guia practica microbiologia

90
ASOCIACIÓN UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA SEMESTRE 2013-I IV CICLO GUIA DE PRÁCTICA DE MICROBIOLOGIA MÉDICA

Upload: ediberto-hinostroza-antonio

Post on 25-Jan-2017

1.222 views

Category:

Engineering


0 download

TRANSCRIPT

Page 1: Guia practica microbiologia

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

SEMESTRE 2013-I

IV CICLO

GUIA DE PRÁCTICA

DE

MICROBIOLOGIA MÉDICA

Page 2: Guia practica microbiologia

ASOCIACIÓN

UNIVERSIADA PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MÉDICA

INDICE

Página

Recomendaciones generales 3

Microscopia: estudio y manejo del microscopio 4

Métodos de coloraciones: coloraciones simples., diferenciales y especiales 7

Coloración diferencial de Gram 9

Coloración diferencial de Ziehl-Neelsen 11

Coloración especial: coloración de Leishman y Vago 12

Medios de cultivo: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales 14

Siembra bacteriana. Medios de aislamiento 17

Metabolismo bacteriano 19

Pruebas de sensibilidad a los antibióticos (antibiograma) 27

Reacción antígeno – anticuerpo: Aglutinación 29

Fagocitosis 31

Reacción de Precipitación 32

Pruebas Inmunoenzimaticas: ELISA 33

Preparación de Antígenos bacterianos 35

Aislamiento e Identificación de cocos Gram positivos: Genero Staphylococcus 38

Aislamiento e Identificación de cocos Gram positivos: Género Streptococcus 40

Aislamiento e Identificación de cocos Gram negativos: Genero Neisseria 42

Aislamiento e Identificación de bacilos Gram positivos: Genero Bacillus 44

Aislamiento e Identificación de bacilos Gram positivos: genero Listeria 46

Estudio microbiológico de la flora normal de la Secreción Bucofaríngea 48

Aislamiento e Identificación de bacilos acido- alcohol- resistentes: Genero Mycobacterium. 50

Aislamiento e identificación de bacilos Gram positivos: genero Corynebacterium 52

Aislamiento e Identificación de bacilos Gram negativos: Genero Pseudomona 54

Aislamiento e Identificación de bacilos Gram negativos: Genero Brucella. Hemocultivo y 56

Serología

Aislamiento e Identificación de Enterobacterias: Coprocultivo 59

Estudio e Identificación de Vibrio cholerae 62

Estudio e Identificación del Genero Leptospira 64

Estudio e Identificación de Bartonella 66

Estudio e Identificación de Treponema – Prueba de VDRL ó RPR 67

Cultivo de muestras de infecciones urinarias: Urocultivo 68

Aislamiento de virus en huevos embrionados y en ratones lactantes. 71

Estudio e Identificación de Hongos Ambientales 74

Estudio e Identificación de Hongos Dermatofitos 78

Estudio de Hongos Levaduriformes: Observación de cortes histopatológicos 81

Estudio de Hongos Dimórficos: Observación de cortes histopatológicos 83

ANEXOS: SEMINARIOS:

Genética Microbiana e Ingeniería Genética 86

Vacunas Antimicrobianas. Programa de Vacunación 87

Antibióticos y quimioterápicos 88

Enfermedades de transmisión sexual. SIDA 89

Arbovirus. Dengue y Fiebre amarilla 90

Page 3: Guia practica microbiologia

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO

DURANTE EL CURSO DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA

1. El estudiante deberá asistir a las clases prácticas llevando consigo la Guía de Prácticas,

mandil, plumón indeleble para escribir sobre vidrio y lápices de colores.

2. No se podrá ingresar sin mandil, guantes y mascarilla a la sala de prácticas, para evitar

contaminaciones

3. Durante las prácticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles

contaminaciones.

4. Sobre la mesa de trabajo sólo deberán colocar su guía de práctica y su libreta de apuntes.

5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodón, etc. al tacho de basura

6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de práctica para evitar que se

tiñan la mesa de trabajo, ropa o manos.

7. Colocar las láminas preparadas sobre hojas de papel blanco.

8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan

debidamente cerrados y en posición vertical para evitar que se derramen.

9. Las láminas coloreadas a desecharse deberán ser colocadas en frascos de boca ancha con

desinfectante.

10. Todos los cultivos que se preparen deberán incubarse, teniendo en cuenta las siguientes

anotaciones:

Nombre o iniciales de los estudiantes

Nombre del germen, número de mesa, turno y fecha de la siembra

Las placas deberán ser invertidas, a menos que el profesor de instrucciones contrarias

Los tubos deberán estar bien tapados y colocados en gradillas

Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37ºC

11. Al finalizar el trabajo:

Limpiar con algodón los objetivos del microscopio

Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no

queden láminas sobre la platina

Limpiar la mesa de trabajo

Comprobar que la llave de gas este cerrada

Lavarse prolijamente las manos con jabón.

12. El Protocolo de cada práctica será controlado por el profesor al final de la práctica.

El Profesor Responsable del Curso

Page 4: Guia practica microbiologia

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

SIGNATURA DE MICROBIOLOGÍA MÉDICA

PRÁCTICA N° 1

MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

I. OBJETIVO

1. Conocer e identificar correctamente las partes ópticas y mecánicas del microscopio

compuesto.

2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservación del microscopio.

II. MATERIALES

Microscopios

Láminas portaobjetos

Laminillas cubreobjetos

Láminas coloreadas

Suero fisiológico

Pipeta Pasteur

Plumón indeleble

Papel lente

Tela de felpa(25 cm)

Fibra de pelo y lana

III. PARTES DEL MICROSCOPIO Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio:

PARTE MECANICA

Tubo portalentes y cremallera

Tornillos macro y micrométrico

Revolver

Platina

Condensador

Brazo y Pie

Charnela

PARTE OPTICA

Ocular

Objetivos

Espejo

Lentes de condensador

Diafragma

IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.

2. Sistema de Iluminación: comprende el foco, condensador y diafragma.

3. Sistema de Ajuste: comprende el macrométrico, micrométrico y cremallera

4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los objetivos

de 4x, 10, 20x, 40, y 100x.

Page 5: Guia practica microbiologia

5

Page 6: Guia practica microbiologia

6

Page 7: Guia practica microbiologia

7

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 2

METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES

Y ESPECIALES.

INTRODUCCION

La mayor parte de los colorantes usados en Microbiología son de tres tipos:

A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromóforo) es el anión llamados colorantes

ácidos Ej. Eosinato de sodio ó Eosina.

B) Aquellos cuyo cromóforo es el catión llamados colorantes básicos Ej. Cloruro azul de

metileno.

C) Los colorantes neutros, compuestos por básicos y ácidos Ej. Hematoxilina (básico) Eosina

(ácido).

En los trabajos bacteriológicos generalmente se usan colorantes básicos como el azul de metileno,

cristal de violeta, fucsina básica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los colorantes

derivados de la anilina.

Las coloraciones pueden ser según el número de colorantes que utilizan:

A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de

lactofenol

B) Diferenciales: cuando utilizan más de un colorante como la coloración de Gram, y Ziehl -

Neelsen.

C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares

como la coloración de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.

A. COLORACIONES SIMPLES

Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfología de los

microorganismos.

MATERIAL

Muestra con mezcla bacteriana

Láminas portaobjetos

Laminillas cubreobjeto

Asa bacteriológica de Kolle en aro

Colorante Azul de metileno

Colorante Tinta China

Page 8: Guia practica microbiologia

8

Colorante Azul de lactofenol

Mechero de Bunsen

Varillas para coloración

Aceite de cedro

Xylol

Papel lente

Microscopio de luz con objetivo de inmersión

COLORACIÓN AZUL DE METILENO:

1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor

2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 – 5 minutos

3. Lavar con agua y dejar secar

4. Observar al microscopio con objetivo de inmersión y aceite de cedro

RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso

COLORACIÓN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

1. Colocar una gota de tinta china sobre la lámina portaobjetos

2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana

3. Cubrir la preparación con una laminilla cubreobjeto

4. Observar con lente de menor y mayor aumento.

RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teñir resaltan sobre un fondo oscuro.

Como la capsula de la levadura Cryptococcus

COLORACIÓN AZUL DE LACTOFENOL:

1 Colocar una gota del colorante sobre la lamina portaobjetos

2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante

3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto

4 Observar con lente de menor y mayor aumento

RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul – celeste

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfología de los microorganismos observados

Page 9: Guia practica microbiologia

9

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

B. COLORACIONES DIFERENCIALES

Son aquellas coloraciones que utilizan más de un colorante y, generalmente el segundo colorante es

llamado colorante de contraste. Entre los más usados tenemos la coloración de Gram y la de Ziehl

Neelsen o también llamado ácido- alcohol resistente

COLORACION DE GRAM

Es una coloración diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram

negativas, según la estructura y composición de la pared celular. En las Gram negativas, el

peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no están entrelazadas; en las Gram positivas la

mayoría presenta muchas capas de peptidoglucano.

Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff

MATERIAL

Muestra con mezcla de bacterias

Solución fisiológica al 0.85%

Láminas portaobjetos

Asa bacteriológica de Kolle en aro

Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:

Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario)

Bicarbonato de sodio

Lugol (mordiente)

Alcohol- acetona (decolorante)

Fucsina básica (colorante de contraste)

Mechero de Bunsen

Varillas para coloración

Microscopio de luz con objetivo de inmersión

Aceite de cedro

Xylol

Papel lente

Page 10: Guia practica microbiologia

10

PROCEDIMIENTO

1. Dividir la lámina en 3 partes: 1/3 para rotular el N° de muestra y 2/3 para la preparación del

frotis.

2. Con el asa bacteriológica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el

centro de la lámina portaobjeto, extendiéndola en espiral del centro a la periferia, para obtener

una preparación en capa fina.

3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la llama

débil del mechero de Bunsen.

4. Colocar la lámina portaobjetos con la preparación sobre la varilla de coloración.

5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solución de

bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.

6. Lavar con agua corriente (evitar la caída del chorro de agua directamente sobre el frotis)

7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.

8. Decolorar el frotis con una solución de alcohol- acetona (inclinar la lámina y decolorar hasta que

no arrastre colorante) máximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.

9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina básica durante 30 segundos. Luego lavar con agua.

10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama débil del mechero de Bunsen

11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

RESULTADOS

Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prácticas.

Page 11: Guia practica microbiologia

11

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 3

COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

INTRODUCCION

Coloración diferencial que permite la tinción de microorganismos que poseen elevado contenido de

lípidos, como el género Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados también ácido-alcohol-

resistente. Al teñirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina básica fenicada) que es

soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es forzado a penetrar en la célula y en

esta forma resistir a la decoloración.

MATERIAL

Láminas con frotices de bacilo tuberculoso

Set de coloración Ziehl-Neelsen:

Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)

Alcohol ácido (alcohol etílico con 3% de HCl)

Azul de metileno (colorante de contraste)

Mechero de alcohol

PROCEDIMIENTO

1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lámina y calentar la preparación con el

mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento por

tres veces, evitando que hierva el colorante.

2. Lavar con agua corriente.

3. Decolorar con alcohol ácido hasta que se aprecie una coloración rosada.

4. Lavar con agua corriente

5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.

6. Lavar con agua corriente

7. Secar y observar con lente de inmersión.

RESULTADO

Las bacterias ácido alcohol resistentes se tiñen de color rojo y las no ácido alcohol resistentes se

tiñen de color azul.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.

Page 12: Guia practica microbiologia

12

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 4

COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO

INTRODUCCION

Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con los

colorantes de anilina como: las espiroquetas. Así como también la coloración de microorganismos

presentes en la sangre.

COLORACION DE LEISHMAN

Es una coloración especial policromática utilizada para demostrar la presencia y morfología de

microorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.

MATERIALES

Frotis de sangre con Bartonella

Solución de colorante Leishman

Agua destilada tamponada

Microscopio con lentes de 100X

Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.

2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos

3. Lavar con agua de caño y dejar secar

4. Observar con objetivo de inmersión

5. Anotar los resultados en el protocolo.

COLORACIÓN DE VAGO

Es utilizado para la coloración de gérmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el

método de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy débilmente con el Leishman.

Page 13: Guia practica microbiologia

13

MATERIALES

Lámina portaobjetos

Palito mondadientes

Solución fisiológica al 0.85%

Set de coloración de Vago:

Mercuro cromo al 2%

Violeta de genciana

Asa de siembra en aro

Microscopio con lentes de 100X

Aceite de inmersión

PROCEDIMIENTO

1. En una lamina colocar una gota de suero fisiológico al o.85%

2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa

fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.

3. Fijar el frotis al calor suave

4. Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos

5. Lavar con agua corriente

6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos

7. Lavar con agua corriente

8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersión.

RESULTADOS

Coloración Leishman: Los microorganismos se tiñen de color rosado oscuro

Coloración de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando parte

de la flora normal de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.

Page 14: Guia practica microbiologia

14

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 5

MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y

DIFERENCIALES,

INTRODUCCION Para el aislamiento de bacterias de un material patológico, es necesario su cultivo en medios

especiales con una determinada concentración de iones de hidrógeno, sales, compuestos

nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura. Según su utilización pueden ser: simples,

enriquecidos, selectivos y diferenciales.

MATERIALES

Probetas de 100 ml.

Balones de 250 ml.

Tiras de Papel indicador de pH

Frasco con solución NaOH (N/10)

Frasco con solución HCl (N/10)

Pinzas rectas

Bagetas de vidrio

Goteros de vidrio

Trípodes con malla de Asbesto

Tubos de 16x150 mm

Tubos de 13x100 mm

Placas Petri

Frascos estériles

Agua destilada

Tubo con sangre citratada

Caldo nutritivo Agar simple o Agar nutritivo

Extracto de carne 0.3 g Extracto de carne 0.3 g

Peptona 1.0 g Peptona 1.0 g

Dextrosa 0.5 g Dextrosa 0.5 g

Cloruro de sodio 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g

Agua destilada 100 ml Agua destilada 100 ml

pH 7.0 - 7.4 Agar 1.5 g

pH 7.0 - 7.4

Caldo peptonado

Peptona 2.0 g

Cloruro de sodio 1.0 g

5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado.

6.0 gr. de Agar SS deshidratado.

6.5 gr. de Agar TSI.

2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons

2.1 gr. de Agar Urea.

1.7 gr. de Caldo MR VP

3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.

Page 15: Guia practica microbiologia

15

PREPARACION

I. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES

1. Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter al

calor hasta su completa dilución. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio es ácido

agregar gota a gota la solución de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gota solución de

HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y esterilizar al autoclave a 121ºC por 15 Minutos.

Controlar la esterilidad incubando a 37ºC por 24 horas. Luego dejar en refrigeración hasta su

utilización.

2. Agar nutritivo o simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia, luego

agregar los demás ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOH ó HCl.

Luego envasar y esterilizar a 121ºC por 15 Minutos y controlar la esterilidad por incubación a

37ºC por 24 horas. Dejar luego en refrigeración hasta su utilización.

II. MEDIOS ENRIQUECIDOS

1. Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejar

enfriar hasta una temperatura de 45ºC y adicionar 5ml de sangre citratada o desfibrinada.

Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un buen homogenizado y distribuir en Placas

Petri estériles; dejar luego solidificar y realizar el control de esterilidad. Mantenerlo en

refrigeración hasta su utilización. El color normal del medio debe ser rojo cereza.

2. Para el Agar chocolate; preparar primero Agar sangre y someterlo a una temperatura de 80ºC

hasta que se torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estériles y realizar control de

esterilidad y dejarlo después en refrigeración.

III. MEDIOS SELECTIVOS

3. Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hasta su

completa disolución. Autoclavar a 121º C por 15 Minutos y repartir en placas estériles.

4. Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter al calor

hasta su completa disolución. Repartir luego en placas estériles. No necesita autoclavar.

IV. MEDIOS DIFERENCIALES

1. Para el Agar TSI (Hierro tres azúcares); disolver el medio en 100 ml de Agua destilada, hervir

hasta su completa disolución. Distribuir en tubos de 13x100mm y esterilizar en autoclave a 121º

C por 15 Minutos. Luego de autoclavar colocar los tubos en plano inclinado. El medio al final

tendrá un color rojo naranja.

2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendrá un color

verde.

3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolución y

autoclavar. Después adicionar 5 ml de Solución de Urea al 40% esterilizada por filtración;

Page 16: Guia practica microbiologia

16

mezclar homogéneamente y repartir en tubos de 13x100mm en plano inclinado. El medio tendrá

un color amarillo.

4. Para el Caldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos de

13x100mm y autoclavar a 121º C por 15 Min.

5. Agar Lisina Hierro; disolver el medio en agua destilada por calor hasta su completa disolución

y repartir en tubos de 13x100mm; luego autoclavar a 121º C por 15 min., y dejar enfriar los

tubos en plano inclinado.

PROTOCOLO

Realizar un cuadro indicando:

A. Los medios de cultivo preparados en cada mesa.

B. El color que presentan cada medio de cultivo preparado.

C. Materiales que usaron para la preparación.

Page 17: Guia practica microbiologia

17

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 6

SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.

INTRODUCCION

Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un

incremento marcado del número de células. Algunas especies alcanzan una población máxima a las

24 horas y otras necesitan un período más prolongado para alcanzar su máximo desarrollo.

Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan cultivos

y el resultado de la multiplicación bacteriana colonia, así como el procedimiento por el cual se pone

en contacto un microorganismo con un medio de cultivo, se llama siembra. Existen varias

técnicas de siembra, siendo las más usadas : La siembra por estría, por dispersión-agotamiento,

por inoculación y por puntura.

Las principales características morfológicas que presentan las colonias son:

FORMA : Circular, elíptica, puntiforme y filamentosa.

ELEVACIÓN : Plana, convexa, acuminada, umbilicada.

BORDE : Entera, ondulada, dentada y filamentoso.

SUPERFICIE : Lisa, rugosa, granulada.

TAMAÑO : Diámetro en milímetros.

CONSISTENCIA : Cremosa, membranosa y mucoide.

CROMOGENESIS : Pigmentación verde, amarilla, roja, etc.

MATERIALES

Tubos con suero fisiológico estéril

Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo

Tubos de 16x150 con Agar nutritivo

Placas con Agar nutritivo

Placas con Agar Mac Conkey

Placas con Agar hipertónico de Chapman

Tubos con Agar Sabouraud

Tubos de 16x150 con medio hipertónico

de Chapman

Torundas estériles

Asas de siembra en aro y punta

PROCEDIMIENTO

A) TIPOS DE SIEMBRA

Siembra por estría: Diseminar en forma de zigzag, una pequeña cantidad de muestra bacteriana

sobre la superficie del medio de cultivo sólido con la ayuda de un Asa de siembra en aro.

Page 18: Guia practica microbiologia

18

Siembra por dispersión-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de

la superficie del medio de cultivo sólido que se encuentra en una placa Petri, girar ésta unos 45º y

continuar sembrando en zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.

Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-sólido, con ayuda

del Asa de siembra en punta, introduciéndola en forma vertical hasta la mitad de Agar.

Siembra por inoculación: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e introducirlo

hasta el fondo del tubo con medio líquido, procurando no tocar las paredes del tubo.

B) LECTURA:

Con la ayuda del profesor:

1. El alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de

cultivos sembrados.

2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos.

PROTOCOLO

METODOS DE SIEMBRA DESCRIPCION DE LA

SIEMBRA

MEDIO DE CULTIVO

USADO

ESTRIA

DISPERSION

AGOTAMIENTO

PUNTURA

INOCULACIÓN

CARACTERISTICA

DE LA COLONIA

OBSERVACION DE

COLONIAS

MEDIO DE CULTIVO

USADO

FORMA

ELEVACIÓN

BORDES

SUPERFICIE

TAMAÑO

CONSISTENCIA

CROMOGENESIS

Page 19: Guia practica microbiologia

19

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 7

METABOLISMO BACTERIANO

INTRODUCCION

La identificación bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinación de las características

de las colonias y morfología con tinción de Gram u otras coloraciones. Sin embargo, la

caracterización final de un aislamiento bacteriano desconocido, para identificarlo a nivel de género y

especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimáticos que son únicos para cada especie y

sirvan como marcadores de identificación.

En el laboratorio, estos sistemas enzimáticos se detectan inoculando una pequeña porción de la

colonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos específicos e

indicadores químicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de subproductos

específicos.

I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS

Por definición, la fermentación es un proceso metabólico de oxido- reducción que ocurre en un

medio ambiente anaerobio, y en lugar de oxígeno, un substrato orgánico sirve como el aceptor final

de hidrógeno (electrones). Este término de fermentación se refiere a la utilización de hidratos de

carbono como la glucosa los cuales les servirán como fuente de energía y carbono.

Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de ácidos

mixtos producidos, dando como resultado la acidificación del medio, el cual es visible por el cambio

de color en el medio de cultivo de fermentación (pH- indicador); la presencia de gas (CO2 e H+) se

manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio sólido.

A) REACCIONES DE OXIDACIÓN- FERMENTACIÓN DE AZUCARES:

EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)

EL medio TSI fue diseñado para la diferenciación de Bacilos Gram negativos, basándose en la

capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrógeno

(H2S).

El medio contiene tres azúcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10

respectivamente. Para detectar los productos ácidos generados se emplea un indicador de pH que es

el rojo de fenol cuyo rango de viraje está entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).

Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes en

este medio pueden ser fundamentalmente tres:

1. Fermentación de glucosa únicamente.

2. Fermentación de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos.

3. No fermentación de carbohidratos.

Page 20: Guia practica microbiologia

20

Como producto de la fermentación de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se

detecta como pequeñas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba

del tubo.

El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de

hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).

MATERIAL

Tubo con medio TSI en plano inclinado.

Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. Aeruginosa

PROCEDIMIENTO

1. Con el asa de siembra inocule una porción pequeña de la colonia en el centro del tubo y estríe la

superficie del pico de flauta.

2. Rotular e incubar a 37°C por 18- 24 horas.

INTERPRETACION

Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubación indicada.

1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.

2. Fermentación de la glucosa únicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que se

encuentra en baja concentración con respecto a los otros azúcares), ha sido utilizada y la cantidad

de ácido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados por la

utilización de la peptona; además los ácidos pueden ser utilizados.

Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo,

por no estar en contacto con el oxígeno, sólo hay fermentación y el medio permanece ácido.

3. Fermentación doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentación de la

glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azúcares produce gran cantidad de ácidos, por lo que

el tubo permanece amarillo.

4. No fermentación de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta únicamente utilización

oxidativa de peptonas, por lo que sólo la superficie del tubo se alcaliniza.

5. Producción de gas: Formación de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.

B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)

1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )

2.

La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una característica

valiosa para identificar especies bacterianas que producen ácidos fuertes (láctico, acético,

fórmico) a partir de glucosa.

Estas bacterias que primariamente siguen la vía de fermentación de ácidos mixtos

frecuentemente producen suficiente ácido después de una incubación prolongada, como para

mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto ácido límite del indicador rojo de metilo),

superando el sistema amortiguador del pH del medio.

Page 21: Guia practica microbiologia

21

3. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )

El ácido pirúvico, un compuesto fundamental formado en la degradación fermentativa de la

glucosa, es metabolizado por algunos microorganísmos produciendo el acetil- metil-

carbinol(Acetoina)un subproducto neutro de la vía 2,3- butilenglicol.

La prueba se basa en la conversión del acetil- metil- carbinol en diacetil a través de la acción del

KOH y Oxígeno atmosférico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la acción

catalítica del Alfa naftol y Creatinina.

MATERIALES

Cepa bacteriana MR positivo y negativo

Cepa bacteriana VP positivo y negativo

Reactivo Rojo de metilo

Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%)

Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella

PROCEDIMIENTO

1. Por la técnica de inoculación, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y

negativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37°C.

2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.

INTERPRETACION

1. Para la prueba Rojo de Metilo, añadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre,

cuyo rango de viraje está entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se

manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo- naranja.

2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y 0.2

ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15 minutos. Es

importante añadir los reactivos en el orden específico.

Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es

observada dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza después de una hora los

cultivos pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretación falsa positiva.

En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.

II. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS

PRODUCCION DEL INDOL

Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminoácido

triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, ácido pirúvico y amoniaco(NH3). El indol

puede detectarse en un medio rico en triptofano, observando la aparición de un color rojo(en

forma de anillo o impregnado en la tira de papel), luego de agregar una solución que

contiene p- dimetilaminobenzaldehido.

Page 22: Guia practica microbiologia

22

MATERIALES

Cepa indol positivo y negativo.

Medio líquido peptonado y/o Medio SIM

Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino

benzaldehido).

Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.

PROCEDIMIENTO

La aparición de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos

segundos después de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y

constituye una prueba positiva. Las bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero

que no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecerá sin cambio alguno, siendo esta

una prueba negativa.

III. UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO

Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia

Enterobacteriaceae, las cuales pueden obtener energía por vía distinta de la fermentación de

los carbohidratos, utilizando el citrato de sodio como única fuente de carbono para su

metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se emplee para determinar esta

característica no debe contener proteínas ni carbohidratos.

El citrato de sodio es una sal del ácido cítrico, compuesto orgánico simple que constituye

uno de los metabolitos del ciclo de Krebs.

PRINCIPIO

La utilización del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con

citrato con formación de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons)incluye

citrato de sodio, un anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única

fuente de nitrógeno.

Las bacterias que pueden utilizar citrato también pueden extraer nitrógeno de la sal de

amonio, con producción de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversión del NH3 en

hidróxido de amonio(NH4OH), detectándolo con el indicador de pH incorporado el azul de

bromotimol cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).

MATERIALES Cepa control citrato positivo y negativo.

Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado

PROCEDIMIENTO

1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la técnivca de estría en cada tubo la

cepa citarto positiva y negativa.

2. Rotular los tubos e incubar a 37°C por 18- 24 horas.

Page 23: Guia practica microbiologia

23

INTERPRETACION

Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio

inclinado.

Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.

IV. HIDRÓLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)

Prueba importante para la identificación de especies bacterianas que poseen la enzima ureasa

que hidroliza la urea, según el siguiente esquema:

O

NH2- C- NH2 + 2HOH ------------------- CO2 + H2O + 2 NH ═ (NH4)2 CO3

Ureasa

El amoniaco reacciona en la solución para dar carbonato de amonio, produciéndose una

alcalinización y un aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.

MATERIALES

Cepa patrón ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus )

Medio Agar urea según Christensen

PROCEDIMIENTO

1. Por medio de la siembra por estría, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular en el

fondo.

2. Incubar durante 18- 24 horas a 37°C

INTERPRETACION

Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el medio.

Prueba negativa: El medio permanece del color original

V. PRUEBA DE LA CATALASA

La catalasa es una enzima que poseen la mayoría de las bacterias aerobias y facultativas

anaerobias.

El peróxido de hidrógeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo oxidativo

de los carbohidratos y sí se acumula es letal para el microorganismo.

La catalasa convierte el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno de acuerdo a la siguiente

reacción:

2 H2O2 --------> 2 H2O + O2

La prueba es de vital importancia en la diferenciación de los estreptococos (catalasa

negativa) de los estafilococos (catalasa positiva).

Page 24: Guia practica microbiologia

24

MATERIALES Cepas Control: S. aureus, Streptococcus ó Enterococcus

Solución de Peróxido de hidrógeno (H2O2) al 3%

Medio de cultivo: cualquier medio sólido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los

eritrocitos poseen actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados

falsos positivos.

PRUEBA EN LÁMINA

a) Con el asa bacteriológica en punta o un aplicador estéril, picar el centro de una colonia

bien aislada y transferir él inoculo a un portaobjetos limpio.

b) Añadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%

c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente después que se añade el reactivo.

d) Descartar la lámina en un recipiente con desinfectante.

PRECAUCIONES

1. El orden de la prueba en lámina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya que

puede resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado de la

prueba.

2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos más viejos pueden perder

su actividad de catalasa dando una reacción falsa negativa.

3. El H2O2 es extremadamente acústico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en caso

que ocurra inundar el área afectada con alcohol de 70% para neutralizar la acción. NO

DEBE USARSE AGUA.

INTERPRETACION

Prueba cualitativa: La aparición rápida y prolongada de burbujas, de gas o efervescencia

son indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la

catalasa que descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutas durante 20- 30’, éstas

no son catalasa positivas.

VI. PRUEBA DE LA CITOCROMO – OXIDASA

Los citocromos son hemoproteínas que contienen hierro y actúan como el último eslabón de

la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxígeno con formación de

agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios

facultativos, permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzima o son anaerobios

estrictos.

En el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil o

tetrametil- p- fenilendiamina ( el cual se presenta en solución, discos o tiras llamados

comúnmente oxidasa).

MATERIAL

Cepa control: sembrada en Agar nutritivo

Reactivo de oxidasa

Page 25: Guia practica microbiologia

25

PROCEDIMIENTO

1. Directo: Se añaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo.

2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los

discos o tiras de papel que tienen ya el reactivo de oxidasa

INTERPRETACIÓN

Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente un

intenso color azul oscuro.

AGAR LIA (Agar Lisina Hierro)

Principio: Determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminoácido Lisina

descarboxilándolo o desaminándolo, la fermentación de la glucosa, la producción o no de gases

(CO2), junto con la producción o no de ácido sulfhídrico (H2S).

Lectura: Se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación. Se lee la reacción producida en la

superficie (parte aerobia) y en la profundidad (parte anaerobia) del medio. El indicador de pH

del medio es purpura de bromocresol, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad

al color purpura. Por contener una pequeña cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el fondo

del tubo es amarillo y la superficie alcalina

Interpretación: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:

a) Fermentación de la glucosa: la bacteria no utiliza el aminoácido sólo fermenta la

glucosa: superficie purpura/fondo amarillo.

b) Descarboxilación de la lisina: Positivo (purpura todo el medio), Negativo (superficie

violeta/fondo amarillo).

c) Desaminación de la lisina: superficie roja/fondo amarillo.

d) Producción de gas: ruptura del medio.

e) Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.

VII. PRUEBA DE LA HEMOLISINA

Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias tóxicas

que pueden ser detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar sangre,

produciendo la lisis de los eritrocitos, según el tipo de lisis que producen pueden clasificarse

en tipo Alfa, Beta y Gamma.

MATERIALES

Cepa bacteriana

Placas con Agar sangre de carnero

PROCEDIMIENTO

1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre

2. Incubar por 18 – 24 horas a 37° C

Page 26: Guia practica microbiologia

26

INTERPRETACIÓN

Hemólisis tipo Alfa: Es un tipo de hemólisis incompleta, hay un enverdecimiento del medio

debido a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a

compuestos del tipo de la biliverdina

Hemólisis tipo Beta: Hay una lisis completa de los eritrocitos observándose una zona clara

alrededor de la colonia

VIII. PROTOCOLO

PRUEBAS

BIOQUÍMICAS

MEDIO DE

CULTIVO

REACTIVO Y /O

INDICADOR

LECTURA

TSI

(Fermentación-

H2S)

VP

VOGES-

PROSKAUER

MR

ROJO DE

METILO

INDOL

CITRATO

CATALASA

UREASA

CITOCROMO

OXIDASA

LIA

(Agar Lisina

Hierro)

HEMOLISINA

Page 27: Guia practica microbiologia

27

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 8

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)

INTRODUCCION

Es una prueba de laboratorio clínico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los

antibióticos y quimioterapeúticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.

La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes métodos:

Método de dilución

Método de Difusión en Agar

OBJETIVOS

1. Realizar la técnica de difusión en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los

antibióticos.

2. Interpretar los resultados del método utilizado.

3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la técnica empleada.

DILUCION EN TUBO

Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibiótico, midiendo la concentración

inhibitoria mínima (CIM), es decir, la concentración más baja que inhibe el crecimiento “in vitro”

bacteriano.

Consiste en la preparación de una serie de diluciones del antibiótico estudiado en caldo o en medio

agar al cual se inocula luego una suspensión del germen. Luego de una incubación por 24 horas, se

puede observar la CIM como la dilución más alta en la que no existe crecimiento macroscópico

bacteriano. Esta técnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza.

DIFUSION EN AGAR (Según Kirby- Bauer y col.)

Es un método simple de rutina en Microbiología médica, para seleccionar el antibiótico o

quimioterápicos más adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar la

muestra en estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y colocar luego discos de papel

filtro que contienen los antibióticos y que después de una incubación de 24 horas, se observan las

zonas de inhibición alrededor de cada disco de antibiótico. La cantidad de antibiótico presente en el

disco difiere para los distintos fármacos.

MATERIALES

Placas de Agar Müller Hilton o Tripticase soya

Tubos con caldo nutritivo

Tubos con Agar semisólido

Tubos con cultivo bacteriano

Asas de siembra

Page 28: Guia practica microbiologia

28

Torundas estériles

Discos impregnados con diferentes antibióticos o quimioterápicos (sensi- disck).

Pinzas

Mecheros

PROCEDIMIENTO

1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar

uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.

2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.

3. Con la pinza en condiciones estériles, colocar los discos impregnados con los diferentes

antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm.

4. Incubar a 37°C durante 24 horas.

LECTURA

a) Medir en milímetros el diámetro de las zonas de inhibición del desarrollo bacteriano alrededor de

los discos, incluyendo el diámetro del disco.

b) Comparar con la tabla el diámetro de las zonas de inhibición obtenidas y determinar si el

microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes antimicrobianos

utilizados.

Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero puede

responder a dosis altas del antibiótico.

La cantidad de antibiótico presente en el disco depende de la concentración y de su capacidad de

difusión en el Agar.

c) Anotar e interpretar los resultados.

Antimicrobiano Código Resistente Sensible Antimicrobiano Código Resistente Sensible

Gram negativo Gram positivo

Amikacina AK-MK ≤ 14 ≥17 Ac.nalidixico NA ≤ 21 ≥ 16

Amoxicilina + clavulanico

AM

≤ 13

≥ 18

Cefepima

FEP

≤ 14

≥ 18

Ampicilina AMP ≤ 13 ≥17 Ciprofloxacin CIP ≤ 15 ≥21

Cefalotina CFM ≤ 14 ≥18 Clindamicina CM-DA ≤ 14 ≥17

Cefotaxima CTX ≤ 14 ≥ 23 Cloranfeicol C ≤ 12 ≥18

Ceftazidima CAZ ≤ 14 ≥ 20 Eritromicina E ≤ 13 ≥18

Ceftriaxona CRO ≤ 13 ≥17 Gentamicina GM-GE ≤ 12 ≥15

Cefuroxina RBA ≤ 14 ≥18 Nitrofurantoina FD ≤ 14 ≥17

Ciprofloxacin CIP ≤ 15 ≥21 Norfloxacin NOR ≤ 12 ≥17

Cloranfenicol C ≤ 12 ≥18 Oxacilina AO ≤ 10 ≥13

Gentamicina GM-GE ≤ 12 ≥15 Penicilina P ≤ 19 ≥20

Sulfazotrim SUT ≤ 12 ≥ 18 Rifampicina RIF ≤ 16 ≥ 20

Tetraciclina T ≤ 14 ≥19 Sulfazotrim SUT ≤ 12 ≥ 18

Tobramicina NN ≤ 12 ≥15 Tetraciclina T ≤ 14 ≥19

Vancomicina V ≤ 9 ≥12

PROTOCOLO Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la práctica

desarrollada.

Page 29: Guia practica microbiologia

29

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 9

REACCION ANTIGENO – ANTICUERPO: AGLUTINACIÓN

La aglutinación es un fenómeno inmunológico producto de una reacción antígeno-anticuerpo en el

que uno de los reactantes es de naturaleza particulada, de tamaño grande. Estas partículas pueden ser

bacterias, eritrocitos, partículas de látex, bentonita, etc., y se encuentran recubiertas en forma natural

o artificial por antígenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino y mezclarse con

antisueros o antígenos específicos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac observables a simple

vista o con lentes de poco aumento.

AGLUTINACION BACTERIANA

Existen muchos métodos comúnmente empleados para demostrar la aglutinación bacteriana, uno de

los más simples es la aglutinación en lámina o prueba de Widal, que consiste en la mezcla del

antígeno con el suero del paciente en una lámina. Esta técnica ofrece un método de muestreo rápido

para análisis de rutina.

MATERIALES

Lámina para aglutinación ( láminas excavadas)

Antígeno bacteriano

Suero de paciente

Pipetas serológicas de 0.2 ml

Palitos mondadientes

PROCEDIMIENTO

1. Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocitos de una lámina de

vidrio excavada.

2. Agregar una gota de cada uno de los antígenos a cada gota de suero de un mismo paciente.

3. Mezclar uniformemente con ayuda de un mondadientes distinto para cada gota.

4. Hacer rotar suavemente la lámina por espacio de 2 a 3 minutos.

RESULTADO

La aglutinación se observa por la aparición de grumos de tamaño variable que tienden a agruparse en

la periferia de la gota. Anotar los resultados en su protocolo.

PROTOCOLO:

Realizar una aglutinación cualitativa y una cuantitativa

Page 30: Guia practica microbiologia

30

Aglutinación cuantitativa

REACTIVOS

TUBOS

1 2

3 4 5

ANTISUERO

0.08

0.04

0.02

0.01

0.005

ANTIGENO

AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO

TITULO

1/20

1/40

1/80

1/160

1/320

RESULTADO:

Título del suero: ………………………………………………………….

Esquematizar o dibujar las reacciones realizadas en práctica

Page 31: Guia practica microbiologia

31

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 10

FAGOCITOSIS

La línea celular de defensa está íntimamente asociada con la línea humoral. La fagocitosis o el

englobamiento de partículas extrañas por ciertas células es un fenómeno no específico, pero se

incrementa cuando intervienen anticuerpos específicos o complementos. Entre las células

fagocíticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrófagos (monocitos libres). A estas

sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antígenos más susceptibles a la fagocitosis se

les llama OPSONINAS.

FAGOCITOSIS “IN VITRO”

Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difíciles de realizar, en comparación con otras pruebas

serológicas, pero en ciertos sistemas es la única a ser utilizada. El antígeno y la sangre total

(conteniendo los anticuerpos, complemento y leucocitos) se incuban juntos y luego, muestras de

estas mezclan se colorean.

El índice fagocítico es el número promedio de partículas ingeridas por cada 100 Neutrófilos de la

sangre.

MATERIAL

Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o

Klebsiella

Tubos de 13x100 con 0.5 ml de EDTA

sódica al 1%

Una jeringa de 5 ml con aguja N° 20

Pipetas Pasteur con perilla de jebe

Láminas portaobjetos

Colorante Wright

Agua tamponada

Baño María a 37°C

Centrífuga

Gradilla

Microscopio con objetivo de inmersión

Aceite de cedro

PROCEDIMIENTO

1. Con la jeringa hipodérmica recolectar 5 ml de sangre venosa.

2. Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente.

3. Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente.

4. Llevar los tubos a Baño María por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos.

5. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo.

6. Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glóbulos blancos de cada

tubo.

7. Realizar los frotices y colorear con Wright:

Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos.

Añadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla.

Después de 15 minutos, lavar con agua de caño.

Secar y observar con objetivo de inmersión.

RESULTADO

Se observará la presencia de gérmenes intracelulares que han sido fagocitados.

Page 32: Guia practica microbiologia

32

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 11

REACCION DE PRECIPITACION

INTRODUCCION

Es una reacción antígeno- anticuerpo, en el que el antígeno es de naturaleza soluble. Cuando se

mezcla un antígeno soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zona de

equivalencia y visibles por lo general macroscópicamente. Las reacciones de precipitación pueden

realizarse en un gel como el Agar.

INMUNODIFUSION SIMPLE

Llamada técnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentración de Inmunoglobulinas en el

suero humano. En el que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y se deja

gelificar; luego se realizan perforaciones en el Agar donde se coloca el antígeno, procediéndose

luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observándose la formación de un halo circular

de precipitación cuyo diámetro es proporcional a la concentración antigénica.

INMUNODIFUSION DOBLE

Llamada también método de Ouchterloni, es útil para comparar antígenos, detectar anticuerpos

precipitantes, anticuerpos antinucleares y antígenos en enfermedades. En esta prueba se emplea Agar

semi-sólido en portaobjetos, en el cual se efectúan perforaciones, los cuales se llenan con los

elementos reaccionantes (antígeno- anticuerpo) y luego de 12 a 24 horas de incubación a temperatura

ambiente, observamos la aparición de bandas de precipitación.

MATERIALES

Suero positivo

Antígeno

Láminas de vidrio con Agar noble al 1%

Placas Petri

Pipetas capilares

Láminas preparadas y coloreadas

PROCEDIMIENTO

1. Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central.

2. Depositar en los orificios periféricos los antígenos a estudiar.

3. Colocar las láminas en una cámara húmeda.

RESULTADO

Observar las bandas de precipitación que se forman:

Identidad total : Las bandas de precipitación se unen.

Identidad parcial : Se observa un espolón.

No identidad : Las bandas se cruzan.

Page 33: Guia practica microbiologia

33

INMUNOELECTROFORESIS

Es útil para la separación de las proteínas en un campo eléctrico, permitiendo medir e identificar

componentes séricos: IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales.

Resulta de la combinación de la electroforesis con la inmunodifusión. En una primera fase los

antígenos son colocados en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su

movilidad en un campo eléctrico, luego de una corrida electroforética, se coloca el antisuero en una

especie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las proteínas que han migrado. Luego

de incubar, se forman bandas de precipitación frente a las Inmunoglobulinas reaccionantes.

PRACTICA N° 12: PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA

INTRODUCCION

En los últimos años se han desarrollado numerosos métodos para la detección de antígenos virales

como de anticuerpos específicos (Ig. M, Ig. G o Ig. Totales).

Se trata de procedimientos de alta sensibilidad, mucho mayor que la prueba de Hemaglutinación o la

prueba de Fijación de Complemento y similar a la prueba de Radioinmunoensayo (RIA).

Esta prueba se usa para medir la cantidad de anticuerpo presente en una muestra determinada

utilizando colorantes fluorescentes o enzimas con sustratos cromogénicos, las que producen una

reacción de color. Estas pruebas se conocen como “Análisis de Inmunoabsorbencia Ligada a

Enzimas” (enzime- linked immunosorbent assay) ó ELISA.

La ventaja de ELISA con respecto a la prueba de Inmunofluorescencia consiste en que no es

necesario un observador experimentado y en que es posible procesar un gran número de muestras

simultáneamente en forma rápida y automatizada.

PROCEDIMIENTO

Determinación de Anticuerpo en fase sólida

Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo ó perla, esto consiste en absorber la superficie de la

placa con el anticuerpo específico antiviral o anticuerpo de captura.

Luego se añade la muestra clínica, si esta contiene antígeno viral se unirá al anticuerpo de

captura

Esta unión se detectará mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas más

usadas son la peroxidasa, fosfatasa alcalina ó biotina- aviclina.

Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el

antígeno.

Añadir el sustrato de la enzima.

Observar la presencia de color.

LECTURA

El desarrollo de color puede observarse visualmente o de preferencia con un colorímetro o un

espectrofotómetro.

A mayor cantidad de antígeno presente en la muestra, más intenso será el color observado.

Page 34: Guia practica microbiologia

34

ESQUEMA DE LA PRUEBA DE ELISA

(Ensayo Inmunoenzimático para la detección de Anticuerpos contra los virus de Inmunodeficiencia humana

HIV-1 grupo O y HIV-2)

SUSTRATO A

20 ul. Cromogénico

PLACAS CON

SUEROS

CONJUGADO

(Ag-Ac color celeste)

SOLUCION

GLICO-PROTEINA + OBTENIDOS + (Peroxidasa con Ig G + SUSTRATO B + DE

DEL VHI

DE PACIENTE

Antihumana) 5ul C/ pozo

Buffer Peróxido

PARADA

Hidrogeno 100 ul

CONTROL + INCUBAR INCUBAR

30 min a 30 min a

37° 37°

CONTROL +

Absorber

CONTROL -

LAVAR LAVAR

twin salino

twin salino

CONTROL - 1/10 1/10

(5 veces)

CONTROL -

PACIENTE

PACIENTE

SECAR SECAR

PACIENTE la placa la placa

(tomado de Wiener lab.)

Page 35: Guia practica microbiologia

35

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA N° 13

PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS

INTRODUCCION

Antígeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales, induce

la formación de anticuerpos o la aparición de fenómenos de hipersensibilidad. "In vitro" y en

presencia de factores accesorios, pueden reaccionar con el anticuerpo específico, dando lugar a

fenómenos perceptibles.

Los Antígenos más comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos,

hematíes, suero, etc.

Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antígeno en dosis adecuadas y

generalmente progresivas con las siguientes finalidades.

1. Inducir en el hombre o en los animales, la formación de anticuerpos que los protejan contra

determinados procesos infecciosos. Este método conocido como vacunación confiere inmunidad

adquirida activa.

2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales serán empleados en:

a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, tétanos, etc.,

en las cuales se administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente una

inmunidad adquirida pasiva.

B) La tipificación de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas de

clasificación, como el de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para las

Shigellas y el de Kauffmann-Knipschildt- Vahlne para Escherichia coli.

I. PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS SOMATICOS Y FLAGELARES

A PARTIR DE CULTIVOS EN MEDIO SOLIDO.

A. MATERIAL

Cultivo bacteriano en medio sólido y en desarrollo confluente

Cultivo bacteriano en medio líquido (caldo nutritivo)

Pipetas graduadas estériles de 5 cc.

Suero fisiológico estéril, repartido en frascos de 100 cc.

Embudos y gasa, estériles para filtrar

Acido fénico concentrado en tubos de 13x100 ml.

Formol concentrado, en tubos de 13x100 ml.

Pipetas de Pasteur, estériles

Escala de MacFarland (tubo Nº 3)

Pipetas graduadas de 1 ml.

Tubos vacíos estériles de 16x150 ml.

Page 36: Guia practica microbiologia

36

Algodón y Alcohol yodado

Agar nutritivo en placas y tubos

B. PROCEDIMIENTO

1. Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiológico estéril a los cultivos

bacterianos presentados en medio sólido

2. Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar Agar

3. Filtrar a través de gasa estéril

4. Separar la suspensión en cantidades iguales en dos tubos de 13x100

5. Para preparar el Antígeno somático "O", medir la cantidad de suspensión bacteriana

de uno de los tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar una

concentración de 0.5%.

Se puede así mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antígeno a la

ebullición durante dos horas, o tratándolo con alcohol absoluto.

6. Para preparar el Antígeno flagelar "H", inactivar las fracciones somáticas en el otro

tubo de suspensión bacteriana, agregando formol puro hasta alcanzar una concentración

del 0.5%

7. Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x108

gérmenes por cc. para lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. de

suero fisiológico, gotas de cada uno de los antígenos concentrados hasta alcanzar una

turbidez similar al tubo Nº3 de la Escala de MacFarland.

Este es un Método turbidimétrico de cálculo bacteriano, que consiste en diluir el antígeno y

apreciar la turbidez obtenida comparándola con la de los tubos patrones de un nefelómetro o

determinándola con exactitud mediante un Espectrofotómetro.

El Nefelómetro más conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera:

Preparar una solución de Cloruro de Bario al 1%

Otra de Ácido sulfúrico al 1%.

Colocar una serie de 10 tubos vacíos y estériles

Agregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:

TUBO N°

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Cl2Ba 1%

0.1 cc.

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

H2SO4 1%

9.9 cc.

9.8

9.7

9.6

9.5

9.4

9.3

9.2

9.1

9.0

Bacterias

por cc.

3.0 x

108

6.0 x

108

9.0 x

108

1.2 x

109

1.5 x

109

1.8 x

109

2.1 x

109

2.4 x

109

2.7

x

109

3.0

x

109

Page 37: Guia practica microbiologia

37

La unión de ambos reactivos químicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que al

homogenizarse da una turbidez que es más intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de bario

empleado. A cada tubo corresponde una concentración de gérmenes determinada, de acuerdo a lo

señalado en el cuadro.

C. CONTROL DE ESTERILIDAD

Sembrar cada uno de los antígenos preparados, en caldo nutritivo y/o Agar sangre, con la

finalidad de controlar su esterilidad

Realizar la observación a las 18 ó 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano.

Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la práctica.

D. INOCULACION

1. Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc., 1.0cc.,

1.5cc., 2.0cc., 2.5cc., hasta 3.0cc., del antígeno, con intervalo de 4 a 5 días.

2. Realizar la sangría después de 4 días de la última inyección.

E. DESARROLLAR UN PROTOCOLO DE INOCULACIÓN (DEMOSTRACION)

Page 38: Guia practica microbiologia

38

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 14

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:

GENERO STAPHYLOCOCCUS

INTRODUCCION

Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organismos redondos u ovales,

agrupados generalmente en forma de racimos, inmóviles, no esporulados, y Grampositivos en los

cultivos jóvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como

patógeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde forúnculos, abscesos,

intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus, S.

epidermidis y S. saprophyticus, sólo dos tienen importancia médica. Sólo la especie patógena S.

aureus produce una enzima llamada coagulasa.

MATERIALES

Placas Petri con Agar hipertónico de Chapman (MH) o Manitol salado

Placas Petri con Agar sangre (AS)

Tubos con Caldo plasma

Láminas portaobjetos

Set de colorantes para Gram

Asa de platino en aro

Reactivo Catalasa

PROCEDIMIENTO:

1. Estudiar la bacteria sembrada en las placas con Agar hipertónico de Chapman y Agar sangre,

por el método de dispersión-agotamiento y con 24- 48 horas de incubación a 37°C

2. Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram.

3. Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylocococcus, estudiando las

características de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman

(tamaño, forma, pigmento, hemolisis, etc.)

4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertónico de Chapman, tomar una asada de una colonia

de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37ºC (Prueba de la

coagulasa)

5. Realizar la prueba de la Catalasa.

6. Agar hipertonico de Chapman o manitol salado contiene: Manita, Cloruro de sodio al 6.5% y

como indicador de pH el rojo de fenol

7. Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novoviacina

Page 39: Guia practica microbiologia

39

RESULTADOS:

1. Características macroscópicas de la muestra:

2. Resultado de la coloración realizada

3. Resultado de la reacción de la Coagulasa, en caldo plasma observar que sólo S. aureus coagula

el plasma.

4. Resultado de la reacción de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparición de

burbujas en las tres especies.

5. Resultado en Agar hipertónico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) de

S. aureus y S. saprofiticus; y color rosado (manita negativa) en S .epidermidis.

6. Observar la presencia de hemólisis en las placas con Agar sangre

7. La novoviacina permite diferenciar S. epidermidis de S. saprofiticus. S. epidermidis es sensible

y S. saprofiticus resistente.

PROTOCOLO:

Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamaño de la

colonia, forma que presenta, pigmento, hemólisis, y otras características que crea conveniente.

Complete el cuadro con lo realizado durante la práctica.

CEPAS

BACTERIANAS

TRABAJADAS

MH

o

Manitol

salado

AS

(Agar

sangre)

COAGULASA

CATALASA

GRAM

Característica

morfológica

Page 40: Guia practica microbiologia

40

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 15

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:

GENERO STREPTOCOCCUS

INTRODUCCION

El género Streptococcus comprende muchas especies agrupadas según la clasificación de Lancefield

en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej. Enterococos); G (S. canis);

H (S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae (no pertenece a ningún grupo). Con

la coloración de Gram se comportan como positivos adoptando formas de cadenas. Algunos son

patógenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora normal o transitoria del

cuerpo humano y otros son saprofitos.

Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que permite diferenciar

algunas especies en base a la hemólisis producida. La hemolisis tipo es incompleta, los glóbulos

rojos que rodean a la colonia son parcialmente dañados pero no lisados como sucede en la hemolisis

tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un derivado del tipo

de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina. El grupo de estreptococos

alfa hemolíticos se denominan S. viridans. La mayoría de Streptococcus pueden desarrollar en

presencia o ausencia de oxígeno. Diversas pruebas bioquímicas permiten la diferenciación de las

especies de Streptococcus.

MATERIAL

Cultivo de Streptococcus en medio de

caldo BHI

Placas con Agar sangre de carnero

Torunda estéril y bajalengua

Tubos con Thioglicolato

Tubos con caldo Inulina

Discos de Bacitracina

Discos de Optochin

Solución de Desoxicolato al 2%

Tubo con ClNa al 6.5%

Láminas portaobjetos

Set de colorantes de Gram- Kopeloff

Asas de Kolle, pinzas

Microscopio, aceite de inmersión.

PROCEDIMIENTO

1. Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento produce

turbidez o sedimento.

2. Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el método de dispersión y

agotamiento e incubado a 37°C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la lámina portaobjetos y

colorear por Gram.

Page 41: Guia practica microbiologia

41

3. Estudiar el comportamiento de las especies de Streptococcus, frente a la Bacitracina y el disco

de Optochin,

4. Sembrar las cepas bacterianas en el medio de Thioglicolato.

5. Sembrar la cepa en el caldo de Inulina.

6. Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5%

7. Realizar la prueba de la catalasa

8. Realizar la prueba de Desoxicolato de sodio, permite observar la capacidad de ciertas bacterias

de lisarse en presencia de sales biliares

LECTURA

1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son beta- hemolíticos; S. viridans y S. pneumoniae

son alfa- hemolíticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram.

2. Respecto a la sensibilidad a la Bacitracina y Optochina: S. pyogenes es sensible a la Bacitracina

y S pneumoniae es sensible a la Optochina

3. Agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias en la placa de

Agar sangre e incubar a 35°C durante 30 minutos. En una reacción positiva se observa que las

colonias son lisadas (desaparecen)

4. Observar que solo S. pneumoniae metaboliza la Inulina.

5. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. Este medio es usado para determinar el

efecto del O2 sobre las bacterias (Aerobio, Anaerobio, Facultativo), contiene Agar 0.075% y

ácido tioglicolato que actúa como agente reductor disminuyendo aun más el potencial de oxido-

reducción del medio.

6. En la solución de ClNa al 6.5% , observar que sólo desarrolla Enterococo (Grupo D)

7. Todas las especies del género Estreptococo son catalasa negativa

PROTOCOLO

Realizar un protocolo de trabajo de la práctica realizada

IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE STREPTOCOCOS

ORGANISMO

SENSIBILIDAD

CAMP

Hidrólisis

De

Metabo

lismo

de la

Inulina

Desarro

llo en

NaCl

6.5%

Lisis por Bilis

Bacitra

cina

Opto

chin

Hipu

rato

Escu

lina

Desoxi

colato Sodio

- hemolíticos

GRUPO A

S. pyogenes

S

R

N

N

N

N

N

N

GRUPO B

S. agalactiae

R*

R

P

P

N

N

P*

N

GRUPO C, F, G

R

R

N

N

N

N

N

N

- hemolíticos

GRUPO Viridans

R*

R

N

N

N*

N

N

N

S. pneumoniae

R

S

N

N

N

P

N

P*

S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reacción variable

Page 42: Guia practica microbiologia

42

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 16

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO

NEISSERIA

INTRODUCCION

Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan característicamente en pares, con los

lados adyacentes aplanados, simulando “granos de café”. Comprende varias especies, entre éstas N.

gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa en el hombre. En

muestras clínicas del tracto urogenital u otras, se tiñen adicionalmente con el colorante azul de

metileno, observándose las Neisseria intra y extracelularmente.

Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate, que

le proporciona una rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.

La mayoría de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una

tensión de CO2 entre 5 a 10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37°C y un pH de 7.2 a

7.6.

Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros

microorganismos morfológicamente similares.

La diferenciación bioquímica se realiza por pruebas de utilización de hidratos de carbono: Glucosa,

maltosa, sacarosa y lactosa.

El diagnóstico de gonorrea requiere una estrecha cooperación entre el médico y el laboratorio.

Se debe considerar los siguientes aspectos:

a) Recolección correcta de la muestra.

b) Selección del recipiente apropiado para el transporte y rápido envío al laboratorio.

c) Selección del medio de cultivo apropiado

d) Aislamiento e identificación de la bacteria en el laboratorio.

MATERIALES

Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria

Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria

Lámina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram

Reactivo de Citocromo- oxidasa

Reactivo de catalasa

Solución fisiológica al 0.85%

Láminas portaobjetos

Set de coloración de Gram

Page 43: Guia practica microbiologia

43

Colorante de Azul de metileno

Microscopio

Asas de siembra en aro y punta

Solución de alcohol yodado

Algodón y Xilol.

METODOLOGIA

1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeñas, circulares de

bordes continuos, blanco- grisáceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas si corresponden a

N. gonorrhoeae y si es N. meningitidis colonias pequeñas de borde entero, circulares,

translúcidas o ligeramente opacas.

2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3 minutos el

cambio de color del rosado al marrón o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva.

3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la

lámina control.

4. Realizar un frotis de la muestra clínica de secreción endocervical y colorearla con el azul de

metileno.

PROTOCOLO

MEDIO DE CULTIVO

MUESTRA

COLONIAS TAMAÑO GRAM AZUL DE

METILENO

AGAR THAYER MARTIN

AGAR CHOCOLATE

SECRECION

ENDOCERVICAL

PRUEBAS

BIOQUIMICAS

OXIDASA CATALASA

Page 44: Guia practica microbiologia

44

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 17

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS:

GENERO BACILLUS

INTRODUCCION

El género Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas y que

pueden sobrevivir en el ambiente por muchos años. Algunas especies causan enfermedades en el

hombre y los animales como el B. anthracis causante de la enfermedad conocida como

"carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B. mycoides son saprofitas y se

encuentran en el suelo, agua y aire.

La especie patógena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patológicos se presenta

como un bacilo rectilíneo, Gram positivo, grueso, inmóvil y capsulado. En los cultivos, las colonias

son grandes, mates, rugosas con bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se agrupan en

largas cadenas, sin cápsula y conforme el cultivo envejece forman esporas.

MATERIALES

Placas Petri con Agar nutritivo

Placas Petri con Agar sangre

Tubos con Caldo nutritivo

Tubos con Agar semisólido

Tubos con gelatina

Láminas para frotices

Set de coloración de Gram

Set de coloración de Hiss para cápsula

Set de coloración de Wirtz Conklin para esporas

Asa de Kolle

PROCEDIMIENTO

1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina.

2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.

COLORACION HISS (PARA CAPSULA)

1) Preparar un frotis

2) Cubrir con Fucsina básica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos

3) Lavar con solución acuosa de Sulfato de cobre al 20%.

4) Lavar con agua corriente y secar

5) Observar al microscopio con lente de inmersión

Page 45: Guia practica microbiologia

45

COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS)

1) Preparar un frotis

2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos

(adicionar colorante cada vez que falte)

3) Lavar con agua corriente

4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto

5) Lavar y secar

6) Observar al microscopio con lente de inmersión

LECTURA:

EN LOS CULTIVOS

En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisáceo, no hemolítica en las especies patógenas

y ß- hemolíticas en las especies saprofitas.

En Agar nutritivo: Se observan bacilos endoesporulados

En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.

En Agar semisólido: Se observa un crecimiento en forma de pino invertido

En Gelatina: sólo las especies saprofitas producen hidrólisis.

EN LAS LAMINAS COLOREADAS

Gram : Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el

centro del bacilo.

Hiss : El cuerpo bacteriano se observa de color púrpura y la cápsula de color claro o incoloro.

Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde.

RESULTADOS

A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:

GENERO BACILLUS ESPECIE PATÓGENA

ESPECIE SAPROFITA

Caldo nutritivo

Agar nutritivo

Agar sangre

Agar semisólido

Hemolisis

Hidrólisis de la gelatina

Prueba de la Catalasa

Fermentación salicina

Movilidad

Page 46: Guia practica microbiologia

46

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 18

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO

LISTERIA

INTRODUCCION

El género Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerófilos, no esporulados, móviles y

presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V ó

de Y. Esta ampliamente distribuido en la naturaleza, en los vegetales en descomposición, en el suelo,

en las heces de los portadores sanos animales y hombres. La especie patógena es Listeria

monocytogenes y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual compromete los

ganglios linfáticos, produce síntomas neurológicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre.

El microorganismo se puede aislar de la sangre, líquido cefalorraquídeo y de las heces, desarrolla

bien en medios de cultivo comunes.

MATERIAL

Tubos con Caldo nutritivo

Tubos con medios semisólidos (Motilidad)

Placas Petri con Agar sangre

Placas Petri con Agar nutritivo

Tubos de 13x100 con:

Agar urea de Christensen

Citrato de Simmons

Caldo rojo de fenol con glucosa

Caldo rojo de fenol con sacarosa

Caldo rojo de fenol con lactosa

Caldo rojo de fenol con manita

Caldo rojo de fenol con salicina

Caldo esculina

Caldo:

MR-

VP

PROCEDIMIENTO

1. Hacer frotices a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con Gram.

2. Preparar una lámina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, entre lámina y

laminilla.

Page 47: Guia practica microbiologia

47

3. Sembrar en el Tubo con medio semisólido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los

diferentes medios diferenciales

4. Dejar en incubación por 24 a 48 horas a 37ºC.

LECTURA

FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos.

LAMINAS EN FRESCO : Se observará la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40

aumentos.

EN CALDO NUTRITIVO: Se observará una turbidez tenue y homogénea.

EN AGAR SANGRE : Se observará colonias pequeñas con hemólisis tipo Beta.

EN MEDIOS DIFERENCIALES : Observar

MOVILIDAD

+

GLUCOSA

+

MR

+

HEMOLISINA

+

SACAROSA

-

VP

+

CATALASA

+

LACTOSA

-

OXIDASA

-

MANITA

-

UREA

-

SALICINA

+

CITRATO

-

ESCULINA

+

Page 48: Guia practica microbiologia

48

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 19

"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION

BUCOFARINGEA”

INTRODUCCION

La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco después del nacimiento, y cambia de forma

continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento dependen de la

edad, nutrición y medio ambiente del individuo, por lo que es difícil determinar la flora normal de

cada individuo ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados; ejemplo, los lactantes

alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto gastrointestinal, en

los pacientes que están recibiendo grandes dosis de antibióticos presentan un gran desarrollo de

levaduras.

La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos,

Estafilococos, difteroides, y cocos Gram negativos.

La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran número de bacterias

anaerobias.

La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolíticos y diplococos Gram

negativos, en ella puede poblarse un gran numero de especies patógenas como Streptococcus

pneumoniae, Neisseria meningitidis, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus

influenzae.

MATERIALES

Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)

Agar nutritivo en placas

Agar sangre en placas

Agar chocolate en placas

Medio hipertónico de Chapman en placas

Agar Mac Conkey en placas

Agar Sabouraud en tubos

Torundas estériles (2 x tubo)

Baja lengua

Asa de Kolle en aro

Laminas portaobjetos

Set de colorante Gram

Varillas para coloración

Page 49: Guia practica microbiologia

49

PROCEDIMIENTO

A. PRIMER DIA

1. Con ayuda de torundas estériles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe.

2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo.

3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37ºC

B. SEGUNDO DIA

LECTURA

Con la ayuda del Profesor, el alumno procederá a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los

medios de cultivos.

IDENTIFICACION

Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioquímico correspondiente y pruebas de

patogenicidad si se requiere.

Caldo plasma en tubo

- Disco de Bacitracina

- Disco de Optochin

- Reactivo de Citocromo- oxidasa

- Reactivo de catalasa

PROTOCOLO

El alumno realizará un cuadro estadístico con los resultados obtenidos.

Page 50: Guia practica microbiologia

50

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 20

AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOL-

RESISTENTES

GENERO MYCOBACTERIUM.

INTRODUCCION

Este género esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfología bacilar,

poseen un alto contenido de lípidos complejos en su estructura química y se desarrollan lentamente

en los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los componentes nutritivos.

Existen especies patógenas para el hombre y los animales, así como especies saprofitas en el aire, en

el agua y en la tierra.

Las especies patógenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad hominis, que

puede infectar cualquier lugar del organismo, siendo la localización pulmonar, renal y digestiva los

mas frecuentes y el esputo es el espécimen clínico más común para establecer el diagnóstico

específico a través de la baciloscopia.

Mycobacterium leprae produce la lepra ó enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis,

Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor frecuencia,

también, son patógenos.

MATERIALES

Un frasco de boca ancha con muestra de esputo positivo

Láminas portaobjetos nuevas y desengrasadas

Láminas con extensiones de M. tuberculosis var. Hominis

Láminas con extensión de otros tipos de Micobacterias

Set de colorante de Gram

Set de colorante de Ziehl- Neelsen (col. A. A. R.)

Cepas patrones sembradas en medio Lownstein Jensen + verde de malaquita

PROCEDIMIENTO

1. Observar los caracteres macroscópicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento.

2. Tomar una partícula mucopurulenta del esputo y hacer una extensión homogénea sobre la

lámina portaobjetos nueva.

3. Fijar la preparación.

4. Realizar una coloración con Gram y otra con Ziehl- Neelsen

Page 51: Guia practica microbiologia

51

El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, líquido cefalorraquídeo, líquido

pleural, etc.

LECTURA

Observar como los gérmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloración de Ziehl- Neelsen

porque no son ácidos alcohol resistente.

El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares rojos en

un fondo azul.

EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO

Enfocar con el objetivo de 100x la lámina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la

longitud de los 2/3 del extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los

resultados, según el siguiente cuadro:

Negativo : No se observan bacilos en 100 campos.

Positivo (+) : Menor de 1 bacilo por campo, en 100 campos.

Positivo (++) : De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos.

Positivo (+++) : Más de 10 bacilos por campo, en 25 campos.

La lectura cuantitativa permite controlar la evolución del paciente que esta en tratamiento y permite

detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento.

TIPIFICACIÓN DE MICOBACTERIAS

Se investiga la velocidad de desarrollo y la producción de pigmento, permitiendo clasificarlos en

grupos.

I. Cepas que desarrollan en 8 ó más días. Llamadas de desarrollo lento.

GRUPO I: Pigmentan por estímulo de la luz. Son fotocromógenas.

Ejemplo: M. kansasi , M. simiae

GRUPO II: Pigmentan sin necesidad de estímulo luminoso. Son escotocromógenas. Ejemplo: M.

scrofulaceum

GRUPO III: No pigmentan espontáneamente, ni por estímulo luminoso.

Son no cromógenas. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano y

M. tuberculosis var. Bovina

II. Cepas que desarrollan en 7 días o menos.

GRUPO IV: Pueden pigmentar o no pigmentar. Ejemplo: M. fortuita

PROTOCOLO DE TRABAJO:

Realizar esquemas de lo realizado y observado en la práctica correspondiente.

Page 52: Guia practica microbiologia

52

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 21

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO

CORYNEBACTERIUM

INTRODUCCION

El género Corynebacterium comprende un grupo heterogéneo de bacterias en el cual se incluyen

especies comensales y patógenos a animales, plantas y bacterias de suelo.

Las características comunes del género son:

1) Bacilos pleomórficos Grampositivos, No forman esporas

2) Las células se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su disposición en

“letras chinas”,

3) Aerobios o anaerobios facultativos,

4) Catalasa positivos,

5) Citocromo oxidasa negativo.

La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae que causa la difteria, infección aguda, contagiosa y

febril, caracterizada por inflamación local y formación de una seudomembrana en la orofaringe,

además del daño al corazón y nervios periféricos por acción de una exotoxina (toxina difterica). Es

propagada por portadores sanos y convalecientes, su puerta de entrada es las vías respiratorias

superiores.

El género se divide en tres grupos:

Grupo I : Corinebacterias parásitas y patógenas para el hombre y animales;

Grupo II : Corinebacterias fitopatógenas, y;

Grupo III : Corinebacterias no patógenas.

Algunas de las especies más frecuentemente halladas en el laboratorio clínico son: C.diphtheriae,

C.pyogenes, C.ulcerus, C.haemolyticus, C.xerosis, C.renale, C.equi, C.ovis, C.bovis, C.ovis y

C.hoffmannii (pseudodiphthericum).

La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enérgicamente sobre cualquier lesión

inflamatoria, además del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y enviar

inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer o Agar telurito.

MATERIAL

Cepa de Corynebacterium diphtheriae en

caldo enriquecido

Placa con Agar sangre

Placa con Agar chocolate telurito de

potasio

Tubo de 13x100 con medio Pai en plano

inclinado

Set de colorante de Gram

Set de colorante de Albert

Tubos con Agar Urea Christensen en

plano inclinado

Caldo Rojo de fenol + Glucosa

Caldo Rojo de fenol + Maltosa

Asas de siembra

Láminas portaobjetos

Aceite de inmersión

Microscopio

Page 53: Guia practica microbiologia

53

PROCEDIMIENTO

1. Tomar el inóculo de la cepa de C.diphtheriae y realizar la siembra por el método de

dispersión agotamiento en las placas de Agar sangre y Agar chocolate, y en el medio Pai por

estrías. Incubar por 48 horas a 37°C.

2. Realizar el frotis del cultivo en caldo enriquecido y colorear por Gram.

3. Realizar el frotis del cultivo y colorear por el método de Albert.

4. Bioquímica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, en el caldo

Rojo de fenol + Glucosa, caldo Rojo de fenol + Maltosa.

COLORACION DE ALBERT

Los gránulos metacromáticos conocidos también como de volutina, son material de reserva de

polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se tiñen

de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy débilmente.

PROCEDIMIENTO

1. Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave.

2. Cubrir con la Solución A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, ácido acético, alcohol

etílico, agua destilada) por 3 a 5 minutos.

3. Lavar con agua corriente, evitar el lavado directo del frotis.

4. Cubrir con la Solución B de Albert (yodo metálico, yoduro de potasio, agua destilada) por 1

minuto.

5. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, objetivo de 100X

LECTURA

En la coloración Gram- Kopeloff observar los bacilos rectos o ligeramente curvados

ensanchados en sus extremos como mazos, pleomórficos (en forma de pera, huso) o

dispuestos paralelamente, o en forma de “letras chinas”.

En la coloración Albert observar la bacteria color verde y los gránulos de color azul oscuro

En el cultivo en Agar chocolate telurito de potasio (medio selectivo inhibidor de Gram

negativos) observar los tres tipos de bacilos diftéricos:

a) Tipo gravis: colonias grandes grisáceas.

b) Tipo mitis: colonias medianas, circulares, lisas totalmente negras.

c) Tipo intermedius: colonias pequeñas, lisas o rugosas con centro negro.

En el cultivo en Agar sangre observar el crecimiento de colonias pequeñas, convexas, con

bordes enteros, color crema o blanco grisáceas, sólo las colonias Tipo mitis producen beta

hemolisis.

BIOQUIMICA DE Corynebacterium diphtheriae

Hemolisis: Beta (sólo el Tipo mitis) Gelatina : Negativo

Catalasa : Positivo Sacarosa : Negativo

Movilidad: Negativa Glucosa : Negativo

Urea* : Negativa Maltosa : Positivo

Nitrato : Positivo Lactosa : Negativo

Page 54: Guia practica microbiologia

54

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 22

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS:

GENERO PSEUDOMONAS

INTRODUCCION

La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son móviles con

flagelos polares monotricos y multitricos, poseen cápsula, no forman esporas, no son exigentes

para su desarrollo “In Vitro”.

Pseudomona aeruginosa es la especie más frecuentemente asociada con enfermedad humana,

principalmente quemaduras severas, pero también se aíslan de orina, sangre, lavados bronquiales,

esputo y tracto genital femenino. En pacientes comprometidos pueden causar infecciones con

riesgo de vida fatales.

La detección del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnóstica de P.

aeruginosa, la mayoría de los aislamientos producen también el pigmento fluoresceina y

desarrollan bien a 42°C.

MATERIAL

Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo.

Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150

Agar nutritivo en Placa Petri

Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150

Agar semi-sólido en tubo de 13 x 100

Medio TSI

Reactivo de Oxidasa

Frasco con cloroformo

Set de colorantes Gram

Láminas portaobjetos

PROCEDIMIENTO

1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el método de

Gram.

2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las técnicas

conocidas.

3. Incubar a 37°C por 24- 48 horas.

Page 55: Guia practica microbiologia

55

RESULTADOS

COLORACION DE GRAM: Bacilos pequeños, Gram negativos.

CALDO NUTRITIVO: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento de

color verdoso y un olor característico.

AGAR MAC CONKEY: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa.

MEDIO TSI: No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este género no

fermentan los carbohidratos [utilizan los carbohidratos sólo por vía oxidativa en el medio

de oxidación- fermentación (OF)].

AGAR NUTRITIVO: Describir la colonia, observar la difusión del pigmento en el

Agar, y realizar la prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.

CALDO TRIPTICASE: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la

piocianina.

PROTOCOLO

CARACTERÍSTICAS

MICROORGANISMOS

Pseudomona aeruginosa

Crecimiento en Mac Conkey

Reacciones en TSI

Difusión de Pigmento en Agar nutritivo

Prueba de Citocromo- oxidasa

Solubilidad Cloroformo- piocianina

Crecimiento Agar nutritivo

Agar semisólido

Page 56: Guia practica microbiologia

56

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 23

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO

BRUCELLA

HEMOCULTIVO Y SEROLOGIA

INTRODUCCION

Son microorganismos pequeños, usualmente cocobacilares, inmóviles no formadores de esporas.

Son Gram negativos y necesitan una tinción prolongada con la fucsina básica de por lo menos 2

minutos en lugar de los 30- 60 segundos de tinción convencional de Gram.

La enfermedad conocida como Brucelosis o “Fiebre Malta” es causada por las siguientes especies

Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus.

Su multiplicación y desarrollo “in vitro” es muy lento, necesitan de medios especiales como el Agar

Brucella o Caldo tripticasa soya.

Para la identificación de especies se utiliza una serie bioquímica para observar la producción de H2S,

hidrólisis de la urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 %, Thionina 0.002 % y

requerimiento de CO2.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, líquido cefalorraquídeo, médula ósea o biopsias

de ganglios linfáticos e hígado.

I: HEMOCULTIVO

Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (sólido + líquido) de Ruiz- Castañeda. La

incubación debe hacerse en una atmósfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37°C. Las colonias aparecen

entre el 4 al 5 día, pero los cultivos deben ser incubados hasta los 30 días antes de ser descartado

como negativo.

II: SEROLOGIA

Para el diagnóstico serológico se utilizan las técnicas de:

1. Aglutinación rápida en placa

2. Aglutinación lenta en tubo (Wright)

3. Prueba de aglutinación del 2- mercaptoethanol (2- ME)

4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina)

5. ELISA

Page 57: Guia practica microbiologia

57

MATERIAL

Tubo con cepa de Brucella

Frascos con medio de Ruiz- Castañeda

Muestra de sangre total de paciente

Agar fucsina en placa

Agar Thionina en placa

Suero positivo y suero control negativo

Antígeno estandarizado de Brucella

Láminas excavadas

Pipetas de 0.2 ml

Palito mondadientes

Láminas portaobjetos

Set de coloración de Gram

PROCEDIMIENTO

I: HEMOCULTIVO

Agregar 5 ml. de sangre de paciente sospechoso a Brucelosis en el medio de Ruiz- Castañeda, e

incubar por 4 a 5 días a 37°C. Se debe esperar hasta 30 días para descartar el cultivo.

COLORACION

Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el método de Gram,

siguiendo las recomendaciones señaladas anteriormente.

II: SEROLOGIA

1. Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer círculo de la 2da. Línea de

la lámina excavada.

2. Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lámina excavada, las siguientes cantidades de suero

positivo: 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente.

3. A cada alícuota de suero añadir una gota de antígeno, equivalente a 0.03 ml.

4. Mezclar cuidadosamente por rotación, con ayuda de un palito mondadientes empezando por el

suero negativo y la dilución más alta 1:400

5. Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lámina durante un minuto y dejar en

reposo por 4 minutos más.

6. A los 8 minutos no más, observar la presencia de grumos (aglutinación) que indica una reacción

positiva antígeno- anticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.

Page 58: Guia practica microbiologia

58

INTERPRETACION

SUERO ANTIGENO DILUCION / TITULO

0.08 + 0.03 25 ó +

0.04 + 0.03 50 ó ++

0.02 + 0.03 100 ó +++

0.01 + 0.03 200 ó ++++

0.005 + 0.03 400 ó +++++

DIFERENCIACION BIOQUIMICA

ESPECIES

DE

BRUCELLA

PRUEBAS DE DIFERENCIACION

Huésped

Preferido

Necesidad

CO2 (5%)

Producción

de H2S

Hidrólisis

de Urea

Crecimiento en

Fucsina

0.002 %

Thionina

0.002 %

B.abortus

Bovino

+

++

Débil

+

-

B.melitensis

Cabra, oveja

-

-

Débil

+

+

B.suis

Cerdos

-

+

Fuerte

-

+

B.canis

Perros

-

-

Fuerte

-

+

Page 59: Guia practica microbiologia

59

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 24

AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: COPROCULTIVO

INTRODUCCION

En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichia

coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunos de

los cuales son patógenos para el

Hombre y causantes de enfermedades.

El diagnóstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante el

COPROCULTIVO, es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para el

aislamiento del agente patógeno bacteriano.

La mayoría de las Enterobacterias tienen una acción invasiva penetrando en la mucosa intestinal

produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisión es generalmente por ingesta de

alimentos contaminados con heces humanas.

Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en

determinadas condiciones patógena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite

causar infecciones en el tracto gastrointestinal así como en el sistema urinario. La E. coli

enterotoxigénico (ECET) es la causa común de la "Diarrea del viajero" y produce en el organismo

enterotoxinas potentes y poseen factores de colonización; la E.coli enteroinvasiva (ECEI) y la

E.coli enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.

Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cápsula producen infecciones

oportunistas en el huésped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y

urinario son los lugares de infección más comunes, es difícil distinguir entre colonización e

infección y son productoras de endotoxinas.

Salmonella typhi, bacilo Gram negativo móvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre y

causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la

Salmonella paratyhi A, B ó C.

El género Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmóviles, causan la

Disentería bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y

fiebre. La especie S. dysenteriae es la mas virulenta.

El género Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, móviles con flagelos

peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de infecciones

urinarias, heridas crónicas adquiridas generalmente en el hospital.

Page 60: Guia practica microbiologia

60

MATERIALES

Muestra de heces.

Placas Petri con Agar Mac Conkey

Placas Petri con Agar SS

Placas con Agar Manitol

Tubos con Agar Sabouraud

Tubos con medio TSI, LIA

Tubos con caldo peptonado

Tubos con Citrato de Simmons

Tubos con caldo MR-VP

Frasco con Lugol

Reactivo para Citocromo-oxidasa

Reactivo de Kovacks (prueba de indol)

Reactivo para Rojo de metilo

Láminas portaobjeto y cubreobjeto

Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidróxido de Potasio al 40%)

Juego de colorantes para Gram

Material básico para laboratorio

PROCEDIMIENTO

1. Realizar un estudio macroscópico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de

sangre, moco, etc.)

2. Realizar un estudio microscópico de la muestra con Lugol y suero fisiológico y Gram.

3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:

a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de

solución salina.

b) Tomar una asada de la suspensión de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey,

Agar SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37°C por 24 horas.

c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciación bioquímica: TSI, LIA,

Caldo peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37°C por 24 horas.

LECTURA

EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la

Lactosa y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.

EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en

las colonias que son SH2.

EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD, observar el desarrollo de colonias y anotar las

características.

EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma el

medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.

EN LIA (Agar, Lisina, Hierro ), observar si hay descarboxilación y desaminación de la Lisina y

producción de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilación de la lisina se eleva el pH del medio

debido a la producción de aminas, pH= 5.2 ( color amarillo), pH 6.8 (color púrpura) [indicador

púrpura de bromocresol]

Page 61: Guia practica microbiologia

61

EN CALDO PEPTONADO, observar la producción de Indol por las bacterias, al agregar el

reactivo de Kovac tornándose rojo grosella.

EN CITRATO DE SIMMONS, se tornará de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como

fuente de energía y alcaliniza el medio. (Formación de Hidróxido de amonio). Positivo (color azul),

negativo (color verde).

EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le añade el Rojo de metilo. Cuando hay

producción de ácidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color

amarillo).

EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma después de 15 minutos cuando se le

añade alfa-naftol y KOH por la producción de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo), negativo

(color amarillo).

PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del reactivo oxidasa sobre la

colonia y observar a los 5 minutos un intenso color azul si son productoras de la enzima en caso

contrario no habrá ningún cambio de color

COLORACION DE GRAM observar los bacilos Gram negativos.

CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay

movilidad utilizando objetivos de 40 aumentos

DIFERENCIACION BIOQUÍMICA

Especies

TSI

(glucosa, sacarosa

lactosa,SH2 )

LIA

Lisina

Cp

Indol

Ct

Citrat

o

MR-VP

Oxidasa

Ac.

Sup

Ac.

Fon

Ga

s

SH2

Escherichia coli

+

+

+

-

V

+

-

+ -

-

Klebsiella

+

+

+

-

-

V

+

- +

-

Salmonella typhi

-

+

-

+

+

-

+

+ -

-

Shigella

-

+

-

-

-

V

-

- -

-

Proteus

-

+

-

V

-

-

V

+ -

-

Page 62: Guia practica microbiologia

62

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 25

ESTUDIO E IDENTIFICACION DE VIBRIO CHOLERAE

INTRODUCCION

Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los

géneros: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. El género Vibrio comprende muchas especies siendo las

de importancia médica Vibrio cholerae, causante del cólera epidémico; V. parahaemolyticus,

causante de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de bacteriemia, infecciones en heridas cutáneas,

celulitis; y V. alginoliticus, responsable de otitis externa, infección de heridas cutáneas, tejidos

blandos.

Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en

parejas o en cadenas que semejan espirilos, muy móviles, poseen un flagelo polar, no forman

esporas, sin cápsula, aerobios y oxidasa positivo.

La última pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa.

Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato,

citrato, sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.

MATERIAL

Placa Petri con medio TCBS sembrada con V. cholerae y V. parahaemolyticus

Tubos con TSI

Tubos con LIA

Tubo con Caldo peptonado

Tubo con MR-VP

Tubo con Citrato de Simmons

Desoxicolato de sodio al 0.5 %

Láminas portaobjetos

Set de coloración de Gram

Microscopios

Aceite de cedro

PROCEDIMIENTO Y LECTURA

1. En Agar TCBS (thiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de V.

cholerae, de 2-4 mm de diámetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente, circulares,

de color amarillo (resultado de la utilización del citrato y formación de ácidos a partir de la

utilización de la sacarosa)

En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de aspecto

Page 63: Guia practica microbiologia

63

verde- gris translucido; V. alginolyticus se observa de color amarillo (sacarosa positiva)

2. En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de la

sacarosa, no produce H2 S.

3. En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol

4. En el medio LIA observar si hay decarboxilación de la Lisina.

5. En el medio MR- VP detectar la producción del acetil-metil-carbinol

6. En el medio Citrato de Simmons, observar la formación o no de hidróxido de amonio

7. Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram

8. Realizar la prueba de la “cuerda positiva”, colocando una gota de la solución de Desoxicolato

sobre una lamina portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro transferir una colonia de V.

cholerae, mezclar y observar que se produce una suspensión viscosa al retirar el asa “como una

cuerda larga” que se torna mas pegajosa después de 60 segundos mas.

9. Realizar las lecturas en los medios diferenciales bioquímicos sembrados.

PROTOCOLO

MEDIOS

Vibrio cholerae

Vibrio parahaemolyticus

TSI

Acidez en superficie y profundidad

Acidez superficie y

profundidad

LIA

Positiva por descarboxilación de la

Lisina

Positiva

VP

10- 50% cepas es positivo

Negativo

MR

Negativo

Negativo

Indol

Positivo

Positivo

Citrato

Negativo

Negativo

Urea

Negativo

Negativo

Oxidasa

Positiva

Positivo

Catalasa

Positiva

Positiva

Prueba de la cuerda

Positiva

Negativo

RESULTADOS

1. Realizar esquemas de lo observado en la práctica

2. Realizar las pruebas bioquímicas correspondientes.

Page 64: Guia practica microbiologia

64

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 26

ESTUDIO E IDENTIFICACION DEL GENERO LEPTOSPIRA

INTRODUCCION

Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas,

muy móviles, con una longitud de 6 a 20 µm y 0.1 µm de diámetro, sus extremos semejan a ganchos

semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).

El género Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la Familia Leptospiraceae, Orden Spirochetales;

comprende 6 especies patógenas Leptospira interrogans con 18 variantes serológicas, L. noguchi,

L. santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirhneri y L. inadai, y mas de 200 serovares saprofitos

comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se diferencian por su virulencia, sus propiedades

antigénicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de la endonucleasa de

restricción o la composición de su DNA.

La Leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial. Los reservorios naturales son los roedores

y una gran variedad de animales silvestres y domésticos, los cuales eliminan con la orina el agente

etiológico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de transmisión puede ser

directo (orina, órganos de animales infectados) o indirecto (a través del agua o material

contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a través de lesiones de la piel y mucosas

incluyendo la conjuntiva ocular.

Se colorean por métodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y

coloración de Kiktenko, ya que toman débilmente los colorantes de anilina. Son visibles al

microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas.

Desarrolla en medios especiales líquidos, semisólidos y sólidos enriquecidos con suero de conejo o

carnero al 8-10%, a una temperatura óptima de 28 – 30ºC, en un periodo de incubación de 5- 10 días,

en condiciones de aerobiosis.

Para el diagnóstico definitivo de Leptospirosis se requiere de:

1. Aislamiento de la Leptospira a partir de muestras clínicas (sangre, líquido cefalorraquídeo,

orina) en medios de cultivo o inoculación en hámster o cobayo.

2. Evidencia sexológica en sueros pareados con incremento cuádruple del título de diagnóstico

inicial de 1:100

Page 65: Guia practica microbiologia

65

MATERIAL

Cultivo de Leptospira en medio semisólido de Fletcher- modificado

Lamina control coloreada por el método de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo de

Congo.

Microscopio.

LECTURA

En el medio semisólido de Fletcher- modificado observar el desarrollo de las Leptospiras en

todo el tubo y la formación de un anillo a unos milímetros de la superficie del medio

En la coloración de Kiktenko las Leptospiras se tiñen de un color rosado- violeta en fondo

incoloro, presentándose sueltas o entrelazadas, semejando la letra C ó S, generalmente con los

extremos en forma de semigancho y con las espiras bien unidas.

En la observación al microscopio de campo oscuro, las leptospiras se observan como un “collar

de perlas” son muy móviles, realizan movimientos de translación, rotación y al rededor de su

eje.

RESULTADOS

1. Características del cultivo observado.

2. Realiza esquema de la observación en las láminas coloreadas

Page 66: Guia practica microbiologia

66

UNIVERSIDAD

PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 27

ESTUDIO E IDENTIFICACCON DE BARTONELLA

INTRODUCCIÓN

La familia Bartonelaceae comprende cinco (5) especies, siendo B. bacilliformes la causante de la

Bartonelosis humana o Enfermedad de Carrión y se transmite a través de la picadura de un insecto

alado hematófago conocido como Lutzomya.

Bartonella bacilliformes presenta un marcado polimorfismo (bacilar, cocobacilar, cocoide), su

tamaño varía entre 1- 3 m de longitud por 0.25- 0.30 m de diámetro, presenta flagelos unipolares

en número de 1 a 10. En los cultivos jóvenes predominan las formas bacilares (forma virulenta), y en

cultivo viejo la forma cocoide (no virulenta)

Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero si tiene afinidad por los

colorantes derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright).

Desarrolla en aerobiosis y microaerobiosis, a una temperatura óptima de 29°C en medios

enriquecidos con peptona, triptosa, y plasma (gel de fases) y medio bifásico con sangre y plasma,

durante un periodo de incubación de 5- 10 días. Su crecimiento es lento por lo general semanas,

enturbia el medio con sedimento y a veces se observa películas o témpanos en la superficie de la

parte líquida del medio.

Puede ser aislada de la sangre (Hemocultivo) en la fase hemática de la enfermedad, de las lesiones

eruptivas (fase verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis.

En el laboratorio se puede aislar la bacteria por Hemocultivo (fase hemática) usando el agar de fases,

medio de aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden realizar

pruebas serológicas (aglutinaciones, fijación de complemento, Elisa, etc.), ó por Infección de los

hematíes humanos por Bartonella (Danza de los hematíes) e Inhibición del movimiento de los

hematíes por acción de anticuerpos específicos antibartonella

MATERIAL

Frotices coloreados por Leishman, Wrigth ó Giemsa procedentes de cultivo.

Cultivo de la bacteria en Medio Agar Gel de Fases

Cortes histológicos de verrucoma coloreados con Hematoxilina eosina

PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIÓN

Observar al microscopio las láminas coloreadas y apreciar la morfología y tinción de Bartonella.

En las láminas coloreadas observar las bacterias en forma de empalizada y en forma aislada.

En los cultivos observar la turbidez del medio, la formación de sedimento y la formación de

películas o témpanos

Realizar esquemas de las observaciones realizadas.

Page 67: Guia practica microbiologia

67

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 28

ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE TREPONEMA – PRUEBA DE VDRL ó RPR

INTRODUCCIÓN

Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogéneo de microorganismos espirilares

móviles, dentro de las cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres géneros

de microorganismos patógenos para el hombre: Treponema ( T. pallidum, causa la sífilis, T.

pertenue, produce el pián, T. carateneum, produce el pinto), Borrelia ( B. recurrentis produce la

fiebre recurrente, B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira que origina

infecciones generales con fiebre, ictericia y meningitis.

La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho y

5 a 15 m de largo, son móviles y giran constantemente, no se tiñen bien con los colorantes de

anilina y es difícil su cultivo en medios artificiales.

PRUEBAS DE DIAGNOSTICO

1. Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (líquidos tisulares) pueden

observarse en un microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas móviles

características.

2. Por inmunofluorescencia usando suero antitreponema marcado con fluoresceina

3. Pruebas serológicas para sífilis, estas pueden usar antígenos treponémicos o antígenos no

treponémicos (cardiolipina purificada del corazón de buey)

4. Prueba de Floculación (VDRL), el antígeno VDRL es una solución alcohólica que contiene

0.03% de cardiolipina, 0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en que

las partículas del antígeno lipido (cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en

enfermos se combina con la reagina de la sífilis (la reagina es una mezcla de IgM e IgA dirigidos

contra algunos antígenos).

MATERIALES

Suero problema

Antígeno VDRL

Laminas excavadas

Pipetasgraduadas

PROCEDIMIENTO

Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (baño María a 56°C x 30’) sobre la lamina

excavada

Añadir una gota del antígeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos

Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formación de floculos cuando la

reacción es positiva.

RESULTADOS

N (No reactivo) ........................ Ausencia de floculos

RD (Reactivo débil) ........................ Floculos pequeños

R (Reactivo) ....................... Floculos medianos y grandes

Page 68: Guia practica microbiologia

68

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 29

CULTIVO DE MUESTRAS DE INFECCIONES URINARIAS: UROCULTIVO

INTRODUCCION

El Urocultivo es el examen de muestras de orina que permiten el aislamiento de agentes patógenos

causantes de una infección urinaria.

Para la obtención de muestras debe considerarse:

La recolección debe ser con un mínimo de contaminación

Establecer el momento óptimo para la recolección, con el objeto de tener la mejor probabilidad

de recuperar microorganismos causales.

Obtener una cantidad suficiente de la muestra para efectuar las técnicas de cultivo necesarias.

Toda vez que sea posible, obtener las muestras antes de la administración de antibióticos.

Normalmente la orina es estéril, pero al tomarse la muestra existe la posibilidad de contaminación

por lo que se realiza de rutina el Urocultivo cuantitativo:

1. Si existe menos de 10,000 gérmenes por ml. se considera como contaminantes, siendo la muestra

negativa.

2. Cuando la orina tiene más de 100,000 bacterias por ml, se considera que hay infección urinaria.

3. Si el número de gérmenes oscila entre 1,000 a 100,000 se interpreta como dudoso y será

necesario repetir el cultivo.

La orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes a la recolección para

lograr recuentos de colonias exactos, luego se deberá identificarlas y realizar el Antibiograma

correspondiente.

MATERIAL

Muestra de orina patológica

Sedimento de orina

Agar Mac Conkey, Medio hipertónico de Chapman (Agar Manitol), Agar Sabouraud, en placas

Agar nutritivo en tubos con 20 ml licuado +/- 50°C

Agar Mac Conkey en tubos con 20 ml licuado +/- 50°C

Tubos con medio TSI, LIA, Caldo peptonado, MR-VP, Agar Citrato de Simmons, Agar Urea de

Christensen.

Tubos con 9.9 ml de Suero fisiológico 0.85%

Pipetas de 1 ml. estériles

Placas Petri, vacías estériles

Page 69: Guia practica microbiologia

69

Bocal con desinfectante

Microscopio

Serie de colorantes de Ziehl- Neelsen

Serie de colorantes de Gram

Láminas portaobjetos y laminillas

PROCEDIMIENTO

PRIMER DIA:

A. Estudio de las características macroscópicas

Describir el aspecto de la orina:

Color (amarillo, oscuro, castaño o incoloro)

Señalar si la orina es clara o turbia.

B. Estudio de las características microscópicas

1. Obtener una gota del sedimento urinario y observarlo entre lámina y laminilla al microscopio

con objetivos de 10X y 40X

2. Realizar un frotis y colorear por el método de Gram y Ziehl- Neelsen

C. Siembra de la muestra de orina:

1. Tomar 0.01 ml. de la orina sin centrifugar y sembrar por dispersión agotamiento en las

placas con Agar Mac Conkey, Agar Manitol y Agar Sabouraud

2. Método de dilución: Preparar una dilución de la orina de la siguiente manera.

a) Con la pipeta de 1 ml, obtener 0.1 ml de orina sin centrifugar y transferirlo al tubo con

suero fisiológico 0.85% estéril. Mezclar bien.

b) Con la misma pipeta transferir 0.1 ml de la mezcla a cada una de las placas Petri vacías

estériles.

c) A cada una de las placas agregar el Agar Mac Conkey licuado y a la otra el Agar

nutritivo licuado, rotar sobre la mesa del laboratorio para obtener una mezcla

homogénea.

d) Una vez solidificado el Agar, incubar a 37°C por 18- 24 horas.

LECTURA

1. En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos, cristales

anormales, leucocitos, levaduras, parásitos, espermatozoides, células epiteliales, cilindros.

2. En los frotices coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y Gram

negativas, y por el método de Ziehl- Neelsen las bacterias ácido alcohol resistentes(en caso de

infección por Mycobacterium).

SEGUNDO DIA:

1. En la siembra de la orina sin centrifugar, observar en la placa de Agar Mac Conkey el

crecimiento de colonias lactosa positivas; en las placas de Agar Manitol, el desarrollo de

Page 70: Guia practica microbiologia

70

colonias resistente a altas concentraciones de sales, y en el Agar Sabouraud, si hay presencia de

levaduras.

2. En la siembra por dilución, observar el desarrollo bacteriano en las placas, contar el número de

colonias en un 1/8 de la placa y multiplicarlo por 8 y luego por 1000.

3. Se deberá seleccionar una colonia lactosa positiva y negativa del Agar Mac Conkey, preparar

suspensiones en caldo nutritivo y realizar las pruebas diferenciales en la serie bioquímica

respectivamente: TSI, Caldo peptonado, MR-VP, Citrato de Simmons, LIA y Urea de

Christensen. Incubar a 37°C por 18-24 horas.

Nota: El agente causal aislado e identificado deberá ser sometido a Pruebas de Susceptibilidad

Antimicrobiana. El Antibiograma se realiza tomando 5 colonias del Agar Mac Conkey, se prepara

una suspensión en un tubo con SF al 0.85%, y se determina la Concentración Mínima Inhibitoria

(MIC) del antibiótico cuya finalidad es orientar en la terapéutica y la concentración del antibiótico

alcanzado en el suero o en foco de infección.

El método de disco-difusión estandarizado [Kirby - Bauer] es el que se usa de rutina en el

laboratorio, para dicha determinación (MIC).

REPORTE FINAL

Diseñar el protocolo correspondiente, señalando:

1. La observación macroscópica y microscópica de la muestra clínica.

2. Las características del desarrollo bacteriano, y los principios bioquímicos en cada uno de los

medios selectivos empleados.

3. Los resultados del comportamiento bioquímico.

4. La determinación del agente patógeno causante de la infección urinaria.

5. Determinación cuantitativo número de UFC por ml.

Nota: UFC (Unidad Formadora de Colonia)

Page 71: Guia practica microbiologia

71

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 30

AISLAMIENTO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Y EN RATONES

LACTANTES.

OBSERVACION DE LÁMINAS COLOREADAS

INTRODUCCION

Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los

animales, de las plantas y también de las bacterias (bacteriófagos).

En este capítulo analizaremos solamente los virus que producen patología en el ser humano; debido

a sus características especiales como son su pequeño tamaño y su parasitismo intracelular obligado,

los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien algunas de las

enfermedades producidas por ellos ya se conocían desde la antigüedad (viruela, rabia, hepatitis, etc.).

Dado que los virus carecen de los constituyentes fundamentales para el crecimiento y

multiplicación deben necesariamente utilizar los sistemas de las célula que parasitan y por ello se

denominan parásitos intracelulares obligados.

En los últimos años, se han desarrollado métodos de diagnóstico rápido para la mayoría de las

infecciones virales así como drogas antivirales específicas para muchos virus.

Se emplean métodos directos para el diagnóstico de los virus, y dado que estos solo se replican en

el interior de las células vivas, para su cultivo in Vitro es necesario el empleo de métodos especiales

en el laboratorio de virología, tales como:

a) Cultivos tisulares de humanos o animales. La mayoría de los virus pueden multiplicarse en

cultivo de células apropiadas.

b) Embriones de pollo (membrana corioalantoidea, cavidad amniótica, cavidad alantoidea y

saco vitelino).

c) Animales de laboratorio (ratones lactantes, Hámsters, monos)

d) Serología o demostración de anticuerpos frente al virus.

e) Demostración directa del virus o de antígenos víricos a partir de frotis de las lesiones.

OBJETIVO DE LA PRÁCTICA

El aislamiento de los virus es de gran importancia en la investigación médica y epidemiología y

constituye un método muy extendido para el diagnóstico de la infección.

Por lo tanto estas prácticas nos orientan a conocer los diversos métodos de aislamiento directo o

indirecto para demostrar los efectos citopáticos de los diferentes virus y sus formas como se deben

evaluar en los diferentes procesos infecciosos que generan en el ser humano.

METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLÓGICO:

Page 72: Guia practica microbiologia

72

A. USO DE LOS HUEVOS EMBRIONADOS PARA LA PROPAGACION DE LOS VIRUS.

Muchos de los virus y rickettsias patógenas para el hombre y los animales pueden propagarse en las

células vivas de las membranas extraembrionarias o en el propio embrión de huevos embrionados de

gallina. Estas técnicas fueron introducidas por Footdpasture y col., en 1931, y desde entonces están

siendo ampliamente usadas.

Las vías de inoculación y la edad del embrión a usar dependen del agente viral que va a ser

inoculado.

MATERIALES

Huevos embrionados de 7-9 días.

Huevos embrionados de 10-12 días.

Jeringas de tuberculina con aguja N° 25 x ¼” y 22 x 2”.

Colorante Fucsina al 1% con agua destilada

Colorante Azul de metileno al 1% con agua destilada

Frascos con Alcohol yodado

Algodón

Ovoscopio

Cinta adhesiva o parafina para sellar los huevos embrionados

Equipo de disección (Pinzas, tijeras curvas, guantes)

INOCULACION DEL COLORANTE POR VIA ALANTOIDEA

a) Marcar y limpiar con alcohol yodado, huevos de 10-12 días.

b) Hacer un pequeño orificio con el punzón en la zona marcada de huevos embrionados.

c) Introducir la aguja de la jeringa cargada con colorante aproximadamente ¼” en ángulo de 45° e

inocular 0.2 ml. de colorante.

d) Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubación a 33-35°C por 2-4

días, luego cosechar y observar.

INOCULACION POR VIA AMNIOTICA

a) Marcar la cámara de aire y la posición del embrión de 10-12 días.

b) Limpiar con alcohol yodado un área de la cámara de aire que está situada por encima del

embrión y hacer una perforación rectangular de 0.5 cm, con el punzón.

c) Deja caer una gota de suero fisiológico o aceite mineral estéril, para visualizar una zona no

vascularizada de la membrana corioalantoidea subyacente.

d) Con una pinza curva introducir a través de esta área, coger hacia arriba la membrana amniótica,

formando una pequeña “tienda” en la base del cual se inyecta 0.2 ml, de la solución de Azul de

metileno o del inoculo problema.

e) Se suelta la membrana que se localiza en su sitio de origen.

f) Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a 33-35°C

por 2-4 días (sujeto a la muestra: Influenza)

INOCULACION DEL SACO VITELINO

a) Limpiar con alcohol yodado, la porción de la cáscara que cubre la cámara de aire del huevo

embrionado de 6-7 días.

b) Perforar la cáscara en el centro de la cámara de aire.

c) Con una jeringa de 1 ml y aguja de 22x½” inocular 0.5 ml de Azul de metileno, introduciendo la

Page 73: Guia practica microbiologia

73

aguja verticalmente a través de la cámara de aire, hasta 35 mm de profundidad.

d) Sellar la abertura

COSECHA DE LOS LIQUIDOS (SEGÚN LAS CAVIDADES INOCULADAS)

a) Comprobar que el embrión este vivo. Enfriar a 4°C los huevos embrionados por algunas horas

(2-3 horas antes) para prevenir sangrado de los embriones.

b) Cortar la cáscara que cubre la cámara de aire y separar con pinzas, las membranas subyacentes.

c) Verter el contenido del huevo embrionado en una placa Petri. Observar la localización del Azul

de metileno y/o Fucsina en las zonas de inoculación (Membrana alantoidea, amniótica,

corioalantoidea y saco vitelino).

d) Cosechar las membranas en estudio y extraer el liquido alantoideo, amniótico y realizar las

pruebas de diagnóstico correspondientes según la investigación solicitada

D. INOCULACIÓN EN RATONES LACTANTES:

Se utilizaran ratones lactantes y las vías de inoculación serán:

Intraperitoneal, Intracraneal, Subcutánea y Nasal.

E. OBSERVACIÓN DE LAMINAS COLOREADAS:

Observar la presencia de cuerpos anormales intracelulares denominados cuerpos de inclusión

(Efecto citopatico). Estas estructuras pueden encontrarse en el núcleo o en el citoplasma y su

localización es específica de la enfermedad viral.

Se considera estos cuerpos de inclusión (efecto citopatico) como conglomerados de virus

asociados a productos de reacción de la célula infectada.

OBSERVACIÓN DE LÁMINAS:

1. Cultivo de células normales, coloreadas con Hematoxilina eosina (HE), no se tiñe de rosado el

citoplasma.

2. Rabia: corte histológico de cerebro. Coloración HE. Observar inclusiones eosinofilas

intracitoplasmáticas denominadas corpúsculos de negri.

3. Enterovirus- Virus Polio: En cultivos de células humanas (HEP-2), observar la degeneración

celular, el redondeamiento celular, la picnosis nuclear y desplazamiento del núcleo hacia el

borde de la célula.

4. Herpes simple en cultivos de células: Observar las células gigantes polinucleadas, las

inclusiones eosinofilas intracelulares denominadas cuerpos de Lipschutz.

5. Citomegalovirus en sedimento de orina: Observar la inclusión intranuclear basófila en “ojos

de lechuza” rodeada de un halo claro y el citoplasma ce color azulado (Basófilo).

6. Adenovirus en cultivo de células HEP-2: Observar la agrupación de células en racimo y las

inclusiones basófilas intranucleares.

PROTOCOLO

Esquematizar los resultados de las inoculaciones realizadas.

Page 74: Guia practica microbiologia

74

Page 75: Guia practica microbiologia

75

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 31

ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS AMBIENTALES

INTRODUCCION

Los hongos ambientales se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza viviendo a

expensas de la materia inerte existente, la mayoría se encuentra como saprofito, otros pueden ser

causantes de inducir hipersensibilidad así como también ser responsables de infecciones. Entre los

hongos ambientales comunes tenemos: Aspergillus, Penicilluim, Fusarium, Rhizopus,

Cephalosporium, Helmintosporium, Rhodotorula

MATERIALES

Tubos con cultivo de Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium,

Rhodotorula y Helmintosporium.

Láminas con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.

Microscopios

PROCEDIMIENTO

1. Estudie las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de

micelio aéreo, aspecto de la colonia, producción de pigmento y consistencia de la colonia.

2. Observar al microscópico utilizando lentes de menor y mediano aumento, las características

microscópicas de cada uno de los hongos preparados en las láminas con azul de lactofenol.

CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS AMBIENTALES

Aspergillus

Colonias al inicio de color blanco, luego varía de acuerdo a la especie en: amarillo, verde azufrado,

marrón o negro.

Microscópicamente presenta hifas tabicadas que forman conidióforos no tabicados que se ensanchan

en su extremo distal dando lugar a la cabeza aspergilar que da origen a los esterigmas y de donde

salen las conidias en cadena.

Penicillium

Colonias de color azul verdosas, pulverulento y desarrollo abundante.

Microscópicamente presenta hifas tabicadas con conidióforos ramificados en cuyo extremo se hallan

los esterigmas en forma de pincel del cual se originan las conidias en cadena.

Fusarium Colonias de micelio aéreo algodonoso de color rosado ó violeta en la superficie.

Page 76: Guia practica microbiologia

76

Microscópicamente presenta filamentos tabicados con cortos conidióforos, macroconidias septadas y

alargadas, fusiformes.

Rhizopus

Colonias de micelio aéreo, de aspecto algodonoso, de un color blanco grisáceo.

Microscópicamente presenta hifas sin septos, rizoides a partir de los cuales se forman largos

esporangioforos que terminan en una estructura globosa llamada esporangio en cuyo interior se

encuentran las esporas.

Cephalosporium

Colonias de micelio aéreo de color blanco- rosado o blanco- amarillento.

Microscópicamente presentan hifas septadas, conidióforos cortos que dan origen a conidias hialinas

agrupadas.

Helmintosporium

Colonias de color gris al inicio, después se torna de color negro en el centro, con la periferia elevada

de color gris.

Microscópicamente se observan hifas septadas y macroconidios con septos longitudinales sobre

conidióforos cortos y nudosos

Rhodotorula

Desarrolla colonias de aspecto cremoso, de color rojo o rosado debido a que forma pigmentos

carotenoides. Microscópicamente se observa células ovoides o redondeadas con o sin yema.

PROTOCOLO

Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la práctica.

Page 77: Guia practica microbiologia

77

Page 78: Guia practica microbiologia

78

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 32

ESTUDIO E IDENTIFICACIÓN DE HONGOS DERMATOFITOS

INTRODUCCION

Los dermatofitos son organismos queratinófilos que invaden las estructuras queratinizadas del

cuerpo como la piel, pelo y uñas. Las artrosporas se adhieren a los queratinocitos, germinan y los

invaden, son causantes de las micosis superficiales y constituyen una de las infecciones más

comunes en los humanos.

Los agentes causales mas importantes son los hongos del género Trichophyton, Microsporum y

Epidermophyton, así como también Malassezia furfur que es causante de la Tiña versicolor o

Pitiriasis versicolor y la Piedraia hortai que afecta los pelos y produce nódulos en el tallo piloso

de los cabellos, barba y bigote.

Por su hábitat pueden clasificarse en: Zoofílicos (Microsporum canis), Geofílicos (Microsporum

gypseum), y Antropofílicos (Epidermophyton).

MATERIALES

Tubos con cultivo de: T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum y E.

floccosum.

Lámina con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.

Láminas preparadas de M. furfur en hidróxido de potasio al 20%.

Láminas preparadas de pelo infectado con Piedraia hortai.

Material básico de laboratorio(xilol, algodón, alcohol)

Microscopios con lentes de menor y mediano aumento.

PROCEDIMIENTO

1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de

micelio, aspecto de la colonia , producción de pigmento y consistencia de la colonia.

2. Observar al microscopio las características microscópicas de cada uno de los hongos preparados

en láminas.

CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DERMATOFITOS, MALASESSIA Y PIEDRAIA.

Trichophyton rubrum

Colonias de micelio aéreo blanco, de aspecto algodonoso, al reverso puede observarse un pigmento

de color púrpura.

Al microscopio se observan hifas septadas con microconidias sésiles piriformes, a veces puede

observarse macroconidias, clamidosporas y cuerpos nodulares.

Page 79: Guia practica microbiologia

79

Trichophyton mentagrophytes

Colonias blanquecinas pulverulentas, granuladas, yesosas, al reverso puede observarse un pigmento

amarillo- pardusco.

Al microscopio se observan hifas septadas con abundante microconidias esféricas agrupadas, pueden

presentar hifas en espiral y macroconidias.

Trichophyton tonsurans

Colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia acartonada con

pigmentación amarillo- castaño al reverso.

Al microscopio se observan microconidias piriformes hialinas, clamidosporas, e hifas en raquetas

septadas, pueden observarse macroconidios.

Microsporum gypseum

Colonias poco elevadas pulverulentas con pigmento de color canela.

Al microscopio se observan hifas septadas, macroconidios con tabiques transversales en número de

4-6, rara vez se observan microconidias.

Microsporum canis

Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de la

colonia.

Al microscopio se observan macroconidios fusiformes hasta con 8 tabiques transversales y con

pequeñas excrecencias en la superficie, pueden también observarse microconidias y clamidosporas.

Epidermophyton floccosum

Colonias de aspecto aterciopelado, pulverulentas de color amarillo- azufre con pliegues en la

colonia.

Al microscopio se observan macroconidios con su extremo distal romo y con 3-4 tabiques

transversales, pueden encontrarse aisladas o en racimo.

Malassezia furfur (Pityrosporum)

Al microscopio se observan hifas cortas de extremos romos al lado de formas redondeadas

agrupadas; este hongo no desarrolla en medios comunes por lo que el diagnóstico se da por el

examen directo de la muestra

Piedraia hortai

Los nódulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a negro que

envuelven completamente el tallo piloso.

PROTOCOLO

Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la práctica

Page 80: Guia practica microbiologia

80

Page 81: Guia practica microbiologia

81

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 33

ESTUDIO DE HONGOS LEVADURIFORMES.

OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.

INTRODUCCION:

Los hongos levaduriformes son frecuentes al estado saprofito en el suelo, aguas, plantas y en las

cavidades naturales del hombre como el tubo digestivo y en las regiones de los pliegues cutáneos.

Muchas especies han sido vinculadas a infecciones humanas como la Candida albicans y otras

especies de Candida que puede producir infecciones agudas o crónicas en la piel o mucosas, aparato

genito- urinario, y respiratorio; otras levaduras como Cryptococcus neoformans pueden causar

infecciones cerebrales y rara vez infecciones cutáneas; en el hombre la infección primaria es casi

siempre pulmonar.

MATERIALES

Cultivo con Candida albicans y Cryptococcus neoformans.

Láminas de Candida albicans en Agar harina de maíz.

Láminas de Cryptococcus neoformans en tinta china.

Cortes histológicos con C. albicans y Cr. neoformans.

Material básico de laboratorio (xilol, algodón, alcohol)

Microscopios con lentes de menor y mayor aumento.

PROCEDIMIENTO

1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el aspecto y

consistencia de la colonia.

2. Observar al microscopio las características que presentan cada especie de los hongos en el Agar

harina de maíz, tinta china y en los cortes histológicos.

CARACTERISTICA DE LOS HONGOS LEVADURIFORMES

Candida albicans

Las colonias son de aspecto cremoso y consistente, de color blanco perlado.

En el Agar- almidón- arroz, se observan clamidospora, pseudomicelio y blastospora que

tipifican a Candida albicans.

En los cortes histopatológicos observar la presencia de filamentos cortos y levaduras en las

lesiones rodeadas de una zona de histiocitos.

Cryptococcus neoformans

Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color ocre, de aspecto

mucoide viscosas y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de cultivo.

En las láminas con tinta china se aprecia la cápsula como un halo brillante entre el borde de la

levadura y el fondo oscuro dado por la tinta china.

En los cortes histopatológicos, se observan como levaduras a lo largo de los vasos en las

lesiones, las cuales comprimen los tejidos vecinos y los necrosan, escasa infiltración celular.

Page 82: Guia practica microbiologia

82

Page 83: Guia practica microbiologia

83

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

PRACTICA Nº 34

ESTUDIO DE HONGOS DIMORFICOS.

OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.

INTRODUCCION

Los hongos dimórficos, son hongos causantes de infecciones mucocutáneas y/o sistémicas en el

hombre y algunos animales.

Paracoccidioides brasiliensis

En su fase inicial esporógena, se encuentra en el suelo, fragmentos vegetales, espinas, etc. Y en su

fase de levadura en tejidos infectados.

Es el agente causante de la Paracoccidioidomicosis, infección crónica, granulomatosa de la piel,

mucosa, ganglios y vísceras. Es más frecuente entre los trabajadores rurales.

Histoplasma capsulatum

En el ambiente natural se encuentra en la fase miceliar esporógena, que se desarrolla principalmente

sobre compuestos nitrogenados, tales como excretas de aves (gallina, lechuza), excremento de

murciélagos, etc., y en su fase de levadura se encuentra en tejido infectado.

Es el agente causal de la Histoplasmosis que puede afectar el sistema respiratorio en su forma

benigna pudiendo producir calcificaciones dispersas en los campos pulmonares.

Sporothrix schenckii Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la Esporotricosis en el hombre y algunos

animales, el hongo ingresa generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales

contaminados con el hongo. La infección esta localizada preferentemente en los ganglios linfáticos

MATERIALES

Cultivo en Agar Sabouraud y Agar BHI de P. brasiliensis, H. capsulatum, S. schenckii.

Microcultivos coloreados con Azul de lactofenol

Cortes histológicos infectados por estos hongos.

PROCEDIMIENTO 1. Estudiar las características macroscópicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de

micelio, aspecto de la colonia y consistencia de la colonia.

2. Observar las características microscópicas de cada uno de los hongos.

CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DIMORFICOS

Paracoccidioides brasiliensis En los frotices coloreados con Leishman o en cortes histológicos, se presentan como células

esféricas u ovaladas de 10 a 80 micras de diámetro, con doble membrana y multigemantes.

En cultivo en Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio aéreo de color blanco

compacto, de crecimiento lento. Microscópicamente se observan filamentos hialinos, tabicados con

microconidias esféricas o piriformes.

Page 84: Guia practica microbiologia

84

En Agar Infusión cerebro corazón (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige claro.

Microscópicamente se observan células esféricas.

Histoplasma capsulatum

En frotices o cortes histológicos se observan intracelularmente como nidos de levadura incluidas en

los histiocitos o polimorfonucleares. Las levaduras son pequeñas, redondas u ovaladas de 1-3 micras

de diámetro.

En Agar Sabouraud glucosado, desarrolla colonias algodonosas de color blanco. Microscópicamente

se observan hifas tabicadas con escasa producción de microconidias y gran cantidad de

macroconidias tuberculadas redondas y grandes de pared gruesa “Clamidospora tuberculada”.

En el medio BHI desarrolla colonias pequeñas de aspecto membranoso rugoso, color marrón claro.

Microscópicamente, se observan como células ovaladas a veces gemantes.

Sporothrix schenckii

En Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias al inicio pequeñas, blanquecinas presentando

posteriormente un aspecto húmedo, rugoso y membranoso, de un color que puede variar de crema a

negro.

Microscópicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidióforos en cuyo extremo se

encuentran las conidias agrupadas dando el aspecto de una margarita.

En medio BHI, desarrolla colonias levaduriformes. Al microscopio se observan células en gemación

ovales o en forma de cigarrillos Gram positivos.

PROTOCOLO

Esquematice o dibuje lo observado en la práctica.

Page 85: Guia practica microbiologia

85

Page 86: Guia practica microbiologia

86

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MÉDICA

SEMINARIO-I

GENETICA MICROBIANA E INGENIERIA GENÉTICA

(Organización de los genes. Transferencia del DNA. Mutación. Expresión génica e

Ingeniería genética)

TEMA 1 : ORGANIZACIÓN DE LOS GENES (ADN PROCARIOTICO)

TEMA 2 : TRANSFERENCIA E INTERCAMBIO DE LA INFORMACIÓN

GENETICA BACTERIANA.

TEMA 3 : MUTACIÓN Y SUS CONSECUENCIAS

TEMA 4 : EXPRESIÓN GÉNICA E INGENIERIA GENÉTICA Y SUS

APLICACIONES EN LA MEDICINA.

OBSERVACIONES A TENER EN CUENTA:

PRESENTACIÓN EN POWER- POINT Y TRÍPTICO

EXPOSICIÓN: CADA TEMA 10-15 MINUTOS

LUGAR: AULA DE CLASES TEÓRICAS

HORA: EN HORAS DE PRÁCTICAS

PASO AL FINAL DE LA EXPOSICIÓN

Profesor Responsable del Curso

Page 87: Guia practica microbiologia

87

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MÉDICA

SEMINARIO – II

VACUNAS ANTIMICROBIANAS. PROGRAMA DE VACUNACIÓN

(Tipos de vacunas. Requisitos de una buena vacuna)

TEMA 1: TIPOS DE VACUNAS Y CONSECUENCIAS PATOLÓGICAS DE LA

VACUNACIÓN.

TEMA 2: OBJETIVOS DE LA VACUNACIÓN Y REQUISITOS DE UNA BUENA

VACUNA.

TEMA 3: PRACTICAS DE VACUNACIÓN ACTUAL Y MEDIDAS DE CONTROL

TEMA 4: CONSECUENCIAS PATOLÓGICAS DE LA VACUNACIÓN

TEMA 5: PROGRAMAS DE VACUNACIÓN

Profesor Responsable del Curso

Page 88: Guia practica microbiologia

88

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

SEMINARIO - III

ANTIBIÓTICOS Y QUIMIOTERÁPICOS

(Mecanismos básicos de actividad y resistencia a los antibióticos)

TEMA 1: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS

1.1: Inhibidores de la Síntesis de la pared celular

1.2: Inhibidores de la Síntesis de proteínas

1.3: Inhibidores de la Síntesis de ácidos nucleicos

1.4. Inhibidores de la función de la membrana citoplasmática

TEMA 2: RESISTENCIA A LOS AGENTES ANTIBACTERIANOS

2.1: Genética de la resistencia

2.2: Mecanismos de resistencia

TEMA 3: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS Y ANTITUBERCULOSTÁTICOS

3.1. Mecanismos básicos de actividad

3.2. Mecanismos de resistencia

TEMA 4: CLASES DE AGENTES ANTIVIRALES

4.1: Mecanismos básicos de actividad

4.2: Mecanismos de resistencia

TEMA 5: CLASES DE AGENTES ANTIMICÓTICOS

5.1: Mecanismos básicos de actividad

5.2: Mecanismos de resistencia

Profesor Responsable del Curso

Page 89: Guia practica microbiologia

89

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MÉDICA

SEMINARIO - IV

ENFERMEDADES DE TRANSMISION SEXUAL:

(ETS) Y SIDA

1. SÍFILIS CONGÉNITA. FASES DE LA ENFERMEDAD. DIAGNÓSTICO

SEROLÓGICO.

2. PAPILOMAVIRUS

3. VIRUS DE LA HEPATITIS B

4. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH):

A) ETIOPATOGENIA DEL SIDA Y ESTRUCTURA DEL VIH

B) ASPECTOS GENERALES DEL CURSO DE LA INFECCIÓN POR VIH

C) EPIDEMIOLOGÍA. TRATAMIENTO Y PREVENCIÓN

Profesor Responsable del Curso

Page 90: Guia practica microbiologia

90

ASOCIACIÓN

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MÉDICA

SEMINARIO - V

ARBOVIRUS. DENGUE Y FIEBRE AMARILLA

TEMA 1: FIEBRE AMARILLA

a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA

b) MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y EPIDEMIOLOGÍA

TEMA 2: FIEBRE AMARILLA

a) DIAGNÓSTICO E INMUNOLOGÍA

b) PREVENCIÓN Y CONTROL

TEMA 3: DENGUE

a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA

b) MANIFESTACIONES CLÍNICAS Y EPIDEMIOLOGÍA

TEMA 4: DENGUE

a) DIAGNÓSTICO E INMUNOLOGÍA

b) PREVENCIÓN Y CONTROL

Profesor Responsable del Curso