r

1

I

1

" "

- I"

..- r I - r L

?- I L

T- i

r i

r L

c c c r

r

c r

L

L

L

r L P L P

Y

UNIVERSIDAD AUTON6MA METROPOLITANA DIVISIÓN DE CIENCIAS BlOL&lCAS Y DE LA SALUD SECRETARIA ACADÉMICA

A QUIEN CORRESPONDA:

Por medio de la presente se hace constar que la:

del Departamento de BlOTECNOLOGlA de la División de Ciencias Biológicas y de la Salud, asesoró el siguiente Servicio Social:

M. en C. LlLJA VAiQUEZ CHAVEZ

T¡TULO "CARACTERIZACIdN DE LA PROTElNA DE TRIGO, SOMETIDAS A DIFERENTES TEMPERATURAS DE SECADO"

ALUMNA VALENCIA BLANCO PAOLA BlBlANA MATR~CULA 93231255 J

LICENCIATURA INGENIER¡A EN ALIMENTOS PERIODO

Se extiende la presente para los fines que a la interesada convengan, en la Ciudad de México, Distrito Federal a diecinueve de julio del dos mil.

A T E N T A M E N T E , "CASA ABIERTA AL TISMPO"

OCTUBRE 13, 1998 A JUNIO 16, 2000

- __ SECRETARIO ACADEMICO

UNIDAD IZTAPALAPA Av Michoaodin y Io Purisirns. col. Vicsn«na. D.F. 09340 Tel. (5) 723 83 51, Fax (9812 80 83 emall: cdcb2nnm.umrn.rnx.

/NOMBRE: Valencia Blanco Paola Bibiana.

MATRICULA:93231255

,/ LICENCIATURA: INGENIERIA EN ALIMENTOS.

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD: IZTAPALAPA

JDIVISIONCIENCIAS BILOGICAS Y DE LA SALUD.

TELEFONO: 690 71 21.

HORAS SEMANALES: 20 HORAS.

TRIMESTRE: 98-0

NOMBRE DEL PROYECT0:Efecto del secado por lecho fluidificado sobre la calidad del trigo.

J TITULO DEL TRABAJO:CARACTERIZACION DE LA PROTEINA DE TRIGO, SOMETIDAS A DIFERENTES TEMPERATURAS DE SECADO.

ASES0R:LlLlA VAZQUEZ CHAVEZ.

PUESTO Y ADSCRIPCION: PROFESOR CATEGORIA “C” TIEMPO COMPLETO

LUGAR: LABORATORIO DE GRANOS Y CEREALES (R008) INICIO: 13 DE OCUBRE DE 1998.

FINALIiA: 13 DE ABRIL DE 1 9

CLAVE: lA.060.98

Paola E. Valencia Blanco. M. en C. Lilia Vázquez Chavez.

~

Jombre: Valencia Blanco Paola Bibiana.

iatrícuia: 93231255

kenciatura: Ingenieria en Alimentos

rituio del Proyecto: EFECTO DEL SECADO POR LECHO FLUIDIFICADO SOBRE LA CALIDAD DEL TRIGO.

iegistro del Servicio Social:13 de Octubre de 1998.

'echa de entrega: 13 de Abril de 1999. Vombre y adscripción de los asesores: M. En C. Lilia Vazquez Chávez.

3bjetivo General: O Determinar y cuantificar el daño causado por el tratamiento termico de

secado en las proteínas del gluten de trigo.

Objetivos Especificos: .:. CuantiFlcar proteinas en muestras desengrasadas de la variedad Oasis y Salamanca.

e:. Aplicar las técnicas de Bradford y Electroforésis para este fin.

Se determino el efecto que tiene tanto la temperatura y el tiempo de secado en la pérdida de solubilidad de la proteina dañada del gluten de trigo en dos tipos de variedades "Oasis y Salamanca", las muestras fueron tratadas con NaCl ai 2%, de donde se pesan 100 mg de muestra se les agrega 5 ml de la solucion anterior se agita en un vortex y se espera que sedimente para tomar del sobrenadante 1OOtiL de muestra agregándole lOOOltL de reactivo de Bradford leyendose a una absorbancia de 595 nm en el espectro "Spectronic Gene4sys S",obteniendose as¡ los datos y haciendo un análisis estadístico que resulta significativo con un u=O.OOl y R '= 0.9981 donde se concluye que hay una relación entre la absorbancia y la cantidad de proteina, ya que fue dismlnuyenda esta primera conforme las condiciones de secado del trigo fueron más severas y por lo tanto la solubllidad de las proteínas también, notando con mayor efectu en la variedad Salamanca ya que posee un gluten débil que la variedad Oasis.

Con lo que respecta a la técnica de electroforésis sólo se fundamento y valido la técnica sometiendo a las muestras de eslas variedades a un tratamiento de centrifugación con y sin desnaturalización con mercaptoetanol, obteniendo gelei de poiiacrilamida donde se aprecian las subunidades proteicas y observando que en las muestras sometidas a temperaturas de 100°C a tiempos cortos de secadc el número de subunidades proleicas disminuye y en una segunda etapa de estudio se llevará acabo la identificación de los pesos moleculares para SL

posterior identificación.

BlBLlOGRAFlA

I. Modelling of Wheat Drying in Fluidized Bed. Giner. S.A. JOURNAL OF

2. Biotechnology of Wheat Quality. Shewy, Peter. JOURNAL SCI FOOD

3. Charley. Tecnologia de Alimentos: Procesos Quimicos y Fisicos en la

4. Dale Every. A Simple, Four-minute, Protein-solubility Test for Heat Damage

5. Bonnie S. Dunbar. Two-Dimensionel Electrophoresis and ilmunological.

FOOD SCIENCE.VOl. 52, N"5, Año 1987. pp1358-1363.

AGRIC. Vol. 73. Año 1997. pp 397-406.

Preparación de Alimentos. 1995. Edit. Limusa. pp. 207-223.

in Wheat. JOURNAL OF CEREAL SCIENCE 6 (1987) PP. 225-236.

Techniques . 2da. edición. 1990. Edit. Plenum Press.

g

CONCLUSIONES

El mbtodo de Bradford es usado para determinar protina soluble, resulto ser muy sensible y rápido en la determinación del dafío de las proleinas por el tratamiento térmico, donde se observa que la absorbancia fue disminuyendo conforme la temperatura de secado fue aumentando y por lo tanto la solubilidad de las proteínas disminuye.

Así se observa que en las tablas I - l h €Id como Sus respectivas gráficas, el comportamiento que tiene el contenido proteico el gluten del trigo en dos diferentes tipos de variedades de trigo "Oasis" y "Salamanca", tras haber sometido previamente a un tralamiento térmico, al secar ambas variedades arlificialmente por medio de lecho fluidificado a diferentes tiempos y temperaturas de secado. En dichas tablas se resgistro la concentración proteica de las muestras agrupadas en tiempos de secado diferentes a una misma temperatura (variando esta en 40, 60, 70, 80 y 100OC) donde se observa un cambio significativo en la concentración con respecto a la muestra testigo (no sometida al tratamiento térmico), más aun el cambio es más significativo cuando la lemperatura de secado incrementa. Es importante mencionar que para una temperatura de 80°C y 1 OOOC a un tiempo de 30 y 20 minutos respectivamente se obtuvieron los valores más bajos de concentración proteica comparado con el resto de las muestras y el testigo.

En el ánalisis estadístico realizado resultó significativo con un (r=0.001 y con una R2=0.9981, donde los valores oblenidos nos indican que hay una relación entre la absorvancia y la cantidad de proteína, ya fue disminuyendo esta primera conforme las condiciones de secado del trigo fueron más severas y por lo tanto la solubilidad de sus proteinas también.

Con lo que respecta a la prueba de eleclroforésis es una etapa primaria de estudio para la obtención de geles de poliacrilamida de las diferentes muestras obtenidas de los tratamientos térmicos a diferentes tiempos y temperaturas de secado , por lo que no se determino el peso molecular de las diferentes proteinas separadas mediante la electroforesis y se realizara en una segunda etapa de estudio. Asi se observara el comportamiento de solubilidad de las proteinas ya que fueron centrifugadas y agregando mercaptoelanol , asi como las mismas muetras también centrifugadas pero sin agregar mercaptoetanol, ya que este es un agente reductor el cual cambia la estructura tridimensional de las proteinas, lo cual permite una mejor desnaturalización proteica y con ello una mejor separación en las subunidades de las proleinas, donde se observa que hubo un número menor de subunidades en muestras lratadas a una temperatura de 100°C a un tiempo reducido de secado. La técnica es simple, rápida y altamente sensible, sin embargo se debe contar con una área especial para su realización ya que se trabaja con reactivos altamente tÓxicos y humificador para mantener los geles en óptimas condiciones.

I ir-. I)

OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS

Se realizo el estudio del daño ocasionado en el gluten del trigo al aplicar diferentes temperaturas de secado as¡ como el desengrasado previo de las muestras en dos tipos de variedades de trigo OASIS y SALAMANCA, esto se logro mediante la cuantificación de la canlidad proteíca de dichas muestras aplicando la técnica de Bradford donde se realizaron por duplicado cada análisis para obtener una reproducibilidad en los resultados, con ello se compararon ambas variedades OASIS y SALAMANCA, ya que una contiene un gluten fuerte y la otra un gluten débil respectivamente, donde es de observarse que al someter muestras de la primera variedad mencionada con una humedad inicial de 18% a una temperatura de 100°C a tiempos cortos de secado nos arrojaron valores de concentración de proteina bajos, pero no obstante a una humedad inicial de 20% el valor fue ligeramente mayor con respecto al primero, pero haciendo un analisis comparativo entre las dos variedades bajo las mismas condiciones donde la variedad SALAMANCA posee un gluten débil la concentración proteica es mayor con respecto ala variedad OASIS, lo cual no es justificable ya que dicha variedad posee un gluten fuerte y por lo tanto se esperaria una mayor concentración de proteína, pero no hay que descartar el hecho de que ambas variedades fueron desengrasadas ed una etapa anterior a este estudio. No obstante se puede determinar que con la serie de datos obtenidos se recomienda que se utilicen temperaturas de secado inferiores a 80°C a tiempos cortos, para eviatr el daño al gluten y con ello aumentar la calidad panadera deseable.

Con lo que respecta a la técnica de electroforésis, se estableció la técnica y la aplicación de la muestra en los geles de poliacrilamida, por lo que no se identificaron las bandas de separación correspondientes a cada muestra y como consecuencia no se identifico el daño ocasionado a la proteina por el tratamiento térmico ocasionado por el secado artificial del lecho fluidificado. Esta Ultima etapa de identificación por medio del densímetro, se realizará en una segunda etapa para as¡ identificar los pesos moleculares de las proteinas , para obtener resultados confiables acerca del daño que sufren las proteinas al ser sometidas a un IralainientÓ térmico durante un secado artificial y con ello establecer condiciones de operación que permitan mantener en condiciones Óptimas tanto de almacenamiento como de las propiedades mismas del grano.

a

\

I

I

I I

!

Figura 2.0. Gel.i~i)liaciilaiiiida eii rniiesiras di: liariiio (le t i igo de la vaiieclacl "Salainanca". 1.a piwleiiia file soliibilizadti eii m a soliii:itiii 1RIS-SIX por 24 horas, ceritrifiiyatlas a '17,000 I p in. dtiraiile iiiia hora a 5°C sin riiercaploeiaiiol

7'= Teii~iperali.ii a (le secado 4O"C, por 36ít iiiiiiiilos y liiiiiieclixl iiiicial de 18 '!h 9'- Teinperaiiii-ri de secado 60T, pcii' ,IOU iiiiiiii1oc y liiiiii<.:tlncl iiiicial dc Zil '%

IO'= Teinperaliirii ( I t ? secadti 6 0 Y p i r I50 i i i i i i i i los y Iiiiiiietlad inicial de 70 I%,

ill = Albiíiniiia (0 l ' i 5 iiigliiil)

.VI'- ~Teiiilieraliirct (le cecaclo GOY;, por 12i) iiiiiititos y l.iiiiiieilad iiiicial (le I8 '%I.

.I 2'7: leiiiperaliira (la secado GOY;, por 913 iiiiiii 110s y hiiiiici lad iiiiciol (le It1 ';O.

= leiiiperatiira ile secado (iiiilo), Siii 1i;il;iiiiiei~iiu

= Marcador de I )ali«n de pesos iriole~.iiI;:ii~ec ( I 68 iiighiil)

Eleclroforesic.

Figiira 4.0. Gel-poliacrilainida en miieslras de Iiarina (le trigo de la variedad "Salarnaiica". 1 a proleina fue soliibilizadri en i.ina soliicioi-i 1.RIS-SDS por 24 horas, cenlrifi.igndas a 17,000 r p.in cliirante iiiia hora a !5"C siti mercaploelanol.

13 '= 'Teiiiperaliira de secado 60°C. por If0 riiiniitos y hiiiiierlatl inicial de 20 'XI. '14 '= Teinperaliira de secado 7Wí;, por 60 iiiiiiiiios y Iiiiiiictl;id iiiicial (te ,IO %I

15 '= l~einperaliira de secado 70'C por 30 iiiiiiiilos y tiiiiiic!tia<i inicial cle IR u/n

.' ' = íoiiipci-;iliii;i de secado (niilo), Siii lialaiiiitiiilr~

Ir! - Alli i i i i i i ia (O ,I 15 mgliiil).

' I ' = Marcador de Ilallon de pesos ii1olei;iilares ( . I (38 tiighnl).

16 '= Teinperaiiira de secado 70°C por 45 iniiiiiios y Iiiiiiiethd inicial cle 18 "/O 17 '= Ternperatiirn de secado W ' C , por 40 ininiilos y Iiiiri.iedad inicial de 20 '%I

# _

Figura 6.0 Gel-poliacrilarnida en rniiestiac de Iiariiia de trigo de la variedad "Salaiiiaiica". ILa proteína fue solubilizacla en iiiia solución TRIS-SIX por 24 horas, ceiitiifiigadas a ,17,000 r p in diii-aiite i.ina hora a 5Y; sin niercaptoelanol.

22 '= Teiiiperatcira de secado 8O"C, por 40 iiiiniilos y 1,iiiiriedad inicial de . IO %. 27 '= Teiiiperatiiia de secado IíW'C, por 10 iiiiniilos y Iiiiiiietlad inicial tie 'IO o/, 28 '- Teiiiperatiiia de secado IOO"C;, por 20 iiiiiiiitos y liiiiriedad iiiicial de 18 "h.

= l~emperaiiira de secado (riiilo), Sii i Iialaiiiieiito

t ' ~ '= Alt)iiiiiiiiii (0 175 inglinl)

29 '= Ternperahira de secado 10o"C, poi 20 iiiincilos y Iiiiiiiednd inicial de 20 '%

j ( , - - Marcador iio Lkilton de pesos iiioleciilares (1 .tit3 iii!j/iiiI)

Figura 8.0. Gel-poliacrilamida en muestras de harina de trigo de la variedad "Oasis". La proteína fue solirbilizada en una soluciOii TRIS-SDS por 24 tioras, centrifugadas a 17,000 f.p.m. durante tina tiora a 5°C siii mercaptoetanol.

32' = Tempei-iiliira de secado 4O"í:, por 300 iiiiiiiitos y ticiiiieclad inicial de 20 %. 33' = Teiiiperaiura de secado &PC, por 340 iiiiiiiitos y Iii.iiriedad inicial de 20 YO. 3 4 = Teinperatiira de secado 40°C. por 2 IO inii.ii.ilos y Iiiiiiiedad inicial de I8 %

= T'eniperaliira de cecado (iiiilo), Sin Iralainieiito

= Marcador de Dalton tie pesos iiiolemilíires ( 1 .Gü iiig/iiil)

'= All.~i'iiiiiiiü (O. 175 iiigliill)

35 = Teiiiperatiira de secado 4 O T , por 270 inincitos y Iiiiiiiedad inicial de 20 %. 37'= Temperatura de secado 40"C, por 40 iiiiriiitos y hiiiiiedad inicial de 20 %.

Figura 10.0. i:el-I,oliacrilainida en iiiiieslias de harina de iiigo cle la variedad "Oasis" 1.a pr~oleiiia fiie soli.ibilizaiia en iina soliicióri TRIS-SDS por 24 horas, cenlrifiigadas a I i,OOO r.p.iri. duranle iina hora a 5°C sin iiiei-capioeiannl

54' = leiiiperaliiia de secado .Ií)O"C,, pc-~r 20 iiiiriiilos y hiiiierlad inicial de .I8 50 : = -I eiiipernli ii a tle secado (riiiio), Sin 1i.alniiiieiito.

.¡if '= Alh'lii i i i ia ( O I75 iiigliiil).

''1 '= Marci-icloi~ ilo 1~)aiton (le pesos iiiule(:iiliait~s (.I 68 iiig/iiii)

56' = 1eiiiperali.ita de secado l O D " C , por :>O iiiiiiiitos y l i i i i i iodad inicial de U0 "A,. 6.1'= leiiiperaliiia de secado 70°C por 30 iiiiiiiitos y tiiiiiiedad iiiicial de .IR '%.

i I

I

Figura 'I 2.0 (;el.-poliacrilairiida eii iiicieclrac de hai'ii-ia cle trigo de la variedad "Oasis" (.a (mikina hie soliibilizada en i.iiia soliit:tOii TRIS-SDS por 24 tioias, cenlrifiigadac a .17,OOO r p rn diiranle iiiia Iiora a 5'Y: coii rriei-.ca~iloelarioI

63 = Teiiipei-ritiira de secailtr 80°C; p o r 30 ii i i i i i i los y Iiiiidedad inicial de 20 % 65 = TeIripeIatura de secado 6O"C, [lor 'I 50 iiiiiiiilos y Iiiiiiiedatl inicial <le ,I8 '%

' '= ~reiiipei-aliira de secado (ri i i lo). Sin Iiataiiiieiilo

= Altii'iiiiiiia (O. 175 riiglrril)

= Marcador de Dalloii de pesos i>wIe(:iilarec ( 1 ( i t4 iiigliiil) 66 = Teinperaliira de secatlo 4O"C, poi 120 iiiiiiiitoc y liiiiiietlatl iiiicial (1s 18 ':b 67- Temper-aliira de secado GO"C, poI ILi) i i i i i i i i toc y tiiiiiiedad iiiicial cle I8 'Yo

. -. .- . . . . . . .

ñ- *: U m-

Figiira 3.0. Gel-poliacrilamida en incieslras de harina de trigo de la variedad "Salainanca" I..a proteína fiie soliihilizatla en iina soli.icibii 1.RIS-SDS por 24 horas, ceiitrifiigadas a 17,000 r prri. diiranle i~ina hora a 5°C con niercaptoelariol.

.I3 = Teiiipeialwa de secado 6OoC, por 90 iniiiiilos y tiiiiiiedad inicial de 20 Yo. 14 = leinperaliira de secado 70"C, poi ($0 riiiniilos y hiiinetlad inicial de 18 "At. ,IS = Teiiilwraliira de'secado 70"C, por 30 iniiiiilos y Iiiiiiiedad inicial de .I8 '%B. .' = 1 eiIipr?raliira.de secad« (niilo), Sin iialainiei~io

11' = Albi'iinina (O. 175 mglrnl) I ! = Maicadoi- de Dalton de pesos inoleciilai,es ( 1 .GU iiig/iril)

IF = Teiiiperaiiira de secado 70"C, por 45 iniiiulos y Iii~iiimlatJ iiiicial de .I8 % 17 = Teinperaiiira de secado 80°C, por 40 niini.itos y tiiiinedad iiiicial de 20 O,!,

P- a" * d-

a- z i - c

* a- *

Fiyiira 5.0. (.;el poliacrilamida eii iiiiiestras tie harina de trigo de la variedad "Salamanca" 1.a proleina fue soliibilizaila eii una soli icióri TRIS.-SDS por 24 horas, cenlrifiigadas a 17,000 r.p.m diiranle uiia tiora a 5°C con riiercaploetariol.

22 = Teinixialiiia de secado 80"C, p>i 40 iiiiiiulos y Iiiiirieda<I iiiicial d e 111 'XI 27 = 1'eiiilwi;itiira de secado ~1OíJ"C, poi' :VI iiiiriiilos y Iiiiiiicr1:itl iiiicial de 18 %D 28 = Teiiipraliira de secado ~IíXIY;, poi' :>O iii1iiulos y tiiiinetlad iriicial de .I8 'XI. : = I ciiipeialiira de secado (riiilo), Siii l i i i l ~ ~ r i i ¡ ~ ! r i l c ~

.h = Albi'iiriiiia (O 175 mglrnl) 11, = Mxcaior de Dalton de pesos iriolecxilorec ( I ($8 iiigliiil)

29 = Teiiii>ei-atiira de secado 100uC, poi 20 iiiiiwlos y Iiiiinedntl iiiiciai de 20 '%I

Figiira 7.0 Gel-poliac ainida en incieclras de haiiiia de trigo de la variedatl "Oasis" 1.a proteha. file solubilizadi en iiiia solcicióii TRISSDS por 24 horas, cenlriíiigatlas a '1'7,000 r.p.rn. durante iiria Iiora a 5°C con nieicaploelanol.

32 = Ternpei~iitiiIa de secado 4 0 T poi^ 3 0 0 riiiriiilos y tiiiniedad inicial de 20 %. 33 = Teniperatiira de secado 40°C pix 240 iiiiiiiilos y tiiiinedacl iiiicial de 20 34 = Teni(.ieraliira de secado 4O"í:, poi 2.10 iriiriiitos y Iiiiiriedad iiiicial de 18 "/O.

, , - - Teiiipcratirra de secado (riiilo), Sii i 11 alariiieiilo

I f 1 A1lx;iiiiiia (0. 175 inghnl)

= Mal-cador de Dalton de pesos irioleciilares (1 68 inglriil). 35 = Teinperatcira de secado 40T , por 270 minutos y Iii.iinedad iriicial de 20 %). . 37= Teinpei aiiira de secado 4 0 T poI 4 0 iniricitos y Iiiiiiiedad inicial de 20 O/..

I

.t ....-

Fiaiira 9.0 Gel -poliacrilamida en iiiue5 3s d harina de trigo de la variedad "Ok is " . 1.a proteína fue solubilizada eii iina solw3oii 'TRIS-SDS por 24 horas, cenlrifugadas a 17,000 r.p in. durante una tiora a 5°C con rriercaploetanoi.

54 = Ternpeialiira de secado 100°C, por 20 miniilos y Ixiirredad inicial de 18 Yo. ' = l-eiiipcmliira de secado (niilo), Sii i Iiatainierilo.

" = Marr.a(loi de Dalton de pesos inoleciilaies (1 .ti8 iiigliiil)

5ii = T e i i ? p r a i m de secado 100nC, peor 20 ininirlos y humedad inicial de 20 "AI. @ . = Teinr~$i.atiira de secado 70°C. par 30 iiiiniitos y tiiiinedad inicial de .I8 %I.

1.1. = All>iliiiiiisi (O 175 iii(Jliii1).

Figura 1'1.0 Gel-poliacrilamida eii iriueslras de harina de trigo de la variedad "Oasis". 1.a proieina fue soliibilizada en una solución TRIS-SDS por 24 horas, cerilrifiigadas a 17,000 r.p.m diirarile una hora a 5°C sin,rnercaploelanol.

63' = Teinperaliira de secado 80"C, por 30 inintitos,y titiniedad inicial de 20 I%.

65' = .Teinpraliira de secado 60"C, por 150 iiiiriiilos y li'liii-iedad inicial de 18 %t.

, . - . - I einperalcira de secado (niiio), Sin lraiaiiiieiilo.

, / I , , '= Albi'imina (0.175 mgliiil).

IIl '= Marcador de Dallon de pesos nioleci.ilares ( I 68 rnglrnl). 66' = Teiiiperalura de secado 40"C, por 120 ii i ir i~ilcis y Iicirnedad inicial de IR '>/o. 67'= 'Teiiiperaliira de secado 60"C, por 120 rniniilos y hiiiiiedad inicial de 18 Yn .

ELECTROFORESIS

O Las figuras de la 1 hasta la 12, representan los geles de poliacrilamida donde las bandas de separación muestran las proteinas que fueron separadas por medio del gel mediante la aplicación de la técnica de electroforésis, éstas proteinas fueron obtenidas a partir de muestras de harina desengrasadas previamente secadas por lecho fluidificado aplicando diferentes tiempos de secado y temperaturas, con una humedad de 18% y 20% tanto de la variedad “Salamanca” y “Oasis” .

#- a-

, J

Teinperalura ("C) Medias (Concentracion de - protelna pglmg)

40 8.129 60 5 98 1 O0 4 320

7.302 20 (Testigo) .___ -

L

a 1)-

ANALISIS ECTADISTICO

Variedad SALAMANCA.

Se realizó un análisis de varianza utilizando el paquete estadistico NCSS version 5.0; para el estudio del comportamiento de la concenlracion de proteha con las variables de respuesta: temperatura, tiempo de secado, humedad inicial contenida en el grano, siendo altamente significativo este modelo para dicho estudio, arrojando un valor de F= 34.12~ un a= 0.001 y una R2= 0,9880; as¡ mismo para obtener el valor de las medias para las diferenles variables de estudio asi como la conbinacion de estas variables de respuesta y a d establecer el comportamiento de la variable dependiente.

En la tabla 2a $e muestra el valor de las medias a diferentes temperaturas de secado y a una humedad inicial de 20 %

Tabla 2a. Valores de las rnedlis de la concenlraclbn de ptoleina a difrentes lnnl>eraluras de secado

I - *

ANALISIS ESTADISTICO

I'I<iJT-BA I)¡ l~ l<AlWOl<I~.

Variedad OASIS.

Se realizó un análisis de varianza utilizando el paquete estadistico NCSS version 5.0; para el estudio del comportamiento de la concentracion de proteina con las variables de respuesta: temperatura, tiempo de secado, humedad inicial contenida en el grano, siendo altamente significativo este modelo para dicho esludio, arrojando un valor de F= 35.79 y un u= ,001 y una R2= 0.9495; as) mismo para obtener el valor de las medias para las diferentes variables de estudio as¡ como la conbinacion de estas variables de respuesta y as¡ establecer el comportamiento de la variable dependiente.

En la tabla l a se muestra el valor de las medias a diferentes temperaturas de secado y a una humedad inicial de 20 O h

Teniperalura ("C) Medias (Concentracibn de __- proteina &ma)

40 7.55 9.33 60 5.74 - 80 5.767 I O0

.~ 10.195 20 (Testigo)

.__ .. - ________

_______ __- ~ _ _ _ ~ _ ~ _ _ . __ .__.- -

Taúla la. Valores de las medlar de la coiiceiilraclbli de ploleiiia a dlbenles lemperaliirai de secado

ANALISIS ESTADISTICO

I’IiUCIM DI; I~IiAi>lY~IiD.

Variedad OASIS.

Se realizó un análisis de varianza utilizando el paquete estadistico NCSS version 5.0; para el estudio del comportamiento de la concentracion de proteina con las variables de respuesta: temperatura, tiempo de secado, humedad inicial contenida en el grano, siendo altamente significativo este modelo para dicho estudio, arrojando un valor de F= 31.54 y un a= ,001 y una RZ= 0.9988; as¡ mismo para obtener el valor de las medias para las diferentes variables de estudio y as¡ establecer el comportamiento de la variable dependiente.

En la tabla 1 se muestra el valor de las medias a diferentes temperaturas de secado y a una humedad inicial de 18 %.

Teinperatlira (“C) Medias (Coiicentracibn de proteina pg/ins)

8.03 40 9.63 60 7.90 70

1 O0 . ~.. 4.91

-__--__I

_.__, - --

-_--.I._ ~ __ -.__ 20 (T-oL - - ~ 10.195

Tilila 1. Valores <le las medlar de Ir conrciitracl<iii de ploleliia a dllenlar lemperiliiras de secado

5, z *

I- *

.-.. ~ ~~ . . . . ~

1 O0 I 20 20 .. . . . . . .. . .. .. . .

. . . . ~ ~.~ ~

Tabla Ih. Resultados de la prueba do Bradford para la determinación de proteina soluble on Iiglrng en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Oasis" a una temperatura de 100°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 20 S/u

~. pg/mg . de _ _ muestra. 5.767 .. ~~ ~

10.195 . ... .~. ~ . . ... . . ~ ~

_. __ ~ ._._

I Concentración de proteina

1-Tiempo (minutos) Temperatura ("C) 7

O

Grdfica 1 h Concentración de proteína a diferentes tiempos temperatura de 100" C y humedad inicial de 20%

Concentración de proteina a diferentes tiempos de secado, a una temperatura de 100°C y

humedad de 20%

<n 30 s

20 'E 10

O

s r

E Ql O

E .* I-

n Tiempo wConc. De

pro te í na

1

20

-

Concentración de proteína (aglmg de muestra )

de secado.

a!

Tabla 9. Resultados de la prueba de Bradford para la delerminación de proteína soluble en Lcglmg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Salamanca" a una temperatura de 100°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 20 %

1

racidn de

I ..--- O &in tratamiento) .-__I ~ ~~ . ~ 20

Gráfica 9. Concentración de proteína a diferentes tiempos de secado, temperatura de 100" C y humedad inicial de 20°k.

Concentración de proteina a diferentes tiempos de secado, a una temperatura de 100°C y

E a3 20

mConc. De proteína

I

20 4.32

O 7.302

I Concentración de protelna (uglmg dc

muestra )

Tabla Ig . Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteina soluble en pg/mg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Oasis" a una temperatura de 80°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 20 %.

___ ~~ ~ .~

Tlempo Temperatura ('C)

~.~ ~ ~ . ~.~ 80 20 .....

.. . ~ . . . . ~ . .

~

Concentracidn de proteína

.. lmg de muestra 5.746 10.195

.. ~. . . . ~ ~ . ~ . ~

Grbfica Ig . Concentrecián de proteína a diferentes tiempos de secado, temperatura de 80" C y humedad inicial de 20%.

1

30 5.746

Concentración de proteina a diferentes tiempos de secado, a una temperatura de 80°C y

humedad de 20%

2

O 10.195

40 o - a 'E E

20

u Tiempo aConc. De proteína

Concenbacl6n de proieliia (ugfmg de muesfa )

Tabla 8. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteina soluble en Iiglmg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Salamanca" a una temperatura de 80°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 20 %

~ __ .~ ~

("C) Concentración de proteina

. I!.@ mg L de muestra 2

. .~ ... ~- 6.429 . .~. ~ ~ . . . ~

~. . 7.302 ..~ ~ . . .- . -

Grdfica 8. Concentración de proteina a diferentes tiempos de secado, temperatura de 80" C y humedad inicial de 20%

8 +, a

E C .- E a O

E al i=

Concentración de proteina a diferentes tiempos de secado, a una temperatura de 80°C y

humedad de 20%

50

O

_-

i. I, 1

40 6.429

u Tiempo conc c. De proteína

Concentración de proteína (uglmg a muestra )

[:k-J 2

O 7.302

Tabla If. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteina soluble en Iiglmg en muestras de harina desengrasadas de la variedad “Oasis” a una temperatura de 60°C y tiempos de secado diferenles y húmedad inicial de 20 %

I .~~ --- .. . -. Temperatura (‘c) Concentración de

proteina I!B!~g.de.Fuestr%..-~-

6% ~ ~~ ~.~~~ ~. ~~. 9.334 ~~~

. . --

10.195 ~. ~ _ _ . 20

Gráfica I f . Concentración de proteína a diferenles tiempos de secado, temperatura de 60“ C y humedad inicial de 20%.

Concentración de protelna a diferentes Hempoc de secado, a una temperatura de 60% y

humedad de 20%

v>

El s E

O o Tiempo 120 nconc. De 9.334 10.195

proteina Concenbaci6n de protelna (iiglmg de miiesh )

Tabla 7. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteína soluble en pg/mg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Salamanca" a una temperatura de 60°C y tiempos de secado diferentes y tiumedad inicial de 20 %.

._ - - .__ ___~ Tiempo (minutos) Temperatura ("C) Concentracidn de

... .~ ____.. .. pghmg de __ muestra. proteína

60 5.434

60 - ___ 60 ___.-. .~ ~ 5.997 __

. ~~. ~ __ 5.213 - -

1 O0 150 1 -__o(sintratamiento)-- .- 20 . .-~ .___ 7.302

.__ . ~ ... ~. ., ~ ~ ~~. .. ~~ . . . ...

90 __._ ~

3

90

5 213

Gráfica 7. Concentración de proteína a diferentes tiempos de secado, temperatura de 60" C y humedad inicial de 20%.

4

0

7 302

Concenlraci6n de proleina I dlferenter tiempos de secado y a una lempeialura de O O T u humedad de 20%

I60 140 120

$ 1 O0

80

60

40 20

O

E E

o knpo

u Coiw: De proleha

- --I_ 2 ..

1oc)

5 997

"

Tabla le . Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteina soluble en pgimg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Oasis" a una temperatura de 40°C y tiempos de secado diferentes y humedad inicial de 20%.

~ X p ( m i n u t o s ) ~ e m p e r a t u r a ("c) Concentración de proteína

pgimQ de muestra. 7.424 6.579

40 - 6.952 210 - 40 6.609

20 10.195 -_

Gráfica le . Concentración de proteína a diferentes tiempos de secado, temperatura de 40" C y humedad inicial de 20%.

.... .~ .... ~ ~ ~~~ ~ ~ ~ ~ ~-

Concentracibn de protein. adilerenter tiempos de sadado Y a una temperdui. de 4ü.C y humedad de 20%

400

a 300

200 'E 2 c V 1 100

O .~

~

allempo

OConc. De proteina

.. ~ ~

..

0 5

O

10 2

Concentración de prdslna (ugímg de mu

, .

Tabla 6. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteína soluble en pgimg en muestras de hqina desengrasedas de la variedad "Salamanca" a una temperatura de 40°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 20 %.

._

, *.

1.-

F

Concentracián de

r-

Gráflca 6. Concentracibn de proteína a diferentes tiempos de secado y L._

T- temperatura de 40" C. L

L .~ .~~ .~ . - ~

P- Conuntrrlón de protein. a dilerentar thmpos da secado Y a una temperatura da 40- y humedad de 20%

L

. . . .. I-

._

~ . . ~ ~ ~ .. . .. ~

Concentraclón de proteína (i@m de nuestra) ~ ~ .~ .

c-

L

I ~ ~ ~_ .~ .... .~ .

Tabla ld. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteha soluble en (iglmg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Oasis" a una temperatura de 100°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 18 %.

-- .. ~

Tiempo (minutos) proteína

@ma . de muestra. .

Gráfica l d . Concentración de proteína a diferentes tiempos de secado, temperatura de loo" C y humedad inicial do 18%.

Concentración de proteína a diferentes tiempos de secado, a una temperatura de 100°C y

humedad de lW0

u Tiempo 20 O aConc. De 4.912 10.195

proteína Concentración de proielna (ughg de muestra 1

- P

-

Tiempo (minutos) Temperatura ( 'C)

- 30 100 - 20 100

O (sin tratamiento) 20 .

Tabla 5. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteina solubie en pglmg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Salamanca" a una temperatura de 100°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 18 %.

Concentracidn de proteina

pgimg de muestra. 3.789

7.302

._

.-

Gráfica 5. Concenfración de proteína a diferentes tiempos de secado y temperatura de 100" C.

,.... ~ ._ . ~ .. . ~ ... ~ ~ ~ . ... . . .. . . .

Concentraclón de protelna a diferentes tlernpos de secado y

40

30

UJ

2 C .- E C al 20

a 10 E i= O al

O .- ~ Tiempo .. .. ~

Conc. DE , proteina

a una tern peratura de 1W'C .. ~~ . .. . .. ...~~ . . . ~ ~. ~ . . .- --

' I 2 30 4 I 20

.

3.789 I 5.969 Concentración de proteína (uglmg de muesti

_ _

Tabla 4. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteina soluble en pg/mg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Salamanca" a una temperatura de 80°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 18 Om.

I Tiempo (mlnutos) Temperatura ('C)

7.302 ___

Gr&Rca 4. Concentración de proteina a diferentes tiempos de secado y temperatura de 80" C.

- ._ _. - _ _ _ _ ... - --- ._ . _--. ..- - -.

Concentracibn de protelna a diferentes tiempos de secado y a una temperatura de 80%

8

-E ci 3 E

E al O p.

al E F ,

50 ~ ~ ~ .... . .. ..... . .....

- 1 40

6.841 .

Tiempo aConc. De

O 7.302

Concentración de proteína (ugimg d muestra )

Tabla lc. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteina soluble en Iigimg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Oasis" a una temperatura de 70°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 18 %.

Temperatura ('C) I Concentración de proteína

~ ~~~ pgLmg, de muestra.

. . 9.133 10.195

~

.. ~~~. ~. 7.293 . . __ ~~.

~ ~- ~

Gráfica IC. Concentración de proteina a diferentes iiempos de secado, temperatura de 70" C y humedad inicial de 18%.

Concentraclón de proteha a dllerentes tlempos de secado y a una temperatura de 70% y humedad de 18%

u> 80

9 c 60 '2 C u 40 O tl. 20 u

O F

U Tiempo I Conc. De

proteína

U 1

60

7.293

n rn 3 2

30 O

9.1 33 10.195

I h

Concentración de proteína (ugiing de muestra)

#-- c

Tabla 3. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteina soluble en pglmg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Salamanca" a una temperatura de 70°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 18 YO.

Temperatura ("C) Concentración de

. .. - __ p@rng.de - muestra. 70 6.931 I 70 6.258

proteína

70 5.604 ...

. ~~. 0 m!o!?mk?!!!ol.-.. .~, .~ . . 3.. ~ . ~ ~ . ~. . . ~... ~. ~7.302 .

- Tiempo (minutos)

.. 45 ~ . .... ~~ . - .-..- 60 ~

30 . ~

~~ ~ .. . . . ~ ~ ~~~ ~. .~... . ~ ~. ,~ .... ~ -

Gráfica 3. Concenlracion de proleina a diferentes tiempos de secado y temperatura de 70" C.

I Concenliaci6n de proieina a dllerentas liempos de recado y a una IemDeratuta de 70%

70

60

50

40 'E 5 30

20

10

O

4 e

1

45

6 931

! 60 2

5 604

-:I 'm 3

30

G 258

4

o 7 302

Concenlraclbn de proteina (uglg de mueaIiaJ

- *_.<. ." .. . . ... , I ' .. N

Tiempo (minutos) TempeZtura ('c)

Tabla Ib. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteína soluble en pglmg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Oasis" a una temperalura de 60°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 18%.

Concentracldn de

-

60 60 20

- __ -- ~-

-2glmg de muestra. 7.525 67639 7.654 8 480 10 195

____ __

Graiica Ib. Concentración de proteína a diferentes tiempos de secado, temperatura de 60" C y humedad inicial de 18%.

150

7525

-

Concentr8clbn de piolelna a diIerenles liempos de secado y a una lemperalura de M'C yhumedad de 18%

120 120

6639 7654

200

150

1 O0

50

O ib 4

90

8 48

-n 5

O

10 2

Concentracldn de poíelna (udmg de muestra)

. ... .. .. . . ~ ~~ ~ .. .

Tabla 2. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteina soluble en Iiglmg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Salamanca" a una temperatura de 60°C y tiempos de secado diferentes y humedad inicial de 18 70.

__ _..___r .-- ___ __ Tiempo (minutos) I Temperatura ("C) 1 Concentración de

protelna .._I iglmg _- de muestra.

~ ~

60 4.469

7.302 ~ . .

60 6.119 O e n tratamientg I ~~ ~~ 20 .

~

120 90

~.~ . ~ ~ . . . ~ . . .. ..- . ~~. . ~~~ ~

~ ~.

Grhflca 2. Concentración de proteina a diferentes tiempos de secado y temperatura de 60" C.

. . .. .. ~ . ~ . ,~ ConcentiacUn'de prolclna a dlfercnler'tlempos da secado y a una

temperatura de ü0.C

140

120 1 O0

EO 'E 5 60 & u 40 F

20

O

* c

o Tempo

nCnrn: De proteha

m 2 3 4 n 90 O

7 302

T

1

la 4 169 6119

Concenlracl6n de prolelna (ugfg de mueslra)

Tabla la. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de proteina soluble en Iigimg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Oasis" a una temperatura de 40°C y tiempos de secado diferentes y humedad inicial de 18 ?'in.

~ ~~ ~~ ~ ~ - ___ Tiempo (mlnutos) Temperatura ('C)

protelna

~~ ~ F-gi-mg ..- de muestra. __ 210 ~ - ~. 40 ~

120 40 ___ ~ _._.____ 7.212 ___..

60 ----- 40 ~ 5.922 20 -..~ 10.195

Gráfica la. Concentración de proteina a diferentes tiempos de secado, temperatura de 40" C y humedad inicial de 18%.

. . . ..I Concentración de protelna a diie;eniei~ikmpos'ie & d o y a un*

250

200 a 5 .5 150 E

100 5

50

imperatura de 40aC u humedad de le.%

.n- 2 . c-z1-. 1 3 4

~ ' 0 e.om 7.212 5.922 10 1%. 60 1 ~~

. . ~ 210 120

~ .

. . Concentrncl6n de piotclns luglmg de mucsiial

.. U.

j !

1: T i e m p i i T ('c)

- 40 - 40

- 40 210 40

O (sin tratamiento - 20

Análisis de Resultados.

Prueba de Bradford.

Concentración protelna de

pgmg de muestra. 7.752 7.503 8.312 6.991 7.302

Tabla 1. Resultados de la prueba de Bradford para la determinación de protelna soluble en pglmg en muestras de harina desengrasadas de la variedad "Salamanca" a una temperatura de 40°C y tiempos de secado diferentes y húmedad inicial de 18 Om.

Gráfica 1. Concentración de protelna a diferentes tiempos de secado y temperatura de 40" C.

.. ............ __ ... . . . . . . . . . ............. .. Concenír.cl6n de protelns e dlkrentea tiempos de secado y a une

400 350

300 250

200 150 100 50

E 5

temperatura de 40%

I ~ .. ~ ~ ~.

. . . . . . . .. .

. . . . . . . . . .

3 4 I 2 ........ ........... .........

210

6.991 . . . . . . . .

.. .. Conccntraclh de piotelna lugfg de muestra)

..... .....,._. ,- ..... ~ ...... ~.~ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ...- ...... T'

L

p w *, . r i ". *--- ii,\. , + . ~ ' . . '

ANALISIS DE RESULTADOS

Prueba de Bradford

* Tabla de resultados y graficas de los resultados obtenidos en la cuantificación de la proleina soluble en muestras de harina desengrasada de la variedad "Salamanca" y "Oasis", a diferentes tiempos de secado y una misma temperatura con humedad de 18%.

Temperatura de 40%

Temperatura de 6OoC

Temperalura de 70°C.

Temperatura de 8 0 T .

Temperatura de 100°C

* Tabla de resultados y gráficas de los resultados obtenidos en la cuantificación de la proteína soluble en muestras de harina desengrasada de la variedad "Salamanca" y "Oasis". a diferentes tiempos de secado y una misma temperatura con humedad de 20%

Temperalcira de 40%

Temperatura de G O T

Temperatura de 8OOC.

Temperatura de l 0OT

Gráfica "T. Representa la concentración de protelna en muestras de harina desengrasada de la variedad "Oasis" sometidas a diferentes tiempos y temperaturas de secado.

Concenbación de proteina en muesbes de harina desengrasada de la vatiedad "Oasis" pot el metodo de

Bradford

0.1 .I I

O 2 4 6 8 lo Conceniraclón de protelna (UgIiOOUt)

Resultados de las muestras desengrasadas variedad “Oasis”, haciendo el uso de la curva tipo para obtener la concentración de proteina .

proteina (iiglm(l) - 8 809 7 212

7.424 6 579 6 952 6 609 7 525 6 639 7.654 8 480 9 334 7 293

5 746 5 767 1912

5 922 __

9 -- 133 -_

Tiempo (minutos) Temperatura (“C)

- 18 18 18 20 20 20 20 18 18 18 18 20 18 18 20

18 - 20

210 40 120 40 60 40 300 40

40 270 240 40 210 40 150 60 120 60 120 60 90 60

60 120 60 70

70 30 30 80 20 1 O0

~ 20 1 O0

-____

--

--__ -

Concentración de I Humedad inicial

. - -,..7,--- ~--.--. .. . .., ..-----.* .. , . , . . - ... . _._ ... .. . <.< -. . __..... . . ,, . I RP

Grbfica Nol. Representa la concentración de proleina en mueslras de harina desengrasada de la variedad "Salamanca" sometidas a diferentes tiempos y temperaturas de secado

.... ~ . . . ~ . ~ . . ~ . ~ .. . ~ .., . . . . . .... ~ . . ...... ~~ ~ . .. .

Cenceniracl6n de proielna en mues&as de hatlna desengrasada da la mrledád "Sahmiinca" por el metodo de Bradford

b6

0 5

0 4

3 03 n

a i

0 2 4

o 1

O O

. .

b **

4. e 4*

4 4

**

I I

2 1 6 8 10

ConcenlracUn de protelna (uallooui)

Resultados de las muestras desengrasadas variedad "Salamanca", haciendo el uso de la curva tipo para obtener la concentración de proteína ,

Tiempo (minutos) Temperatura ("C) Concentración de Humedad inicial ~ _ _ _ _ _ _ ~ . proteína (pglmg) -

360 40 -_ 7 752 18 240 40 -__ 7 503 18 210 40 8 312 18 210 40 6 991 18 270 40 8 216 20 240 40 8 959 20 120 60 4.469 18 90 60 6 119 18 150 60 5 434 20 1 O0 60 5.997 20 90 60 5 213 20 45 70 6 931 18 60 70 5.604 18

6 258 18 6 429 20 6.841 18

1 O0 3 709 20 1 -____ O0 3 709 18

20 1 O0 5.969 18

Gráfica de la curva patrón, elaborada con Suero de Albúmina de Bovino, utilizando la prueba de Bradford.

0.7

0.6

0 5

O 4

H O 3 4 0 2

0.1

O

. . . . , . . . . ~ .... . ....,.

CUrvd patrón ¿e BSA pat id mhabdo da &adfor¿

2 5 ' 5 7 5 10 15 175 ñ)

Concentiecl6tc de protalha (ttgfioo üi)

25

Tubo BSA (pL) Agua( pL) BSAlpg 1 O 1 O0 O 2 O 1 O0 O 3 10 90 2.5/100pL 4 20 80 5.011 OOpL 5 30 70 7.5/1 OOpL

.___ 60 40 15/100pL 7 8 80 30 1 7.511 OOpL

6 - 40 60 1 O/l OOpL

9 90 20 20/100~iL 10 1 O0 O 20/100~iL

-

A cada tubo se les agrega 1000 p1. del reactivo y se lee a la misma absorbancia.

Para le reproducibilidad y confiabilidad de los resultados obtenidos se realiza todo por duplicado.

Rcalizaiido wid rcgrcsiáíi iincat tic los l idos arrojdos SE obluvo io SiRUiClilC:

r-0.9 Y 36 Y=O.O!2488x + 0.07801

TECNICA DE BRADFORD

Fundamento.Se basa en las dos formas de color que presenta el coloranle azul de Coomassie Brillante G-250, el rojo y azul, donde el primero es convertido en el segundo cuando interaccionan con los enlaces protelcos.

Un dia antes de la realizar la prueba, se preparan los reactvos a utilizar, el cloruro de sodio al 2% y el reactivo de Bradford; para la preparación del primero, se pesan 209 de NaCl en un vaso de precipitados, se disuelve poco a poco en agua destilada, pasandose seguidamente a un matraz aforado de un litro de capacidad y se afora a un volumen de un litro, se vierte en un frasco ambar para evitar su sedimentación.

Para el reactivo de Bradford se requieren los siguientes reactivos: -50 ml de elanol al 95%. -100 ml de ácido fosfórico al 85Y0 (w/v) -100 mg de colorante Azul de Coornassie Brillante G-250. -Agua destilada.

Primeramente se disúelven los 100 mg del colorante en los 50 ml de elanol al 95%, posterioermente se adicionan los 100ml de acido fosforico y se lleva a un volumen de 1 litro con agua destilada en un frasco ambar, guardándolo a una temperatura de 4°C.

De las muestras sometidas a una temperatura de secado de 40°, 60°, 80°, 100°C y desengrasadas, se pesan 1OOmg de harina, las cuales se colocan en un tubo de ensaye, se les agrega 5ml de NaCl al 2%, se agita en un vortex y se espera a que sedimente, posteriormente del sobrenadante se toman 1 OOciL de muestra y se les agrega 1OOOpL del reaclivo de Bradford leyendose a una absorbancia de 595 nrn, en un espectro Spectronic Genesys 5

Para la curva patrón se prepara la proteina BSA (suero de Albúmina de Bovino), se pesan 25 mg de ESA y se disuelven en 1OOrnl de agua deslilada, siguiendo la siguiente sereie de lubos:

c-

TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS CON MERGAPTOETANOL Y CENTRIFUGADAS.

Se colocan 4001iL del sobrenadante que se obtuvo al haberse terminado la etapa de centrifugación, se adicionaron 100 1iL de la solución 14, se ponen a ebullición los tubos por un tiempo de 5 minutos. Se dejan enfriar a temperatura ambiente y se colocan 15 pL en cada canal del gel. Donde la concentración final de la muestra problema de harina resultó ser de 3.2 x microgramos lrnicrolitro de muestra.

0.1 g de harina --------- 2500 pL de solución TRIS-SDS

X=0.016 1ig de harina ------- 400 1iL

0.016 ti9 ----- 500 biL

X= 4.8 x * O 4 pgll5 1iL de muestra

X= 3.2 x iigl 1iL de muestra.

Ya que se termino de colocar cada una de las muestras en los canales del gel, se colocan en la cámara que consiste de un resorvorio para la colocación del buffer de tanque, se ponen cada placa de vidrio en el soporte en ambos lados, se deposita el buffer de tamqiie y se verifica que no haya fugas, sino existen se llena la cámara a la mitad con dicho buffer y se coloca a la fuente de poder a 150 volts por un tiempo de 45 minutos.

AI cabo del tiempo se desconecta la fuente de poder, se relira de la cámara el buffer y los geles se desmontan de las placas de vidrio depositando los geles en cirtalizadores que contienen la solución coloranle se mantienen ah¡ por un tiempo de media hora, se les retira esta solución y se le agrega la solución decolorante, se le cambia tres veces esta solución o hasta que se vean transparentes los geles, se retira esta solución y se les agrega agua destilada y al siguiente dia se sacan del agua y se montan entre dos capas de papel celofan sobre una superficie lisa y de vidrio, siendo sostenidas las cpas de papel por una pinzas para evitar que enconjan los geles, se recortan y se identifican.

. -. -. .-

Tinción de los geles.

c

d

L

Una vez que tia transcurrido el tiempo de corrimiento de las proteinas en el gel, mediante el uso del aparato para electroforesis. Se colocan los geles en un cristalizador que contenga suficiente solución teñidora ( azul de Coomassie R- 250), por una hora, a continuación se elimina el exceso de colorante y se colocan en otro recipiente que contenga previamente la solución decolorante para que cubra el gel, esto último se repite cambiando 3 o 4 veces para que se logre una clarificación completa de los geles. Finalmente se adiciona agua destilada al gel y se deja por un espacio de 24 horas. AI termino de este tiempo se colocarán los geles para poder ser leidos en el densitornetro.

TRATAMIENTO DE LAS MUESTRAS SIN MERCAPTOETANOL Y CENTRIFUGADAS.

Se toman 3501iIL del sobrenadante que se obtuvo la haberse termiando la etapa de centrifugación, se adicionaron 150 riL de la soluci6n 14 (tratamiento de desnaturalizacion, no agregando a esta solución el mercaptoetanol) Se ponen a ebullición los tubos por un tiempo de 5 minutos Se dejan enfriar a temperatura ambiente y se colocan 10 IiL en cada canal del gel.

Donde la concentración final de la muestra problema de harina resultó ser de 2.8 x 10” microgramos /rnicroiitro

0.1 g de harina ------------2500 1iL de SDS-TRIS

X= 0.014 pg de harina ---------350 pL

O 014 1ig de harina -------400 IIL

x= 2.8 x io4 lig -----io I i ~

X= 2 8 x 10 -5 1ig/IiL de rnuestia de harina

25 mg de albumina---------IO0 rnl de agua destilada

2500 rnicrogramos---------I O0 000 microlilros.

87.5 micrograrnos ----------350 microlitros.

87.5 microgramos ---------600 microlilros

2.625 micrograrnos --------I 5 microlilros.

O. 175 micrograrnoslmicrolilro.

Montaje de las muestras en el gel,

Se colocaron 400 rnicrolilros del sobrenadanle que se obtuvo al haberse solubilitado las protelnas en la solucibn de cloruro de sodio al 2%, se adicionaron 100 microlilros de la solución 14 (Iralamienlo de desnaturalización). Se colocan los tubos de ensaye en agua ebulliendo por 5 minutos aproximadamenle Se dejan enfriar las muestras a temperatura ambiente Finalmente se agregaron 15 microlitros en cada Úno de los canales que tiene el gel Dando el mismo tratamiento a la albúmina y el reactivo de DALTON identificando cada una de las posiciones tornadas por cada una de las diferentes muestras analizadas La concentracih final de la mueslra problema de harina resull6 ser de 1 6 x I O 5 rnicrogramoslrnicrolitro

O 1 g de harina -------------5 O ml de la solución de NaCl al 2%

_._-_. . .. . . . _- ..~ .- ..,..., .., . . . , . . . ._ . . , - .;-.I,.-

PREPARACION DE LAS MUESTRAS.

Indicador de pesos molecu1ares:DALTON MARK VI.

Se debe mantener una relación 1 3, entre dicho marcadory la solución 14, dependiendo de la prueba se le agregara mercaptoelanol o no, obleniendose una concnetración de 1681iglliL, se pone a ebullición por cinco minutos, se deja enfriar a ternperalura ambiente y se colocan 15 1iL en un canal del gel

A continuacion se muestran los calculos para oblener la concentración

13 5mg-----------2 rnl ( agua destilada)

13,500 microlitros----2000 microlilros

X=6750 microlitros----I O00 microlitros

X=202 5 microlitros-----30 microlilros

202.5 rnicrolilros --;-----I 20 microlilros

25 31 microgramos------I 5 microlilros

X= 1 68 microgramoslmicrolilro

Albúmina :BSA

Se adicionan 3501iL de la solución de albúmina, previamente preparada se adicionan 15011L de la solucion 14, de la misma forma se agregara o no mercaploetanol, dependiendo la prueba obleniendose una concentración de 0.17511 I iiL, se pone a ebullicon por cinco minutos , se deja enfriar a temperatura ambiente y se colocan 15 1iL en el canal del gel.

Para la preparación de los geles se procedio de la siguiente manera:

GEL DE SEPARACI~N.

Se adicionan 2 34ml de solución 9 (acrilamida). 1.75ml de Buffer de separación, 70 1iL de solución SDS al IO%, 2 82ml de 1420, 30 IIL de persulfato de amonio, 30 IIL de TEMED. De esta preparación se toman 3ml y se colocan con la ayuda de una pipeta entre las placas de vidrio soportadas por bandas de plastic0 llamaas espaceadores. las cuales son previamente lavadas y colocadas en el soporte para verificar presencia de fugas colocando en dicho espacio alcohol, si no existe la presencia de fuga se procede a retirar en alcohol y entoces se colocan los 3ml del gel. con el fin de delinear la parte superior de este gel se colocan 30 1iL de alcohol isopropilico y se espera a que este gelefique

GEL DE EMPAQUETqMIENTO.

AI mismo tiempo en que el gel de separacion gelifica se prepara el gel de empaquetamiento donde se agregan 790pi de solucion SDS al lo%, 3.62 ml de agua, 301iL de persulfalo de amonio. 301iL de TEMED, se toman 1 5ml del gel y se colocan en las placas de vidrio seguido del primer gel se dejar burbujas en su interior y con la ayuda de un peine de teflon se forman los pozos o hendiduras en donde serán aplicadas las muestras, una vez gelificado se extrae con cuidado el peine y si hay creación de burbujas se eliminan aplicando buffer de tanque con la ayuda de una pipeta y de deja el buffer en los pozos para evitar que se seque el gel mientras se preparan las muetras a correr.

SOLUCION TEfiIDORA.

Se mezclaron 1.25mg de azul de Commassie R-250, con 92ml de ácido acetico glacial y se aforaron a un litro con una solución de etanol al 50% (V).

PERSULFATO DE AMONIO (AL loo/.)

Se pesaron O. 1 g de persulfato de amonio y se agregaron 1 ml de agua destilada (preparar al momento).

SOLUCION 14 (Tratamiento de desnaturalización)

Se mezclaron 2.5ml de la soluciOn 15, con 4ml de la solución 13 y se le agregan 2ml de glicerol y un ml del reactivo 2-mercaptoetanol y finalmente se le agregaron 0.25ml de azul de bromofenol al 1% y 10 in1 de agua destilada.

SOLUCION TRIS-SDS

Se pesan 1.211g de TRIS y se afora a 1OOml obteniendo una solución O 1M. se pesan 29 de SDS y se afora a IOOml con la solución antes preparada y se ajusta a un pH=8.

Una vez preparado; todos lo reactivos para correr las muestras, se procede a la extracción de la proteína de las mustras de harina con la solución TRIS-SDS, se pesan 0.lg de harina y se le agregan 2.5ml de la solución TRIS-SDS para obtener una relación 125, se dejan reposar durante 24 horas posteriormente se centrifuga a 17,000 r.p.m por un tiempo de una hora a una temperatura de 5" C (centrifuga Beckman J2-MI).

METODOLOGIA

TECNICA DE ELECTROFORESiS

Fundamento. Se basa en el movimiento que tiene un componente proteico a través de un medio eléctricamenle conductivo, en respuesta a una aplicación de vollaje. Por lo cual la carga eléctrica efectiva ylo el radio molecular son las caracteristicas bioqulmicas de las protelnas, que se han usado para el desarrollo de los procedimientos eleclofólicos. Además el pH, la fuerza iónica y la conductividad del medio son factores importantes que influyen en la movilidad de las moléculas durante el desarrollo elscforetico.

Preparacion de reactivos.

SOLUCION 9. Mezclar 14.69 de acrilamida con 0.49 de N,N'-methylene-bis-acrilamide aforados a 500ml de agua destilada, se almacena a 4" C.

BUFFER 11. (Buffer de separación) Se pesaron 9.0759 de TRIZMA BASE (Iris~Hidroximetil~aminomelano) y aforados a 50ml con agua destilada. ajustando el pH 8.8 con Hcl.

BUFFER DE TANQUE Se pesan 39 de TRIZMA BASE, con 14.49 de glicina y 1Oml de SDS al lo%, aforados a un litro con agua destilada.

SOLUCION 15 (Buffer de empaquetamiento) Se pesan 39 de TRIZMA BASE aforados a 50 ml.ajuslando el pH a 6 con Hcl

SOLUCION 13 (SDS al 10%) Se pesaron 5g de lauril sulfato (SDS, Sodium dodecylsulfate) y se afora con 50ml de agua deslilada.

SOLUCION DECOLORANTE. Se miden 75ml de ácido acetic0 glacial, 50ml de elanol y se afora con agua destilada a un litro.

METODOLOGIA

TECNlCA DE ELECTROFORESIS

Geles con diferentes muestras de harinas de ambas variedades

PRUEBA DE BRADFORD

O Curva patrón

O Tabla de resultados de concentración de proteína soluble.

O Gráfica de resultados de la concentración de proteína.

O Analisis estadisticos.

Diagrama de flujo de la malodologia en el proyecto de investigacion 'I

Determinación del efecto del trataminelo térmico del trigo sobre las propiedades del gluten".

1

+

.__ J J

OBJETIVO GENERAL

*:* Determinar y cuantificar el daño causado por el tratamiento térmico desecado en las proteínas del gluten de trigo.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

+:e Cuantificar proteínas en muestras desengradas de la variedad Oasis

*:* Aplicar las técnicas de Bradford y Electroforésis para este fin. y Salarnanca.

El trigo es uno de IOS cereales más importantes en el mundo, ya que es altamente versátil, pudiéndose cultivar en todos los continentes con un amplio rango de cultivares .adaptados a las condiciones del lugar, también presenta la propiedad de elaborar harina de trigo y masa que permite ser procesada para un amplio rango de alimentos incluyendo pan fermentado, pastas, pasteles y bisquets.

La transformación de harina de trigo en masa para pan es un complejo proceso todavía muy poco comprendido, cuando las partículas de harina se humedecen y luego se amasan se forma una masa coherente cuyo carácter viscoso-elástico se atribuye al desarrollo de un complejo coloidal denominado gluten. Las proteínas de la harina participan en la formación del gluten en la masa, que están presentes en una cantidad del 10 al 15% en las que están comprendidas a las gluteninas y prolaminas del citoplasma de las células del endosperm0 que actuan como componentes estructurales y de reserva de nitrógeno para su crecimiento, presentándose en menor cantidad las albúminas y globulinas, para llevar acabo su separación de cada una de las fracciones que integran las proteinas del trigo se hace mediante su propiedad de solubilidad. (2)

Las cuales son tradicionalmente clasificadas dentro de dos grupos, las gliadinas que son solubles en alcohol acuoso ( 60-70% etanol, 50% propanol) que están presentes como proteinas monoméricas las cuales sus cadenas simples tienen estructuras primarias cdn diferente composición de aminoácidos y su peso molecular varia desde los 15,000 a los 80,000, su conformación se estabiliza por medio de enlaces disulfuro intramolec:ulares, que al hidratarse forma una masa viscosa, extensible, fluida pero poco elástica y son las responsables de la expansión de la masa durante la elaboración del pan. Las gluteninas insolubles en alcohol, pueden separarse en una fracción que es soluble en. ácido acético diluido y una fracción que es insoluble en este medio, esta última esta formada Por subunidades de polipéptidos, cada uno de ellos mantenidos de manera compacta por enlaces disulfuro iiilramoleculares y estas asu vez en una forma más o menos lineal por enlaces disulluro inlerpolipéplidos. Las sububidades de glutenina solubles en ácido acético se cree que están unidas una a la otra y a los polipeptidos de la glutenina insoluble por enlaces secundarios como los de tiidrogeno, hidrofóbicos o enlaces de Vander Waals. La glutenina insoluble contribuye a la elasticidad y los enlaces móviles de la glutenina soluble contribuyen con el elemento viscoso del gluten.(3)

Con esto el gluten presenta cambios en sus propiedades viscoelásticas, las cuales se ha observado que tienen una relación direcla con el cambio en la solubilidad de la proteína. Uno de los métodos que se emplean para este tipo de determinación son el rnélodo de Bradford y Eleclroforésis.

I

I N T R O D U C C I O N

Conforme a transcurrido el tiempo se han llevado acabo una serie de pruebas para la determinación y cuantificación de proteínas en los alimentos, incluyendo los cereales, mejorando así la sensibilidad de los métodos obteniéndose resultados confiables.

Cuando los granos de trigo se someten a tratarnienlo térmico presentan danos por la acción del calor, esto sucede cuando el trigo se somete a un secado artificial para reducir su contenido de humedad, eslo trae como consecuencia que cuando se emplean temperaturas criticas de secado una desnaluralización en las proteinas en especial atención la glutenina reduciéndose as¡ la calidad panadera y nutricional del grano.

El trigo es el principal cereal utilizado para preparar harina la cual ha tenido un rol determinante en el desarrollo de las grandes civilizaciones por que contiene los valores nutricionales fundamentales para la dieta diaria. Por lo anlerior, se llevan acabo análisis fisicos, quimicos, reológicos que nos determinan su calidad.

El trigo contiene un 25% de humedad cuando es recién cosechado para ello es conveniente someterlo a un secado artificial para reducuir su contenido de agua al 14%, para que se mantega inalterable durante su almacenamiento as¡ mismo la conservación de su valor nuticional (1 )

Se empleo para este fin un secador de lecho fluidizado, sin embargo cuando la temperatura es muy excesiva llega a causar daño en el grano debido a la acción del calor provocando en el grano una coloración café oscura afectando así mismo el embrión y al endosperm0 en forma total (NOM-FF-36-1982), en donde también se debilitan los enlaces de las proteinas debido a su desnaturalización. ya que su función es formar el gluten que es el que proporciona a la masa las propiedades de exlensibilidad y elasticidad

El secado mediante lecho fluidizado ofrece alternativas interesanles, ya que hay equilibrio entre los sólidos que se someten a la fluidificación y el tratamiento térmico, es decir; hay una buena homegenización en el control de la temperatura del grano, además de que ofrece un excelente rango de transferencia de calor y masa entre el grano y los alrededores (aire), lo cual trae como resultado tiempos de residencia cortos.(?)

crwüsudIEn~0

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

MBxico D.F. , a de Junio de 2000

Doctor: Gerard0 Saucedo C. Director de la divisi6n de CBS

PRESENTE .

Por este conducto, me permito informarle que habiendo revis io el documento del informe final. del servicio social titulado: "CARACTERIZACION DE LA PR TEINA DE TRIGO SOMETIDAS A DIFERENTES TEMPERATURAS DE SECADO, presentado por la alumna Paola Bibiana Valencia Blanco, con matrlcuia 93231255. de la licenciatura INGENIERIA EN ALIMENTOS; cubre satlsfactorlamente los obJetivos planteados para el servicio social referido.

FECHA DE INICIO: 13 DE OCTUBRE DE 1998.

FECHA DE TERMINACION: 13 D E ABRIL DE 1999.

ASESOR: Liliana VBzquez Chavez. Cargo y adscripci6n: Profesor categoria "C" tiempo completo.

Sin mas por el momento queda de usted.

M. en C. Liliana Vazquez Chavez Profesor asociado "C" tiempo completo

Area de Alimenlos Depto. De Biolecnologla.

UNIDAD ILTAPAUPA Av. Michoacbn y La Purlsima. Col. Viceiitina. 09340 Mhico. D.F. Tel.: 724-4600 TELEFAX: (5) 612 0885

I I,,.¡< ( 3 , D.F. a de Junio de 2000.

1, 1' I Gerard0 Saucedo C I Y I ,r de la División de C.8

, , I:,;,: .NTE:

\JNlVtWJllAD AUTONOMA METROPOLITANA

1 I N I U Ail IL IAPALAFA fi * . ?v!¡ho;r&n y La Purlsima. Col. Vicelitina. 09340 MQxico, D.F. Tel.: 724.4600 TELEFAX: (5) 612 0885

..

I , iiiedio de la presente. me permito comunicarle, que el Informe final del trabajo del servicio i l l con Tltuio "CARACTERIZACION DE LA PROTEINA DE TRIGO, SOMETIDAS A

1 1 1 1 FRENTES TEMPEkATURAS DE SECADO tenla que ser entregado el 13 de abrll de 1999; 1 I ciiibargo por causas ajenas a nuestra voluntad se retrasó la fecha de entrega de dicho

* J ,-vfT to

1 ' I I , anterior le solicito de la manera mCis atenta. acepte este iniorme final

' r b 1.1 $s por el momento y agradeciendo de antemano su atención. quedo de Ud como su s s

Atentamente

Paota B Valencia Blanco