepa
Los NIFs se han postulado como posibles homólogos funcionales de
laminas en plantas (Blumenthal et al., 2004; Moreno Díaz de la Espina, 2009),
pero las plantas carecen de ortólogos de las principales proteínas que se unen a
laminas como LRB, LAPs y emerina (Wilson y Foisner, 2010).
Para desvelar las proteínas estucturales que interaccionan con p65 NIF en
el núcleo de Allium cepa, investigamos su asociación con espectrina, un
componente estructural del núcleo (Young y Kothary, 2005) que hemos
demostrado que también forma parte del NSK de la monocotiledónea Allium cepa
(Pérez-Munive y Moreno Díaz de la Espina, 2011). Las espectrinas nucleares
animales están implicadas en diferentes procesos nucleares y se asocian con
diferentes proteínas incluyendo aquellas implicadas en organización estructural,
estabilidad de la matriz nuclear y organización de la cromatina como la lamina A
(Sridharan et al., 2006)
Los resultados de co-inmunoprecipitación demuestran la asociación de p65
NIF con las proteínas semejantes a espectrina en el núcleo de Allium cepa. Estos
resultados de asociación de ambas proteínas en un complejo multiproteico han
sido confirmados con los datos de co-localización in situ de las mismas en el
núcleo mediante inmunofluorescencia confocal, demostrando la asociación de p65
NIF y proteínas semejantes a espectrina en el retículo intranuclear.
Así en esta tesis determinamos por primera vez una de las proteínas de la
red intranuclear del NSK que interacciona con los NIFs de plantas. Estos
resultados representan una contribución importante en la investigación en el
campo de las interacciones macromoleculares implicadas en la organización del
núcleo y NSK de plantas, un campo muy poco desarrollado actualmente (Moreno
Díaz de la Espina, 2009)
Discusión
115
2.4. Comparación de las proteínas de tipo NIF y proteínas semejantes a las
laminas en Allium cepa
Existe una controversia respecto a la existencia de proteínas semejantes a
laminas en plantas. La conclusión de que las plantas carecen de FIs y laminas se
basa en que los genomas de plantas secuenciados hasta el presente carecen de
genes ortólogos de las laminas animales, aunque los análisis de búsqueda de
homología mediante PROSEARCH que permite efectuar predicciones de
homología con identidades de secuencia por debajo del 25% (y hay que recordar
que la familia de los FIs tiene identidad de secuencias limitada: Hermann et al.,
2007) han detectado 13 proteínas con homología con diversas laminas (Gardiner
et al., 2011), dos de las cuales AtFPP1 y AtFPP3 son miembros de una familia de
proteínas que ya había sido propuesta como filamentos intermedios de plantas
debido a su organización en coiled-coil (Gindullis et al., 2002).
Por otra parte en los años noventa se habían descrito proteínas que
presentaban reacción cruzada con distintas laminas animales en varias especies
de plantas y en diferentes laboratorios (Frederick et al., 1992; Li y Roux, 1992;
McNulty y Saunders, 1992; Mínguez y Moreno Díaz de la Espina, 1993;
Ivanchenko et al., 1993; Moreno Díaz de la Espina, 1995). Esta proteínas
presentaban masas moleculares, valores de pI y localización nuclear semejante a
las laminas animales. Posteriormente en 2004 Blumenthal y colaboradores
describieron en Pisum sativum las proteínas NIFs que también presentan reacción
cruzada con las laminas animales y masas moleculares y valores de pI
semejantes. El análisis de péptidos demostró que tienen secuencias similares con
laminas animales y con la proteína FPP3 de Arabidopsis que ha sido propuesta
recientemente como un homólogo de laminas en plantas (Gardiner et al., 2011).
Debido a que ya entonces la existencia de laminas en plantas se había puesto en
entredicho a la vista de los datos genómicos de Arabidopsis los denominaron
NIFs ya que además de su reacción cruzada y analogía de secuencia con FIs
formaban filamentos in vitro (Blumenthal et al., 2004).
Los proteínas NIFs semejantes a laminas en núcleos de plantas podrían
haber conservado los dominios característicos implicados en la polimerización de
los FIs animales y de las laminas, de tal forma que son reconocidas por el
Discusión
116
anticuerpo IFA (Pruss et al., 1981; Herrmann et al., 2000), y podrían contener
otros dominios funcionales de laminas junto con otros específicos de plantas y
funcionar como homólogos funcionales de las laminas, tal como ocurre con la
coilina (involucrada en la organización de los cuerpos de Cajal) en Arabidopsis,
que presenta muy baja homología con la coilina de vertebrados pero conserva la
misma localización y funcionalidad como se ha comprobado en los mutantes del
gen (Collier et al., 2006).
Existen muchas similitudes entre el p65 NIF de Allium cepa y algunas de
las proteínas descritas previamente como laminas en este sistema.
En primer lugar entre las proteínas previamente descritas como laminas,
existen algunas que presentan la misma masa molecular (65 kDa) y pIs similares
a p65 NIF. Estas se corresponden con la proteína de 65 kDa (pI 5,75) reconocida
mediante el anticuerpo contra la L1 de Xenopus laevis y la proteína de 65 kDa (pI
5,65) reconocida por el anticuerpo contra la lamina A de pollo (Moreno Díaz de la
Espina, 1995). Además, ambas proteínas así como p65 NIF reaccionan con el
anticuerpo IFA que reconoce un dominio conservado de los FIs implicado en la
dimerización demostrando que se trataría en todos los casos de proteínas de tipo
FIs. Su especificidad nuclear está apoyada porque las proteínas semejantes a
laminas no son reconocidas por anticuerpos contra FIs citoplasmáticos
específicos de plantas tal como el anticuerpo monoclonal MAC322 contra FIs del
citoplasma de zanahoria (Mínguez y Moreno Díaz de la Espina, 1993).
Ambos tipos de proteínas p65 NIFs y las laminas de 65 kDa presentan la
misma distribución en la periferia nuclear pero también en el interior del núcleo
formando parte de la lamina periférica y endoesqueleto, que es también similar a
la que presentan las laminas animales (Dechat et al., 2010a,b) y por lo tanto
podrían estar implicadas en funciones similares.
Tercero: la reactividad de las proteínas nucleares de 65 kDa con los
anticuerpos contra el NIF p65 de Pisum sativum, los anticuerpos anti-lamina L1 de
Xenopus y lamina B de pollo e IFA sugieren que estas proteínas contendrían no
solo el dominio de dimerización general de todos los FIs sino también epítopos
específicos de las laminas animales y NIFs de plantas.
Discusión
117
En base a todo lo anterior podemos concluir que Acp65 NIF correspondería
a una de las proteínas previamente descritas como laminas en este sistema
(Moreno Díaz de la Espina, 1995).
En cuanto a su funcionalidad como lamina la p65 NIF realiza algunas de las
funciones atribuidas a las laminas como la función estructural, ya que forma parte
de la lámina y endoesqueleto. Otras funciones asociadas a laminas como
organización, replicación y expresión del ADN podrían estar sugeridas por su
localización pericromatínica pero necesitarían más evidencias experimentales
para confirmarse. Además Acp65 NIF se asocia con la espectrina al igual que
ocurre con la lamina A de mamíferos (Sridharan et al., 2006). Por tanto no
podemos afirmar que el papel de Acp65 NIF sea análogo al de las laminas
animales, ya que como vimos anteriormente existen otras proteínas específicas
de plantas como NMCPs que también tienen estuctura coiled-coil y son
componentes de la lámina y endoesqueleto (Ciska et al., 2011).
Discusión
118
Conclusiones
119
CONCLUSIONES
Los resultados de este trabajo conducido bajo la hipótesis de que las
plantas podrían tener proteínas estructurales del NSK específicas con dominios
conservados con las proteínas animales pero con similaridad de secuencia muy
baja, que constituirían homólogos funcionales de las mismas y en el cual se han
investigado las características de dos proteínas estructurales coiled-coil del NSK:
proteínas del tipo NIF y proteínas semejantes a espectrina en la planta
monocotiledónea Allium cepa L. var. francesa han generado las siguientes
conclusiones:
1.- Los núcleos de las células meristemáticas de la raíz de Allium cepa
contienen proteínas semejantes a espectrina que tienen diferentes masas
moleculares (240, 220 y 60 kDa) siendo la mayoritaria la de 60 kDa con varias
isoformas de pI entre 5,7 y 6,5. Las de 240 y 220 kDa tienen masas moleculares
que corresponden a las de las espectrinas y , mientras que las de masas
moleculares menores podrían corresponder a proteínas específicas como es el
caso de la -espectrina truncada de 70 kDa del NSK de animales o a productos
proteolíticos de las mismas.
2.- La proteína de 60 kDa no fue detectada mediante el anticuerpo 1622
que reconoce a la -especrina no eritrocítica lo que sugiere que esta proteína no
tiene epítopos reconocidos por este anticuerpo o que han sido eliminados
proteoliticamente. Este anticuerpo detectó a una banda tenue de 240 kDa
correspondiente a la -espectina y a varias bandas menores, una de 190 kDa
corresponde a isoformas con pI de 4,6 a 5,0 y de 6,3 a 6,6.
3.- Las proteínas semejantes a espectrina presentan una distribución
nuclear heterogénea en la población meristemátca asincrónica de Allium cepa,
surgiriendo su implicación en diferentes funciones nucleares. Aparecen asociadas
a la envoltura nuclear, regiones pericromatínicas, focos nucleares y nucleolo.
Conclusiones
120
4.- Las proteínas semejantes a espectrina forman parte del NSK. La
espectrina de 60 kDa es la mayoritaria en el NSK, aunque presenta varias
fracciones con diferente solubilidad. Las espectrinas de 240 y 220 kDa son menos
abundantes en el NSK. Las bandas de movilidad intermedia, posibles productos
de degradación proteolítica aparecen también asociadas al NSK a excepción de la
banda de 100 kDa. Estas proteínas se distribuyen en el retículo de la matriz
interna o endonucleoesqueleto y en la lámina que constituye el nucleoesqueleto
periférico.
5.- El análisis de péptidos de la proteína de 60 kDa mediante
espectrometría de masas no ha revelado homología con ninguna de las proteínas
de la familia de la espectrina aunque mostró similitud baja con la nesprina-1
humana, una proteína del NSK que contiene repeticiones de espectrina
perteneciente a esta familia de proteínas. Este hecho así como la presencia de
epítopos comunes con las espectrinas de origen animal sugiere que podría
tratarse de una proteína específica de plantas que contendría algunos dominios
conservados con las espectrinas, aunque la mayor parte de su secuencia no
estaría relacionada.
6.- Los resultados de inmunoprecipitación y co-localización demuestran que
las proteínas nucleares semejantes a espectrina se asocian con actina y
constituyen la primera referencia de proteínas estructurales nucleares de unión a
actina en plantas. Estos resultados demuestran también una funcionalidad
semejante de estas proteínas y las espectrinas nucleares de animales.
7.- Los núcleos de las células meristemáticas de la raíz de Allium cepa
contienen una proteína p65NIF que tiene epítopos conservados con los filamentos
intermedios nucleares (NIFs) de Pisum sativum y también los reconocidos con el
anticuerpo IFA que reconoce a todos los FIs. Demostrando que estas proteínas
descritas en una dicotiledónea están también conservadas en monocotiledóneas.
8.- La proteína AcNIF mayoritaria tiene una masa molecular de 65 kDa y pI
entre 5,5 y 5,6. Detectándose asimismo una forma minoritaria de 60 kDa y pI 6,5 y
Conclusiones
121
6,6 que podría corresponder a una modificación de la misma. Estos valores son
similares a los de las NIFs descritas en la dicotiledónea Pisum sativum.
9.- p65 AcNIF se distribuye en la envoltura nuclear y en los dominios
pericromatínicos.
10.- p65 AcNIF presenta distintas fracciones con diferente solubilidad. Una
fracción minoritaria se extrae de los núcleos mediante baja fuerza iónica, otra más
abundante se une débilmente al NSK siendo necesaria alta fuerza iónica para su
extracción y finalmente una fracción de p65 AcNIF permanece asociada a la
fracción insoluble formando parte del NSK.
11.- Las proteínas semejantes a espectrina y p65 AcNIF se asocian en el
núcleo. Estos resultados constituyen la primera evidencia de asociación entre
proteínas estructurales del núcleo de plantas. Ambas proteínas forman parte del
NSK donde probablemente juegan un papel importante en la organización
estructural y funcional de los procesos nucleares en plantas.
12.- En base a la similitud de masa molecular, pI, distribución nuclear,
presencia en el NSK y reacción con IFA, la proteína p65 AcNIF podría
corresponder a una de las proteínas previamente caracterizadas como laminas en
Allium cepa que es reconocida por los anticuerpos anti-lamina L1 de Xenopus y
anti-lamina A de pollo.
Conclusiones
122
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