ESTANDARIZACIÓN DE UNA METODOLOGIA ANALITICA POR ESPECTROFOTOMETRIA ULTRAVIOLETA PARA LA DETERMINACIÓN DEL

HIDROXIMETILFURFURAL EN MIELES DE ABEJA

STANDARDIZATION OF AN ANALYTICAL METHODOLOGY FOR HYDROXYMETHYLFURFURAL DETERMINATION IN HONEY

BY ULTRAVIOLET SPECTROMETRY

Natalia HINCAPIE V.1*, Mónica J. LÓPEZ S.1, Catalina VICTORIA A.1

RESUMEN

En este trabajo se presentan los resultados del desarrollo y estandarización de una metodología analítica para la determinación del HMF en miel de abeja por la técnica de espectroscopia de absorción ultravioleta, UV. El procedimiento consiste en evidenciar la presencia de este aldehído cíclico con incrementos de temperatura, utilizando un método de corrección de fondo, con medidas de absorbancia a longitudes de onda de 284 nm y 336 nm para la muestra y referencia respectivamente.

Los resultados obtenidos son tratados de manera estadística para hallar la linealidad, reproducibilidad, repetitividad, incertidumbre y sensibilidad del método realizado como parámetro fundamental en un proceso de estandarización.

Palabras clave: Espectrofotometría ultravioleta, miel, hidroximetilfurfural, HMF,

ABSTRACT

This work presents the results of development and standardization of analytical methodology for the determination of HMF in honey by means of ultraviolet absorption spectroscopy (UV). The procedure consists in evidence the presence of this cyclical aldehyde with increases in temperature, using a method of background correction, with measurements of absorbance at wavelengths of 284 and 336 nm for the sample and reference, respectively.

The results are treated statistically to find the linearity, reproducibility, repititividad, uncertainty and sensitivity of the method performed as parameters in a process of standardization .

keywords: spectrophotometry ultraviolet, honey,  hydroxymethylfurfural, HMFINTRODUCCION

Desde el punto de vista composicional, la miel de abejas es básicamente una solución

acuosa concentrada de azúcar invertido, que contiene además, una mezcla muy compleja de

1 Estudiantes, Facultad de Química Farmacéutica, Universidad de Antioquia, Ciudad Universitaria, Calle 67 53-108. A.A. 1226, Medellín, Colombia*Autor a quien se debe dirigir la correspondencia: nathiva17@gmail.com

otros hidratos de carbono, diversas enzimas, aminoácidos, ácidos orgánicos, minerales,

sustancias aromáticas, pigmentos, ceras, granos de polen, entre otros. Los azucares son el

componente mayoritario de la miel, representando, el 99-95% de la materia seca. La mayor

parte de estos no se encuentran en el néctar, sino que se forman durante la maduración y

almacenamiento de la miel. Las numerosas propiedades biológicas encontradas en la miel,

la convierten en un producto complementario de la alimentación humana y muy útil en

otros campos que nada tienen que ver con la alimentación. La miel es considerada un

producto natural por excelencia, sin embargo en los últimos años ha sufrido los efectos de

la industrialización y de la producción agrícola. Los elementos objetivos de la calidad de la

miel de abejas son extremadamente simples y se pueden reducir a tres fundamentales como

son:

La higiene: la miel de abejas no debe contener sustancias nocivas, su presencia se debe

fundamentalmente a los tratamientos con sustancias químicas, llevados a cabo durante su

producción.

Genuinidad: la miel de abejas no debe adulterarse.

Frescura: la miel debe mantener sus características naturales intrínsecas, su pérdida se debe

fundamentalmente a las prácticas de manejo en la colmena, los procesos de

industrialización con tratamientos térmicos excesivos y a las condiciones de temperatura y

tiempo de almacenamiento.

La miel comercializada, entre otras características de calidad, deberá tener determinadas

cualidades apreciables a simple vista por el consumidor que la distingan como son:

limpieza, nitidez, fluidez, coloración, homogeneidad y cristalización.

El proceso de industrialización de la miel, aunque es un proceso sencillo, presenta una serie

de inconvenientes que pueden tener una gran repercusión en la calidad de la miel

procesada, por tanto se hace un control exhaustivo de los tiempos y temperaturas de los

tratamientos industriales y del almacenamiento posterior, ya que no siempre estos son

controlados con la rigurosidad necesaria, repercutiendo en la calidad final de las mieles

comercializadas mermando en gran medida las propiedades beneficiosas de estas (1).

El hidroximetilfurfural es un aldehído cíclico (HMF, véase Figura 1) que se origina

espontáneamente a partir de la fructuosa en medio acido (valor medio de pH 3.9) en un

proceso lento. Este proceso es acelerado fundamentalmente por el calor: almacenamientos

de pocos días a 50°C tienen el mismo efecto sobre el aumento de HMF en miel que varios

meses a 20°C. También los calentamientos para la licuefacción o pasteurización de la miel

elevan los niveles de HMF. El HMF no es una sustancia toxica, ni altera la miel a no ser

que se encuentre en cantidad excesiva, lo que provocaría el oscurecimiento de la misma por

interacciones con compuestos aminados y azucares, sufriendo polimerización y

reordenación, tanto en presencia como en ausencia de oxigeno.

Figura 1. Estructura molecular del hidroximetilfurfural.

Fuente: Biblioteca Digital de la Universidad de Chile. Sistemas de Información de

Servicios y Bibliotecas. Disponibe en:

http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/ap/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/ap-

fisquim-farm11/c17.2.html.

Entre otros parámetros la formación de HMF esta correlacionado directamente con la

humedad y contenido inicial de HMF en la miel. También la acidez ejerce un efecto

positivo en su formación, comprobándose la existencia de una baja tasa de HMF en mieles

calentadas debido a su más alto pH (4.5-5.0).

El aumento del contenido de HMF de la miel es un proceso paralelo a la degradación de

vitaminas, proteínas y enzimas de este alimento, así como a la perdida de sabor y aroma por

lo que se ha convertido en el mejor parámetro indicador de la frescura de la miel y permite

juzgar sus condiciones de procesado y almacenamiento (2). Una miel natural, recolectada

en calentamiento particular, no contiene más de 5 mg de HMF por Kilogramo, el

recalentamiento, indispensable para la refundición antes del acondicionamiento, por

ejemplo, puede desarrollar algunos miligramos de HMF. Se deben tener en cuenta las

condiciones de comercialización, los tiempos y temperaturas de almacenamiento. En

resumen la presencia de HMF en la miel es siempre reveladora de las degradaciones

térmicas que sufrió el producto y es un indicador muy importante de la calidad y de la

frescura. Así la norma técnica colombiana (NTC) permite un máximo de 40 mg/Kg de

HMF, valores superiores a este indican mieles viejas de baja calidad y/o excesivamente

calentadas o adulteradas (3).

El hidroximetilfurfural de determina por el método propuesto por White basado en utilizar

dos porciones alícuotas de la muestra previamente clarificada mediante la adición de

reactivos Carrez y posterior filtración. Una de ellas, a la que se le adiciona 5 ml de agua

destilada, se lee frente a la otra, a la que se añade igual volumen de solución de bisulfito de

sodio el cual hace desaparecer la absorción debida al hidroximetilfurfural por rotura del

doble enlace conjugado, con lo que otras absorbancias inespecíficas son corregidas (4).

DESARROLLO EXPERIMENTAL

Materia prima

El presente estudio se ha realizado con miel procedente de Carmen de Bolívar la cual es

distribuida por productos alimenticios el Alpolen.

Equipos

Espectrofotómetro Agilent serie 8453 UV-VIS. Mewlett Packard. Rango de longitud de

onda 190-1100nm.

Balanza analítica Sartorius CP2245.

Baño maría Memmert

Material volumétrico

Tubos de ensayo

Embudos

Celdas de cuarzo

Papel filtro Whatman

Reactivos y soluciones

Agua para análisis

Etanol

Solución de ferrocianuro de potasio (Carrez I)

Solución de acetato de zinc (Carrez II)

Solución de bisulfito de sodio

Preparación de las soluciones

Solución Carrez 1: pesar 15 g de Ferrocianuro de potasio, transferir a un balón volumétrico

de 100 ml, aforar con agua destilada.

Solución Carrez II: Pesar 30 g de Acetato de zinc, transferir a balón volumétrico de 100 ml,

aforar con agua destilada.

Solución de Bisulfito de sodio: Pesar 0.20 g de bisulfito de sodio, adicionar 100 ml de agua

destilada.

Determinación del Hidroximetilfurfural

Se pesan 5 gramos de muestra de miel, a los cuales se le agregan 25 mL de agua destilada,

agitando para lograr total disolución de la miel, transferir esta solución a un balón

volumétrico de 50.0 mL. Adicionar luego 0.5 mL de solución Carrez I y mezclar, a

continuación agregar 0.5 mL de solución Carrez II y mezclar. Estas soluciones se utilizan

para eliminar la turbidez. Se pueden agregar gotas de etanol para suprimir la espuma si se

requiere. Aforar con agua hasta completar 50 ml.

Agitar y filtrar el contenido del balón con papel de Whatman. Los primeros 10 ml del

filtrado son eliminados, y el resto se colecta para su respectivo análisis. Se toman dos tubos

de ensayo: Colocar 5 ml del filtrado en cada uno de los dos tubos de ensayo, agregar al

contenido de uno de los tubos de ensayo 5 ml de solución de bisulfito de sodio y al otro

tubo de ensayo agregar 5 ml de agua destilada. El bisulfito de sodio destruye el HMF, por

lo que el contenido del primer tubo se usa como solución de referencia para medir la

absorbancia. El contenido del segundo tubo constituirá la solución de muestra a medir.

Nota: una vez agregado el bisulfito de sodio leer inmediatamente, ya que este fuera de

reducir el HMF puede reducir otras sustancias presentes en la miel.

Colocar las soluciones en celdas de 1 cm y medir la absorbancia a 284 y 336 nm para

muestra y estándar respectivamente, correspondientes a las longitudes de onda del espectro

de luz UV.

Si la absorbancia de la solución de muestra es mayor de 0.6, diluirla con agua y diluir la

solución de referencia con solución de bisulfito de sodio al 0.1% en la misma proporción y

corregir la absorbancia para esa disolución. Por último se determinan los miligramos de

HMF presentes en la muestra. (mg/Kg).

Todo el procedimiento de la metodología se realizó por triplicado sometiendo la muestra a

diferentes temperaturas y los respectivos resultados fueron analizados (4).

Anotaciones al método

Antes de proceder con el desarrollo de la metodología se verifica la idoneidad del

sistema analítico. El material volumétrico y el instrumental empleado se calibran

debidamente.

Para evaluar el incremento del Hidroximetilfurfural con la temperatura, una

cantidad suficiente de muestra se somete a la temperatura que se va a analizar

durante un tiempo de 45 minutos con agitación de la misma cada 10 minutos para

garantizar la transferencia de calor en toda la muestra; esta se enfría y se procede

con la metodología anteriormente descrita.

A la solución de referencia inmediatamente se le adicione la cantidad de bisulfito

establecida por el método realizar la lectura de la absorbancia.

Antes de proceder con la lectura de absorbancia tanto de la muestra como la de la

referencia se deben someter las celdas de cuarzo a un proceso de lavado con una

mezcla sulfocrómica para evitar posibles interferencias y obtención de resultados

negativos.

La metodología utilizada es un método de corrección de fondo, por lo cual no

necesita un blanco para realizar las lecturas de absorbancia; en caso tal que el

equipo necesite éste, se utilizará agua destilada para tal fin.

Para lograr reproducibilidad y repetibilidad en el método se debe tener cuidado con

el manejo del material volumétrico, para que no se vean afectados tales parámetros.

Cálculo para determinar el contenido de HMF en la muestra

Calcular la cantidad de Hidroximetilfurfural (HMF) en la miel con los datos de absorbancia

a 284 nm (A284) y 336 nm (A336), usando la siguiente fórmula: (4)

Factor = 14.97 = (126/16,830) (1000/10) (100/5).

Donde:

126 = peso molecular del HMF

16,830 = absortividad molar (ɛ) del HMF a 284 nm.

1000 = mg/g

10 = centilitros/L

100 = g de miel reportados

5 = peso nominal de la muestra.

Los resultados son expresados en mg/Kg, con una cifra decimal.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Con la ecuación arriba presentada se calcularon los miligramos de HMF que aparecen en la

tabla 1, que corresponden a los obtenidos por cada analista a diferentes temperaturas.

Los resultados obtenidos del análisis de HMF en miel, son tratados con Excel 2007, para

hallar los parámetros de desviación estándar, coeficiente de variación y la ecuación de la

recta. También se usa Start Grafic Plus 5.1, éste para hacer las comparaciones muestrales,

en procura de obtener las tablas de ANOVA y el gráfico de caja y bigotes. Todos los

análisis son aplicados con un grado de confiabilidad de 95 %.

Se compararon los resultados obtenidos por los tres analistas los cuales se presentan en las

figuras 1, 2 y 3, de allí se sacaron: los coeficientes de correlación (R2), las pendientes de las

curvas (B) y los interceptos (A) y éstos aparecen de manera resumida en la figura 4 y en la

tabla 2 con sus respectivas medias, desviaciones estándar y coeficiente de variación.

Tabla 1. Miligramos de HMF obtenidos por cada uno de los analistas a diferentes temperaturas.

Temperatura Analista 1 Analista 2 Analista 3

25°C

mg HMF mg HMF mg (HMF)

31,838 31,7326 31,8023

31,853 31,8673 31,8772

31,853 31,7925 31,6976

45°C

35,0768 36,6194 36,9748

36,3029 36,1261 36,7803

35,8394 36,8436 36,885

55°C

37,9705 38,2445 38,0385

38,5692 38,5888 38,0984

37,761 38,7235 37,9188

65°C

39,0978 39,5048 39,5899

39,6365 39,1911 39,9786

39,6215 39,0865 39,9637

75°C 42,41 42,6068 42,2636

42,3053 42,3225 42,1141

42,3202 42,3973 42,4729

85°C

45,0312 44,7757 45,1877

44,4925 45,2095 44,9034

45,0462 44,8205 45,1428

Figuras 1 y 2. Resultados obtenidos por los analistas, 1y 2 respectivamente

Figura 1 Figura 2

Figuras 3. Resultados obtenidos por el analista, 3 . Figura 4. Resumen de todos los resultados de los tres analistas, y allí se puede observar que dichos resultados no se encuentran muy dispersos entre sí.

Tabla 2. Magnitudes halladas por cada analista, de los parámetros: coeficiente de correlación (R2), el intercepto (A) y la pendiente (B). Al final (fila de total) se presenta la media (X), la desviación

estándar (S) y el coeficiente de variación (CV) de cada parámetro.

R2 A B

ANALISTA 1

0.982 0.994 0.993 25.75 26.82 26.11 0.219 0.206 0.216

ANALISTA 2

0.990 0.976 0.983 26.56 26.88 26.39 0.211 0.214 0.206

ANALISTA 3

0.989 0.992 0.983 26.43 26.81 26.64 0.215 0.208 0.211

TOTAL X= 0,987; S= 0,00613; CV=0.62% X= 26,43; S= 0,340; CV=1.29% X= 0.212; S= 0,0046; CV= 2,16%

Para comparar dichos estadígrafos, se aplicó el test de ANOVA, planteando las siguientes hipótesis:

1. Hipótesis nula: los tres analistas trabajaron de manera igual2. Hipótesis alternativa: los tres analistas trabajaron de manera diferente

Los resultados del test aparecen (véase tabla 3)

Figura 3

Gráfico X-Y Múltiple

TEMPERATURA EN C

VariablesCURVA 1CURVA 2CURVA 3CURVA 4CURVA 5CURVA 6CURVA 7CURVA 8CURVA 9

25 35 45 55 65 75 8531

34

37

40

43

46

31

34

37

40

43

46 Figura 4

Tabla3. ANOVA para los tres estadígrafos: coeficientes de correlación, pendientes e interceptos de las curvas, donde GL son los grados de libertad y CM son los cuadrados medios.

FuenteSuma de

cuadradosGL CM Cociente F Valor P

ANOVA para comparación de

R2

Entre grupos 0,0000722

20,00003611

0,95 0,4398Intra

grupos 0,00022876

0,00003811

Total0,0003009

8

ANOVA para comparación de

la pendiente

Entre grupos 0,00001756

20,00000878

0,350,7175

Intra grupos 0,00015

60,000025

Total0,00016756

8

ANOVA para comparación del

intercepto

Entre grupos 0,307222

2 0,153611

1,17 0,3729Intra grupos

0,7891336 0,131522

Total 1,09636 8

ANÁLISIS DE LA REPETIBILIDAD Y REPRODUCIBILIDAD

Las ANOVAs que fueron presentadas antes, y particularmente los valores p de las pruebas,

confirman la hipótesis nula de igualdad en los resultados reportados por los tres analistas.

De modo que no hay diferencia estadísticamente significativa entre esos resultados, con un

grado de confiabilidad del 95 %. Con esto se puede decir, que la reproducibilidad del

método es adecuada bajo las condiciones de trabajo realizado y que los resultados

obtenidos siempre serán similares.

La reproducibilidad y repetibilidad fue analizada como función de la dispersión entre los

resultados obtenidos por cada uno de los analistas y de todos ellos a cada temperatura. Para

ello, se aplicó el cálculo de desviación estándar y coeficiente de variación a cada

temperatura en la que se trabajó. (Véase tabla 4.) Y de manera gráfica el CV (Véase la

figura 5.) En la figura 6 se presenta el gráfico de caja y bigotes para los resultados

reportados a 45 0C que es la temperatura a la que se dio la mayor dispersión en los datos.

Tabla 4. Magnitudes de las medias y de algunos valores de dispersión: desviación estándar (S) y coeficiente de variación (CV).

Temperatura en 0C Media S CV25 31,8126 0,062459816 0,19633665

45 36,3831 0,62271469 1,7115472

55 38,2126 0,339660175 0,88887009

65 39,5189 0,33736391 0,85367666

75 42,3569 0,138412147 0,32677566

85 44,9566 0,233210326 0,51874534

Figuras 5. Se grafican las magnitudes de CV a diferentes temperaturas

Figura 6. Caja y bigotes para los resultados reportados a 45 0C.

En la figura 5 se observa que el valor mayor para CV es el obtenido a 45 0C, concordando

con la figura 4 en la que también se puede observar una mayor dispersión a esa

temperatura. Sin embargo el CV no llega al 2% que es el valor límite para este estadígrafo

reportado por algunos autores; incluso otros aceptan hasta un CV de 5 %. Para ampliar el

Gráfico de Caja y Bigotes

T 4535 35,4 35,8 36,2 36,6 37

análisis, en la figura 6 se presenta el gráfico de caja y bigotes a 45 0C, en el cual se observa

una ligera asimetría del lado izquierdo pero ningún dato atípico.

Por esto, se puede decir que el método es reproducible con un CV máximo de 1.71 % a las

condiciones del laboratorio.

ANÁLISIS DE LA LINEALIDAD

Partiendo de que todos los resultados reportados por los tres analistas deben ser tenidos en

cuenta ya que no hay datos atípicos y todos ellos son similares con una confianza de 95%.

Con esto se calcula la relación de linealidad entre concentración de HMF en mg y

temperatura en grados centígrados; encontrándose un R2 = 0.987 ± 0.018 para un grado de

certeza de 95%. La figura 7 presenta las magnitudes de los R2, y como se puede observar

ninguno de ellos tiene un valor estadísticamente diferente a los demás.

Figura 7. Caja y bigotes para las magnitudes de R2

Ecuación de la recta

De la tabla 1, asumiendo que la pendiente, el intercepto y el coeficiente de correlación tienen una distribución normal, teniendo en cuenta que la ecuación de la recta es: y = bx + a; se obtiene para análisis de HMF en miel con la corrección de fondo y la lectura hecha a la longitud de onda y según el procedimiento descrito, la siguiente ecuación:

mg HMF = (0,212±0,0138) * T + 26,43±1.02mgHMF con R2 = 0.987 ± 0.018

Donde la temperatura (T) es en 0C.

CONCLUSIONES

Gráfico de Caja y Bigotes

0,97 0,974 0,978 0,982 0,986 0,99 0,994

R2 todos

Se encontró reproducibilidad adecuada con la que se puede asegurar resultados similares cada vez que se realiza el método. De igual manera, también se considera que la repetibilidad es aceptable, ya que ningún resultado reportado es atípico.

Hay una relación lineal directa (R2= 0.987), entre el incremento de temperatura y la concentración de hidroximetilfurfural presente en la muestra de miel; resultado que lleva a concluir que a mayor temperatura de conservación de la miel, habrá mayor cantidad de ese derivado de degradación.

La temperatura a la que se encontró mayor dispersión entre los datos, manifestado por mayor magnitud en el valor del CV, fue a 45 0C, cuyo valor fue de 1.71 %. Por lo que esa es la incertidumbre del método aplicado bajo las condiciones propias del laboratorio; estando dentro de lo permitido.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Jhon Fredy Urrego, profesor de laboratorio de análisis de

alimentos y bromatología por su ardua colaboración, a la profesora Rosario Echeverry,

técnica y coordinadora del laboratorio de análisis de alimentos y bromatología por facilitar

los equipos e instalaciones requeridos para el desarrollo de dicha estandarización.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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