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UNIVERS]DAD DE EL SALVADORFACULTAD DE CIENCTAS AGRONOMCAS

DEPARTAMENTO DE PROTECCION VEGETALMICROBIOLOGA ANIMAL\

..clcLo I- 2014

. INTERPRETACIN Y FUNDAMENTO DE TAS PRUEBAS PARAIDENTIFICACIN DE BACTERTAS

Licda: , Rosmerv Erroa

En esquema, la realizacin de una prueba boqumca implca:

1) Cultvar el mcroorgansmo que se investiga en un medio que contiene undeterminado sustrato o inhlbdor y luego de la incubacin vlsullzar el crecimlento y ladegradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agrgado de.unreactivo revelador de la pfesencia del sustrator o de algtin producto de su degradacin.

2) cultivaf el microorganismo en un medio de propagacin gue contenga el sustratode una enzima induclble y luego de la incubacin demostrar la activldad enzlmuca.

En todos los casos se debe tener un cultlvo fresco (18-24 hrs. de ncubacin) en unmedio en que el microorganismo se desanolla en forma ptima, a pH, atmsfera ytemperatura adecuados

Existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines deidentficcin,

-se enumeran a continuacn solo las que se utilizan ms

frecuentemente, agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombrecorriente.

Agar TRES AZUCARES Y IIIERRO (TSI)

Fundamento,

El agar se prepara en forma de Bsel de flauta o bisel. Esto determina que existan doscmaras de reaccin dentro del mismo tubo. La porcin nclinada (Bisel) expuest entoda su superficie al oxgeno es aerobia y la porcin inferior (fondo) est protegida delare v es relatlvamente anaeroba.

Al crecer un m;croorganismo en el TSI, el Bsel tlende a virar al pH alcalino (color rojopor el rojo fenol) por la produccin de aminas, debido a la utilizacin aerobla de laspeptonas. En el fondo del tubo -donde no hay oxgeno- la degradacin de peptonas esmenor y no se generan aminas, de manela que se pueden detectar la produccin depequeas catidades de cido (color amarllo por el rojo fenol). S se inocrlanmicrooorqanismo no feimentadores no se formarn cdos, pero por la produccln deaminas en el Blsel, todo el medio quedar rojo,

La glucosa en el TSI est en una proporcn 10 veces menor que la lactosa y lascarosa. s el TSI es inoculad-o'con una bactera fermentadora de glucosa pero no de

lactosa ni de sacarosa. la cantidad de cido Producda por fermentacin ser baja(porque la cantdad de glucosa inicial es baja). En las primeras horas (10 a 16 hs) dencubacn se producir viraje del indcador al amarillo en todo el tubo (Bisel y fondo),pero al contlnuar la incubacin, el Bsel del tubo retornar al rojo por la produccin deminas dbida a la degradacin aerobia de las peptonas antes descrF.Si el microorganismo, fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentracones deestos azcares son 10 veces mayores a Ia glucosa, se produqir gran cantidad de cido(que no puede ser neutralizado por la produccin de aminas en la superficie), por lotanto todo el tubo (Bisel y fondo) virar al cofor amarillo (cido)'

La produccin d"-!d.3-Pg!i!.f|gjiQglruje pone en-evidenca por precpitacn delsulfuro ferroso (nE6JT mri iI reaciise da preferencialmente en medo cido,un ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede.cubrlr todo el fondo dll tubo yenmascarar el color amarillo) se lee como fermentacin de algunos de los azcares deliledio. Adems puede observarse la pfoduccin de gas (Hz y COr), ya sea comoburbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo haciala superficie.

a Glucosa 0.17o C_.!C "

I Sacarosa 1%I Lactosa 1%{iosulfato oe sodio *} JI Suffato amnico ferrosot Peptona- Rojo fenol (indcador)

POS]BLES LECIUMSEj E, coli I )-* cido (A): Bisel color amarillol// I Ut fermentat I glucosa, lactosa y/o| | scarosa(-J+ cido (A); fondo amarllo

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. Vogs-Proskauer: A la otra porcn de cultivo se fe aade;

. 0,6m1 del Reactivo A de Voges-proskauer (alfa-naftol 5olo en etlico absoluto). Flmedo adquiee un aspecto lechoso.

. 0,2m del Reactvo B de Voges-proskauer (KOH 400/0). Desaparece el aspectolechoso y se agta fuertemente,

. Prueba positva: antes de cinco minutos apaiece un color rosado-violceo oanaranjado rojzo, ms o menos ntenso, que se inicia qn la parte superior deltubo, 6 la prueba es negatva no aparece ninguna coloracln.

PRUEBA DfL MANITOI.

Srve para detectar s los mcroorgansmos son capaces de fermentar el mantol!9f:.t{: ei$$g:cidos gue srn detectadgs sra.gias at ndicadio-i@iqGcamorara a coror amailo. para esta pruba et medio mantol incluye 7,5 g/l de D_Manita. Bacterias manitol (-) son. dentro de las enterobacteria,, proteus-mrdblAProteus wlgans y Shlgella dysenterae. Entre las bacterias de mportancla clnica, laprueba del manitof srve para dferencar Staphylococcus aureus(+) de Staphytococcusepdernds (),

Prueba postiva: cambo de color de rosado a amarillo

Piueba negativa: No hy cambio de color

PRUEBA DE LA MOVILIDAD

Sirve para determinar s n mfcrootgansmo es mvl o inmvil. Las bacters tienenmovlidad por medo de $us flagelos que se encuentmn princpalmente entre los bacilosaunque exsten algunas formas de cocos mviles.

Estas dos. pruebas forman parte del IMVIC de las colimetras y permiten ladiferenclacin dentro de las entefobacterias de grupo coli y ergenes, Lasenterobacteras son anaerobios facurtatvos que utrizarn ra qrucose ef dos fq:91Olqgl. 13 letahol?d0--ggr!iaeDte-tfe5ru.cin*ffi.UA, consumrenooraproamente et oxfgeno del med,, para, en;qgr$gJt$gr, cAllnu.Ff metabolizndolarqr va maer.qhhJfffmenta#I). sta pueA'se-i J?-i tipos: *e%

. Fermentacin e&-$*EtL$) La reatizan.tas bacteras det grupo de Ecoil y ros productos frnates son acidos orgnicos (cidos frmico, acflco, lcticoy succnico) que provocan un fueite descenbo del pH inaial Ael medio. peaedetectarse por el vlraje del indicador de rojo de metilo que permanece amarillopor encima de pH 5,1 y rojo por debajo de 4,4.

. Fermentaci uilni'Ugirtm CVD L ieatzan tas bacterias cel qrupo JKlebsella-Enterobader, Los productos finales son compuestos neutros iomo Iel butanodot y :l e.?!g9q!qe"4!!dig!toJna goTojJrme;*ard"ffi ,ser detectada Onadreglfpg{io KOH (ieactioA-le Voges-proskauer) y alfq:l{*;l-ii:",1'"" a telloffiF3iiui) qe reaccionarn- con este.coGlo}paoducendo un color rojo caracterstco.

F*': ;lTl',t*l* El medio movilidad permte la reatizacin de esta prueba gracas a ser semistido ya' { I E41'qJ' que presenta solamente 3,5 9/l de agar. En estas condicibnes, las bacterias mvilLs

; . .- .,.. f r,. producirn un enturbiamiento-homogdneo del medio debido a la distribucin aleatoria..

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, ' 'f iJ L- \--' de los microorganismos, Por el contraro, las bacterias inmviles permanecern en lap

.

msma linea de la pcadura en que se sembraron.1"." r, /ri :' l:" ,. ",. -*3 f-,-,,fr,"l Entrelasenterobacterias,lamovildadnospermitediferenciarelgnero Klebsrella(-)rrr !i"{r-dr' : : Fr ' " de las restantes que.guelen ser movlidad (+).

. positiva: si vira al rojo

. Negatlva: s permanece amarillo.

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f t" .,,r],rrJj...,fiilt 'rd;' !'&vqSiembra "{t,, '?".., " !t '..i ,.:f,-tA partir de un cutvo puro, serbrar en TSI, picando el fondo y extendendo sobre lasuperficie de medio.

IncubacinA 35-37oC durante 24 horas, en aerobiosis,

Resultados

1-Bisel alcalno/fondo cido (Bsel rojo/fondo amarlllo): el microorgansmo sotamentef"T-gB+4ll!oa*-:* -

2-Bisel cido/fodo cdo (Bisel amarillofondo amarillo): el micoorganismo fermentaglucosa, lactosa v/o sacarosa

3-Bisel alcalno/fondo alcalino (Bisel rojo/fondo rojo): el microorgansmo es nofermentador de azcares.

4-La presencia de burbujas, o ruptum del medo de cultvo, indca oue elmcroorgansmo produce gas.

s-El ennegrecmiento del medo ndica que el microorganismo produce cidosulfhdrico.

ROJO DE METTLO/VOGEs-PROSKAUER

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1,'r.' t1i*. -?'.;:Jt]' Dentro.del gnero Baciltus, nos perrnte diferencar B,anthracis (-) de otras espectes

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, , pRUEBA DE LA REDUCCTN DE NTTRATOSI.r,f : g'{''iq:'rr"i

Algunas bacteras pueden usar nitratos como aceptor fnal de e- en la respiracin. El;c , ,. . , La..F litrato. puede ser reducjdo a ntrito o en un paso ms a gases (xdos de ntrgeno)-1' ' {. - P : Las enterobacterias y Pseudomonas son usualmente positvos

,.rgir:ai,,r,.' ;,.r.q'1,r1!,? dql*.1a!,.'' .1 l *'-' 1 " i'* f-,{ i'r"r b*,, , i.8.., { q*i{*', ,JC ',:* h&j4

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. Rojo de Metilo: A uno de los tubos se le aade unas gotas (4-5) de solucinndicadora de Rojo de Metlo. Se agta para homogeneizar y s observa ta

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Las bacterias se inoculan en medos conteniendo nitrato sdco. E ntrto procedentede la reduccin de clulas puede detectarse aadiendo alfanaftilamna y cidosulfanlico producindose un color rojo.

Se puede saber s el ntratq puede habeBe reducido a ms que a nltritosproducindose gas. Si al aadir zinc en polvo no hay color rojo es que no hay nitratoporque se ha reducido a gas (desnitrifcacn)

. Un cambo de color (rojo) dentro de los 30 seg. indica prueba completa conresutado positivo,

. Si no cambia de color, se agrega directamente al tubo una pizca (unos 20mg)de polvo de cinc pursimo, totalmente exento de nitratos o ntrtos, y seobserva el cambo de color drante otros 30 seg, al cabo de los cuales serealza la interpretacin final,

. Las enterobactetias son generalmente nitratos (+)

PRUEBA DEL INDOLMediante esta prueba se detecta la llbe:acin dq indol en un cultivo bacteriano. Dichalberacn se debe a l" O"gfig*j9n-?-q_-ffi:q!.ff:tr-'glane mediante el grtAnra'

'gi$gfe$e*Para la relizacin de esta prueba la bacteria se cultiva durante 2448 horas en uncaldo de triptona con NaCl al 0,5% (la triptona presenta abundante trptfano), Para laposterior deteccin del indol se usa el reactivo de Kovacs (Erlich)

Si la bacteria posee la enzima trptofanasa, al aadr al cultvo 5 gotas del reactivo deKovacs (Erlich) por la pared del tubo, se producir un anillo de color rojo en lasuperficie del caldo y la prueba ser consderada positiva.

Si esto ocurre despus de 24 horas, la prueba se consdera completa, pero si esnegativo deber ncubarse otras 24 hors y repetirse la prueba. Por ello es convenentehacer siempre la prueba no en el tubo incubado sno en una porcin de unos 2 mf quese retira de l aspticamente.

PRUEBA DEL CITRATO

Se cultiva el microorganismo en agar citrato de Simmons. Este medlo contiene ctratode sodio y fosfato de amonio como fuentes de carbono y de ntrgeno respectivamentey azul de bromotimol como indicador de pH. Slo las bacterias capaces de metabolizarel ctrato (citrato per:reasa) podrn multpticarse en este medo y liberarn onesamonio lo q; junto con la elmnacn del ctrato (cdo), generar una fuertebasificacin del medlo que ser aparente por un camblo de color del indcador de pH,de verde a azul.

-Postivo: creclmiento y color azul en el Bsel, alcalinidad,

-Flegativol el medo permanece de color verde debdo a que no hay desarrollobacteriano y no hay cambo de color.

PRUEAA DE LA UREASA (Urea)Determina la caDacdad de un microoroanismo de desdoblar la urea formando dosmolculas da @sE"Tiudad *ejii'' escaracterstic de todas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciareste gnero de otras enterobacteras que dan negativo o postvo retafdado.

5e cultiva el microorganismo en agar urea de Christensen, Este medio se complementadespus del autoclavado con 50 ml/l de urea estril. Esta ser degradada por aquellosmicroofganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradacn produceamonaco oue har variar el color del indicador de amarllo a rojo,*ponindose as dematriesroliffiffrteeg:** " ' -;dPara revelar el resultado de esta prueba es mportante tener en cuenfa el tiempo deincubacin ya que especles de Proteus welven alcalino el medio poco despus de lainoculacn y sus resultados deben ser ledos en las primeras 2-6 horas, mentras queCltrobacter freundy Klebslella pneumoniae tienen actvldad ureasa dentTo de las 2+48 horas de lcubacn.

FERMENTACION DE AZUCARES

LACTOSA/DEXTROSA/SUCRO5A

Esta prueb se usa para diferenclar entre las enterobacterias en general y el grupo delas coliformes. Se trata por tanto de una prueba de gran importanc debido a que loscoliformes se utilizan como organismos indicadores de coltaminacn fecal en anlsis,sobre todo, de aguas, En bacteriologa se define el grupo de organismos coliformescomo los "bacilos Gram negatvos, aerobios y anaerobos facultatvos, noformadores de esporas y que fermentan la lactosa con formacn d gas a35oc

n 48 horas", Se incluye una gran varedad de bacterias, la mayora de ellas deorigen intestinal.

Una manera sencilla de realzar las pruebas de la fermentacn de la Lactosa, Dextrosa,Sucrosa en enterobacterias es sembrar el microorganismo g rnedios con la azcarespecfica conteniendo un indcador de pH (rojo neutro o rojo fenol)

En las enterobacteras, entre ellas, las que fermenten la lactosa (colformes) lberarnproductos cidos-que producrn u! cambioq pll,qutile-clelectar gracas algpfenol.6HIDRLISIS DE GELATINA

La mayora de los polmeros son demasado grandes para ser transportados dentro delas clulas. Las bacterias excreban.enzmas exiracelularqg 4ue hidroll4A.esos polimerostransportando af-itioi?i-id-itla en monmeros que les sirven para crecer,

La produccin de prolq?Eas-es evaluada por incorporacn de una protena (gelatina o

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casena) en un medio semi slido en tubo. El tubo inoculado se coloca en elrefrigerador o una base de hielo por 30 min

Medo licuado: prueba postva

Medio slido: prueba negativa

HIDRLISIS oEL ALMIDN

Los polisacarjdot como el almidn son demasiados largos para ser transportados alinterior de la clula, Los mcroorgansmos xcretan amilasas que hdrolzn esospolmeros hasta oligo o monosacridos que pueden usarse como sustratos para crecer.

La hidrlisis de almldn es analzada en medio lqudo conteniendo almldn. Despusde ncubar se agrega de 3-4 gotas de lugol que al unirse con el almidn Intacto formaun complejo prpura

r No hay cambo de color: Positvo si el almdn es degradado, no se une el odo-oduro de' Lugol y no se observa color en el medio. La prueba es-pOStTIVA, sincolor., la bacteria posee la enzima amlasa para degradar el almidn presenteen el medo de cultivo, para convertirlo en azcaes simples. El iodo-loduro dellugol adconado NO se une por que el almidn no est presente en el medo decultvo.

. Color azul o prpura: Negativo prueba de amilasa NEGATIVA, color azuloscuro, La bactera no posee la enzma amilasa paa degradar el almidnpresent en el medio de cultivo. por eso el iodo-ioduro del luool adiclonado seune al almidn presente en el medio de cultivo,

MIO (Movilida4 ltldol, Ornitina)5e ncluyen en este 3 pruebas boqumicas debido a que se pueden realizar cultivandoel microorganismo en un nico medio, Movilidad Indol y Ornltna, que se prepara entubo con agar recto y se siembra en pcadura, incubndose a 37oC durante 24 horas..

f Medio usado para la identifcacln de Enterobacteriaceae en base a su movildad,) actvdad de ornitna decarboxilasa y produccin de indot.UMedo de cultivo semislido, altamente nutritivo debdo a la presenca de extracto de

levadura, peptona y triptefna, La triptena aporta grandes cantidades de triptofano,sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la p"ueba del indsl. Ladextrosa es el hdrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para ladeteccin de la enzima orntina decarlloxilasa, el prpura de bromocresol es elindcador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en medlo cido es

, amarillo.j,Por su composicin, es posble detectar 3 reaccones en un msmo tubo: movilidad,y'presencia de orntna decarboxilasa e indol.

La movlidad se demuestra por un enturbamiento del medio o por crecimento cuedifunde ms all de la lnea de inoculacin.

La reaccn postiva a la ornitina est dada por un color prpura del medo.

Debido a la fermentacn de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicincda y orlginando que el indicadorde pH prpura de bromocresol vre al amarllo,

La presencia de aidez, otorga condciones ptmas para la actvidad de la enzimaornitina decqo.Xilasa, la cual decarboxila la ornitina presente.

-..d.s.-

Po decarboxllacin, se alcalinz el medo, con el consecuente viraje del indicadorhacia el color prpura,

El indol, es producdo a partr del trptofanqpor los microorganismos que contienen laenzma triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas dereactivo de Kovac's o de Erlich, Indica un resultado positvo.

l-Movilldad:

El agaf es el agente soldificante, el cual se encuentra en una concentracin que le dala caracterlsticas de medio semislido util para evidenciar la rnotilidad bacterana.

-Resultado postivo: presencia de turbidez o crecmiento ms all de la lnea desiembra.-Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de sembra.

2-Ornitina decarboxlasa:

-Resultado positivo: color prpura.-Resultado negativo: color amarillo, A veces se puede desarollar un color violceo enla suDercie del medio.

3-Pruba del indol:

La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movildad y la pruebade orntna.-Resultado postvo: color rojo al agregar el reactivo revelador.-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarllento.

SIM : (Movilidad, produccin de indol y de eulfuro de hidrgeno)Es un medo semisldo destinado a veriflcar la movilidad, produccn de indol y desulfuro de hidrgeno en un msmo tubo al igual que el MIOEs til para diferenciar membros de la famila Enterobacteriaceae.

FundamentoEl triptfano es un aminocdo constituyente de muchas peptonas, y particularmentede la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. Fn elproceso intervene un conjunto de enzmas llamadas triptofanasa, El lndol producido secombina con el aldehido del reactivo de Kovac's o de Erlich, para originar uncompuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medo, por laturbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras qoe aquellas

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