Linfoma  canino    Luis  Feo  Bernabé  

Resident  of    ECVIM-­‐CA  (Internal  Medicine)    Hospital  Ars  Veterinaria  

Barcelona  l.feo@arsveterinaria.es  

Definición

•  Enfermedad  sistémica,  progresiva  debido  a  la  proliferación  maligna  y  descontrolada  de  las  células  del  sistema  linfoide.  

•  Expansión  clonal  de  células  linfoides  con  caracterís?cas  morfológicas,  inmunofeno@picas  y  moleculares  específicas.  

Epidemiologia:  

•  5-­‐7  %  de  todas  las  neoplasias  del  perro    •  80%  de  los  tumores  hemopoie?cos  

•  Perros  adultos  (6-­‐8  años)  

•  Hembras  NO  castradas  posiblemente  menor  riesgo.  

•  Boxer,  bassethound,  san  bernardo,  terriers,  bulldog,          pastor  aleman,  roRweiler,  bull  mas?ff,  golden  retriver,  

labrador  retriever  y  beagle  

Factores  de  riesgo:  

•  Predisposición  gené?ca  y  aberraciones  cromosómicas:  •  Factores  ambientales:    

–  Exposición  a  benceno  –  Uso  de  herbicidas;  –  Exposición  a  humo  de  tabaco  –  Exposición  a  campos  magné?cos  

•  Causas  infecciosas  (virales);    –  Retrovirus?  

•  Causas  inmunomediadas  (uso  de  ciclosporina,  inmunosupresión)  

Linfoma  canino  

•  Existen  diferentes  clasificaciones  basadas  en:  – Localización  anatómica.  – Criterios  histológicos.  – Caracterís?cas  de  inmunofeno?paje.  – Molecular  

Historia  y  signos  clínicos  

Presentación  MÁS  frecuente:  linfadenopa@a  generalizada  y  asintomá?co.    Signos  clínicos  MUY  variados  e  inespecíficos:  – Anorexia,  pérdida  de  peso,  apa@a,  etc…  – PU/PD:  generalmente  en  hipercalcemia  asociadas  a  linfoma  de  ?po  T.  

Historia  y  signos  clínicos  

Signos  clínicos  menos  frecuentes:  – Discrasias  sanguíneas  – Anemia,  trombocitopenia  o  neutropenia.  – Fiebre  –  Infiltrado  pulmonar  (27-­‐34%  de  los  perros  con  linfoma  mul?centrico).  

– “Precaval  syndrome”  linfoma  medias@nico  

Historia  y  signos  clínicos  

Signos  clínicos  menos  frecuentes  – Los  signos  cutaneos  suelen  ser  generalizados  o  mul?focales  

– Nodulos,  placas,  ulceras,  eritema,  derma??s  exfolia?va  con  hipopigmentación  y  alopecia.  

– Siempre  puede  ser  linfoma?!!  

Diagnós?co  y  estadiaje  clínico  

•  Examen  Esico:  – LO  MAS  COMPLETO  POSIBLE  – Linfadenopa@a  generalizada  de  severa  a  moderada.  

– Muy  variada  en  base  a  localización    

Diagnós?co  y  estadiaje  clínico  

•  Hemograma,  bioquímica  y  urianalisis  – Anemia  no  regenera?va  normoci?ca  normocrómica  

– Mielop?sis  – Anemia  hemoli?ca  inmunomediada  secundaria  – Hipoproteinemia  (linfoma  alimentario)  – Gammapa@a  monoclonal  (6%)  – Depende  del  organo  afectado  

Diagnos?co  y  estadiaje  clínico  

•  Citología  – Los  ganglios  de  elección  prescapular  o  popliteo  – Población  homogena  de  linfocitos/linfoblastos  de  tamaño  mediano  o  grande  

– Abundantes  criterios  de  malignidad:    •  Nucleolos  visibles  •  Figuras  mitó?cas  •  Cuerpos  linfoglandulares  

Diagnós?co  y  estadiaje  clínico  

•  Citología  – En  la  mayoria  de  casos  (>80%)  es  suficiente  para  el  diagnós?co.  

– A  veces  es  dificil  diferenciar  entre  una  hiperplasia  reac?va  severa  vs  linfoma…  

 

Diagnós?co  y  estadiaje  clínico    

•  Biopsia  –  El  diagnós?co  del  linfoma  es  sencillo,  ya  que  en  la  mayoría  de  casos  se  puede  realizar  mediante  una  citología.  

–  Sin   embargo,   actualmente   con   este   sistema   perdemos  información  y  posiblemente  es  insuficiente.    

–  Para   completar   una   correcta   clasificación   del   linfoma   se  deben   realizarse   estudios   histopatológicos   con  inmunohistoquímica,   evaluación   de   la   clonalidad   y/o  inmunofeno?pado.  

–  La  información  adquirida  con  estas  técnicas  avanzadas  nos  orienta  mejor  en  el  tratamiento  que  vamos  a  realizar  y  el  pronós?co  de  la  enfermedad.  

Diagnós?co  y    estadiaje  clínico  

•  Biopsia  Preferible   el   linfonodo   entero,   incluiendo   la   capsula   aunque  también  es  posible  la  evaluación  de  una  parte.      

Diagnos?co  y  estadiaje  clínico  

•  Biopsia  – Las   primeras   clasificaciones   histopatológicas   del  linfoma   como   la   de   Kiel   sin   inmunofeno?paje  siguen   siendo   ú?les,   pero   actualmente   se  recomienda   el   estudio   inmunohistoquímico   para  una  mejor  definición  de  la  enfermedad.    

– La   organización   mundial   de   la   salud   (OMS)  recomienda   la   clasificación   del   linfoma   en   varios  grupos  según  el  origen  de  la  célula  afectada.    

Clasificación  de  la  OMS.  Tabla  adaptada  por  cortesia  de  Josep  Pastor  

Diagnós?co  y  estadiaje  clínico  

•  Biopsia  – Esta   clasificación  es   compleja   y   se  ha  propuestos  agruparla   en   7   grandes   categorías   que   pueden  tener  valor  pronós?co.    

Valli  et  al.  2013.  Tabla  adaptada  por  Josep  Pastor  

Supervivencia  media:  1.-­‐  351  d  2.-­‐  168d  3.-­‐  160  d  4.-­‐    412d  5.-­‐  213  d  +  frequente  6.-­‐    308d  7.-­‐  162d  

Alto  grado    categorías  3  y  7  >  mortalidad.  Bajo  grado  categoría  4  <  mortalidad    

Histopatología-­‐  En  resumen  

•  Los   linfomas   B   de   alto   o   grado   intermedio  suelen  responder  mejor  a  la  quimioterapia.  

•  Los   linfomas  de  bajo  grado  pueden  tener  una  supervivencia  media  más   larga   sin   necesidad  de   tratamientos   quimioterapicos   muy  agresivos.  

 

Diagnós?co  y  estadiaje  clínico  

•  Citometría  de  flujo  –  El  obje?vo  de  la  citometría  de  flujo  es  ayudar  en  la  clasificación  de  los  linfomas,  iden?ficando  la  es?rpe  celular  implicada.  

–  Su  u?lidad  en  el  diagnós?co  es  más  limitada  que  la  PARR,  ya  que  se  necesita  que  la  mayoría  de  células  sean  neoplásicas  y  siempre  debe  correlacionarse  con  estudios  citológicos  o  de  biopsia.    

–  Por  otro  lado,  la  simplicidad  de  realización,  los  pocos  efectos  adversos  en  la  obtención  de  muestra,  está  haciendo  de  ésta  prueba  una  herramienta  muy  ú?l  para  el  veterinario  clínico.  

Material  para  citometria  flujo  

SIZE

INTE

RNA

L CO

MPL

EXIT

Y

lymphocytes neutrophils

An?cuerpos  específicos  de  receptores  o  moléculas  de  membrana  o  intracelulares.  

CD45    MHCII  CD19  CD79a,b  CD10,CD20  IgM  CD21  

CD45    CD2,  CD5  CD3ε  CD7                                                                                                                        ?  CD1  CD3  CD4/CD8            

InmunofenoZpado  –  neoplasias  linfoides  

Diagnós?co  y  estadiaje  clínico  •  Citometría  de  flujo  •  El  inconveniente  más  importante,  son  las  consideraciones  de  

transporte  de  la  muestra,  y  el  elevado  coste  de  la  misma.  •  Existen  diferentes  marcadores  que  son  estudiados  en  la  

diferenciación  linfoide:  –  Linfocitos  T:  CD3,CD5,  CD4  y  CD8.  –  Linfocitos  B:  CD  21  y  CD79a.    –  Macrofagos:  CD  14.    –  Celulas  pluripotenciales  de  la  medula  osea:  CD  34      

•  De  esta  forma  mediante  la  citometría  se  pueden  iden?ficar  diferentes  sub?pos  de  linfoma,  algunos  de  ellos  correlacionados  con  diferentes  pronós?cos.  

Sub?pos  de  linfomas  en  función  de  sus  marcadores    

Servei d’Hematologia Clínica Veterinària

Facultat de Veterinària (Edifici V - VO-323) Universitat Autònoma de Barcelona. 08193-Bellaterra (Cerdanyola del Vallès), Barcelona.

Tel.: 93 581 20 66. Fax: 93 581 20 06. E-mail: shcv@uab.cat

ID PACIENTE: Nina, Martínez Núñez. Bichón Maltés hembra, 14 años MUESTRA: Linfonodo FECHA EXTRACCIÓN: 03/05/2016 HISTORIA: Linfadenopatía periférica marcada

CITOLOGÍA: Se remite SI NO

Compatible con linfoma/leucemia No disponible

Comentarios: La citología remitida el 03/05/2016 contiene mayor número de linfocitos intermedios que la citología previa, aunque todavía se detectan linfocitos pequeños.

MUESTRA: - Recuento automático: No se realiza. - Calidad: Óptima

15 % Células muertas

COMENTARIOS: Los hallazgos indican más de un 80% de células linfoides de tamaño intermedio positivas a CD21, lo que es consistente con un linfoma B sin atipias, con baja expresión de Ki67.

INTERPRETACIÓN: Linfoma B

Patólogo clínico: Josep Pastor

SOLICITANTE: Ars Veterinaria NIF/CIF: PERSONA DE CONTACTO: Luís Feo DIRECCIÓN: TELÉFONO: E-MAIL: veterinarios@arsveterinaria.es

ANTICUERPOS EMPLEADOS: CD45, CD14, CD18, CD4, CD8, CD21, CD5, CD3, CMHII, CD34, CD79a, Ki67 RESULTADOS: 82% de la población de linfocitos no-pequeños positivos a CD45, CHCMII, CD21 (98%), CD79a (98%) y negativos a CD14, CD18, CD5, CD3, CD4 y CD8. 10% positivos a Ki67.

INFORME INMUNOFENOTIPAJE

I-344

¿La  citometría  de  flujo  puede  diferencia  entre  reac?vo  y  neoplasia?  

2013  

PARR(PCR  for  an?gen  receptor  rearrangements)  

•  PARR  nos  informa  si  una  población  de  linfocitos  se  han  derivado  de  una  única  célula  o  de  múl?ples  células.  

•  La  presencia  de  monoclonalidad  es  muy  específica    (94%)  para  neoplasia  linfoide.    

•  El  PARR  detecta  el  80%  de  los  linfomas  (sensibilidad  del  80%)  •  Se  puede  hacer  en  cualquier  muestra  no  fijada  con  formalina,  

incluso  citologías  teñidas:  importante  para  LCR!!  •  Ú?l  para  el  diagnós?co  de  linfoma  en  casos  ambiguos.  •  Puede  detectar  una  célula  neoplásica  en  100  células.    

Ejemplo  de  un  gel  REACTIVE MONOCLONAL B

CELL + B B T

Clasificación  clínica  del  linfoma  (WHO)  

•  Zona  anatómica.  – Mul?céntrico  o  generalizado  (84%).  – Alimentario  (5-­‐7%).  – Tímico-­‐  Medias@nico  (5%).  •  Hipercalcemia  10-­‐40%  casos.  

– Cutáneo:  epiteliotrópico  o  no  epiteliotrópico.  – Leucemia.  – Otras  localizaciones:  •  Renal,  hepatoesplénico,  intravascular  angiotrópico,  granulomatosis  linfomatoide  pulmonar..etc  

Estadio  1:  media  324  d  Estadio  2:  media  218  d  Estadio  3:  media  199  d  

Clasificación  clínica  

•  Estadiage  clínico:  –  I.  Un  único  linfonodos  o  tejido  linfoide  en  un  órgano.  –  II.  Varios  linfonodos  en  una  región  anatómica  (con  o  sin  afectación  tonsilas).  

–  III.  Afectación  generalizada  de  los  linfonodos.  –  IV.  Afectación  de  hígado  y/o  bazo.  –  V.  Manifestación  en  sangre  periférica  o  médula  ósea.  

•  Subclasificado  en:  –  a)  sin  síntomas  clínicos.  –  b)  con  síntomas  clínicos.  

En   conclusión   la   clasificación   clínica  ?ene  cierta   importancia   en   el   pronós?co   y   a  veces  en  el  tratamiento.  

Tratamiento  •  “Hemos   hecho   numerosos   avances   en   el  d i a gnó s?co ,   c l a s i fi c a c i ón ,   g ené?ca ,  epidemiología,   diagnós?co   por   la   imagen,  aspectos   clínico-­‐patológicos   y   patológicos   del  linfoma  en  perros  y  gatos,  pero  el  hecho  es  que  los   ?empos   de   supervivencia   han   cambiado  poco  en  casi  3  décadas.”    

Dr.  Guillermo  Couto.  2015  

Tratamiento  

Doxorubricina  Vincris?na  Ciclofosfamida  Prednisona  

Tratamiento  

Tratamiento  de  rescate  

Protocolo  de  rescate   Chapter 32 Hematopoietic Tumors 625

performed.243,244 Although efficacy was established, enhancement of remission or survival durations over equivalent doses of native doxorubicin was not observed.

Treatment Approaches Using Immunologic or Biologic AgentsMonoclonal Antibody ApproachesIn the past decade, enhanced durability of first remissions in humans with non-Hodgkin’s B-cell lymphoma has been achieved primarily through the institution of monoclonal antibody (MAb)-based therapies (so-called R-CHOP protocols); the “R” refers to rituximab, a recombinant chimeric murine/human antibody directed against the CD20 antigen, a hydrophobic transmembrane protein located on normal pre-B and mature B lymphocytes. Fol-lowing binding, rituximab triggers a host cytotoxic immune response against CD20-positive cells. Unfortunately, rituximab does not have therapeutic activity in dogs due to a lack of external recognition of a similar antigen on canine lymphoma cells and the inherent antigenicity of human-derived antibodies in dogs.245,246 Another immunotherapy approach involved MAb-231, a murine-derived anticanine MAb (IgG2a). It mediates antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADDC) and complement-mediated cellular cytotoxicity (CMCC).247-249 It also prevented outgrowth of canine lymphoma xenografts in nude mice. In a noncontrolled clinical study of 215 dogs treated with CHOP-based chemotherapy and MAb-231, enhanced overall survival was observed; however, the antibody was removed from the commercial market in the mid-1990s without definitive randomized trials being performed. Several laboratories throughout the world are currently working to characterize and develop effective MAb therapies for use in dogs.

Antitumor Vaccine ApproachesSeveral antitumor vaccine approaches have been applied in dogs with lymphoma. A tumor vaccine extract using killed lymphoma cells combined with Freund’s adjuvant was administered to a small number of dogs after remission induction with combination che-motherapy.250 Prolongation of median survival was noted in the treatment group; however, a subsequent study revealed that prolon-gation was likely due to the Freund’s adjuvant.251 An autologous killed lymphoma tumor cell vaccine has been intralymphatically administered to dogs placed in remission using a combination che-motherapy protocol, and, although modest gains were reported in remission times, no survival advantage was found.252 An explor-atory vaccine study targeting telomerase253 (see Chapter 14, Section D) and one using RNA-loaded CD40-activated B cells254 in dogs with lymphoma have also been conducted. These studies involved small numbers of nonrandomized patients and lacked controlled populations for comparison. In a randomized study of 60 dogs with lymphoma comparing CHOP-based chemotherapy with CHOP-based chemotherapy and a human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) DNA cationic-lipid com-plexed autologous whole tumor cell vaccine, a small measure of immunomodulation was documented by delayed-type hypersensi-tivity; however, significant improvement in clinical outcome was not noted.255 Although little well-supported activity is reported to date with these immunomodulatory approaches, our basic under-standing of methodologies is expanding.

SurgeryMost dogs with lymphoma have multicentric disease and therefore require systemic chemotherapy to effectively treat their disease.

chemotherapeutic compounds from cells (see Chapter 11).239 P-glycoprotein is under the control of the MDR1 gene. MDR has been reported in canine lymphoma following exposure to chemotherapy.156a,225,240 Expression levels of mRNA encoding the canine MDR1 gene have been characterized in canine cell lines and lymphomas. Although expression of MDR1 mRNA correlated with in vitro drug sensitivity, it did not correlate with in vivo doxorubi-cin sensitivity in dogs with lymphoma in this study. Additionally, quantitative analysis of mRNA for 10 different drug-resistance factors was performed in 23 dogs with lymphoma.241 These dogs were divided into drug “sensitive” and “resistant” categories based on response to a CHOP-based protocol; however, significant differ-ences in expression were not observed in this small study.

Altering Drug PharmacokineticsMethods of increasing the time that tumor cells are exposed to chemotherapeutics should theoretically enhance tumor killing. These methods could include long-term continuous infusions (impractical in many veterinary situations), increasing the fre-quency of treatments, or enhancing the circulation time of drugs used. In one study, dogs with lymphoma received lower dose doxo-rubicin weekly rather than a higher dose every 3 weeks (thereby decreasing Cmax, which is associated with cardiotoxicity) in order to potentially increase the time of drug exposure.242 No benefit was noted, and, in fact, remission rates were inferior. Studies evaluating pegylated long-circulating doxorubicin-containing liposome drug delivery systems in dogs with lymphoma have also been

• Table 32-5 First-Line Rescue Protocol*

Cycle 1

Week 1 Baseline ALT ________ U/LL-Asparaginase 400 U/kg SQCCNU 70 mg/m2 POPrednisone 2mg/kg PO, once daily

Week 2 Prednisone 1.5 mg/kg PO, once dailyWeek 3 Prednisone 1.0 mg/kg PO, once dailyCycle 2Week 1 Optional ALT/ ________ U/L

L-asparaginase 400 U/kg SQCCNU 70 mg/m2 POPrednisone 1.0 mg/kg PO, EOD

Week 2 Prednisone 1.0 mg/kg PO, EODWeek 3 Prednisone 1.0 mg/kg PO, EODCycle 3 to 5Week 1 Mandatory ALT ________ U/L

CCNU 70 mg/m2 POPrednisone 1.0 mg/kg PO, EOD

Week 2 Prednisone 1.0 mg/kg PO, EODWeek 3 Prednisone 1.0 mg/kg PO, EODALT, Alanine aminotransferase; SQ, subcutaneous; PO, by mouth; EOD, every other day.*Treatment discontinuation criteria:1. After completion of protocol, two treatments beyond complete response

(CR).2. Progressive disease.3. Increase in ALT activity >2× upper limit of normal (or 2× baseline if higher

than upper limit of normal at initiation)—institute drug discontinuation and reinstitution/dose reduction depending on normalization of ALT.

Conocer  el  inmunofeno?pado  •  Importancia  en  el  tratamiento.  – Linfoma  B  (an?  CD20):  

•  CHOP  plus  Mab  ARATANA  an?  CD20  •  Doxo  +  Mab  an?  CD20.  Mejores  resultados  de  remisión  completa  pero  similar  supervivencia.  

– Linfoma  T  (an?  CD52):  •  Estudios  con  CHOP,  Lomus?na.  

Pronós?co:  •  Factores de mal pronóstico: -  Estadio V “b” -  Immunofenotipo T (excepcion: Linfoma de Burkitt/

linfoma a celulas pequeñas claras) -  Histopatología -  Linfoma mediastínico -  Hipercalcemia -  Raza grande -  Administración de Prednisona previa? -  Recaída antes de terminar el primer ciclo de quimio

Conclusión  

•  Linfoma  NO  es  una  única  enfermedad,  posiblemente  es  un  grupo  de  enfermedades  con  diferente  pronós?cos  (y  quizás  en  el  futuro  con  diferente  tratamiento).  

•  La  clasificación  histológica  y  citometría  de  flujo  pueden  aportar  información  pronós?co  en  muchos  animales.  

•  No  necesariamente  todos  los  linfomas  T  son  muy  “malos”.  

•  No  todos  los  linfomas  B  son  “buenos”.