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UNIVERSIDAD PERUANA CAYETANO HEREDIA
FACULTAD DE MEDICINA ALBERTO HURTADO
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE TECNOLOGÍA MÉDICA
PREGRADO EN TECNOLOGÍA MÉDICA
INSTRUMENTOS Y EQUIPOS DE LABORATORIO II
GUIA DE PRACTICAS DE
INSTRUMENTOS Y EQUIPOS DE LABORATORIO II
2013-I
LIMA-PERÚ
INTRODUCCION
El laboratorio clínico contribuye en la prevención, diagnóstico y tratamiento de
diversas patologías. En el se congregan disciplinas como, Química Clínica,
Hematología, Inmunología y Microbiología, cada una de las cuales se vale de una
serie de principios, procedimientos, técnicas, metodologías, empleando diferentes
materiales, instrumentos y equipos que aplicados a cabalidad llevan a resultados que
constituyen valiosos recursos en la atención médica.
No nos extraña entonces que el curso de instrumentación y equipos en
laboratorio, se incluya en la currícula por ser uno clave en la formación de los futuros
tecnólogos médicos, el cual busque por sobre todo la familiarización con los
instrumentos y equipos de uso en el laboratorio, así como el desarrollo de un
pensamiento critico, fomentando a la vez el trabajo en equipo. En este curso se
expone el por que y como se emplean los materiales, reactivos e instrumentos en un
ensayo o determinación de un analito, las potencialidades y limitaciones de los
diferentes equipos para que así los alumnos logren asumir con criterio los problemas
analíticos, basándose en la aplicación de fundamentos teóricos que se consoliden en
la experiencia durante las practicas.
En la actualidad contamos con instrumentos algunos mas complejos que otros
y la automatización ya es una realidad en las diferentes áreas del laboratorio, sin
embargo no se puede trabajar con equipos automatizados si no se comprende las
bases de su funcionamiento. Si bien es cierto en el siglo XXI, las pruebas de
laboratorio pueden resultar sencillas, lo complejo e interesante es comprender la
esencia de la tecnología, los principios físicos, químicos, biológicos que se aplican en
cada análisis, dado que la tecnología no es mas que la aplicación de la ciencia.
“Él que no sabe lo que está buscando no comprenderá lo que encuentra”
Claude Bernard
INDICE
Práctica Nº 1: Espectrofotometría. Equipos automatizados Microlab 200
Práctica Nº 2: Espectrofotometría. Preparación de curvas de calibración. Parte I
Práctica Nº3: Espectrofotometría. Preparación de curvas de calibración. Parte II
Práctica Nº 4: Automatización en Hematología
Práctica Nº 5: Automatización en Química Clínica
Práctica Nº 6: Espectrofotometría. Casos prácticos y aplicaciones
Práctica Nº 7: Automatización en Banco de Sangre
Práctica Nº 8: Automatización en coagulación
Práctica Nº 9: Potenciometría
Práctica Nº 10: Inmunocromatografia
Práctica Nº 11: Enzimoinmunoensayos: ELISA no competitivo
Práctica Nº 12: Enzimoinmunoensayos: ELISA competitivo
Práctica Nº 13: Fijaciones y coloraciones en el laboratorio clínico y anatomía
patológica
Práctica Nº 14: Cromatografia em papel /TLC
Práctica Nº 15: Electroforesis de proteínas
PAU T AS P ARA EL INFORME DE PRACTICA DE LABORATORIO
Hoja de datos o carátula
Contiene al menos el nombre completo, código del alumno, titulo de la
práctica, nombre del curso, ciclo y año.
Introducción
Contiene los principios teóricos, entre otros conceptos generales, y resumir los
fundamentos lógicos para la realización del mismo y se indicara el objetivo y se
presenta el tema de la práctica.
Material y Métodos
Se identificarán los métodos, aparatos (reseñar el nombre del fabricante y su
dirección entre paréntesis), y los procedimientos utilizados con detalle suficiente
como para permitir a otros profesionales reproducir los ensayos. Se facilitarán las
referencias de los métodos, incluidos los métodos estadísticos (consultar en
referencias bibliograficas) y se suministrarán referencias y breves descripciones de
los métodos que aunque ya estén publicados no sean muy conocidos; se describirán
los métodos nuevos o sustancialmente modificados y se darán las razones para
utilizarlos, evaluando sus limitaciones. Se identificarán con precisión todos los
reactivos y productos químicos utilizados, incluyendo los nombres genéricos y
concentración utilizados.
Así mismo se describirán como fueron realizados los ejercicios durante la
sesión práctica, la forma de realizar los cálculos y como se obtuvieron los
resultados para cada variable cuando amerite.
Resultados
En el texto, las tablas y las figuras, los resultados se presentarán en un orden
lógico. No se debe repetir en el texto la información de las tablas o figuras; se
destacarán o resumirán sólo las observaciones relevantes obtenidas durante la
práctica.
Discusión y conclusiones
Se comenta lo aprendido, se discuten los resultados obtenidos. En este se
destacarán los aspectos nuevos y relevantes de la práctica, así como las
conclusiones que de ellos se derivan. Hay que evitar repetir de forma detallada
información u otro material ya facilitado en la Introducción o en el apartado de
resultados.
Las conclusiones se vincularán a los objetivos de la práctica y se evitará
realizar afirmaciones no cualificadas y conclusiones que no estén plenamente
respaldadas por los datos. Se deberá evitar en particular hacer declaraciones sobre
los beneficios económicos y los gastos, a menos que su práctica incluya información
y análisis económicos. Hay que evitar reclamar prioridad y aludir a un trabajo que
aún no esté terminado. Se establecerán nuevas hipótesis cuando estén claramente
justificadas. Cuando sea conveniente se incluirán recomendaciones.
Cuestionario
Desarrolle adecuadamente las preguntas indicadas en la guía o en práctica.
Referencias bibliográficas.
Indique el material consultado.
Las referencias bibliográficas se redactarán siguiendo las Normas de
Vancouver. http://www. u pch.edu.pe/vrinve/doc/nvanco.htm
Artículos:
Primero debe aparecer el nombre del autor o autor corporativo, colocando el
apellido de cada autor seguido de la inicial del nombre, pueden citarse hasta seis
autores, separados por comas; si son mas de seis se anotarán los tres primeros y se
agregará "et al", se debe colocar un punto al final de la inicial del nombre del último
autor y a continuación se citará el título del artículo en el idioma de origen terminando
en punto seguido. A continuación el nombre de la Revista (en abreviatura reconocida
internacionalmente) y el año de publicación seguido de un punto y coma, luego el
número del volumen seguido del número de la publicación entre paréntesis luego
dos puntos, finalizando con las páginas en que aparece el artículo y un punto final.
Ejemplo
Rey de Castro J, Vizcarra D. Frecuencia de síntomas del Síndrome Apnea
hipopnea del sueño e insomnio en médicos de una clínica privada peruana.
Rev Med Hered 2003; 14(2):53-58.
Opcionalmente, se admite la omisión del número en las revistas con
paginación consecutiva para los números dentro de un volumen
Ejemplo:
Rey de Castro J, Vizcarra D. Frecuencia de síntomas del Síndrome Apnea
hipopnea del sueño e insomnio en médicos de una clínica privada peruana.
Rev Med Hered 2003; 14:53-58.
Libros:
Autor y/o coautores (presentados en igual forma que para los artículos
originales), título del libro, nombre de la ciudad donde se editó el libro, nombre de
la Editorial, punto y coma, año de publicación, punto, colocar letra P, dos puntos y
el número de las páginas consultadas.
Ejemplo:
Jiménez SA. Interpretación clínica del electrocardiograma. 3ra edición.
Bucaramanga. Publicaciones UIS; 1995. P: 87.
Capítulos de libros, folletos o similares:
Primero debe aparecer el nombre del autor o autor corporativo, colocando el
apellido de cada autor seguido de la inicial del nombre, pueden citarse hasta seis
autores, separados por comas; si son mas de seis se anotarán los tres primeros y se
agregará "et al", se debe colocar un punto al final de la inicial del nombre del último
autor y a continuación se citará el título del artículo en el idioma de origen terminando
en punto seguido y luego la preposición " En: ", seguida del nombre del Autor y/o
coautores (presentados en igual forma que para los artículos originales), título del
libro, ciudad donde se editó el libro, nombre de la Editorial, punto y coma, año de
publicación, punto, colocar letra P, dos puntos y el número de las páginas consultadas
Ejemplo:
Addison RG, Blonsky ER. Pain. En: Conn's Current Therapy, Rakel ER.
W.B. Saunders Company, Philadelphia; 1988. P: 1-5.
Tesis:
Nombre del autor en igual forma que para los artículos. Título del trabajo,
punto seguido, especificar el grado optado, punto seguido. Ciudad y país donde se
sustentó, separados por una coma, dos puntos y la Universidad de procedencia, una
coma, el año, punto seguido, luego el número de páginas, seguido de la abreviatura
pp.
Ejemplo:
Duda F. Gota: Morbilidad y Mortalidad. Estudio retrospectivo en pacientes
hospitalizados del Hospital Cayetano Heredia. Tesis de Bachiller. Lima, Perú.
Universidad Peruana Cayetano Heredia, 1990. 59 pp.
Páginas Web:
Las páginas electrónicas nombradas en las referencias bibliográficas deben estar
acompañadas de la fecha en la cual se consultaron.
Family Health International. Los hombres y la salud de la reproducción. En:
Network en Español 1998 Volumen 18. http://www.f h i.org/sp/networks/sv18-
3/index.html (Acceso el 17 de noviembre de 2003).
La presentación del informe, orden, limpieza, apreciación critica y
discusión de sus resultados serán consideradas en la calificación.
Las hojas deben estar numeradas, ser iguales y estar correctamente
editadas. Todos los informes deben de ser subidos en el EVD dentro
del plazo establecido. NO se recibirán informes impresos ni fuera de
fecha.
PARA TENER EN CUENTA:
Las prácticas se iniciaran a la hora indicada en los horarios con una tolerancia
de 5 minutos una vez iniciada la misma.
No se permitirá el ingreso al laboratorio a los alumnos que no tengan mandil ni
guantes.
El alumno deberá de traer su guía de práctica en cada sesión del laboratorio
que se imparta.
Se deberá mantener una adecuada disciplina durante la estancia en el
laboratorio.
Se debe asistir a la práctica en el grupo al que corresponde A o B.
Todos los objetos personales deben quitarse de la mesa de trabajo.
Esta prohibido comer, beber, fumar y en general llevarse cosas a la boca en el
laboratorio.
Estar atento a las instrucciones del docente.
Los materiales se entregaran a cada mesa de trabajo y los integrantes se
harán responsables por él.
En el caso de que el experimento no resultara como está planeado, el alumno
deberá investigar, consultar y agotar todas las posibilidades para lograr un
desarrollo correcto. Si no se lograra el objetivo de la práctica, debe preguntar al
docente, él le explicara en donde está la falla y la manera de corregirla. De esta
forma se logrará desarrollar una actitud crítica hacia la materia, un mejor
aprovechamiento de clase práctica y un apoyo mayor a la clase teórica.
Cualquier accidente debe ser notificado de inmediato al docente o al auxiliar
del laboratorio Si alguna sustancia entra en contacto con tu piel u ojos, lava la
zona con abundante agua y avisa al profesor. Si tienes el pelo largo, recógelo
para evitar que se prenda con las llamas o se enrede en los aparatos.
Dejar ordenadas y limpias las mesas al terminar la practica.
Una vez culminada la práctica se presentaran los informes en la siguiente
sesión práctica. No se aceptaran informes fuera de fecha..
Todos los informes de práctica se suben al EVD. NO SE ACEPTARAN
INFORMES IMPRESOS.
PRACTICA Nº 1
ESPECTROFOTOMETRIA: Microlab 200 y Hera
I COMPETENCIAS
Al culminar la practica el alumno:
Maneja e identificara los componentes del Espectrofotómetro y
fotocolorímetro
Programa el fotocolorímetro y el espectrofotómetro.
Aplica y conocerá la importancia de la Ley de Lambert y Beer.
II GENERALIDADES
Las técnicas analíticas y la instrumentación representan las bases de todas las
mediciones hechas en un laboratorio moderno de química clínica. La mayor parte de
las técnicas se ubican en una de las disciplinas básicas:
Espectrofotometría
Luminiscencia
Métodos electro analíticos
Cromatografía
Disciplinas que se irán revisando a lo largo del curso.
El primer término: Espectrofotometría sugiere la medición de la cantidad de
energía radiante que absorbe un sistema químico en función de la longitud de onda de
la radiación.
Regiones del Espectro Óptico:
Región Intervalo de longitud de onda
UV 180 – 380 nm
Visible 380 – 780 nm
IR cercano 0.78 – 2.5 um
IR medio 2.5 – 50 um
Todo analito molecular es capaz de absorber ciertas longitudes de onda
característica de la radiación electromagnética.
LEYES FUNDAMENTALES DE LA ESPECTROFOTOMETRIA
Ley de Lambert.- “Cuando un rayo de luz monocromática atraviesa un medio
absorbente, su intensidad (I) decrece en forma exponencial al espesor del medio (b)”.
Ley de Beer.- “La intensidad de un rayo de luz monocromática (I) disminuye
exponencialmente conforme aumenta la concentración (c) del material absorbente”.
Ambas leyes pueden fusionarse en una sola ley conocida como la Ley de Lambert y
Beer
Log I0 / I = A = a bc
Log Io/I = (A) = Absorbancia o Densidad Óptica (O.D.).
I0 = rayo incidente
I = rayo trasmitido
a = constante: índice de absorbancia o "coeficiente de extinción" para el
compuesto particular
b = Longitud de la cubeta
c = Concentración
La absorbancia de una solución 1 M de una sustancia a una longitud de onda
determinada, medida en una cubeta de 1 cm de paso, sería numéricamente igual a am.
Nótese que la absorbancia es función lineal de la concentración:
A = amcl
Nota: La ley de Beer no se cumple en todas las sustancias, especialmente a
concentraciones elevadas.
Absorbancia: Cantidad de luz que es absorbida por la sustancia a determinar y que
se mide en unidades de absorbancia.
Transmitancia
Log %T = 2 – Absorbancia
III PARTE PRÁCTICA
1) Cada mesa recibirá un recuadro en el cual este escrito un componente del
espectrofotómetro. Entre los grupos colocaran cada componente en un esquema de
funcionamiento en la pizarra, y comentaran acerca del elemento que aportaron.
2) Por mesas se revisara el Microlab 200 y el Hera componentes, características
técnicas, programación.
IV REFERENCIAS
Bishop M, Fod
y P, Schoeff L. Química clínica: Principios procedimientos y correlaciones.
Quinta edición. México; 2007.P: 91-96
Universidad Nacional de Colombia. Instrumentos para la medida de Absorción
de luz. Se encuentra en Network en Inglés:
http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ciencias/2001184/lecciones/Ca p05/05_01
_01.htm (Acceso 25 de Noviembre del 2009)
New Mexico State University Department of Chemistry and Biochemistry.
Spectronic. 20. Se encuentra en Network en Inglés:
http://www.chemistry.nmsu.edu/Instrumentation/Spectronic_20.html (Acceso
del 08 de diciembre del 2009)
Thermospectronic. Operator’s Manual Spectronic 20+. Se encuentra en
Network en inglés:
http://www.cienytec.com/PDFS/Espec_SPEC20_OpMan_ing.pdf. (Acceso el 20
de Noviembre del 2009)
Universidad de Cádiz. Determinación espectrofotométrica. Se encuentra en
network en Español: http://www2.uca.es/grup-invest/corrosion/integrado/P2.pdf.
(Acceso el 20 de febrero del 2010)
ENLACES DE INTERNET RECOMENDADOS
Austin Community College. Laboratory Manual. 12 ava edición. 2006.
Absorbance measurements with Spectronic 20D. En network en Inglés:
http://www.austincc.edu/biology/labmanuals/140612th/12th1406labappD.pdf
Camp U, Seely O. Operating instructions for the Spectronic 20 D. Se encuentra
en network en Inglés:
http://www.csudh.edu/oliver/che230/labmanual/spec20d.htm
Wellesley College. The standard curve and Analog Spec instructions. Se
encuentra en network en Español:
http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/Html/standardcurve.html
http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/Html/analogspec20instructions.ht
Universidad Nacional de la Plata. Colimetría visual. Métodos ópticos de
análisis. Se encuentra en network en Español:
http://catedras.quimica.unlp.edu.ar/instrumental/2009/tp5_visual-spectronic.pdf
PRÁCTICA Nº 2 y 3
CURVAS DE CALIBRACIÓN
I COMPETENCIAS:
Al finalizar la practica el alumno:
Aplica y conoce la importancia de la Ley de Lambert y Beer, y la cinética de
Michaelis y Menten.
Elabora curvas de calibración: enzimas, metabolitos.
Realiza el cálculo de regresión lineal manual y con software
Comprende la aplicación de la regresión lineal
Determina la linealidad de un método.
II GENERALIDADES
Una curva de calibración se construye a partir de diferentes concentraciones o
actividades de un analito y su respuesta frente a una reacción. Las curvas de
calibración pueden ser lineales o no lineales. Este gráfico tiende a ser lineal, mientras
progrese según la ley de Lambert-Beer.
Aplicando la ley de Lambert- Beer, la absorbancia es directamente
proporcional a la concentración. Por ejemplo: en muchas determinaciones
colorimétricas se cumple una relación proporcional entre la magnitud o intensidad de
color que da una reacción y la cantidad o actividad del analito que la provoca. Por
ejemplo: si la presencia de 2.5 g/dl de proteínas en una solución genera la aparición
de un color azul pálido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 5.0
g/dl de proteína dará lugar a que la solución se torne azul más oscuro y así
sucesivamente. Entonces la relación entre intensidad de color y concentración de la
sustancia es proporcional y así, si se grafica el valor de intensidad de color medido con
un espectrofotómetro o fotocolorímetro que nos dan datos de absorbancia en función
de las concentraciones crecientes de la sustancia obtentremos una recta que sigue la
ley de Lambert-Beer.
Como para la elaboración de curvas de calibración se trabaja con datos reales,
los gráficos que se obtienen no son tan ideales, pero esta situación no es un obstáculo
ya que dentro de ciertos valores es posible trazar la recta más probable que une una
serie de puntos. Para definir la curva de calibración que mejor representa la relación
entre absorbancia (A) y la concentración se pueden usar cálculos de regresión lineal,
determinando la ecuación de la recta:
y= mx+b
En donde: y= Absorbancia m= Pendiente x= Concentración b= intercepto.
La determinación de estos valores puede realizarse manualmente, o utilizando
softwares como Microsoft Excel o una calculadora que tenga incluida la función de
regresión lineal para ajustar la recta la cual también se conoce como curva de trabajo.
III PARTE PRÁCTICA:
1.- Para elaborar una curva de calibración con las siguientes concentraciones:
5x107 ng/dl
250 mg/L
8 x 105 ug/L
0.0125 g/dl
100 mg/dl
2 mg/ml
Usted dispone 5500ul del estándar de 4 g/l. Prepare las diluciones, tratando de
emplear en lo posible diluciones seriadas buscando tener volumen final en todas las
diluciones de 4 ml.
Lea en el espectrofotómetro a la longitud de onda apropiada. Elabore la curva de
calibración y haga el cálculo de regresión lineal. Por ultimo, determine la concentración
para una muestra desconocida que posee una absorbancia de 0.250
2.- Para la elaboración de la curva de calibración de proteínas – Biuret, se realizaron
diluciones del estándar obteniéndose las siguientes concentraciones. Se leyó a 540
nm y se obtuvo:
Concentración ( g/dl) Absorbancia
0 0.025
2.5 0.065
5.0 0.127
7.5 0.186
10 0.244
15 0.293
a) Graficar la curva de calibración de proteínas
b) Calcular la linealidad
c) Calcular la pendiente
d) Calcular el factor
e) Calcular la Concentración de las siguientes muestras, que fueron leidas a
540nm
Utilizando el factor y utilizando la pendiente
a. 0.124 b.0.155 c.0.210 c.0.104
3.- Para la elaboración de la curva de calibración de un analito “X”, se realizaron
diluciones del estándar obteniéndose las siguientes concentraciones. Se leyó a 405
nm y se obtuvo los datos en el recuadro.
Graficar la curva de calibración del analito
Calcular la linealidad
Calcular la pendiente
Calcular el factor
Concentración
g/LAbsorbancia
0.0 0.032
20 0.128
40 0.240
60 0.331
80 0.426
100 0.587
120 0.618
140 0.724
160 0.759
Calcular la Concentración de las siguientes muestras, que fueron leidas a 405nm
Mencione el color de la solución en estudio
Utilizando el factor y utilizando la pendiente
a.0.13 b.0.185 c.0.298 d.0.754
3.- Construya una curva de calibración de glucosa en suero con los siguientes datos:
A partir de ella:
a) Calcule la concentración de glucosa en un suero que da una lectura de
0.125
b) ¿Qué haría con un suero que diera una lectura de 0.7? ¿Interpolaría la
Lectura sin más o lo diluirías?
c) ¿Cuál se consideraría el limite de linealidad con arreglo a esta curva de
calibración? ¿Por qué?
4.- Tiene 5 tubos que muestran las siguientes actividades de una enzima “X”, lea en el
fotocolorímetro a 505 nm , anote la absorbancia y conviertala a transmitancia.
Actividad (U/L) Absorbancia % Transmitancia
0
10
40
100
150
Concentración (mg/dl) Absorbancia
0 0
50 0.05
100 0.1
150 0.150
250 0.250
500 0.500
800 0.600
a) Mencione el color de la reacción
b) Elabore la curva de calibración en papel milimetrado (Abs vs act) y en
semilogarimico (%T vs Act)
c) ¿Que observa en los gráficos? ¿A que se debe la diferencia?
IV REFERENCIAS
Bishop M, Fody P, Schoeff L. Química clínica: Principios procedimientos y
correlaciones. Quinta edición. México; 2007.P: 91-96
Universidad de Cádiz. Determinación espectrofotométrica. Se encuentra en
network en Español: http://www2.uca.es/grup-invest/corrosion/integrado/P2.pdf.
(Acceso el 20 de febrero del 2011)
Coto E. Facultad de Ciencias exactas. Universidad de buenos Aires. Curvas de
calibración.Se encuentra en network en Espanol:
http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/calibracion/calibracion.htm
. ( Acceso el 03 de marzo del 2011)
ENLACES DE INTERNET RECOMENDADOS
Wellesley College. The standard curve and Analog Spec instructions. Se
encuentra en network en Español:
http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/Html/standardcurve.html
http://www.wellesley.edu/Biology/Concepts/Html/analogspec20instructions.ht
PRACTICA Nº 4
AUTOMATIZACIÓN EN HEMATOLOGÍA
I COMPETENCIAS
Al concluir la practica el alumno:
Reconoce los principios de medición que emplean los autoanalizadores
hematológicos de 3 y 5 diferenciales.
Interpreta los parámetros del CBC, dispersogramas e histogramas medidos y
calculados por los autoanalizadores hematológicos de uso más frecuente (Coulter,
ADVIA, Cell Dyn y Sysmex).
Relaciona los datos proporcionados por el autoanalizador vs la revisión del frotis
sanguíneo.
Discute sobre los criterios para la validación automática de los resultados
obtenidos por los autoanalizadores hematológicos.
II GENERALIDADES
El término automatización es la técnica, método o sistema para hacer funcionar
o controlar un proceso mecánico o productivo por medios automáticos como
dispositivos electrónicos. Cuando se aplica al laboratorio se refiere a un método
mecánico para llevar a cabo procesos analíticos, es así que muchas etapas que se
llevaban a cabo de forma manual ahora se pueden realizar automáticamente, lo que
permite al profesional centrarse en tareas que no posibles automatizar incrementando
de esta manera tanto la eficiencia como la capacidad.
En el laboratorio clínico el avance de la automatización se traduce en:
Resultados más rápidos
Menores errores
Datos altamente reproducibles
Sistemas prácticos para el control de la calidad
Contribución a la bioseguridad
Utilización de la informática
En el área de hematología, como sucede en las otras áreas, la etapa analítica
es la más automatizada. El inicio del camino a la hematología automatizada se
remonta a la década de los 50 con el desarrollo de instrumentos para realizar
hemogramas, cuando los hermanos Coulter, Wallace y Joseph, patentan su equipo
basado en el método de la impedancia eléctrica, únicamente para contar leucocitos y
eritrocitos. Desde entonces diversas casas comerciales fueron mejorando y
añadiendo nuevas metodologías para la medición de los distintos parámetros
hematológicos y en la actualidad, en nuestro país se cuenta con una variedad de
instrumentos que han llegado a los laboratorios, desde hace unos 15 años, y
contamos tanto con equipos de tres partes en su diferencial, como algunos de los más
desarrollados de la industria, con 23 parámetros, incluyendo un diferencial de cinco
partes, obtenido con luz láser. Existen diversos modelos con principios los cuales
utilizan como método de análisis la impedancia, la radiofrecuencia, cuya evaluación no
ha sido ampliamente conocida, como también algunos con canales de lobularidad,
citoquímica, dispersión y fluorescencia. También presentan diferentes sistemas de
alarmas de sospecha por hallazgos anormales en las muestras, además la posibilidad
de incluir sistemas de control de calidad intralaboratoriales que permiten manipulación
de datos por análisis estadístico, en muestras y controles.
PRINCIPIOS
Los sistemas de recuento células en estos analizadores se basa en la medida del
tamaño, complejidad, propiedades físicas de las células suspendidas en medio liquido
de acuerdo con uno de siguientes principios.
Impedancia
- Conductividad eléctrica
Citometría de flujo
- Láser
- Fluorescencia
- Foco hidrodinámico y Absorción.
III PARTE PRACTICA
1.- Revisaremos los principios de medición de cuatro autoanalizadores: Coulter
Gen-S, Advia 120, Sysmex XE-2100 y Cell Dyn 3700.
2.- Analizaremos los histogramas de RBC, WBC, plaquetas y los patrones de
dispersogramas de los equipos Advia 120, Sysmex XE 2100y Cell Dyn 3700.
IV CUESTIONARIO
1. Haga un comentario respecto a las limitaciones de los actuales analizadores
hematológicos.
2. Señale cuales pueden ser las causas de error en el recuento automatizado.
3. ¿Cuales serian las consideraciones primarias que tendría en la selección de un
autoanalizador hematológico para su laboratorio?
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Lehner, J., Greve, B., (2007). Automation in Hematology [versión electrónica].
Review Article. Transfus Med Hemother, 34, 328–339.
2. CLSI. (2007). Document H20 A2: Reference Leukocyte (WBC) Differential
Count (Proportional) and Evaluation of Instrumental Methods, second edition.
Pennsylvania.
3. Villarrubia, J. (2002). Avances en el diferencial leucocitario automatizado.
Criterios para la revisión del hemograma y sistemas expertos de validación
automática [versión electrónica]. Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl.1.
4. Molero, T., Castellano, L., De la iglesia, S., Santana, A. (2002). Nuevos Índices
Plaquetarios: Valor en el Diagnóstico y trascendencia en las decisiones
terapéuticas [versión electrónica]. Haematologica (ed. esp.), volumen 87, supl.
1.
5. Jou, J.M. Análisis automatizado de las poblaciones eritrocitarias: Su aplicación
en el diagnóstico de las anemias. (2002). Haematologica (ed. esp.), volumen
87, supl.1.
6. Katsuyasu S, Yasuyuki S, Yukako M et al. Clinical utility of new parameters
provided by XE 2100 RET channel. Sysmex Journal International .2007;7 (2):
81-94
Manuales:
Guía preparatoria para entrenamiento de los analizadores hematológicos
automatizados Sysmex Serie XE. (2005).
Beckman Coulter. ACV Differential Technology. (2000).
ENLACES DE INTERNET RECOMENDADOS
Citometría de Flujo. http://www.citometriadeflujo.com/
PRACTICA Nº 5
AUTOMATIZACIÓN EN QUIMICA CLINICA
I COMPETENCIAS
Al finalizar la practica el alumno:
Entiende las fuerzas impulsadoras detrás del desarrollo de los analizadores
automatizados.
Explica los pasos en el análisis automatizado.
Nombra métodos básicos para el análisis de muestras que se emplean en los
analizadores automatizados en Química clínica.
Proporciona ejemplos de analizadores en Química clínica.
Compara los enfoques de los instrumentos.
Comprende las consideraciones en la selección de un analizador
automatizado.
II GENERALIDADES
En el laboratorio moderno de Química Clínica se emplea un alto grado de
automatización, es así que muchos procedimientos que antes se realizaban
manualmente ahora ya están automatizados, permitiendo que los profesionales se
enfoquen en puntos clave en los que la automatización no ha calado, como la fase
preanalítica: preparación de paciente, transporte y conservación de los especimenes,
dado que ningún resultado; por mas instrumento de última generación que se emplee
en su análisis, tendrá mas calidad de la que posee la muestra con la que se trabajo. El
control de calidad y la validación que forman parte de la fase posanalitica son tambien
puntos cruciales en los que es imperante el juicio de un profesional. De las tres fases
del proceso analítico es la fase analítica la más automatizada en la actualidad
haciendo creciente el interés en incrementar la automatización de los otras fases.
Ya conocemos que en el análisis clínico, la automatización es al mecanización de los
pasos en un procedimiento analítico. Los fabricantes diseñan sus instrumentos para
imitar técnicas manuales.
III PARTE PRÁCTICA
1.-El análisis automatizado comprende una serie de etapas que se pueden listar, para
esto por grupos recibirá un sobre con tarjetas en las que figuran en desorden los
pasos del análisis automatizado. Con los integrantes de su equipo, arme un flujograma
con el material proporcionado. En el mismo sobre se adjuntan imágenes que debe de
asociar cada paso.
2.- Cada equipo tomando como base el flujograma armado, comentara los aspectos
observados en sus rotaciones hospitalarias en cada uno de los pasos del análisis
automatizado. Por ejemplo: Como se lleva acabo la identificación de muestras en el
laboratorio de su sede de práctica, este proceso, esta automzatizado o no.
3.-Se comentara cada paso del análisis automatizado, las características, principios,
para la obtención de una medición y en ultima instancia el resultado en los
analizadores elegidos ya que tienen componentes que representan ya sea
características comunes empleadas en la instrumentación en Química Clínica o un
método único de automatizar un paso.
IV CUESTIONARIO
1. Elabore un cuadro resumen de las características de por lo menos 5
analizadores de Quimica clínica.
2. Menciones las consideraciónes primarias en la selección de un analizador de
química automatizado.
3. ¿Qué tipo de analizadores ofrecen capacidad de acceso aleatorio?
4. Elabore un cuadro que contenga la siguiente información de un proceso
laboratorial:
Sistema de ingreso de solicitudes, identificación de la muestra,
Sistemas de preparación y entrega de la muestra
Manejo y transporte del espécimen desde la preanalitica al instrumento,
Detallar marca del instrumento, modelo, serie
Ingreso, transporte y cargado de la muestra en el equipo
Sistema de cargado, transporte y almacenamiento de reactivos en el
equipo.
Fase de reacción química y métodos de medición
Sistema de validación de resultados, control de calidad
Transmisión de resultados e impresión del reporte.
Señale en cada punto si el proceso es automatizado o manual.
5.- En relación al articulo “Modelo informático para la gestión de los sistemas
analíticos del laboratorio clínico”, señale que elementos serian necesarios para
aplicarlo en un laboratorio de química clínica.
V REFERENCIAS
Bishop M, Fody P, Schoeff L. Química clínica: Principios procedimientos y
correlaciones. Quinta edición. 2007.
Henry, John Bernard, El laboratorio en el diagnóstico clínico, Madrid; Marbán;
2005. 2 v.
Anderson, Shauna C; Cockayne, Susan, Química clínica, México, D.F;
Interamericana McGraw-Hill.
ENLACES DE INTERNET RECOMENDADOS
http://www.sysmex-europe.com
https://www.mylabonline.com/products/
http://www.orthoclinical.com
http://www.irisdiagnostics.com
http://www.medical.siemens.com
http://www.sediglac.org/congresos/11congreso-7/textos/PerezMartinezA-
01ii.pdf
PRACTICA Nº 6
ESPECTROFOTOMETRIA: CASOS PRACTICOS Y APLICACIONES
I COMPETENCIAS
Comprende las aplicaciones de la espectrofotométrica en el laboratorio clínico.
Aplica los conocimientos previos en espectrofotometría en la resolución de
casos prácticos.
II GENERALIDADES
La espectrometría de Absorción molecular UV-visible tiene múltiples usos en el
ámbito de la bioquímica clínica, entre otros:
La medida de las moléculas en disolución.
Identificación de longitudes de onda útiles.
Valoración de reacciones químicas.
Determinación de características estructurales de macromoléculas.
Medición de concentraciones.
Esta última es la aplicación más importante y frecuente, puede realizarse de
diferentes maneras:
1) Se pueden representar los valores de absorbancia de distintos calibradores en
función de su concentración que es conocida. La grafica resultante es la curva de
calibración. Una vez medida la absorbancia de la muestra analizada. La curva permite
hallar la concentración correspondiente. Es un procedimiento gráfico, aunque también
hay ajustes electrónicos.
2) Según la ley de Lambert –Beer la absorbancia es función de la concentración
mediante el coeficiente de absorción molar (ε) y el recorrido de la radiación ( l)
entonces tenemos:
A= ε.l.c
donde ε . l es la pendiente de la curva de calibración.
3) Identificación de longitudes de onda útiles
4) Valoración de reacciones químicas.
5) Determinación de las características estructurales de las macromoléculas.
III PARTE PRACTICA
EJERCICIOS
A.- Se presentarán algunos ejercicios de repaso, para después resolver algunos casos
prácticos.
1.-Convertir los siguientes valores de absorbancia en tanto por ciento de transmitancia
a. 0.375 b. 1.325 c. 0.012
2.-Convertir los siguientes valores de tanto por ciento de transmitancia en valores de
absorbancias.
a. 33.6 b. 92.1 c. 1.75
3.-Una solución acuosa de KMnO4 (pM 157) de concentración 7.5 x 10 -5M tiene una
absorbancia de 0.502 medida a 485 nm en celda de 1.5 cm. Calcule:
a) la absortividad expresada en dos formas diferentes, indicando en cada caso las
unidades respectivas.
4.-Del análisis de los siguientes resultados experimentales, compruebe si hay o no
cumplimiento de la ley de Beer,
C (M) % T
0.01 30
0.02 40
0.03 50
0.04 60
0.05 70
5.-Una solución de una muestra coloreada que responde a la ley de Beer, muestra
una transmitancia de 80.0% cuando se mide en una celda de 1,00 cm de longitud.
a) Calcule el % T para una solución de doble concentración en la misma celda.
b) ¿Cuál debe ser la longitud de la celda para obtener la misma transmitancia (80%)
en el caso de una solución cuya concentración es dos veces la original?
6.- En la preparación de una curva de calibración para análisis espectrofotométrico, se
obtuvieron los siguientes datos
Concentración (mgL-1) Io I
0 98 98
1 97 77.2
2 100 63.5
3 99.5 50
4 100 41.3
5 100 33.5
6 100 27.9
7 99.0 23.4
8 98.2 20.3
9 100 18.1
10 100 16.4
¿Se sigue la ley Beer? ¿Que concentración corresponde a una absorbancia de 0.42?
7,- Una disolución que contiene 10,0 ppm (1 ppm = 1 mg / litro) de cierto material
coloreado que es medida con un espesor óptico de 1,00 cm, presenta la absorbancia y
el porcentaje de transmitancia (% T) que se muestran en la tabla. Calcular los valores
que faltan en la tabla. Se supone que el sistema sigue la ley de Beer.
Concentración
(ppm)Ε
Paso óptico
(cm)%T Absorbancia
10 1 38.9
4 0.410
B.- Durante la practica se le proporcionara una serie de casos a desarrollar.
V REFERENCIAS
Fuente X, Castiñeiras M, Queralto J. Bioquímica clínica y patología molecular.
Vol I , Editorial Reverte. 1998. 214-216
Bishop M, Fody P, Schoeff L. Química clínica: Principios procedimientos y
correlaciones. Quinta edición. México; 2007.P: 91-96
Universidad de Cádiz. Determinación espectrofotométrica. Se encuentra en
network en Español: http://www2.uca.es/grup-invest/corrosion/integrado/P2.pdf.
(Acceso el 20 de febrero del 2010)
Universidad de chile. Espectofotometria aplicada. Se encuentra en network en
español: http://www1.ciq.uchile.cl/login/index.php ( Acceso el 28 de Marzo del
2010)
PRACTICA Nº 7
AUTOMATIZACIÓN EN BANCO DE SANGRE
I COMPETENCIAS
Al finalizar la practica el alumno:
Conoce la organización por áreas de un Banco de sangre.
Proporciona ejemplos de analizadores empleados en banco de sangre.
Compara los enfoques de los instrumentos.
Comprende la base del funcionamiento de separadores celulares.
II GENERALIDADES
Un banco de sangre, es el establecimiento autorizado para obtener, recolectar,
analizar, conservar, aplicar y proveer los componentes de la sangre humana. Los
centros de Hemoterapia y banco de sangre pueden ser de tipo I o II, estos últimos
cuentan con las siguientes áreas:
Área de recepción y atención de solicitudes transfusionales.
Área de reconocimiento de donantes y extracción de sangre (área de captación
de donantes; área de selección de donantes).
Área de análisis de sangre (inmunoserología e inmunohematología)
Área de producción de componentes sanguíneos.
Área de conservación de componentes.
Seroteca.
Área de preparación de medios y reactivos para control de calidad.
La automatización ya se ha abierto campo en este campo y con la validación
adecuada, las técnicas y procedimientos, todas las tareas rutinarias de los bancos de
sangre eventualmente serán automatizadas, como ya ha sucedido en laboratorio de
Bioquímica o hematología. Es así, que la automatización de cada eslabón contribuirá
en reducir el riesgo de un error.
III PARTE PRÁCTICA
1) Se dará a conocer los principios de la automatización en cada área del Banco de
Sangre.
CUESTIONARIO
Buscar 2 artículos relacionados con el tema y elaborar un cuadro sinóptico de
cada uno.
V REFERENCIAS
Ministerio de Salud. Resolución Ministerial Nº 1191-2006.
Molé J, Fernandez V, Suarez D, Nuñez C. Sistema automatizado para el
control de donantes de sangre. Rev cubana hematol inmunol hemoter
1998;14(2):107-110
Benavides ME. 2000. Optisystem: Manual de operaciones. Gráfica y Científica
Ltda., Bogotá, Colombia.
Hurtado C, S Bonard, M Soler, V Mirabet, I Blasco, M Planelles, A De Miguel.
2000. Quality analysis of blood components obtained by automated buffy-coat
layer removal with a Top and Bottom system (Optipress ® II). Haematológica
85, 390-395.
Del Rey-Pineda G. Aplicación de nuevas técnicas de biología molecular a la
virología. Detección de tamizaje en bancos de sangre Gac Méd Méx Vol. 140,
Suplemento No. 3, 2004
Malomgré W, Neumeister B. Recent and future trends in blood group
typing.Anal Bioanal Chem (2009) 393:1443–1451
PAGINAS WEB RECOMENDADAS
www.galileoecho.com
www.beckmancoulter.com
www.inmucor.cor
http://www.orthoclinical.com
PRACTICA Nº 8
AUTOMATIZACIÓN EN COAGULACIÓN
I COMPETENCIAS
Al finalizar la practica el alumno:
Conoce los principios para el desarrollo de analizadores automatizados en el
laboratorio de coagulación.
Construye curvas de calibración para el dosaje de factores de la coagulación.
Conoce ejemplos de Autoanalizadores disponibles en el mercado.
II GENERALIDADES
En el área de Hematológia: hemostasia del laboratorio clínico se pueden
realizar pruebas tales como:
Perfil de Coagulación ( TP, TTP, TT, Fib, Plaquetas )
Pruebas de Funcionalidad Plaquetaria (Recuentos, agregación
plaquetaria, adhesividad plaquetaria )
Perfil Trombótico ( PC, PS, AT – III, Plasminógeno, t – PA, PAI, α2 –
antiplasmina, RPC, Anticoagulante Lúpico )
Determinación de Factores de la Coagulación ( VI – VE )
Pruebas de Biología Molecular ( FVL, protrombina 20210, CF )
Estas se pueden llevar acabo a través de diferentes tipos de ensayos:
- Actividad Funcional
Coagulómetrico (óptico y mecánico)
Cromogénico
- Inmunológico / Antigénico
Nefelometría
Electroforesis
ELISA
- Biología molecular: PCR
CROMOGENICO VS COAGULOMETRICO
Los ensayos cromogénicos son más específicos, exactos, precisos; son menos
susceptibles a las variables preanalíticas.
Los ensayos coagulométricos son más rápidos y baratos. Están sujetos a
interferencia por los niveles de los factores de coagulación, heparina, warfarina,
otros anticoagulantes, así como la presencia del anticoagulante lúpico.
La dilución relativamente alta utilizada en los ensayos cromogénicos, son
considerados como una preocupación.
Ambos ensayos pueden ser fácilmente instalados en analizadores
automatizados.
III PARTE PRÁCTICA
1) Se desarrollara un taller que se proporcionara durante la práctica.
IV REFERENCIAS
1. Kordich, Blanco, Cerrato (et al) (2003). Fundamentos para el Manejo Práctico
en el Laboratorio de Hemostasia. Grupo CAHT
2. Kitchen, Olson, Preston (2009). Quality in Laboratory Hemostasis and
Thrombosis. Primera ed. Ed. Wiley – Blackwell.
PRACTICA Nº 9
TOMA DE MUESTRA DE GASES ARTERIALES
I COMPETENCIAS
Al finalizar la practica el alumno:
Conoce las condiciones prenaliticas en el estudio de gases arteriales.
Comprende las principales fuentes de error en AGA
II GENERALIDADES
La medición de los gases arteriales proporciona información útil para evaluar y
controlar el tratamiento de los pacientes con trastornos metabólicos y respiratorios;
como todas las mediciones en el laboratorio también están sujetas a errores
preanalíticos, analíticos y posanalíticos, una gran parte de estos errores se concentran
en la fase pre-analítica, sobretodo durante la toma de muestra, transporte y
conservación.
La toma de muestra de sangre arterial se puede llevar a cabo por punción
directa o a través de catéter arterial.
TOMA DE GASES ARTERIALES POR PUNCIÓN DIRECTA
MATERIALES
• Jeringa de tuberculina desechable,Tapon de goma.
• Aguja 25 o 24 g
• Gasas estériles
• Anticoagulante ( Heparina de Litio)
• Guantes de protección
• Solución antiséptica (alcohol)
ZONAS DE PUNCIÓN
Radial, braquial, femoral, pedia.
PREPARACIÓN DEL PACIENTE:
CIRCULACIÓN COLATERAL (PRUEBA DE ALLEN)
Hay que tener en cuenta que durante la toma de sangre arterial ya sea
obtenida por punción directa o mediante la utilización de un catéter arterial se puede
producir la invasión de la luz arterial la cual puede provocar, formación de un trombo
intramural o aparición de un hematoma periarterial. Cualquiera de estas
complicaciones puede implicar isquemia distal. En consecuencia, es recomendable
verificar la viabilidad de la circulación colateral si se pretende colocar un catéter
arterial.
La prueba de Allen constituye un método sencillo y fiable para comprobarla en
la arteria radial. Se pide al enfermo que abra y cierre vigorosamente el puño tras haber
localizado y comprimido la onda de pulso radial y cubital. Tras 5-10 flexiones suele
aparecer palidez isquémica palmar. Con la mano del enfermo extendida, se liberará la
compresión cubital y se registrará el tiempo necesario para que reaparezca la
coloración palmar habitual. En general, se considera que la circulación colateral cubital
es adecuada si ésta reaparece en menos de 15 s.
TÉCNICA DEL EXAMEN:
• Preparar los materiales, si no se cuenta con una jeringa para gasometria es decir ya
heparinizada, proceder a cubrir el interior de la jeringa de tuberculina con heparina de
Litio, la relación es 0.1cc de Anticoagulante con cada 1cc de sangre.
• El paciente realiza una hiperextensión de muñeca aproximadamente de 45 grados
utilizando algún soporte o apoyo en la muñeca por ejemplo una toalla o una almohada.
• Localizar el sitio exacto de la punción mediante la palpación de la arteria elegida con
los dedos de la mano.
• Desinfectar la zona de punción.
• Se continúa con la palpación de la arteria con una mano y utilizando la otra para
introducir la aguja y avanzar lentamente según la necesidad del bisel, penetrando la
piel a un ángulo de aproximadamente 45 grados en la arteria radial, 60º en la arteria
humeral, en 90º en arteria femoral.
• La penetración de la arteria puede ser sensible al tacto. La sangre arterial impulsara
por si sola el embolo.
• Retirar la aguja rápidamente después que la muestra de sangre haya sido obtenida.
• Hacer presión por lo menos durante 5 minutos para evitar hematoma post punción.
Especial precaución en pacientes con terapia de anticoagulación.
PUNCIÓN CAPILAR
La punción capilar constituye una forma alternativa de obtener una muestra sanguínea
susceptible de ser interpretada como si se tratase de una muestra arterial.
Suele emplearse en lactantes y niños
TRANSPORTE Y DEPÓSITO
– Entre la extracción de la muestra sanguínea y su análisis no deben pasar, en
condiciones habituales, más de 10-15 min. En todo momento es imprescindible
mantener un hermetismo absoluto.
– Si se prevé que dicho lapso de tiempo será superior, la muestra arterial debe
guardarse en hielo triturado.
ANALISIS DE LA MUESTRA
La muestra debe analizarse, de ser posible, inmediatamente después de su
obtención. La variabilidad de los actuales equipos de gases permite realizar una sola
lectura, siempre que la muestra haya sido extraída, manipulada y procesada
correctamente, dada la gran reproducibilidad de la técnica.
Se recomienda anotar los resultados obtenidos inmediatamente después de
cada lectura. Para ello, se dispondrá de una libreta junto al propio aparato, con objeto
de evitar posibles errores de transcripción posterior. Junto a esto, es muy útil, además,
disponer de otra libreta en la que se hará constar el mantenimiento efectuado, así
como las posibles averías u otras incidencias que pudieran presentarse.
IV CUESTIONARIO
1. Mencione las probables fuentes de error en un AGA
2. ¿Por qué es importante conservar las muestras en hielo, en caso el AGA
demore?
3. Describa el principio en el que se basan los analizadores de gases arteriales
V REFERENCIAS
Bishop M, Fody P, Schoeff L. Química clínica: Principios procedimientos y
correlaciones. Quinta edición. 2007.Pags.354-360
Wilson K. and Walker J. (eds) (1994). Principles and Techniques of Practical
Biochemistry. 4 Ed. Cambridge University Press.
PRACTICA Nº 10
INMUNOCROMATOGRAFÍA
I COMPETENCIAS
Al finalizar la practica:
Comprende el fundamento del método
Conoce las aplicaciones de las pruebas inmunocromatográficas en el
laboratorio clínico.
II GENERALIDADES
La inmunocromatografía es una de las técnicas de inmunodiagnóstico más
modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez del test. Cada vez son
más las aplicaciones de esta técnica.
En el siguiente esquema se resume el fundamento del método:
1.- La muestra se pone en contacto con la zona del conjugado. Esta lleva
impregnada un conjugado formado por un anticuerpo específico contra uno de los
epítopos del antígeno a detectar y un reactivo de detección. Si la muestra contiene el
antígeno a detectar, éste se unirá al conjugado formando un complejo y empezarán a
migrar a través de la membrana de nitrocelulosa. Sino, migrarán el conjugado y la
muestra sin unirse.
2.- La zona de captura está formada por un segundo anticuerpo específico
contra otro epítopo del antígeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos
formados por la unión del antígeno y conjugado quedarán retenidos y la línea se
coloreará (muestras positivas). Si la muestra no contenía el antígeno, el segundo
anticuerpo no captura nada y la línea queda trasparente (muestras negativas).
3.- La zona control está formada por un tercer anticuerpo que reconoce al
reactivo de detección. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se
unirá al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta línea
es un control de que el ensayo ha funcionado bien, porque se colorea siempre, con
muestras positivas y negativas.
TIPOS DE INMUNOCROMATOGRAFIA
• Competitivo
• No competitivo
IV CUESTIONARIO
1. Grafique que sucede en una prueba inmunocromatografica para detección Ab
VIH
2. Elabore un cuadro con las ventajas y desventajas de los test
inmunocromatograficos.
3. Comente el article “ A rapid review of rapid HIV Antibody test”
PRACTICA Nº 11
ENZIMOINMUNOENSAYO NO COMPETITIVO
I COMPETENCIA
Al finalizar la practica el alumno:
Comprende el principio de los enzimoinmunoensayos, clasificación,
aplicaciones y limitantes en el laboratorio clínico.
II GENERALIDADES
Desde su presentación en 1971, los ensayos inmunoenzimáticos se han
aplicado ampliamente en investigación básica, diagnóstico clínico y en el campo de la
biotecnología. La adaptación de la técnica de ELISA a las placas de microtiter ha sido
clave para el desarrollo contínuo de numerosas aplicaciones. Tanto antígenos como
anticuerpos pueden ser detectados y cuantificados de forma rápida y específica.
Paralelamente, se ha ido desarrollando la instrumentación necesaria para
poder automatizar al máximo estos ensayos, de forma que se pueden realizar un
número muy alto de análisis, en un tiempo corto y con un coste mucho menor al de
otras técnicas analíticas.
Principio básico E.L.I.S.A.
Al suero problema se le agrega un conjugado que son anticuerpos dirigidos
contra anticuerpos humanos o antígenos, los cuales se unirán a una enzima. Las
enzimas son capaces de modificar un sustrato en presencia de un cromógeno
produciendo un producto coloreado que es detectado visualmente o por un
espectrofotómetro.
Clasificación
ELISA no competitivo
- Directo
- Indirecto
- Tipo sándwich o captura de Ag
Elisa competitivo.
ELISA NO COMPETITIVO
Consiste en enfrentar la muestra con el antígeno o anticuerpo que está en la fase
sólida. Si una muestra es positiva se formará el complejo antígeno-anticuerpo y al
agregar el conjugado reaccionará con el respectivo sustrato desarrollando color.
Pasos generales de un ELISA
1. Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo
2. Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos
3. Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado
en el posillo.
4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de anticuerpo o antígeno no unido
5. Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima
6. Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo
7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida
8. Adición del sustrato
9. Unión del sustrato a la enzima
10. Desarrollo del color
III PARTE PRÁCTICA
En la sesión práctica se realizara un inmunoensayo no competitivo.
1.- Llenar los siguientes datos dependiendo el ensayo a realizar teniendo como base la
explicación dada al comienzo de la clase:
ELISA:
Clasificación:
En base a esto se describa:
Reactivos a necesitar:
Material requerido
Muestra:
Pasos de la técnica:
2.- Compare lo descrito por su mesa de trabajo con lo señalado en el inserto del Kit de
ELISA con el que se trabajara.
3.- Elabore un flujograma de trabajo para realizar el enzimoinmunoensayo
correspondiente.
4.- Ejecute el enzimoinmunoensayo.
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Calculo del Cut-off
Muestras no reactivas: Se consideran aquellas con absorbancia menores que el
límite inferior de la zona de indeterminación
Muestras reactivas: Se consideran aquellas con absorbancia mayores que el límite
superior de la zona de indeterminación.
Muestras indeterminadas: Se consideran aquellas con absorbancia que caen dentro
de la zona de indeterminación. Estas muestras deben ser ensayadas nuevamente.
CURVA DOSIS RESPUESTA: Elisa No competitivo
AUTOMATIZACIÓN
Existen equipos electrónicos que permiten la automatización de los
procedimientos y el análisis computacional de los resultados.
La lectura y medida de los Ags-Ac se hace mediante colorímetros,
fluorómetros, fotómetros, facilitando la reproducibilidad de las técnicas, mayor
precisión de registro de los resultados, mejor cuantificación y valoración de los
mismos, a la vez disminuye los errores y permite un mejor control de calidad.
IV CUESTIONARIO
1. ¿Que enzimas se pueden utilizar para los enzimoinmunoensayos?
2. Grafique la curva dosis respuesta en un inmunoensayo no competitivo
3. Describa un ensayo homogéneo y uno heterogéneo
4. Comente las variables que intervienen en un enzimoinmunoensayo
V REFERENCIAS Crocker J, Burnett D. The Science of Laboratory Diagnosis. Second edition.
Wiley; 2005.542p.
Lequin R. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA) Clin. Chem., Dec 2005; 51: 2415 - 2418.
Van Weemen B. The Rise of EIA/ELISA Clin. Chem., Dec 2005; 51: 2226.
Bishop M, Fody P, Schoeff L. Química clínica: Principios procedimientos y
correlaciones. Quinta edición. 2007.
Wilson K. and Walker J. (eds) (1994). Principles and Techniques of Practical
Biochemistry. 4 Ed. Cambridge University Press.
PRACTICA Nº 12
ENZIMOINMUNOENSAYO COMPETITIVO
I COMPETENCIAS
Al finalizar la practica el alumno:
Comprende el principio de los enzimoinmunoensayos competitivos.
Conoce diferentes cromógenos que se pueden emplear en un ELISA.
Elabora curva de dosis respuesta en enzimoinmunoensayos
Conoce en principio de analizadores de inmunoensayos.
II GENERALIDADES
Los ELISA en fase sólida, competitivos se utilizan para determinar antígenos,
haptenos o anticuerpos. Aquí el ligando no marcado compite con un ligando conjugado
con enzima por un número limitado de sitios de enlace con el anticuerpo inmovilizado,
y siguiendo el protocolo se retira el ligando no reactante, para así poder relacionar
inversamente la cantidad de producto que se forma con la concentración del ligando
no marcado en la muestra problema.
Pongamos un ejemplo para la detección de anticuerpos en un
enzimoinmunoensayo competitivo el anticuerpo que se busca en la muestra compite
con el conjugado (que es un anticuerpo también dirigido contra el antígeno para el cual
esta dirigió el anticuerpo problema) para ocupar sitios reactivos en el antígeno fijado
en la base el pocillo. Así, en este tipo de prueba, tanto la muestra que contiene el
anticuerpo, como el conjugado se agregan a la fase sólida (conteniendo el antígeno) al
mismo tiempo. Si la concentración de anticuerpos en la muestra es alta, muy poco del
conjugado puede fijarse a los antígenos inmovilizados, ya que muestra y conjugado
compiten por los mismos lugares del antígeno. Habrá ausencia de coloración dado que
no habrá fijación de la enzima como para unirse al sustrato.
Inversamente, con muestras que contienen poco o ningún anticuerpo, se fijará
más conjugado al antígeno en la fase sólida y la consiguiente adición de sustrato
provocará la presencia de color. Por esto, la cantidad de anticuerpos desconocidos en
la muestra analizada es inversamente proporcional a la cantidad de coloración que
aparezca.
Por otro lado, para la detección de antígenos en el formato competitivo se
presentan los siguientes pasos:
III CUESTIONARIO
1. En que se basan las generaciones de los Enzimoinmunoensayo. Ponga un
ejemplo.
2. Describa y grafique el principio del Axsym (MEIA), mencione otros analizadores
que se basen en la misma tecnología
3. Elabore un cuadro de comparación en el desempeño de las enzimas:
peroxidasa, β-galactosidasa y fosfatasa alcalina
4. Describa el principio de los enzimoinmunoensayos fluorescentes. Mencione
algunos equipos que se basen en ELFIA.
IV REFERENCIAS
Crocker J, Burnett D. The Science of Laboratory Diagnosis. Second edition.
Wiley; 2005.542p.
Lequin R. Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
(ELISA) Clin. Chem., Dec 2005; 51: 2415 - 2418.
Van Weemen B. The Rise of EIA/ELISA Clin. Chem., Dec 2005; 51: 2226.
Bishop M, Fody P, Schoeff L. Química clínica: Principios procedimientos y
correlaciones. Quinta edición. 2007.Pags.151-158.
PRACTICA Nº 13
FIJACIONES Y COLORACIONES EN EL LABORATORIO CLINICO Y
ANATOMIA PATOLOGICA
I COMPETENCIAS
Al finalizar la practica el alumno:
Comprende el fundamento de la coloración Gram y realizarla,
Comprende el fundamento de la coloración de papanicolau entre otras
coloraciones muy empleadas en el laboratorio clínico y anatomía patológica.
Conoce las pruebas básicas de control de calidad de insumos: colorantes
Identifica los fijadores mas empleados.
II GENERALIDADES
COLORANTES
Son compuestos químicos que poseen un grupo cromóforo, conjunto de
átomos de una molécula que le otorga color, y un grupo auxocromo que otorga al
colorante la capacidad de disociarse electrolíticamente y por lo tanto formar sales
facilitando la unión del colorante a otras sustancias con carga eléctrica.
Clasificación de los colorantes según los Grupos Auxocrómos y Apetencia
Tisular.
Los colorantes ácidos son aniónicos y la porción cromogénica tiene carga (-),
por lo tanto tienen alta afinidad de unión por constituyentes de carga (+) en la
célula.
En los colorantes básicos el grupo cromóforo es catiónico y tiene carga (+), por
ende el colorante tiene mayor afinidad por los constituyentes (-) de las células.
Colorantes Neutros: unión de colorantes ácido y básico para formar un
precipitado comúnmente insoluble en agua y muy estable en disolución
alcohólica.
Colorantes Indiferentes: En condiciones normales colorean los tejidos por un
mecanismo de impregnación física no poseen carácter ácido, básico o salino
definido.
Colorantes Metacromáticos : Azul de toluidina
Ejemplos de colorantes:
Anaranjado de metilo, Sudan R, Sudan 4, Safranina , Azul de metileno, Cristal
violeta, Verde de metilo, Hematoxilina- Eosina, Giemsa, Fucsina Acida
Principales coloraciones usadas en el Laboratorio Clínico
Microbiología
Coloración de Gram, Acido alcohol resistente ( Ziehl Neelsen), de Hiss, Tinta
china, de Leifson, de Vago.
Hematología
Coloración de Wright, Giemsa, Azul cresil brillante
Anatomía patológica
Coloración de Hematoxilina y Eosina, Papanicolau, Tricromica de Masson, de
Mallory, Tricromica de Van Gison.
FIJACIÓN
La fijación tiene por objeto matar las células y conservarlas, hasta donde sea
posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un método
histológico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura
morfológica y química de las células y tejidos al estado vivo y que permite realizar,
posteriormente, los procedimientos de coloración o de identificación que facilitan el
completo conocimiento de su constitución intima.
Se llaman fijadores a las sustancias químicas o a los agente físicos que se
utilizan para tal fin.
Cualidades que debe tener un fijador
Actuar con rapidez, matando y fijando a las células antes de que aparezcan los
fenómenos agónicos o post- mortem (autolisis, desintegración, etc)
Poseer alto poder de penetración para asegurar la fijación correcta hasta en las
capas mas profundas de la pieza a fijar.
Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vitro.
Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su
observación ulterior (ejecución de cortes, coloración, etc)
Impedir la desaparición de los elementos solubles durante la fijación o después
de ella
No provocar o impedir la producción de estructuras artificiales.
No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.
Fijadores simples:
a) Formol del 10%, es el más usado. Su empleo es aconsejable en todos los
casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se
trata de fijar órganos o tejidos para estudios histólogicos topográficos.
b) Alcohol etílico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microquímica
c) Alcohol metílico, se emplea con frecuencia para fijar frotis desecados
(sangre, médula ósea, ganglio, bazo, líquidos de punción, etc).
d) Äcido ósmico al 1 o 2%, es poco penetrante pero enérgico, conserva muy bien
estructuras celulares.
e) Bicromato de potasio al 3-5%
Fijadores compuestos:
En su composición intervienen un número variable de fijadores simples
racionalmente elegidos con el fin de completar la acción de cada uno de ellos o
atenuar sus defectos.
a) Liquido de Fleming : mezcla de cromo-osmio-acética
b) Liquido de Zenker, mezcla de bicromato-sublimado-acética
c) Liquido de Helly , mezcla de Zenker –formol
d) Liquido de Bouin, mezcla de picro-formol-acética.
e) Liquido de Duboscq- Brasil , o Bouin alcohólico
Fijadores Físicos
a) Desecación
b) Calor Seco
c) Calor Húmedo
d) Frío
e) Congelación y desecación
III PARTE PRACTICA
1) Coloración de Wright (en base a las indicaciones del profesor)
Técnica de coloración
1. Hacer un frotis de sangre venosa. Dejar secar.
2. Cubrir el frotis con varias gotas del colorante Wright (según indicación)
3. Agregar el agua tamponada (según instrucciones)
4. Enjuagar, escurrrir y dejar secar al aire.
5. Observar al microscopio
2) Reconocer las baterías de coloraciones microbiológicas y realizar la
coloración Gram.
1. Preparar el frotis
Dejar secar
2. Fijar a la flama
3. Colorear: colocando suficiente cantidad de colorante cristal violeta o violeta de
genciana, sobre la muestra, dejar por 1 minuto
4. Lavar con agua corriente
5. Crubir con lugol ( mordiente) por 1 minuto
6. Decolorar con alcohol acetona
7. Lavar con agua
8. Cubrir con safranina (contraste) por 20 segundos
9. Lavar, secar y observar al microscopio
IV CUESTIONARIO
1. ¿Qué otro tipo de coloraciones microbiológicas conoces?
2. ¿Cuál es la diferencia entre bacterias Gram negativas y Gram positivas?
3. Averiguar como se prepara la coloración de Zielh Neelsen
4. Mencione ejemplos de colorantes ácidos, básicos, indiferentes, neutros y meta
cromáticos
5. Defina coloración progresiva y coloración regresiva
6. De que otra forma se puede clasificar a los colorantes.
7. ¿Cual es la función del mordiente?
8. ¿Por qué se fijan a la flama los frotices microbiológicos?
9. Describa la naturaleza y características tintoriales cada uno de los colorantes
que se utilizan en la coloración de papanicolau.
V REFERENCIAS
Koneman E, Washington W. Diagnóstico microbiológico. Sexta edición. México;
2006 . P: 59-61. 102, 279, 280.
Atlas Virtual de medicina. Bacilos Gram Negativos. Se encuentre en network en
español: http://www.telmeds.net/AVIM/Abacterio/bacilos%20gram
%20negativos/bacilos_gram_negativos_fermentad.htm (Acceso el 21 de
diciembre del 2009)