UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

FACULTAD DE MEDICINA

II CÁTEDRA DE MICROBIOLOGÍA, PARASITOLOGÍA E INMUNOLOGÍA

ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA I

PROFESOR TITULAR: DR. NORBERTO A. SANJUAN

GUIA DE TRABAJOS PRACTICOS

2019

AUTORES:

GONCALVES VALENTE, CAMILA

MARIN, FRANCISCO

SADER LIMA, LUANA

SCIARONI, OSCAR

TRABAJO PRÁCTICO 1

CONTENIDOS: EL LABORATORIO EN MICROBIOLOGIA – BIOSEGURIDAD – EL MÉTODO EXPERIMENTAL – LAVADO DE MANOS – TOMA DE MUESTRA AMBIENTAL -

OBJETIVO GENERAL: Comprender el método experimental y adquirir destrezas.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ➔ Conocer normas de bioseguridad y qué hacer en caso de accidentes o incendio. ➔ Recordar el método científico y desarrollar los pasos del método experimental. ➔ Determinar la presencia de microorganismos en las manos. ➔ Estudiar qué ocurre con el número de esos microorganismos luego de los diferentes lavados de manos.

NOTA INTRODUCTORIA: A TODOS LOS TRABAJOS PRÁCTICOS DEBERÁ CONCURRIR CON GUARDAPOLVO, GUANTES Y EL CABELLO RECOGIDO, ASÍ COMO LA GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS, UN LAPIZ AZUL Y OTRO ROJO. ESTÁ PROHIBIDO FUMAR, BEBER O COMER EN EL LABORATORIO O LLEVARSE LAS MANOS A LA BOCA O A LOS OJOS.

QUIEN NO CUMPLA CON ESTAS NORMAS NO PODRÁ REALIZAR EL TRABAJO PRÁCTICO Y TENDRÁ “AUSENTE”.

LOS TRABAJOS PRÁCTICOS SERÁN EVALUADOS EN LOS EXÁMENES PARCIALES Y EN LOS FINALES.

AL FINAL DE LA GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS SE ENCUENTRAN HOJAS DE ACTIVIDADES Y UN ENCUESTA DE ENTREGA OBLIGATORIA PARA LA REGULARIDAD EN LA MATERIA, LA ENCUESTA PODRA SER LLENADA ANTES DE CONCURRIR A LOS TRABAJOS PRACTICOS

RECUERDE QUE “TODO LO QUE SE ENSEÑA, SE EVALÚA”

RECONOCIMIENTO DE SEÑALES DE RIESGO

“PRECAUCIÓN” Ó “PELIGRO”: RADIACTIVIDAD

(CONOCER UN CONTADOR GEIGER)

RIESGO BIOLÓGICO

CONDUCTAS A SEGUIR ANTE CASOS DE INCENDIO

1. El primer día de concurrencia al laboratorio del piso 14, identifique las 2 salidas de emergencia (que están indicadas por letreros verdes) y la forma de operar las puertas de salida. Al abrirlas sonará una alarma. NO LAS USE INNECESARIAMENTE. Hay una salida hacia las escaleras del lado de Junín y otra hacia las del lado de Uriburu.

2. Identifique la ubicación de los matafuegos y la manera de operarlos.

3. Si hay un foco de incendio chico, el Instructor intentará apagarlo con los

matafuegos. Si no se controla inmediatamente, EVACÚE EL LUGAR.

4. Identifique el foco de incendio, CIERRE TODAS LAS PUERTAS DE LOS LABORATORIOS para evitar la circulación de aire y abandone INMEDIATAMENTE EL PISO por la salida de emergencia contraria al incendio.

5. Si hubiera mucho humo, respire a través de un pañuelo y desplácese agachado

hacia la salida de emergencia.

6. No entre en pánico ni corra. Camine rápido y en forma contínua. Antes de descender POR LAS ESCALERAS (NUNCA POR EL ASCENSOR) mire hacia abajo para ver si hay humo denso en los pisos inferiores. En ese caso NO descienda. Comunique la situación a los números indicados en el punto 7 y su ubicación en la Facultad.

7. Cuando esté a salvo llame al 911 indicando el lugar del incendio y a la Oficina de Seguridad de la Facultad: 5950-9500 Int 2024. O, DIRECTAMENTE “2024” SI LLAMA DESDE UN TELÉFONO INTERNO.

CONDUCTAS A SEGUIR ANTE ACCIDENTES DE LABORATORIO

1. Trate de evitarlos aplicando correctamente los métodos que les serán explicados en cada actividad.

2. Ante CUALQUIER tipo de accidente, comuníquelo INMEDIATAMENTE al docente a cargo.

DESCARTE DEL MATERIAL CONTAMINADO

Hay varias alternativas:

1. El material va a contenedores que se envían a empresas de descontaminación.

2. El material se esteriliza y luego se descarta.

3. El material SE COLOCA EN BOLSAS ROJAS, que más tarde se juntarán en el subsuelo de la Facultad y se procesarán.

DESARROLLO

MARCO TEÓRICO:

NOCIONES BASICAS DEL MÉTODO CIENTÍFICO Y EL MÉTODO EXPERIMENTAL

La ciencia es un cuerpo de conocimientos y la investigación científica es la acción de generarlos.

El método científico (del griego: -µετά = hacia, a lo largo- -οδός = camino-; y del latín scientia = conocimiento; camino hacia el conocimiento) es un procedimiento de investigación usado para producir los conocimientos que forman una ciencia. Es un proceso sistemático, que permite obtener el conocimiento basándose en la observación y la experimentación (“donde no hay método científico no hay ciencia”; Bunge, M. l981). Para que haya ciencia debe haber dos componentes, “un conjunto de conocimientos” y “un método apropiado para su estudio: la observación”, y la observación ha de ser sistemática y controlada.

El método científico es tan general que lo pueden utilizar investigadores de todas las disciplinas. Dadas sus características, el método científico es también un proceso que se produce en el tiempo y que comprende varias fases, cada una de las cuales comprenden y necesitan la anterior.

1. Observación: 2. Planteamiento del problema 3. FORMULACIÓN DE LA HIPÓTESIS 4. Comprobación de la hipótesis=> EXPERIMENTACION 5. Análisis y conclusión => Construcción de leyes, teorías y modelos.

1. Observación: de la curiosidad por tratar de explicar los fenómenos que ocurren, el ser humano plantea una pregunta a resolver.

2. Planteamiento del problema: No todo problema tiene resolución científica; los problemas científicos son exclusivamente aquellos que se plantean sobre un trasfondo racional y sistemático y se estudian por la aplicación del método científico, con el objetivo primario de incrementar nuestro conocimiento. Los problemas por resolver implican la necesidad de hallar la respuesta a una cuestión indagada. Entonces debe tener ciertas consideraciones:

a. Debe existir un “cuerpo de conocimientos” en que se pueda insertar el problema, de tal modo que sea posible tratarlo.

b. Se tiene que expresar en forma clara, con términos lógicos y precisos. c. Se deben incluír las variables involucradas en el estudio. d. Debe estar bien delimitado para evitar confusiones.

3. Hipótesis: La hipótesis es aquella explicación anticipada que le permite al científico asomarse a la realidad (López, 1990). Una hipótesis es una suposición, que da

respuesta tentativa al problema de investigación; que permite establecer relaciones entre hechos. ➢ Características de las hipótesis:

o Tienen que ser claras o Deben tener referentes empíricos; ninguna hipótesis utilizable debe

llevar a juicios morales o Deben ser susceptibles de verificación

o Deben permitir la conexión entre el marco teórico y el campo específico de estudio.

o Tienen que apoyarse en conocimientos previos comprobados. o Deben tener el mismo alcance que el problema propuesto. o Deben conducir a la predicción de fenómenos reales. ➢ Tipos de hipótesis: o De una sola variable: se las denomina hipótesis descriptivas ya que

plantean sólo la descripción del objeto de estudio

o De dos variables (relación causa-efecto): se las llama hipótesis explicativas porque proponen estudiar las causas y los efectos de los fenómenos.

o De dos o más variables con una relación asociativa: se denominan hipótesis asociativas. La modificación de una variable, también modifica la otra (sin una relación causa-efecto)

4. Comprobación de la hipótesis: La hipótesis, una vez formulada, permite inferir y

hacer predicciones verificables que, a su vez, inducen a la realización de los experimentos necesarios. Para que una hipótesis esté debidamente fundamentada tiene que someterse a constatación, vale decir, un modelo experimental que, a través de sus resultados, la confirme o la refute.

5. Análisis de datos y resultados => Formulación de leyes, teorías y modelos: Una hipótesis se convierte en ley cuando ha sido comprobada teórica y experimentalmente de manera simultánea. Si los resultados no comprueban la hipótesis, volvemos al paso

ACTIVIDAD: COMPLETE LOS CÍRCULOS Y UNA CON FLECHAS SIGUIENDO LOS PASOS DEL MÉTODO CIENTÍFICO

¿QUÉ ES UN EXPERIMENTO?

El experimento es la experiencia científica en la que se provoca deliberadamente algún cambio y se observa e interpreta su resultado con alguna finalidad cognitiva.

En el experimento, el desarrollo de los procesos ocurre en condiciones previamente planeadas y controladas. En efecto, si se varían las condiciones es posible lograr que se repitan los procesos, que se retarde o se acelere su curso; en fin, que se produzcan otras muchas perturbaciones en su comportamiento. El control de las condiciones puede consistir simplemente en que el investigador sea capaz de hacer que se presenten y de conseguir que se mantengan durante el tiempo que dure el experimento.

Cabe recordar que existen aquellas condiciones que el experimentador puede controlar o modificar (VARIABLE INDEPENDIENTE) y aquellos que no dependen del mismo, y pueden ser el producto del experimento o lo que se quiera observar (VARIABLE

DEPENDIENTE); así como aquellas que se mantienen constantes (VARIABLES CONTROLADAS).

A su vez los modelos experimentales deben tener CONTROLES o testigos en donde la variable independiente no cambie o se omita: buscan eliminar explicaciones aleatorias de los resultados experimentales (errores o sesgos experimentales). Así, en un experimento microbiológico podemos realizar:

CONTROL POSITIVO

CONTROL NEGATIVO

CONTROL INTERNO

El control del investigador se ejerce tanto en los estímulos que debe provocar al proceso como en el resultado mismo. Las fases principales del método experimental son la observación cuidadosa, la reflexión acerca de las hipótesis, la predicción de sus consecuencias, la planeación del experimento para someter la hipótesis a prueba, el diseño del experimento, la ejecución del experimento planeado, la obtención de resultados y la confrontación entre los resultados experimentales y las predicciones teóricas para la interpretación de las conclusiones

EN RESUMEN:

En el método científico EXPERIMENTAL (ya que hay otros que no lo son, como por ejemplo en la matemática o la lógica) esquemáticamente se cumplen los siguientes pasos:

CONOCIMIENTO PREVIO: Es lo que se acepta como cierto de un hecho determinado hasta antes de comenzar el trabajo de investigación. Por ejemplo, es lo que se aprende en la Universidad como verdadero.

OBSERVACIÓN: Casual o provocada.

CONTRADICCIÓN: La observación no concuerda con lo que se acepta como “cierto” en ese momento.

HIPÓTESIS: Es una explicación teórica que el investigador elabora como para poder explicar el nuevo fenómeno.

EXPERIMENTACIÓN: Es la puesta a prueba de la hipótesis a través de experimentos controlados, usando técnicas precisas, repitiendo el experimento 3 veces y empleando los controles positivos, negativos e internos deseados.

RESULTADOS: Es lo que dio. El investigador sólo lo describe. No los interpreta. De tal forma que cualquier otro investigador pueda repetir el experimento y reproducir los resultados en forma independiente, aunque luego arribe a otras conclusiones. A esto se le denomina REPRODUCIBILIDAD.

CONCLUSIONES: Es la interpretación de los resultados por parte del investigador. Los mismos resultados deberían llevar a investigadores independientes a las mismas conclusiones, pero a menudo esto no es así. Es lo que en la redacción de los trabajos de investigación se desarrolla en el tópico de DISCUSIÓN, donde el investigador afirma algo y después dice el por qué de esa afirmación y también presenta alternativas lógicas para explicar el hecho.

Si los resultados concuerdan con la hipótesis se considerará que es válida y que –por consiguiente- la explicación que plantea es verdadera. Si ocurriera lo contrario la

hipótesis será falsa y habrá que elaborar otra.

El MÉTODO DIAGNÓSTICO: es la aplicación del método científico en la práctica médica, aunque NO ES EXACTAMENTE IGUAL AL MÉTODO EXPERIMENTAL.

Por ejemplo, cuando concurre a la consulta un paciente, luego de presentarse, el médico lo interroga acerca de su nombre, edad, medio de vida, antecedentes, etc. Está adquiriendo CONOCIMIENTO sobre el paciente, su vida pasada y su actualidad.

Luego comenzará el interrogatorio específico. El paciente describe el motivo de su consulta: dolor, alguna insuficiencia, palpitaciones o lo que fuere. El médico va dirigiendo el interrogatorio (por ejemplo, si el paciente tuviera dolor el médico interroga dónde, cómo, para donde se corre, con qué calma, desde cuándo, etc). Durante este proceso (observación) el médico va elaborando mentalmente un diagnóstico presuntivo (hipótesis).

Más tarde se llega al examen físico, es decir, mediante la inspección, la palpación, la percusión y la auscultación, el médico experimenta (provoca puntos dolorosos, compara diferentes zonas simétricas del cuerpo, ausculta un soplo cardíaco que suponía que iba a encontrar como consecuencia de su hipótesis), etc. Este examen físico reforzará la hipótesis o la descartará. Se llegará a una conclusión (diagnóstico), que será o no confirmada por nueva experimentación: exámenes de laboratorio, imágenes o histopatología. Se llega así al diagnóstico de certeza. La contraprueba de esto es la “prueba terapéutica” en la que, si el diagnóstico fue correcto y el tratamiento también, el cuadro clínico debería mejorar.

Es claro que la precisión del método diagnóstico dista mucho de la exactitud del método

experimental, pero éste es la base de aquel.

ACTIVIDAD 1: LAVADO DE MANOS (APLICABLE EN CIRUGÍA)

1. El ayudante le brindará un cepillo, jabón y papel absorbente.

2. Recibirá una placa de Petri con medio de cultivo sólido. Rotúlela escribiendo en el borde de la misma su turno y la letra de su grupo con un marcador. Abra la placa y apoye las yemas de sus dedos suavemente sobre el medio de cultivo. Cierre la placa. Identifíquela con el número 1. 3. Lávese las manos con agua y jabón.

4. Apoye los mismos dedos que utilizó en la placa anterior, pero esta vez en una segunda placa. Identifíquela con el número 2.

5. Lávese las manos con agua, jabón y cepillo.

Para lavarse las manos en la pileta, haga lo siguiente:

a. Enjabone la esponja y comience a limpiarse las manos, primero las palmas, luego el dorso, luego las uñas y luego, con movimientos rotatorios, cada uno de los dedos: cara externa, cara palmar, cara interna y cara dorsal. Continúe ascendiendo en forma circular hacia la muñeca SIN VOLVER A PASAR LA ESPONJA HACIA LA MANO, siga subiendo hasta el pliegue del codo. Haga lo mismo con el otro brazo. Enjuague ambos brazos al mismo tiempo bajo el chorro del agua de la canilla desde la punta de los dedos hasta el codo. b. Repita una segunda vez esta operación pero cepillando hasta el tercio inferior del antebrazo. c. Una vez más, repita la misma operación pero llegando hasta las muñecas.

6. En otra placa de Petri apoye nuevamente las yemas de los dedos e identifíquela con el número 3. Cierre la Placa.

6. Sumerja las manos en un compuesto de yodo-povidona o de alcohol iodado que le proveerá el Laboratorio (INDIQUE ANTES AL DOCENTE SI TIENE O TUVO ALERGIA AL IODO). Deje secar las manos al aire sin tocar nada.

7. En una tercera placa de Petri (indicada con el número 3) apoye nuevamente los dedos. Márquela con el número 4. Cierre la placa y coloque las 4 placas en la estufa de 37°C.

8. El laboratorio incubará otras 3 placas de Petri, una sembrada con bacterias, la otra sembrada con medio estéril y la tercera sin abrir. La primera será el “control positivo” es decir, garantiza que el medio de cultivo permite el desarrollo bacteriano, la segunda es el “control negativo” y la tercera es el “control interno”, es decir, evalúa si el medio de cultivo estaba contaminado durante su preparación. RECUERDE EL CONCEPTO DE CADA TIPO DE “CONTROL”.

LAVADO DE MANOS CON ALCOHOL EN GEL

1. Concurra con alcohol en gel.

2. Recibirá una placa de Petri con un medio de cultivo sólido. Rotúlela escribiendo en el borde de la misma su nombre con un marcador. Abra la placa y apoye las yemas de sus dedos suavemente sobre el medio de cultivo. Cierre la placa. Identifíquela con el número 1.

3. Lávese las manos con el alcohol en gel, con el mismo método utilizado en el lavado de manos con jabón o como se observa en la siguiente imagen.

4. En otra placa de Petri apoye nuevamente las yemas de los dedos e identifíquela

con el número 2. Cierre la Placa y coloque las 2 placas en la estufa de 37°C.

LOS RESULTADOS DEL EXPERIMENTO DE LAVADO DE MANOS SE ANALIZARÁN DURANTE EL SEGUNDO DÍA

1. Tome las placas de Petri de la estufa (las del experimento de las manos y las del repique), obsérvelas y responda:

A ¿Hay colonias bacterianas en la placa de “control interno”?

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B. ¿Hay colonias bacterianas en la placa de “control negativo”?

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C. ¿Hay colonias bacterianas en la placa de ¿control positivo?

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D. ¿Qué conclusiones saca de esto?

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E. ¿Hay colonias bacterianas en la placa donde colocó sus dedos sin lavar?

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F ¿Y en la placa en la que colocó sus dedos lavados?

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G ¿Y en la que colocó sus dedos luego de haberlos sumergido en antiséptico? Eventualmente, ¿cuántas hay en cada una? ¿Puede hacer una relación matemática entre ellas?

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H. ¿QUÉ CONCLUSIONES FINALES SACA DE ESTE EXPERIMENTO?

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ACTIVIDAD 2: TOMA DE MUESTRA AMBIENTAL

Pueden obtener muestras de diferentes lugares, para ver si desarrollan o no microorganismos.

Materiales: ➢ Placas de Petri con agar base o 2xYT ➢ Hisopos estériles (los encontraran en tubos, en las respectivas cajas)

Procedimiento:

1. Elegir el lugar de la toma de muestra. 2. Pasar el hisopo estéril por el área elegida. 3. Usar el espacio designado en la placa de Petri para esparcir la muestra tomada. 4. Verificar que la placa esté rotulada acorde al turno y laboratorio. 5. Incubar la muestra en la estufa localizada en el laboratorio 8

NO SE OLVIDE DE ROTULAR LA PLACA IGUAL A LA DE LAVADO DE MANOS

DIVIDA LA PLACA SEGÚN CUANTAS TOMAS REALIZARON CON SU GRUPO Y ESCRIBA DE DONDE OBTUVIERON LA MUESTRA.

ACTIVIDAD 3: REPIQUE DE BACTERIAS EN MEDIOS DE CULTIVO (AISLAMIENTO EN PLACAS).

OBJETIVO GENERAL: Conocer y desarrollar habilidades en el laboratorio bacteriológico.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ➢ Desarrollar los conceptos de medios simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales. ➢ Caracterización de una bacteria a partir de un caldo de cultivo.

Materiales: ➢ Tubos con caldos de cultivo sembrados con bacterias desconocidas. ➢ Placas con medio 2xYT ➢ Ansa ➢ Mechero de Bunsen

Procedimiento: ➢ Encender el mechero de Bunsen y colocarlo en llama de trabajo. ➢ Se quemará el ansa hasta dejarla al rojo y enfriar. ➢ Abrir el tubo y una vez abierto, flamear la boca del tubo (se puede tocar el borde interno del tubo con el ansa, a fin de enfriarla) - EN CASO DE QUE EL ANSA ESTÉ MUY CALIENTE, PODRÍA MATAR A LAS BACTERIAS DE LA MUESTRA EN EL TUBO) ➢ Tomar una gota, volver a flamear el tubo y cerrar. ➢ Una vez realizado esto, tomar la placa y realizar una estría. ➢ Cerrar la placa, quemar el ansa, y tomando parte de la primera estría, realizar una segunda sobre el sector circular adyacente. Cerrar la placa. ➢ Volver a quemar el ansa y enfriarla. Realicar una tercera estría sobre un nuevo sector de la placa tomando parte del anterior. ➢ Repetir la operación una cuarta vez, realizando la última estría hacia el centro de la placa SIN TOCAR LA PRIMERA ESTRÍA. ➢ Incubar en estufa a 37°C. ➢ Se realizará un aislamiento de cada muestra de bacterias.

EXPLIQUE QUÉ HACE EL AYUDANTE EN CADA DIBUJO.

¿Por qué se realizan 4 estrías y no sólo una?

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¿Cuál es la finalidad de realizar el aislamiento en placa?

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¿Conoce alguna otra forma de aislamiento que no sea por estrías?

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RESULTADOS: SE OBSERVARÁN EN EL TRABAJO PRÁCTICO 2.

1. Retire las placas de la estufa. 2. Indique qué observa en cada placa de aislamiento.

3. Complete el siguiente cuadro:

Medio de cultivo Tipo de medio Color Bacterias que desarrollan

ACTIVIDAD 4: OBSERVACIÓN MACROSCOPICA Y MICROSCOPICA DE CULTIVOS DE HONGOS UNICELULARES Y FILAMENTOSOS

OBJETIVO GENERAL: Conocer y desarrollar habilidades en el laboratorio micológico.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

-Recibir información acerca de cómo se sembraron los tubos.

-Obtener muestras de las colonias y procesarlas para su observación al microscopio.

Materiales: ➢ Cultivos de hongos unicelulares y filamentosos. ➢ Portaobjetos y cubreobjetos ➢ Gancho y aguja ➢ Mechero de Bunsen ➢ Colorante azul de metileno al 1%.

Procedimiento:

El ayudante mostrará en primer lugar todos los pasos de la coloración para que luego cada alumno realice la misma secuencia. ➢ En un portaobjetos limpio coloque una gota de azul de metileno. ➢ Encienda un mechero de Bunsen y regúlelo con máxima entrada de aire:

aparecerán dos llamas concéntricas, una pequeña, celeste y “fría” en el centro y otra más pálida y grande, casi invisible, periférica que tiene 1200º. Use esta llama cuando trabaje y cierre la entrada de aire cuando no trabaje de tal forma de obtener una llama amarilla, informe, carbonosa y “fría” que NO se usa para trabajar pero que es muy luminosa, indicando que el mechero está encendido. La llama celeste, por el contrario no se ve, puede producir quemaduras y puede apagarse con facilidad. ➢ Queme la aguja y el gancho (o dos ansas) hasta que estén al rojo y déjelos enfriar

al aire. (EL ANSA Y EL GANCHO SE ESTERILIZAN CON LA LLAMA DEL BUNSEN - NO USAR LA LLAMA AMARILLA) ➢ Abra el cultivo cerca del mechero y tome una muestra SIN ROMPER EL AGAR. ➢ Suspenda el material fúngico en la gota de azul de metileno sobre el portaobjetos

y disgréguelo con el gancho y la aguja (o con el ansa) hasta que se obtenga un material homogéneo.

➢ QUEME EL ANSA Y EL GANCHO DE NUEVO PARA ESTERILIZARLOS

ANTES DE APOYARLOS SOBRE LA MESADA. DE OTRA FORMA CONTAMINARÁ LA MESADA. TENGA PRECAUCIÓN CON ESTE PASO. ➢ Coloque encima un cubreobjetos sobre el preparado y aplástelo suavemente. ➢ Observar al microscopio con los objetivos seco débil y seco fuerte.

EJERCITACIÓN:

1. Esquematice los tubos que recibió y descríbalos brevemente (morfología, color, aspecto). NO SE OLVIDE DE COLOCAR EL NOMBRE DEL HONGO

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2. Esquematice lo que visualiza al microscopio y trate de describir qué es lo que observa: Micelio hialino o pigmentado, tabicado o no, ¿presenta ramificaciones? ¿Y

elementos de fructificación?

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3. Observe otro preparado de sus compañeros y repita la actividad

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TRABAJO PRÁCTICO 2 OBJETIVO GENERAL: Conocer y desarrollar habilidades útiles en la práctica clínica.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ✓ Observar y explicar los fundamentos de las pruebas intradérmicas. ✓ Recordar las partes de la jeringa y los fundamentos de la técnica de intradermorreacción. ✓ Desarrollar los conceptos de antígenos y respuesta inmune. ✓ Explicar los fundamentos del aspirado nasofaríngeo y su utilidad frente al diagnóstico de infecciones virales. ✓ Poder clasificar e identificar parásitos a partir de la observación.

CONSIDERACIONES GENERALES:

Los alumnos al final del TP deberán adquirir el conocimiento de cómo se realiza una intradermorreacción, qué es lo que se observa (respuesta inmune celular) y cuál es la utilidad en la práctica clínica hoy en día: diagnóstico/pronóstico de TBC, HISTOPLASMOSIS, etc.

Aprender cómo se realiza un aspirado nasofaríngeo en un neonato-infante, la importancia de los brotes epidemiológicos estacionales de bronquiolitis y cómo es el procesamiento de la muestra en el laboratorio virológico para arribar a un diagnóstico y abordar posteriormente una conducta médica.

ACTIVIDAD 1: INTRADERMORREACCIÓN. Será realizada entre 2 ayudantes. No por parte de los alumnos.

PREGUNTA PRELIMINAR: ¿Cuál inyección corresponde a cada ángulo?

➢ Practicar la intradermorreacción ○ Explicarle al paciente lo que se le va a hacer ○ luego desinfectar la piel de la cara anterior del antebrazo donde no se vean

venas superficiales con una solución iodada después de haberle preguntado al paciente si es alérgico al iodo.

○ Tomar la ampolla de solución fisiológica y desinfectarle el cuello con un algodón con alcohol iodado.

○ Con el cuello rodeado por el algodón partir la ampolla. ○ Sacar la jeringa con la aguja del estuche. Con la uña del pulgar de la mano

hábil sujetar el cono y con la otra mano traccionar con firmeza pero con cuidado el capuchón.

○ Cargar la jeringa con 0,1 cc de Sn fisiológica (cargar de más ponerla vertical, sacar el aire golpeando en la camisa y ajustar el volumen con el émbolo que previamente debió ser deslizado para arriba y para abajo).

○ Poner el bisel de la aguja mirando hacia el operador y paralelo a las dos “orejitas” que tiene la camisa. (Se sugiere tomar la aguja cargada con el pulgar ya tocando el émbolo, listo para inyectar)

○ Lo que sigue es esencial: con la otra mano rodear por detrás el antebrazo del paciente y traccionar con fuerza estirando la piel.

○ En ese momento apoyar la aguja en 15% y presionar hasta que el orificio de la misma haya entrado por debajo de la epidermis.

○ Inyectar. ○ La aguja se retira y se coloca el algodón con alcohol sobre la punción. Puede

haber un puntito de sangre.

SE HACE CON GUANTES. CADA AYUDANTE DEBERÁ USAR UN PAR.

Descartar las agujas en el descartador ROJO/NEGRO correspondiente. ¡¡NO EN LAS BOLSAS ROJAS!!

PREGUNTAS

1. ¿Cuándo se usa una intradermorreacción en Clínica Médica? ¿En Infectología? ¿En Alergología / Inmunología clínica?

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2. Mencione los antígenos que Usted conozca y para la detección de qué microorganismos se utilizan

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3. ¿Cuál es el resultado esperado de la intradermorreacción?.

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4. ¿Cuál es el mecanismo involucrado en esa respuesta fisiológica del organismo?

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ACTIVIDAD 2: ASPIRADO NASOFARÍNGEO (CON MUÑECOS) ➢ Usando una muñeca se medirá con la sonda k-33 la distancia que hay desde la sien hasta la narina homolateral, formando un ángulo recto. ➢ Se marcará con la uña del dedo pulgar esa distancia y se introducirá lentamente la sonda hasta la marca del dedo. Se colocará una jeringa estéril y se aspirará el moco. Se retirará la sonda y se la colocará justo con la jeringa en la bolsa de la sonda. ➢ Se rotulará y se la enviará al laboratorio de Virología. ➢ El virólogo presionará el émbolo de la jeringa con la punta de la sonda introducida en un tubo cónico, al que luego se le agregarán 2 ml de un buffer (PBS ó buffer de fosfatos), se lo mezclará, se centrifugará a 1500 rpm 10 minutos en centrífuga de mesa, se descartará el sobrenadante, y el sedimento –donde están las células infectadas por el virus- se distribuirá en gotas y por duplicado sobre un portaobjetos con múltiples “pocillos”. ➢ Se dejará secar al aire, se fijará con metanol 15 minutos y en cada par de “pocillos” se agregará un suero primario contra los diferentes virus. ➢ Luego se realizará una inmunofluorescencia indirecta (IFI) para hacer el diagnóstico rápido (se informa en el día). Repasar la técnica de IFI).

Anotar en el esquema del multiwell, como sería el test y cuáles serían los virus a ser diagnosticados.

No se olvide de colocar los controles y pintar IFI positivas y negativas:

ACTIVIDAD 3: HISOPADO DE FAUCES

La actividad consta de tomar una muestra de fauces mediante hisopado y transladarla al laboratorio. Se mostrará la siembra en agar-sangre.

Materiales: ➢ Hisopo estéril individual (los alumnos deben aportarlos) ➢ Placa de Petri con agar sangre

Procedimiento:

Trabajando de a dos alumnos, uno hará de médico y el otro de paciente. Se le deberá explicar al paciente que se le realizará un hisopado faríngeo, para qué sirve y el hecho de que puede sentir una molestia pero no dolor ni complicaciones.

Se hará que el paciente trague saliva, saque la lengua y diga “a”. Se iluminarán las fauces con la luz de un celular y se introducirá el hisopo estéril que trajo el alumno en la boca del paciente, SIN TOCAR LA LENGUA, Y TOCANDO LOS PILARES AMIGDALINOS ROTANDO EL HISOPO Y, SI FUERA POSIBLE, LA PARED POSTERIOR DE LA FARINGE CON LA PUNTA DEL HISOPO.

Se sumergirá el hisopo en el medio de transporte, se rotulará el tubo con el nombre del paciente, el material hisopado, la fecha y la hora de tomada la muestra y se le indicará que lo lleve al laboratorio de Bacteriología. NO REFRIGERAR.

PREGUNTA: ¿Qué precaución tiene que tener el Bacteriólogo con la muestra remitida? ¿Por qué?

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Se procederá al aislamiento en placa con agar sangre, primero desplazando el hisopo en un sector circular de la placa y luego haciendo un aislamiento con el ansa.

EJERCICIO: UNA CON FLECHAS LAS BACTERIAS DE LA COLUMNA IZQUIERDA CON SU PATRÓN DE HEMÓLISIS

Staphylococcus epidermidis Beta-hemólisis

Streptococcus pneumoniae Gamma-hemólisis

Streptococcus pyogenes Alfa- hemólisis

Staphylococcus aureus

NOTA: DESCARTAR LOS HISOPOS EN LA BOLSA ROJA QUE ESTARÁ EN EL LABORATORIO 8.

ACTIVIDAD 4: ANÁLISIS Y OBSERVACIÓN DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN EL TP N°1 DE LOS CULTIVOS EN MEDIOS DIFERENCIALES - COLORACIÓN DE GRAM –

HAY ACTIVIDADES PARA COMPLETAR EN LA SECCIÓN DE LAVADO DE MANOS Y REPIQUE DE CULTIVOS.

1. Observe las placas que sembró y describa lo que ve: forma, tamaño, bordes, aspecto, coloración y número de las colonias que se desarrollaron (no se olvide de llenar las observaciones en la parte de lavado de manos y repique de cultivos).

EN ESTE PUNTO SE MOSTRARÁN MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES Y SELECTIVOS (MacConkey, TSI, Simmons y Chapman) QUE SERÁN DISCUTIDOS JUNTO CON EL AYUDANTE PERO QUE NO SERÁN USADOS PARA REALIZAR COLORACIONES. SON TODAS BACTERIAS PATÓGENAS PRIMARIAS. PRECAUCIÓN.

2. En un portaobjetos limpio coloque una gota de agua de la canilla en el centro.

3. Necesitará un ansa insertada en un mango de Kohler

4. Encienda un mechero de Bunsen y regúlelo con máxima entrada de aire: aparecerán dos llamas concéntricas, una pequeña, celeste y “fría” en el centro y otra más pálida y grande, casi invisible, periférica que tiene 1200° C. Use esta llama cuando trabaje y cierre la entrada de aire cuando no trabaje de tal forma de obtener una llama amarilla, informe, carbonosa y “fría” que NO se usa para trabajar pero que es muy luminosa, indicando que el mechero está encendido. La llama celeste, por el contrario no se ve, puede producir quemaduras y puede apagarse con facilidad.

5. Queme el ansa hasta que esté al rojo y deje enfriar al aire.

6. Abra la placa de Petri cerca del mechero y toque una colonia con el ansa.

7. Suspenda ese material en la gota de agua sobre el portaobjetos y desparrámelo en no más de 1 cm2.

8. QUEME EL ANSA DE NUEVO PARA ESTERILIZARLA ANTES DE APOYARLA SOBRE LA MESADA. DE OTRA FORMA CONTAMINARÁ LA MESADA. PRECAUCIÓN CON ESTE PASO.

9. Tome el preparado con una mano y colóquelo alto sobre la llama del Bunsen controlando que no se caliente demasiado. Esto se hace tocando periódicamente con el preparado el dorso de la otra mano. Con esto se intenta ir deshidratando de a poco el preparado.

10. Cuando está seco páselo 3 veces directamente por la llama del Bunsen (su ayudante le dirá cómo hacerlo). Acaba de hacer la “fijación” del preparado.

11. Coloque el portaobjetos sobre el soporte y realice una coloración de Gram.

COLORACIÓN DE GRAM

El ayudante explicará cómo son los pasos de la tinción de Gram.

Luego, cada alumno realizará una coloración.

-Tome la muestra sobre un portaobjetos limpio, haga una suspensión de la colonia bacteriana en una gota de agua, deshidrate alto en la llama del Bunsen y fije el preparado pasándolo 3 veces directamente sobre la llama.

-Vierta sobre el preparado unas gotas de violeta de Genciana (o Cristal Violeta), 1 minuto.

-Escurra SIN LAVAR el colorante en el cristalizador con soporte.

-Agregue unas gotas de reactivo de Lugol (solución acuosa de Iodo más Ioduro de potasio) 1 minuto.

-ALEJADO DEL MECHERO DE BUNSEN (EN OTRA MESDADA) LAVE CON ALCOHOL. TENGA EXTREMA PRECAUCIÓN EN ESTE PASO. LO HARÁ SOLAMENTE ACOMPAÑADO DEL AYUDANTE. PELIGRO DE QUEMADURAS E INCENDIO.

-Lave con agua de la canilla.

-Cubra el preparado con el colorante de contraste (Safranina acuosa o fucsina fenicada de Ziehl diluída). 1 minuto.

-deshidrate de nuevo el preparado, colocándolo alto sobre la llama del Bunsen sin que le queme la mano. NO VUELVA A FIJAR EL PREPARADO CON LA LLAMA. SÓLO DESHIDRATE.

-Cuando esté COMPLETAMENTE seco, colóquele una gota de aceite de inmersión y observe el preparado al microscopio. Tiene que saber reconocer 3 cosas:

1. Forma de las bacterias (bacilos o cocos).

2. Si son Gram positivas (tomaron el colorante violeta) o Gram negativas (se tiñeron de rosa o rojo).

3. Agrupación (en cadenas, en racimos, de a 4 o en cubos).

1.

USO DEL MICROSCOPIO CON ACEITE DE INMERSIÓN

En ese momento su ayudante le hará repasar las partes del microscopio, la limpieza de las lentes y le enseñará los fundamentos de la técnica de inmersión, que es como sigue:

1. Reconozca en el revólver del microscopio el objetivo de inmersión (tiene, en general, una banda negra, es de 100 X y dice “Oil” ú “Oel”).

2. Use la linterna del celular como la lámpara del microscopio y coloque el preparado con el aceite en la platina.

3. Mirando de costado desplace el tubo del microscopio hasta que el objetivo de inmersión toque la gota de aceite.

4. CON MUCHO CUIDADO (para no romper el preparado ni dañar la lente frontal del

objetivo), bájelo aún más, hasta que toque la cara superior del portaobjetos.

5. Observe por el ocular y lentamente, con el tornillo micrométrico, vaya levantando el tubo hasta observar una imagen nítida.

EJERCICIO: Describa si los microorganismos que ve son bacilos o cocos, la coloración de Gram y cómo están agrupados, si en racimos, cadenas, en fila, de a 4 o en cubos.

DIBUJE EN EL CÍRCULO LO QUE VEA AL MICROSCOPIO

ACTIVIDAD 5: RONDÍN DE PARÁSITOS

Estarán dispuestos por los laboratorios los preparados de parásitos enumerados:

1 2 3 4

5

6 7 8

9

10 11 12

13

14 15 16

17

18 19 20

21 22 23 24

25

26

27 28

NOTA: Tendrá un minuto para poder visualizar y anotar la respuesta que usted crea, luego se hará una puesta común y se analizarán los resultados.

ANEXO:

HOJA A ENTREGAR AL FINALIZAR EL DIA 1 DE TRABAJOS PRÁCTICOS

LA ENTREGA DE ESTAS HOJAS ES EXCLUYENTE PARA OBTENER LA REGULARIDAD DE LA MATERIA DADO QUE CERTIFICAN LA ASISTENCIA A LOS TRABAJOS PRÁCTICOS.

NOMBRE y APELLIDO ________________________________________________

LU _______________________________ TURNO _____________________________

1. ¿De qué lugar tomó la muestra en la actividad “toma de muestras ambientales”?

__________________________________________________________________________

2. ¿En qué colorante realizó una suspensión de hongos para ser visualizados en el microscopio?

__________________________________________________________________________

3. Describa brevemente CON SUS PALABRAS los pasos del experimento de lavado de manos:

_______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4 ¿Qué medidas de seguridad utilizó el primer día de los trabajos prácticos?

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

ENCUESTA DE EVALUACIÓN DE LA CÁTEDRA PARTE 1

TURNO _____________________ DOCENTE A CARGO DEL SEMINARIO: _____________________________

AYUDANTES ____________________________________________________

Pedimos que respondan a conciencia, con el máximo de veracidad, a fin de mejorar las actividades docentes de la Segunda Cátedra de Microbiología. Por lo tanto no hay necesidad de escribir su nombre en esa hoja, ya que la encuesta puede ser anónima.

¿Cuantas materias está cursando en ese cuatrimestre? (Contando Microbiología)

( ) 1 ( ) 2 ( ) 3 ( ) 4 ( ) 5

¿Recursa la materia? ( ) NO

( ) SI (la curse la primera vez en la Cátedra1) ( ) SI (curse la primera vez en la Cátedra 2)

Asistió a las clases teóricas? ( )SI (a la mayor parte de ellas) ( ) NO

Si no asistió, ¿por qué causa fue? ( ) El horario no me lo permitía (trabajo o curso)

( ) No quise

¿Pudo acceder a las grabaciones de las clases teóricas?

( ) SI ( ) NO ( ) Desconocía las grabaciones

¿Pudo responder a las preguntas del examen parcial referentes a las clases teóricas?

( ) SI ( ) NO ( ) No sé cuáles eran.

En relación a los seminarios, la información brindada era:

( ) Poca ( ) Innecesaria ( ) Repetitiva ( ) Útil ( ) Muy útil

La disposición (didáctica y capacidad de responder dudas) del docente a cargo de los seminarios fue:

( )Pésima ( )Mala ( )Regular ( )Buena ( )Muy buena

¿Qué material utilizó como bibliografía?

( )Libros ( )Apuntes ( )Notas de clases ( )Internet

HOJA A ENTREGAR AL FINALIZAR EL 2º DÍA DE LOS TRABAJOS PRÁCTICOS

LA ENTREGA DE ESAS HOJAS ES EXCLUYENTE PARA OBTENER LA REGULARIDAD DE LA MATERIA, YA QUE CERTIFICA LA ASISTENCIA A LOS TRABAJOS PRÁCTICOS.

NOMBRE y APELLIDO ________________________________________________

LU _______________________________ TURNO _____________________________

1 ¿En cuál de las placas del lavado de manos crecieron más colonias?

__________________________________________________________________________

2 ¿Cuál era el parásito en el lugar 11 del rondín?

__________________________________________________________________________

3 ¿Con qué sustancia se realizó la intradermorreacción? Cuál es su uso en la clínica?

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

4 ¿Hasta qué edad se realiza un aspirado nasofaríngeo para diagnosticar una bronquiolitis?

___________________________________________________________________________

5 ¿Que reconoció al microscopio en la tinción de Gram? ¿Qué usó para tener un mayor aumento con el microscopio?__________________________________________________________________________________________________________________________________________

ENCUESTA DE EVALUACIÓN DE LA CÁTEDRA PARTE 2

TURNO _____________________ DOCENTE A CARGO DE LOS SEMINARIOS: _____________________________

AYUDANTES ____________________________________________________

Pedimos que respondan a conciencia, con el máximo de veracidad, a fin de mejorar las actividades docentes de la Segunda Cátedra de Microbiología. Por lo tanto no hay la necesidad de poner su nombre en esta hoja.

Sobre los ayudantes y las tutorías

¿Le fueron útiles las tutorías para entender mejor la materia y resolver dudas?

( ) Poco ( )Eran repetitivas ( ) Fueron útiles ( ) Fueron muy útiles.

Las preguntas y los casos clínicos vistos en las tutorías fueron:

( ) Relevantes y ayudaban a entender la materia ( ) No entendí para qué servían

¿Los ayudantes lograron responder las dudas satisfactoriamente y sumar temas durante las tutorias?

( ) SI ( ) NO

¿El primer examen parcial fue acorde a los temas vistos en la cursada?

( ) SI ( ) NO

¿Recomendaría la cursada a otros compañeros?

( ) SI ( ) NO

Cualquiera haya sido su respuesta, ¿Por qué?

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

¿Pretende cursar MICROBIOLOGÍA 2 en la II Cátedra?

( ) SI ( ) NO

Deje sus observaciones (críticas, comentarios, sugerencias) sobre los contenidos de la cursada abarcados en seminarios, clases teóricas, tutorías y trabajos prácticos.

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Gracias.