UNIVERSIDAD DEL VALLE FACULTAD DE INGENIERIAS

ESCUELA DE INGENIERIA DE ALIMENTOS

PLAN DE ESTUDIOS: Tecnología en Alimentos ASIGNATURA: Microbiología de alimentos GUIA DE LABORATORIO: 3. ANALISIS MICROBIOLOGICO DE ALIMENTOS

INTRODUCCIÓN

La investigación sobre los productos alimenticios requiere especial atención para detectar

aquellos microorganismos que los deterioran o que son patógenos para el consumidor. El

examen microbiológico permite obtener pautas para el establecimiento de normas de

higiene aplicables durante la producción, así como métodos eficaces de conservación. Microorganismos indicadores: Este término se aplica a cualquier grupo taxonómico,

fisiológico o ecológico de microorganismos cuya presencia proporcione evidencia indirecta

de que los alimentos estuvieron expuestos a condiciones que pudieron determinar la llegada de microorganismos peligrosos o permitir la proliferación de especies patógenas o

toxigénicas. Los organismos patógenos son de gran utilidad tanto para determinar la

calidad bacteriológica de los alimentos como la garantía que ofrecen al consumidor. Escherichia coli y coliformes: Son organismos que habitan en el tracto digestivo del hombre y otros animales. Su presencia en un alimento indica contaminación directa o

indirecta de origen fecal. La presencia de E. coli advierte el riesgo de que pudieran estar presentes bacterias patógenas entéricas, entre ellas algunas de los géneros Salmonella, Shiguella y Vibrio; así como virus entéricos y parásitos diversos. Los otros coliformes (especies de varios géneros de la familia Enterobacteriaceae), son

buenos indicadores de limpieza y desinfección inadecuadas, o de una manipulación o

tratamiento incorrecto de los alimentos. La presencia de niveles altos de coliformes en un alimento tratado, no indica necesariamente un contacto inmediato con heces o con superficies contaminadas con heces. Indica que pudieron existir circunstancias favorecedoras de la multiplicación de estos microorganismos introducidos probablemente

por deficiente limpieza o desinfección. Streptococcus salivarus Se ha utilizado como indicador de contaminación oral, debido a

que está casi siempre presente en la boca humana. Staphylococcus aureus, Su presencia se interpreta como contaminación proveniente de la

piel, la boca o las fosas nasales de los manipuladores. Clostridium botulinum y Clostridium perfringens: La presencia de esporas en alimentos enlatados no ácidos, es señal de que posiblemente el tratamiento térmico fue insuficiente.

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OBJETIVOS

Determinar la calidad del producto alimenticio en términos de contaminación microbiana. MATERIALES

Muestra de alimentos 12 Cajas de petri esterilizadas. 4 Pipetas esterilizadas. 1 Frasco con 90 mL de agua peptonada. 120 mL de Agar cuenta gérmenes fundido 2 Tubos de ensayo con 9 mL de agua peptonada. 9 Tubos de ensayo con 10 mL de caldo LSMUG. Mechero. Gradilla para tubos. Reactivo de Kovac's. PROCEDIMIENTO

1. Dilución de la muestra de alimento.

1. Comenzar el trabajo lo más pronto posible. Se preparan diluciones del alimento

10-1 a 10-3. 2. La dilución 10

-1 se prepara pesando 10 gramos de la muestra, que se vierte asépticamente en un frasco con 90 mL de diluyente (agua peptonada).

3. La dilución así preparada se vierte luego en una bolsa plástica y se lleva al

stomaker (homogenizador) para obtener fragmentos muy pequeños.

4. Transferir luego mL de la dilución 10-1 a un tubo que contenga 9 mL de diluyente

para obtener la dilución 10-2

5. Transferir 1 mL de la dilución 10-2 a un tubo con 9 mL de diluyente para obtener la

dilución 10-3

6. Cada dilución sucesiva disminuirá 10 veces la concentración. No olvide marcar

convenientemente los tubos. 2. Recuento de Mesófilos. (Agar cuenta gérmenes)

Su presencia puede reflejar deficiencias en el proceso de elaboración y contaminación en

la manipulación durante el empaque.

1. Tomar 1 mL de las diluciones (10-1 a 10-3) transfiéralos a cajas de petri vacías

estériles y previamente marcadas por duplicado. 2. Inmediatamente adicione el agar cuenta gérmenes fundido. 3. Mezcle el inóculo con el medio fundido, moviendo suavemente la caja hacia arriba,

hacia abajo y en forma circular. 4. Deje solidificar el agar. 5. Invierta e incube las cajas de petri a 37 °C durante 24 horas. 6. Pasado este tiempo, cuente las colonias que hayan crecido en las cajas.

2.1 Lectura de resultados:

Seleccione las cajas de la misma dilución que tengan entre 30 y 300 colonias. Cuente el

número de colonias de ambas cajas, haga promedio aritmético y multiplique por el reciproco de la dilución leída. Los resultados se deben expresar con 2 dígitos y el resto en potencia de 10. Ej: Si el recuento se realiza en una dilución 10

-2 y fue de 148 colonias, el tercer dígito por

ser mayor a 5 se aproxima al siguiente número, o sea que el recuento sería 150x102, se

expresa mejor como 15x103. Si el recuento fue 234, por ser el tercer dígito menor que 5, se anula y se expresa: 230x102, o mejor 23x103. Reporte el recuento de microorganismos mesófilos como Unidades Formadoras de Colonia (UFC) por gramo o mililitro según el tipo de muestra

analizada. Cuando el recuento se utiliza para determinar la aceptación de un alimento, se compara

con los valores límites establecidos según la normatividad del Ministerio de Salud, del

INVIMA o las Normas Icontec. 3. Número más probable de coliformes totales y fecales:

3.1 Prueba para coliformes totales. Pipetee 1 mL de cada una de las diluciones (10-1 a 10-3) en tubos con Caldo Lauryl sulfato MUG, utilizando 3 tubos por dilución. Incube los tubos a 35±2°C por 24-48 horas. Pasadas las 24-48 horas, anote como positivos los tubos que muestren turbiedad y producción de gas, que se puede observar por el desplazamiento del tubo de Durham. 3.2 Prueba para coliformes fecales

Esta prueba se realiza después de pasado el tiempo de incubación. Para su determinación se adicionan 2-3 gotas del reactivo de Kovac�s a los tubos positivos para coliformes totales, este reactivo permite revelar la presencia del indol, que se produce a consecuencia del crecimiento de este grupo de bacterias, anote como positivos aquellos tubos que formen un anillo rosado salmón en la superficie. 3.3 Interpretación de los resultados.

Leer la tabla del NMP (Número Más Probable), para saber el resultado de acuerdo con el

número de tubos positivos, tanto para los coliformes totales, como para los coliformes fecales. Ver Tabla 1. 4. Recuento total de mohos y levaduras

1. Tomar 1 mL de las diluciones (10-1 a 10-3) transfiéralos a cajas de petri vacías

estériles y previamente marcadas por duplicado. 2. Inmediatamente adicione el agar Base Ogye. 3. Mezcle el inóculo con el medio fundido, moviendo suavemente la caja hacia arriba,

hacia abajo y en forma circular. 4. Deje solidificar el agar. 5. Invierta e incube las cajas de petri a 25 °C durante 3 a 5 días. 6. Pasado este tiempo, cuente las colonias que hayan crecido en las cajas

4.1 Lectura de resultados

Seleccione las cajas de la misma dilución que tengan entre 10 y 100 colonias. Cuente el

número de colonias de ambas cajas, haga promedio aritmético y multiplique por el reciproco de la dilución leída. Los resultados se deben expresar con 2 dígitos y el resto en potencia de 10. Reporte como recuento de mohos y levaduras en Unidades Formadoras de Colonia (UFC) por gramo o mililitro según el tipo de muestra analizada

CUESTIONARIO:

¿Cuál es el fundamento de las diferentes pruebas que se han realizado?. ¿Cuáles son los componentes de cada uno de los medios de cultivo y porqué se utilizan? ¿Qué importancia tienen los tipos de microorganismos analizados en la calidad de los

alimentos? Tabla 1. Número Más Probable (NMP) por g/mL de muestra, usando tres tubos de

0.1, 0.01 y 0.001 g/mL

Numero de Tubos

positivos Numero de Tubos

positivos Numero de Tubos

positivos Numero de Tubos

positivos 0.1 0.01 0.001 NMP 0.1 0.01 0.001 NMP 0.1 0.01 0.001 NMP 0.1 0.01 0.001 NMP 0 0 0 3 1 0 0 3.6 2 0 0 9.1 3 0 0 23 0 0 1 3 1 0 1 7.2 2 0 1 14 3 0 1 39 0 0 2 6 1 0 2 11 2 0 2 20 3 0 2 64 0 0 3 9 1 0 3 15 2 0 3 26 3 0 3 95 0 1 0 3 1 1 0 7.3 2 1 0 15 3 1 0 43 0 1 1 6.1 1 1 1 11 2 1 1 20 3 1 1 75 0 1 2 9.2 1 1 2 15 2 1 2 27 3 1 2 120 0 1 3 12 1 1 3 19 2 1 3 34 3 1 3 160 0 2 0 6.2 1 2 0 11 2 2 0 21 3 2 0 93 0 2 1 9.3 1 2 1 15 2 2 1 28 3 2 1 150 0 2 2 12 1 2 2 20 2 2 2 35 3 2 2 210 0 2 3 16 1 2 3 24 2 2 3 42 3 2 3 290 0 3 0 9.4 1 3 0 16 2 3 0 29 3 3 0 240 0 3 1 13 1 3 1 20 2 3 1 36 3 3 1 460 0 3 2 16 1 3 2 24 2 3 2 44 3 3 2 1100 0 3 3 19 1 3 3 29 2 3 3 53 3 3 3 1100