Fundamentos de la Extracción de ADN

Cd. Obregón, Sonora a 26 de mayo de 2015

M.C. Arturo Muñoz Pérez

I Taller de Técnicas Moleculares

La Célula

Unidad fundamental de todos los organismos vivos

Animales Microorganismos Plantas

Tipos de células

Las células se clasifican en dos grandes grupos: Eucariotas Procariotas

¿Cuáles son las diferencias?

ÁCIDOS NUCLÉICOS

Ácidos NucleicosSon moléculas esenciales para las funciones de la célula y constituyen el material genético de los organismos.

Ácido desoxirribonucleico Ácido ribonucleico (ADN) (ARN)

NucleótidosMonómeros de los ácidos nucleicos, están compuestos por los siguientes tres elementos:

Base nitrogenada(5 diferentes)

Azúcar pentosa

Grupo Fosfato

Bases nitrogenadasLa información genética esta almacenada con un código formado por cuatro bases químicas. Las bases nitrogenadas están divididas en dos grupos:

GuaninaAdenina TiminaCitosina

Purinas Pirimidinas

Uracilo

ARN

ADN

Ensamblaje de ADN

Enlace fosfodiéster

Apareamiento de basesLos nucleótidos se enlazan por medio de puentes de hidrógeno para formar ácidos nucleicos o polinucleótidos. Un átomo de hidrógeno de una molécula es atraído a un átomo electronegativo especialmente nitrógeno, oxígeno, y otra molécula

Estructura de ADN

EXTRACCIÓN DE ADN

Extracción de ADNProtocolo de Raeder & Broda, 1985.

La extracción y purificación del ADN es el paso inicial y básico para realizar trabajos en biología molecular.

Consideraciones para una buena extracción

• Cantidad de ADN• Remoción de inhibidores• Remoción o inhibición de nucleasas• Maximizar la calidad de ADN

Proceso

1. Obtención de muestra2. Extracción y purificación3. Cuantificación4. Calidad5. Conservación

I. OBTENCIÓN DE MUESTRA

Obtención de muestra

II. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN

Fenol-Cloroformo

Es un método de extracción líquido-líquido. Se fundamenta en la lisis total de las células y sus estructurar subcelulares mediante el empleo de detergentes con lo posterior eliminación de las proteínas y lípidos con solventes orgánicos.

Solución de extracción

La solución de extracción esta formado por 200 mM Tris HCl pH 8.0, 250 mM NaCl, 250 mM EDTA, 0.5 % SDS

Nos ayuda a:• Disolver membranas celulares• Inactivar ADNasas y RNAsas• Remoción de contaminantes

EDTA

NaClProporciona iones Na+ que bloquean la carga negativa del fosfato del ADN. Esta negatividad en el ADN provoca que las moléculas se repelen unas a otras. Los iones Na+ forman un puente iónico con los grupos fosfatos, neutralizando las cargas y permitiendo una mayor afinidad entre las moléculas de ADN

SDSDetergente aniónico que desnaturaliza las proteínas y solubiliza la membrana celular

Precipitación de ADN

• El ADN es altamente insoluble en isopropanol, este se disuelve en agua para inducir a que el ADN tenga un cambio estructural en la solución, se junte y precipite.

III. CUANTIFICACIÓN

Cuantificación de ADNLa cuantificación de ADN se realiza mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 260 nm. La pureza es evaluada por la tasa de absorbancia de 260 nm y 280 nm.

Un ADN de buena calidad es aquel que su relación es de 1.7 a 2.0

IV. CALIDAD

Prueba de calidad

Electroforesis

Es una técnica de separación de moléculas en una mezcla por la aplicación de un campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada por su relación carga:masa

Elementos de la electroforesis

Gel de agarosa (1 – 2 %)Cámara de electroforesis Buffer

Marcador peso molecularBuffer de carga Transiluminador

Prueba de calidad

Las biomoléculas poseen una carga eléctrica (ADN negativa), estas se ven sometidas a un campo eléctrico hacia el polo de carga opuesta al de la molécula.

Prueba de calidad

V. ALMACENAMIENTO DE ADN

Conservación de ADN

• El ADN se mantiene en congelación (-80 °C) hasta su empleo. A menor temperatura la preservación se prolonga y múltiples descongelaciones ocasionan una degradación progresiva, por lo que es recomendable hacer alícuotas.

PRÁCTICA DE LABORATORIO

Colocar 100 mg de micelio fresco en un tubo

eppendorff de 1.5 mL

Práctica de Laboratorio

Agregar 500 µL de buffer de extracción

Resuspender el pellet celular

Mezclar el vórtex durante

5 min

Añadir 350 µL de fenol (4 °C),

mezclar en vórtex 30 seg

Añadir 150 µL de cloroformo,

mezclar en vórtex 30 seg

Centrifugar durante 30

min a 13 000 rpm a 4 °C

Tomar la fase acuosa

Agregar 1 volumen de cloroformo y

mezclar en vortex 30 seg

Centrifugar a 13 000 rpm durante 10 min

Transferir la fase acuosa y agregar 0.6 volúmenes de

isopropanol

Homogenizar por inversión y centrifugar 5

min a 13,000 rpm. Descartar sobrenadante

Lavar pellet con 500 µL de etanol al 70 %

Centrifugar a 13,000 g por 2 min a 4 °C y

descartar sobrenadante

Cheng & Jian, 2006

PROTOCOLO EXTRACCIÓN DE ADN HONGOS

Secar pellet y resuspender en 40

– 70 µL de H2O MQ

Almacenar a -20 °C

2x

Preparar la cámara de electroforesis, llenándola

con TAE 1X

Práctica de Laboratorio

Preparar gel 30 g agarosa/ 30 mL

TAE 1X

Calentar en microondas

Una vez enfriado, agregar 1.2 µL de intercalante

Gelred y mezclar

Verter sobre el portagel y colocar

peines

Cargar 5 µL de ADN y mezclar con 1 µL de buffer de carga

Correr las muestras de ADN a 80 V durante 30 min

Visualizar en UVIdoc

Interpretar resultados

GEL DE ELECTROFORESIS VISUALIZACIÓN DE ADN

GRACIAS POR SU ATENCIÓN