Genotipos y fenotipos en enfermedades con defectos en la reparación del daño al DNA

Graciela Spivak

Biology Department, Stanford University, Stanford CA 94305, USA

gspivak@stanford.edu

Ejemplos de enfermedades hereditarias con defectos en reparación del DNA

G. Spivak©

Ejemplos de genes de reparación del DNA cuyas mutacionescausan enfermedades en humanos

G. Spivak©

Clinical features XP CS TTD UVSS

Dermatological:

Quemaduras de sol agudas + + +/– +

Telangiectasia + + +/– +

Pecas + –/+ +/– +

Tumores de piel + – – –

Other organs & systems:

Anormalidades oculares – + + –

Defectos neurologicos + + + –

Reflejos anormales + + – –

Inmadurez sexual + + + –

Enanismo caquectico – + + –

Defectos oseos, osteoporosis – + + –

Defectos del pelo, uñas – – + –

Xeroderma pigmentosum (XP) Síndrome de Cockayne (CS)

Síndrome UV-sensitivo (UVSS) Tricotiodistrofia (TTD)

Enfermedades Humanas con defectos en NER

G. Spivak©

La mielina forma la sustancia blanca. Es un

fosfolípido que aisla los axones, incrementando la

velocidad de los impulsos eléctricos.

Dismielinización (mielina anormal) occurre en CS,

TTD y en el síndrome autoinmune Aicardi-Goutières.

sustancia blanca sustancia gris

Las células neurales forman la sustancia gris.

La pérdida de neuronas en NER-deficiente XP

puede ser causada por acumulación de lesiones en

el DNA, como la purinas cíclicas y productos de la

peroxidación de lípidos, reparados por NER.

Neurodegeneración en XP puede ser debida a

defectos en NER.

Neurodegeneración en CS no es debida a

defectos en la reparación del DNA por NER.

Causas de neurodegeneración

XERODERMA PIGMENTOSUM (XP)

Group GGR TCR Protein function

A – – Verification

B – – TFIIH helicase, ATPase

C – + Recognition, initial opening of the strands (complex

with hRAD23b, centrin1)

D – – TFIIH helicase

E – + Recognition

F – – Endonuclease (complex with ERCC1)

G – – Endonuclease, stabilizes TFIIH

Variant + + Translesion DNA polymerase

• Fotosensitividad elevada o severa

• Piel reseca, tipo pergamino

• Muy alta incidencia de cancer de piel, ojos, punta de la lengua

• Incidencia elevada de tumores internos

• ~20 % de los pacientes sufren degeneración neurológica progresiva

XP

clá

sic

a

Fenotipos en pacientes con XP

La severidad depende de:

• La mutación(s) (homocigótica or heterocigótica, dominioy/o función afectada)

• El contexto genético:– Sistema inmune– Capacidad antioxidante

• El medio ambiente (protección solar, polución, etc.)

Mutaciones en XPD, una helicasa en el complejo TFIIH

(mapa cortesia de Miria Stefanini)

XP32NH2

arg616glnXP32NH1

Mutaciones del codón 683

causan solo XP, y afectan

al 80% de los pacientes

XP-D

Mutaciones del codón 616

resultan en proteina

inactiva; homocigotas son

probablemente letales.

El fenotipo de los

heterocigotas depende del

otro alelo.

Pacientes XP-D con mutaciones R683Q (ArgGln) y síntomas ligeros

XP32NHheterocigotaR683Q/R616Q

XP62TA, XP32TA, XP29TAhomocigotas R683Q

Quemaduras de sol & pigmentación;No/poco cancerNo/tardía neuropatía

Falik-Zaccai et al., Environmental Molecular Mutagenesis, 53:505-514, 2012

a b

d ec

proteina inactiva

Pacientes XP-D con mutaciones R683W (ArgTrp) en un alelo

AS552 & AS553R683W/I455del (–1 aa)BSC, melanoma, neurodegeneración, fallecidos a 35 & 39 años.

XP29BER683W/Q542X (truncado)>300 canceres de piel, neurodegeneration, muerte a los 37 años.

XP34BE, XP35BER683W/199insPP (+2 aa)Protección solar: pigmentación mínimaFunción neural normal

Figure 1

3’ 5’

RPA

XPF

XPC-HR23B-Centrin

XPE (DDB2)

TFIIH

XPA

XPG

RNA

RNAPII

CSACSB UVSSA

XAB2TFIIS

Síntesis reparativa, ligado

GGR TCR

TFIIH

USP7

p300 HMGN1

XPB XPDXeroderma

pigmentosum

ERCC1

Síndrome de Cockayne

Criterios requeridos para el diagnóstico:

Falta de crecimiento, baja estatura (<5to percentil)

Disfunción neurológica progresiva, leucodistrofia

(degeneración progresiva de la sustancia blanca)

Microcefalia

Criterios adicionales (por lo menos 5):

Sensibilidad a la luz solar, quemaduras

Neuropatía periferal desmielinizante

Retinopatía pigmentaria y/o cataratas

Pérdida del oído sensorineural

Enanismo caquéctico

Ojos hundidos

Postura encorvada

Progeria (envejecimiento prematuro)

Corta vida

Otros síntomas: Defectos del andar, contracturas, espasticidad, temblores

Caries dentales

Defectos de circulación (manos y pies fríos), temperatura corporal baja

Problemas alimentarios - Dormir con ojos abiertos

Calcificaciones en los ganglios basales

Anormalidades del hígado; enzimas hepáticas elevadas

Hipertensión - picazón severa - osteoporosis - hiper-reflexia

Ian - falleció a los 5 años

Brandon - falleció a los 6 años

La clasificación en CS depende de los síntomas clínicos:

Desarrollo Comienzo

Prenatal síntomas Progreso Supervivencia

•CS tipo I normal primer año mediano 10-20 años

•CS tipo II anormal inmediato rápido < 7 años

•CS tipo III normal tardío lento >30 años

Grupos de complementación:

•CS-A

•CS-B

•XPB-CS

•XPD-CS Aspecto combinado de CS y XP

•XPG-CS

•XPF-CS

•ERCC1

Mutaciones en CSA o CSB pueden resultar en CS tipos I, II o III

No hay diferencias fenotípicas entre pacientes de

CS con mutaciones en CSA o en CSB

3’ 5’

RPA

XPF

XPC-HR23B-Centrin

XPE (DDB2)

TFIIH

XPA

XPG

RNA

RNAPII

CSACSB UVSSA

XAB2TFIIS

Síntesis reparativa, ligado

GGR TCR

TFIIH

USP7

p300 HMGN1

XPB XPDCockayne

syndrome

ERCC1

Tricotiodistrofia Síntomas similares a CS

Diagnóstico:• Pelo quebradizo, deficiente en

azufre

• La microscopía polarizada

muestra bandas alternadas (cola

de tigre)

• Estructura anormal de la hebra

capilar

Grupos de complementación:

• XPB

• XPD

• TTD-A

• TTDN1

• ?

• ?

fotosensibles, NER–

componentes de TFIIH

no fotosensibles, NER+

función desconocida

Adaptado de K. H. Kraemer et al., Neuroscience 145:1388-1396 (2007)

3’ 5’

RPA

XPF-ERCC1

XPC-HR23B-Centrin

XPE (DDB2)

TFIIH

XPA

XPG

RNA

RNAPII

CSACSB UVSSA

XAB2TFIIS

Síntesis reparativa, ligado

GGR TCR

TFIIH

USP7

p300 HMGN1

XPB XPDTricotiodistrofia

TTDA

Síndrome UV-sensitivo

G. Spivak©

8 pacientes 6 Japoneses

1 Israelita

1 Frances

3 grupos de complementación UVSS-A: mutados en KIAA1530 (UVSSA)

UVSS-CSB: mutados en CSB (ERCC6)

UVSS-CSA: mutados en CSA (ERCC8)

Características:

Quemaduras de sol severas

Hiperpigmentación en areas expuestas al sol

Neurología y desarrollo normales

NO cancer

3’ 5’

RPA

XPF-ERCC1

XPC-HR23B-Centrin

XPE (DDB2)

TFIIH

XPA

XPG

RNA

RNAPII

CSACSB UVSSA

XAB2TFIIS

GGR TCR

TFIIH

USP7

p300 HMGN1

XPB XPDSíndrome

UV-sensitivo

Síntesis reparativa, ligado

¿Por qué los pacientes con CS o UVSS son sensitivos a la luz solar pero no son propensos al

cáncer?

• La falta de TCR causa muerte celular por apoptosis

• Las células que sobreviven poseen GGR normal: pocas mutaciones

Por contraste, en pacientes con xerodermapigmentosa:

• GGR es deficiente: las células sobrevivientes adquieren muchasmutaciones que pueden resultar en cáncer.

G. Spivak©

XP / T

TD

Xerodermapigmentosum

Xerodermapigmentosum with

neurological anormalities

XP / CS

Tricothiodistrophy

Cock

ayne

Synd

rome

UVSS

COFS

Synd

rome

XPA

XPC

XPF

XPE

XPV

XPG

CSA

TTD-A

Adapted from K. H. Kraemer et al., Neuroscience 145:1388-1396 (2007)

UVSSA

Genes y síndromes

TTDN1

?

?

?

XPB

CSA

CSB

KIAA1530???

Cockayne syndrome

UV-sensitive syndrome

XPD

XPG

XPF

ERCC1

lesión

RNAPIIo

mRNA

RNAPIIa

promotor

CSB

CSB

2. Elongación

CSB

CSB

3. Recluta CSA

ubiquitinación de RNAPII

esencial para TCR

P

CSB participa en muchas funciones celulares

nucleosoma

1. Restorar RNAPII competente para

iniciación

4. Remodelador de cromatina

CSA

CSB

5. Localización nucleolar,

transcripción de rDNA por RNAPI

6. Estimulación de BER

7. Reparación de complejos topo I-DNA

8. Mitocondrias

Ub

DSC COFS

CS

CSCS

CS

CSCS

CS

CSCS

CS CS

CS

CS

CS

UVSS

CS

C-terminusN-terminus

CS

CS*

CS**

CS**

UVS1KO, CS3AM: C308 G308 = stop codon 77

KPSX6 (mild, adult-onset): 304-307 stop codon 82

CS548VI, CS539VI (severe): promoter, intron 1

CS*

CS**

>71 mutaciones identificadas en CSB

UVSS

No proteina CSB

CS

Laugel et al., Human Mutation 2009; http://www.umd.be/CSB/

Known mutations in the CSA gene

CS type II (severe)CS type I (moderate)

UVSS

CS, type not determined

Laugel et al., Human Mutation 2009; http://www.umd.be/CSA/

Mutations in CSA can cause UVSS: UVSS1VI

Age 8

Age 13

Nardo, Oneda, Spivak, Vaz, Mortier, Thomas, Orioli, Laugel, Stary,

Hanawalt, Sarasin and Stefanini, 2009, PNAS 106:6209-6214

WD 1 WD 2 WD 3 WD 4 WD 5 WD 6 WD 7

GHYKTVDCCVFQSNFQELYSGSRDCNILAWV

GHYKTVDCCVFQSNFQELYSGSRDCNILACV

CSA es una proteina de motivos WD-repeat

La paciente UVS1VI es homocigótica

para la transversión G->T, que resulta

en la substitución trp (W) to cys (C) en

el séptimo motivo WD-repeat.

Ejemplo de una hélice de 7 paletas

típica de proteinas de WD-repeat

(W: tryptofano; D: acido aspartico).

Cada motivo repetido forma una paleta

que puede contactar otras proteinas.

Ciertas mutaciones afectan la función de CSA o CSB en TCR de

lesiones causadas por la radiación UV y aductos abultados,

pero ambas proteínas juegan un papel adicional y separable que

determina el fenotipo.

Conclusiones

G. Spivak©

G. Spivak©

A qué se deben las diferencias fenotípicas entre CS y UVSS?

Respuestas celulares a la UV

Spivak et al., DNA Repair 2006

normal XPA, B, XPC, CS UVSS

D, F, G E

Supervivencia + - - - -

NER global + - - + +

TCR de fotolesiones + - + - -

Supervivencia al daño oxidativo

0.1

1

10

100

0 5 10 15 20

% S

urviva

l

KBrO3, mM

0.1

1

10

100

0 25 50 75 100

% S

urviva

l

Menadione, microM

Normal

Normal

WTUVSS

CS-A

CS-ACS-B

UVSS

WT

Reactivación en células huéspedes

b-galactosidasa

pCMVb

24-48 h

lacZ

Luz UV

G. Spivak©

Tratamientos

químicos

REACTIVACIÓN EN CÉLULAS HUÉSPEDES

Lesiones/4.5kb gen lacZ

0 1 2 3 4

Tg

0 2 4 6 8

8-oxoG

0 5 10 15 20

sitios AP

0 5 10 15 20

SSB

0 10 20 301

10

100

UV (CPD)

Normal

UVSS

CS-B

CS-A

% a

cti

vid

ad

b-g

ala

cto

sid

asa

G. Spivak©

Respuestas celulares a la UV

Spivak et al., DNA Repair 2006

normal CS UVSS

Supervivencia + - -NER global + + +

TCR de fotolesiones + - -

Reactiv. cél. huésp. UV + - -

Respuestas celulares al daño oxidativo

Supervivencia + - +

Reactiv. cél. huésp. oxid. + - +

Hipótesis:

•Las células de CS son deficientes en el procesamiento de lesiones

oxidativas en las cadenas de DNA transcriptas.

•Durante períodos de actividad metabólica

intensa, la generación de lesiones oxidativas

resulta en muerte celular masiva, creando

deficiencias en tejidos y órganos esenciales.

•Las células de UVSS poseen mecanismos normales para transcribir genes

que contienen lesiones oxidativas.

Incremento en

apoptosis

durante el

desarrollo?

¿Por qué los pacientes con CS tienen problemas neurológicos o de desarrollo?

¿Por qué los pacientes con UVSS no los tienen?

G. Spivak©

Tratamiento con

glicosilasas:

hOGG1

Tratamiento

alcalino y

electroforesis

Hibridización con

sondas fluorescentes,

teñido del DNA con

DAPI

Reparación

Ensayo Cometa-FISH

Células embebidas en

agarosa son colocadas

en láminas y lisadas

Células vivas de

cultivos o tejidos

cabeza cola

DNA

lesionado(KBrO3)

Hibridación con sondas para las puntas de la cadena inferior de la secuencia analizada.

Sondas del alelo azul aparecen en sitios adyacentes la secuencia está intacta.

Sondas del alelo marrón están separadas la secuencia contiene una o mas rupturas.

MAR

Localizacion de sondas FISH en Cometas

A B

C D

E F G

Un alelo de ATM tiene rota la cadena transcripta

10 mm

Reparación de 8-oxoG acoplada a la transcripción y global

Repair Time (Hr)

Normal CSB

Repair Time (Hr)

UVSSA

Repair Time (Hr) Repair Time (Hr)

WT with α-Amanitin

TCR – ATM gene

Non-transcribed strand

Transcribed strand

Fibroblastos humanos expuestos a 50 mM KBrO3 por una hora

Normal CSB

Repair Time (Hr) Repair Time (Hr)

UVSSA WT with α-Amanitin

Repair Time (Hr) Repair Time (Hr)

GGR

With OGG1

Without OGG1

Enzimas necesarias para la TCR de 8-oxoG

Repair Time (Hr)

Normal OGG1 Knockdown

Repair Time (Hr)

TCR – ATM gene

Non-transcribed strand

Transcribed strand

Repair Time (Hr)

XPA

Normal

Repair Time (Hr) Repair Time (Hr)

GGR

With OGG1

Without OGG1

OGG1 Knockdown XPA

Repair Time (Hr)

Modelo: conversación entre caminos de reparación

reparaciónglobal via BER

hOGG1 glycosilasa

AP endonucleasa, dRpaae

sitio AP

mella de 1 nucleótido

8-oxoG

Modelo: conversación entre caminos de reparación

genomic repair via BER

Reclutamiento de factores de TCR

RNAP removida o retrocede;reclutamiento de factores de NER

reparación completatranscripción continúa

RNAPII

CSACSB UVSSAXAB2TFIIS

USP7

p300HMGN1

RPA

TFIIH

XPA

XPF-ERCC1 XPG

Transcripciónbloqueada

hOGG1 glycosylase

AP endonuclease, dRpase

AP site

single nucleotide gap

8-oxoG✖

✖

✖

1. Diferencias en TCR de lesiones oxidativas

2. Diferencias en traspaso de lesiones oxidativas por las

RNAP

3. Diferencias en funcionamiento de las mitocondrias

G. Spivak©

A qué se deben las diferencias fenotípicas entre CS y

UVSS?

A qué se debe la hipersensibilidad de CS a la

oxidación?

600

400

200

Control MB + VL

0 1 2 3 10 0 1 2 3 10

RO

Transcripción en vitro

Time,

minutes

EcoRI

AdMLP

HindIII

Run off

productos

troncados

RNA 630 nt

+ extracto nuclear de HeLa

+ NTPs

+ 32P-CTP

azul de metileno

luz visible

8-oxoG

Funciones de CSA y CSB en mitocondrias

mitofagia = autofagia de mitocondrias

control de calidad por eliminación de organelas envejecidas o dañadas

proteinas

agregadasneurodegeneración

Síntomas de deficiencia mitocondrial:

Enanismo, atrofia cerebral y cerebelar, neuropatía periferal,

leucodistrofia, sordera, ataxia, temblores, cataratas, etc.

G. Spivak©

A qué se deben las diferencias fenotípicas entre CS y

UVSS?

1. Traspaso por polimerasas de RNA

2. Función, estructura y autofagia de mitocondrias

Lineas de investigación: