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IDENTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DEL CUELLO DE LAS ROPTRIAS 2 (RON2) DE Plasmodium vivax
GABRIELA ARÉVALO PINZÓN
Trabajo de grado presentado como requisito para obtener el título de
MSc. EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Director:
MANUEL ALFONSO PATARROYO GUTIÉRREZ, M.D., Dr.Sc.
Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC)
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
MAESTRIA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
BOGOTÁ, COLOMBIA
2011
NOTA DE ADVERTENCIA
"La Universidad no se hace responsable por los
conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos
de tesis. Solo velará por que no se publique nada
contrario al dogma y a la moral católica y por que las
tesis no contengan ataques personales contra
persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia". Artículo 23 de la
Resolución No13 de julio de 1946.
Aprobada por la Facultad de Ciencias en cumplimiento
de los requisitos exigidos para otorgar al título de MSc.
en Ciencias Biológicas.
_____________________________________
Ingrid Schuller, Ph.D
Decana Académica
Pontificia Universidad Javeriana
______________________________________
Manuel Antonio Franco, M.D., Ph.D.
Director de Posgrado en Ciencias Biológicas
A mi mamá, por su cariño, comprensión y apoyo incondicional,
…gracias por guiarme por este camino y entender todas aquellas veces
que no he podido estar a su lado. A mi esposo, por su comprensión y
amor, que me hacen sentir que puedo lograr todo lo que me propongo;
Gracias por escucharme, por sus consejos y por ser parte de mi vida.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al Doctor Manuel Alfonso Patarroyo por seguir confiando en mí, por su paciencia y por la dirección de este trabajo.
Muchas gracias a Hernando Curtidor por su apoyo, su exigencia y consejos durante este proceso de aprendizaje.
A mi jefe (Manuel Elkin Patarroyo), quien me ha permitido formarme en uno de los mejores institutos de Investigación en Colombia y que sepa que, en tanto pueda, seguiré allí.
A los Grupos de Biología Molecular-Malaria, Síntesis y Receptor-Ligando por toda su colaboración y enseñanza.
A mis compañeras de laboratorio, Liliana y Diana por sus consejos durante el proceso experimental de mi tesis.
A mis amigas Giovanna Bedón, Diana Millán y Ruth Sánchez por escucharme, apoyarme y confiar siempre en que puedo lograr cosas grandiosas.
A mi familia: mi hermano (Fernando), mis abuelos (Silvina y Gustavo), mis tías (Mireya, Priscila, Martha y Nubia) y a mis primas por toda la energía que me han transmitido.
A la Pontificia Universidad Javeriana y en especial al posgrado en Ciencias Biológicas por sus enseñanzas.
A mis docentes, que participaron en mi desarrollo profesional durante mi maestría, sus conocimientos fueron fundamentales para culminar este proceso.
RESUMEN
IDENTIFICACIÓN DE LA PROTEÍNA DEL CUELLO DE LAS ROPTRIAS 2 (RON2) DE Plasmodium vivax
por
GABRIELA ARÉVALO PINZÓN
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Director: Manuel Alfonso Patarroyo, M.D., Dr.Sc.
Plasmodium vivax causa alrededor de 100 millones de casos clínicos de malaria al año en las
zonas tropicales y subtropicales de Asia y América Latina. Debido a la falta de un cultivo
continuo in vitro para esta especie, nuestro entendimiento a cerca de la biología y de los
antígenos que participan durante el proceso de invasión de las células blanco es limitado
respecto a otras especies. Para superar este inconveniente, se ha desarrollado una
aproximación comparativa para identificar y caracterizar en P. vivax moléculas involucradas
en la invasión descritas previamente en Plasmodium falciparum (la especie más letal de
malaria). Por lo tanto, basados en el amplio conocimiento que ha surgido sobre las
interacciones moleculares entre la proteína AMA-1 (conservada en todas las especies de
Plasmodium spp) con las proteínas del cuello de las roptrias (RONs) durante la formación del
enlace fuerte en el proceso invasión en P. falciparum y Toxoplasma gondii, se identificó la
primera proteína del cuello de las roptrias de P. vivax denominada PvRON2 homóloga a la
proteína PfRON2. Herramientas bioinformáticas y ensayos moleculares e inmunológicos
permitieron identificar una proteína de 2,204 residuos codificada por un solo exón de 6,615pb.
La secuencia de aminoácidos contiene un péptido señal, un dominio transmembranal y dos
motivos α-helicales coiled coil, características encontradas en varios candidatos a vacuna
descritos previamente. Similar a lo que ha sido reportado para PfRON2, PvRON2 se expresa
en esquizontes tardíos y se localiza en el cuello de las roptrias lo que sugiere su participación
durante la invasión de la célula huésped.
ABSTRACT
IDENTIFICATION OF THE Plasmodium vivax RHOPTRY NECK PROTEIN 2 (RON2)
by
GABRIELA ARÉVALO PINZÓN
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
Director: Manuel Alfonso Patarroyo, M.D., Dr.Sc.
About 100 million clinical cases of malaria occur per year due to Plasmodium vivax infections,
mainly in tropical and subtropical regions of Asia and Latin America. Our current
understanding of the parasite‟s biology and the antigens involved in the invasion of target cells
is very limited, partly because the lack of a Plasmodium vivax continuous in vitro culture,
which makes it particularly difficult to study this species. We have developed a comparative
approach to identify and characterize P. vivax molecules involved in invasion, which have
been previously described in Plasmodium falciparum (the most lethal species causing
malaria), in order to overcome this inconvenient. Based on the knowledge that has been
emerging regarding the molecular interactions between AMA-1 protein (which is conserved in
all Plasmodium ssp. species) and the rhoptry neck proteins (RONs) during the strong bond
formation in the P. falciparum and Toxoplasma gondii invasion processes, the first P. vivax
rhoptry neck protein, which is homologous to PfRON2 and here named PvRON2, was
identified in the present study. Different bioinformatics tools and immunological and molecular
assays allowed identifying a 2,204 residue-long protein, encoded by a single 6,615 bp exon.
The amino acid sequence contains a signal peptide, a transmembranal domain and two α-
helical coiled coil motifs, all of them being characteristics found in several previously
described vaccine candidates. Similar to what has been reported for PfRON2, PvRON2 is
expressed in late schizonts and located in the rhoptries neck, findings that suggest its
participation during the invasion of host cells.
LISTADO DE ABREVIATURAS
AAPs: Proteínas Asociadas a AMA-1, del inglês, AMA1-associated proteins.
ACF: Adyuvante Completo de Freund.
ADN: Ácido desoxirribonucléico.
ADNg: ADN genómico.
ADNc: ADN complementario.
AIF: Adyuvante Incompleto de Freund.
AMA-1: Antígeno Apical de Membrana 1, del inglés, Apical Membrane Antigen 1.
ARN: Ácido ribonucleico.
BLAST: Herramienta Básica de Búsqueda de Alineamientos Locales, del inglés, Basic Local
Alignment Search Tool.
CelTOS: Proteína para el cell traversal de ooquinetes y esporozoitos, del inglés, Cell
Traversal Protein for Ookinetes and Sporozoites.
CMH: Complejo Mayor de Histocompatibilidad.
CR1: Receptor del complemento tipo 1, del inglés, Complement Receptor Type 1.
CSP: Proteína Circumsporozoito, del inglés, Circumsporozoite Protein.
DAPI: 4',6-diamidino-2-fenilindol diclorhidrato.
DBL: Familia de proteínas similares a aquella de unión a Duffy (DBL, del inglés, Duffy Binding
Like).
DBP: Proteína de Unión a Duffy, del inglés, Duffy Binding Protein.
EDTA: Ácido Etilendiaminotetraacético.
EGF: Factor de Crecimiento Epidérmico, del inglés, Epidermal Growth Factor.
ELISA: Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas, del inglés, Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay.
FITC: Isotiocianato de Fluoresceína.
GD: Gránulos Densos.
GPI: Glicosilfosfatidilinositol.
HABPs: Péptidos de alta actividad de unión, del inglés, High Activity Binding Peptides.
HPLC-RP: Cromatografía Líquida de Alta Eficacia en Fase Reversa, del inglés, High
Performance Liquid Chromatography-Reverse Phase.
IgM: Inmunoglobulina M.
IgG3: Inmunoglobulina G isotipo 3.
KAHRP: Proteína Rica en Histidinas Asociada a los Knob, del inglés, Knob-Associated
Histidine Rich Protein.
LB: Luria Bertani.
MCP1: Proteína de Capping del Merozoito 1, del inglés, Merozoite Capping Protein-1.
MET: Microscopia Electrónica de Transmisión.
MJ: Moving Junction.
M-MLV: Virus de la Leucemia Murina Moloney.
MSP: Proteínas de Superfície del Merozoito, del inglés, Merozoite Surface Proteins.
MVP: Membrana de la Vacuola Parasitófora.
OMS: Organización Mundial de la Salud.
ORF: Marco de Lectura Abierto, del inglés, Open Reading Frame.
PBS: Buffer Fosfato Salino.
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa, del inglés, Polymerase Chain Reaction.
PMSF: Fluoruro de Fenilmetilsulfonilo.
PS: Péptido Señal.
RBL: La familia de Proteínas Similares a aquellas de Unión a Reticulocitos, del inglés,
Reticulocyte Binding Like Proteins.
RCT: Receptor de Células T.
RESA: Antígeno de superficie del eritrocito infectado en estadio de anillo, del inglés, Ring-
Infected Erythrocyte Surface Antigen.
Rhs: Proteínas homólogas a aquellas de unión al reticulocito, del inglés, Reticulocyte-binding
protein homologue.
RIMA: Antígeno de membrana de los anillos, del inglés, Ring Membrane Antigen.
ROM4: Proteasa Romboide 4, del inglés, Rhomboid protease 4.
RONs: Proteínas del Cuello de las Roptrias, del inglés, Rhoptry Neck Proteins.
RT: Repeticiones en Tándem.
RT-PCR: Transcripción Reversa-Reacción en Cadena de la Polimerasa, del inglés, Reverse
Transcription-Polymerase Chain Reaction.
SDS-PAGE: Electroforesis en Gel de Poliacrilamida con Dodecilsulfato Sódico.
SIVIGILA: Sistema de Vigilancia en Salud Pública.
SMART: Del inglés, Simple Modular Architecture Research Tool.
SPECT 1 y 2: Proteínas de las Micronemas del Esporozoito Esenciales para el Cell Traversal
1 y 2, del inglés, Sporozoite microneme Protein Essential for Cell Traversal.
SUB-2: Subtilisina 2.
TAE: Tris-Acetato-EDTA.
TJ: Enlace Fuerte, del inglés, Tight Junction.
TRAP: Proteína Adherente Relacionada a Trombospondina, del inglés, Thrombospondin-
Related Anonymous Protein.
VCG-1: Vivax Colombia Guaviare-1.
VP: Vacuola Parasitófora.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Incidencia estimada de malaria por cada 1.000 habitantes, 2006. 4
Figura 2. Distribución geográfica de P. falciparum y P. vivax. 5
Figura 3. Distribución de los casos de malaria en Colombia por departamento
y especie parasitaria para 2010. 6
Figura 4. Distribución mundial de la resistencia a medicamentos antimaláricos
de primera línea. 7
Figura 5. Ciclo de vida de Plasmodium spp. 10
Figura 6. Estructura básica de un merozoito de Plasmodium. 12
Figura 7. Microscopia electrónica de transmisión, mostrando los organelos
apicales de un merozoito de P. falciparum. 13
Figura 8. Localización sub-celular de proteínas del merozoito de P. falciparum
involucradas en la invasión. 15
Figura 9. Pasos durante la invasión de los merozoitos a eritrocitos. 16
Figura 10. Procesamiento proteolítico de AMA-1 en merozoitos de P. falciparum. 18
Figura 11. Reorientación y formación del TJ durante el proceso de invasión. 20
Figura 12. Modelo de la organización del TJ en Toxoplasma gondii. 24
Figura 13. Modelo de interacción entre las proteínas AMA1-RON2. 26
Figura 14. Mecanismos de inhibición del complejo AMA-1/AAPs propuestos
para P. falciparum. 27
Figura 15. Localización de los cebadores diseñados sobre la secuencia del gen
pvron2. 38
Figura 16. Mapa del vector pEXP5/CT/TOPO (Invitrogen). 40
Figura 17. Identificación de la proteína PvRON2 mediante la herramienta BLAST. 48
Figura 18. Comparación entre la secuencia de aminoácidos de PvRON2
(PVX_117880) de la cepa Sal-1 y PfRON2 (PF14_0495) de la cepa 3D7. 49
Figura 19. Análisis de sintenia de la región cromosómica que contiene a RON2. 51
Figura 20. Amplificación del gen pvron2 a partir de ADNg y ADNc obtenido
mediante RT-PCR. 52
Figura 21. Amplificación por PCR de dos fragmentos de pvron2. 53
Figura 22. PCR de colonias puntiformes aisladas de agar suplementado con
ampicilina. 54
Figura 23. Análisis de restricción enzimática de plásmidos que contienen la
región II y III de pvron2. 55
Figura 24. Comparación entre la secuencia PvRON2 de la cepa de referencia
Sal-1 (2,203 residuos) y la cepa VCG-1 (2,204 residuos). 57
Figura 25. Identificación del péptido señal en la secuencia de aminoácidos
de PvRON2. 60
Figura 26. Identificación de hélices transmembranales en la secuencia de
aminoácidos de PvRON2. 62
Figura 27. Identificación de motivos y dominios en la secuencia de aminoácidos
de PvRON2. 63
Figura 28. Representación esquemática de la proteína PvRON2. 65
Figura 29. Evaluación de la producción de anticuerpos específicos contra
péptidos de PvRON2. 66
Figura 30. Análisis de la expresión de PvRON2 en esquizontes de P. vivax. 67 Figura 31. Localización celular de la proteína PvRON2. 69
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Estudios de genómica, transcriptómica y proteómica en P. falciparum y P. vivax 29
Tabla 2. Cebadores utilizados para la amplificación y secuenciación del gen
pvron2 a partir de ADNg y ADNc. 37
Tabla 3. Resumen de los polimorfismos encontrados para PvRON2 entre las
cepas Sal-1 y VCG-1. 69
ÍNDICE GENERAL
1. Justificación 1
1.1 Objetivo General 3
1.2 Objetivos Específicos 3
1.3 Hipótesis Experimental 3
2. Marco Teórico 4
2.1 Epidemiología y localización geográfica de la malaria 4
2.2 Malaria en Colombia 5
2.3 Resistencia del parásito a medicamentos antimaláricos 6
2.4 Ciclo de vida de la malaria y antígenos implicados 8
2.4.1 Fase hepática 9 2.4.2 Fase eritrocítica 11
2.4.2.1 El merozoito y los organelos apicales 11 2.4.2.2 Fases de invasión de los merozoitos a los eritrocitos 15
2.5 Proteínas del cuello de las roptrias y su rol biológico 23
2.6 Biología y limitaciones en la investigación de P. vivax 28
2.7 Avances en la investigación de P. vivax 29
3. Diseño Metodológico 33
3.1 Análisis bioinformático 33
3.2 Extracción y fuente de ácidos nucleicos y proteínas 34
3.2.1 Extracción de ADNg y ARN 35 3.2.2 Síntesis de ADNc 35 3.2.3 Extracción de proteínas 36
3.3 Diseño de cebadores 36
3.4 Amplificación, clonación y secuenciación del gen pvron2 38
3.5 Selección y síntesis de péptidos derivados de PvRON2 42
3.6 Producción de anticuerpos policlonales 43
3.7 Inmunoensayos 44
3.7.1 ELISA 44 3.7.2 Western Blot 45 3.7.3 Inmunofluorescencia indirecta 45
4. Resultados y Discusión 46
4.1 Identificación de pvron2 y genes ortólogos 47
4.2 Amplificación de pvron2 en la cepa VCG-1 de P. vivax 51
4.3 Evaluación de las colonias por PCR y restricción enzimática 53
4.4 Análisis de secuencia 55
4.5 Análisis bioinformático de la secuencia de PvRON2 59
4.5.1 Identificación del péptido señal 59 4.5.2 Identificación de motivos de anclaje 62 4.5.3 Identificación de otras características importantes en la secuencia de
PvRON2 62
4.6 Expresión de PvRON2 en esquizontes de P. vivax en la cepa VCG-1 65
4.7 Localización celular de PvRON2 en esquizontes de P. vivax 68
5. Conclusiones 72
6. Perspectivas 73
7. Referencias 74
8. Anexos 84
9. Publicaciones 89
1. Justificación
La malaria es producida por parásitos protozoarios del género Plasmodium y es transmitida
por la picadura de un mosquito Anopheles hembra infectado [1]. Se estima, según datos de la
Organización Mundial de la Salud (OMS), que hay cerca de 3.3 miles de millones de
personas en zonas de riesgo de infección por malaria y como consecuencia se producen un
millón de muertes y más de 300 millones de casos clínicos anuales [2, 3]. Cinco especies de
Plasmodium infectan al humano, de las cuáles P. falciparum y P. vivax producen las mayores
tasas de mortalidad y morbilidad a nivel mundial [1, 4].
P. falciparum es el responsable de las complicaciones severas de la enfermedad y de cerca
del 90% de los casos clínicos de malaria en el África subsahariano. P. vivax es el
responsable de alrededor de 100 millones de casos clínicos, lo cual representa
aproximadamente el 40% de los casos anuales de malaria en las zonas tropicales y
subtropicales de América Latina y Asia [5, 6]. En Colombia, para el año 2010, se notificaron
107,976 casos de malaria al Sistema de Vigilancia en Salud Pública (SIVIGILA) del Instituto
Nacional de Salud (INS), de los cuales, 75,744 (70.2%) correspondieron a P. vivax [7].
Aunque la malaria por P. vivax es clínicamente menos severa que la producida por P.
falciparum, varios factores como: la cronicidad de la infección generada por la presencia de
formas durmientes del parásito en el hígado (hipnozoitos) [8], la aparición de cepas de
parásito resistentes a agentes antimaláricos como la cloroquina [9], la resistencia del
mosquito a los insecticidas y las recientes complicaciones clínicas atribuidas a la infección
por esta especie parasitaria [10], hacen necesaria la búsqueda de antígenos implicados
durante el proceso de invasión para el desarrollo de una vacuna completamente efectiva
contra las infeccionas causadas por P. vivax.
2
Debido a las dificultades de mantener un cultivo continuo in vitro de P. vivax y al retraso en
los estudios de genómica, transcriptómica y proteómica, el conocimiento de la biología de
esta especie parasitaria y el desarrollo de métodos efectivos de control, son limitados con
respecto a lo reportado para otras especies de Plasmodium. Para superar este inconveniente,
se ha desarrollado una aproximación comparativa para caracterizar e identificar en P. vivax,
antígenos involucrados en la invasión previamente descritos en P. falciparum como
potenciales candidatos a vacuna. De esta forma, en los últimos cuatro años, nuestro grupo ha
identificado alrededor de cinco nuevos antígenos localizados en la superficie o en las roptrias
en P. vivax denominados: Pv38 [11], Pv41 [12], Pv34 [13], PvTRAMP [14] y la familia
PvRhopH1/clag [15].
Recientemente, se han identificado en cuello de las roptrías de P. falciparum y T. gondii un
grupo de proteínas implicadas en la formación del enlace fuerte o TJ (del inglés tight junction)
durante el proceso de invasión [16-19]. Estás proteínas denominadas RONs (RON2, RON4,
RON5 y RON8) se asocian junto con la proteína de micronemas AMA-1 [20, 21] que es
conservada entre el filo Apicomplexa y considerada candidata a vacuna en P. falciparum [22].
Aunque no se conoce exactamente la función de las proteínas RONs, se ha encontrado que
la región carboxi-terminal de la proteína RON2 interactúa directamente con la proteína AMA-1
y que el bloqueo de esta interacción previene la invasión de los merozoitos o taquizoitos a
sus células huésped [20, 23]. Lo anterior sugiere que RON2 tiene una función fundamental en
el proceso de invasión en P. falciparum y T. gondii.
Si el mecanismo de invasión es conservado en P. vivax, la identificación y caracterización
bioquímica e inmunológica de las proteínas del cuello de las roptrias (en especial la proteína
RON2), puede contribuir a definir posibles nuevos candidatos a vacuna contra esta especie
parasitaria, dentro del desarrollo de nuevos métodos de control de la malaria.
3
1.1 Objetivo general
Identificar y caracterizar en Plasmodium vivax la proteína homóloga a la del cuello de las
roptrias 2 (RON2) de Plasmodium falciparum.
1.2 Objetivos específicos
1. Identificar el gen codificante para la proteína PvRON2 de P. vivax y analizar la
secuencia obtenida.
2. Evaluar la expresión transcripcional y traduccional del gen pvron2 en el ciclo
intraeritrocítico de P. vivax.
3. Analizar las características más importantes a nivel de estructura primaria y
secundaria de la proteína PvRON2.
4. Determinar la localización celular de la proteína PvRON2 en esquizontes de P. vivax.
1.3 Hipótesis experimental
El gen pvron2 se encuentra en el genoma de Plasmodium vivax, se transcribe, y la proteína
codificada se expresa en el cuello de las roptrias de esquizontes tardíos.
4
2. Marco Teórico
2.1 Epidemiología y localización geográfica de la malaria
La malaria es un problema de salud mundial y se estima, según datos de la OMS, que hay
cerca de 3,000 millones de personas que se encuentran en riesgo de contraer la enfermedad,
afectando principalmente a mujeres embarazadas y a niños menores de cinco años en países
en vías de desarrollo [3]. Anualmente, la malaria causa aproximadamente 1 millón de muertes
y alrededor de 300-500 millones de casos clínicos en las zonas tropicales y subtropicales del
mundo [2, 3] (Figura 1). Se calcula que los fondos internacionales desembolsados para el
control de la malaria han aumentado de US $200 millones en el 2004 a US $1,500 millones
para el 2009 [24].
Figura 1. Incidencia estimada de malaria por cada 1.000 habitantes, 2006. Tomado del reporte de la OMS, 2008 [3].
De las especies de Plasmodium que infectan al humano, P. ovale y P. malariae son causas
infrecuentes de morbilidad y las infecciones no tratadas pueden persistir como parasitemias
5
de bajo grado por varias décadas. Por el contrario, P. falciparum (distribuido principalmente
en el continente africano) [4, 25] (Figura 2), es la especie más virulenta y se caracteriza por
su capacidad de adherirse a receptores sobre los vasos sanguíneos pequeños durante la
fase eritrocítica del ciclo de vida, y obstruir el flujo sanguíneo en órganos vitales [26].
Adicionalmente, P. vivax causa alrededor de 100 millones de casos clínicos anuales y se
distribuye principalmente en Asia y en América Latina [6] (Figura 2). P. vivax y P. ovale
causan enfermedad crónica por la presencia de formas durmientes del parásito en el hígado
denominadas hipnozoitos, que dificultan la erradicación del parásito en el humano [8]. Una
quinta especie denominada P. knowlesi, descrita originalmente infectando a monos macacos
de cola larga (Macaca fascicularis) y de cola corta (Macaca nemestrina), tiene la capacidad
de infectar naturalmente a humanos en algunas áreas de Malasia [27].
Figura 2. Distribución Geográfica de P. falciparum y P. vivax. (a) P. falciparum (b) P. vivax. Tomado de Guerra C y cols, 2006 [25].
2.2 Malaria en Colombia
En Colombia, la malaria es un problema de salud pública muy extendido sobre regiones
tropicales como la Costa Pacífica, Urabá, Río Cauca Bajo, Orinoquía y Amazonía (Figura 3).
a)
b)
6
Datos del Sistema de Vigilancia en Salud Pública (SIVIGILA) del Instituto Nacional de Salud
(INS), muestran que para Noviembre de 2010, se reportaron cerca de 107.976 casos de
malaria, de los cuales 75.744 (70.2%) correspondieron a P. vivax, 30.813 (28,5%) a P.
falciparum, 1.368 (1,3%) fueron infecciones mixtas y 51 casos (0.05%) correspondieron a P.
malariae [7]. Según datos de la OMS, para 2009, el 90% de los casos de malaria reportados
para la región de las Américas ocurrieron en Brasil, Colombia Haití y Perú [24].
Figura 3. Distribución de los casos de malaria en Colombia por departamento y especie parasitaria para 2010. Se muestran las regiones y las especies parasitarias que causan malaria según datos del INS [7].
2.3 Resistencia del parásito a medicamentos antimaláricos
Los medicamentos más utilizados en el tratamiento contra la malaria son la quinina y sus
derivados, en combinación con medicamentos antifolatos (Figura 4). Sin embargo, la
resistencia a estos medicamentos se ha extendido e intensificado en los últimos 20 años,
situación que enfatiza la necesidad de ampliar los programas de vigilancia a la resistencia y la
7
búsqueda de métodos de control más efectivos. Dentro de las especies de Plasmodium con
reportes de resistencia a fármacos antimaláricos se encuentran P. falciparum y P. vivax. En
1989 se reportó la resistencia de una cepa de P. vivax de Papua Nueva Guinea a la
cloroquina y desde entonces se ha encontrado resistencia en otros países de Asia y América
Latina, principalmente Colombia, Brasil, Guyana, Etiopía, India e Indonesia [9, 28]. También
ha sido documentada la resistencia a pirimetamina sola o en combinación con sulfadoxina así
como la aparición de cepas de P. vivax con una menor sensibilidad a la primaquina (el único
fármaco actualmente disponible para prevenir las recaídas por P. vivax) [29].
Figura 4. Distribución mundial de la resistencia a medicamentos antimaláricos de primera línea. Datos de la resistencia a cloroquina (círculo azul) y sulfadoxina/pirimetamina (círculo amarillo) a nivel mundial. En rojo se muestran las áreas de transmisión de la malaria. Tomado de Ridley R, 2002 [30].
Aunque la evolución de la resistencia a los medicamentos antimaláricos no se entiende
completamente, las bases moleculares de la resistencia son cada vez más claras. Se ha
reportado que el desarrollo de resistencia a la cloroquina probablemente requiera de
mutaciones sucesivas específicas en un gen que codifica una proteína similar a un
transportador sobre la superficie de la vacuola de P. falciparum [31]. Reportes preliminares
sugieren que un grupo diferente de mutaciones está probablemente asociado a la resistencia
a cloroquina en P. vivax [32]. Por otro lado, la resistencia a sulfadoxina/pirimetamina en P.
falciparum está conferida por mutaciones sucesivas puntuales en el gen que codifica la
8
hidrofolato reductasa y en mutaciones adicionales en el gen dhps que codifica para la enzima
dihidropteroato sintetasa [33].
Adicionalmente, varios factores relacionados a los medicamentos, al parásito y a las
interacciones huésped-patógeno, contribuyen al desarrollo y propagación de la resistencia a
drogas. Dentro de estos factores, se encuentran la biología del vector y del parásito, la
farmacocinética, la dosificación incorrecta, el incumplimiento en la duración del régimen de
dosificación, la calidad de los medicamentos y la absorción deficiente e irregular, entre otros
[34].
2.4 Ciclo de vida de la malaria y antígenos implicados
La malaria es transmitida por protozoarios del filo Apicomplexa, pertenecientes al género
Plasmodium. El filo Apicomplexa representa un grupo diverso de parásitos intracelulares
obligados que tienen la capacidad de infectar a un amplio rango de huéspedes. El filo incluye
parásitos de importancia clínica y veterinaria, tales como: Plasmodium, el agente causal de la
malaria; Cryptosporidium, asociado con enfermedades gastrointestinales; Toxoplasma, un
patógeno oportunista relevante en pacientes inmunocomprometidos; y Eimeria, un parásito
importante en la industria de aves de corral, y productor de coccidiosis en gallinas. Las
formas invasivas (zoitos) de estos parásitos se caracterizan por su capacidad de invadir
eficientemente la célula huésped, a través de la secreción de proteínas contenidas en un
grupo de organelos apicales especializados, que incluye las roptrias, las micronemas, los
gránulos densos y los exonemas [35-37], en asociación con el motor actina-miosina [38]. Sin
embargo, a pesar de la semejanza morfológica de estos parásitos, los apicomplexas difieren
con respecto al tipo de huésped, célula blanco, nichos que ocupan y modos de transmisión.
Parásitos como el T. gondii, C. parvum, Isospora belli, forman ooquistes que son tomados por
vía oral a través de la comida y agua contaminados. De manera distinta, los esporozoitos de
Plasmodium son transmitidos por vectores artrópodos a través de inoculación intradérmica.
9
El ciclo de vida de los parásitos del género Plasmodium alterna entre un huésped definitivo
(un mosquito del género Anopheles) donde se lleva a cabo la reproducción sexual y un
huésped intermediario (vertebrado) en el cual se da la reproducción asexual (Figura 5).
2.4.1 Fase hepática
En el humano, el ciclo de vida del parásito inicia con la picadura del mosquito Anopheles
hembra, que inyecta en la piel del huésped aproximadamente 15 a 200 esporozoitos (formas
alargadas) [39, 40] que permanecen allí alrededor de 15 minutos, antes de alcanzar el
sistema circulatorio [41]. Una vez los esporozoitos acceden a los vasos sanguíneos, son
arrestados en los sinusoides del hígado, donde atraviesan estas barreras sinusoidales
(células de Kupffer) mediante un proceso denominado “cell traversal”, hasta alcanzar e
invadir su primera célula blanco: los hepatocitos. En ratones se ha demostrado que después
de la inoculación intravenosa de esporozoitos, éstos alcanzan e invaden el hígado en
aproximadamente 2 minutos. La mayoría de los esporozoitos pierden su capacidad infectiva
cuando son incubados a 37ºC durante 45-60 minutos, por lo que su capacidad de migrar y de
atravesar las células es probablemente esencial para llegar al hígado. Se ha descrito que el
“cell traversal” es un mecanismo mediado por un grupo de proteínas derivadas del parásito
conocidas como „proteínas de las micronemas del esporozoito esenciales para el cell
traversal 1 y 2‟ (SPECT 1 y 2, del inglés Sporozoite microneme Protein Essential for Cell
Traversal) [42, 43], la proteína para el “cell traversal” de ooquinetes y esporozoitos (CelTOS,
del inglés Cell Traversal protein for Ookinetes and Sporozoites) [44] y una fosfolipasa
denominada PL [45].
10
Figura 5. Ciclo de vida de Plasmodium spp. Los esporozoitos son inyectados en el huésped a través de la picadura del mosquito Anopheles infectado. En la fase hepática, los esporozoitos viajan por el torrente sanguíneo hasta alcanzar los hepatocitos. Allí, los esporozoitos crecen y se dividen dentro de cada hepatocito, hasta producir de 10.000 a 30.000 merozoitos, dependiendo de la especie de Plasmodium. Algunas especies como P. vivax y P. ovale adoptan formas de hipnozoitos que perduran meses e incluso años en el hígado. Los merozoitos en el torrente sanguíneo invaden rápidamente (30 seg) eritrocitos circulantes (fase eritrocítica) y se desarrollan en anillos, trofozoitos (en P. falciparum, se da un proceso de remodelación de membrana del eritrocito que consiste en la formación de knobs, compuestos de proteínas derivadas del parásito que se unen al endotelio de los vasos capilares) y finalmente se forman de 8 a 32 esquizontes que rompen el eritrocito e invaden nuevos eritrocitos. Este ciclo eritrocítico se desarrolla periódicamente en un lapso de 48 a 72 horas, dependiendo de la especie. Algunos merozoitos se desarrollan en formas sexuales denominadas gametos, que son ingeridas por el mosquito. La reproducción sexual se lleva a cabo dentro del intestino medio del mosquito, donde se desarrollan nuevos esporozoitos que migran a las glándulas salivales para dar inicio nuevamente al ciclo de vida del parásito. Tomado de http://www.mcwhealthcare.com/malaria_drugs_medicines/life_cycle_of_plasmodium.htm
De igual forma, la invasión de los esporozoitos a los hepatocitos (fase hepática) [46], es
mediada por interacciones específicas receptor-ligando entre proteínas de la membrana del
huésped y proteínas derivadas principalmente de las micronemas del parásito. Hasta el
momento, las proteínas mejor caracterizadas son: la proteína circumsporozoito (CSP, del
inglés Circumsporozoite Protein), localizada mayoritariamente en la superficie del
Fase
hepática
Merozoítos
GametosMerozoitos
Fase EritrocíticaAnillos
Trofozoítos
Esquizontes
Reproducción sexual (mosquito)
Formación de
Knobs
11
esporozoito, y dos proteínas de las micronemas denominadas „proteína adherente
relacionada a trombospondina‟ (TRAP, del inglés Thrombospondin-Related Anonymous
Protein) y AMA-1. La proteína CSP interactúa durante el proceso de invasión con
proteoglicanos tipo heparán sulfato (altamente sulfatados) de los hepatocitos [47]. AMA-1 y
TRAP son proteínas transmembranales tipo I que aumentan su secreción después del
contacto con el hepatocito [48]. TRAP contiene dos motivos adhesina y un dominio A similar a
integrina, los cuales interactúan con proteoglicanos sobre los hepatocitos involucrados en la
invasión celular [48-50].
Una vez dentro de los hepatocitos, cada esporozoito se desarrolla dentro de cientos de
merozoitos, que tienen la capacidad de invadir los eritrocitos (Figura 5).
2.4.2 Fase eritrocítica
La fase eritrocítica del ciclo de vida de Plasmodium es responsable de las manifestaciones
clínicas de la enfermedad y ha sido una de las fases de invasión más estudiadas, ya que se
cuenta con un cultivo sincronizado in vitro de merozoitos de P. falciparum. Como el objetivo
inicial es identificar la proteína hipotética PvRON2, homóloga en P. falciparum a la PfRON2
en el estadio sanguíneo, se explicará en detalle el merozoito, los organelos implicados y, por
último, los pasos que se dan durante el proceso de invasión de los eritrocitos.
2.4.2.1 El merozoito y los organelos apicales
El merozoito es una célula ovoide pequeña con una longitud aproximada de 1.5 a 2.5 µm y de
1.0 hasta 2.0 µm de ancho, que varía en tamaño dependiendo de la especie de Plasmodium
[51]. Posee una maquinaria celular básica de una célula eucariota: núcleo, mitocondria,
retículo endoplasmático, aparato de Golgi y ribosomas, entre otros. Como componentes
propios del filo, el merozoito presenta un polo apical compuesto de organelos especializados
12
caracterizados por su forma, función y contenido proteico denominados roptrias, micronemas,
gránulos densos [35] (Figura 6) y exonemas, éste último recientemente descrito en P.
falciparum [36].
Figura 6. Estructura básica de un merozoito de Plasmodium. El polo apical está formado por un set de organelos especializados necesarios para la invasión de los merozoitos a los eritrocitos. Tomado de Baum y cols, 2006 [52].
Aunque la función de estos organelos se sobrelapa (lo que se ha denominado cooperatividad
entre organelos secretorios), se conoce que hasta cierto punto, cada organelo cumple un
papel particular. Las roptrias contienen proteínas necesarias para el reconocimiento e
invasión de la célula huésped y lípidos que ayudan a establecer la vacuola parasitófora (VP)
[53, 54]. Las micronemas contienen adhesinas necesarias para la identificación y unión a la
célula huésped, y participan junto con los filamentos del motor actina-miosina para el gliding
(motilidad deslizante del parásito) e invasión [37]. Los gránulos densos (GD) contienen
proteínas que establecen la línea de comunicación entre la membrana de la vacuola
parasitófora (MVP) y la célula huésped, y proteínas necesarias para el egreso del parásito de
la célula huésped [55].
Anillo polar apical
Granulos densos
Roptrias
Micronemas
Apicoplasto
Membrana Interna
Microtúbulos
Mitocondria
Retículo
endoplasmático
Núcleo
Capa Superficial
Membrana Plasmática
13
Por microscopia electrónica de transmisión (MET), los GD de merozoitos de P. knowlesi y P.
falciparum se observan como esferas de alrededor de 80nm de diámetro, con una zona clara
justo debajo de la membrana que delimita el GD [56, 57]. Se distribuyen entre el núcleo y las
roptrias [58] y se encuentran libres en el citoplasma del parásito. Después de la invasión, los
GD se mueven hacia la superficie del merozoito y descargan su contenido por exocitosis
dentro de la VP. Este evento genera un alargamiento de la VP extendiéndose sobre el
citoplasma del eritrocito [56]. En P. falciparum se han identificado tres proteínas en los GD: El
antígeno de superficie del eritrocito infectado de anillos (RESA del inglés, Ring-infected
Erythrocyte Surface Antigen) [59], el antígeno de membrana de los anillos (RIMA, del inglés,
Ring Membrane Antigen) [60] y una proteasa denomina Subtilisina 2 (SUB-2) [58].
Figura 7. MET de los organelos apicales de un merozoito de P. falciparum. Se muestran las roptrias (rh) que tienen forma de pera, un conjunto de micronemas (flecha blanca) y los gránulos densos (dg) cerca del núcleo (nuc). Tomado de Bannister L y cols, 2003 [57].
Las micronemas de P. falciparum son sacos fusiformes (Figura 7) de alrededor de 120nm de
longitud, atadas en un extremo al ducto de las roptrias y se encuentran delimitadas por una
membrana, mostrando un fino contenido granular en su interior [37]. Se ha observado que
durante la invasión de los merozoitos de P. knowlesi, las micronemas se fusionan con el
ducto de las roptrias, para la descarga completa del su contenido proteico [61]. Dentro de las
proteínas de las micronemas importantes en el proceso de invasión, se encuentra la familia
14
de proteínas similares a aquella de unión a Duffy (DBL, del inglés Duffy Binding Like) y AMA-
1 [62, 63].
Las roptrias son organelos largos en forma de pera, localizados en el extremo apical de los
merozoitos (Figura 6 y 7) y esporozoitos, y ausentes en los ooquinetes. Varios estudios han
sugerido que las roptrias se encuentran divididas en dos compartimentos: una zona granular
homogénea conocida como el bulbo, y una zona con apariencia heterogénea electrolúcida
denominada ducto [64, 65]. La membrana tiene una estructura de bicapa típica y contiene
distintas partículas intramembranosas, involucradas probablemente en la regulación del agua
y concentración de iones en el parásito [64]. A través de microscopia inmunoelectrónica e
inmunofluorescencia, se ha encontrado que varias proteínas de T. gondii y P. falciparum se
distribuyen preferencialmente en el ducto o el bulbo. En el bulbo de las roptrias de P.
falciparum, se identificó el complejo de bajo peso molecular, conformado por las „proteínas
asociadas a las roptrias 1, 2 y 3 (RAP1, 2 y 3, del inglés, Rhoptry-Associated Proteins 1, 2
and 3), y el complejo de alto peso molecular, compuesto por las proteínas RhopH1, RhopH2 y
RhopH3 [66]. En el cuello de las roptrias, se han identificado las RONs, y algunas proteínas
homólogas de unión a reticulocito (Rhs, del inglés, Reticulocyte-binding protein homologues)
(Figura 8). La localización de las proteínas de las roptrias en dos regiones diferentes sugiere
por tanto, la formación de diferentes complejos multiprotéicos. Sin embargo, hasta el
momento no se conoce con exactitud la importancia biológica de esta compartamentalización.
15
Figura 8. Localización sub-celular de proteínas del merozoito de P. falciparum involucradas en la invasión al eritrocito. Agrupado por Gilberger T y actualizado de acuerdo a Cowman AF y Crabb BS, 2006 [67].
2.4.2.2 Fases de invasión de los merozoitos a los eritrocitos.
La invasión de los eritrocitos por merozoitos de Plasmodium es un proceso complejo y
coordinado que ha sido ampliamente estudiado en P. falciparum [67]. Parte de los eventos
moleculares del ciclo de los Apicomplexa han sido descritos en T. gondii, el organismo
modelo para este filo [68, 69]. Estudios basados en videomicroscopia y análisis
ultraestructurales de la invasión de merozoitos a los eritrocitos han mostrado que este
proceso toma tan solo 30 segundos y se divide en varias fases [70, 71], tales como: (i) unión
inicial, (ii) reorientación y formación de un enlace fuerte o TJ (del inglés, Tight Junction), (iii)
entrada y establecimiento del parásito (Figura 9).
Proteínas de las
micronemas
Proteínas del cuello de
las roptrias
Proteínas de superficie
Microtubulo
ApicoplastoMembrana
Interna
Mitocondria
Extremo Apical
Proteínas de superficie anclajes vía GPI
Proteínas del bulbo de las roptrías
16
(i) Unión inicial
Esta primera fase consiste en interacciones reversibles al azar y de baja afinidad entre
proteínas del merozoito expresadas sobre la superficie del parásito y proteínas de membrana
del eritrocito. Estudios de videomicroscopia de la adhesión de merozoitos de P. knowlesi a
eritrocitos, muestran que el contacto entre estas dos células coincide con deformaciones en
la membrana de los últimos [72]. Dentro de algunos de los ligandos identificados sobre la
superficie del parásito, se encuentra la familia de proteínas de superficie o MSPs (del inglés,
Merozoite Surface Proteins) (Figura 8). Esta familia contiene 11 integrantes agrupados entre
proteínas ancladas vía glicosilfosfatidilinositol (GPI) como MSP-1, -4, -5, -8 y -10, y proteínas
solubles, como MSP-2, -3, -6, -7, -9 y -11, algunas de ellas involucradas en la formación de
complejos multiprotéicos junto con MSP-1 sobre la membrana del merozoito [73, 74].
Figura 9. Invasión de merozoitos o eritrocitos. En Plasmodium, la entrada a la célula huésped inicia con una unión de baja afinidad entre proteínas localizadas sobre la superficie del parásito y la célula blanco, seguido de la reorientación y formación de un enlace fuerte (mediado por adhesinas liberadas de las micronemas y roptrias) entre el extremo apical del parásito y la membrana de la célula huésped, que da lugar a la formación de una zona similar a un anillo conocido como Tight Junction (TJ). Este TJ se mueve a la parte posterior del parásito y, conectado al sistema actina-miosina, permite que el merozoito se deslice hacia la naciente vacuola parasitófora (VP) dentro de la célula huésped, donde el parásito residirá. Durante la internalización, las proteínas que cubren la superficie del merozoito y algunas proteínas de las micronemas son hidrolizadas por proteasas y excluidas de la VP. Finalmente,
Unión inicial
Reorientación y
Formación del TJ
Internalización completaMaduración
dentro del GR
Formación de la
vacuola parasitófora(exclusión de
proteínas)
Secreción secuencial de
organelos apicales
17
la membrana del eritrocito es sellada y el merozoito empieza a desarrollarse dentro de la célula
huésped. Tomado de http://sites.huji.ac.il/malaria/maps/erythrocyteInvasionpath.html.
La proteína MSP-1 es el antígeno más abundante sobre la superficie del parásito y es
esencial para la supervivencia, debido a que no es posible obtener parásitos knock out para
el gen codificante de esta proteína [75, 76]. MSP-1 es un polipéptido de 200kDa que es
procesado en cuatro fragmentos (83kDa, 30kDa, 38kDa y 42kDa) que permanecen unidos
no-covalentemente sobre la superficie del merozoito [77]. Posteriormente, el fragmento de
42kDa es procesado en un fragmento soluble de 33kDa y a uno de 19kDa que permanece
unido a la superficie del parásito y entra dentro de la naciente vacuola parasitófora [78].
MSP119 está compuesto de dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF,
del inglés, Epidermal Growth Factor). Estos dominios son considerados importantes blancos
de anticuerpos, tanto en individuos expuestos naturalmente, como en animales infectados
experimentalmente y vacunados [79, 80].
(ii) Reorientación y formación de un enlace fuerte o TJ
Después del primer contacto entre el parásito y el eritrocito, el merozoito reorienta su polo
apical para quedar en contacto directo con la superficie de la célula huésped. Un estudio en
presencia del anticuerpo monoclonal inhibitorio de la invasión, denominado mAb R31C2 (que
reconoce un epitope de AMA-1 de P. knowlesi), muestra cómo los merozoitos interactúan con
el eritrocito pero no son capaces de reorientarse, sugiriendo que AMA-1 es la responsable de
mediar este paso durante la invasión de los eritrocitos [81].
AMA-1 es una proteína de membrana integral tipo I, presente en varios Apicomplexa como P.
falciparum, T. gondii y Babesia [62, 82-84]. PfAMA-1 contiene un segmento citoplasmático de
alrededor de 55 aminoácidos y una región extracelular conocida como ectodominio, que se
ha dividido según la localización de los puentes disulfuro en tres dominios: DI, DII y DIII [85].
PfAMA-1 se expresa en las micronemas de esquizontes tardíos como un precursor de 83kDa.
18
En el momento de la ruptura del eritrocito infectado, PfAMA-1 es hidrolizada en el extremo N-
terminal en un fragmento de 66kDa que se transloca a la superficie del parásito a través del
cuello de las roptrias. Allí, PfAMA-166 experimenta un segundo procesamiento proteolítico
dando lugar a dos fragmentos solubles de 44 o 48kDa (Figura 10) [86, 87].
Figura 10. Procesamiento proteolítico de AMA-1 en merozoitos de P. falciparum. (A) AMA-1 es sintetizada como un precursor de 83kDa con un péptido señal (rojo) hacia el extremo N-terminal para permitir el transporte a través del retículo endoplasmático (ER), hasta alcanzar las micronemas (Mn). (B) En las micronemas, el precursor es cortado proteolíticamente en la región N-terminal (azul) para producir un fragmento de 66kDa. (C) La forma madura de AMA-1 es translocada a la superficie del merozoito a través del cuello de las roptrias (Rn). (D) Allí, PfAMA-166, experimenta un segundo evento de hidrólisis, liberando parte de del ectodominio. Tomado de Healer y cols, 2002 [87].
La dificultad de generar parásitos knock out para el gen de ama-1 en Plasmodium [88] y T.
gondii [83] sugiere funciones vitales de AMA-1 para estos parásitos Apicomplexa. De manera
interesante, el desarrollo de parásitos con un knock out condicional para TgAMA-1, seguido
de un análisis de los pasos individuales de la invasión, mostró un deterioro en la habilidad de
los parásitos para establecer interacciones fuertes con la célula huésped y regular la
secreción de las roptrias [89], lo que permitió sugerir funciones adicionales para esta proteína
durante el proceso de invasión. Estudios inmunológicos en ratones y monos inmunizados con
la proteína recombinante AMA-1 muestran protección frente al reto experimental con
19
parásitos de malaria murina y de simios, respectivamente [90, 91]. Así mismo, un correcto
plegamiento del ectodominio de la proteína recombinante AMA-1 induce anticuerpos
inhibitorios de la invasión [92]. Se han reportado secuencias peptídicas derivadas de PfAMA-
1 con capacidad para unirse a los eritrocitos y bloquear la invasión de los merozoitos a los
eritrocitos, sugiriendo que AMA-1 puede actuar como adhesina [93, 94].
Después de la reorientación apical, se da la formación del TJ irreversible entre el merozoito y
la célula huésped. El TJ es una zona circular que se caracteriza por un engrosamiento
electro-denso en el sitio de contacto entre las dos células [70] que se mueve en forma de
anillo (unión movible, deslizante o “Moving Junction” (MJ)) desde la parte apical al polo
posterior del parásito, conectándose con el motor actina-miosina para impulsar al merozoito
dentro de la naciente VP. La formación del TJ coincide con la descarga secuencial del
contenido de las micronemas que interactúa con la membrana de la célula huésped, seguido
de la roptrias y finalmente los gránulos densos [68]. Estudios recientes han mostrado que la
unión de las proteínas de las micronemas a los receptores de la célula huésped activa la
exocitosis del componente de las roptrias, contribuyendo así a la formación del TJ y
posteriormente a la formación y remodelación de la VP [95].
Aunque las características ultraestructurales del TJ se describieron hace 30 años [70], no se
han descrito completamente las interacciones moleculares que se establecen entre el
parásito y la célula huésped. Hasta el momento, se conoce que una vez el parásito se
reorienta, las proteínas que pertenecen a la familia DBL (derivadas de las micronemas) y la
familia de proteínas similares a aquellas de unión a reticulocitos (RBL, del inglés, Reticulocyte
Binding Like), derivadas de las roptrias, interactúan específicamente con receptores sobre la
célula huésped (Figura 11).
20
Figura 11. Reorientación y formación del TJ durante el proceso de invasión. Una vez el parásito se reorienta, ligandos provenientes de los organelos del parásito (P. falciparum: EBA-175, EBA-140, EBA-181, PfRh1, PfRh2a/b, PfRh4 y PfRh5, y en P. vivax DBP o RBP-1 y 2) interactúan con receptores sobre la superficie del eritrocito o reticulocito. Estas interacciones activan la formación del enlace fuerte o TJ, que se mueve a través de la superficie del parásito. Algunas interacciones receptor-ligando son liberadas durante la invasión por el procesamiento de los ligandos del parásito con la proteasa romboide 4 (ROM4, del inglés, Rhomboid protease 4) o la subtilisina 2 (SUB-2). Recientemente, se ha descrito que PfAMA-1 participa en la formación del TJ a través de la unión con las proteínas del cuello de las roptrias (RONs) que se translocan a la superficie de la membrana del eritrocito. Tomado de Kappe y cols, 2010 [96].
La familia DBL, incluye las proteínas de unión a Duffy (DBP, del inglés, Duffy Binding Protein)
encontradas en P. vivax y P. knowlesi, la proteína EBA-175 (del inglés, Erythrocyte Binding
Antigen) de 175kDa expresada en P. falciparum [97] y cuatro genes parálogos al codificante
para esta última proteína denominados EBA-181 [98], EBA-140 [99], EBL-1 (del inglés,
Erythrocyte Binding Ligand-1) [100] y EBA-165 [101]. Esta familia se caracteriza por un
dominio conservado rico en cisteínas (conocido como dominio DBL) responsable de mediar la
unión con receptores sobre la célula huésped [102, 103]. El uso de eritrocitos tratados
enzimáticamente o eritrocitos carentes de algunas proteínas de superficie (eritrocitos-nulos)
ha permitido la identificación de algunos receptores potenciales para las proteínas DBL. EBA-
175 interactúa específicamente con glicoforina A, [103, 104], mientras que EBA-140 se une a
Eritrocito
Receptores
célula huésped
21
glicoforina C [105], EBL-1 a glicoforina B [106] y EBA-181 al receptor E, aún no caracterizado
[98].
La familia RBL está compuesta por proteínas de las roptrias de 235kDa de P. yoelii [107] que
han sido postuladas como las responsables de la selección de la célula huésped, al
diferenciar entre los distintos estadios de maduración de los eritrocitos [108]. Miembros
adicionales han sido identificados en P. vivax denominados „proteínas de unión a reticulocito
1 y 2‟ (RBP-1 y RBP-2, del inglés, Reticulocyte Binding Proteins 1 and 2) [109] y en P.
falciparum las proteínas Rhs, entre las que se incluyen Rh1 [110], Rh2a [111], Rh2b [111],
Rh3 (pseudogen) [112], Rh4 [113] y Rh5 [114]. Aunque varios de los receptores para las
proteínas DBL han sido caracterizados, solo el receptor del complemento tipo 1 (CR1, del
inglés, Complement Receptor type 1) ha sido encontrado como el receptor para la proteína
Rh4 [115].
Mientras P. vivax invade preferencialmente reticulocitos positivos para el grupo sanguíneo
Duffy, a través del uso exclusivo de las proteínas RBP-1/2 y DBP, P. falciparum invade todos
los eritrocitos humanos (independientemente de su estadio de maduración) y utiliza múltiples
caminos alternos de invasión, a través de la expresión diferencial de las proteínas DBLs y
RBLs [63, 116]. Evidencia de este hecho, ha sido reportado en cepas de P. falciparum que
invaden eritrocitos deficientes en glicoforina A, carentes de residuos de ácido siálico, o en
eritrocitos que han sido tratados previamente con enzimas que hidrolizan sustratos
específicos sobre la membrana [117-119]. Aunque hasta el momento no es claro el
mecanismo de acción de estas dos familias de proteínas, se ha propuesto que el parásito
utilizaría una combinación entre dos ligandos de las Rhs y DBLs, que dependerá de la
disponibilidad de los receptores sobre la superficie de la célula huésped. En consecuencia,
los merozoitos tendrían la capacidad de adoptar 25 caminos de invasión alternos [120]. Por
22
otro lado, Duraisingh y cols [121] proponen que las RBLs tienen como función percibir la
célula huésped adecuada, lo que genera el reclutamiento de ligandos de más alta afinidad,
tales como los miembros de la familia DBL, para una efectiva invasión.
Aunque estas dos familias de proteínas representan antígenos importantes durante las
interacciones receptor-ligando de alta afinidad durante el proceso de invasión del merozoito al
eritrocito, solo una proteína de 60kDa denominada „proteína de capping del merozoito 1‟
(MCP1, del inglés, Merozoite Capping Protein-1) había sido asociada con el MJ hasta hoy
[122]. Estudios recientes en T. gondii y en P. falciparum destacan la identificación de nuevos
componentes del cuello de las roptrias denominadas RONs que interactúan con AMA-1,
dando lugar a la formación de un complejo AMA-1/ proteínas asociadas a AMA-1 (AAPs, del
inglés, AMA1-Associated Proteins) que se localiza en la maquinaria del MJ como se explicará
en detalle más adelante.
(iii) Entrada y establecimiento del parásito
Durante la internalización del parásito dentro de la célula huésped, se secretan los lípidos y
proteínas del bulbo de las roptrias, que participarán en la formación de la VP. La VP actúa
como un filtro que excluye selectivamente varias proteínas del huésped y del parásito.
Algunas de las proteínas del merozoito son cortadas proteolíticamente durante la
internalización por las subtilisinas o las enzimas romboides (Figura 11). Finalmente, el cierre
de la VP se consigue una vez el MJ ha migrado completamente a la parte posterior del
parásito. Allí, el parásito puede iniciar su proceso de replicación para producir múltiples
células hijas, que iniciarán nuevamente el proceso de invasión de los eritrocitos (Figura 5).
23
2.5 Proteínas del cuello de las roptrias RONs y su rol biológico durante el proceso
de invasión
El proceso de invasión en Apicomplexa es único entre los patógenos eucariotas, debido a
que involucra dentro de su ciclo una estructura conocida como TJ, que es usada por el
parásito para establecer interacciones de alta afinidad con la célula huésped e impulsarse
dentro de la VP. Hace aproximadamente 30 años se describió morfológicamente esta
estructura, pero su composición y las interacciones moleculares que se establecen allí, son
poco entendidas [70]. El análisis del proteoma de los organelos de las roptrias en T. gondii
reveló la presencia de proteínas del cuello de las roptrias, que muestran similitud a algunas
proteínas hipotéticas de P. falciparum [16]. De estas proteínas se encontró que TgRON4 se
localiza en el TJ durante la invasión de los taquizoitos a sus células huésped [123] y es
inmunoprecipitada, junto a RON2, RON5 y RON8, con anticuerpos dirigidos, ya sea contra la
proteína AMA-1, o contra RON4 [21, 124]. Ensayos complementarios utilizando anticuerpos
específicos contra las proteínas RON2, RON5 y RON8 han confirmado la asociación de estas
proteínas con AMA-1 y RON4 [124].
Un modelo de organización del complejo durante la formación del TJ, descrito por Besteiro y
colaboradores en el 2009 [124], propone que el parásito inserta directamente las proteínas
RONs dentro de la membrana de la célula huésped, sirviendo a su vez de receptores para la
proteína TgAMA-1 (Figura 12). Aunque no es claro cómo las proteínas RONs son exportadas
e insertadas en la membrana de la célula huésped, tratamientos selectivos sobre las
membranas del parásito y de la célula huésped, sugieren que TgRON4 y TgRON8, al no
contener dominios transmembranales, son expuestas a la cara citoplasmática de la célula
huésped, mientras que RON5 y RON2 (que contienen dominios transmembranales), son
expuestas sobre la cara exterior de la célula huésped y, de esta forma, quedan disponibles
24
para la interacción específica con AMA-1 (Figura 12). Sin embargo, sólo la interacción entre
la proteína AMA-1 y RON2 se mantuvo en presencia de 0.6% de dodecilsulfato sódico (SDS),
lo que permite sugerir que estas dos proteínas interactúan fuertemente y son los
componentes mínimos requeridos para la formación del complejo [21, 124]. Esta es la
primera evidencia de funcionamiento del TJ en los Apicomplexa a través de la cooperación
entre distintos organelos secretorios.
Figura 12. Modelo organizacional del MJ en Toxoplasma gondii. Inmunoprecipitaciones y ensayos de inmunofluorescencia, utilizando distintos tipos de permeabilización selectiva de membranas, han permitido establecer el primer modelo organizacional del MJ. AMA-1 es secretada desde las micronemas (rojo) hacia la membrana del parásito, mientras que las proteínas RONs son secretadas hacia la superficie de la célula huésped. Allí, las proteínas RONs sirven de receptor para la proteína AMA-1 durante la formación del TJ. (IMC, complejo de membrana interna). Tomado de Besteiro y cols, 2009 [124].
En P. falciparum se han identificado y caracterizado los genes que codifican las proteínas
PfRON2 (Pf14_0495) [17], PfRON4 (Pf11_0168) [125] y PfRON5 (MAL8P1.73) [18],
homólogas a las proteínas de T. gondii. La proteína RON8 no se encontró en el genoma de
P. falciparum, indicando que esta proteína se encuentra restringida a funciones específicas
en los coccidias como T. gondii y Neospora caninum [124, 126]. Varios estudios en P.
falciparum han concluido que las proteínas RON2, RON4 y RON5 se localizan en el cuello de
25
las roptrias de esquizontes maduros y se asocian específicamente a la proteína PfAMA-1,
similar a lo reportado para T. gondii [20]. Recientemente se caracterizó la proteína PfRON3,
que se expresa en esquizontes tardíos, pero a diferencia de lo reportado para las demás
proteínas RONs, se localiza en el bulbo de las roptrias. PfRON3 interactúa con PfRON2 y
PfRON4 pero no con PfAMA-1, lo que indica que PfRON3 participa en la formación de un
nuevo complejo de proteínas RONs (RON2/RON3/RON4), más no en el complejo del TJ
formado por AMA1 y las AAPs [127]. Se requieren de estudios adicionales para elucidar la
función de este nuevo complejo en el que participa la proteína RON3. Entre otras proteínas
RONs identificadas, se encuentra la PfRON6 que se localiza en el cuello de las roptrias, pero
no se ha demostrado ninguna interacción con las proteínas del complejo del TJ [128].
A través de varios ensayos de interacción con las proteínas recombinantes o nativas de AMA-
1 y RON2 en P. falciparum y T. gondii se ha encontrado que la región conservada carboxi-
terminal de la proteína RON2 interactúa específicamente con el ectodominio de la proteína
AMA-1 [23] (Figura 13). De manera interesante, análisis con mutantes de la proteína PfAMA-
1 mostraron que el residuo Y251, localizado dentro del canal hidrofóbico, es absolutamente
esencial para la formación del complejo AMA-1/AAPs [20], sugiriendo que tanto el canal
hidrofóbico de AMA-1 como el dominio carboxi-terminal de RON2, son elementos esenciales
para que se establezca la interacción.
El rol biológico de esta interacción se estableció a través de experimentos de inhibición de la
invasión usando proteínas recombinantes, donde se encontró que la interacción entre
AMA1/RON2 es crucial para la entrada de P. falciparum y T. gondii a sus respectivas células
huésped [23].
26
Figura 13. Modelo de interacción AMA1-RON2. De acuerdo a los estudios de interacción proteína-proteína se puede proponer los siguientes modelos: a) Sólo la región que comprende los residuos 1295-1359 de RON2 se expone para interactuar con el surco hidrofóbico de la proteína AMA-1. b) Toda la región carboxi-terminal se expone para interactuar con el surco hidrofóbico de AMA-1. Tomado de Lamarque M y cols, 2011 [23].
Estos hallazgos han ayudado a la comprensión de cómo actúan los anticuerpos inhibitorios
de la invasión, específicamente el anticuerpo 4G2, que reconoce una región conservada del
dominio II de PfAMA-1. Ensayos de inmunoprecipitación con este anticuerpo mostraron que,
a pesar de unirse a AMA-1 libre, no era capaz de unirse al complejo AMA1/AAPs y, como
consecuencia, no inmunoprecipitaba ninguna proteína RON. Sin embargo, este anticuerpo
tiene la capacidad de unirse a un mutante de la proteína PfAMA-1 que carece del residuo
específico de unión a las proteínas RONs, indicando que el anticuerpo no bloquea
directamente el sitio de contacto entre AMA-1 y las RONs [20, 129]. El mecanismo de
inhibición de la invasión, mediado por este anticuerpo, estaría dado a través de cambios
conformacionales en AMA-1 o un impedimento estérico que bloquea la interacción
AMA1/APPs (Figura 14) [129]. De forma similar, el péptido R1, derivado de una librería de
expresión en fagos y conocido por ser un potente inhibidor de la entrada de los merozoitos a
los eritrocitos, actúa uniéndose al canal hidrofóbico de la proteína PfAMA-1 (Figura 14b) y de
esta manera inhibe el complejo AMA-1/AAPs [130]. Estos datos indican que la interacción
a) b)
Surco
Hidrofóbico
Surco
Hidrofóbico
27
entre un candidato a vacuna, como la proteína PfAMA-1, con nuevos componentes del cuello
de las roptrias, es crítica durante el proceso de invasión. Adicionalmente, estos resultados
mejoran nuestro entendimiento de los mecanismos moleculares implicados en este proceso,
lo que podría ayudar al desarrollo de nuevas estrategias efectivas contra la malaria y a la
inclusión de las proteínas RONs en ensayos inmunológicos para evaluar sus propiedades
inmunológicas y antigénicas.
Figura 14. Mecanismo de inhibición de la invasión en P. falciparum. a) Modo de acción propuesto para el anticuerpo inhibitorio de la invasión 4G2. En ausencia del anticuerpo, se forma el complejo AMA1/AAPs y hay invasión. En presencia del anticuerpo, se produce un impedimento estérico o cambio conformacional de AMA-1 que previene la formación del complejo. Tomado de Treeck M, 2009 [129]. b) Después de la reorientación se da la formación del TJ y la translocación del complejo de las RONs a la membrana de la célula huésped (1). La interacción entre las RONs con AMA-1 genera la secreción del bulbo de las roptrias y posterior invasión (2). La unión del péptido R1 al surco hidrofóbico de AMA-1 previene la interacción con el complejo RON, impidiendo la invasión del merozoito al eritrocito. Tomado de Richard D y cols, 2010 [130].
Impedimiento estérico
mediado por 4G2
Cambio conformacional
mediado por 4G2
Invasión No Invasión No Invasión
a)
1. Unión2a. Invasión
2b. Inhibición por R1
b)
28
2.6 Biología y limitaciones en la investigación en P. vivax
P. vivax posee características biológicas especiales que lo distinguen de las demás especies
de Plasmodium y que han dificultado en gran medida la investigación y el desarrollo de una
vacuna contra esta especie. Una de las características más notorias es que, durante la
infección a los hepatocitos, P. vivax puede persistir como formas parasitarias durmientes
(hipnozoitos) por meses e incluso años antes de iniciar la fase sanguínea. Parte del fracaso
de algunos medicamentos antimaláricos se debe a que no son capaces de eliminar este tipo
de formas parasitarias albergadas en el hígado.
Otra característica biológica importante es que, en comparación con P. falciparum, P. vivax
solo es capaz de invadir reticulocitos, los cuales corresponden tan sólo al 1% de las células
rojas en sangre periférica. La base molecular de este requerimiento se debe a las
interacciones de ligandos del parásito, específicamente las proteínas RBP1 y 2, con proteínas
sobre la superficie celular de los reticulocitos. Esta preferencia celular dificulta el desarrollo y
mantenimiento de este parásito en un cultivo continuo in vitro. Como consecuencia, los
estudios de la secuenciación completa del genoma [131] y los análisis del transcriptoma [132]
fueron publicados varios años después, respecto a los de P. falciparum [133, 134] (Tabla 1).
Recientemente ha sido publicado el proteoma del esquizonte de P. vivax, en el cual se
encontró la expresión de alrededor de 316 proteínas [135]. En adición, un análisis del
inmunoproteoma de P. vivax ha identificado alrededor de 18 proteínas que son altamente
reconocidas por sueros de pacientes infectados con P. vivax [136].
29
Tabla 1. Estudios de genómica, transcriptómica y proteómica en P. falciparum y P. vivax
Estudios P. falciparum P. vivax
Cultivo continuo in vitro 1978 Trager W and Jenson JB. Nature [137].
2007-2009
Panichakul, T y cols. Int J Parasitol [138].
Genoma 2002
Gardner, KJ y cols. Nature [139].
2008
Carlton, J y cols. Nature [131]
Transcriptoma 2003
Bozdech, Z y cols. Plos Biol [133].
2008
Bozdech, Z y cols. PNAS [132].
Proteoma 2002 Florens, L y cols. Nature [134].
2010-2011 (esquizontes) Chen JH y cols. J Proteome Res [136] y
Roobsoong W y cols. J. Proteomics
[135].
Mientras P. falciparum es capaz de alternar la expresión de sus ligandos dependiendo de los
receptores disponibles sobre la membrana de la célula huésped, P. vivax invade sólo
reticulocitos positivos para el antígeno Duffy, utilizando como ligando la proteína DBP. Por
tanto, la carencia de la expresión del antígeno Duffy sobre la superficie de los eritrocitos
previene la entrada de los merozoitos de P. vivax a los eritrocitos. A esto se debe la ausencia
de este parásito en el África subsahariano, donde parte de la población es negativa para este
antígeno. Sin embargo, dos reportes de individuos negativos para el antígeno Duffy con
infecciones por P. vivax, podría eliminar el dogma de que este antígeno es absolutamente
esencial para la invasión de los merozoitos a los reticulocitos [140, 141].
2.7 Avances en la investigación de P. vivax
Aunque la infección por P. vivax se ha considerado clínicamente menos severa que la
producida por P. falciparum, la aparición de cepas de P. vivax resistentes a medicamentos
antimaláricos como la cloroquina, la primaquina [29, 32] y la prevalencia de esta especie en
las zonas tropicales y subtropicales de Asia y América Latina, con cerca de 100 millones de
casos clínicos anuales, plantea una amenaza significativa para la salud mundial [5, 6].
30
Parte del conocimiento de la biología y de las interacciones moleculares que se dan durante
el ciclo de vida en P. vivax ha sido limitado debido a que no se cuenta con un sistema de
cultivo continuo in vitro que pueda generar un alto número de parásitos en estadio sanguíneo.
En 1989 se reportó un método que permitía la maduración de los parásitos de P. vivax a
partir de muestras de pacientes de sangre infectada en cultivos a corto-plazo [142]. Hace ~23
años se hicieron esfuerzos para mantener parásitos de P. vivax en un sistema de cultivo
continuo in vitro en presencia de reticulocitos de monos Aotus en condiciones de agitación
constante [143]. En los últimos años, este método se mejoró utilizando reticulocitos humanos
en un medio modificado y condiciones de agitación y reposo [144]. Otro método explorado fue
el uso de células hematopoyéticas en combinación con factores específicos de diferenciación
a reticulocitos, que generaron una fuente constante de estas células pero bajos porcentajes
de parasitemia [138]. A pesar de estos refuerzos, no se ha conseguido hasta el momento un
método reproducible que soporte el crecimiento exponencial de P. vivax para obtener altas
cantidades de este parásito.
Para solucionar parte de este inconveniente, distintos grupos de investigación han realizado
estudios para adaptar cepas de P. vivax en monos Aotus [145-147]. En nuestro instituto, la
cepa VCG-1 de P. vivax se adaptó exitosamente en monos Aotus spp. manteniendo su alta
virulencia después de 22 pases y alcanzando niveles de parasitemia por encima del 5%
[148]. De esta forma, se han obtenido progresos importantes en la identificación y
caracterización de diferentes proteínas en P. vivax homólogas a las de P. falciparum [11, 13,
15, 149].
De acuerdo a los datos de la OMS, solo hay tres candidatos a vacuna de P. vivax en ensayos
clínicos y un modesto número de candidatos en ensayos preclínicos en comparación con las
31
70 formulaciones de vacunas diferentes en P. falciparum con cerca de 23 en ensayos clínicos
[150]. Los estudios en P. vivax se han centrado específicamente en cuatro proteínas:
PvMSP1, PvCSP, PvAMA-1 y DBP. Ensayos de inmunización en monos Saimiri boliviensis
con el fragmento recombinante de 19kDa de la proteína PvMSP1, acoplado junto a dos
epítopes T del toxoide tetánico, mostró que tres de cinco monos se protegieron frente al reto
experimental con la cepa Sal-1. Sin embargo, ningún mono mantuvo la protección cuando se
expusieron por segunda vez al parásito [151]. Recientemente, un estudio realizado en Brasil
inmunizando ratones con el fragmento recombinante de PvMSP19 con un agonista del TLR5
administrado o unido genéticamente a la recombinante, mostró una fuerte respuesta de
anticuerpos tipo IgG1 de larga duración [152].
Resultados prometedores han sido obtenidos por nuestro grupo, en ensayos de inmunización
de monos Aotus nancymaae con polipéptidos recombinantes (rPvMSP114 y rPvMSP120) o con
una mezcla de péptidos sintéticos con alta capacidad de unión, contenidos en el fragmento
de 33kDa de la proteína PvMSP-1. Los monos fueron retados experimentalmente con una
cepa heteróloga de P. vivax. De los doce monos inmunizados con dos dosis de la mezcla de
las recombinantes, cuatro se protegieron parcialmente y dos totalmente [153]. Un estudio
posterior, utilizando el mismo protocolo de inmunización pero en 3 dosis, mostró protección
parcial en 4 de 5 monos [154].
En un estudio realizado por otro grupo, con constructos codificantes de las proteínas PvAMA-
1, PvMSP-1 y PvCSP basados en vacunas de ADN, se encontró altos niveles de anticuerpos
específicos en ratones [155]. Estudios en la Universidad de Sao Paulo, Brasil han mostrado
que el dominio II de PvAMA-1 es una región antigénica reconocida por anticuerpos tipo IgG
presentes en muchos individuos durante una infección activa por P. vivax. Este mismo
32
fragmento formulado en distintos adyuvantes como hidróxido de Aluminio, QS21, saponina,
CpG-ODN mostró ser altamente inmunogénico en ratones.
Si bien se han obtenido avances importantes en la evaluación de las propiedades
antigénicas, inmunogénicas y protectivas de algunas proteínas en P. vivax, la liberación del
genoma, los análisis del transcriptoma y algunos análisis pequeños del proteoma indican que
este parásito consta de alrededor de ~5400 genes [132] de los cuales se han detectado
alrededor de 316 proteínas en muestras enriquecidas con esquizontes [135]. Por lo tanto, es
necesaria la caracterización de nuevos antígenos en P. vivax involucrados en el proceso de
invasión, que puedan ser evaluados en ensayos inmunológicos para su inclusión en una
vacuna multi-estadio multi-antigénica contra esta especie parasitaria.
33
3 Diseño Metodológico
Para el desarrollo de los objetivos planteados, se determinó la siguiente metodología que se
resume en el siguiente esquema general:
3.1 Análisis Bioinformático
Mediante la herramienta básica de búsqueda de alineamientos locales (BLAST, del inglés
Basic Local Alignment Search Tool) [156] disponible en el National Center for Biotechnology
Information (NCBI) se hizo la búsqueda del gen homólogo de PfRON2, utilizando como
señuelo la secuencia de aminoácidos de esta proteína, frente a todo el genoma de P. vivax
de la cepa Sal-1 [131]. La secuencia con el mayor puntaje fue seleccionada como el gen
putativo pvron2. Se escanearon las bases de datos de PlasmoDB [157] y del Instituto Sanger
[158] para la búsqueda de genes homólogos de pvron2 y pfron2 en los genomas parciales de
otras especies de Plasmodium (P. knowlesi, P. chabaudi, P. yoelli y P. berghei). Para los
análisis de sintenia, se evaluó la estructura génica y la dirección de la transcripción de los
marcos abiertos de lectura (ORFs, del inglés, Open Reading Frames) corriente arriba y abajo
del gen ron2 en las diferentes especies de Plasmodium. Adicionalmente, se determinaron los
Identificación y Caracterización
de PvRON2
Análisis bioinformático
Genoma Transcripción Expresión
Localización
subcelular
Análisis Experimental
Herramienta BLAST:
Identificación PvRON2
• Valores de Identidad y
Similitud.
• Análisis de sintenía.
Identificación de ortólogos
Análisis de las características
primarias de PvRON2
Diseño de primers y selección
de péptidos epítopes B
34
valores de identidad y similitud a nivel de nucleótidos y aminoácidos entre P. falciparum-P.
vivax, P. vivax-P. knowlesi y entre las demás especies, utilizando la herramienta ALignX y
ClustalW [159].
Se analizó la presencia de motivos y dominios en la secuencia de la proteína PvRON2
utilizando las siguientes herramientas: 1) SignalP, para determinar la presencia de péptido
señal (PS) [160], 2) TMHMM y PredGPI [161] para evaluar las posibles regiones de anclaje,
3) XSTREAM, para determinar las secuencias repetitivas y 4) SMART (Simple Modular
Architecture Research Tool) [162] y GlobPlot [163] para determinar otros motivos y dominios
importantes en la secuencia de PvRON2.
3.2 Extracción y fuente de ácidos nucleicos y proteínas.
Como fuente de ADN, ARN y proteína se utilizó la cepa Colombia Guaviare 1 (VCG-1) de P.
vivax que se cultivó a través de pases sucesivos in vivo en monos Aotus spp de la estación
de primates de Leticia, Amazonas, como se describió previamente [148]. Los animales se han
mantenido y cuidado bajo la constante supervisión de un primatólogo de acuerdo a las
condiciones establecidas por el Estatuto Nacional de Protección Animal (Ley 84 de 1989) y
bajo las condiciones establecidas por el Instituto Oficial del Ministerio del Medio Ambiente,
Corpoamazonía (resolución 00066, Septiembre 13 de 2006).
Se extrajo una muestra de 3-4mL de sangre infectada con un alto contenido de esquizontes y
se enriquecieron en un gradiente de Percoll discontinuo (30, 40, 45 y 50%) (GE Healthcare,
Uppsala, Sweden) (Anexo 1) de acuerdo a un protocolo descrito previamente [164]. El Percoll
es una suspensión coloidal estéril compuesta de partículas de sílice de alrededor de 15-30nm
de diámetro unidas con polivinilpirrolidona. Debido a que el tamaño de sus partículas es
heterogéneo, el Percoll puede formar un gradiente de densidad cuando se centrifuga.
35
El anillo de esquizontes obtenido de la separación por Percoll, se lavó varias veces con buffer
fosfato salino (PBS, que contiene: 13,7mM de NaCl, 0.27mM de KCl, 0.43mM de
Na2HPO4.7H2O y 0.14mM de KH2PO4, pH: 7.3) y se trató con una solución de saponina
(Sigma, St. Louis, MO, USA) al 0.2% en PBS para lisar los eritrocitos que contienen los
esquizontes. Posteriormente, se lavó extensivamente con PBS para eliminar los residuos de
saponina y los esquizontes obtenidos se utilizaron como fuente para extraer ADN, ARN y
proteínas.
3.2.1 Extracción de ADNg y ARN: Para la extracción de ADN genómico (ADNg) se utilizó
el kit de purificación de Wizard® (Promega, Wisconsin, USA) siguiendo las especificaciones
del fabricante.
El ARN total fue extraído mediante el método de Trizol [165] y tratamiento con RQ1 ADNasa
libre de ARNasas (Promega). El Trizol es una solución monofásica de fenol e isotiocianato de
guanidina, que mantienen la integridad del ARN mientras las células son lisadas. La muestra
de parásito se mezcló con el reactivo de Trizol y se incubó por 24horas a -70ºC.
Posteriormente, se adicionó cloroformo y se centrifugó a 12,000 × g por 15min permitiendo la
separación de la solución en una fase acuosa y una fase orgánica. La fase acuosa se
transfirió a un tubo nuevo y se precipitó el ARN por la adición de alcohol isopropílico. La
muestra se centrifugó a 12,000 × g por 10min a 8ºC y el pellet se lavó con etanol al 75%. Por
último, el ARN se disolvió en agua libre de ARNasas y se almacenó a -70ºC.
3.2.2 Síntesis de ADNc: Se tomaron cinco microlitros de ARN tratado con ADNasa como
templado para la síntesis de ADNc utilizando la transcriptasa reversa Superscript III
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) y cebadores oligo (dT)20, de acuerdo a las especificaciones
del fabricante. La transcriptasa es una versión de la enzima del Virus de la Leucemia Murina
Moloney (M-MLV), producto del gen pol. Es una ARN polimerasa dependiente de ADN que
consiste en una subunidad de aproximadamente 71kDa. Los oligo (dT)20 están compuestos
36
de 20 nucleótidos con base timina que son complementarios a las poliadeninas presentes en
el ARN mensajero de organismos eucariotas.
El proceso de síntesis se realizó en un volumen final de 26µL, con un ciclo inicial de 5min a
65ºC, seguido por un ciclo de 60min a 50ºC y finalmente un ciclo de 15min a 70ºC. Para
remover el molde de ARN, se adicionó 1µL de ARNasa H y se incubó por 20min a 37ºC.
3.2.3 Extracción de proteínas
Para la obtención de un extracto total de proteínas de la cepa VCG-1, se tomaron los
parásitos lavados varias veces con PBS y se trataron con una solución de lisis que contenía:
100mM de PMSF, 20% de SDS, 0.5M de EDTA, pH: 8.3 y 100mM de Iodoacetamida. Esta
mezcla se agitó vigorosamente y se guardó a -70ºC para los estudios de Western blot.
3.3 Diseño de cebadores
La secuencia de nucleótidos del gen pvron-2 (PVX_117880) reportada en PlasmoDB [157],
fue usada como molde para el diseño de tres sets de cebadores que cubren la secuencia
completa del gen, utilizando el software Gene Runner v3.05. Los cebadores PvRON2-pEXP-
F1 y PvRON2-pEXP-R1 se usaron para la amplificación de la región I (52-2,226nt) que cubre
desde el aminoácido 18 al 742. PvRON2-pEXP-F2 y PvRON2-pEXP-R2 amplifican la región II
(2,101-4,680nt) del aminoácido 701 al 1,560. La región III (4,549-6,609nt) se amplificó con los
cebadores PvRON2-pEXP-F3 y PvRON2-pEXP-R3 y cubren desde el residuo 1,517 al 2,203
(Figura 15 y Tabla 2). Como se muestra en la figura 15, los tres sets de cebadores se
sobrelapan en aproximadamente 100pb.
Para obtener la secuencia completa del gen pvron2, se diseñaron cuatro cebadores para
amplificar dos fragmentos que cubren el codón de inicio del gen pvron2 (fragmento 1) y el
codón de parada (fragmento 2). Los cebadores utilizados para el fragmento 1 se
37
denominaron: PvRON2-Ext-Dir, diseñado 24pb corriente arriba del gen pvron2, y el PvRON2-
sec-Rev1 (Tabla 2), los cuales amplifican un producto de 1,078pb. Los cebadores PvRON2-
pEXP-F3 y el PvRON2-Ext-Rev (localizado 32pb corriente abajo del gen pvron2) amplifican el
fragmento 2, de aproximadamente 2,084pb (Tabla 2). Adicionalmente, se diseñaron siete
cebadores distribuidos a lo largo del gen pvron2 para asegurar la secuenciación completa del
gen (Tabla 2 y Figura 15).
Para la amplificación del ectodominio de PvAMA-1 (43-487 aminoácidos) se diseño un set de
cebadores denominados PvAMA-1D: 5‟-ATGCCTACCGTTGAGAGAAGCA-3‟ y PvAMA-1R:
5‟-TAGTAGCATCTGCTTGTTCG-3‟.
Tabla 2. Cebadores utilizados para la amplificación y secuenciación del gen pvron2 a partir de ADNg y ADNc
Aplicación Cebador Secuencia
Amplificación
PvRON2-pEXP-F1
PvRON2-pEXP-R1
PvRON2-pEXP-F2
PvRON2-pEXP-R2
PvRON2-pEXP-F3
PvRON2-pEXP-R3
PvRON2-Ext-Dir
PvRON2-Sec-Rev1
PvRON2-Ext-Rev
5’-ATG AGT ACA AGG GAG GCA AAA G-3’
5’-ATA TCT TTT GTT TCT CGT CCT G-3’
5’- ATG AAC CCA TTA GTA TAT CAC GTG-3’
5’- CAG CAG TTT CAT CTT GGC C-3’
5’- ATG ACC AGG GCT GAG AAA TTC G-3’
5’- CAC CTG TAT GCG GGC GTA-3’
5’- TTA TGA CCG CAA AAG CAA AG-3’
5’- GGT ACG CACT TCC AGC C-3’
5’- GAA GGA GAG GCC ACA CC-3’
Secuenciación
PvRON2-Sec-Rev1
PvRON2-Sec-Rev2
PvRON2-Sec-Rev4
PvRON2-Sec-Rev5
PvRON2-Sec-Rev6
PvRON2-Sec-Rev8
PvRON2-Sec-Rev9
5’- GGT ACG CAC TTC CAG CC-3’
5’- GAT CTA ACC CAT AAG TTG TC-3’
5’- AGC TTA GTG TAT TTC TTT TAT-3’
5’- AAC CCT GCA CGA AGT AGC-3’
5’- CTA CCA GCG TTT CTA ATT TG-3’
5’- TTT TTG AAA AAT TTT CGA AAC GC-3’
5’- CTA TGA AGT GAC CAA AAT ATG-3’
38
Todos los cebadores se diseñaron teniendo en cuenta los siguientes parámetros: i) tamaño
del oligonucleótido entre 18 y 25nt de longitud; ii) temperatura de fusión del par de cebadores
entre 54-58ºC; iii) especificidad de los cebadores evaluada a través de la herramienta BLAST
y iv) ausencia de estructuras secundarias como loops, dímeros y horquillas, entre otras.
Figura 15. Localización de los cebadores diseñados sobre la secuencia del gen pvron2. La secuencia del gen pvron2 (PVX_117880) se utilizó para el diseño de los cebadores de amplificación y secuenciación. Las flechas en rojo, morado y verde claro, indican la longitud de los fragmentos amplificados con los tres sets de cebadores diseñados sobre la secuencia de nucleótidos. Las flechas en gris indican las posiciones de los cebadores utilizados para la secuenciación del gen, mientras que las flechas azules indican la posición de los cebadores diseñados corriente arriba y abajo del gen.
3.4 Amplificación, clonación y secuenciación del gen pvron2.
La amplificación por PCR se realizó con la enzima GoTaq Flexi ADN polimerasa (Promega),
en un volumen final de reacción de 25µL que contenía 5µL de buffer 5X, 4µL de dNTPs
(1.25µM), 1.5µL de MgCl2 (1.5mM), 2µL de cada cebador a una concentración de 5µM, 0.3µL
de polimerasa (5U/µL) y 8.2µL de agua ultrapura libre de nucleasas. La polimerasa adiciona
una adenosina (A) en el extremo 3‟ del producto amplificado para facilitar la posterior
clonación en el vector. Las condiciones de amplificación para el gen pvron2 utilizadas para
las tres regiones y los dos fragmentos corriente arriba y abajo del gen fueron: un ciclo de
7min a 95°C, seguido de 35 ciclos de 1min a 95°C, 1min a 58°C y3min a 72°C y finalmente
un ciclo de extensión de 10min a 72°C. Para la amplificación del ectodominio de PvAMA-1 se
utilizaron las mismas condiciones de amplificación de pvron2. Los productos de PCR se
visualizaron utilizando la técnica de electroforesis, en geles de agarosa al 1% en buffer Tris-
39
acetato-EDTA (TAE que contiene 4.84g/L Tris-Base pH: 8.5, 0.74gr/L de Na2EDTA y 1.14mL
de ácido acético glacial) teñidos con SYBR Safe (Invitrogen). Para determinar el peso
molecular de cada amplicón, se utilizó un patrón de peso molecular de 200pb a 10kb o de
500pb a 5kb (Bioline Inc, London, UK). El corrido electroforético se realizó a 100V durante
20min utilizando buffer de corrido TAE y al final los geles se visualizaron con luz ultravioleta.
Los productos de PCR se purificaron utilizando el kit Wizard PCR preps (Promega) de
acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR purificados de las tres
regiones de pvron2 se ligaron en el vector de expresión pEXP5-CT/TOPO (Invitrogen) (Figura
16), mediante clonación TOPO TA. Brevemente, se utilizaron cuatro microlitros de producto
de PCR purificado y se mezclaron con 0.5µL de plásmido junto con 0.5µL de agua libre de
nucleasas y 1µL de solución salina en un volumen de reacción final de 6µL. La reacción se
incubó durante 45min a temperatura ambiente. Esta reacción se utilizó para transformar
células de Escherichia coli químicamente competentes One Shot® TOP10 (Invitrogen), según
las especificaciones del fabricante. Para este fin, 2µL de reacción de ligación se mezclaron
con 100µL de células TOP10, seguido de la adición de 100µL de KCM (100mM de KCl,
30mM de CaCl2 y 50mM de MgCl2). La reacción se incubó durante 20min en hielo y
posteriormente se indujo un choque térmico a 42ºC durante 2min seguido de 5min en hielo.
Posteriormente, se adicionaron 250µL de medio S.O.C (2g Triptona, 0.5g de extracto de
levadura, 0.05g de NaCl, 50mg de MgCl2 y 50mg de MgSO4 en 100mL) suplementado con
5µL de D-glucosa al 20% y se incubó durante una hora a 37ºC en agitación constante. 100µL
de la reacción se extendieron en cajas de agar Luria Bertani (LB) (10g/L de triptona, 5g/L de
extracto de levadura, 10g/L NaCl, 1.5% p/v de agar) que contenía ampicilina (100µg/L) como
marcador de selección y posteriormente se incubaron durante 16h a 37ºC.
40
Figura 16. Mapa del vector pEXP5-CT/TOPO (Invitrogen). El vector tiene como característica principal un gen de resistencia a ampicilina como marcador de selección y dos timinas (T) al extremo 3‟ de cada uno de los extremos del vector que facilitan el clonaje del producto amplificado junto con la Topoisomerasa tipo I del virus Vaccinia. Adicionalmente, contiene: 1) un promotor del bacteriófago T7 para la expresión alta y regulada de la proteína recombinante; 2) un sitio de unión al ribosoma (RBS); 3) codifica para una cola de 6 histidinas al extremo carboxi-terminal, para la posterior detección y purificación de la proteína recombinante; 4) un origen de replicación pUC. 5) y una secuencia de terminación del bacteriófago T7 que permite la eficiente finalización de la transcripción.
Las colonias pequeñas y puntiformes se picaron, se extendieron en medio agar LB fresco y
se verificó la correcta orientación del producto mediante PCR y restricción enzimática. Para la
PCR, cada colonia se colocó directamente en una reacción junto con 1µL de buffer Taq
polimerasa 5X, 0.5µL de MgCl2 (1.25mM), 2µL de dNTPs (1.25mM), 1µL de cada uno de los
cebadores (5µM), 0.1µL de Taq polimerasa y 4.4µL de agua libre de nucleasas para un
volumen final de 10µL. Para la amplificación de la región I, se utilizó el cebador universal del
vector pEXP5: T7 5‟-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3‟ y el PvRON2-pEXP-R1, para la
región II, se utilizó el cebador T7 y el PvRON2-pEXP-R2 y para la región III se utilizaron los
cebadores T7 y PvRON2-pEXP-R3. Las condiciones de amplificación para las tres regiones
fueron: un ciclo de 10min a 95°C, seguido de 25 ciclos de 1min a 52°C, 1min a 72°C y 1min a
95°C y, finalmente, un ciclo de extensión de 10min a 72°C.
41
Las colonias que después de la amplificación dieron los productos de PCR esperados, fueron
sometidas a confirmación por restricción enzimática. Para la región I y III se utilizó la enzima
HincII (GTY/RAC), mientras que para la región II se utilizó la enzima XbaI (TCT/AGA). Para
este fin, se hizo la extracción de ADN plasmídico utilizando el método de lisis alcalina para
cada colonia, como se describe a continuación:
Las bacterias crecidas en 5mL de medio líquido LB se centrifugaron a 16,000 × g por 30min a
4ºC y se eliminó todo el sobrenadante. Posteriormente, se adicionó 300µL de la solución I
(50mM de glucosa, 25mM Tris-HCl (pH: 8.0) y 10mM de EDTA a pH: 8.0) y se mezcló con el
vórtex. A esta mezcla, se le adicionó 400µL de la solución II (0.2M de NaOH y 1% de SDS) y
se incubó en hielo durante 5min. Se adicionó 300µL de la solución III enfriada previamente en
hielo (5mM de acetato de potasio, 11.5mL de ácido acético glacial y 28.5mL de agua
destilada) y se incubó en hielo durante 10min. Esta mezcla se centrifugó a 16,000 × g por
5min. El sobrenadante se transfirió a una bala que contenía 900µL de isopropanol para
precipitar el ADN plasmídico y se centrifugó a 16,000 × g por 5min. Se descartó el
sobrenadante y se adicionó 1mL de etanol al 70% enfriado previamente en hielo y se
centrifugó durante un minuto a 16,000 × g. El pellet se dejó secar a temperatura ambiente y el
ADN plasmídico se resuspendió en 50µL de buffer TE (10mM de Tris-HCl pH: 8.0, 1mM de
EDTA y 20µg/mL de ARNasas).
Una vez obtenido el ADN plasmídico, se realizaron reacciones independientes para cada
región incubando 10µL de ADN plasmídico, 1.5µL de buffer 1X para la enzima de restricción,
5U de la respectiva enzima de restricción, 1µL de albúmina sérica bovina (BSA) y 1µL de de
agua libre de nucleasas para un volumen final de 15µL. Cada reacción se incubó durante 6h
a 37ºC y posteriormente se detuvo por incubación a 65ºC durante 20min. Los productos se
visualizaron en geles de agarosa como se describió arriba.
42
Una vez verificadas las colonias por PCR y restricción enzimática, se extrajo ADN plasmídico
de tres colonias (2 provenientes de RT-PCR y una de ADNg) para cada región. Cada ADN se
secuenció utilizando el equipo ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin Elmer-Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA). Para la secuenciación de la región I se utilizaron los
siguientes cebadores: T7, PvRON2-sec-Rev1, PvRON2-sec-Rev2 (tabla 2) y pEXP5-CT-Sec-
rev: 5‟-CAA GGG GTT ATG CTA GTT AT-3‟. Para la región II, se utilizaron: T7, PvRON2-sec-
Rev4, PvRON2-sec-Rev5, PvRON2-sec-Rev6 y pEXP5-CT-Sec-rev. Los cebadores para la
región III fueron: T7, PvRON2-sec-Rev7, PvRON2-sec-Rev8 y pEXP5-CT-Sec-rev.
Adicionalmente, se secuenciaron los productos de PCR purificados obtenidos de los dos
fragmentos de pvron2 que incluyen alrededor de 30pb corriente arriba y abajo del gen. El set
de cebadores empleado para la secuenciación fue: PvRON2-Ext-Dir y PvRON2-sec-Rev1 y
PvRON2- pEXP-F3 con PvRON2-Ext-Rev.
3.5 Selección y síntesis de péptidos derivados de PvRON2.
La secuencia de PvRON2 se utilizó como plantilla para seleccionar dos péptidos epitopes B
lineales, basados en los siguientes parámetros: 1) promedio de los valores altos de
antigenicidad de Parker, hidrofilicidad y accesibilidad al solvente obtenidos con el software
Antheprot [166], 2) valores altos obtenidos con la herramienta Bepipred (umbral de 0.35 por
defecto y una especificidad del 75%) que usa una combinación entre un modelo oculto de
Markov y un método de escala de propensión para seleccionar los epitopes B lineales [167] y
3) que los péptidos seleccionados se localicen en diferentes porciones de la proteína, con el
fin de detectar fragmentos en caso que exista un procesamiento proteolítico en PvRON2.
Los péptidos seleccionados se sintetizaron en el Grupo Funcional de Síntesis de la
Fundación Instituto de Inmunología de Colombia (FIDIC) mediante síntesis de péptidos en
fase sólida utilizando la estrategia terbutoxicarbonil (t-Boc). Los péptidos se numeraron de
acuerdo a nuestro sistema serial numérico como: 35519
43
(CG734YGRTRNKRYMHRNPGEKYKG753GC) y 35520
(CG1674KLQQEQNELNEEKERQRQEN1693GC).
Para los ensayos de localización, se sintetizaron los péptidos 37870
(CG23RNQKPSRLTRSANNVLLE40GC) derivado de la región N-terminal de PvAMA-1 y el
32416 (CG792SAGVGTVSTHSPATAARMGL811GC) derivado de la proteína PvRhopH3. El
péptido 37870 es inmunogénico en ratones [168] y el péptido 32416 ha sido utilizado para la
producción de anticuerpos policlonales en conejos y posterior reconocimiento y localización
de la proteína PvRhopH3, homóloga a la proteína PfRhopH3 [149]. Todos los péptidos
sintetizados se analizaron por cromatografía líquida de alta eficacia en fase reversa (HPLC-
RP) y espectrometría de masas MALDI-TOF (Auoflex, Bruker Daltonics, Bremen, Germany).
Durante la síntesis de todos los péptidos, se adicionó CG a los extremos amino y carboxi-
terminal para permitir la polimerización de los péptidos.
3.6 Producción de anticuerpos policlonales.
Para la obtención de anticuerpos policlonales contra la proteína PvRON2, se seleccionaron
dos conejos (89 y 90) New Zealand, negativos para el reconocimiento de proteínas derivadas
P. vivax por Western blot. Cada conejo fue inoculado subcutáneamente con 500µg del
péptido 35519 (conejo 90) ó con el péptido 35520 (conejo 89) emulsificados en adyuvante
completo de Freund (ACF) en el día 0. Se hicieron refuerzos los días 20 y 40 utilizando los
mismos péptidos emulsificados en adyuvante incompleto de Freund (AIF). El suero de los
conejos se recolecto el día 60 y se utilizaron para posteriores ensayos.
Para obtener anticuerpos contra la proteína PvAMA-1 y PvRhopH3, se inmunizaron
intraperitonealmente (i.p.) ratones de la cepa BALB/c de 7-8 semanas de vida con 100µg del
péptido 37870 ó el péptido 32416 emulsificados en ACF. Se realizaron tres refuerzos los días
44
30, 45 y 60 con 100µg de péptido emulsificado en AIC. Los animales se sangraron 15 días
después de la última inmunización y el suero se recolectó para posteriores ensayos.
Las inmunizaciones y las sangrías de los animales de realizaron de acuerdo a las
recomendaciones del Estatuto Nacional de Protección Animal (Ley 84 de 1989) y de la
Resolución Número 8430 de 1993 para el manejo de animales vivos con fines de
investigación o experimentación.
3.7 Inmunoensayos
3.7.1 ELISA
Para evaluar la producción de anticuerpos policlonales en conejos contra los péptidos de
PvRON2, se realizó la técnica de ELISA (del inglés, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
10µg/mL de cada uno de los péptidos (35519 o 35520) se adicionaron a platos de 96 pozos y
se incubó durante 1h a 37ºC. Posteriormente, las placas se dejaron toda la noche a 4ºC,
seguido de incubación a 37ºC durante 1h. Los platos se lavaron cinco veces con PBS-tween
al 0.05% y se incubaron durante 1h a temperatura ambiente con 0.5% de leche descremada
diluida en PBS-tween al 0.05%, posteriormente, se lavaron 5 veces más con PBS-tween al
0.05%. Los sueros de cada sangría (preinmune, PII, PIII) se adicionaron a los pozos en una
dilución 1:100 y se incubaron por una 1h a 37°C. Para remover el exceso de anticuerpo y las
uniones inespecíficas, las placas se lavaron cinco veces con PBS-tween al 0.05%.
Posteriormente, a cada pozo se adicionaron 100µL de anticuerpo anti-conejo acoplado a
peroxidasa en una dilución 1:5,000 y se incubó durante 1h a 37°C. El exceso de anticuerpo
no unido se removió lavando los pozos tres veces con PBS-tween al 0.05%. La
inmunoreactividad se reveló usando TMB Microwell Peroxidase Substrate System kit (KPL
45
Laboratories, WA, USA) de acuerdo a las especificaciones del fabricante y se midió la
absorbancia a 620nm.
3.7.2 Western Blot
El lisado de parásito de P. vivax tratado con saponina (descrito en la sección 3.2.3) se
resolvió por SDS-PAGE en geles de poliacrilamida al 10%. Las proteínas resueltas se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa para el reconocimiento específico de la
proteína PvRON2 mediante Western blot. Para eliminar las uniones inespecíficas, la
membrana se bloqueó con una solución de leche al 5% en PBS-tween 0.05% durante 1h.
Posteriormente, la membrana se lavó y se cortó en tiras para la incubación individual con
sueros pre-inmunes e hiperinmunes (SII ó SIII) de conejos en una dilución de 1:20 durante
90min. Finalmente, las tiras se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con anti-conejo
IgG acoplado a fosfatasa (PIERCE) en una dilución 1:5,000 durante 1h. Como solución
reveladora se utilizó el kit BCPI/NBT (Promega) según recomendaciones del fabricante.
3.7.3 Inmunofluorescencia
Para ensayos de inmunofluorescencia, se hicieron extendidos de sangre infectada con P.
vivax de la cepa VCG-1 y se dejaron secar durante 24h. Las láminas se fijaron con
formaldehido al 4% v/v durante 10min a temperatura ambiente y se lavaron con PBS filtrado.
Posteriormente, las láminas se permeabilizaron con Tritón X-100 al 1% v/v durante 10min a
temperatura ambiente y se bloquearon con una solución de BSA/PBS al 1% p/v a 37°C
durante 30min. Las láminas se lavaron tres veces con PBS y se incubaron con 300µL de
suero hiperinmune anti-PvRON2 (derivado del conejo 89) en una dilución 1:40 y con anti-
PvAMA-1 en una dilución 1:20 ó anti-PvRhopH3 en una dilución 1:20 durante 1h a 37ºC.
Como anticuerpo secundario, se utilizó anti-conejo IgG marcado con fluoresceína (FITC)
46
(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) y con anti-ratón IgG marcado con Rodamina
(Millipore, Billerica, MA, USA) durante 1h seguido de tres lavados con PBS filtrado. Por
último, se tiñeron los núcleos del parásito con una solución de 2µg/mL de 4',6-diamidino-2-
fenilindol diclorhidrato (DAPI) por 20 minutos a temperatura ambiente y la fluorescencia se
visualizó al microscopio de fluorescencia (Olympus BX51) y se utilizó una cámara Olympus
DP2. Las fotografías se analizaron con el software Volocity (Perkin Elmer, Waltham, MA,
USA)
47
4 Resultados y Discusión
4.1 Identificación de pvron2 y genes ortólogos
En busca del gen homólogo de pfron2, que codifica PvRON2 en P. vivax, se utilizó la
secuencia protéica de PfRON2 (PF14_0495) como plantilla para los análisis de tBlastn y
Blastp sobre todo el genoma P. vivax disponible en PlasmoDB (versión 6.5) [157]. La
herramienta tBlastn, utiliza como secuencia de entrada proteína y la compara con una base
de datos de nucleótidos en busca de secuencias de ADN traducidas dentro de los seis
marcos de lectura para la identificación de nuevos genes, mientras que Blastp compara la
secuencia de la proteína de entrada con una base de datos de proteínas. Los análisis de
tBlastn muestran una secuencia nucleotídica con alta probabilidad de contener el gen pvron2
que se localiza en el marco de lectura -2 entre 2,221.529-2,214.921pb del contig CM000453
(Figura 17). Un contig se define como la reconstrucción de una secuencia de ADN a partir de
un set de segmentos de ADN sobrelapados.
Resultados obtenidos con la herramienta Blastp muestran que PVX_117880 presenta el
mayor puntaje, indicando que corresponde a la proteína PvRON2, homóloga a PfRON2
(Figura 17). Alineamientos entre la secuencia de aminoácidos entre PfRON2 y PvRON2
(Figura 18) muestran una identidad (% de residuos que son idénticos entre secuencias) del
47,8% y una similitud (% de residuos que son similares entre secuencias) del 61,7%,
sugiriendo que estas dos proteínas podrían compartir un origen común. Se observa una
región conservada hacia el extremo carboxi-terminal entre las dos proteínas desde los
aminoácidos 844 para P. vivax y 833 para P. falciparum. Cuando esta región se comparó, se
encontró valores de identidad del 64% y de similitud del 91%, mostrando que es la porción la
más parecida entre las dos proteínas (Figura 18).
48
La sintenia conservada, se refiere a la localización conservada de genes en posiciones
equivalentes entre especies relacionadas. Algunos autores se refieren a segmentos
genómicos que contienen genes ortólogos basados en la misma estructura génica (número
de intrones y exones), orientación en la transcripción y valores de similitud superiores al 35%
[169]. Los resultados del análisis sinténico entre P. falciparum y P. vivax mostraron que los
genes localizados corriente arriba y abajo del gen pvron2 conservan la misma estructura
génica, con valores de identidad y similitud en aminoácidos del 42.7%-96.6% y 60.4%-98.3%,
respectivamente (Figura 18 y 19).
Figura 17. Identificación de la proteína PvRON2 mediante la herramienta BLAST. (a) resultados obtenidos con la herramienta tBlastn y (b) Blastp. En el recuadro rojo se muestra el mejor resultado. La mayor puntuación (high score) es una medida de la significancia estadística del alineamiento: entre más alta sea la puntuación, más similares son las dos secuencias. Puntuaciones por debajo de 50 son muy poco fiables. La probabilidad o E-value proporciona la medida de significancia más importante. Entre más baja sea la probabilidad (cerca del 0), mayor similitud hay y más fiable es el análisis.
ORF -2 (2221529-2214921 pb)
a) b)
49
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0
| | | | | | | |
PVX_117880-Sal1 M L K I I F L I L L I F A R I D S I S T R E A K G S V R D G K Q Y V K T K S P T Y T P Q K K T K V I F Y M P G Q E Q E E E E D - - D N D P N G S K K N G K S D T
PF14_0495-3D7 M L K F F I F I L H I Y L Y I D S I Y S S E L S K H V K H D T D E L K Y A S P T Y D P K K G T K V I F Y M P G N E Q G V I P N N I Q N K Q H G T S I Y P A I E Y
* * * : : : : * * * : * * * * : * . * : . . . : : * * * * * * : * * * * * * * * * * : * * : : * . : * : . :
9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0
| | | | | | | |
PVX_117880-PvRON2 G A N K G T H M G S K T D A G N S P S G L N K G S G V G S G S R P A S N N Y K G N A G G G I N I D M S P H G D N S N K G Q Q - - - - G N A G L N K N Q E D T L R
PF14_0495-PfRON2 P T T K Y P A I E Y P G S E M N N G K T G T T N S G I Y N K A H G S S N D Y N A S N S Q D K T I N L H I D E N N S N N S Y Q P Y D S N N T N N N T N S N N N S N
: . * . : . * . . . . . * * : . : : : * * : * : . . . . . * : : . : * * * : . * . * : . * . * . : : . .
1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0
| | | | | | | |
PVX_117880-PvRON2 D E Y E K I R K Q E E E E E E R I N N Q R R A D M K R A Q R G K N K F G - - - - - - D D K G V Q D S L P H T K Y E L S N P Q A G P T N P N A K N R G T G V Y D E
PF14_0495-PfRON2 N N S N N N S N N N S N N Y S N N N S N T N S N T N S N T N S N N N T T N Y D L N S E Y E K I R R K E E E A A R R I E R E R R A D I N R K N Q D N N S N K Y N N
: : : : : : : . : : . . * . : . : : : . . : * : : : : : . . : . : . . : . * : : : . . : . * : :
2 5 0 2 6 0 2 7 0 2 8 0 2 9 0 3 0 0 3 1 0 3 2 0
| | | | | | | |
PVX_117880-PvRON2 F G N G P Y N L V G K Q S G G L T P T A P P Y E H Y G E H G A E G K G Y G P Y G G A E G K G Y G P Y G G S D G K G Y G T Y G G A D G K G Y G P Y G G S D G K G Y
PF14_0495-PfRON2 E Q N G G Y E S D G N S P N S R V N I N I T N N G T H G N P H N N N S Y G H K N N M H N T T N G N Y A N G N Y A N G N Y S K G D Y T N G D Y T N G D Y T N G D Y
* * * : * : . . . . . . : : : . : . * * . . . . . * * . . . : . . * : * . * . . . *
3 3 0 3 4 0 3 5 0 3 6 0 3 7 0 3 8 0 3 9 0 4 0 0
| | | | | | | |
PVX_117880-PvRON2 G P Y G G S D G K G Y G P Y G G S D G K - G Y G P Y G G A D R K G Y G P D G - - T A G S A Y H G G Y D D G - - T N P T Y R S H L N V N L R D G K G D H D G K N G
PF14_0495-PfRON2 T N G I N N N M H G K N N Y N T A N G E Y V N G A Y D G L N N G S Y K L I G N L N N N Q N V D N S Y N Q G N E N D K T Y T S N Y N I N L E D N K N S P D N N - -
. . : : * . * . : : * : * . * . * : . . * * . . . . . . * : : * . : * * * : * : * * . * . * . . * . :
4 1 0 4 2 0 4 3 0 4 4 0 4 5 0 4 6 0 4 7 0 4 8 0
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PVX_117880-PvRON2 M E G Y P N Y F K K H F R P G D A K G A G T D G N E S G T Y V V A P G E G G Y G K N K G T G A D G Q N G T E A G G Q N G S G T D A Q N G S G P H G H S G V G P T
PF14_0495-PfRON2 - Q N Y I S T F N K D I G P N - - K S E R S Y Y D V Y G R E Y D D N K Y N P Y N K T N N H N T N - Q N G S T T Y G S N A N G T Y G P N G T - - Y G S N G T Y E P
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4 9 0 5 0 0 5 1 0 5 2 0 5 3 0 5 4 0 5 5 0 5 6 0
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PVX_117880-PvRON2 T Y G V D F G K S G G G R G N G G G P G E E G E N K T N P S Y D G G Y E K N S G P E K H G E N G T P Y Y V E H P D E N D G S G T T T Y G L D H G K N G G T Q G G
PF14_0495-PfRON2 N E S Y G P N G A Y G P N G T Y G H N G K Y G S K G T Y G N N E T P Y Y V E H P E Y D N G K S M S D F H V K D S K D N I G P G G D Y P N L Y Q N I Y G N E K N P
. . . . : * . * . * * : * . : * . : * : . : * : . : : : * : . . . : * * . * . * : . * . : .
5 7 0 5 8 0 5 9 0 6 0 0 6 1 0 6 2 0 6 3 0 6 4 0
| | | | | | | |
PVX_117880-PvRON2 H G Q D G L G E G G H G Q D G H G Q G G Y G Q G G Y G K G G H G E G G Y G N G G - H G E G G Y G N G G H G E G G Y G N G G P G E - G G Y G N G G H G E G G Y G Q
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: * . . : . * . * . * * . . . : * * . * * . . * . . . * * * . : * . * . . * * * . * * : . . *
6 5 0 6 6 0 6 7 0 6 8 0 6 9 0 7 0 0 7 1 0 7 2 0
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PVX_117880-PvRON2 G G H G H G G H G Q G G Y G Q S G H G Q G G Y G H G G Y G Q N H P G S A N G A G T H P M H S N G R S S V P S L E Y I H G L R P V N A G D G Q G V Y G G N G - I N
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. . : . * . : * . . : * . * : . * . : . . . * . . . : : * . : . * . : : * * . . . : . . * * * : *
7 3 0 7 4 0 7 5 0 7 6 0 7 7 0 7 8 0 7 9 0 8 0 0
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PVX_117880-PvRON2 N P L V Y H V Q H G V N I P N S N S D K K A S D H T P D E D E D T Y G R T R N K R Y M H R N P G E K Y K G S N S P H D S - - - - N D D S G D T E Y E L N E G D V
PF14_0495-PfRON2 N G T E Y N V H Y G N S D S N N T N D S M L N E N Y Y S D S D Y D D H T P G N K K K V Y K S V A E R N K K S A S Q D S L G A G F S D S D S D S E Y E V V D G E N
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8 1 0 8 2 0 8 3 0 8 4 0 8 5 0 8 6 0 8 7 0 8 8 0
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PVX_117880-PvRON2 K R L T P K N K K G A T T E E V D T Y P Y G K K T N G S E F P R M N G S E T G H Y G Y N N T G S G G H N D E N G Y T P I I V K Y D N T H A K N R A N E I E E N L
PF14_0495-PfRON2 K K Y K K K N K E - - - N N E K D K Y E N N W D S N - - - - - - N - - - - - - - Y N S D N E I K D G Y L S E S - - - - - - - - - E R E Y A R N K A N E I E D K M
* : . * * * : . : * * . * . . : * * . : * . . * : . * . : . : * : * : * * * * * : : :
8 9 0 9 0 0 9 1 0 9 2 0 9 3 0 9 4 0 9 5 0 9 6 0
| | | | | | | |
PVX_117880-PvRON2 N K G E Y S R - I K M A K G K K G Q K S G G Y E S D G E D S D V D S S N V F Y V D N G Q D M L I K E K M S R S E G P D E M S E E G L N V K Y K A Q R G P V N - Y
PF14_0495-PfRON2 K K G E Y S R K Y K N S K S N E S G Y A S K Q T S D S D D S D I E A N - A F Y V D N G Q E M L I K E K E H Y S S D S E H H K E E S A S I G N L N V F F P A E N Y
: * * * * * * * : * . : : . : . * * . : * * * : : : . . * * * * * * * : * * * * * * * . . . : . . * * . . : * . : *
9 7 0 9 8 0 9 9 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 2 0 1 0 3 0 1 0 4 0
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1 0 5 0 1 0 6 0 1 0 7 0 1 0 8 0 1 0 9 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 2 0
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1 1 3 0 1 1 4 0 1 1 5 0 1 1 6 0 1 1 7 0 1 1 8 0 1 1 9 0 1 2 0 0
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1 2 1 0 1 2 2 0 1 2 3 0 1 2 4 0 1 2 5 0 1 2 6 0 1 2 7 0 1 2 8 0
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1 2 9 0 1 3 0 0 1 3 1 0 1 3 2 0 1 3 3 0 1 3 4 0 1 3 5 0 1 3 6 0
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1 3 7 0 1 3 8 0 1 3 9 0 1 4 0 0 1 4 1 0 1 4 2 0 1 4 3 0 1 4 4 0
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Figura 18. Comparación entre la secuencia de aminoácidos de PvRON2 (PVX_117880) de la cepa Sal-1 y PfRON2 (PF14_0495) de la cepa 3D7. Los residuos en negro indican 100% de identidad, los residuos en gris oscuro indican similitud fuerte y los residuos en gris claro son residuos con baja similitud. La línea roja muestra la región conservada entre estas dos especies.
Cuando la secuencia de aminoácidos de PfRON2 se utilizó como plantilla para la evaluación
de genes ortólogos, mediante la herramienta Blastp, sobre los genomas parciales de algunas
especies de Plasmodium, se encontró que ron2 está presente en P. knowlesi (PkRON2:
PKH_125430), P. chabaudi (PcRON2: PCAS_131900), P. berghei (PBANKA_131570) y P.
yoelii (Py06813). En general, los genes ron2 codificados en las distintas especies se
localizaron en regiones cromosómicas similares, como lo demuestran los altos valores de
similitud (35%-88%) y de identidad (16%-75%) a nivel de aminoácidos, y la elevada
conservación de los patrones intrón-exón y orientación de los ORFs. Los genes de P. yoelii
corriente abajo del gen PyRON2 (Figura 19) se excluyeron del análisis, debido a que no ha
sido completamente ensamblada esta región, en el genoma de esta especie.
1 4 5 0 1 4 6 0 1 4 7 0 1 4 8 0 1 4 9 0 1 5 0 0 1 5 1 0 1 5 2 0
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1 5 3 0 1 5 4 0 1 5 5 0 1 5 6 0 1 5 7 0 1 5 8 0 1 5 9 0 1 6 0 0
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1 6 1 0 1 6 2 0 1 6 3 0 1 6 4 0 1 6 5 0 1 6 6 0 1 6 7 0 1 6 8 0
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1 6 9 0 1 7 0 0 1 7 1 0 1 7 2 0 1 7 3 0 1 7 4 0 1 7 5 0 1 7 6 0
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1 7 7 0 1 7 8 0 1 7 9 0 1 8 0 0 1 8 1 0 1 8 2 0 1 8 3 0 1 8 4 0
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1 8 5 0 1 8 6 0 1 8 7 0 1 8 8 0 1 8 9 0 1 9 0 0 1 9 1 0 1 9 2 0
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1 9 3 0 1 9 4 0 1 9 5 0 1 9 6 0 1 9 7 0 1 9 8 0 1 9 9 0 2 0 0 0
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2 0 1 0 2 0 2 0 2 0 3 0 2 0 4 0 2 0 5 0 2 0 6 0 2 0 7 0 2 0 8 0
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PF14_0495-PfRON2 K I I F S Q M Q L P Y L S Q M F Y M Q A P Y F G H F I G K W Q K K R Q Q S R L K E I M S F M T L G S L S A Y T L F S A M D I T Q Q A K D I G A G P V A S C F T T
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2 0 9 0 2 1 0 0 2 1 1 0 2 1 2 0 2 1 3 0 2 1 4 0 2 1 5 0 2 1 6 0
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2 1 7 0 2 1 8 0 2 1 9 0 2 2 0 0 2 2 1 0 2 2 2 0
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PF14_0495-PfRON2 L S L K G I S K L R G I F K R K K A M K K K I I E N A T R K M N D M K N N P E K A K A H K M A L K K I N N Y S K G S Y H Y I S Y A K I R I
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Se encontraron valores de identidad (80.7%) y similitud (88.0%) para RON2 entre P. vivax y
P. knowlesi (Figura 19) mucho más altos a los obtenidos con P. falciparum y las otras
especies de Plasmodium que infectan roedores, lo que está de acuerdo con la estrecha
relación filogenética entre P. vivax y P. knowlesi, un parásito que infecta a monos (Macaca
fascicularis) [170].
Figura 19. Análisis de sintenia de la región cromosómica que contiene a RON2. Representación esquemática de la localización cromosómica de ron2 (en gris) y los marcos abiertos de lectura (ORFs) corriente arriba y abajo de ron2 (en blanco) de P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. chabaudi, P. berghei y P. yoelii. Se muestra debajo de cada ORF los números de acceso en PlasmoDB [157]. A la derecha, se muestra la longitud de cada fragmento cromosómico representado y su localización dentro del genoma de cada especie de Plasmodium. Se muestran los valores de identidad y similitud entre P. falciparum y P. vivax, y entre P. vivax y P. knowlesi.
4.2 Amplificación de pvron2 en la cepa VCG-1 de P. vivax
Para la amplificación del gen pvron2 de P. vivax de la cepa VCG-1 a partir de ADNg y ADNc
se utilizaron tres sets de cebadores. Se obtuvieron tres productos de amplificación tanto de
ADNg como de ADNc de ~2,176pb (región I), ~2,580pb (región II) y 2,061pb (región III)
(Figura 20) que muestran la misma longitud en pares de bases para el ADNg y el ADNc,
sugiriendo que el gen pvron2 consiste en un solo exón y que se transcribe en esquizontes de
P. vivax de la cepa VCG-1 (Figura 20 a y b). Este resultado está de acuerdo con los
52
resultados obtenidos en los análisis del transcriptoma de P. vivax, que muestran que pvron2
se transcribe entre las 35 (TP7) y 40 (TP8) horas del ciclo intraeritrocítico, similar a lo
reportado para otras proteínas involucradas en la invasión como PvMSP-1 [132]. Resultados
del análisis del transcriptoma de P. falciparum revelan que PfRON2 empieza su transcripción
después de las 35 horas y alcanza su pico máximo de expresión a las 45 horas dentro del
ciclo eritrocítico [133]. Como control positivo de amplificación, se utilizó el gen PvAMA-1 que
se transcribe en esquizontes tardíos de P. vivax (Figura 20).
Figura 20. Amplificación del gen pvron2 a partir de ADN genómico (a) y ADNc obtenido mediante RT-PCR (b) con tres sets de cebadores como se describió en materiales y métodos. R-I: Región I (~2,176pb). R-II: Región II (~2,580pb). R-III: Región III (~2,061pb). PM: Patrón de Peso Molecular. C+: Control positivo, amplificación del ectodominio de PvAMA-1 (~1,335pb). C-: Control negativo.
Adicionalmente, se amplificaron dos fragmentos de ~1,078pb y de ~2,084pb que comprende
alrededor de 30pb corriente arriba y abajo del gen pvron2, respectivamente (Figura 21). Estas
regiones se amplificaron con el objetivo de obtener la secuencia completa del gen pvron2 con
el codón de inicio (para el fragmento de 1,078pb) y el codón de parada (para el fragmento
~2,084pb).
53
Figura 21. Amplificación por PCR de dos fragmentos de pvron2. (a) Se muestra una banda de ~1,078pb que corresponden a 24pb corriente arriba del gen pvron2 y las primeras 1,054pb del gen (línea 1). (b) Se muestra una banda de ~2,084 que corresponde a 2,052pb del gen pvron2 y las primeras 32pb corriente debajo de éste.
4.3 Evaluación de las colonias por PCR y restricción enzimática.
Los productos de PCR obtenidos de cada una de las regiones (RI, RII y RIII) de PvRON2 se
clonaron en el vector pEXP5-CT-TOPO y posteriormente se transformaron bacterias
químicamente competentes. Para evaluar la correcta orientación e integración del inserto, se
picaron alrededor de 15 colonias para cada región, que crecieron en agar LB suplementado
con ampicilina. Posteriormente, se sometieron a PCR con cebadores específicos y a
restricción enzimática.
En la figura 22 se muestran los resultados de la PCR de seis colonias de la región II y cinco
de la región III. Para la región II se esperaba un producto de aproximadamente 2,664pb, de
las cuales las primeras 81pb hacen parte de la secuencia del vector y las restantes son del
inserto (Figura 22). En la región III, se esperaba un producto de aproximadamente 2,145pb,
de las cuales 2,064pb hacen parte del inserto.
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Figura 22. PCR de las colonias puntiformes aisladas de agar LB suplementado con ampicilina (gen de selección). En la parte de arriba, se muestra un esquema del plásmido con el inserto, la ubicación de cada uno de los cebadores utilizados para la amplificación por PCR y el tamaño del producto esperado. En la parte de abajo, se muestran los productos de PCR obtenidos para cada colonia de la Región II ó III corridos en geles de agarosa al 1%.
Para la región I se obtuvo un producto de alrededor de 2,257pb en diez de las quince
colonias evaluadas (datos no mostrados). Posteriormente, se extrajo ADN plasmídico de las
colonias que amplificaron por PCR los productos de peso molecular esperado y se trataron
con enzimas de restricción, como se describió en los materiales y métodos. Como se muestra
en la Figura 23, las enzimas de restricción que se seleccionaron tienen cortes específicos
dentro del inserto y dentro de la secuencia del vector, para verificar la correcta orientación del
inserto. Para la región II, se encontró que los seis ADN plasmídicos evaluados presentaron
las bandas de peso molecular esperado (529pb, 1,005pb y 3,734pb), mientras que para la
región III se encontraron dos fragmentos de 3,753pb y 996pb generados por la enzima HincII
(Figura 23). La enzima HincII también se utilizó para el corte de la región I, que tiene un sitio
de corte entre las pares de bases 680-686 de la región I y otro sitio de corte en el inserto, con
dos productos esperados de ~2,097pb y ~2,766pb (datos no mostrados).
55
Figura 23. Análisis de restricción enzimática de plásmidos que contienen la región II (a) ó III (b) de pvron2. Se extrajo ADN plasmídico utilizando el método de lisis alcalina y posteriormente se trataron con enzimas de restricción (a la derecha) que tienen secuencias de corte específicas sobre la secuencia del constructo. XbaI (TCT/AGA) y HincII (GTY/RAC). Los productos se visualizaron en geles de agarosa al 1%.
4.4 Secuenciación de PvRON2 en la cepa VCG-1 de P. vivax
Las secuencias de los clones recombinantes y de los productos de PCR, junto con sus
respectivos electroferogramas, se analizaron con el programa CLC DNA Workbench (CLC
bio). Cuando las secuencias del gen pvron2 obtenidas a partir de ADNg y ADNc se
compararon, se encontró que las dos secuencias eran idénticas y de igual longitud,
confirmando que este gen consiste en un solo exón de 6,615pb que codifica una proteína de
2,204 residuos. Al comparar la secuencia de nucleótidos obtenida para VCG-1 con la cepa de
referencia Sal-1 de P. vivax depositada en la base de datos de PlasmoDB, se encontraron
dos substituciones no-sinónimas y la inserción de una tripleta (codón) (Tabla 3 y Figura 24).
Las substituciones en la posición 1,241 y 1,814 generaron un cambio de valina por glicina
(V414G) y de histidina por prolina (H605P), respectivamente, mientras que la adición de un
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ácido glutámico (E) se encontró entre la posición 1,487-1,489 (residuo 496). La secuencia
consenso se depositó en el GenBank con el ID: HQ82532. De manera interesante, los
polimorfismos encontrados se localizaron en una región variable interespecies (Anexo 2),
localizada aproximadamente entre los residuos 50 a 850 [17], lo que sugiere que esta región
podría estar sujeta a presión selectiva inmune.
Tabla 3 Resumen de los polimorfismo encontrados para PvRON2 entre las cepas Sal-1 y
VCG-1
Posición
Nucleótido
Posición
Aminoácido
Cepa de parásito
Sal-1 VCG-1
1,241 414 Val Gly
1,814 605 His Pro
1,487-1,489 496 - Glu (AAG)
57
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0
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Sal-1:PvRON2 M L K I I F L I L L I F A R I D S I S T R E A K G S V R D G K Q Y V K T K S P T Y T P Q K K T K V I F Y M P G Q E Q E E
VCG-1: PvRON2 M L K I I F L I L L I F A R I D S I S T R E A K G S V R D G K Q Y V K T K S P T Y T P Q K K T K V I F Y M P G Q E Q E E
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7 0 8 0 9 0 1 0 0 1 1 0 1 2 0
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Sal-1:PvRON2 E E D D N D P N G S K K N G K S D T G A N K G T H M G S K T D A G N S P S G L N K G S G V G S G S R P A S N N Y K G N A
VCG-1: PvRON2 E E D D N D P N G S K K N G K S D T G A N K G T H M G S K T D A G N S P S G L N K G S G V G S G S R P A S N N Y K G N A
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0
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Sal-1:PvRON2 G G G I N I D M S P H G D N S N K G Q Q G N A G L N K N Q E D T L R D E Y E K I R K Q E E E E E E R I N N Q R R A D M K
VCG-1: PvRON2 G G G I N I D M S P H G D N S N K G Q Q G N A G L N K N Q E D T L R D E Y E K I R K Q E E E E E E R I N N Q R R A D M K
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1 9 0 2 0 0 2 1 0 2 2 0 2 3 0 2 4 0
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Sal-1:PvRON2 R A Q R G K N K F G D D K G V Q D S L P H T K Y E L S N P Q A G P T N P N A K N R G T G V Y D E F G N G P Y N L V G K Q
VCG-1: PvRON2 R A Q R G K N K F G D D K G V Q D S L P H T K Y E L S N P Q A G P T N P N A K N R G T G V Y D E F G N G P Y N L V G K Q
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
2 5 0 2 6 0 2 7 0 2 8 0 2 9 0 3 0 0
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Sal-1:PvRON2 S G G L T P T A P P Y E H Y G E H G A E G K G Y G P Y G G A E G K G Y G P Y G G S D G K G Y G T Y G G A D G K G Y G P Y
VCG-1: PvRON2 S G G L T P T A P P Y E H Y G E H G A E G K G Y G P Y G G A E G K G Y G P Y G G S D G K G Y G T Y G G A D G K G Y G P Y
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
3 1 0 3 2 0 3 3 0 3 4 0 3 5 0 3 6 0
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Sal-1:PvRON2 G G S D G K G Y G P Y G G S D G K G Y G P Y G G S D G K G Y G P Y G G A D R K G Y G P D G T A G S A Y H G G Y D D G T N
VCG-1: PvRON2 G G S D G K G Y G P Y G G S D G K G Y G P Y G G S D G K G Y G P Y G G A D R K G Y G P D G T A G S A Y H G G Y D D G T N
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
3 7 0 3 8 0 3 9 0 4 0 0 4 1 0 4 2 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 P T Y R S H L N V N L R D G K G D H D G K N G M E G Y P N Y F K K H F R P G D A K G A G T D G N E S G T Y V V A P G E G
VCG-1: PvRON2 P T Y R S H L N V N L R D G K G D H D G K N G M E G Y P N Y F K K H F R P G D A K G A G T D G N E S G T Y G V A P G E G
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
4 3 0 4 4 0 4 5 0 4 6 0 4 7 0 4 8 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 G Y G K N K G T G A D G Q N G T E A G G Q N G S G T D A Q N G S G P H G H S G V G P T T Y G V D F G K S G G G R G N G G
VCG-1: PvRON2 G Y G K N K G T G A D G Q N G T E A G G Q N G S G T D A Q N G S G P H G H S G V G P T T Y G V D F G K S G G G R G N G G
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
4 9 0 5 0 0 5 1 0 5 2 0 5 3 0 5 4 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 G P G E E G E N K T N P S Y D - G G Y E K N S G P E K H G E N G T P Y Y V E H P D E N D G S G T T T Y G L D H G K N G G
VCG-1: PvRON2 G P G E E G E N K T N P S Y D E G G Y E K N S G P E K H G E N G T P Y Y V E H P D E N D G S G T T T Y G L D H G K N G G
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
5 5 0 5 6 0 5 7 0 5 8 0 5 9 0 6 0 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 T Q G G H G Q D G L G E G G H G Q D G H G Q G G Y G Q G G Y G K G G H G E G G Y G N G G H G E G G Y G N G G H G E G G Y
VCG-1: PvRON2 T Q G G H G Q D G L G E G G H G Q D G H G Q G G Y G Q G G Y G K G G H G E G G Y G N G G H G E G G Y G N G G H G E G G Y
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
6 1 0 6 2 0 6 3 0 6 4 0 6 5 0 6 6 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 G N G G H G E G G Y G N G G H G E G G Y G Q G G H G H G G H G Q G G Y G Q S G H G Q G G Y G H G G Y G Q N H P G S A N G
VCG-1: PvRON2 G N G G P G E G G Y G N G G H G E G G Y G Q G G H G H G G H G Q G G Y G Q S G H G Q G G Y G H G G Y G Q N H P G S A N G
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
6 7 0 6 8 0 6 9 0 7 0 0 7 1 0 7 2 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 A G T H P M H S N G R S S V P S L E Y I H G L R P V N A G D G Q G V Y G G N G I N N P L V Y H V Q H G V N I P N S N S D
VCG-1: PvRON2 A G T H P M H S N G R S S V P S L E Y I H G L R P V N A G D G Q G V Y G G N G I N N P L V Y H V Q H G V N I P N S N S D
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
7 3 0 7 4 0 7 5 0 7 6 0 7 7 0 7 8 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 K K A S D H T P D E D E D T Y G R T R N K R Y M H R N P G E K Y K G S N S P H D S N D D S G D T E Y E L N E G D V K R L
VCG-1: PvRON2 K K A S D H T P D E D E D T Y G R T R N K R Y M H R N P G E K Y K G S N S P H D S N D D S G D T E Y E L N E G D V K R L
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
7 9 0 8 0 0 8 1 0 8 2 0 8 3 0 8 4 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 T P K N K K G A T T E E V D T Y P Y G K K T N G S E F P R M N G S E T G H Y G Y N N T G S G G H N D E N G Y T P I I V K
VCG-1: PvRON2 T P K N K K G A T T E E V D T Y P Y G K K T N G S E F P R M N G S E T G H Y G Y N N T G S G G H N D E N G Y T P I I V K
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
8 5 0 8 6 0 8 7 0 8 8 0 8 9 0 9 0 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 Y D N T H A K N R A N E I E E N L N K G E Y S R I K M A K G K K G Q K S G G Y E S D G E D S D V D S S N V F Y V D N G Q
VCG-1: PvRON2 Y D N T H A K N R A N E I E E N L N K G E Y S R I K M A K G K K G Q K S G G Y E S D G E D S D V D S S N V F Y V D N G Q
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
9 1 0 9 2 0 9 3 0 9 4 0 9 5 0 9 6 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 D M L I K E K M S R S E G P D E M S E E G L N V K Y K A Q R G P V N Y H F S N Y M N L D K R N T L S S N E I E L Q K M I
VCG-1: PvRON2 D M L I K E K M S R S E G P D E M S E E G L N V K Y K A Q R G P V N Y H F S N Y M N L D K R N T L S S N E I E L Q K M I
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
58
9 7 0 9 8 0 9 9 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 2 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 G P K F S E E V N K Y C R L N E P S S K K G E F L N V S F E Y S R A L E E L R S E M I N E L Q K R K A V G S N Y Y N N I
VCG-1: PvRON2 G P K F S E E V N K Y C R L N E P S S K K G E F L N V S F E Y S R A L E E L R S E M I N E L Q K R K A V G S N Y Y N N I
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 0 3 0 1 0 4 0 1 0 5 0 1 0 6 0 1 0 7 0 1 0 8 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 L N A I Y T S M N R K N A N F G R D A Y E D K S F I S E A N S F R N E E M Q P L S A K Y N K I L R Q Y L C H V F V G N P
VCG-1: PvRON2 L N A I Y T S M N R K N A N F G R D A Y E D K S F I S E A N S F R N E E M Q P L S A K Y N K I L R Q Y L C H V F V G N P
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 0 9 0 1 1 0 0 1 1 1 0 1 1 2 0 1 1 3 0 1 1 4 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 G V N Q L E R L Y F H N L A L G E L I E P I R R K Y N K L A S S S V G L N Y E I Y I A S S S N I Y L M G H L L M L S L A
VCG-1: PvRON2 G V N Q L E R L Y F H N L A L G E L I E P I R R K Y N K L A S S S V G L N Y E I Y I A S S S N I Y L M G H L L M L S L A
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 1 5 0 1 1 6 0 1 1 7 0 1 1 8 0 1 1 9 0 1 2 0 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 Y L S Y N S Y F V Q G L K P F Y S L E T M L M A N S D Y S F F M Y N E V C N V Y Y H P K G T F N K D I T F I P I E S R P
VCG-1: PvRON2 Y L S Y N S Y F V Q G L K P F Y S L E T M L M A N S D Y S F F M Y N E V C N V Y Y H P K G T F N K D I T F I P I E S R P
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 2 1 0 1 2 2 0 1 2 3 0 1 2 4 0 1 2 5 0 1 2 6 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 G R H S T Y V G E R K V T C D L L E L I L N A Y T L I N V H E I Q K V F N T S E A Y G Y E N S I S F G H N A V R I F S Q
VCG-1: PvRON2 G R H S T Y V G E R K V T C D L L E L I L N A Y T L I N V H E I Q K V F N T S E A Y G Y E N S I S F G H N A V R I F S Q
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 2 7 0 1 2 8 0 1 2 9 0 1 3 0 0 1 3 1 0 1 3 2 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 V C P R D D A K N T F G C D F E K S T L Y N S K V L K M D E G D K E N Q R S L K R A F D M L R T F A E I E S T S H L G D
VCG-1: PvRON2 V C P R D D A K N T F G C D F E K S T L Y N S K V L K M D E G D K E N Q R S L K R A F D M L R T F A E I E S T S H L G D
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 3 3 0 1 3 4 0 1 3 5 0 1 3 6 0 1 3 7 0 1 3 8 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 P S P N Y I S L I F E Q N L Y T D F Y K Y L F W Y D N R E L I N V Q I R N A G R R K K G K K V K F V Y D E F V K R G K Q
VCG-1: PvRON2 P S P N Y I S L I F E Q N L Y T D F Y K Y L F W Y D N R E L I N V Q I R N A G R R K K G K K V K F V Y D E F V K R G K Q
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 3 9 0 1 4 0 0 1 4 1 0 1 4 2 0 1 4 3 0 1 4 4 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 L K D K L I K I D A K Y N A R S K A L L V F Y A L V D K Y A N I F R K S E N V R K F F L N D V S S I R H H L Y L N S V L
VCG-1: PvRON2 L K D K L I K I D A K Y N A R S K A L L V F Y A L V D K Y A N I F R K S E N V R K F F L N D V S S I R H H L Y L N S V L
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 4 5 0 1 4 6 0 1 4 7 0 1 4 8 0 1 4 9 0 1 5 0 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 T K S P K S N L D S M K K T L E E L Q S L T N A P L K F I V R G N N L K F L N N V A K F E N L F Y V N L F I M S S L S R
VCG-1: PvRON2 T K S P K S N L D S M K K T L E E L Q S L T N A P L K F I V R G N N L K F L N N V A K F E N L F Y V N L F I M S S L S R
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 5 1 0 1 5 2 0 1 5 3 0 1 5 4 0 1 5 5 0 1 5 6 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 K D P V K S Y Y S E K K K M L T A T R A E K F A T S T S A L I P H K L R K L V V T M K K G L L K K K L L T A L A K M K L
VCG-1: PvRON2 K D P V K S Y Y S E K K K M L T A T R A E K F A T S T S A L I P H K L R K L V V T M K K G L L K K K L L T A L A K M K L
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 5 7 0 1 5 8 0 1 5 9 0 1 6 0 0 1 6 1 0 1 6 2 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 L Q H I P A N L L E N I L T T I R F T T H T I A T R E I I Q N A K Y M P K N L T F Y Q N R N V E L A K Q V F A D G G F A
VCG-1: PvRON2 L Q H I P A N L L E N I L T T I R F T T H T I A T R E I I Q N A K Y M P K N L T F Y Q N R N V E L A K Q V F A D G G F A
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 6 3 0 1 6 4 0 1 6 5 0 1 6 6 0 1 6 7 0 1 6 8 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 K Y A D N L M S T W F T K G F E E F K R E K I E K Q K M E Y S I E K E L K E A S N N D I S A S E E I T E Q E K L Q Q E Q
VCG-1: PvRON2 K Y A D N L M S T W F T K G F E E F K R E K I E K Q K M E Y S I E K E L K E A S N N D I S A S E E I T E Q E K L Q Q E Q
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 6 9 0 1 7 0 0 1 7 1 0 1 7 2 0 1 7 3 0 1 7 4 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 N E L N E E K E R Q R Q E N K L I F N Q N D K W D Q Y I N K E F A K A L G I W L E L S D N A Y N K D S F I Y R V V E D S
VCG-1: PvRON2 N E L N E E K E R Q R Q E N K L I F N Q N D K W D Q Y I N K E F A K A L G I W L E L S D N A Y N K D S F I Y R V V E D S
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 7 5 0 1 7 6 0 1 7 7 0 1 7 8 0 1 7 9 0 1 8 0 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 K Y L L E S N I E D N I M F S R T V K P T K Q T A F R K F F K K I I S L G N M L L R K P S F K V E H A I W F G A T I N M
VCG-1: PvRON2 K Y L L E S N I E D N I M F S R T V K P T K Q T A F R K F F K K I I S L G N M L L R K P S F K V E H A I W F G A T I N M
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
1 8 1 0 1 8 2 0 1 8 3 0 1 8 4 0 1 8 5 0 1 8 6 0
| | | | | |
Sal-1:PvRON2 K K A M M L L E K V A E L H K L L R N E D E S W L I N E A F I E I V D H V V L I S S E K R L R E P F S V A R N P G M V A
VCG-1: PvRON2 K K A M M L L E K V A E L H K L L R N E D E S W L I N E A F I E I V D H V V L I S S E K R L R E P F S V A R N P G M V A
* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *
59
Figura 24. Comparación entre la secuencia PvRON2 de la cepa de referencia Sal-1 (2,203 residuos) y la cepa VCG-1 (2,204 residuos). La secuencia consenso de la cepa VCG-1 se obtuvo de la secuencia del gen a partir de ADNg y ADNc. En el recuadro negro, se indican las dos substituciones y la inserción de un ácido glutámico (E).
4.5 Análisis bioinformático de la secuencia de PvRON2
4.5.1 Identificación de péptido señal
La secuencia completa de la proteína PvRON2 se utilizó para determinar las características
más importantes a través del uso de diferentes herramientas bioinformáticas. Se utilizó la
herramienta SignalP para predecir la presencia de péptido señal (PS) basada en la
combinación de redes neuronales artificiales y modelos ocultos de Markov [160]. Mediante
redes neuronales, se determinan cuatro parámetros, S que predice la longitud y los
aminoácidos que pertenecen al PS, C que predice la probabilidad del primer aminoácido que
formará la proteína madura (posición del sitio de corte), Y es la media geométrica de S y la
pendiente de C, que da una mayor valoración del posible sitio de clivaje del PS y, finalmente,
D que es el promedio del puntaje más alto de Y y la media del puntaje de S (calculado desde
la posición N-terminal a la posición más alta del puntaje de Y), que permite una mayor
discriminación entre los que no son PS y los que sí [160, 171]. Con este modelo, se encontró
1 8 7 0 1 8 8 0 1 8 9 0 1 9 0 0 1 9 1 0 1 9 2 0
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1 9 3 0 1 9 4 0 1 9 5 0 1 9 6 0 1 9 7 0 1 9 8 0
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1 9 9 0 2 0 0 0 2 0 1 0 2 0 2 0 2 0 3 0 2 0 4 0
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2 0 5 0 2 0 6 0 2 0 7 0 2 0 8 0 2 0 9 0 2 1 0 0
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2 1 1 0 2 1 2 0 2 1 3 0 2 1 4 0 2 1 5 0 2 1 6 0
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VCG-1: PvRON2 M A G L A V W N V L K S E F K V L Q R V D M A L K S V F K N M W R K F L S I K G I R K L K Y I F K R R K T M K K K I I E
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2 1 7 0 2 1 8 0 2 1 9 0 2 2 0 0
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60
para PvRON2 un PS de 17 aminoácidos que presenta un corte por una peptidasa entre los
aminoácidos S17 e I18 (IDS-IS) (Figura 25).
Figura 25. Identificación del péptido señal en la secuencia de aminoácidos de PvRON2. (a) Gráfica obtenida utilizando redes neuronales. Se muestran los puntajes C, S, Y y D. El sitio de clivaje es predicho en el puntaje más alto de Y. (b). Gráfica obtenida utilizando modelos ocultos de Markov. Se muestran las probabilidades para las regiones n, h, c y sitio de clivaje.
Los modelos ocultos de Markov determinan los PS basándose en las zonas que los
componen, es decir, determina la región n (N-terminal) que contiene residuos cargados
positivamente, la región h (hidrofóbica), compuesta de mínimo seis residuos hidrofóbicos, y
la región c (C-terminal), que contiene residuos polares no cargados donde los últimos tres
aminoácidos son consenso para el reconocimiento por una peptidasa. La peptidasa tipo I
reconoce un sitio de hidrólisis donde los aminoácidos más frecuentes en la posición -1 en
eucariotas son: alanina (A), cisteína (C), glicina (G), leucina (L), prolina (P), glutamina (Q),
serina (S) and treonina (T) [172]. En la secuencia de PvRON2, se identificaron las tres
regiones características de un péptido señal, con un sitio de corte por una peptidasa entre los
a)
b)
61
residuos 17 y 18, similar a lo encontrado mediante la predicción por redes neuronales. En
PvRON2, el sitio de reconocimiento de la peptidasa se localiza en los residuos IDS, donde el
aminoácido -1 es una serina, lo que coincide con los aminoácidos descritos arriba. La
presencia del PS en la secuencia de PvRON2 sugiere que la proteína es translocada a través
de la membrana del retículo endoplasmático, transportada por el aparato de golgi y exportada
por vesículas secretorias a su destino final: organelos o membrana celular.
Se ha demostrado que las proteínas de las roptrías contienen un PS hacia el amino-terminal
que les permite el paso a través del retículo endoplasmático y el aparato de golgi [173, 174],
pero no se conocen las señales blanco específicas que direccionan las proteínas dentro de
vesículas destinadas a las roptrias. En células de mamíferos, el destino de las proteínas
transmembranales es mediado por un complejo adaptador citoplasmático (AP) que reconoce
motivos específicos dentro de las colas citoplasmáticas de las proteínas [175]. En T. gondii, el
complejo adaptador citoplasmático AP-1 y AP-2 ha sido implicado en el tráfico de las
proteínas a las roptrias. Estudios in vitro mostraron que AP-2 se une a una región de la
proteína ROP2 (localizada en el bulbo de las roptrias de T. gondii) y media su tráfico hacia las
roptrias [176].
De manera interesante, en P. falciparum se ha mostrado que la proteína RAP-1 contiene
distintas señales para su localización en los subcompartimentos de las roptrias y su posterior
transferencia a la VP después de la invasión. A través de los residuos 23-55, RAP-1
interactúa con RAMA y es transportada a las roptrias, mientras que los residuos 344-444 son
necesarios para la retención de RAP-1 en el bulbo de las roptrias para su posterior
transferencia a la VP [177]. Sin embargo, cuando se comparan estas señales con secuencias
blanco de proteínas de T. gondii necesarias para el tráfico a las roptrias, así como con
secuencias de P. falciparum, no se identifican motivos conservados entre ellas, sugiriendo
que hay señales de tráfico a las roptrias específicas para cada proteína [177].
62
4.5.2 Identificación de dominios de anclaje
Los dominios transmembranales se identificaron con el programa TMHMM, que predice con
alto grado de precisión las hélices transmembranales y discrimina entre proteínas solubles y
de membrana, basándose en modelos ocultos de Markov [161]. Para PvRON2, se encontró
un dominio transmembranal entre los residuos 2,087 y 2,109 compuesto de 22 residuos en su
mayoría de A, L, P y V. Se encontró una alta probabilidad de que los residuos 1 a 2,086 se
localicen hacia el exterior de la célula y los residuos 2,110 a 2,203 se localicen hacia el
citoplasma (Figura 26), indicando que PvRON2 tiene la orientación de una proteína de
membrana integral tipo I.
Figura 26. Identificación de dominios transmembranales en la secuencia de aminoácidos de PvRON2. Se muestra las probabilidades para las regiones transmembranales, residuos localizados hacia el citoplasma y los residuos localizados hacia el exterior. La presencia de los dominios transmembranales se evalúo con el programa TMHMM.
4.5.3 Identificación de otras características importantes en la secuencia de PvRON2
Otras características de la proteína como dominios, motivos y regiones de baja complejidad,
entre otras, se determinaron con el servidor GlobPlot y SMART. GlobPlot utiliza una
aproximación basada en la suma continúa de la tendencia (propensión) de los aminoácidos
para estar en un estado ordenado o desordenado [163], mientras que SMART consiste en
63
una librería de modelos ocultos de Markov [162]. Estas dos herramientas coinciden con la
presencia de un dominio transmembranal previamente identificado con el programa TMHMM
y de dos motivos α-helicales coiled coil (residuos 145-184 y 1,651-1,703) (Figura 27). Estos
motivos se caracterizan por repeticiones de siete aminoácidos (abcdefg)n con residuos
hidrofóbicos localizados en las posiciones a y d y generalmente residuos polares en los sitios
restantes que han sido implicados en las interacciones proteína-proteína. Los coiled coils han
sido identificados en importantes candidatos a vacuna en P. falciparum como LSA-1, MSP-3,
MSP6, MSP11 [178, 179] y son reconocidos por anticuerpos adquiridos naturalmente u
obtenidos mediante su inoculación en ratones [180].
Figura 27. Identificación de motivos y dominios en la secuencia de aminoácidos de PvRON2. (a) representación de los resultados obtenidos con la herramienta GlobPlot. En el recuadro se indican cada uno de los motivos y dominios identificados, así como las regiones de baja complejidad. b) Resumen de los resultados obtenidos con la herramienta SMART.
Adicionalmente, se encontraron regiones de baja complejidad, características de la presencia
de repeticiones de aminoácidos. Mediante el método computacional XSTREAM, se
encontraron dos repeticiones en tándem (RT) localizadas dentro de la secuencia variable
inter-especies (Anexo 2). Ocho repeticiones de 11 aminoácidos de longitud
(GADGKGYGPYG) se localizaron entre los residuos 258 a 345 y 9 repeticiones de la
a) b)
64
secuencia GGYGNGGHGE se localizaron entre los residuos 542 a 628 constituyendo el
segundo tándem. Se encontró la presencia de RTs en otras secuencias de RON2 de distintas
especies de Plasmodium y a pesar de la baja identidad a nivel de nucleótidos y aminoácidos
entre las RTs de diferentes RON2, hay aproximadamente un 40% de similitud entre P. vivax y
P. knowlesi, lo que está de acuerdo con su estrecha relación filogenética.
Las RTs han sido identificadas en diferentes antígenos de malaria como la proteína CSP,
PfRESA y la proteína rica en histidinas asociada a los knob (KAHRP, del inglés Knob-
Associated Histidine Rich Protein). En el caso específico de malaria, las RTs pueden regular
la maduración de los isotipos y la producción de anticuerpos de alta afinidad, actuando como
super-antígenos de las células B, a través de la inducción de una respuesta policlonal
independiente de timo. La respuesta de anticuerpos independiente de timo es usualmente de
corta vida, compuesta predominantemente por anticuerpos de baja afinidad como la IgM e
IgG3, lo que permite sugerir que estas repeticiones podrían ser usadas durante la invasión
para distraer la respuesta inmune, actuando como “cortinas de humo” al enmascarar los
residuos críticos de los antígenos [181, 182]. Teniendo en cuenta todos los datos antes
mencionados, sería importante evaluar las implicaciones funcionales e inmunológicas de
estas repeticiones en PvRON2.
Análisis de las secuencias de aminoácidos de las otras proteínas RON2 en distintas especies
de Plasmodium, mostraron que todas presentan longitudes similares que van desde 1,990
aminoácidos para PcRON2 a 2,232 residuos para PyRON2. Todas contienen una
organización similar respecto a la presencia de PS, dominios transmembranales y RTs.
Además, alineamientos entre Pf, Pv, Pk, Pc y Py permitieron la identificación de una región
variable inter-especies hacia el extremo amino-terminal y la presencia de ocho cisteínas (C)
conservadas hacia el extremo carboxi-terminal, relacionadas probablemente con
características estructurales y funcionales de las proteínas RON2 (Anexo 2). Recientemente,
65
dos publicaciones muestran, a través de distintos experimentos de interacción proteína-
proteína, que la región que interactúa y sirve de puente entre AMA-1 y las otras proteínas del
complejo, se localiza en una región conservada hacia el extremo carboxi-terminal [23, 183].
Todas las características identificadas en la secuencia de PvRON2 como PS, dominios
transmembranales, motivos coiled coil y regiones con cisteínas conservadas (Figura 28), son
propiedades comunes en proteínas importantes de P. falciparum y P. vivax implicadas en el
proceso de invasión.
Figura 28. Representación esquemática de la proteína PvRON2. El péptido señal (PS) se muestra en azul, el dominio transmembranal (DT) en gris oscuro y los motivos α-helicales coiled coil en gris claro. Las líneas rojas punteadas indican las ocho cisteínas conservadas entre Pf, Pv, Pk, Pc, y Py. * representan sitios polimórficos entre la cepa de referencia Sal-1 y la cepa VCG-1. Se indica la localización y secuencia de los péptidos predichos por ser epitopes B lineales inoculados en conejos.
4.6 Expresión de PvRON2 en esquizontes de P. vivax de la cepa VCG-1
Para evaluar la expresión y localización celular de PvRON2 en esquizontes de P. vivax, se
generaron anticuerpos policlonales contra la proteína, inmunizando conejos con péptidos
poliméricos derivados de PvRON2. Una vez obtenidos los anticuerpos, se validó mediante
ELISA si estos reconocían específicamente los péptidos 35519 (inoculado en el conejo 90) y
35520 (inoculado en el conejo 89). Como se observa en la figura 29, después de la
inoculación de los péptidos, hay un aumento en la absorbancia hasta de cinco veces con
respecto al obtenido para los conejos sin inmunizar. Estos datos indican que hay una
producción de anticuerpos específica contra cada uno de los péptidos una vez son
inmunizados.
66
Figura 29. Evaluación de la producción de anticuerpos específicos contra péptidos de PvRON2. Los péptidos 35519 y 35520 se sembraron en las placas de ELISA y se incubaron con el suero pre-inmune y con los sueros obtenidos después de la inmunización (SII y SIII) de los conejos con los péptidos poliméricos derivados de la secuencia de PvRON2.
Para determinar si el transcrito de pvron2 detectado en esquizontes tardíos (Figura 20b) se
expresa como proteína en este mismo estadio, se realizó un Western blot utilizando los
anticuerpos anti-PvRON2. El peso molecular predicho para PvRON2 mediante el software
Gene Runner es de 242kDa incluyendo el PS y de 240kDa sin el PS. Los anticuerpos
policlonales generados contra el péptido 35519 ó 35520 detectaron específicamente dos
bandas de alrededor de ~220kDa y de ~185kDa con el suero hiperinmune, mientras que no
se detectó ninguna banda con el suero preinmune (Figura 30a). La presencia de estas dos
bandas sugiere que la proteína PvRON2 experimenta un procesamiento proteolítico, en
contraste con lo reportado para PfRON2 [17]. Esta diferencia en la masa molecular respecto
a la predicha, podría corresponder a migraciones electroforéticas anómalas, como ha sido
reportado para TgRON2 [21].
0,0
0,3
0,5
Pre-90 II-90 III-90 Pre-89 II-89 III-89
Péptido 35519 Péptido 35520
Ab
sorb
an
cia
(6
20
nm
)
67
Figura 30. Análisis de la expresión de PvRON2 en esquizontes de P. vivax. (a) Western blot que muestra el reconocimiento de dos bandas específicas por los anticuerpos anti-PvRON2. Línea 1: suero preinmune y línea 2: suero hiperinmune. (b) Inmunofluorescencia sobre esquizontes fijados y permeabilizados. En verde (FITC) se muestra el reconocimiento de PvRON2 (flechas blancas indica el patrón punteado) y en azul (DAPI) se muestra los núcleos del parásito.
En muchos casos, se ha encontrado que las proteínas de las roptrias son sintetizadas
inicialmente como pre-proteínas y maduran durante el proceso de transporte a las roptrias
[184]. Por lo tanto, el procesamiento sugerido para PvRON2, podría servir para activar la
proteína, exponiendo dominios funcionales que le permitan interactuar con la membrana de la
célula huésped o con las mismas proteínas del parásito, como se ha sugerido entre
PfAMA1/RON2 [23].
Análisis de “pull-chase” han mostrado que TgRON2 se expresa como una pro-proteína de
~150kDa que es procesada para producir una proteína madura de ~120kDa. Aunque no se
conoce específicamente que proteasas actúan en la maduración de TgRON2, se ha sugerido
que ésta proteína puede ser hidrolizada por TgSUB2 [124]. El proceso de invasión de todos
los Apicomplexa es acompañado por la ruptura específica de proteínas de superficie, roptrias
y micronemas como un mecanismo esencial para disolver el MJ durante la invasión [185]. La
inhibición de este proceso, mediante inhibidores de proteasas, es capaz de bloquear la
invasión de la célula huésped [186]. Estudios con importantes adhesinas de P. falciparum
68
tales como AMA-1, la familia de proteínas MSP, la familia DBL, Rhs y la proteína TRAP han
identificado sitios de corte putativos para las proteasas romboide dentro de los dominios
transmembranales y sitios de corte para la SUB2 [187, 188].
Ensayos utilizando el sistema de células COS-7 han revelado que la substitución del residuo
A1427 en la proteína EBA-175 previene el corte mediado por la proteasa PfROM4,
impidiendo la liberación de EBA-175 de la membrana del parásito [189]. De forma similar, la
substitución del motivo GA (residuos que desestabilizan las α-hélices) cercano al extremo
extracelular del dominio transmembranal (predicho por ser el sitio requerido para el
reconocimiento de la proteasa) elimina el corte específico de la proteasa [189]. Cuando se
buscaron secuencias de reconocimiento por proteasas en la proteína PvRON2, se encontró
que entre los residuos 2,101AGLA2,104 hay un sitio de corte putativo para una proteasa
romboide. Esto estaría de acuerdo con el reconocimiento de dos bandas por el anticuerpo
anti-PvRON2, sin embargo, se requiere de estudios adicionales para evaluar la importancia
del procesamiento, así como la identidad de la proteasa responsable.
4.7 Localización celular de PvRON2 en esquizontes de P. vivax
Análisis de inmunofluorescencia sobre esquizontes de P. vivax muestran que los anticuerpos
anti-PvRON2 reconocen un patrón punteado típico de organelos apicales, como las roptrias y
micronemas (Figura 30b). Para examinar en detalle la localización celular de PvRON2, se
utilizaron anticuerpos policlonales contra PvAMA-1 y PvRhopH3 producidos en ratón. En la
figura 31, se observa que no hay una colocalización entre la proteína PvAMA-1 (marcador de
micronemas) y PvRON2, sugiriendo que PvRON2 no está presente en este organelo. En
contraste, hay una pequeña área de localización central entre la proteína PvRhopH3 y
PvRON2 que muestra la localización de las dos proteínas en las roptrias, aunque en
compartimentos distintos, indicando que PvRON2 se encuentra localizada en el cuello de las
69
roptrias, como se ha descrito para PfRON2 y TgRON2 [17, 124]. Por lo tanto, la presencia,
transcripción y expresión de la proteína RON2 en las roptrias de esquizontes de P. vivax
sugiere un papel similar al reportado para la proteína RON2 en P. falciparum que involucraría
un mecanismo de invasión conservado entre estas dos especies de Plasmodium.
Figura 31. Localización celular de la proteína PvRON2. Estudios de colocalización: los esquizontes se incubaron simultáneamente con anti-PvRON2 y anti-PvAMA-1 (arriba) ó anti-PvRhopH3 (abajo) y se detectó con anti-conejo marcado con FITC y anti-ratón marcado con rodamina. Las flechas indican un típico patrón punteado característico de organelos apicales. En azul se muestran los núcleos teñidos con DAPI.
Recientemente, un estudio mostró que la proteína RON2 de P. berghei se localiza en las
roptrias de merozoitos y esporozoitos con un tiempo de expresión comparable al encontrado
para RAP2/3. Estos datos indican fuertemente un rol esencial de la proteína RON2 durante la
invasión y establecimiento de la infección en merozoitos y probablemente en esporozoitos
[190].
70
La identificación y caracterización funcional de las proteínas que participan en el proceso de
invasión son paso críticos en el momento de desarrollar una vacuna completamente efectiva
contra la malaria. En P. falciparum se han reportado cerca de 58 proteínas que participan en
la invasión eritrocítica [133] y una parte de éstas han sido utilizadas como componentes en
una vacuna contra la malaria. Sin embargo, gran parte del fracaso de muchas de las
formulaciones, se debe en parte a que el parásito presenta variación en muchos de sus
antígenos entre distintas cepas, y a la vez es capaz de alternar la expresión de sus proteínas
dependiendo de los ligandos y/o receptores disponibles durante la invasión dem su célula
blanco.
En la FIDIC se ha desarrollado una metodología lógica y racional para el diseño de una
vacuna contra la malaria, orientada hacia la identificación de las subunidades mínimas de las
proteínas relevantes en el ciclo de invasión en las distintas fases del parásito [191]. Estas
subunidades se denominaron péptidos de unión de alta actividad (HABPs, del inglés High
Activity Binding Peptides), algunos de los cuales presentaron variabilidad genética y
generaban altas respuestas inmunes cepa-específica y otros eran conservados (no
presentaban variaciones en sus secuencias de aminoácidos). Estos HABPs conservados no
generaban anticuerpos y no inducían protección frente a reto experimental en el modelo
Aotus spp, sugiriendo que las secuencias conservadas no eran vista por el sistema
inmunológico [192].
Para romper este silencio inmunológico, la secuencia de aminoácidos de los HABPs
conservados se utilizaron como plantillas para el diseño de péptidos análogos, a los cuales se
les substituían los residuos críticos en la invasión, de acuerdo a los principios fisicoquímicos
previamente definidos [192]. Estas modificaciones permiten un mejor ajuste de los péptidos
en los bolsillos de unión del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) y así se mejora la
71
presentación al receptor de las células T (RCT), induciendo una fuerte respuesta
inmunológica, protectiva frente al reto experimental en monos Aotus [191].
En P. falciparum han sido identificados y modificados todos los componentes mínimos
necesarios para bloquear la invasión de P. falciparum [191]. En P. vivax, pocos antígenos han
sido identificados y tan solo tres proteínas: PvMSP-1 [193], PvDBP [194] y PvRBP-1[195] han
sido incluidas en ensayos de interacción receptor-ligando para identificar los HABPs. Por
consiguiente, el descubrimiento de nuevos antígenos y la caracterización e identificación de
las regiones funcionales que se unen a los reticulocitos, son de vital importancia para el
desarrollo de una vacuna contra P. vivax.
Las proteínas RONs y, en especial, la proteína RON2 de P. falciparum y T. gondii es una de
las principales proteínas implicadas durante el proceso de invasión junto con la proteína
AMA-1. Por lo tanto, la caracterización e identificación de la proteína RON2 en P. vivax,
realizadas en el presente trabajo, son importantes en el proceso de selección de antígenos
candidatos a ser posteriormente evaluados en el desarrollo de una vacuna contra P. vivax.
72
5. Conclusiones
a) El gen pvron2 se encuentra en el genoma de P. vivax de la cepa VCG-1 y se
transcribe durante el ciclo intraeritrocítico.
b) El gen que codifica la proteína PvRON2 se expresa en el cuello de las roptrías en el
estadio de esquizontes, similar a lo reportado para su homólogo en PfRON2
c) PvRON2 es una proteína que contiene motivos y dominios característicos de
antígenos de malaria que participan durante la invasión.
d) La presencia de PvRON2 en P. vivax sugiere que hay un mecanismo conservado de
invasión entre P. falciparum y otros parásitos Apicomplexa.
73
6. Perspectivas
Basados en los estudios que adelantan otros grupos de investigación a nivel mundial en la
caracterización funcional de las proteínas asociadas a AMA-1 en otros Apicomplexa y en la
identificación y caracterización de la primera proteína del cuello de las roptrias en P. vivax
(PvRON2), descrita en este trabajo, las perspectivas futuras se pueden orientar de diferentes
formas:
1) Determinar las propiedades antigénicas e inmunogénicas de la proteína PvRON2 y
evaluar el polimorfismo en diferentes cepas de P. vivax. El conocimiento de estas
características será fundamental para la inclusión o no, de este antígeno en una
vacuna contra la malaria.
2) Evaluar el papel de PvRON2 en la formación de un complejo con la proteína PvAMA-1
a través de diferentes ensayos de interacción proteína-proteína, como
inmunoprecipitación, ensayos de pull-down, calorimetría de titulación isotérmica,
BiaCore y ELISA, entre otros.
3) Determinar las regiones funcionales de PvRON2 que interactúan con la proteína
PvAMA-1 para el diseño de métodos de control que bloqueen esta asociación.
4) Identificar las subunidades mínimas funcionales de PvRON2 que interactúan con los
reticulocitos y su posterior modificación, para el desarrollo de vacunas que incluyan
subunidades peptídicas capaces de inducir eficientemente una respuesta inmune
protectiva.
74
7. Referencias
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84
8. Anexos
Anexo 1
Enriquecimiento de esquizontes de una muestra infectada con P. vivax de la cepa VCG-1
mediante gradiente de Percoll. En la siguiente ilustración se muestra la separación diferencial
de las células.
14
13
15
12
11
10
2
3
4
5
6
7
8
9
Plasma sanguíneo
Glóbulos rojos parasitados:
Trofozoitos y Esquizontes
Plaquetas y glóbulos blancos
Glóbulos rojos parasitados:
Anillos
Glóbulos rojos no parasitados
85
Anexo 2
Comparación entre las secuencia de aminoácidos de RON2 entre las especies de Pf, Pv, Pk,
Pc y Py. En el recuadro azul de muestra el PS y en verde el dominio transmembranal en cada
una de las especies. Los asteriscos rojos muestran la presencia de las cisteínas
conservadas.
86
1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 0
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1 1 0 1 2 0 1 3 0 1 4 0 1 5 0 1 6 0 1 7 0 1 8 0 1 9 0 2 0 0
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89
9. Publicaciones
Publicación internacional:
Arévalo-Pinzón Gabriela, Curtidor Hernando, Patiño Liliana C, Patarroyo Manuel A.
PvRON2, a new Plasmodium vivax rhoptry neck antigen.
Malaria J. 2011. 10:60
PvRON2, a new Plasmodium vivax rhoptry neckantigenArévalo-Pinzón et al.
Arévalo-Pinzón et al. Malaria Journal 2011, 10:60http://www.malariajournal.com/content/10/1/60 (14 March 2011)
RESEARCH Open Access
PvRON2, a new Plasmodium vivax rhoptryneck antigenGabriela Arévalo-Pinzón1,2,3, Hernando Curtidor1,2, Liliana C Patiño1,2, Manuel A Patarroyo1,2*
Abstract
Background: Rhoptries are specialized organelles from parasites belonging to the phylum Apicomplexa; theysecrete their protein content during invasion of host target cells and are sorted into discrete subcompartmentswithin rhoptry neck or bulb. This distribution is associated with these proteins’ role in tight junction (TJ) andparasitophorous vacuole (PV) formation, respectively.
Methods: Plasmodium falciparum RON2 amino acid sequence was used as bait for screening the codifying genefor the homologous protein in the Plasmodium vivax genome. Gene synteny, as well as identity and similarityvalues, were determined for ron2 and its flanking genes among P. falciparum, P. vivax and other malarial parasitegenomes available at PlasmoDB and Sanger Institute databases. Pvron2 gene transcription was determined byRT-PCR of cDNA obtained from the P. vivax VCG-1 strain. Protein expression and localization were assessed byWestern blot and immunofluorescence using polyclonal anti-PvRON2 antibodies. Co-localization was confirmedusing antibodies directed towards specific microneme and rhoptry neck proteins.
Results and discussion: The first P. vivax rhoptry neck protein (named here PvRON2) has been identified in thisstudy. PvRON2 is a 2,204 residue-long protein encoded by a single 6,615 bp exon containing a hydrophobic signalsequence towards the amino-terminus, a transmembrane domain towards the carboxy-terminus and two coiledcoil a-helical motifs; these are characteristic features of several previously described vaccine candidates againstmalaria. This protein also contains two tandem repeats within the interspecies variable sequence possibly involvedin evading a host’s immune system. PvRON2 is expressed in late schizonts and localized in rhoptry necks similar towhat has been reported for PfRON2, which suggests its participation during target cell invasion.
Conclusions: The identification and partial characterization of the first P. vivax rhoptry neck protein are describedin the present study. This protein is homologous to PfRON2 which has previously been shown to be associatedwith PfAMA-1, suggesting a similar role for PvRON2.
BackgroundOf the five Plasmodium parasite species producinghuman malaria, Plasmodium vivax causes 100 to300 million clinical cases per year [1,2], representing~40% of the population suffering from this disease.Although P. vivax malaria has been considered to beless severe than that produced by Plasmodium falci-parum in clinical terms, several factors have highlightedthe need to search for new effective control measures tocounteract P. vivax infections, i.e. its ability to causechronic infections by inducing dormant forms present
in the liver (hypnozoites), increased severe manifesta-tions caused by this parasite species and the emergenceof strains resistant to chemotherapeutic agents, such aschloroquine [3,4]. Due to the difficulty of carrying out aP. vivax continuous culture in vitro, this parasite hasbeen relatively less studied compared to other Plasmo-dium species. To overcome this problem, a comparativeapproach has been undertaken aimed at identifying andcharacterizing in P. vivax parasite molecules involved intarget cell invasion previously described for other Plas-modium species (mainly P. falciparum), and in recenttranscriptome studies of the P. vivax intraerythrocyticdevelopment cycle [5].The Plasmodium parasite life-cycle is very complex,
beginning with a larva-like structure (or sporozoite)
* Correspondence: [email protected]ón Instituto de Inmunología de Colombia FIDIC, Carrera 50 # 26-20,Bogotá, ColombiaFull list of author information is available at the end of the article
Arévalo-Pinzón et al. Malaria Journal 2011, 10:60http://www.malariajournal.com/content/10/1/60
© 2011 Arévalo-Pinzón et al; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the CreativeCommons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, andreproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
being injected by the Anopheles mosquito during its bitein the search for a blood meal. The sporozoites thenmigrate to the liver and invade hepatocytes, where theyrapidly reproduce and transform into thousands ofpear-like structures (merozoites). During the asexualerythrocytic phase, which is responsible for the clinicalmanifestations of the disease, merozoites invade redblood cells (RBCs) very quickly through a processmediated by multiple receptor-ligand interactions [6].A large number of parasite proteins associated with thistype of interaction are stored in a set of specialized api-cal organelles known as rhoptries, micronemes anddense granules [7,8]. After initial contact with the RBC,the parasite redirects its apical pole over the erythrocytemembrane and sequentially releases the contents frommicronemes, rhoptries and then the dense granules [9].These molecular events lead to tight junction (TJ) andparasitophorous vacuole (PV) formation, as well as thebiochemical and functional remodelling of host cellarchitecture [10].A TJ is characteristic of members belonging to the
phylum Apicomplexa and can be seen as a ring-shapedelectro-dense structure by electron microscope; thisconnects to the parasite’s actin-myosin motor [11] topropel the parasite within the nascent PV, where it willreside during the intraerythrocytic development cycle[12]. Several microneme- and rhoptry-derived proteins,such as reticulocyte-binding protein homologues (RH)[13,14], erythrocyte-binding ligands (EBL) and theMCP-1 protein [15] either form part or are associatedwith the TJ.Apical merozoite antigen 1 (AMA-1) is derived from
micronemes and is essential in invasion of most Api-complexa studied so far [16,17]. It has been recentlydescribed that it is associated with proteins derivedfrom the rhoptry neck in Toxoplasma gondii, such asRON-2, -4, -5 and -8 in the TJ. A TJ organizationalmodel described by Besteiro et al in 2009 [18], proposedthat the parasite directly inserts some RON proteins(also identified as AMA-1 associated proteins (AAPs))into the host cell membrane, thus acting as additionalTgAMA-1 receptors. A clear interaction between theTgRON2 C-terminal region and the AMA-1 ectodomain(forming a crucial bridge between TgAMA-1 and therest of the AAPs) has been recently demonstratedthrough different protein-protein interaction assays.Moreover, inhibition assays using recombinant proteinshave shown that the RON2 and AMA-1 interaction iscritical for the entry to host cells [19,20].Previous comparative analysis between T. gondii and
P. falciparum genomes has revealed the presence ofhomologues for TgRON2, TgRON4 and TgRON5 pro-teins in P. falciparum: PfRON2 (Pf14_0495), PfRON4(Pf11_0168) and PfRON5 (MAL8P1.73), respectively.
PfRON2 [21], PfRON4 [22] and PfRON5 [23] arelocated in the rhoptry neck and co-immunoprecipitatewith PfAMA-1 [21,22,24,25]. Furthermore, the PfRON2protein and the PfAMA-1 ectodomain interaction hasalready been characterized, as well as its importance forerythrocyte invasion, suggesting that the mechanismdescribed in T. gondii could be conserved among differ-ent members of the phylum Apicomplexa [19].Studies with parasite lines expressing PfAMA-1 protein
mutants have shown that the Y251 residue, locatedinside the hydrophobic channel, is absolutely essential forPfAMA1/AAP complex formation [25]. Interestingly, aninvasion inhibition antibody known as 4G2, that recog-nizes the domain II loop of PfAMA-1 [26], preventsPfAMA1/AAP complex assembly through steric hin-drance and/or by inducing a PfAMA-1 conformationalchange which interferes with the AAP binding site[25,27]. Likewise, the R1 peptide derived from a randomphage display peptide library and known for being apowerful inhibitor of merozoite invasion of human RBCs[28] acts by binding to the PfAMA-1 hydrophobic chan-nel and blocking PfAMA1-AAPs complex formation [29].These data suggest that the interaction of a vaccine can-didate molecule such as PfAMA-1 with new rhoptry neckcomponents is critical during invasion of erythrocytesand a better understanding of the molecular mechanismsinvolved in this process might thus help in developingnew anti-malarial strategies.Taking into account the importance and implication
of RONs in different parasites belonging to the phylumApicomplexa and based on previous studies carried outin P. falciparum, the identification and characterizationof the first P. vivax rhoptry neck protein (PvRON2),which is homologous to PfRON2, are described in thepresent study. This protein is 2,204 amino acids-long(~220 kDa molecular mass), displaying an apical expres-sion in P. vivax late schizonts, which suggests its roleduring invasion of target cells.
MethodsBioinformatics methodsThe search for a PfRON2 homologous gene in P. vivaxwas carried out using the tBlastn tool in the P. vivax Sal-1 strain genome [30]. The sequence having the greatestscore was selected as pvron2 putative gene. PlasmoDBand Sanger Institute [31] databases were scanned forpvron2 and pfron2 homologous genes in partial genomesfrom other Plasmodium species (Plasmodium knowlesi,Plasmodium chabaudi, Plasmodium yoelii and Plasmo-dium berghei). Identity and similarity values betweenP. falciparum - P. vivax and the other species wereobtained with ALignX and ClustalW tools [32]. The pre-sence of a signal peptide was assessed by using SignalP[33] and anchor regions were predicted using the
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PredGPI and TMHMM servers [34]. Repeat sequencesand domains were predicted with the sequence tandemrepeats extraction and architecture modelling software(XSTREAM, variable ‘X’), the simple modular architec-ture research tool (SMART) and GlobPlot tools [35-37].Bepipred tool [38] and ANTHEPROT software [39] wereused for linear B epitope selection.
Nucleic acids source and extractionThe P. vivax Colombia Guaviare 1 (VCG-1) strain wasused as DNA, RNA and protein source. The strain wascultured through successive passes in Aotus sppmonkeys from FIDIC’s Primate Station in Leticia, Ama-zonas, as previously described [40] and according to theconditions established by the Ministry of the Environ-ment’s official Institute, Corpoamazonía (resolution00066, September 13th 2006). Three to four mL ofP. vivax VCG-1-infected monkey’s blood were extracted;a schizont-rich sample was then obtained by discontinu-ous Percoll gradient (GE Healthcare, Uppsala, Sweden)according to a previously described protocol [41].A Wizard genomic DNA purification kit (Promega, Wis-consin, USA) was used for genomic DNA extraction(gDNA) following the manufacturer’s specifications.Total RNA was extracted by the Trizol method [42] andthen treated with RQ1 RNase-free DNase (Promega,Wisconsin, USA). Five microlitres of RNA were used ascDNA synthesis template using the Superscript IIIenzyme (Invitrogen, Carlsbad CA) and oligo (dT) pri-mers in a 5-min cycle at 65°C, followed by 60 minutesat 50°C and a final 15-min cycle at 70°C.
Primer design, cloning and pvron2 gene sequencingThe pvron-2 nucleotide sequence (PVX_117880),reported in the PlasmoDB database, was used as tem-plate for designing three sets of primers with GeneRun-ner v3.05 software. PvRON2-pEXP-F1 5’-ATG ATAAGTA CAA GGG AGG CAA AA-3’ and PvRON2-pEXP-R1 5’-ATA TCT TTT GTT TCT CGT CCT G-3’primers were used for amplifying region I, consisting ofamino acids 18 to 742. PvRON2-pEXP-F2 5’-ATG AACCCAT TAG TAT ATC ACG TG-3’ and PvRON2-pEXP-R2 5’-CAG CAG TTT CAT CTTG GCC-3’ wereused for amplifying region II, consisting of amino acids701 to 1560. Region III (amino acids 1517 to 2203) wasamplified with PvRON2-pEXP-F3 5’-ATG ACC AGGGCT GAG AAA TTC G-3’ and PvRON2-pEXP-R3 5’-CAC CTG TAT GCG GGC GTA-3’. Two primers wereused for amplifying the PvAMA-1 ectodomain (43-487amino acids): PvAMA-1D 5’-ATG CCT ACC GTTGAG AGA AGC A-3’ and PvAMA-1R 5’-TAG TAGCAT CTG CTT GTT CG-3’.PCR amplification was carried out using GoTaq Flexi
DNA polymerase enzyme (Promega) in a 25 μL final
reaction, according to manufacturer’s instructions.Amplification conditions were as follows: a 7-min cycleat 95°C, followed by 35 cycles of 1 min at 58°C, 3 minat 72°C and 1 min at 95°C, and finally, a 10-min exten-sion step at 72°C. Products were visualized on a 1%agarose gel and then purified with a Wizard PCR prepskit (Promega). PCR products obtained from cDNA werecloned in the pEXP5-CT/TOPO expression vector usingTOPO TA cloning (Invitrogen, Carlsbad CA). Positiveclones were analysed by enzymatic restriction andsequenced in an ABI PRISM 310 Genetic Analyser (PEApplied Biosystems).
Peptide synthesis and polyclonal antibody productionTwo linear B-cell epitope peptides were selected for pro-ducing polyclonal antibodies against the PvRON2 proteinbased on the following parameters: (1) high averagevalues for Parker’s antigenicity, hydrophilicity and solventaccessibility obtained with Antheprot software [39],(2) high values in results obtained with the Bepipred tool(at default 0.35 threshold and 75% specificity) [38] and(3) selected peptides had to be located in different por-tions of the protein, with the aim of detecting differentfragments in case the PvRON2 protein was proteolyti-cally processed. Selected peptides were synthesized bysolid-phase peptide synthesis (SPPS) using the tert-butoxycarbonyl (t-Boc) strategy [43] and numberedaccording to our institute’s serial numbering system as:35519 (CG734YGRTRNKRYMHRNPGEKYKG753GC) and35520 (CG1674KLQQEQNELNEEKERQRQEN1693GC).Peptide 37870, derived from the N-terminal region
of PvAMA-1 protein (CG23RNQKPSRLTRSANNVL-LE40GC), and 32416, derived from PvRhopH3 protein(CG792SAGVGTVSTHSPATAARMGL811GC), weresynthesized by SPPS. Peptide 37870 has been shown to beimmunogenic in mice [44] and peptide 32416 has pre-viously been used for polyclonal antibody production inrabbits, followed by localization experiments for thePvRhopH3 protein [45]. Synthesized peptides were ana-lysed by reverse phase high performance liquid chromato-graphy (RP-HPLC) and MALDI-TOF mass spectrometry(Auoflex, Bruker Daltonics, Bremen, Germany). Cysteineand glycine were added to the N- and C-termini duringsynthesis to allow peptide polymerization. These peptideswere inoculated in mice and the obtained sera were usedfor co-localization experiments as explained below.Two New Zealand rabbits were selected (numbered 89
and 90) for obtaining polyclonal antibodies againstPvRON2 protein; they were negative for P. vivax-derivedprotein recognition by Western Blot. Each rabbit wassubcutaneously inoculated with 500 μg of putativePvRON2-derived peptide 35519 (rabbit 90) or peptide35520 (rabbit 89), emulsified in Freund’s complete adju-vant (FCA) on day 0. Booster immunizations on days
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20 and 40 were administered using the same peptidesemulsified in Freund’s incomplete adjuvant (FCI).Rabbits’ sera were collected on day 60 and used forfurther assays.7-8 week old BALB/c strain mice were intraperitone-
ally (i.p.) immunized with 100 μg of peptide 37870 orpeptide 32416, emulsified in FCA. Three boosterswere given on days 30, 45 and 60 with 100 μg of FCI-emulsified peptide. These animals were bled 15 daysafter the last immunization and their sera were collectedfor further assays. Immunizations and animal bleedingwere carried out following Colombian Ministry ofHealth recommendations for handling live animals usedin research or experimentation.
Immunoblotting and immunofluorescenceSaponin-treated parasite lysate was separated by 10%SDS-PAGE and proteins were then transferred to anitrocellulose membrane. The membrane was blockedwith a 5% milk solution in 0.05% PBS-Tween for onehour to eliminate unspecific binding. The membranewas cut into stripes for individual incubation with pre-immune and hyper-immune sera (anti-PvRON2 polyclo-nal antibodies) in 1:20 dilution for 90 min, followed byincubation with phosphatase-coupled anti-rabbit IgG(PIERCE, Rockford, IL, USA) in a 1:5,000 dilution for 60min. A BCIP/NBT kit (Promega) was used as a revealingsolution, according to the manufacturer’s instructions.Plasmodium vivax VCG-1 thick smears were used for
immunofluorescence assays and fixed with 4% v/v for-maldehyde for 10 min. The slides were then permeabi-lized for 10 min with 1% v/v Triton and blocked with a1% BSA/PBS solution at 37°C. The slides were washedseveral times with PBS and incubated with 300 μL ofanti-PvRON2 polyclonal serum (primary antibody) in a1:40 dilution with either anti-PvAMA-1 in a 1:20 dilu-tion or anti-PvRhopH3 in the same dilution for 60 min.Fluorescein-labelled anti-rabbit IgG (FITC) (VectorLaboratories, Burlingame, CA, USA) and rhodamine-labelled anti-mouse IgG (Millipore, Billerica, MA, USA)were used as secondary antibody for 60 min, followedby three PBS washes. Parasite nuclei were stained with a2 μg/mL solution of 4’,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI) for 20 minutes at room temperature and fluores-cence was visualized in a fluorescence microscope(Olympus BX51) using an Olympus DP2 camera andVolocity software (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA).
Results and Discussionpvron2 identification and orthologous genesThe PfRON2 protein amino acid sequence (PF14_0495)was used as template for scanning the P. vivax completegenome, available in PlasmoDB (version 6.5), in thesearch for the homologous PvRON2 encoding gene.
tBlastn analysis revealed a nucleotide sequence having ahigh probability of containing the pvron2 gene locatedin reading frame -2 between 2,221,529-2,214,921 bp,contig CM000453. High similarity (61.7%) and identity(47.8%) values were found between PfRON2 andPvRON2 protein amino acid sequences, suggesting thatthese two proteins share a common origin. pvron2neighbouring genes located upstream and downstreamwere also analysed, as well as their intron-exon organi-zation; identity and similarity values were determined bycomparing P. falciparum and P. vivax protein sequences(Figure 1). Similarity and identity values were found ran-ging from 60.4%-98.3% and 42.7-96.6%, respectively, inthe analysed chromosomal region.PfRON2 and PvRON2 orthologues were found in
P. knowlesi (PkRON2: PKH_125430), P. chabaudi(PcRON2: PCAS_131900), P. berghei (PBANKA_131570)and P. yoelii (Py06813) when the PfRON2 amino acidsequence was used as template for Blastp analysis forsome Plasmodium species partial genomes. Plasmodiumspecies ron2 genes were located in homologous chromo-somal regions, as shown by their high similarity and iden-tity values (35%-88% and 16%-75%, respectively) at aminoacid level, similar ORF orientation and intron-exon pat-tern. P. yoelii pyron2 downstream genes (Figure 1) wereexcluded from analysis, given that this genome has notbeen completely assembled.
PvRON2 is encoded by a single exon and transcribed inblood-stage parasitesPlasmodium falciparum transcriptome analysis revealedthat PfRON2 begins its transcription after 35 hours,reaching its maximum peak of expression 45 hours intothe erythrocytic cycle [46]. PCR amplification ofPvRON2 encoding sequence confirmed the transcript’spresence in P. vivax VCG-1 strain parasites during theblood stage (Figure 2A). This agreed with the resultsobtained from P. vivax transcriptome analysis whichshowed that PvRON2 is transcribed between hour35 (TP7) and 40 (TP8) in the intraerythrocytic cycle,similar to other proteins involved in invasion such asPvMSP-1 [5]. When pvron2 gene gDNA and cDNAsequences were compared, obtained from the threeamplification products overlapping by around 100 bp,both are identical, thus confirming that this gene con-sisted of a single 6,615bp exon. Recombinant clonesequences were analysed using CLC DNA Workbench(CLC bio) and the consensus sequence was deposited inthe GenBank with the ID: HQ825321.Two substitutions and the insertion of a nucleotide
triplet were found when VCG-1 strain and Sal-1 refer-ence strain nucleotide sequences were compared. Substi-tutions in positions 1,241 and 1,814 produced a changefrom valine to glycine (V414G) and histidine to proline
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Figure 1 Schematic representation of ron2 chromosomal localization (grey) and adjacent ORFs (white) in Plasmodium falciparum,vivax, knowlesi, chabaudi, berghei and yoelii. The accession numbers for each ORF in PlasmoDB are shown. The length of the representedchromosomal fragment and its localization within the genome in each species is shown on the right. Identity and similarity values at the aminoacid level between P. falciparum and P. vivax, as well as between P. vivax and P. knowlesi are pointed out.
Figure 2 cDNA amplification and PvRON2 schematic representation. A. PCR amplification from pvron2 gene RT-PCR product, with three setsof primers as described in the Materials and Methods section. Lane 1. pvron2 region I (~2,176 bp). Lane 2. pvron2 region II (~2,580 bp). Lane 3.pvron2 region III (~2,061 bp). Lane 4. molecular weight pattern. Lane 5. PvAMA-1 ectodomain amplification (positive control). Lane 6. Negativecontrol. B. PvRON2 protein representation. The signal peptide is shown in blue, the transmembrane domain (TMD) in dark grey, coiled-coil motifsin light grey and red lines indicate conserved cysteines between Pf, Pv, Pk, Pc, Pb and Py. * represents polymorphic sites between Sal-1(reference) and VCG-1 strains. The localization and sequence of inoculated peptides is marked.
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(H605P), respectively. The addition of a glutamic acid(E)-encoding triplet (AAG) was found in position 1,487-1,489nt (residue 496). Interestingly, these changes werelocated in an interspecies variable region, spanningaround residues 50 to 850 [21], suggesting that thisregion might be subjected to selective immune pressure.
Bioinformatics analysis of PvRON2 protein sequenceThe PvRON2 complete protein sequence in the VCG-1strain consists of 2,204 residues having a putative hydro-phobic signal sequence within its first 17 amino acidsand a transmembrane domain (TMD) towards theC-terminus between residues 2,087-2,109. The RON2protein has similar lengths in other species, rangingfrom 1,990 amino acids in P. chabaudi to 2,232 inP. yoelii, as well as a similar domain organization,including a signal peptide, a TMD and containing eightconserved cysteines (Figure 2B) probably related tocommon protein structural features.PvRON2 contains two coiled coil a-helical motifs
(residues 145-184 and 1,651-1,703) (Figure 2B), charac-terized by seven amino acid repeats (abcdefg) n withhydrophobic residues located in positions a and d, andresidues (generally polar) in the remaining sites whichhave been involved in protein-protein interactions.These coiled coil motifs have been identified in severalimportant P. falciparum vaccine candidates such asLSA-1, MSP-3, MSP6 and MSP11 [47,48]; such motifsare recognized by naturally-acquired antibodies andare also immunogenic in mice [49]. Interestingly, pep-tide 35520 (containing part of the second coiled coila-helical motif) has induced an antibody response inrabbits. Additionally, PvRON2 has two tandem repeat(TR) regions located within the interspecies variablesequence. Eight 11 amino acid long repeats (GADGK-GYGPYG) are located between residues 258 and 345,and the second tandem (GGYGNGGHE) is locatedbetween residues 542-628, having 9 repeats (Figure2B). TRs were mostly found in RON2 sequences fromdifferent Plasmodium species and, even though theDNA and protein sequences from the repeats variedwidely amongst RON2 proteins, there was close to40% similarity between PvRON2 and PkRON2 repeats.Such similarity between Pv and Pk was in agreementwith a close evolutionary relationship between simianmalarial parasites and the human P. vivax parasite.TRs have been identified in different malarial antigenssuch as the P. falciparum circumsporozoite protein(CSP), the ring-infected erythrocyte surface antigen(PfRESA) and the knob-associated histidine rich pro-tein (KAHRP). These TRs could downregulate antibodyisotype maturation and high-affinity antibody produc-tion in the specific case of malaria by acting as B-cellsuperantigens, predominantly inducing a polyclonal
thymus-independent humoral response. T-independentantibody responses are usually short lived, predomi-nantly composed of IgM and IgG3 and have low affi-nity, suggesting that these repeats are used duringinvasion to distract the immune response, acting asdecoys or “smokescreens”, thereby masking the criticalepitopes [50,51]. Given all the above-mentioned data,it would be important to assess the functional andimmunological implications of these repeat regions inPvRON2.
PvRON2 is expressed in P. vivax schizontsPolyclonal antibodies were produced against the proteinby immunizing rabbits with polymeric PvRON2-derivedpeptides to assess PvRON2 expression and cellular loca-lization in P. vivax schizonts. Polyclonal antibodiesdetected two bands at around ~220 kDa and ~185 kDa(Figure 3A), suggesting that PvRON2 can undergo pro-teolytic processing, by contrast with that reported forPfRON2 [21]. The predicted size for PvRON2 (240 kDa)is slightly larger than that obtained from mobility onSDS-PAGE (220 kDa). Interestingly, similar behaviourhas been described for TgRON2, suggesting anomalousmigration [52].In many cases, it has been found that rhoptry proteins
are initially synthesized as pre-proteins and maturateduring transport [53]. It could be hypothesized thatsuch cleavage could serve to activate PvRON2 by reveal-ing a functional domain or releasing the protein of para-site surface or RBC membrane to allow successfulinvasion. Additionally, pulse-chase analysis has shownthat TgRON2 is expressed as a pro-protein (~150 kDa)which is cleaved to produce a ~120 kDa mature protein.Even though it is not known which specific proteasesact in TgRON2 maturation, it has been suggested thatthis protein can be cleaved by subtilisin 2 (TgSUB2)[18]. Studies carried out with important P. falciparumadhesins located on merozoite membrane, micronemesor rhoptries, such as AMA-1, merozoite surface protein(MSP), EBL, RBL and thrombospondin-related anon-ymous protein (TRAP) families, contain a putativerhomboid cleavage site within their TMD and putativeSUB-2 cleavage sites. COS-7 cell system studies haverevealed that A1427 residue substitution in the EBA-175protein has prevented PfROM4-mediated shedding,avoiding the release of EBA-175 from the merozoite sur-face [54]. Similarly, substituting the GA motif (residueswhich destabilize a-helices) closest to the TMD extra-cellular end abolished specific cleavage (also predictedas the site required for rhomboid recognition). Interest-ingly, PvRON2 sequence analysis revealed a putativerhomboid cleavage site between 2,101-2,104; this agreedwith the fact that sera recognized two fragments fromthe protein, but additional studies are needed for
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assessing the importance of such processing, as well asthe identity of the responsible protease.Immunofluorescence analysis of P. vivax schizonts
showed that PvRON2 had a dotted pattern typical ofapical organelles, such as rhoptries and micronemes(Figure 3B). To examine their localization in detail, dual
labelling was performed using mouse polyclonal antibo-dies against PvAMA-1 and PvRhopH3. It was found thatthere was no co-localization between the PvAMA-1 pro-tein (microneme marker) and PvRON2 (Figure 3C), sug-gesting that PvRON2 is not present in micronemes. Bycontrast, there was a small area of central localization
Figure 3 PvRON2 expression and apical localization. A. Anti-PvRON2 rabbit polyclonal antibodies detected two bands at around ~220 and~185 kDa in parasite lysate by Western blot. Lane 1: pre-immune serum. Lane 2: hyper-immune serum. B. P. vivax schizonts incubated with anti-PvRON2 polyclonal antibodies and revealed with FITC-labelled anti-rabbit IgG (green). Parasite nuclei were stained with DAPI (blue). C. Co-localization study: schizonts were simultaneously incubated with anti-PvRON2 and anti-PvAMA-1 (top) or anti-PvRhopH3 (bottom) and detectedwith FITC-labelled anti-rabbit and with rhodamine-labelled anti-mouse. Arrows indicate the typical dotted pattern displayed by apical organelles.
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between PvRhopH3 (rhoptry bulb marker) and PvRON2suggesting that even though PvRON2 is located in therhoptries, it is not located in the rhoptry bulb, probablyforming part of the rhoptry neck, as has been describedfor PfRON2 and TgRON2 proteins [18,21]. Recently, astudy that characterized the timing of expression andsubcellular location of Plasmodium homologues in someT. gondii rhoptry proteins showed that P. berghei RON2protein is located in merozoite and sporozoite rhoptries,and presents a timing of expression comparable to theone found in RAP2/3. These data strongly suggest anessential role of RON2 protein during the invasion andinfection establishment in sporozoites [55].
ConclusionsAs has been shown in the present study, RON2 is ahighly conserved protein among different Plasmodiumspecies. pvron2 gene consists of a single exon and istranscribed and expressed in schizonts rhoptries at theend of the erythrocytic cycle. Its similarity to PfRON2(which forms a complex with PfAMA-1), as well as itslocalization and expression time during the schizontstage suggest a similar role in host cell invasion forPvRON2, as that attributed to PfRON2.
AcknowledgementsWe would like to thank Luisa Fernanda Zuleta and Oswaldo Escobar for theirtechnical support, Jason Garry for reviewing this manuscript and especiallyto Prof. Manuel Elkin Patarroyo for his invaluable comments andsuggestions.
Author details1Fundación Instituto de Inmunología de Colombia FIDIC, Carrera 50 # 26-20,Bogotá, Colombia. 2Universidad del Rosario, Carrera 24 # 63C-69, Bogotá,Colombia. 3Pontificia Universidad Javeriana, Carrera 7 # 40-62, Bogotá,Colombia.
Authors’ contributionsGAP carried out bioinformatics analyses, molecular biology assays and wrotethe initial manuscript. HC synthesized and purified the peptides used forrabbit and mice immunizations and analysed data. LCP carried outimmunoassays. MAP evaluated and coordinated assays, and revised the finalmanuscript. All authors read and approved the final manuscript.
Competing interestsThe authors declare that they have no competing interests.
Received: 12 February 2011 Accepted: 14 March 2011Published: 14 March 2011
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doi:10.1186/1475-2875-10-60Cite this article as: Arévalo-Pinzón et al.: PvRON2, a new Plasmodiumvivax rhoptry neck antigen. Malaria Journal 2011 10:60.
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Arévalo-Pinzón et al. Malaria Journal 2011, 10:60http://www.malariajournal.com/content/10/1/60
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