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Universidad de Panamá Docencia Superior Claudia González 8-791-903 Guión Pedagógica 1. La secuenciación es el conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN. Secuenciación Antes se utilizaba el método químico conocido como Secuenciación de Maxam- Gilbert Esta ha quedado en desuso debido a su complejidad técnica, el uso extensivo de productos químicos peligrosos y los reactivos que se usan no se pueden adaptar para utilizarse en un kit biológico estándar. 2. Antecedentes:

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Universidad de PanamáDocencia Superior

Claudia González8-791-903

Guión Pedagógica

1. La secuenciación es el conjunto de métodos y técnicas bioquímicas cuya finalidad es la determinación del orden de los nucleótidos (A, C, G y T) en un oligonucleótido de ADN.

Secuenciación

Antes se utilizaba el método químico conocido como Secuenciación de Maxam- GilbertEsta ha quedado en desuso debido a su complejidad técnica, el uso extensivo de productos químicos peligrosos y los reactivos que se usan no se pueden adaptar para utilizarse en un kit biológico estándar.

2. Antecedentes:

3. En la actualidad se basa en el método de Secuenciación Sanger (método enzimático)El principio clave es el uso de didesoxinucleotidos trifosfato (ddNTPs) como terminadores de la cadena de ADN.

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4. El método está basado en el uso de dideoxinucleótidos (ddNTP) que se diferencian de los deoxinucleótidos (dNTP) en que carecen del grupo OH en el carbono 3' de la ribosa.

5. Actualmente se utilizan los secuenciadores automatizados.

6. En estos los productos de la reacción se detectan directamente durante la electroforesis al pasar por delante de un láser que al excitar los fluoróforos permite detectar la fluorescencia emitida.

7. Para logra llegar a la fase de secuenciación es necesario realizar distintos pasos previos.

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8. Primero se debe identificar el organismo que se desea secuenciar.Se realiza la extracción de Ácidos Nucleicos, ARN o ADN. Luego se realiza la amplificación del extraido, se identifican por electrodoresis, cuantifican y luego se secuencian.Y por último el análisis de las secuencias.

9. Primer paso identificar si se va a utiilizar ADN o ARN.Las muestras de interes deben ser almacenadas con los cuidados pertinentes.

10. Realizar la extracción se basa en la purificación del ácido nucleico de interés ya sea por metodologías como las columnas, magnética o alcoholes

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11. Se amplifica la región de interés utilizando el método de PCR.

12. Luego se realiza un gel de electroforesis de agarosa para identificar la banda y que no haya contaminación en la corrida.

13. Una vez se identifica la banda se procede a la purificación .La purificación en esta fase se basa en la eliminación los restos de primer y los dineuclotidos libre que pueden interferir con la reacción de secuenciación.

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14. Para lograr una reacción de secuenciación balanceada es necesario cuantificar la cantidad de amplificado. Se puede utilizar con equipos o mediante una comparación en una electroresis con una escalera de cuantificación.

15. Una vez se tiene el producto

cuantificado y purificado, se realiza la reacción de secuenciación.

16. En esta reacción Se utilizan los primer , el Big dye terminator, los dinucleotidos, los dideoxinucleotidos y tu purificado.

17. Antes de lograr la detección de las secuencias es necesario eliminar los restos de dineuclotidos libres y dideoxinucleotido, }

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18. Esto se realiza mediante una variedad de metodologías como lo son las que utilizan alcoholes, resinas y columnas.

19.La detección se realiza en el equipo abi 3130, el cual realiza una electroforesis capilar, es decir nuestros fragmentos de interés migran a través de un capilar hasta llegar al un laser en el cual es detectado..

20. El análisis de las secuencias se realiza con programas especiales que permiten la edición de las mismas, y a su vez identificar lo que está en estudio.

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21. Las aplicaciones son diversas en la secuenciación.

22. se pueden identificar organismos, determinaran mutaciones las cuales confieren resistencia a algún medicamento y la identificación de mutaciones por ejemplo en el cáncer

23. Gracias por su atención