DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

CARRERA DE INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA

GENETICA

Calvopiña Flores Jonathan Alexander

Resumen artículo científico: Herencia Extracromosómica

Enero 08 del 2015

SEMESTRE: octubre 2015 – febrero 2016

Transferencia bacteriana de amplio DNA genómico funcional en células humanas

La transferencia eficiente de vectores basados en el cromosoma en células de mamífero es difícil, debido principalmente a su gran tamaño. Usando un vector invasivo de Escherichia coli genéticamente diseñado, el ADN satélite alfa clonado en el cromosoma artificial basado en P1 fue entregado de manera estable en la línea celular HT1080 y generó eficientemente cromosomas artificiales humanos de novo.

Del mismo modo, un gran regulador de conductividad de transmembrana de la fibrosis quística genómico (CFTR), construcción de 160 kb, que contiene una porción del gen CFTR se propagan de forma estable en el vector bacteriano y se transfieren a células HT1080 donde se transcribió y empalmó correctamente, lo que indica la transferencia de un locus intacto y funcional de al menos 80 kb.

Estos resultados demuestran que las bacterias permiten la clonación, la propagación y la transferencia de grandes fragmentos intactos y funcionales de DNA genómico y su posterior entrega directa en las células para el análisis funcional. Este enfoque abre nuevas perspectivas para la terapia génica.

El primer requisito para que se produzca la transferencia de genes de las bacterias a las células de mamíferos es la internalización celular eficiente de las bacterias, que varía dependiendo de la línea celular. El porcentaje de células HT1080 infectadas inicialmente se determinó mediante análisis de citometría de flujo de células fluorescentes después de la invasión con bacterias que expresan GFP bajo el control de un promotor procariota.

La E. coli que alberga un plásmido que dirige la síntesis de GFP en las bacterias, se usó en multiplicidades de infección en la proporcion (MOI) (bacterias / células de mamíferos) de 5 o 25 para infectar HT1080. Después de unas 2 horas de coincubación, las células se lavaron y se incubaron en el médium completo que contenía 20 mg / ml de gentamicina para destruir las bacterias extracelulares.

Después de 45 min de incubación, las células se trataron con tripsina y se analizaron por citometría de flujo. En una MOI de 5, el 74.5% de las células eran fluorescente, y a una MOI de 25, el 97.6% de las células eran fuertemente fluorescentes. Bacterias intracelulares viables se enumeran después de la lisis celular suave; el número de bacterias viables por célula se calculó a partir del número de bacterias recuperadas por pocillo.

El número de bacterias intracelulares viables recuperadas fue 0.25 por célula en una MOI de 5 y 1.2, y en una MOI de 25. La discrepancia entre el número de bacterias viables recuperadas de las células y el porcentaje de células positivas para GFP se puede explicar por el hecho de que las bacterias muertas o moribundas pueden seguir siendo GFP positivo. En conjunto, los resultados indican que, a una MOI de 25, casi todas las células habían internalizado al menos una bacteria productora de GFP. La viabilidad celular en 48 horas después de la infección, varió desde 90 hasta 50% para una MOI de 5 y 25, respectivamente.

Varios laboratorios han demostrado recientemente que las bacterias pueden transferir genes funcionales a una gama muy amplia de células de mamífero. Las cepas atenuadas de Shigella, E. coli invasivos, Salmonella y Listeria son capaces de transferir DNA de plásmido a células de mamífero. Las bacterias utilizadas para la transferencia a las células fagocíticas y no fagocíticas son patógenos intracelulares facultativos que han sido diseñados para lisar después de la invasión celular.

Hasta ahora, esta propiedad se ha explotado principalmente para desarrollar vacunas de DNA basado en la capacidad de Shigella y Salmonella para dirigir células dendríticas. Más recientemente, las bacterias invasivas también han sido utilizadas como vectores de DNA para la terapia génica. La administración a ratones genéticamente inmuno-deficientes de Salmonella avirulenta que llevan el gen de IFN-g por plásmido murino dio lugar a la expresión del transgén dentro de los macrófagos y las células dendríticas y la corrección del defecto genético.

En conclusión se ha mencionado que tomando ventaja de la proximidad de la mucosa intestinal a las bacterias luminales, se ha entregado con éxito un gen terapéutico a la mucosa del colon de los ratones. La E. coli (BM2710/pGB2Oinv-hly) fue capaz de entregar el gen TGF-b1-plásmido realizado en la línea celular epitelial del colon CMT-93, y de la administración oral a ratones de las bacterias redujo significativamente la gravedad de la colitis experimental inducida por TNBS.

Además los vectores basados en el cromosoma se consideran que son potencialmente útiles para introducir genes exógenos en células de mamíferos, ya que al replicarse de forma autónoma y al tener capacidad de clonación ilimitada, permite la inserción de genes enteros con su endógeno adecuado y elementos reguladores específicos de tejido. Por lo tanto, las técnicas simples y eficientes para transferir estas moléculas muy grandes en células de mamífero necesitan ser desarrolladas.

Ya que concretamente hay una gran variedad de enfermedades genéticas de las cuales este tipo de vectores funcionales viables con plásmidos que permiten la inserción de nuevos genes al genoma humano y replicarse con existo, podrían intervenir en esos errores del DNA para solucionar problemas de índole expresivo, es decir corrigiendo correctamente un gen mal formado o por una deleción, se obtendría las proteínas apropiadas para el correcto funcionamiento de los mamíferos, en su metabolismo o morfología.