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Hiperhomocisteinemia en la fertilidad de las hembras carentes de la enzima
cistationina beta sintasa.
I Jornadas Científicas IIS AragónZaragoza, 8 de noviembre de 2010
Mª Ángeles Navarro FerrandoCP08/00043
La homocisteína es un aminoácido no esencial cuya elevación sanguínea se asocia con el desarrollo de enfermedades de tipo vascular, neurológico y reproductivo
HiperhomocisteinemiaEn el campo de la reproducción humana se ha visto que la hiperhomocisteinemia (Hhcy) es un factor de riesgo asociado a problemas placentarios como la preclampsia, abrupción, infarto placentario o aborto espontáneo.
Metilación de fosfolípidos, proteínas, DNA …
Proteínas
Metionina
Homocisteína
BHMT
Betaína
Remetilación
THF
MTHFR
Metilén THF
Metil THF
MS
Vit B12
Cistationina
Cisteína
Glutation
SerinaVit B6CBS
Vit B6
Transulfuración
S-adenosil metionina
S-adenosil homocisteína
ATPMAT
Dimetilglicina
Taurina Sulfato + CO2
α - cetoglutarato + NH4
SAH
SMMT
STHM
CGL
SH2
SH2
Metabolismo de la homocisteína
Deficiencia de la enzima cistationina beta sintasa (CBS) en la población
El defecto se transmite de forma autosómica recesiva
Incidencia homocigosis 1:58000 y 1:1.000.000heterocigosis 1:100
Valores de homocisteína en homocigosis pueden llegar hasta 400 micromolar
Ratones carentes de CBS
1. Los homocigotos presentan una hiperhomocisteinemia muy severa y logran completar el desarrollo embrionario normalmente
Parámetro μM Cbs +/+ Cbs -/-
Homocisteina 25,4 ± 4,8 353 ± 81a
Metionina 144 ± 12 2545 ± 241a
Animales de 2 semanas estirpe C57Bl/6J media ±SD a, p<0.001 t Student
(Akahoshi et al ,2008)
Ratones carentes de CBS
2. Presentan bajo peso al nacer, retardo de apertura del ojo, anormalidades esqueléticas tales como cara, cola y extremidades muy alargadas y delgadas. El pelo en el lomo es menos denso y con menor diámetro
WT (cbs +/+) KO (cbs -/-)
(Watanabe y cols., 1995)
Ratones carentes de CBS
3. El 80% de estos animales mueren antes de cumplir los 21 días
(Watanabe y cols., 1995)
0
20
40
60
80
100
0 5 10 15 20 25 30
día
% s
uper
vive
ncia
cbs -/-cbs +/+
Ratones carentes de CBS
4. Los hepatocitos de estos animales son de mayor tamaño con inclusiones lipídicas intracitoplasmáticas
(Watanabe y cols., 1995)
WT (cbs +/+) KO (cbs -/-)
Ratones carentes de CBS
5. Los machos que sobreviven son fértiles mientras que las hembras no lo fueron
(Watanabe y cols., 1995)
Matingfemale x male
Number of
mating
Number of plugs
Number of pregnacies
Number of pups Litters size
Number of surviving
pups
cbs +/+ x cbs +/+ 6 6 6 49 8 ± 2a 46
cbs +/- x cbs +/- 6 6 6 39 6 ± 2a 24
cbs +/- x cbs -/- 10 9 7 39 6 ± 1a 23
cbs -/- x cbs -/- 10 10 1 2 0.4 ± 1 0
Animales de 6 meses a, p<0.001 vs cbs -/- x cbs -/- anova.
Evaluación del comportamiento reproductivo en hembras en función del genotipo
( Guzman et al Human Molecular Genetics 2006. 15: 3168–76)
Evaluación del comportamiento reproductivo en hembras trasplantadas
MatingTransplanted female x male
Number of pups
Liter size
Number of surviving pups
cbs -/- ovary → cbs +/+ x cbs -/- 7 3 ± 1 7
cbs -/- ovary → cbs +/- x cbs -/- 12 3 ± 1 12
cbs -/- ovary → cbs +/- x cbs +/+ 3 2 ± 1 3
cbs +/+ ovary → cbs +/- x cbs +/+ 11 3 ± 1 11
( Guzman et al Human Molecular Genetics 2006. 15: 3168–76)
Investigación de los mecanismos implicados mediante la caracterización de los patrones de expresión de los
úteros grávidos en el momento de fallo del embrión.
Objetivo 2
• Grupo Control : WT (edad 12 semanas)♀ Cbs +/+ X ♂ Cbs +/+n=24
• Grupo Homocigoto: Cbs KO (edad 12 semanas)♀ Cbs -/- X ♂ Cbs -/-n=24
Grupos experimentales
♀ gestantes sacrificadas a día 4, 8, 12 y 16 de gestación (n=6)
Eutanasia con CO2
Ayuno
HomocisteínaCisteína Lípidos
Plasma
Análisis de expresión
Tejidos
Análisis proteómico
Análisis histológico
Toma de muestras
Diseño experimentalgestación
Registro de pesos y nº de sitios de implantación
día 4,8,12,16
(Ovario, útero, embriones, placenta)
Investigación de los mecanismos implicados mediante la caracterización de los patrones de expresión de los
úteros grávidos en el momento de fallo del embrión.
Objetivo 2
Análisis de expresión de los úteros a día 8 de gestaciónGrupos experimentales
Útero hembras cbs +/+
Útero hembras cbs -/-
con
sin
Sitios de implantación
Análisis de expresión de los úteros a día 8 de gestación
• Extracción y limpieza de RNA
•Análisis de expresión (Affimetrix gene chip).
•Identificación de los genes sobreexpresados y reprimidos en las diferentes condiciones experimentales con respecto al grupo control
•Confirmación a nivel individual por real time PCR
Procedimiento experimental
3.Recuperación del fenotipo de fertilidad femenina por ingeniería genética y terapia celular.
4.Inducción del fenotipo de infertilidad en ausencia de expresión de cbs utilizando siRNA.
5.Ratificación de los mecanismos propuestos en el objetivo 2 al verse corregidos en la recuperación del fenotipo.
Objetivos Futuros