física 2 · 2019. 9. 9. · 9 Óptica fisica física 2 – ondas, óptica y electromagnetismo –...

Profesor: Ignacio J. GeneralEscuela de Ciencia y Tecnología

UNSAM

Física 2Física 2

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Física 2Física 2

Óptica física:Óptica física:Instrumentos ópticosInstrumentos ópticos

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Óptica Fisica

Física 2 – Ondas, óptica y electromagnetismo – UNSAM

Microscopios de campo claro (o brillante) y campo oscuro:Microscopios de campo claro (o brillante) y campo oscuro:

Doc. RNDr. Josef Reischig, CSc. [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)]CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=609954By Zephyris - Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=10762664

● En un microscopio de campo clarocampo claro, toda la luz proveniente de una muestra y sus alrededores es recolectada por un objetivo para formar una imagen de la muestra contra un fondo iluminado. Este es el microscopio más común en los laboratorios.

● Un microscopio de campo oscuro campo oscuro recolecta solo la luz proveniente de la muestra, formando así una imagen donde no se ven sus alrededores.

Microbios aéreos

Zooplancton

Imagen de fibras de papel, en microscopia de campo claro (contraste dado por atenuación de luz de la muestra) vs oscuro (contraste dado por la dispersión de la luz sobre la muestra)

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Microscopio de campo oscuro:Microscopio de campo oscuro:

De R0oland - Trabajo propio, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=23244585

Los objetos muy chicos o estrechos son difíciles de observar con microscopia de campo claro, ya que generan poco contraste. En campo oscuro, la iluminación del entorno es eliminada y solo se forma la imagen de la muestra.

Funcionamiento: Funcionamiento: Una apertura anular forma un cono de luz que es focalizado sobre la muestra, y la lente objetivo solo colecta la luz que es dispersada por ella.

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Microscopio de fluorescencia:Microscopio de fluorescencia:

Henry Mühlpfordt, FluorescenceFilters.svg: Krzysztof Blachnicki [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)]

El uso de fluoróforos (compuestos químicos fluorescentes), que se ligan a sitios específicos de ciertas macromoléculas permite observar dichos sitios con claridad:

Funcionamiento: Funcionamiento: La muestra es iluminada con luz monocromática; esta es absorbida por el fluoróforo, y este responde emitiendo luz de mayor longitud de onda (menor energía).Estos dos colores (provenientes de la fuente de luz y de la muestra) son luego separados por un filtro, permitiendo la observación solo de la luz originada en la muestra

Microscopio de epifluorescencia:Microscopio de epifluorescencia:Tanto la luz que excita la muestra como su respuesta pasan por la misma lente objetivo

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Microscopio de fluorescencia:Microscopio de fluorescencia:

transfert on commons by F Lamiot [CC BY-SA 4.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0)]

Célula de cáncer humano en un microscopio de epifluorescencia:

El ADN está teñido de azul, la proteína INCENP de verde, y los microtúbulos de rojo. Los fluoróforos se observan uno a la vez—usando la combinación apropiada de filtros de emisión y excitación—y luego se superponen las tres imágenes.

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Microscopio de fluorescencia: Microscopio de fluorescencia:

Hoy en día existen muchos tipos de fluoróforos, entre ellos algunos cuyas propiedades son controladas por cambios específicos en el entornocontroladas por cambios específicos en el entorno.Por ejemplo, algunos son sensibles al sensibles al pHpH del medio en el cual están, por lo que se activan solo si están a un pH específico. Otro ejemplo son fluoróforos sensibles al ligamiento de sensibles al ligamiento de CaCa2+2+; este es un ión muy importante a nivel biológico, ya que regula muchas actividades celulares.Incluso hay otros que detectan cambios conformacionales cambios conformacionales de la macromolécula a la cual están ligados.

Cambio temporal del pH de las células cuando el pH de su entorno es llevado de 5.5 a 8.

F.-J. Schmitt et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1837 (2014) 1581-1593

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Microscopio multifotónico:Microscopio multifotónico:

● La microscopía multifotónica usa un láser que provee un rayo intenso de fotones de baja energía, que escanea la muestra de forma similar al microscopio confocal

● Dos (o mas) de estos fotones pueden ser absorbidos por la muestra, proveyendo la misma energía que se obtendría de la absorción de un solo fotón, en un microscopio de fluorescencia usual

● La longitud de onda del haz incidente se sintoniza para que la energía absorbida de esos dos fotones sea la necesaria para excitar al fluoróforo

● La mecánica cuántica permite esta absorción resonante solo si los fotones inciden casi simultáneamente, lo que requiere intensidades muy altas del láser

Ventajas (comparado con el confocal básico):Ventajas (comparado con el confocal básico): ➔ Baja densidad de fotones en regiones donde el haz no esté focalizado

➔ Muy baja probabilidad de que dos fotones sean absorbidos en dichas regiones ➔ Cada fotón tiene menor energía que la de los microscopios usuales (1 fotón), por

lo que es menos probable que la muestra sea dañada (baja foto-toxicidad)

Confocal 2 fotones 3 fotonesE0

E1

E2

E0

E1

E2

E0

E1

E2

(E0

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Microscopía electrónica:Microscopía electrónica:

● La resolución máxima físicamente permitida, a través de una apertura circular, en la difracción de Fraunhofer venía dada por:

● Para el caso de una lente,

●

● Juntando ambas expresiones, usando que θ=2α, la distancia mínima de resolución, o poder de resolución queda:

donde α es el ángulo de aceptación de la lente objetivo, n es el indice de refracción del medio entre la muestra y la lente, y NA≡n·sen(α) es el número de apertura de la lente.● Entonces, λ·n es un factor que puede ser modificado para mejorar la resolución del

sistema:➢ En algunos microscopios se usa aceite (n=1,5) sobre la lente objetivo➢ Otra opción es usar un λ menor: luz violeta tendrá mayor resolución (máxima

resolución usando luz visible ~ 200 nm)➢ Mejor opción: usar otro tipo de ondas con λ menor electroneselectrones

sen(θmin)=1,22λ

D=

rmind

rmin=1,22λ d

D=1,22 λ

2 sen(α)= 0,61λ

sen(α)≡ 0,61λ n

NA

rmin αθ

θmind

D

rmin

sen(α)≃ D /2d

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Postulados de de BrogliePostulados de de Broglie (~1924, inicios de la mecánica cuántica):Existe una dualidad en la naturaleza de los electrones, bajo la cual pueden ser considerados partículas con energía y momento partículas con energía y momento ((EE y y pp)), pero también como ondas con ondas con una cierta frecuencia y longitud de onda (una cierta frecuencia y longitud de onda (νν y y λλ)), tal que:

E=h ν

p=hλ¡¡Los electrones también se comportan como ondas!Los electrones también se comportan como ondas!

λ violeta ~ 400 nmλ electrón típico en microscopio electrónico (acelerándolo en ΔV ~ 50 kV) ~ 0.005 nm

Incremento en resolución comparado con microscopio de luz~ 400/0.005 = 80000 ~ 400/0.005 = 80000 veces veces

Pero existen otras dificultades que limitan dicha mejora:máxima resolución de un microscopio electrónico ~ 0.1 nm

Suficiente para definir átomos individualesSuficiente para definir átomos individuales

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El funcionamiento es muy parecido al de un microscopio óptico, solo que se usa un cañón de electrones como fuente de luz, y lentes electrostáticas/electromagnéticas en lugar de lentes ópticas:

By Dr Graham Beards, Public Domain, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=8106664

Alto voltaje

Cañon de electrones

1ra lente condensadora

Abertura del condensador2da lente condensadora

Abertura del condensador

Abertura del condensadorPorta muestrasLente objetivo y abertura

Haz de electrones

Pantalla fluorescente y cámara

Microscopio electrónico de transmisión

● Un filamento de tungsteno calentado a muy alta T libera un haz de electrones

● Los e- son acelerados a través de una diferencia de potencial de ~ 40-100 kV (reduciendo su λ a medida que aumenta su p)

● La columna del microscopio es evacuada a un alto vacío, reduciendo perdidas de energía de los e- debido a colisiones con aire

● Lentes magnéticas son usadas para guiar los e-● La muestra se ubica sobre rejillas de cobre, ya

que este es un buen conductor térmico, disipando el calor de la interacción con el haz

● Las muestras biológicas son generalmente, en parte transparentes al haz, en parte opacas, por lo que dispersan a los e- incidentes.

● La imagen de la muestra se forma en una pantalla fluorescente o detector al final del camino

● La magnificación final puede ser de hasta 300.000 veces, limitada principalmente por la aberración en las lentes magnéticas

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● Microscopio electrónico de transmisión (TEM):• Es el representado en la imagen anterior. Usa electrones transmitidos a través

de una muestra (debe ser muy fina), por lo que, básicamente, crea una sombra magnificada de la muestra. Como hay regiones que son mas o menos transparentes a los electrones, detecta detalles internos.

• Puede llegar a determinar átomos individuales

● Microscopio electrónico de barrido (SEM):

● SEM tiene una resolución (~10 nm máximo) mucho menor que TEM (0,1 nm), pero da una focalización muy alta, por lo que las imágenes son muy 3D

Fuente de e-

Lentesmagnéticas

Muestra Detector

• Este sistema barre la muestra, focalizando el haz sobre un punto a la vez de la superficie

• Un detector recoge los electrones reflejados, no los transmitidos

• Así, este microscopio es mejor para determinar superficies exteriores, pero no el interior de una muestra

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TEM: cluster de poliovirus. Cada virus mide 30 nm de diámetro.By CDC/ Dr. Fred Murphy, Sylvia Whitfield

TEM: Seccion de una célula de Bacillus subtilis. La barra de escala es de 200 nm.By Allonweiner at English Wikipedia [Public domain]

parapoxvirus 3D

SEM: granos de polen – notar la profundidad de campo característica de SEM. By Dartmouth College Electron Microscope Facility

SEM: Polen Cobaea scandens.By Hirndurst [CC BY-SA 3.0 (https://creativecommons.org/licenses/by-sa/3.0)]

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/7/76/TEM-parapoxvirus-tomograph.ogv/225px--TEM-parapoxvirus-tomograph.ogv.jpg

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Rayos X y estructura de biomoléculas:Rayos X y estructura de biomoléculas:

● Separación interatómica ~ 0,1 nm● Rayos X (~ 0,1 nm)

Los rayos X pueden usarse para estudiar la estructura molecular

(se difractan en la red de difracción 3D interatómica)

Rayos-X incidentes

Rayos-X difractados

Pantalla detectora con manchas de

von Laue

Red cristalinaLas manchas de von Laue se deben a la interferencia constructiva de las ondas emitidas por muchos átomos en distintos planos de la red cristalina

By Furiouslettuce - Own work by uploader - Public Domain,https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=6487785

Interferencia constructiva entre reflexiones en dos planos paralelos si:

Condición de BraggCondición de Bragg2 d sen(θ)=m λ , (m=1,2,3,…)

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● Notar que a pesar de que el haz contiene un contínuo de λ, solo unas pocas longitudes de onda cumplirán la condición de Bragg (interferencia constructiva):

➔ la mayor parte de la radiación incidente es absorbida, transmitida, o las reflexiones se cancelan entre ellas, produciéndose así pocas manchas de von Laue.

● Las reflexiones se pueden dar en planos con distintas orientaciones: habrá una serie de manchas para cada caso

● Para determinar la distancia entre planos, se usa un haz monocromático y el cristal se gira gradualmente, hasta que algún conjunto de planos satisface la condición de Bragg y forma las manchas. Entonces se conoce θ y λ, y se calcula d

● La intensidad de los haces reflejados contiene información acerca de la naturaleza química del elemento, ya que los rayos son reflejados, en realidad, por la nube electrónica de los átomos

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By Source (WP:NFCC#4), Fair usehttps://en.wikipedia.org/w/index.php?curid=38068629

● Fotografía de difracción de rayos X por ADN (Raymond Gosling y Rosalind Franklin, 1952).

● Esta fue la fotografía que condujo a la determinación de la estructura de doble hélice del ADN

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Estructura (licorice y cartoon) tomada del Protein DataBank,http://www.rcsb.org/structure/1H97

● Estructura tridimensional de la mioglobina, obtenida por difracción de rayos X. Resolución 1,17 Å.

● Actualmente, las imágenes de rayos X difractados son tratados computacionalmente, combinándolos con algoritmos de minimización de energía y simulaciones de dinámica molecular, para llegar a obtener estructuras de muy alta resolución, de sistemas de miles de átomos

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A partir de una estructura inicial, es posible estudiar la dinámica posterior en forma teórica, a partir de simulaciones computacionales:

Algoritmo de Dinámica Molecular: dada la energía potencial, U(x), del sistema a estudiar,

x1, v1 condiciones iniciales (t=t1)

F = -∂U/∂x fuerza a partir de U

a = F/m 2da ley de Newton

v2 = v1+a Δt cinemática del movimiento acelerado

x2 = x1+v2 Δt+O(Δt2) cinemática del movimiento acelerado

F

v1

v2F→a→Δv→ΔxΔx

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Dinámica molecular de un sistema péptido-proteína (PL1-fibronectinaEDB):

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