“Identificación y caracterización molecular de genes relacionados con la actividad celulolítica en bacterias del género Bacillus aisladas en el

estado de Sinaloa”.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA EN

RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE

PRESENTA:

MANUEL FAUSTINO JIMÉNEZ LEYVA

GUASAVE, SINALOA, MÉXICO, DICIEMBRE DEL 2015

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN

PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA

 

   

v  

Agradecimientos a proyectos

El trabajo de tesis se desarrolló en el Departamento de Biotecnología Agrícola del Centro

Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional (CIIDIR) Unidad

Sinaloa del Instituto Politécnico Nacional (IPN). El presente trabajo fue apoyado

económicamente a través del SIP20144021 y SIP20144369. El alumno Manuel Faustino

Jiménez Leyva fue apoyado con una beca CONACYT con clave 560300.

   

vi  

DEDICATORIA

Primeramente a Dios por permitir llegar a este momento y concluir una meta más en

mi vida.

Con mucho cariño a mi familia, por su apoyo incondicional a lo largo de esta etapa.

A mis amigos por su cariño y apoyo, muchas gracias.

Y a todas las personas que forman parte de mi vida y que de alguna u otra manera

influyeron en este proceso, muchas gracias, esto también es para ustedes.

   

vii  

AGRADECIMIENTOS

A Dios por ponerme en este camino, rodeado de personas valiosas que me guiaron y

apoyaron.

Agradezco al Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral

Regional (CIIDIR-IPN Sinaloa), al Departamento de Biotecnología Agrícola

(BIOTECSIN) y al Laboratorio de Genómica funcional por permitirme desarrollar mi

proyecto de investigación y ayudarme a crecer académicamente.

A mis directores de tesis la Dra. Claudia Castro Martínez y el Dr. Carlos Ligne

Calderón Vázquez por su apoyo, paciencia, consejos y excelente dirección en mi

trabajo de tesis. Especialmente agradezco al Dr. Carlos por abrirme las puertas de su

laboratorio y ayudarme a crecer tanto académica como personalmente, por su

confianza y amistad, muchas gracias.

Agradezco a mi comité tutorial, Dr. Hervey Rodríguez González, Dr. Ignacio

Maldonado Mendoza y Dr. José Antonio Cervantes Chávez por su disponibilidad y

aportaciones durante el desarrollo de este proyecto.

A cada uno de mis compañeros y amigos del Laboratorio de Genómica Funcional y

el Laboratorio de Bioenergéticos, gracias por su apoyo y amistad, y por hacer que mi

estancia en este centro fuera más placentera.

Gracias también a mis compañeros de generación por su amistad durante las clases,

seminarios y fuera de este centro de trabajo. A mis maestros gracias por sus

enseñanzas, consejos y por ayudarme a crecer académicamente.

Pero ante todo, agradezco a mi familia por su apoyo incondicional a lo largo de este

proceso.

Sin olvidar a cada una de las personas que de alguna u otra forma me apoyaron

durante mi maestría, muchas gracias.

   

viii  

CONTENIDO

Pág.

 

ÍNDICE DE FIGURAS  ..........................................................................................................................  xi  

ÍNDICE DE CUADROS  .....................................................................................................................  xiii  

GLOSARIO  ..........................................................................................................................................  xiv  

RESUMEN  ...........................................................................................................................................  xvi  

ABSTRACT  ........................................................................................................................................  xvii  

1.   INTRODUCCIÓN  ...........................................................................................................................  1  

2.   ANTECEDENTES  .........................................................................................................................  2  

2.1.   Biomasa lignocelulósica  ...................................................................................................  2  

2.2.   Celulosa  .................................................................................................................................  2  

2.3.   Hidrólisis de la celulosa  ....................................................................................................  3  

2.4.   Microorganismos relacionados con actividad celulolítica  .......................................  4  

2.5.   Enzimas y mecanismo involucrado en la degradación de celulosa.  .....................  5  

2.6.   Endo-1,4-β-glucanasas  ......................................................................................................  6  

2.7.   Exo-1,4-β-glucanasas  .........................................................................................................  9  

2.8.   β-glucosidasas  .....................................................................................................................  9  

2.9.   Aplicaciones de enzimas celulolíticas a nivel industrial  .........................................  10  

2.10.   Aspectos moleculares implicados en la actividad celulolítica  ..........................  10  

2.11.   Antecedentes de genes implicados en actividad celulolítica  ............................  11  

2.12.   Regulación génica de la actividad celulolítica en microorganismos  ...............  14  

2.13.   Género Bacillus como productores de enzimas celulolíticas  ...........................  15  

2.14.   Antecedentes de enzimas y genes implicados en actividad celulolítica en el género Bacillus.  .............................................................................................................................  16  

2.14.1.   Actividad endoglucanasa  ........................................................................................  16  

2.14.2.   Actividad exoglucanasa  ..........................................................................................  17  

2.14.3.   Actividad β-glucosidasa  ..........................................................................................  18  

2.14.4.   Regulación de la actividad celulolítica en Bacillus  ..........................................  18    

2.15.   Antecedentes de enzimas celulolíticas de estudios en CIIDIR-Sinaloa  ..........  18  

   

ix  

3.   JUSTIFICACIÓN  .........................................................................................................................  20  

4.   OBJETIVOS  .................................................................................................................................  21  

4.1.   Objetivo general  ................................................................................................................  21  

4.2.   Objetivos específicos  .......................................................................................................  21  

5.   HIPÓTESIS  ..................................................................................................................................  22  

6.   MATERIALES Y MÉTODOS  .....................................................................................................  23  

6.1.   Microorganismos y medio de cultivo  ...........................................................................  23  

6.2.   Identificación a nivel molecular los aislados (RS351, RS273 y RZ164)  ...............  23  

6.3.   Identificar y seleccionar mediante herramientas bioinformáticas los genes que codifican para la actividad celulolítica en el genoma de especies del género Bacillus……………………………………………………………………………………………………………………………………….23  

6.4.   Análisis de la secuencia de los genes que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus  ...........................................................................  24  

6.5.   Curva de crecimiento y determinacion de actividad celulolítica de los aislados del género Bacillus en dos diferentes fuentes de carbono  ................................................  25    

6.6.   Cuantificación el nivel de expresión del gen eglS bajo el efecto de dos fuentes de carbono  ......................................................................................................................................  27  

7.   RESULTADOS  ............................................................................................................................  29  

7.1.   Identificación molecular de aislados bacterianos  ....................................................  29  

7.2.   Identificación de genes implicados en la actividad celulolítica en Bacillus subtilis 168  ......................................................................................................................................  29  

7.3.   Selección de genes implicados en la actividad celulolítica en Bacillus subtilis 168………………………………………………………………………………………………………………………………………………..30  

7.4.   Análisis de secuencia de los genes de que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus  ...........................................................................  36    

7.5.   Curva de crecimiento y determinación de la actividad celulolítica de los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo diferentes fuentes de carbono  .............................  39  

7.6.   Síntesis de ADNc en los aislados RZ164, RS273 y RS351  .....................................  42  

7.7.   Cuantificación del nivel de expresión del gen eglS en los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo el efecto de dos fuentes de carbono  .................................................  44  

8.   DISCUSIÓN  .................................................................................................................................  47  

8.1.   Identificación de los aislados bacterianos  .................................................................  47  

8.2.   Selección de genes implicados en la actividad celulolítica en B. subtilis 168  ..  47  

8.3.   Análisis de secuencia de los genes de que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus  ...........................................................................  49  

   

x  

8.4.   Curva de crecimiento y actividad celulolítica de los aislados RZ164, RS351 y RS273 en CMC y avicel como fuentes de carbono  ...............................................................  50  

8.5.   Nivel de expresión del gen eglS en los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo el efecto de CMC y avicel como fuentes de carbono  ...............................................................  51  

9.   CONCLUSIONES  ........................................................................................................................  56  

10.   BIBLIOGRAFÍA  ...........................................................................................................................  57  

 

 

 

   

xi  

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Mecanismo implicado en degradación de celulosa………………….. 21

Figura 2. Estructura de las enzimas celulolíticas………………………………… 26

Figura 3. Mecanismo de degradación de celulosa por el sistema celulolítico

modelo de T. reesei…………………………………………………………

30

Figura 4. Gel de agarosa al 2 % representativo con los amplicones

correspondientes a los genes eglS, BglC, BglA y BglH en los

aislados RS273, RZ164 y RS351………………………………………….. 50

Figura 5. Alineamiento múltiple de la fracción GH5-CBM3 de endoglucanasas

del género Bacillus………………………………………………………….. 51

Figura 6. Agrupamiento de la fracción GH5-CBM3 de endoglucanasas de

bacterias del género Bacillus……………………………………………… 52

Figura 7. Agrupamiento de betaglucosidasas bacterianas pertenecientes a la

familia GH1 del género Bacillus y otras bacterias filogenéticamente

cercanas……………………………………………………………………..... 53

Figura 8. Cinética de crecimiento de los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo

2 diferentes fuentes de carbono en un periodo de incubación de

120 h………………………………………………………………………….... 54

Figura 9. Actividad endoglucanasa de los aislados RZ164, RS351 y RS273

bajo 2 diferentes fuentes de carbono en un periodo de incubación

de 120 h ………………………………………………………………………. 55

Figura 10. Actividad exoglucanasa de los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo

2 diferentes fuentes de carbono en un periodo de incubación de

120 h …………………………………………………………………………… 55

Figura 11. Actividad β-glucosidasa de los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo

2 diferentes fuentes de carbono en un periodo de incubación de

120 h …………………………………………………………………………… 56

Figura 12. Gel de agarosa al 1 % mostrando los ARNs de las 3 cepas objeto de

estudio en este trabajo crecidas en medio con CMC como única

fuente de carbono……............................................................................. 57

Figura 13. Gel de agarosa al 1.8 % mostrando los amplicones generados a

partir de los ADNc de las 3 cepas objeto de estudio en este trabajo

crecidas en medio con CMC y avicel como única fuente de carbono 58

   

xii  

en un periodo de incubación de 120 h……………………………………

Figura 14. Nivel de transcritos del gen eglS de los aislados RZ164, RS351 y

RS273 bajo el efecto de CMC como única fuente de carbono en un

periodo de 120 h de incubación…………………………………………… 59

Figura 15. Nivel de transcritos del gen eglS de los aislados RZ164, RS351 y

RS273 bajo el efecto de avicel como única fuente de carbono en un

periodo de 120 h de incubación…………………………………………… 60

Figura 16.

Mecanismo general de acción del gen eglS en CMC y avicel como

única fuente de carbono propuesto en este estudio…………………... 68

 

 

 

   

xiii  

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Resumen de actividades de los cinco aislados

seleccionados……………………………………………………………… 33

Cuadro 2. Lista de oligonucleótidos para PCR-Tiempo real……………………. 42

Cuadro 3. Lista de los 3 mejores hits arrojados por las bases de datos del

NCBI y RDP al comparar los fragmentos del gen 16S ADNr de los

aislados RS273, RS351 y RZ164………………………………………… 44

Cuadro 4. Genes con anotación con actividad celulolítica en B. subtilis

168……………………………………………………………………………. 45

Cuadro 5. Búsqueda de proteínas homólogas a exoglucanasas bacterianas

previamente reportadas en el genoma de B. subtilis 168………….. 46

Cuadro 6. Búsqueda de endoglucanasas reportadas en bacterias del género

Bacillus contra el genoma de B. subtilis 168 ………………………… 47

Cuadro 7. Predicción de dominios de endoglucanasas de B. subtilis 168

mediante las herramientas de NCBI y EXPASY………………………. 48

Cuadro 8. Búsqueda de β-glucosidasas bacterianas en el genoma de B.

subtilis 168 en las bases de datos del NCBI y BsubCyc……………. 49

Cuadro 9. Predicción de dominios en β-glucosidasas de B. subtilis 168

mediante las herramientas del NCBI y EXPASY……………………… 49

 

   

xiv  

GLOSARIO

Actividad enzimática: es una medida de la cantidad de enzima activa presente y del

nivel de actividad de la misma, se expresa en Unidades Internacionales (UI) por mL,

considerando una unidad como la cantidad de enzima que libera 1µmol de glucosa

por min.

Azúcar reductor: monosacárido o disacárido que puede ceder electrones a otra

molécula y por tanto actuar como agente reductor.

Biocombustible: son los combustibles obtenidos a partir de biomasa, pueden ser

sólidos como carbón de leña y maderas, líquido como etanol, biodiesel y aceites de

la pirolisis, o gaseosos como el biogás (metano).

Bioetanol: se denomina bioetanol, al alcohol etílico deshidratado al 99.4% de pureza

y se produce mediante la fermentación de los azúcares presentes en la caña de

azúcar, maíz, sorgo y otros cultivos, así como también de residuos agroindustriales.

Avicel: presentación sintética de celulosa cristalina.

Carboximetilcelulosa: Presentación sintética de celulosa amorfa soluble.

Celulasas: Mezcla compleja de enzimas que catalizan la hidrólisis de los enlaces β-

1,4 que unen dos moléculas de glucosa en la molécula de celulosa, estas enzimas

son endoglucanasas, exoglucanasas y β-glucosidasas.

Celulosa: carbohidrato compuesto de unidades de D-glucosa unidas en una larga

cadena lineal por enlaces glucosídicos β en los átomos de carbono 1 y 4 de la

molécula de azúcar.

Enzima: biocatalizadores complejos de gran especificidad, producidos por células de

organismos vivos, que aumentan la velocidad de reacciones biológicas.

Método del ácido di-nitro-salicílico (DNS): método colorimétrico para determinar la

actividad del sistema enzimático celulolítico, esta técnica demuestra la presencia del

   

xv  

grupo carbonilo libre (C=O) de los azúcares reductores que implica la oxidación del

grupo funcional aldehído de la glucosa.

Microorganismos celulolíticos: microorganismos que poseen enzimas capaces de

hidrolizar la materia lignocelulósica, incluyen bacterias, hongos, protozoarios y algas.

PCR-Tiempo real: variante de la técnica de PCR que permite cuantificar la cantidad

de ADN en tiempo real mediante detectores de fluorescencia

Rastrojos: es el conjunto de restos de tallos y hojas que quedan en el suelo después

de cosechar un cultivo.

   

xvi  

RESUMEN  

Las celulasas ocupan el tercer lugar en importancia económica mundial debido a sus

aplicaciones en procesos de la industria alimentaria, textil, papel y biocombustibles;

considerándose el incremento en ésta última el pasaporte al primer lugar. Beltrán-

Arredondo (2013) aisló y caracterizó microorganismos de rastrojo y de rizósfera de

maíz en Sinaloa, con actividad celulolítica y seleccionó 5 aislados que presentaron

actividad endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa comparable con lo reportado

previamente en bacterias. En el género Bacillus se han reportado las tres actividades

enzimáticas, así como un efecto inductor por fuentes de carbono

(carboximetilcelulosa, avicel). En los aislados de Sinaloa, se desconocen los genes

involucrados, por lo que el objetivo de este trabajo es identificar y caracterizar los

genes relacionados con la actividad celulolítica en dichos aislados. Éstos fueron

identificados como B. subtilis y con base a análisis bioinformáticos se seleccionó al

gen eglS como responsable de la actividad endo y exoglucanasa, y a los genes bglC,

bglH y bglA de la actividad betaglucosidasa. Posteriormente se secuenció cada uno

de los 4 genes en los aislados RZ164, RS351 y RS273 y se encontró que las

celulasas se encuentran muy conservadas, sugiriendo que la funcionalidad puede ser

muy conservada en Bacillus sp. Posteriormente, los aislados fueron cultivados en

medio con CMC y avicel como única fuente de carbono y se determinó la actividad

celulolítica, observándose que la máxima actividad endoglucanasa se detectó entre

las 48 y 96 h en los 3 aislados. En avicel se detectó actividad máxima en diferentes

tiempos en las tres cepas de estudio. Finalmente se cuantificó el nivel de transcrito

de eglS en CMC y avicel, detectando un incremento a las 24 h, el cual pudiese

desencadenar la alta actividad endoglucanasa observada a partir de las 48 h,

además una disminución en el nivel de transcrito a las 48 h y se incrementa

nuevamente a las 72 h y 96 h, coincidiendo ésta última tendencia con la máxima

actividad exoglucanasa. En avicel se presentó un incremento a las 48 h, existiendo

para RS351 una marcada relación entre actividad y expresión. Es evidente que existe

una relación entre actividad enzimática y la actividad génica mediada por un efecto

transcripcional, y que efectivamente el gen eglS codifica para dichas actividades.

   

xvii  

ABSTRACT  

Cellulases rank third in global economic importance due to their applications in

processes of the food, textile, paper and biofuels industry; considering the increase in

the latter's passport to first place. Beltrán-Arredondo (2013) isolated and

characterized microorganisms from corn stover and corn rhizosphere that presented

cellulolytic activity. From those, five isolates were selected with endoglucanase,

exoglucanase and β-glucosidase activity levels comparable with other previously

reported strains. For Bacillus the three-enzymatic activities have been reported,

together with an inductive effect that is modulated by the carbon source

(carboxymethylcellulose, avicel). At least for the isolates from Sinaloa, genes involved

in those enzymatic activities are still not known, so the aim of this work was to identify

and to characterize the genes related with the cellulolytic activity that these isolates

presented. The isolates were identified as B. subtilis and through a bioinformatics

analysis the egls gene was selected as the possible responsible for both the endo

and exoglucanase activity, and the genes bglC, bglH and bglA for the beta-

glucosidase activity. Subsequently, these genes were sequenced from isolates

RZ164, RS351 and RS273. It was found that cellulases are highly conserved,

suggesting that the functionality can be highly conserved in Bacillus as well.

Subsequently, isolates were grown in medium with CMC and avicel as the sole

carbon source and cellulolytic activity was determined, detecting that under CMC, the

beginning of the exponential phase was at 48 h presenting the highest

endoglucanase activity between 48 and 96 h for all the 3 isolates. For avicel, the

exponential phase started at 72 hours, with maximal activity at different times among

the three strains. Finally, the transcript levels of eglS gene was quantified under CMC,

detecting an increase at 24 h, which could be triggering the high endoglucanase

activity observed after 48 h, besides a decrease in transcript level at 48 h and

increased again at 72 h and 96 h, the latter trend coinciding with the maximum

exoglucanase activity. Clearly, there is a relationship among enzyme activity and

gene expression possibly mediated by a transcriptional effect, and that eglS gene

could be coding for these enzymatic activities.

   

1  

1. INTRODUCCIÓN

En los últimos años numerosos estudios han mostrado un interesante aumento en el

desarrollo y producción de biocombustibles como una alternativa sustentable a los

combustibles de origen fósil, ya que pueden contribuir a la disminución de emisiones

contaminantes a la atmósfera, a la reducción del uso de los combustibles de petróleo;

y a tener diversidad de fuentes de energía que garanticen el suministro demandado a

nivel mundial (Kim y Dale 2004; Cruz et al., 2009; Chandel y Singh, 2011).

Con la finalidad de responder a la creciente demanda de los biocombustibles,

están siendo desarrollados avances importantes en los procesos bioquímicos

utilizando enzimas. En este sentido, las enzimas han sido empleadas para

aprovechar la materia prima disponible en la naturaleza, como es la biomasa

lignocelulósica, para la producción de bioetanol de segunda generación ( Rubin,

2008; Chandel y Singh, 2011).

Las enzimas de origen microbiano son más estables que las enzimas de

origen animal o vegetal y su producción es más fácil y segura (Rubin, 2008).

Se han desarrollado estudios a nivel bioquímico de enzimas con actividad

celulolítica y también a nivel molecular de una gran diversidad de microorganismos.

Sin embargo, en los últimos años se ha puesto gran interés en bacterias del género

Bacillus spp, debido a que presentan características muy favorables para posibles

aplicaciones a nivel industrial como termotolerancia, halotolerancia, entre otras (

Annamalai et al., 2011; Asha et al., 2015).

Por lo mencionado anteriormente, el presente proyecto tiene como objetivo

caracterizar a nivel molecular los genes que codifican para enzimas celulolíticas en

bacterias del género Bacillus spp aisladas del estado de Sinaloa, con la finalidad de

brindar bases moleculares para futuros trabajos de investigación enfocados en el

mejoramiento en la producción de enzimas de este tipo, así como para potenciales

aplicaciones a nivel industrial.

   

2  

2. ANTECEDENTES 2.1. Biomasa lignocelulósica

La biomasa lignocelulósica (fibras de la materia vegetal) está constituida

principalmente por tres tipos de polímeros: celulosa, hemicelulosa y lignina, forman

parte de la pared celular de las plantas y químicamente están enlazados por enlaces

covalentes y no covalentes (Cullen y Kersten, 1992; Pérez et al., 2002).

En las fibras también se encuentran otros componentes como las pectinas, los

taninos y minerales. Los polímeros que constituyen la fibra tienen las siguientes

características:

a) La celulosa es el mayor componente del complejo lignocelulosa compuesto

por unidades de glucosa (Cullen y Kersten, 1992; Pérez et al., 2002).

b) La hemicelulosa es un polímero complejo que cubre las fibras de la

celulosa, su estructura se compone de unidades de xilosa, manosa, galactosa,

glucosa, arabinosa y ácidos glucorónicos, y a diferencia de la celulosa, es un

polímero fácil de hidrolizar (Beg et al., 2001; Polizeli et al., 2005).

c) La lignina recubre el polímero de la hemicelulosa; su estructura está

compuesta de unidades de fenilpropano, su función es conferir soporte

estructural, impermeabilidad y resistencia al ataque por microorganismos

(Howard et al., 2003; Martínez et al., 2005).

2.2. Celulosa La celulosa es el componente más abundante de la biomasa vegetal.

Estructuralmente, es un polisacárido compuesto de unidades de glucosa unidas en

una larga cadena lineal por enlaces β entre los átomos de carbono 1 y 4 de la

molécula de glucosa (Lynd et al., 2002). Este polisacárido existe en las plantas

superiores, en las algas, en algunos tipos de hongos y en los quistes de algunos

protozoarios.

La celulosa está localizada en la pared celular donde se encuentra como

unidades submicroscópicas de forma alargada conocidas como micelas. A su vez,

estas micelas se arreglan en estructuras más grandes, las microfibrillas, las cuales se

   

3  

encuentran suficientemente empaquetadas para prevenir la penetración no solo de

enzimas sino de pequeñas moléculas semejantes al agua (Lynd et al., 2002).

Una importante característica de la celulosa, relativamente inusual de los

polisacáridos es su estructura cristalina, sin embargo, las fibras individuales no son

puramente cristalinas, lo que genera regiones amorfas donde las fibras contienen

torceduras y espacios en sus microfibrillas lo cual permite la formación de microporos

y capilares lo suficientemente espaciosos para permitir la penetración de moléculas

relativamente grandes incluyendo, en algunos casos enzimas celulolíticas (Lynd et

al., 2002).

Las microfibrillas de celulosa están estabilizadas por enlaces de hidrógeno

intra e intermoleculares y rodeadas por polisacáridos hemicelulósicos (manano y

xilano) que se unen a la celulosa por puentes de hidrógeno y enlaces covalentes, la

hacen extremadamente resistente a la hidrólisis química y biológica (enzimas

producidas por microorganimos). Así mismo, las regiones amorfas de la estructura

cristalina de la celulosa tienen una composición heterogénea caracterizada por una

variedad de enlaces. Finalmente, este arreglo asimétrico que caracteriza las regiones

amorfas es crucial para la degradación de la celulosa (Malherbe y Cloete, 2002).

2.3. Hidrólisis de la celulosa Las celulasas son enzimas que hidrolizan los enlaces glicosídicos internos β-1,4 de

la celulosa a través de la acción conjunta de tres tipos de enzimas: a) Las

endoglucanasas (EGs), endo-1,4-β-glucanasas o carboximetilcelulasas hidrolizan al

azar los enlaces internos de las regiones amorfas que se encuentran en las fibras de

la celulosa generando sitios nuevos para la acción de otras enzimas, y generando

dímeros de celobiosa como productos de su hidrólisis. b) Las celobiohidrolasas

(CBHs), exo-1,4-β-glucanasas ó simplemente exoglucanasas, actúan en los

extremos de las fibras de la celulosa y en los sitios creados por la acción de las EGs

generando moléculas de celobiosa y pequeñas cantidades de glucosa. c) Las β-

   

4  

glucosidasas, por otro lado, hidrolizan las moléculas de celobiosa que fueron

generadas por la hidrólisis de las EGs y CBHs a monómeros de glucosa.

De esta manera, los microorganismos pueden utilizar los productos generados

por la hidrólisis de la celulosa como fuente de carbono para el crecimiento (Cullen y

Kersten, 1992; Pérez et al., 2002; Rabinovich et al., 2002).

2.4. Microorganismos relacionados con actividad celulolítica

Las celulasas son producidas por una variedad de bacterias y hongos aeróbicos o

anaeróbicos, mesófilos o termófilos. Sin embargo, sólo algunos de ellos producen la

enzima celulasa extracelular que es capaz de hidrolizar la celulosa (Ljungdahl y

Eriksson, 1985; Marsden y Gray, 1986; Bhat y Bhat, 1997; Dongowski et al., 2002).

A partir de los hongos aeróbicos, tales como: Trichoderma viride, Trichoderma

reesei, Penicillium pinophilum, Sporotrichum pulverulentum, Fusarium solani,

Talaromyces emersonii y Trichoderma koningii, se han obtenido los complejos

celulolíticos utilizados en la mayoría de los estudios (Eriksson y Wood, 1985), debido

a que presentan un sistema enzimático completo de celulasas capaces de degradar

parcial o totalmente la celulosa en celobiosa y glucosa (Ryu y Mandels, 1980). Entre

estos microorganismos, el hongo filamentoso Trichoderma reesei se caracteriza por

la efectividad que tiene en la degradación de la celulosa nativa y cristalina con el

complejo celulolítico que produce y secreta, el cual presenta las tres actividades

necesarias para la hidrólisis de la celulosa (endo-β-1,4-glucanasa, exo-β-1,4-

glucanasa y β-1,4-glucosidasa) (Ben-Ghedalia y Miron, 1981). También, las celulasas

de T. reesei tienen la ventaja de que son resistentes a inhibidores químicos y

estables en reactores agitados bajo condiciones de pH 4.8 a 50ºC durante 48 horas

(Ryu y Mandels, 1980).

Otros microorganismos productores de celulasas incluyen a los hongos

anaeróbicos mesofílicos: Neocallimastix frontalis, Piromonas communis,

Sphaeromonas communis, las bacterias aeróbicas mesofílicas y termofílicas:

Cellulomonas sp., Cellvibrio sp., Microbispora bispora y Thermomonospora sp., y las

   

5  

bacterias anaeróbicas mesofílicas y termofílicas: Acetivibrio cellulolyticus,

Bacteroides succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens y

Clostridium thermocellum (Koeck et al., 2015; Sangkharak et al., 2012; Beguin y

Aubert, 1993). Entre estos microorganismos, los termofílicos son de interés por su

capacidad para producir enzimas celulolíticas termoestables, las cuales son en

general estables bajo condiciones severas, incluso en valores de pH altamente

ácidos o alcalinos así como temperaturas de hasta 90 °C (Lamed y Bayer, 1988;

Sugden y Bhat, 1994).

Por otro parte, las enzimas celulolíticas producidas por las bacterias del

género Bacillus presentan básicamente actividad de endo-β-1,4-glucanasa y exo-β-

1,4-glucanasa; y tienen una característica particular, en especial las enzimas

producidas por B. subtillis y es que no son inhibidas por la presencia de la glucosa o

celobiosa (Ljungdahl y Eriksson, 1985). El pH óptimo para la actividad de las

celulasas producidas por bacterias abarca un amplio margen. Mientras que, las

celulasas producidas por hongos son activas generalmente a un pH ácido (Howard et

al., 2003).

Para producir celulasas a gran escala se han utilizado principalmente los

hongos mesófilos y termófilos por su capacidad de secretar cantidades considerables

de enzimas al medio (Howard et al., 2003; Ovando y Waliszewski, 2005). Sin

embargo, en los últimos tiempos se ha dirigido el enfoque hacia la producción de

celulasas en bacterias, ya que éstas presentan tiempos de generación cortos,

versatilidad bioquímica, facilidad de manipulación genética y adaptabilidad a diversas

condiciones ambientales, comparadas con los hongos.

2.5. Enzimas y mecanismo involucrado en la degradación de celulosa.

El mecanismo ampliamente aceptado para explicar la hidrólisis enzimática de la

celulosa por parte de los hongos y las bacterias involucra la acción enzimática de

   

6  

tres enzimas: la endo β-1,4 glucanasa (β-1,4 glucano glucanohidrolasa), la exo β-

1,4 celobiohidrolasa y la β-1,4 glucosidasa.

La endo β-1,4 glucanasa hidroliza aleatoriamente los enlaces β-1,4

glucosídicos intramoleculares accesibles de cadena de celulosa para producir

oligosacáridos de varias longitudes. La exo β-1,4 celobiohidrolasa rompe los

extremos no reductores del sustrato generando unidades de celobiosa o glucosa y

por último la β-1,4 glucosidasa, completa el proceso hidrolítico convirtiendo los

fragmentos de celobiosa en glucosa o removiendo unidades de glucosa desde los

extremos no reductores (Figura 1) (Lynd et al., 2002; Zhang et al., 2006). En los

últimos años se ha descrito una variante al mecanismo en algunas bacterias y

hongos, en el cual la enzima endo β-1,4 glucanasa tiene la capacidad de actuar

sobre toda la cadena de celulosa sin necesidad de la acción de la enzima exo β-

1,4 celobiohidrolasa, ya que se han descrito microorganismos que carecen de

dicha enzima pero tienen la capacidad de hidrolizar celulosa cristalina.

Las enzimas celulolíticas pertenecen a la ampliamente distribuida familia de

las glucosil hidrolasas (GHs), familia de enzimas implicadas en el metabolismo de

carbohidratos en una gran diversidad de organismos (Henrissat y Davies, 1997).

De acuerdo a características catalíticas, bioquímicas y genéticas, las enzimas

endoglucanasas y exoglucanasas se encuentran distribuidas en las familias GH5,

6, 8, 9, 12, 44, 45 y 48 principalmente, mientras que enzimas β-glucosidasas se

encuentran en las familias GH1 y GH3 (Berlemont, y Martiny, 2013).

2.6. Endo-1,4-β-glucanasas Las endo-1,4-β-glucanasas rompen los enlaces glucosídicos internos de la

celulosa en forma aleatoria, lo que provoca una rápida disminución en la longitud

de la cadena de los β-glucanos con un incremento lento de los grupos reductores

(Wood, 1989). Estas enzimas han sido reportadas en una gran diversidad de

organismos entre los que destacan los hongos y las bacterias.

   

7  

   Figura 1. Mecanismo implicado en degradación de celulosa: endoglucanasas, celobiohidrolasas y β-glucosidasas (Koeck et al., 2014).

Las endoglucanasas son clasificadas en familias de acuerdo a sus

propiedades hidrofóbicas (Henrissat et al., 1989) y su dominio catalítico (Gilkes et

al., 1991). Las endoglucanasas están distribuidas en 16 de las 118 familias de

glucosil hidrolasas. La familia 5 de las glucosil hidrolasas es una familia altamente

divergente en términos de función con un gran número de miembros, incluyendo

más de 240 endoglucansas diferentes (CAZy database, www.cazy.org). Los

miembros de esta familia tienen una muy baja identidad a nivel de secuencia, y

solo ocho aminoácidos están conservados (Wang et al., 1993), normalmente

caracterizada por un dominio de unión a celulosa CBM3.

Sus sustratos incluyen a la carboximetilcelulosa (CMC) y a la celulosa amorfa

tratada con H3PO4 o álcali, la acción de las endoglucanasas en este sustrato

celulósico se caracteriza por la disminución de la viscosidad como resultado de los

cortes intramoleculares que realiza (Zhang et al., 2006). Además la tasa de hidrólisis

está condicionada a la habilidad de las endoglucanasas para actuar en las regiones

amorfas de la matriz cristalina de la celulosa y crear nuevos extremos reductores en

los cuales las exoglucanasas puedan actuar (Malherbe y Cloete, 2002).

La celulosa cristalina, así como las fibras de algodón o el avicel no son

atacadas de manera efectiva por esta enzima. El porcentaje de hidrólisis de

celooligosacáridos de cadenas largas es alta y se incrementa en el grado de

polimerización, siendo la celobiosa el principal producto de la reacción (Wood et al.,

1988). Sin embargo, en algunas bacterias y hongos se ha reportado la presencia de

enzimas endoglucanasas con la capacidad de actuar sobre este tipo de sustratos

anteriormente conocidos como específicos para exoglucanasas.

La medición de la actividad de endoglucanasa, puede ser basada en la

reducción de la viscosidad del sustrato y/o en el incremento de extremos reductores

que se determinan por técnicas que permitan medir azúcares reductores.

Considerando que la actividad de las exoglucanasas también incrementa el número

de extremos reductores, es recomendable que la actividad de las endoglucanasas

sea medida por ambos métodos (viscosidad y extremos reductores) (Lynd et al.,

2002).

Por otro lado, dicha actividad puede ser fácilmente detectada en medios con

CMC o celulosa y adición de varios colorantes como el rojo Congo, debido a que

estos son adsorbidos solo por largas cadenas de polisacáridos. Este método es

semi- cuantitativo y muy adecuado cuando se requiere procesar un gran número de

muestras (Teather y Wood, 1982).

   

9  

2.7. Exo-1,4-β-glucanasas Las exo-1,4-β-glucanasas, también llamadas celobiohidrolasas, actúan cortando la

celobiosa del extremo no reductor de la cadena y en algunas ocasiones liberan

pequeñas cantidades de glucosa. El porcentaje de hidrólisis de la celobiosa y de

celoligosacáridos de cadenas largas se incrementa con el grado de polimerización de

las mismas (Félix, 1993; Warren, 1996; Wood et al., 1988). La celulosa

microcristalina (Avicel) es un sustrato adecuado para la medición de esta actividad

por tener un bajo grado de polimerización y una baja accesibilidad (Lynd et al., 2002;

Zhang et al., 2006). Las celobiohidrolasas exhiben una acción sinérgica altamente

cooperativa en presencia de endoglucanasas (Gaitán y Pérez, 2007; Wachinger et

al., 1989). Se encuentran ampliamente distribuidas en distintas familias de las

enzimas glucosilhidrolasas, entre las que destacan la GH5, 6, 7, 8, 9, 12 entre otras.

Estas enzimas son producidas por hongos principalmente, sin embargo, existen

algunos reportes de bacterias que las producen, como es el caso de Cellulomonas

flavigena, Thermobifida fusca, Caldicellulosiruptor saccharolytic, entre otras, aunque

por otra parte, existe una gran cantidad de bacterias que carecen de la producción de

enzimas de este tipo, como es el caso de bacterias del género Bacillus y

Saccharophagus.

2.8. β-glucosidasas

Las β-glucosidasas no son propiamente celulasas. No obstante, son componentes

muy importantes de los sistemas celulolíticos, ya que terminan la hidrólisis de

cadenas pequeñas de celoligosacáridos y de celobiosa, liberados por otras enzimas,

hasta glucosa. Los sistemas celulolíticos con niveles bajos de β- glucosidasa, tienen

una baja actividad, debido a la inhibición de las endoglucanasas y celobiohidrolasas

por la celobiosa. No son específicas para enlaces β-1,4 (Félix, 1993; Wood y Bhat,

1988). La tasa de hidrólisis disminuye con el incremento en el grado de

polimerización del sustrato. La actividad de esta enzima puede ser medida usando

celobiosa, la cual no es hidrolizada por las endoglucanasas ni exoglucanasas (Lynd

et al., 2002). Se encuentran distribuidas en diversas familias de las enzimas

glucosilhidrolasas, ubicándose la mayoría de los reportes en las familias GH1 y GH3.

   

10  

2.9. Aplicaciones de enzimas celulolíticas a nivel industrial

Las enzimas celulolíticas presentan una gran diversidad de aplicaciones, entre las

que se puede citar las siguientes (Ovando- Chacón y Waliszewski, 2005):

• En la industria textil, las celulasas juegan un papel muy importante en el

desteñido de telas de mezclilla ya que se usan para remover el color azul

índigo y dar una apariencia de desteñido reduciendo el daño a las telas.

• Las celulasas también son utilizadas en la industria de los detergentes. Estas

enzimas degradan las microfibrillas que se separan parcialmente de las fibras

principales, restituyendo a las fibras una superficie suave y a la prenda su

color original.

• Dentro de la industria alimenticia, las celulasas se usan para favorecer la

extracción y filtración de jugos de frutas o verduras, filtración de mostos,

extracción de aceites comestibles, entre otras aplicaciones.

• Otra aplicación de la celulosa y celulasas es en la obtención de

biocombustibles. Los residuos vegetales son el recurso renovable más grande

que existe, y se considera que más del 85% de los residuos agrícolas y

agroindustriales son de este tipo (Cruz et al., 2009). La producción de

bioetanol de segunda generación a partir de materia lignocelulósica como

residuos agrícolas (tallos, hojas, rastrojos, etc.), hierbas, cultivos leñosos y

desechos de papel, presenta ventajas económicas, ambientales y

estratégicas, debido a se puede producir a gran escala, para ser utilizado en la

elaboración de productos químicos o en la producción de biocombustibles

(Kim y Dale 2004; Chandel y Singh, 2011).

2.10. Aspectos moleculares implicados en la actividad celulolítica

Todas las enzimas celulolíticas son glucosilhidrolasas (GH) que utilizan el mismo

mecanismo catalítico de catálisis acido-base (Davies y Henrissat, 1995). Existen dos

tipos comunes de sitio activo en las celulasas. Celulasas con sitio activo abierto tipo

hendidura típicamente exhiben actividad endocelulolítica, actuando en cualquiera de

los enlaces internos a lo largo de la molécula de celulosa. Por otro lado, las celulasas

que presentan un sitio activo tipo túnel exhiben actividad exocelulolítica, actuando

   

11  

sobre los extremos de la molécula de celulosa y produciendo oligosacáridos (Kurasin

y Valjamae, 2011). Generalmente, las exocelulasas son enzimas procesivas, es

decir, que se unen a la cadena de celulosa y no se desprenden hasta que la cadena

este completamente hidrolizada, mientras las endocelulasas pueden ser procesivas y

no procesivas (Becham et al., 2011).

Las enzimas celulolíticas se caracterizan por contar con un domino catalítico

(en el cual se encuentra el sitio activo) y un péptido señal (el cual funciona como una

señal de reconocimiento para la secreción de la proteína al medio extracelular). Sin

embargo, muchas celulasas son proteínas multidominio, y además de contar con un

dominio catalítico, presentan dominios accesorios tales como módulos de unión a

celulosa (CBMs). La función principal de estos dominios accesorios es ayudar a las

celulasas a unirse a la celulosa y facilitar la procesividad (Fontes y Gilbert, 2010;

Shoseyov et al., 2006) Figura 2.

Todas las celulasas conocidas se encuentran principalmente dentro de 12

familias de glucosilhidrolasas (GH) de la base de datos CAZy. Las familias GH5 y

GH9 tienen el mayor número de celulasas caracterizadas bioquímicamente, esto

podría ser debido a que celulasas de esas familias son abundantes en el modelo

celulolítico bacteriano. A su vez, se han reportado enzimas bifuncionales

presentando actividad endo y exocelulasa dentro de una misma proteína (Han et al.,

1995; Zhao et al., 2012).

2.11. Antecedentes de genes implicados en actividad celulolítica

Existen dentro de la literatura algunos reportes acerca de genes relacionados con

actividad celulolítica. Se han identificado y caracterizado dichos genes con la

finalidad de conocer el mecanismo por el cual están regulados. Dentro de estos

estudios se citan los siguientes:

• Chen et al, (2014) trabajaron con el hongo filamentoso Trichoderma reesei, y

llegaron a la conclusión que la producción de enzimas celulolíticas está

regulada a nivel transcripcional. La transcripción de genes de celulasas es

   

12  

inducida por celulosa y sus derivados, así como por lactosa, L-sorbosa, y está

sujeta a represión catabólica de carbono.

 

Figura 2. Estructura de las enzimas celulolíticas. Propiedades estructurales características (Fontes y Gilbert, 2010; Shoseyov et al., 2006).

 

• Saibi et al., (2011) determinaron que la expresión diferencial de β-

glucosidasas en Stachybotrys microspora, está relacionada con la fuente de

carbono empleada, ya que en sus estudios la expresión de genes bglG

pertenecientes a la familia 3 de las enzimas glucosil hidrolasas fue inducida

utilizando glucosa como fuente de carbono, caso contrario para enzimas

pertenecientes a la familia 1, donde la expresión resultó reprimida.

• En C. flavigena se aisló el gen celcflB, el cual produce una endo-β-1,4-

glucanasa. Al caracterizar dicho gen, la expresión fue inducida utilizando

bagazo de caña de azúcar como fuente de carbono, y reprimida utilizando

glucosa como única fuente de carbono, con lo cual se sugiere que dicho gen

es regulado a nivel transcripcional (Gutiérrez-Nava et al., 2003).

   

13  

• Wang et al, (2015) desarrollaron un análisis transcriptómico del hongo

celulolítico modelo Neurospora crassa sometiéndolo a 5 diferentes residuos

agrícolas como fuente de carbono, algo interesante que encontraron es la

homogeneidad que dicho hongo presenta frente a los diferentes tipo de

residuo (a pesar de las diferencias en su composición química), ya que se

detectaron grupos de genes (regulones) que se expresaron de igual manera

en las 5 condiciones, en especial genes relacionados con el metabolismo de

polisácaridos, con esto, dicho hongo pudiese ser aprovechado para la

producción de enzimas de interés biotecnológico, utilizando indistintamente

una diversidad de residuos agrícolas, ya que al parecer para este

microorganismo el tipo de residuo no contribuye a una expresión diferencial

entre las 5 condiciones.

• Zhang y Hutcheson (2011) detectaron en S. degradans actividad

endoglucanasa máxima después de 24 h de crecimiento en medio con avicel

como única fuente de carbono, coincidiendo con el más alto nivel de

transcritos de los genes Cel5A, Cel5H y Cel5I, el cual se presentó después de

24 de inducción bajo la misma condición, sugiriendo que estos genes

pudiesen ser los responsables de dicha actividad.

• Zhang et al., (2011) observaron actividad β-glucosidasa máxima en fase de

crecimiento exponencial en avicel como única fuente de carbono, de igual

manera detectaron el nivel de trascritos mas alto de los genes Bgl3C y Bgl1A

durante la misma fase de crecimiento, sugiriendo a estos como probables

candidatos de la actividad hidrolítica detectada en S. degradans.

Todos los trabajos de investigación antes mencionados han servido como

base o han brindado bases para otros trabajos de investigación y enfoques a nivel

industrial, ya que conocer cómo se encuentran estructurados los genes de interés y

como se lleva a cabo su regulación, permiten manipular la producción de enzimas

celulolíticas.

   

14  

2.12. Regulación génica de la actividad celulolítica en microorganismos

La producción de celulasas es estrictamente regulada por represión catabólica, este

mecanismo completo de inducción y represión ayuda a los microorganismos a

guardar la energía que no es requerida cuando tiene que ser usada como una fuente

industrial de celulasas. Como ya se ha mencionado anteriormente, se ha reportado que la regulación

en la producción de celulasas por hongos y bacterias está dada a nivel

transcripcional, es decir, que existen moléculas efectoras sobre el inicio de la

transcripción de los genes implicados.

En el sistema celulolítico Trichoderma reesei, se ha reportado la producción de

ocho endoglucanasas (EGLI, EGLII, EGLIII, EGLIV, EGLV, EGLVI, EGLVII, EGLVIII),

dos celobiohidrolasas (CBHI Y CBHII) y dos β-glucosidasas (BGLI, BGLII). Los genes

que codifican para estas celulasas son regulados a nivel transcripcional por los

productos de celulasas expresadas basalmente, es decir, en condiciones no

inductoras (Figura 3). En este sistema celulolítico, los genes de celulasas son

reprimidos en presencia de glucosa mediante represión catabólica (CCR) mediada

por los factores CREI y CreA, dichos genes son inducidos por celulosa y sus

derivados. Tres posibles sitios de unión del factor CREI presentes en la región de -

674 a -724 del promotor del gen cbh1 (el cual codifica para una celobiohidrolasa), se

considera que están involucrados en la represión por glucosa dependiente de la

afinidad de unión de la proteína CREI. La proteína Ace2 se une a la secuencia 5'-

GGCTAATAA-3' del promotor del cbh1 (aproximadamente a -783) dirigiendo la

activación de los genes celulolíticos (cbh1, cbh2, egl1, y egl2) y xyn2, en cultivos

inducidos con celulosa (Liu et al. 2008).

Los sistemas celulolíticos en bacterias también son regulados a nivel

transcripcional. El mecanismo regulatorio para sistemas bacterianos celulolíticos más

común involucra un represor. CebR es un clásico represor de diversos operones del

sistema celulolítico de Streptomyces griseus, el cual responde a celodextrinas. La

expresión del sistema celulolítico de Thermobifida fusca es inducida con celobiosa

mediada por el factor CelR, este factor se une a una repetición invertida de 14 pb

   

15  

para mediar la expresión de genes diana, en algunos casos por represión y en otros

por activación.

El celulosoma en Clostridium utiliza operones de los genes del sistema

celulolítico que son regulados por represores. En Cellulomonas flavigena la inducción

específica de celulasas y xilanasas se ha relacionado con sus sustratos

(carboximetilcelulosa, avicel y xilano) (Zhang y Hutcheson, 2011).

2.13. Género Bacillus como productores de enzimas celulolíticas

Las bacterias del género Bacillus son microorganismos Gram positivos, aerobios o

anaerobios facultativos. Taxonómicamente se encuentran situados dentro del reino

Bacteria, filo Firmicutes, clase Bacilli, orden Bacillales, familia Bacillaceae y género

Bacillus. Una característica importante es que forman endoesporas

extraordinariamente resistentes a condiciones desfavorables, en especial, a

temperaturas altas ( Logan y Turnbull, 2003).

Una gran variedad de especies del género Bacillus producen celulasas,

incluyendo a: B. cereus, B. subtilis, B. licheniformis, Bacillus sp. KSM-330, B.

amyoliquefaciens y Bacillus spp. Alcalofílicas (Thayer y David, 1978; Robson y

Chamblis, 1984; Dhillon et al., 1985; Ozaki e Ito, 1991; Horikoshi, 1984).

Investigaciones recientes están enfocadas en la utilización y mejoramiento de

enzimas provenientes de bacterias para el uso en la industria de los biocombustibles

y bioproductos, y se ha puesto gran interés en aquellas provenientes de bacterias del

género Bacillus (Kim et al., 2012), ya que tienen una característica particular, en

especial las enzimas producidas por B. subtilis, y es la resistencia a ser inhibida por

el producto en este caso por glucosa y celobiosa (Ljungdahl y Eriksson, 1985).

Una característica importante de las enzimas celulolíticas con utilidad a nivel

industrial es su termoestabilidad, actualmente se han logrado aislar bacterias del

género Bacillus que tienen esta capacidad, por ejemplo Annamalai et al. (2012)

purificaron y caracterizaron una celulasa termoestable de una bacteria marina B.

licheniformis que es capaz de crecer en residuos celulósicos.

   

16  

Figura 3. Mecanismo de degradación de celulosa por el sistema celulolítico modelo de Trichoderma reesei (Furukawa et al., 2012; Schmoll y Kubicek 2003; Liu et al., 2008).

Además, en la actualidad existen disponibles numerosos preparados

enzimáticos comerciales grado alimenticio que contienen principalmente actividad

celulolítica endo-β-1,4-glucanasa, exo-β-1,4-glucanasa y β-1,4-glucosidasa. Algunos

de estos preparados enzimáticos son obtenidos de microorganismos entre los que se

encuentra B. subtilis (Bhat, 2000).

2.14. Antecedentes de enzimas y genes implicados en actividad celulolítica en el género Bacillus.

2.14.1. Actividad endoglucanasa

   

17  

Se ha reportado que bacterias del género Bacillus presentan actividad

endoglucanasa, por ejemplo Lee et al., (2008) purificaron y caracterizaron una

endoglucanasa producida por B. amyloliquefaciens DL-3, la cual mostró alta

identidad con celulasas producidas por otras especies del género Bacillus. La

longitud del marco de lectura abierto consistió en 1497 pb codificando para una

proteína de 499 aminoácidos con un peso molecular de 55,118 Da, conformada de

un dominio catalítico correspondiente a la familia cinco de las enzimas glucosil

hidrolasas (GH5), así como un módulo de unión a celulosa tipo tres (CBM3). De igual

manera Yang et al., (2010) clonaron el gen de una endoglucanasa basándose en la

secuencia de ADN de los genes de celulasas reportados en B. subtilis (AY044252,

Z73234, y X04689). El marco de lectura de dicho gen fue de 1,503 pb codificando

una proteína de 501 aminoácidos. De acuerdo a la secuencia de genes relacionados,

esta enzima también corresponde a una glucosil hidrolasa de la familia 5 con un

domino de unión a celulosa tipo 3 (CBM3), ya que estas características estructurales

para endoglucanasas son muy comunes dentro de bacterias del género Bacillus.

Asha y Sakthivel (2014) purificaron y caracterizaron una nueva celulasa

producida por la cepa B. subtilis SU40, esta enzima exhibió propiedades halofílicas,

alcalofílicas y de tolerancia a solventes, además de actuar sobre diversos sustratos

celulósicos, entre ellos CMC y avicel.

2.14.2. Actividad exoglucanasa

Se ha detectado actividad del tipo exoglucanasa en bacterias del género Bacillus.

Kim et al., (2012) detectaron actividad celulolítica sobre avicel (exoglucanasa).

Oliveira et al. (2014) también detectaron actividad exoglucanasa en la cepa Bacillus

sp. SMIA-2 haciéndola crecer en avicel y bagazo de caña de azúcar pretratado como

fuentes de carbono, no hubo diferencias en la producción de enzima entre los dos

tratamientos. Sin embargo, no existen reportes de genes de exoglucanasas o

celobiohidrolasas en bacterias de Bacillus, pero en algunos reportes se ha detectado

degradación de avicel (sustrato específico de exoglucanasas) por parte de

endoglucanasas, atribuyendo esto a la procesividad de las enzimas mediada por los

módulos de unión a celulosa (Kim, 1995), o a la presencia de enzimas bifuncionales

   

18  

(Han et al., 1995; Zhao et al., 2012). Se ha propuesto que posiblemente las bacterias

del género Bacillus poseen un gen que codifica una endoglucanasa (CMCasa) y que

a su vez puede actuar sobre sustratos específicos para exoglucanasas como son el

avicel y celulosa microcristalina (Kim et al., 2012)

2.14.3. Actividad β-glucosidasa

Asha et al. (2015) caracterizaron una β-glucosidasa producida por la cepa Bacillus

subtilis SU40, la cual presentó propiedades de interés industrial como estabilidad en

un amplio margen de pH y temperatura exhibiendo actividad máxima a 75°C y pH 12,

y presentando una alta actividad contra celobiosa y diversos glucósidos.

2.14.4. Regulación de la actividad celulolítica en Bacillus

Se ha reportado que la actividad celulolítica a nivel bioquímico está regulada por

diferentes sustratos, por ejemplo la actividad es inducida por CMC y avicel (Kim et

al., 2012) e inhibida por glucosa. Recientemente, Zhou et al., (2015) detectaron un

incremento en el nivel de transcritos de U712_19750 (fragmento de ADN con posible

actividad endoglucanasa) en la cepa B. subtilis HH2, bajo el efecto de avicel como

única fuente de carbono a las 12 h de incubación, sugiriendo que la regulación de

ésta endoglucanasa es a nivel transcripcional, sin embargo, no reportan la

comparación de los niveles de expresión con análisis de actividad enzimática.

2.15. Antecedentes de enzimas celulolíticas de estudios en CIIDIR-Sinaloa

Beltrán-Arredondo (2013), durante su trabajo de tesis de maestría, generó una

colección de microorganismos de rastrojo y rizósfera de maíz aislados en Sinaloa.

Mediante una serie de pruebas tanto cualitativas como cuantitativas, seleccionó cinco

aislados, los cuales mostraron actividades celulolíticas sobresalientes, denominados:

RZ164, RS241, RS273, R315 y RS351.

Dentro del grupo de cinco aislados seleccionados las actividades máximas del

tipo endoglucanasa fueron las presentadas en el Cuadro 1, valores comparables con

los de otros autores, por ejemplo, Afzal et al. (2010) evaluaron la actividad

endoglucanasa de una cepa de Bacillus sp., obteniendo la máxima hidrólisis de

   

19  

CMC a 60°C y pH 7, con una actividad de 20 UI/mL, siendo este valor de actividad

endoglucanasa menor a los obtenidos para los cinco aislados.

En lo que respecta a la actividad exoglucanasa, los resultados máximos son

comparables con los obtenidas por otros autores, por ejemplo, Kim et al. (2009),

reportaron valores inferiores a los de este estudio en la actividad exoglucanasa

utilizando papel filtro como sustrato (17 UI/mL), también Assareh et al. (2012)

detectaron una actividad máxima de 90.74 UI/mL, cuyo valor es muy cercano a las

máximas actividades exoglucanasa de los aislados RZ164 y RS273.

Cuadro 1. Resumen de actividades de los cinco aislados seleccionados por Beltrán-Arredondo en el 2013.

 

 

No de aislado

Actividad Endoglucanasa

UI/mL

Actividad Exoglucanasa

UI/mL

Actividad Glucosidasa

UI/mL RZ164 53.02 184.03 94.81

RS241 55.83 188.02 60.89

RS273 26.86 168.87 97.84

R315 40.03 164.24 86.83

RS351 60.92 243.09 79.33

   

20  

3. JUSTIFICACIÓN

Las enzimas celulolíticas son de importancia económica debido a sus aplicaciones

biotecnológicas en procesos de la industria alimentaria, textil, papel y

biocombustibles.

Existen numerosos estudios en lo que se refiere a la caracterización

bioquímica de las enzimas celulolíticas, además, en la literatura existen reportes

acerca de genes relacionados con actividad celulolítica en hongos y bacterias. Se

han identificado y caracterizado dichos genes con la finalidad de conocer los

mecanismos moleculares implicados en su regulación.

Los microorganismos aislados en Sinaloa presentaron niveles de actividad

celulolítica competitivos comparados con estudios previos. Para utilizar estas

enzimas en probables aplicaciones biotecnológicas el primer paso es su

caracterización a nivel molecular, por lo tanto, se requiere conocer que genes están

implicados, si dicha actividad está relacionada con su estructura, y si su regulación

es a nivel transcripcional por diferentes fuentes de carbono. De esta forma, se

obtendrán las bases moleculares para proyectos de investigación posteriores

encaminados a una caracterización bioquímica mas detallada y al mejoramiento de la

producción de enzimas celulolíticas, considerando la importancia económica que esto

implica.

   

21  

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Identificar y caracterizar los genes relacionados con la actividad de endo -1-4,

β- glucanasas, exo -1-4, β- glucanasas y β- glucosidasas en 3 bacterias del

género Bacillus (RZ164, RS273 y RS351).

4.2. Objetivos específicos

1) Identificar taxonómicamente los aislados RZ164, RS273 y RS351 mediante

herramientas moleculares.

2) Identificar y seleccionar mediante herramientas bioinformáticas los genes que

codifican para la actividad celulolítica en el genoma de especies del género

Bacillus.

3) Analizar la secuencia de los genes que codifican para la actividad celulolítica

en aislados del género Bacillus.

4) Cuantificar el nivel de expresión del gen eglS en los aislados RZ164, RS273 y

RS351 crecidos en medio con CMC y avicel como única fuente de carbono.

   

22  

5. HIPÓTESIS

La actividad celulolítica de los aislados de Bacillus está regulada a nivel

transcripcional por la fuente de carbono utilizada.

   

23  

6. MATERIALES Y MÉTODOS

6.1. Microorganismos y medio de cultivo Se decidió enfocar nuestro estudio en tres aislados (RS273, RS351 y RZ164) que

fueron los que presentaron mayor actividad endoglucanasa, exoglucanasa y β-

glucosidasa de los aislados con actividad celulolítica sobresaliente obtenidos por

Beltrán-Arredondo, 2013. La selección fue de acuerdo a que el aislado RS351

presentó la mayor actividad endo y exoglucanasa y RS273 y RZ164 presentaron la

mayor actividad β-glucosidasa. Dichas bacterias son cultivadas en medio LB a 30°C

y 200 rpm durante un periodo de incubación de 24, 48, 72, 96 y 120 h.

6.2. Identificación a nivel molecular de los aislados (RS351, RS273 y RZ164)

Para identificar las bacterias de interés en este trabajo, se amplificó un fragmento del

gen 16S ADNr de 1500 pb mediante PCR. Para eso se utilizaron los oligonucleótidos

universales siguientes: 27F: 5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 y 1522 R: 5-

AAGGAGGTGATCCARCCGCA-3 (Kim et al., 2012). Para la amplificación se utilizó un

termociclador C1000 touch BIORAD con los siguientes parámetros: 4 minutos a

94°C, seguido de 30 ciclos de 1 minuto a 94 °C, 30 s a 55 °C, 1 minuto a 68 °C con

una extensión final por 10 minutos a 68°C. Las secuencias obtenidas fueron

comparadas mediante el programa BLAST del Centro Nacional de Información

Biotecnológica (NCBI) en conjunto con la comparación contra las secuencias de la

base de datos Ribosomal database Project (RDP)(Cole et al., 2009).

6.3. Identificación y selección mediante herramientas bioinformáticas de los genes que codifican para la actividad celulolítica en el genoma de especies del género Bacillus

Una vez identificados los aislados RS273, RS351 y RZ164 como B. subtilis, se eligió

como modelo el genoma de la cepa B. subtilis 168 y se seleccionaron genes de

referencia reportados para las tres actividades en bacterias del género Bacillus con la

finalidad de que sirvieran como modelo para identificar los genes responsables de la

actividad celulolítica en dicho genoma: (AY044252, Z73234, X04689, M96979), los

   

24  

cuales se buscaron mediante blastx y blastp en las bases de datos exclusiva para

B. subtilis BsubCyc (Barbe et al., 2009). A su vez, se hicieron búsquedas en la base

de datos BsubCyc de acuerdo a la ontología génica (GO) teniendo en cuenta los

criterios de función celular del gen, rol en procesos biológicos y anotación de cada

gen. También se realizaron búsquedas en dicha base de datos a través del número

de EC (Enzyme commission ontology):  EC: 3.2.1.4 para endo-1,4-β-glucanasa, EC:

3.2.1.91 para exo-1,4-β-glucanasa y EC: 3.2.1.21 para β-glucosidasa EC: 3.2.1.21,

teniendo como criterio que estas enzimas son hidrolasas y que actúan como

glucosilasas. Además mediante la herramienta Regulatory Overview de la base de

datos BsubCyc, revisamos si este listado de genes anotados como celulolíticos no se

encontraban arreglados formando un operón, es decir, que no estuviesen regulados

por un mismo mecanismo. Esta herramienta nos permite buscar si un determinado

gen se encuentra formando parte de algún operón. Para nuestro interés, la idea era

determinar si este listado de genes celulolíticos o algunos de ellos se encontraban

dentro de un mismo operón, ya que este resultado nos facilitaría entender el

mecanismo de regulación génica en la degradación de celulosa, sin embargo se

observó que estos genes no se encontraban dentro de un mismo operón, esto

también fue corroborado al revisar la localización de cada gen en el genoma (datos

no mostrados), donde observamos que ninguno de los genes se encuentra anterior o

posterior de otro del listado.

Mediante estas búsquedas se obtuvieron genes candidatos como responsables de la

actividad celulolítica en Bacillus, los cuales fueron seleccionados en base a los

siguientes criterios: Identidad (%Id), presencia de dominios característicos (dominio

catalítico y dominio de unión a celulosa) mediante la herramienta Expasy-

SUPERFAMILY HMM Search y Conserved Domain Database (CDD) del NCBI

(Gasteiger et al., 2003).

6.4. Análisis de la secuencia de los genes que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus

Las cepas aisladas fueron cultivadas en medio líquido LB a 30 °C y 200 rpm para

tener suficiente biomasa para la extracción de ADN. La extracción se llevó a cabo

   

25  

con el reactivo DNazol y técnicas convencionales para microorganismos (Sambrook

et al., 1989).

Para amplificar los genes de interés, se diseñaron oligonucleótidos de acuerdo

a las secuencias de los genes identificados en el genoma correspondiente o bien en

bases de datos a través del programa Primer3plus de acuerdo a los genes de

referencia mencionados en el punto anterior. Se utilizó ADN total de las bacterias en

estudio y se llevaron a cabo reacciones de PCR para amplificar y obtener los genes

de interés. Se llevaron a cabo 3 reacciones de secuenciación (una con un

oligonucleótido forward, un oligonucleótido reverso y un oligonucleótido interno para

secuenciar la región central del gen) para cada uno de los genes seleccionados para

completar toda la secuencia.

Una vez secuenciados los genes de interés, dichas secuencias fueron

traducidas a proteína median la herramienta Expasy translate tool, se realizaron

alineamientos para comparar las secuencias entre las proteínas de los 3 aislados

objeto de estudio en este trabajo y otras previamente reportados con actividad

celulolítica en Bacillus a través del software MEGA 6.0, con el propósito de identificar

o descartar variaciones o regiones que pudiesen explicar la actividad dentro del

grupo de enzimas, y especialmente ubicar la presencia de dominios característicos

como el dominio catalítico y dominio de unión a celulosa Figura 2. A su vez, a partir

de los alineamientos obtenidos se generaron arboles filogenéticos utilizando el

método Neighbor Joining con un soporte estadístico de 1000 réplicas bootstraps,

esto último con la finalidad de ubicar la relación entre nuestras secuencias y otras

previamente reportadas.

6.5. Curva de crecimiento y determinacion de actividad celulolítica de los aislados del género Bacillus en dos diferentes fuentes de carbono

Para evaluar el efecto de la fuente de carbono en la actividad celulolítica, se partió de

los aislados almacenados en medio LB sólido a 4°C, los cuales fueron resembrados

en placas Petri con medio agar LB, para posteriormente realizar un inóculo en medio

LB líquido, éste se preparó en tubos para cultivo de 16 x 150 mm, que contenían 15

   

26  

ml de medio, a los cuales se les inoculó una colonia del aislado con un asa estéril. Se

mantuvieron en incubación a 30°C y 200 rpm durante 16 h. Una vez transcurrido el

tiempo de incubación del inóculo hasta obtener una densidad óptica de 1.0 se

efectuó el cultivo en matraz, inoculando el 5% de los aislados en matraces

Erlenmeyer de 500 ml que contenían 100 ml de medio CMC al 1% y avicel al 1%,

incubándose a 30°C y 200 rpm durante 120 h, se realizaron tres réplicas biológicas

para cada uno de los aislados. Se tomaron muestras cada 24 h; 5 ml por cada tiempo

para la cuantificación de UFC, determinación de actividad celulolítica y extracción de

ARN.

Posteriormente se realizó el conteo de UFC en placa mediante técnicas

microbiológicas convencionales.

Para la determinación de actividad enzimática las muestras se centrifugaron

durante 20 min a 1000 rpm, para obtener el líquido post-cultivo libre de células.

La actividad endo β-1,4 glucanasa o CMCasa se cuantificó de acuerdo al

protocolo de Stutzenberger (1972); se utilizaron los líquidos post-cultivo libre de

células, obtenidos por centrifugación. Se tomaron 200 µl del sobrenadante de cada

aislado seleccionado, se adicionaron 875 µl de CMC al 1% y 25 µl de amortiguador

acetato de sodio 1.0 M con pH 6.0. Se incubaron a 50 °C durante 50 min.

Posteriormente, se midió la liberación de azúcares reductores por el método de DNS

utilizado anteriormente (Miller, 1959).

La actividad exo β-1,4 glucanasa se determinó por el método de Stutzenberger

(1972). El ensayo consistió en colocar en un tubo de ensayo 12.5 mg de papel filtro

Whatman No.1 al cual se le añadieron 200 µl de amortiguador de acetato de sodio

0.6 M (pH 6.0) y 800 µl de líquido libre de células. Se incubaron a 50 °C durante 50

min y se determinó la liberación de azúcares reductores.

Para la actividad β-1,4 glucosidasa se utilizaron 250 µl de sobrenadante y 250

µl de salicina 10mM en amortiguador de acetato de sodio 1M (pH 6). Se incubaron

   

27  

bajo las mismas condiciones que los casos anteriores y se determinó la liberación de

azúcares reductores (Bernier y Stutzenberger, 1989).

Las actividades enzimáticas se calcularon de acuerdo a la fórmula reportada

por Silveira et al. (2012), para el cálculo de la actividad endoglucanasa,

exoglucanasa y β-glucosidasa, los azúcares reductores del tiempo cero fueron

restados a los valores de los tiempos de incubación 24, 48, 72 y 120 h. Las

actividades enzimáticas se expresaron en unidades internacionales (UI) por ml,

considerando una unidad como la cantidad de enzima que libera 1µmol de glucosa

por minuto.

6.6. Cuantificación el nivel de expresión del gen eglS bajo el efecto de dos fuentes de carbono

De cada una de las condiciones analizadas se realizaron extracciones de ARN total

mediante la técnica sugerida para el Reactivo Trizol acoplado a perlitas de vidrio. La

presencia del ARN fue detectada mediante gel de agarosa al 1% y la calidad fue

evaluada mediante espectro utilizando el Nanodrop 2000. A partir del ARN obtenido

se sintetizó ADNc mediante la enzima retrotranscriptasa Super Script III de Invitrogen

utilizando hexámeros random. Se diseñaron oligonucleótidos específicos para PCR-

Tiempo real utilizando el programa en línea Primer3 plus (los primers diseñados en

este estudio se encuentran en el Cuadro 2) utilizando como modelo el gen eglS,

seleccionado en el objetivo número 2. La cuantificación del nivel de expresión del gen

eglS se llevó a cabo mediante la técnica de PCR-Tiempo real utilizando Syber Green

qPCR Supermix (Qiagen) en un termociclador Rotor Gene Q-Pure detector versión

1.7 (Qiagen). Como gen de referencia o gen normalizador se utilizó rpoB de B.

subtilis (Ho et al., 2011) (los oligonucleótidos se presentan en el Cuadro 2). Para

dicho análisis se consideró como condición control el tiempo a las 0 h, teniendo en

cuenta que el inóculo en ese momento proviene de medio LB (condiciones de

sustrato no inductoras) y que en ese momento no hay efecto de fuente de carbono

por sustratos celulósicos (CMC y avicel), esto para revisar si existe un efecto a nivel

trascripcional en la expresión del gen eglS.

   

28  

La relación de la expresión de cada gen se calculó mediante la función 2-∆∆Ct

(método presentado por PE Applied Biosystems [Perkin Elmer, Forster City, CA]),

previa determinación de la eficiencia de la reacción de PCR para cada uno de los

pares de oligonucleótidos utilizados. La eficiencia calculada sustituirá el valor “2” de

la función descrita.

Cuadro 2. Lista de oligonucleótidos para PCR-Tiempo real.

Gen Oligonucleótido Longitud (pb)

Tm (°C) Amplicón Fuente

rpoB F-CAA ACC GTG GCG CAT GGT TAG AAT 24 60.3 83 Ho et al. 2011 R-CGG CAA CTT ACG TGT GCG ATC AAT 24 60.1

16S F-CAA GCG TTG TCC GGA ATT AT 20 53.2 112 Di Pascua et al. 2014 R-CTC AAG TTC CCC AGT TTC CA 20 54.7

eglS1

F-GTT CAC ACG GAT TGC AAT GG 20 54.8 100 Este estudio R-TAC ATC GCT GCA CGG AAA AC 20 55.9

eglS2

F-TTC TCG GCA CCA AAG ATT CG 20 55.4 102 Este

estudio R- CAT CCC CTG CTC TGT ATT GTA C 22 55.0

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

   

29  

7. RESULTADOS 7.1. Identificación molecular de aislados bacterianos

Se amplificó un fragmento de ADN de los aislados bacterianos RS273, RS351 y

RZ164 de alrededor de 1500 pb correspondiente al gen 16S, el cual fue secuenciado

por ambos extremos para obtener finalmente alrededor de 1200 pb. Estas

secuencias se compararon con las bases de datos del NCBI y RDP buscando la

mayor identidad. Como se puede observar en el Cuadro 3, todas las secuencias

analizadas corresponden a bacterias del género Bacillus especie subtilis y coincide

en ambas bases de datos. Se presentan los tres primeros hits obtenidos para cada

aislado. Para algunos casos alguno de los hits corresponde a Bacillus sp., sin

embargo no existen diferencias en los parámetros como Query cover (superficie de

secuencia cubierta en el análisis), valor E (estadístico de identidad, entre más

cercano a 0 mayor identidad) y porcentaje de identidad con otros correspondientes a

B. subtilis. En lo que respecta a la base de datos RDP, los valores mayores del

parámetro S a_b score (coeficiente de identidad, entre más cercano a 1.0 mayor

identidad) corresponden a B. subtilis. Por lo tanto concluimos que los aislados son B.

subtilis.

7.2. Identificación de genes implicados en la actividad celulolítica en Bacillus subtilis 168

Para la búsqueda de los genes implicados en la actividad celulolítica se utilizó como

base el genoma de la cepa B. subtilis 168, teniendo en cuenta que nuestros aislados

de interés son B. subtilis. Se realizaron búsquedas a través del algoritmo Blastp

contra proteínas ya reportadas con las tres actividades que intervienen en la

degradación de celulosa tanto en la base de datos del NCBI, como en la base de

datos BsubCyc la cual es una base de datos exclusiva de la cepa B. subtilis 168

(Barbe et al., 2009), y en dichas búsquedas se consideraron los parámetros de

porcentaje de identidad (%Id), cobertura (query cover) y el valor estadístico E (E

value).

   

30  

Cuadro 3. Lista de los 3 mejores hits arrojados por las bases de datos del NCBI y RDP al comparar los fragmentos del gen 16S ADNr de los aislados RS273, RS351 y RZ164.

Aislado NCBI RDP Organismo Cobertura Valor E % Identidad Organismo Puntaje de identidad

RS273 B. subtilis 99 0.0 100 B. subtilis 0.890

Bacillus sp. 100 0.0 99 B. subtilis 0.889 B. subtilis 100 0.0 99 B. subtilis 0.889

RS351 Bacillus sp. 100 0.0 99 B. subtilis 1.000 Bacillus sp. 100 0.0 99 B. subtilis 1.000 B. subtilis 100 0.0 99 B. subtilis 1.000

RZ164 B. subtilis 99 0.0 99 B. subtilis 0.872 B. subtilis 99 0.0 99 B. subtilis 0.871 B. subtilis 99 0.0 99 B. subtilis 0.868

Además se hicieron búsquedas en la base de datos BsubCyc de acuerdo a la

ontología génica (GO) teniendo en cuenta los criterios de función celular del gen, rol

en procesos biológicos y anotación de cada gen. También se realizaron búsquedas

en dicha base de datos a través del número de EC (Enzyme commission ontology):  

EC: 3.2.1.4 para endo-1,4-β-glucanasa, EC: 3.2.1.91 para exo-1,4-β-glucanasa y EC:

3.2.1.21 para β-glucosidasa EC: 3.2.1.21, teniendo como criterio que estas enzimas

son hidrolasas y que actúan como glucosilasas.

Estas búsquedas nos indican que existen en el genoma de B. subtilis 168: tres

genes anotados con actividad β-1,4-endoglucanasa, cinco genes anotados como β-

glucosidadas y de forma inesperada ningún gen anotado con actividad β-1,4-

exoglucanasa Cuadro 4.

7.3. Selección de genes implicados en la actividad celulolítica en Bacillus subtilis 168

Debido a que se encontró más de un gen anotado para actividad endoglucanasa y

para β-glucosidasa en el genoma de B. subtilis 168, se requirió depurar la lista

seleccionando genes que tuvieran actividad comprobada y propiedades estructurales

características Figura 2.

   

31  

Cuadro 4. Genes con anotación con actividad celulolítica en B. subtilis 168. Genes por actividad y localización en el genoma. Se incluye el porcentaje de identidad con respecto al gen modelo empleado. NI corresponde a genes que no presentaron identidad con genes modelo pero se encontraron anotados en el genoma de B. subtilis 168.

Genes implicados en actividad celulolítica en B. subtilis 168

Actividad endo -1-4, β- glucanasa (EC: 3.2.1.4)

Gen Localización en el genoma %Id contra gen modelo

eglS 1940625 - 1942124 99

yhfE 1095063 - 1096103 NI

ysdC 2950221 - 2951306 NI

Actividad β-glucosidasa (EC: 3.2.1.21)

Gen Localización en el genoma % Id contra gen modelo

licH 3958516 - 3959844 NI

bglA 4121166 - 4122605 34

bglC 370259 - 371292 41

bglH 4032346 - 4033755 34

GmuD 628,630 - 630,027 36

Para dicha selección de genes implicados en la actividad celulolítica en B.

subtilis 168 se utilizó primeramente el algoritmo Blastp de proteínas reportadas en

bacterias del género Bacillus y algunas otras bacterias como C. flavigena, T. fusca,

C. saccharolytic, entre otras.

Además se realizó la búsqueda de dominios característicos para cada tipo de

actividad celulolítica (endoglucanasa, exoglucanasa y β-glucosidasa) (dominio

catalítico, dominio de unión a celulosa, etc) mediante la herramienta Expasy-

   

32  

SUPERFAMILY HMM Search y Conserved Domain Database (CDD) del NCBI

(Gasteiger et al., 2003).

Debido a que en el genoma del modelo B. subtilis 168 no se encontraron

genes anotados con actividad exoglucanasa, decidimos buscar en dicho genoma

proteínas que presentaran identidad (de 0 a 100 % de identidad) con exoglucanasas

previamente reportadas en bacterias, esto con la finalidad de encontrar o descartar la

presencia de una gen que codifique para una exoglucanasa dentro del genoma de la

cepa modelo, por lo que usamos algunas proteínas ya reportadas con dicha

actividad, como fue el caso de T. fusca (Sandgren et al., 2013), C. flavigena (Herrera-

Herrera et al., 2009) y C Saccharolyticus (Thompson et al., 2010). Sin embargo no se

encontraron proteínas relacionadas Cuadro 5.

Para seleccionar los genes que estén implicados en la actividad

endoglucanasa en B. subtilis 168 se utilizó el algoritmo Blastp del NCBI con algunas

proteínas previamente reportadas con dicha actividad en bacterias del género

Bacillus entre las que se incluyeron: egl de B. subtilis DLG (Robson y Chambliss,

1987), BglC de B. amyloliquefaciens (Lee et al., 2010) y una proteína bifuncional

caracterizada en B. Sp DO4 (Han et al., 1995; Zhao et al., 2012).

Cuadro 5. Búsqueda de proteínas homólogas a exoglucanasas bacterianas previamente reportadas en el genoma de B. subtilis 168. NPR=ninguna proteína relacionadas.  

 

 

 

 

Todas las proteínas presentaron alta identidad con una endoglucanasa

codificada por el gen eglS de B. subtilis 168 Cuadro 6. Las otras proteínas predichas

Proteína Bacteria Referencia NCBI BsubCyc

CelB T. fusca Sangren et al., 2012 NPR NPR

CelC C. flavigena Herrera-Herrera et al., 2009 NPR NPR

CelB C. Saccharolyticus Thompson et al., 2010 NPR NPR

   

33  

como endoglucanasas en B. subtilis 168 no presentan identidad con endoglucanasas

del género Bacillus previamente reportadas en la literatura.

Para tener más certeza de que proteínas pudiesen ser la o las responsables

de la actividad endoglucanasa en B. subtilis 168, se realizó la búsqueda de dominios

característicos. De las proteínas codificadas por los tres genes anotados como

celulolíticos solo la codificada por el gen eglS presenta los dominios característicos

de las endoglucanasas del género Bacillus Cuadro 7.

Las proteínas codificadas por los genes yhfE y ysdC presentan dominios no

reportados actualmente en proteínas con actividad endoglucanasa en bacterias del

género Bacillus y no se presentan reportes actuales de su actividad como

endoglucanasas.

Cuadro 6. Búsqueda de endoglucanasas reportadas en bacterias del género Bacillus contra el genoma de B. subtilis 168 en las bases de datos del NCBI y BsubCyc.

Proteína Bacteria Referencia NCBI % Id BsubCyc E

egl B. subtilis DLG Robson y

Chambliss, 1987

Endoglucanasa 94 Endoglucanasa eglS 0

Proteína bifuncional B. sp DO4

Han et al., 1995; Zhao et

al., 2012 Endoglucanasa 99 Endoglucanasa

eglS 0

BglC B.

amyloliquefaciens

Lee et al., 2010 Endoglucanasa 93% Endoglucanasa

eglS 0

 

Para la selección de genes que codifiquen β-glucosidasas en B. subtilis 168,

se buscaron en dicho organismo algunas proteínas previamente reportadas en

bacterias del género Bacillus y algunas bacterias cercanas filogenéticamente entre

   

34  

los que se incluyeron B. circulans, B. polymyxa, B. natto, B. sp, S. degradans, P. sp,

entre otros.

Cuadro 7. Predicción de dominios en endoglucanasas de B. subtilis 168 mediante las herramientas del NCBI y EXPASY. Con letras rojas se presenta la predicción de dominios para el gen modelo que presenta los dominios proteícos característicos de una endoglucanasa de Bacillus.  

Gen NCBI EXPASY

Egl (B. subtilis DLG)

• Celulasa GH5

• CBM3

• β-glucanasa

• Dominio de unión a celulosa familia 3 (CBM3)

eglS • Celulasa GH5

• CBM3

• β-glucanasa

• Dominio de unión a celulosa familia 3 (CBM3)

yhfe • Peptidasa M42/endoglucanasa

• Exopeptidasa dependiente de Zn

• Aminopeptidasa/ glucanasa

ysdC • Peptidasa M42/endoglucanasa

• Exopeptidasa dependiente de Zn

• Aminopeptidasa/ glucanasa

Todas las proteínas empleadas en esta selección presentaron la mayor

identidad con cuatro proteínas codificadas por los genes bglC, gmuD, bglH y bglA, en

este orden de mayor a menor pero con muy poca diferencia en el porcentaje de

identidad Cuadro 8. Algo que resulta importante es que ninguna de las proteínas

empleadas en la búsqueda presentó identidad relevante con la proteína codificada

por el gen licH, siendo el hit mayor de % Id = 21 en una cobertura del 10 %.

Para identificar de forma precisa (estructural y funcional) los genes que

pudiesen ser los responsables de la actividad β-glucosidasa se realizó análisis de

presencia de dominios característicos con las proteínas codificadas por los cinco

   

35  

genes en cuestión. Las proteínas codificadas por los genes bglC, gmuD, bglH y bglH

presentaron un dominio característico y previamente reportado en bacterias del

género Bacillus y otros géneros, el cual consiste en un domino transglucosilasa de la

Familia 1 (GH1) Cuadro 9.

Cuadro 8. Búsqueda de β-glucosidasas bacterianas en el genoma de B. subtilis 168 en las bases de datos del NCBI y BsubCyc.  

β-glucosidasa NCBI BsubCyc

B. circulans, B. polymyxa, B. natto, Bacillus sp,

S degradans, Paenibacillus sp.

bglC bglC

gmud gmuD

bglH bglH

bglA bglA

Cuadro 9. Predicción de dominios en betaglucosidasas de Bacillus subtilis 168 mediante las herramientas del NCBI y EXPASY. Con letras rojas se presenta la predicción de dominios para el gen modelo que presenta el dominio proteico característico de una betaglucosidasa de Bacillus.

Gen NCBI EXPASY

bglA (B. circulans) GH1 TransglucosidasaGH1

bglC GH1 TransglucosidasaGH1

bglA GH1 TransglucosidasaGH1

bglH GH1 TransglucosidasaGH1

licH GH4 LDH Cterm

NAD(P) binding Rossman

gmuD GH1 TransglucosidasaGH1

   

36  

En base a los resultados obtenidos referentes a la identidad y presencia de

dominios característicos, se propone que los genes implicados en la actividad

celulolítica en bacterias del género Bacillus son eglS (para actividad endoglucanasa y

posible exoglucanasa) y bglC, bglA y bglH (para actividad β-glucosidasa).

7.4. Análisis de secuencia de los genes de que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus

Una vez identificados y seleccionados los genes responsables de la actividad

celulolítica en Bacillus, se diseñaron oligonucleótidos específicos para amplificar

cada uno de los genes mediante PCR. En la Figura 4 se muestra un gel de

electroforesis representativo con los genes amplificados (eglS, bglC, bglA y bglH) con

su respectivo tamaño de amplicón.

Figura 4. Gel de agarosa al 2% representativo con los amplicones correspondientes a los genes eglS, BglC, BglA y BglH en los aislados RS273, RZ164 y RS351. Se incluye el tamaño esperado en pb para cada uno de los genes de interés.

   

37  

Se obtuvieron las secuencias de los genes eglS, bglC, bglH y bglA mediante

tres reacciones de secuenciación utilizando un oligonucleótido forward, un

oligonucleótido reverso, y un oligonucleótido interno para secuenciar la región central

del gen, todo esto se realizó para cada uno de los genes en los aislados RS351,

RZ164 y RS273. Posteriormente se desarrolló la traducción de todos los genes a

proteína y se realizaron alineamientos por actividad con otras secuencias

previamente reportadas. En la Figura 5 se muestra el alineamiento múltiple de la

fracción GH5-CBM3 (390 aminoácidos) presente en endoglucanasas del género

Bacillus. Se observa que estas proteínas son muy conservadas en Bacillus,

específicamente en aminoácidos implicados en el sitio activo de la proteína,

marcados con las barras de color negro.

Figura 5. Alineamiento múltiple de la fracción GH5-CBM3 de endoglucanasas del género Bacillus. Marcadas con flechas negras se encuentran especificados los aminoácidos implicados en el sitio activo de la enzima así como aquellos que intervienen en la interacción con celulosa. Marcados con flechas rojas se encuentran los aislados RZ164, RS351 y RS273, los cuales son objeto de estudio de este análisis.  

   

38  

A partir del alineamiento se generó el respectivo árbol filogenético con la

finalidad de revisar de qué manera se agrupan las endoglucanasas obtenidas en este

estudio y las previamente reportadas (Figura 6).

 

Figura 6. Agrupamiento de la fracción GH5-CMB3 de endoglucanasas de bacterias del género Bacillus mostrando relación de cepas de B. subtilis de esta región(RZ164, RS351 y RS273) con otras del género Bacillus previamente reportadas. EL árbol fue construido mediante el método de Neighbor Joining en el Software MEGA 6. Se incluyen los soportes bootstrap (1000 réplicas) y se utilizó la secuencia de la endogucanasa de T. reesei como grupo externo. Marcados con flechas rojas se encuentran las endoglucanasas de los aislados RZ164, RS351 y RS273.

RS351

RZ164

B subt BEC-1

CelL15 B subt LN

eglS Bsubt 168

Bsubt 1986

B subt CK2

B subt A8-8

RS273

Bsubt 115

celG B subt chz1

Bifunctional B sp

B subt AH18

engA B amylo UMAS1002

eglII B amylo PSM3.1

B subt DLG

BglC B amylo FZB42

B subt JA18

B sp VLSH08

B subt BS-2

B amylo TB-2

B amylo TB-5

egl B lichen DSM13ATCC14580

Cel5A B lichen GXN151

eglI Trichoderma Reesei

99

7699

76

72

52

46

25

76

99

75

53

68

95

2964

4437

22

26

34

9

   

39  

En lo que respecta a las β-glucosidasas, en la Figura 6 se muestra el

alineamiento múltiple de β-glucosidasas bacterianas, mostrando los aminoácidos

implicados en el sitio activo. En la Figura 7 se presenta un dendograma mostrando la

relación de las β-glucosidasas obtenidas en este estudio con las de estudios previos.

Cabe mencionar que el árbol carece de robustez debido a la falta de secuencias

disponibles de proteínas que tengan evidencia experimental de funcionalidad.

 

 

Figura 7. Agrupamiento de β-glucosidasas bacterianas pertenecientes a la familia GH1 del género Bacillus y otras bacterias filogenéticamente cercanas. EL árbol fue construido mediante el método de Neighbor Joining en el Software MEGA 6. Se incluyen los soportes bootstrap (1000 réplicas). Marcados con flechas rojas se encuentran las betaglucosidasas de los aislados RZ164, RS351 y RS273.

7.5. Curva de crecimiento y determinación de la actividad celulolítica de los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo diferentes fuentes de carbono

Antes de medir la actividad celulolítica se realizó el conteo en placa de UFC para

revisar en que tiempo se alcanza la fase estacionaria y relacionar las células viables

de cada tiempo con la actividad enzimática presente. En la Figura 8 se muestra el

conteo de unidades formadoras de colonia para los tres aislados crecidos en A) CMC

BglC Bsubt 168

BglC164

BglC 273

BglC 351

BglA Bsubt 168

BglH Bsubt 168

BglH273

BglH351

cba3 C.bazotea

Bgl B sp

bgl Bcirculans

bglA Paenibacillus polymyxa

Bgla Paenibacillus sp

56100

100

9998

99

100 92

100

58

   

40  

y B) avicel como única fuente de carbono. Cabe mencionar que con este conteo

corroboramos que realmente las cepas pueden crecer bajo dichas condiciones de

sustrato, observándose la fase estacionaria a las 24 y 48 h para CMC y avicel

respectivamente en las tres cepas, y que a las 120 h se mantiene aún la presencia

de células viables.

 

 

Figura 8. Cinética de crecimiento de las cepas RZ164, RS273 y RS351 crecidas en A) CMC y B) avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h. El crecimiento bacteriano se reporta en unidades formadoras de colonia (UFC).

 

A continuación se presentan los resultados obtenidos para la actividad

celulolítica en los tres aislados bajo las condiciones antes mencionadas. En la Figura 9A se presentan los resultados para actividad endoglucanasa en medio con CMC

como fuente de carbono, en donde se detectó actividad desde las 24 h en los tres

aislados, y a partir de las 48 h se observa un intervalo donde la actividad es

sobresaliente y máxima en la mayoría de los tiempos. Por otra parte, en medio con

avicel como fuente de carbono la actividad se detectó a partir de las 72 h. Sin

embargo, fue significativamente menor a la obtenida en medio con CMC como fuente

de carbono (Figura 9B), sugiriendo que el CMC es una fuente de carbono más

adecuada para inducir la actividad de la enzima que producen estos aislados de

Bacillus.

   

41  

 

Figura 9. Actividad endoglucanasa de las cepas RZ164, RS273 y RS351 crecidas con A) CMC y B) avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h.

En lo que respecta a la actividad exoglucanasa, en la Figura 10A se observa

que la actividad en CMC se detectó a partir de las 24 h, presentándose la actividad

máxima principalmente entre 72 y 120 h. Esto coincide con lo obtenido por Kim et al.,

(2012), quienes detectaron actividad exoglucanasa máxima después de 72-96 h de

crecimiento en medio con CMC como fuente de carbono en cepas del género

Bacillus. Sin embargo, en medio con avicel la actividad se detectó a partir de las 72 h

siendo esta significativamente menor a la obtenida en medio con CMC (Figura 10B).

 

Figura 10. Actividad exoglucanasa de las cepas RZ164, RS273 y RS351 crecidas con A) CMC y B) avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h.    

   

42  

Finalmente, en la Figura 11A se presenta la actividad β-glucosidasa en medio

con CMC como fuente de carbono. Dicha actividad se detectó a partir de las 24 h

obteniéndose la actividad máxima a partir de las 48 h. Por otra parte, en medio con

avicel la actividad fue significativamente menor a la obtenida en medio con CMC,

observándose perfiles de actividad diferentes entre los tres aislados (Figura 11B).

 

Figura 11. Actividad β-glucosidasa de las cepas RZ164, RS273 y RS351 crecidas con A) CMC y B) avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h.  

7.6. Síntesis de ADNc en los aislados RZ164, RS273 y RS351 Una vez evaluada la actividad celulolítica a nivel bioquímico, se extrajo ARN total de

las tres cepas de interés bajo las mismas condiciones. En la Figura 12 se muestra un

gel de agarosa al 1% en el cual se presentan los ARN de los aislados de interés

crecidos en medio con CMC como única fuente de carbono a las 72 h de incubación,

se incluyen 3 réplicas biológicas de cada una de las cepas. Cabe mencionar que éste

gel es representativo del experimento ya que lo mismo se llevó a cabo para los

tiempos de incubación 0, 24, 48, 96 y 120 h, así como para las mismas cepas

crecidas en medio con avicel como única fuente de carbono durante el mismo

periodo de incubación.

   

43  

 

Figura 12. Gel de agarosa al 1% mostrando los ARNs de las 3 cepas objeto de estudio en este trabajo (RZ164, RS273 y RS351) crecidas en medio con CMC como única fuente de carbono a las 72 h de incubación. Se presentan tres réplicas biológicas para cada una de las cepas. Se llevó a cabo lo mismo para los tiempos 0, 24, 48, 96 y 120 h (resultados no mostrados).

 

Posteriormente, a partir del ARN obtenido se sintetizó ADNc para ser utilizado

como templado en el análisis del gen eglS por PCR-tiempo real. En la Figura 13 se

presentan los amplicones generados a partir de los ADNc de las cepas RZ164,

RS273 y RS351 crecidas en medio con CMC y avicel como única fuente de carbono

durante 120 h de incubación. Podemos observar que el gen eglS se expresa bajo las

condiciones antes mencionadas a partir de las 24 h. Sin embargo, no inferimos

acerca de incremento o disminución del nivel de transcrito del gen, ya que esto se

   

44  

realizó únicamente para comprobar que efectivamente el gen se expresa, sin

presentar evidencia cuantitativa.

Figura 13. Gel de agarosa al 1.8 % mostrando los amplicones generados a partir de los ADNc de las tres cepas objeto de estudio en este trabajo (RZ164, RS273 y RS351) crecidas en medio con CMC y avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h. Se incluye el amplicón esperado para el gen eglS.

 

7.7. Cuantificación del nivel de expresión del gen eglS en los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo el efecto de dos fuentes de carbono

Una vez obtenidos los ADNc correspondientes, se analizó la expresión relativa del

gen eglS bajo las condiciones antes mencionadas. El gen rpoB fue utilizado como

gen normalizador. Para revisar si existe un efecto transcripcional en la regulación del

gen, se consideró el tiempo a las 0 h como control, con la finalidad de analizar el

cambio en el nivel de transcrito en los diferentes tiempos con respecto a una

condición control (tiempo 0), en la cual el inóculo proviene de medio LB, donde no se

presentan condiciones inductoras ni efecto de sustratos celulósicos. En la Figura 14

   

45  

se presenta un gráfico correspondiente al nivel de transcritos del gen eglS durante

120 h de incubación en CMC como única fuente de carbono en los aislados RZ164,

RS273 y RS351. Se observa a las 24 h un incremento en el nivel de transcritos con

respecto a la condición control, posterior descenso a las 48 h y nuevamente un

incremento a las 72 y 96 h, finalmente a las 120 h no existe diferencias con respecto

a la condición control.

 

Figura 14. Nivel de transcritos del gen eglS de los aislados RZ164, RS351 y RS273 en CMC como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h. Las barras corresponden a la desviación estándar de tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas.

En la Figura 15 se presenta el nivel de transcritos del gen eglS en avicel como

única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h de los tres aislados.

Como podemos observar, RS164 y RS273 presentan tendencias de expresión

similares, presentando un incremento en el nivel de transcritos a las 48 h y

posteriomente un descenso a las 72, 96 y 120 h. RS351 presenta de igual manera un

incremento en el nivel de transcritos a las 48 h, un descenso a las 72 h, y de nuevo

un incremento hacia las 96 y 120 h.

0  

5  

10  

15  

20  

25  

0   24   48   72   96   120  

Expr

esió

n R

elat

iva

Tiempo (h)

RZ164  

RS351  

RS273  

   

46  

 

Figura 15. Nivel de transcritos del gen eglS de los aislados RZ164, RS351 y RS273 en avicel como única fuente de carbono en un periodo de incubación de 120 h. Las barras corresponden a la desviación estándar de tres réplicas biológicas y tres réplicas técnicas.

0  

2  

4  

6  

8  

10  

12  

14  

16  

18  

0   24   48   72   96   120  

Expr

esió

n re

lativ

a

Tiempo (h)

RZ164  

RS351  

RS273  

   

47  

8. DISCUSIÓN 8.1. Identificación de los aislados bacterianos

De acuerdo a los resultados obtenidos en la identificación molecular, los aislados de

interés corresponden a B. subtilis y este resultado implica facilidad en su estudio ya

que a la fecha existen bases de datos disponibles. Además, diversos autores han

reportado o asociado cepas B. subtilis con la producción de enzimas celulolíticas

(Yang et al., 2010; Asha y Sakthivel., 2014). Algunas patentes se han desarrollado a

base de enzimas celulolíticas producidas por B. subtilis. Esto es importante ya que

estos aislados se obtuvieron de fuentes baratas y poco aprovechadas (rastrojo de

maíz), potenciando nuevas fuentes de obtención de dichas enzimas.

8.2. Selección de genes implicados en la actividad celulolítica en B. subtilis 168

De acuerdo a los resultados obtenidos, no se presentan genes con posible actividad

exoglucanasa en el genoma de B. subtilis 168, sin embargo, hay reportes de dicha

actividad. Diversos autores reportan actividad sobre avicel (sustrato específico de las

exoglucanasas) en bacterias del género Bacillus, atribuyendo dicha actividad a una

enzima con actividad endoglucanasa (CMCasa). Beltrán-Arredondo en el 2013

determinó actividad exoglucanasa en aislados del género Bacillus utilizando papel

filtro como sustrato, al igual que otros autores (Kim, 1995; Kim et al., 2012; Lee et al.,

2008; Li, 2009; Robson y Chambliss, 1987). Por otra parte Han et al., en 1995; Zhao

et al., en 2012 caracterizaron una proteína bifuncional (con actividad endo y

exoglucanasa). Todos estos antecedentes nos pueden ayudar a explicar qué

proteína es responsable de la actividad exoglucanasa en bacterias del género

Bacillus ya que estas bacterias poseen esta actividad.

Para la actividad endoglucanasa, la proteína compuesta por un dominio

celulasa de la familia 5 y un dominio de unión a celulosa de la familia 3 (GH5-CBM3)

es la proteína reportada con actividad endoglucanasa en bacterias del género

Bacillus (Bischoff et al., 2006; Lee et al., 2008; Kim et al., 2012) y coincide con la

estructura presente en el gen eglS. Además, la actividad sobre avicel (exoglucanasa)

se atribuye a su dominio de unión a celulosa (Santos et al., 2012).

   

48  

Los genes yhfE e ysdC no comparten identidad ni propiedades estructurales

con endoglucanasas previamente reportadas, por lo tanto, decidimos descartar yhfE

e ysdC, y seleccionar eglS como el gen responsable de la actividad endoglucanasa

en la cepa modelo B. subtilis 168.

En lo que respecta a la actividad β-glucosidasa, bglC, bglH y bglA presentan

identidad y el dominio característico con β-glucosidasas reportadas. Setlow et al.,

2004 analizaron la funcionalidad de las β-glucosidasas producidas por B. subtilis

determinando que bglC, bglA, bglH y gmuD producen proteínas funcionales. En

dicho análisis una cepa sin los genes bglA, bglH y bglC creció pobremente en aril-β-

D-glucósidos comprobando que estos tres genes son importantes en la actividad β-

glucosidasa de B. subtilis. Además revisando en la literatura se encontró que gmuD

se encuentra dentro del operón para utilización de glucomanano, un polisacárido

complejo altamente fibroso, y en dicho operón gmuD se induce por la presencia de

productos generados por la hidrólisis de este polisacárido, actuando la respectiva

proteína en la degradación de manósidos principalmente (Sadaie et al., 2007). Este

tipo de glucósidos no se presentan en la degradación de la celulosa por lo tanto el

gen gmuD no figura como un gen implicado en la actividad celulolítica en B. subtilis

168.

La proteína codificada por el gen licH presentó un dominio del tipo LDH

CtermNAD(P) binding Rossman, dicho dominio no presenta reportes actuales de

actividad β-glucosidasa Cuadro 9. Tobish et al., 1997 detectaron poca o nula

actividad de la proteína codificada por el gen licH contra aril-fosfo-β-D-glucósidos en

una cepa de B. subtilis. En la base de datos del NCBI este gen coincide con una

proteína con actividad di-acetil-quitobiosa hidrolasa. Además no hay reportes

actuales donde se describa la actividad de β-glucosidasas de la familia 4. Por lo que

esta anotación está poco fundamentada. Por esto, se decidió descartar gmuD y licH,

y atribuir la actividad a bglC, bglA y bglH.

   

49  

8.3. Análisis de secuencia de los genes de que codifican para la actividad celulolítica en aislados del género Bacillus

De acuerdo a diversos reportes en las endoglucanasas del género Bacillus, a nivel

del dominio catalítico se encuentran involucrados cuatro aminoácidos de gran

importancia (Figura 5): Glu 169 y Glu 257 los cuales funcionan como neutrófilo y

electrófilo respectivamente, e His 229, Thr 256 y nuevamente Glu 257 formando la

tríada catalítica del sitio activo (Nurachman et al., 2010). De igual manera en el

dominio de unión a celulosa se presentan aminoácidos conservados con gran

importancia en la interacción de la enzima con el sustrato los cuales son: Asn 37, Trp

39, Tyr78 y Glu 80 (Shimon et al., 2000).

Como también se puede observar, la proteína codificada por el gen eglS de los

aislados RZ164, RS351 y RS273 comparten los aminoácidos implicados en el sitio

activo de la enzima y del dominio de unión a celulosa con el resto de las secuencias,

y dichas proteínas se encuentran muy conservadas estructuralmente, lo cual nos

permite sugerir que la funcionalidad de las endoglucanasas de Bacillus pudiese ser

similar y conservada dentro del género.

Como se observa en la Figura 6, se distinguen tres grupos principales

correspondientes a la especie subtilis (en el cual se ubicaron nuestros aislados),

amyloliquefaciens y licheniformis, aunque se encuentran más estrechamente

relacionadas las especies subtilis y amyloliquefaciens. Algo interesante que se

observa, es que las endoglucanasas de los aislados RS351 y RZ164 forman un

pequeño subgrupo con la endoglucanasa producida por la cepa B. subtilis BEC-1,

una enzima caracterizada por ser halotolerante, termotolerante, acidofílica y activa en

diferentes condiciones de solventes, iones metálicos, surfactantes, agentes  

quelantes, y lo más relevante es que tiene la capacidad de hidrolizar celulosa soluble

e insoluble, sugiriendo que las endoglucanasas obtenidas en este estudio pudiesen

presentar también estas características de interés a nivel industrial ( Zhu et al., 2011).

En lo que respecta a β-glucosidasas, se ha reportado que en la catálisis

enzimática intervienen dos aminoácidos aromáticos que funcionan como nucleófilo y

   

50  

electrófilo respectivamente y que interaccionan cada uno con cada una de las

moléculas de glucosa unidas por el enlace O-glucosídico.

En especial en B. subtilis se ha reportado que dichos aminoácidos son Glu 170

y Glu 365 (Barbe et al., 2009). Como se puede observar en la Figura 7, las β-

glucosidasas de los aislados de interés se encuentran conservadas en los

aminoácidos implicados en el sitio activo, y a pesar de ser todas las enzimas de la

misma familia (GH1), se distinguen diversos agrupamientos, entre ellos,

principalmente se agrupan las proteínas de nuestros aislados de interés con

proteínas ortólogas de la cepa B. subtilis 168 (por ejemplo: bglC164 con bglC Bsubt

168), pero de manera general se pueden observar dos grupos principales, uno donde

se agrupan las β-glucosidasas de nuestros aislados con las de la cepa B. subtilis

168, y otro donde se agrupan β-glucosidasas de bacterias filogenéticamente

cercanas pero que no son B. subtilis.

Adicionalmente a estas observaciones estos estudios filogenéticos confirman

la identidad de nuestros aislados como B. subtilis.  

8.4. Curva de crecimiento y actividad celulolítica de los aislados RZ164, RS351 y RS273 en CMC y avicel como fuentes de carbono

Los resultados del conteo de UFC coinciden con lo reportado por Viviano et al.

(2011), quienes reportan valores de 6.4 x106 UFC/ml a las 60 h de crecimiento en

medio con avicel como única fuente de carbono para la cepa Geobacillus

stearothermophilus, resultados del mismo orden que los obtenidos en este trabajo

para el aislado RS351 bajo la misma condición de crecimiento (1.66 x106 UFC/ml).

Como se mostró en los resultados de actividad enzimática los tres aislados

presentan las tres actividades enzimáticas necesarias para la degradación de

celulosa, esto coincide con lo que reportan Kim et al. (2012) donde distintas cepas

aisladas de suelo y de composta, presentan las tres actividades enzimáticas,

predominando bacterias del género Bacillus entre los aislados.

   

51  

Los resultados obtenidos en este estudio son comparables con los obtenidos

por otros autores. Afzal et al. (2010) evaluaron la actividad endoglucanasa de una

cepa de Bacillus sp., obteniendo la máxima hidrólisis de CMC, con una actividad de

20 UI/mL, siendo este valor de actividad endoglucanasa menor a los obtenidos en

este estudio. Kim et al. (2009) analizaron una cepa del género Bacillus, la cual

presentó valores inferiores a los de este estudio en la actividad exoglucanasa

utilizando papel filtro como sustrato (17 UI/mL). Un aspecto importante de notar es

que la actividad β-glucosidasa en CMC se mantiene a partir de las 48 h y hasta las

120 h en los tres aislados, mostrando una aparente resitencia a la inhibición por el

producto final (glucosa). Esto ya ha sido reportado para cepas de B. subtilis

(Ljungdahl y Eriksson, 1985), y resulta relevante ya que la inhibición por glucosa es

un aspecto considerado como un “cuello de botella” en cepas celulolíticas explotadas

a nivel industrial.

8.5. Nivel de expresión del gen eglS en los aislados RZ164, RS351 y RS273 bajo el efecto de CMC y avicel como fuentes de carbono

Como se puede observar en la Figura 14, RZ164 y RS273 presentan tendencias de

expresión del gen eglS similares, en donde el nivel de transcritos a las 24 h pudiese

explicar la actividad endoglucanasa máxima detectada a partir de las 48 h (Figura 9A), es decir, que a las 24 h se generó la cantidad de transcritos suficiente para la

síntesis de enzima necesaria para alcanzar la actividad máxima producida a partir de

las 48 h. A las 48 h el nivel de transcritos presentó una disminución probablemente

porque la célula evita gastar energía de manera innecesaria y en ese momento ya se

había generado la cantidad de enzima suficiente para realizar cortes internos de la

región amorfa de la celulosa. El posterior incremento en el nivel de transcritos a las

72 y 96 h pudiese estar asociado con la idea de una posible bifuncionalidad de la

enzima codificada por el gen eglS, ya que dicho incremento corresponde con el

tiempo en alcanzar la máxima actividad exoglucanasa (96 y 120 h) (Figura 10A).

Esta relación existente entre la actividad enzimática y el nivel de transcritos pudiese

sugerir que primeramente se expresa el gen eglS para sintetizar enzima para actuar

sobre los enlaces internos de la celulosa, y posteriormente las moléculas generadas

a partir de los cortes realizados por la actividad endoglucanasa estimulan un nuevo

   

52  

incremento en el nivel de transcritos de dicho gen, pero ahora para actuar como

exoglucanasa sobre éstas moléculas, dicho comportamiento coincide con el

mecanismo propuesto por diversos autores, donde inicia la acción de

endoglucanasas sobre los enlaces internos de la celulosa, y posteriormente las

exoglucanasas actúan sobre los extremos no reductores generados por la acción de

las endoglucanasas hasta obtener moléculas de celobiosa (Beguin y Aubert, 1994;

Lynd et al., 2002; Zhang et al., 2006). Por otra parte, diversos autores han

relacionado la actividad enzimática con el nivel de transcritos de un determinado gen,

sugiriendo que dicho gen es el responsable de la actividad y que su regulación es a

nivel transcripcional por el efecto de fuentes de carbono. Por ejemplo, Zhang y

Hutcheson (2011) detectaron en S. degradans actividad endoglucanasa máxima

después de 24 h de crecimiento en medio con avicel como única fuente de carbono,

coincidiendo con el más alto nivel de transcritos de los genes Cel5A, Cel5H y Cel5I,

el cual se presentó después de 24 de inducción bajo la misma condición, sugiriendo

que estos genes pudiesen ser los responsables de dicha actividad. Zhang et al.,

(2011) detectaron actividad β-glucosidasa máxima en fase de crecimiento

exponencial en avicel como única fuente de carbono, de igual manera detectaron un

nivel de transcritos máximos de los genes Bgl3C y Bgl1A en la misma fase de

crecimiento, sugiriéndolos como probables candidatos de la actividad hidrolítica

detectada en S. degradans.

En el caso de RS351, se detectó una tendencia diferente con respecto a

RZ164 y RS273 (Figura 14), presentando un incremento en el nivel de transcrito del

gen eglS a las 24 h, sin embargo, posteriormente este disminuye considerablemente

en los siguientes tiempos de incubación. Esto pudiese tener relación con lo

observado en la curva de crecimiento (conteo de UFC) presentada en la Figura 8A,

ya que la bacteria alcanza su fase estacionaria a las 24 h, indicando que a partir de

este punto ya no existe duplicación de células, y se ve reflejado en una disminución

de la actividad génica ya que en este punto quizás la bacteria ya sintetizó la cantidad

de enzima necesaria para hidrolizar celulosa y conseguir una fuente de carbono mas

disponible (glucosa). Sin embargo, resulta complicado explicar el porqué RS351

presenta una expresión diferente a la de los otros aislados, cuando además presentó

   

53  

la mayor actividad enzimática con una menor expresión génica. Probablemente esté

implicado algún mecanismo postraduccional ausente en los otros aislados, que sea

responsable del incremento en la actividad enzimática. Diversos autores han

encontrado diferencias de actividad entre bacterias del género Bacillus, incluso de la

misma especie, ( Beltrán-Arredondo, 2013; Kim et al., 2012). Sin embargo, no existen

reportes de diferencias en la expresión de un gen ortólogo entre bacterias del género

Bacillus.

En lo que respecta al análisis en avicel como única fuente de carbono, RS273

y RZ164 presentan tendencias similares en el nivel de transcritos del gen eglS,

presentando una inducción a las 48 h y una posterior disminución hacia las 72, 96 y

120 h (Figura 15). Esto nos permite sugerir que a las 48 h se alcanza el nivel de

transcrito necesario para sintetizar la enzima suficiente para alcanzar la actividad

endo y exoglucanasa máxima detectada a las 96 h (Figuras 9B y 10B), y que

probablmente el gen y la enzima correspondiente no presentan la misma estabilidad.

RS351 presenta nuevamente una tendencia diferente con respecto a los otros

aislados, presentando un incremento en el nivel de transcritos a las 48 h, un

descenso a las 72 y de nuevo un incemento hacia las 96 y 120 h. Esto tiene relación

con lo detectado para este aislado en actividad endo y exoglucanasa en avicel como

única fuente de carbono (Figuras 9B y 10B). A su vez, esta tendencia en la

expresión del gen eglS, la obsevaron Di Pascua et al. (2014) para un gen ortólogo en

B. amyloliquefaciens (BglC) en avicel como única fuente de carbono, donde la

expresión del gen incrementó en fase lag, disminuyó en fase exponencial y

finalmente incrementó en fase estacionaria, tal como se observó en este

experimento.

Algo importante de notar, es que en CMC la inducción del gen se presenta en

menor tiempo que en avicel (24 y 48 h respectivamente), esto es debido a que avicel

presenta una estructura microcristalina, la cual es más compleja para ser hidrolizada

(Soares et al., 2012).

   

54  

En la Figura 16 se propone un modelo general de acción del gen eglS en

CMC y avicel como única fuente de carbono, indicando los cambios en el nivel de

transcritos antes mencionados y el efecto de las moléculas presentes.

 

Figura 16. Mecanismo general de acción del gen eglS en CMC y avicel como única fuente de carbono propuesto en este estudio.

Resulta evidente que la actividad enzimática y la expresión del gen no

muestran el mismo comportamiento. Sin embargo, presentan una relación justificable

y coincide con lo reportado por Wei et al. (2012), quienes mencionan que el patrón de

expresión de la actividad celulolítica tiene lugar de una manera coordinada que

puede mejorar la eficiencia total de la degradación de celulosa. Por lo tanto, eglS

   

55  

puede ser el responsbable de la actividad endo y exoglucanasa en los aislados de

Bacillus, y sería interesante comprobarlo mediante pruebas funcionales en el futuro.

Es interesante resaltar las celulasas producidas por los aislados analizados

en este estudio, ya que presentan actividad celulolítica a niveles comparables con la

de estudios previos y pudiesen cumplir con los requerimientos a nivel industrial en

tiempos cortos, presentando actividad en celulosa amorfa y celulosa cristalina. Se ha

reportado que la endoglucanasa producida por la cepa B. subtilis 168 se expresa en

muy bajo nivel, siendo esta mejorada mediante expresión heteróloga ( Zhang et al.,

2011). Por lo tanto, la expresión heteróloga del gen eglS puede ser una alternativa

para una futura aplicación biotecnológica de esta proteína, en vista que presenta

propiedades bioquímicas y catalíticas interesantes.

 

   

56  

9. CONCLUSIONES

• Los aislados de interés en este estudio son de B. subtilis, una especie que ha

sido objeto de estudio durante muchos años y se considera con potencial

celulolítico, además de presentar características favorables para aplicaciones

a nivel industrial.

• A través del análisis y selección mediante herramientas bioinformáticas se

sugiere a eglS como responsable de la actividad endo y posible exoglucanasa,

ya que B. subtilis 168 no presenta un gen que codifique para ésta última, y a

bglC, bglA y bglH como betaglucosidasas, sugiriendo que estos genes

pudiesen codificar para la actividad celulolítica en bacterias del género Bacillus

y probablemente permitan la degradación completa de la celulosa.

• Las celulasas del género Bacillus se encuentran muy conservadas,

especialmente en sitios implicados en la catálisis, así como en aminoácidos

que intervienen en la interacción con celulosa, sugiriendo funcionalidad

conservada dentro del género, sobre todo en la especie subtilis.

• Las propiedades estructurales y perfiles de actividad observados postulan a

las celulasas de B. subtilis como atractivas para enfoques en mejoramiento en

la producción de enzimas de este tipo, esto, aunado al hecho que su

regulación es a nivel transcripcional por el efecto de fuentes de carbono,

aporta bases para futuros proyectos o escalamientos a nivel biotecnológico.

   

57  

10. BIBLIOGRAFÍA

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