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FORMATO DE PUBLICACIÓN DEFINITIVA
MONOGRAFÍA DE GRADO
El estudiante Santiago Ortiz Vásquez con código 201616268 ha completado satisfactoriamente todas las correcciones sugeridas por el Jurado Calificador en su documento de Monografía y por tal motivo se autoriza su publicación digital en la Biblioteca General de la Universidad de los Andes.
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Director: Antonio Manu Forero Shelton
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Jurado: Mayerlin Núñez Portela
Fecha: 28/08/2020
çUniversidad de los Andes | Vigilada Mineducación | Reconocimiento como Universidad: Decreto 1297 del 30 de mayo de 1964. Reconocimiento personería jurídica: Resolución 28 del 23 de febrero de 1949 Minjusticia.
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Diseño e Implementación de Microscopio de EDOF con Iluminación Estructurada
Santiago Ortiz Vásquez
201616268
Universidad de los Andes
Departamento de Física
Director: Manu Forero-Shelton, Ph.D.
24 de agosto de 2020
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Agradecimientos Agradezco a mis padres y a mi hermana quienes han estado conmigo en cada paso de mi vida apoyándome en todo momento. A mi asesor Manu, le agradezco por introducirme al bello mundo de la microscopía, por todo el conocimiento brindado y por la paciencia y el apoyo que me tuvo durante los proyectos en los que trabajamos. Le agradezco a Jorge Madrid por dejarme su microscopio y por acompañarme en mis primeros pasos en el laboratorio. A Omar Olarte por su aporte a mi conocimiento en microscopía y por ende a este proyecto. A Luis Gómez y Jorge Guzmán les agradezco por su trabajo en la manufactura de las piezas requeridas en el microscopio. De igual manera a Jhony Turizo por su apoyo en toda la parte de software del microscopio. Por último, agradezco a mis compañeros y amigos que estuvieron ahí para apoyarme y animarme cada vez que lo necesité.
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Resumen La microscopía óptica, y en específico la microscopía de fluorescencia de hoja de luz
ha supuesto numerosos avances en el campo de la biología del desarrollo y la
embriología debido a sus características de seccionamiento óptico. Sumado al alto
contraste que provee la fluorescencia, la microscopía de hoja de luz promete ser una
herramienta muy útil para estudios biológicos del futuro por su capacidad de
obtener volúmenes de muestras a altas velocidades. El objetivo de esta monografía
es diseñar y adecuar un microscopio existente haciendo uso de técnicas de extensión
de profundidad de campo e iluminación estructurada con hojas de luz para
disminuir posibles daños por fotoblanqueamiento de la muestra manteniendo
resoluciones espaciales que permitan identificar células individuales.
Abstract Optical microscopy, and specifically light sheet fluorescence microscopy, has made
numerous advances in the field of developmental biology and embryology due to
its optical sectioning characteristics. In addition to the high contrast provided by
fluorescence, light sheet microscopy promises to be a very useful tool for future
biological studies because of its ability to obtain sample volumes at high rates. The
objective of this monograph is to design and adapt an existing microscope by using
depth-of-field extension techniques and structured light sheet illumination to
decrease possible damage from photobleaching of the sample while maintaining
spatial resolutions that allow identification of individual cells.
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Tabla de contenido
Agradecimientos .............................................................................................................................. 2
Resumen ............................................................................................................................................ 3
Abstract ............................................................................................................................................. 3
1. Introducción ............................................................................................................................. 6
2. Conceptos en Microscopía ..................................................................................................... 8
2.1. Microscopía de Fluorescencia ......................................................................................... 8
2.1.1. Fotoblanqueamiento .................................................................................................. 10
2.2. Microscopía de Fluorescencia de Hoja de Luz ........................................................... 11
2.2.1. Sistemas de Iluminación y Tipos de Hoja de Luz .............................................. 13
2.2.2. Montura de la Muestra .......................................................................................... 15
2.2.3. Sistemas de Detección y Adquisición de Datos ................................................. 16
2.3. Técnicas de Extensión de Profundidad de Campo .................................................... 18
2.4. Iluminación Estructurada .............................................................................................. 21
2.4.1. DMD ............................................................................................................................. 22
3. Sistema de Iluminación ........................................................................................................ 23
3.1. Diseño y Configuración del Sistema ............................................................................ 23
3.1.1. Iluminación con Láser ............................................................................................ 25
3.1.2. Iluminación con LED ............................................................................................. 26
3.2. Resultados y Conclusiones ............................................................................................ 27
4. Montaje de la Muestra .......................................................................................................... 29
4.1. Diseño de la Celda .......................................................................................................... 29
5. Sistema de Detección ............................................................................................................ 32
5.1. Diseño y Configuración del Sistema ............................................................................ 33
6. Microscopio de EDOF con Iluminación Estructurada .................................................... 35
6.1. Acople de Sistema de Iluminación y Detección ......................................................... 36
6.2. PSF del Sistema ............................................................................................................... 36
6.3. Toma de Datos ................................................................................................................ 38
7. Conclusiones .......................................................................................................................... 39
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8. Referencias ............................................................................................................................. 40
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1. Introducción
La microscopía, tomada como conjunto de métodos y técnicas usados para
visualizar elementos invisibles para el ojo humano, es una herramienta muy
poderosa aprovechada actualmente en la frontera del conocimiento de la biología.
Desde identificación de estructuras en microorganismos hasta reconocimiento de
diferentes procesos biológicos in vivo, esta ciencia no para de generar nuevas
fórmulas para crear cada vez mejores imágenes que puedan responder a preguntas
científicas. En especial, la microscopia de hoja de luz (LSFM) que fue considerada
como el mejor método de 2014 por Nature [1], cuyo principio combina técnicas de
microscopía de fluorescencia e iluminación selectiva, ha revolucionado la manera de
estudiar imágenes tridimensionales de diferentes tipos de muestras, lo que se puede
traducir por ejemplo en análisis de sistemas en neurociencias [2], [3].
Naturalmente como en cualquier método de microscopía, existen ventajas y
desventajas. Una de las principales virtudes que ofrece esta técnica es la baja
fototoxicidad y fotoblanqueamiento a la que somete a las muestras con la luz de
excitación en comparación a otras técnicas como lo es la microscopía confocal[4]. El
fotoblanqueamiento y la fototoxicidad son grandes dificultades que presenta la
microscopía y, en mayor medida, la microscopía de fluorescencia pues a medida que
se ilumina con más potencia para lograr ver más detalles de la muestra, los
fluoróforos que emiten la luz que se detecta, pierden sus propiedades fluorescentes
para el primer caso (photobleaching), mientras que en el segundo caso
(phototoxicity) esta misma luz de excitación puede ser tan energética que puede
causar daños a tejidos o células[5], [6].
Una característica que destaca a LSFM con respecto a las demás técnicas de
microscopía avanzada es la velocidad a la que se pueden capturar volúmenes de las
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muestras. Sin embargo, para el estudio de algunos procesos biológicos en los que se
requiere grabar poblaciones de numerosas células, es necesario un gran poder de
resolución espacial y temporal que en varias ocasiones no se logra con LSFM simple.
De este tipo de problema han surgido varias nuevas técnicas que pretenden
aumentar la información adquirida por estos microscopios. Por ejemplo, existen
técnicas que requieren solo de una captura bidimensional de la muestra para obtener
el volumen de la misma, incrementando así de manera excepcional la resolución
temporal del sistema. Un importante exponente de este tipo de técnicas es la
detección por campo de luz, la cual utiliza un arreglo de microlentes en su módulo
de detección para codificar información tridimensional en una imagen
bidimensional [7], [8]. Sin embargo, para mejorar la resolución temporal del sistema
usando esta técnica, se tiene que sacrificar en gran medida la resolución espacial.
Existen otros métodos que intentan encontrar el punto medio en que todas las
resoluciones del sistema sean mejoradas. Entre estos se encuentran aquellos que
generan una extensión en la profundidad de campo de la detección (EDOF)[9], [10].
Estos consiguen aumentar el rango axial en que se puede desplazar la muestra sin
que la detección pierda el foco de la misma.
Con lo anterior en mente, el objetivo de este proyecto es diseñar e implementar un
microscopio de hoja de luz con la intención de combinar técnicas de iluminación
estructurada a partir de múltiples hojas de luz simultaneas con una detección de
extensión de profundidad de campo. Esto se logrará adaptando un microscopio de
hoja de luz existente para lograr resoluciones que nos permitan cuantificar
información de la muestra y a su vez disminuir el fotoblanqueamiento y la
fototoxicidad que sufre la misma.
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2. Conceptos en Microscopía
Hemos mencionado nuestra intención de modificar nuestro microscopio de hoja de
luz para incorporar técnicas de iluminación y detección que nos permitan llegar a
un balance entre resolución temporal y espacial. Este tipo de microscopio depende
de los principios de microscopía de fluorescencia, microscopía de hoja de luz
convencional, iluminación estructurada, entre otros. El objetivo de este capítulo es
presentar una base teórica necesaria para el entendimiento de estos principios.
Dividiremos el capítulo en cuatro secciones, las primeras dos introducirán conceptos
de los tipos de microscopía óptica con las que estaremos trabajando, y en las últimas
dos nos adentramos en las técnicas más específicas con las que construiremos
nuestro nuevo microscopio.
2.1. Microscopía de Fluorescencia
Durante muchos años, las mejoras en la microscopía se han centrado en el aumento
de contraste entre lo que es interesante (señal) y lo que no lo es (ruido de fondo). La
fluorescencia es un ejemplo de este tipo de mejoras que, con su selectividad
intrínseca, se ha convertido en uno de las técnicas más utilizada por la biología.
Para poder usar esta técnica de microscopía, es necesario que la muestra a estudiar
fluorezca. La fluorescencia es la emisión de luz que ocurre nanosegundos después
de que un fotón de una longitud de onda específica es absorbido por un átomo[11].
Cuando el fotón es absorbido, uno de sus electrones es excitado y llevado a un estado
de mayor energía, posteriormente este mismo electrón perderá un poco de energía
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a través de una transición no radiativa, lo cual lo llevará a un tercer nivel del cual el
electrón decaerá emitiendo de esta manera un fotón de longitud de onda distinta a
la del fotón de excitación[12]. Este proceso se puede visualizar en un diagrama de
Jablonski como se muestra en la figura 2.1. La diferencia de longitudes de onda,
conocida como la variación de Stokes es la propiedad que hace a la fluorescencia tan
poderosa, ya que haciendo el uso de un filtro que solo permita pasar luz procedente
de la emisión de la muestra, se logra bloquear por completo la luz de proveniente
del sistema de iluminación del microscopio. Los encargados de generar
fluorescencia son los fluoróforos, que a partir de diferentes técnicas de marcación,
se pueden adherir a partes específicas de la muestra[13]. Comparando con
iluminación de luz transmitida blanca, la microscopía de fluorescencia presenta
ventajas en el contraste, la selectividad, y la información cuantitativa que se puede
extraer de la muestra.
Figura 2.1 Diagrama de Jablonski para fluorescencia. Tomada de https://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescence
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Ahora bien, este mecanismo de contraste se usa en diferentes tipos de microscopía,
la más común siendo Widefield Fluorescence Microscopy (WFM) en la cual se
ilumina toda la muestra lo que lleva a que se detecte una gran cantidad de luz de
fondo, lo que imposibilita un buen seccionamiento [14]. Para eliminar esas señales
fuera de foco se puede usar una apertura confocal y una configuración de escaneo
de puntos, técnica a la cual se le da el nombre de Microscopía Confocal (CLSM por
sus siglas en inglés)[15]. En esta se ubica un pinhole en un plano conjugado en frente
del detector, para así eliminar la luz que no proveniente del plano focal del sistema.
Para producir una sección del campo de visión que se desea se recoge la luz que pasa
por la apertura y para completar la imagen de la muestra completa se hace un
escaneo, como su nombre lo indica, de la región de interés del specimen. Esta es una
muy poderosa herramienta ya que provee un buen seccionamiento junto con una
excelente resolución transversal y axial. Sin embargo, a pesar de que solo se colecta
fluorescencia del plano focal del sistema, se sigue iluminando la totalidad de la
muestra, lo que produce un rápido fotoblanqueamiento, fenómeno por el cual se
diferenciarán distintas técnicas de microscopía fluorescente.
2.1.1. Fotoblanqueamiento
El fenómeno conocido como fotoblanqueamiento se da cuando el fluoróforo pierde
permanente la habilidad de fluorescer debido a daños irreversibles causados por
alteraciones fotoquímicas[16]. Cuando se generan las transiciones desde el estado
singlete excitado al estado triplete, los fluoróforos pueden reaccionar con otras
moléculas provocando modificaciones en los enlaces covalentes que lo conforman y
de esa manera dañando irreparablemente su propiedad fluorescente.
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Este fenómeno puede ser aprovechado para obtener información de muestras que
de otra manera sería difícil alcanzar, como se hace en métodos de recuperación de
fluorescencia después de fotoblanqueamiento (FRAP) para estudiar interacciones
entre enlaces en células vivas [17]. Sin embargo, cuando se quiere hacer seguimiento
de procesos en organismos vivos, el fotoblanqueamiento es problemático pues a
medida que se captan las secuencias, más moléculas pierden su fluorescencia y las
imágenes pierden cada vez más contraste. Ahora bien, esto puede ser controlado de
distintas maneras tales como disminuir la intensidad o el intervalo de tiempo al que
se expone la luz de excitación, aumentar la concentración de fluoróforos o usar
distintos tipos de fluoróforos que sean menos propensos a blanqueamiento.
Con la intención de mitigar los efectos de este fenómeno, nace LSFM otra técnica de
microscopía de fluorescencia que reúne lo mejor de dos mundos, provee un buen
seccionamiento de la muestra, y gracias a la geometría de su sistema de iluminación,
logra evitar efectos dañinos hacia la muestra.
2.2. Microscopía de Fluorescencia de Hoja de Luz
A comienzos del siglo XX, Richard Adolf Zsigmondy junto a Henry Siedentopf
introdujeron un nuevo esquema de iluminación al área de la microscopia de campo
oscuro: el ultramicroscopio. Este usaba luz solar o una lampara blanca para iluminar
con precisión una rendija, la cual era posteriormente proyectada usando un lente
condensador en la muestra, formando así una hoja de luz[18]. Con esta
configuración Zsigmondy y Siedentopf lograron visualizar moléculas de oro dentro
de coloides de oro gracias a la alta relación señal/ruido que presentaba este nuevo
método. Sin embargo, la técnica se mantuvo olvidada por varias décadas hasta que
en 1994 Arne Voie y su grupo de investigación juntaron el concepto de ‘hoja de luz’,
introducido por Zsigmondy y Siedentopf años atrás, con la fluorescencia. Esto les
permitiría observar y analizar una estructura del oído interno de un conejillo de
12
indias[19]. A partir de este suceso, la técnica siguió evolucionando pasando por
diferentes variaciones de la misma, desde el uso de una detección tipo microscopio
confocal, hasta el actualmente conocido SPIM (Selective Plane Illumination
Microscopy)[20], [21].
Microscopía de Fluorescencia de Hoja de Luz (LSFM) es el nombre general que se
les da a un conjunto de técnicas de iluminación por planos que está en constante
crecimiento y que a su vez ha revolucionado la manera en que especímenes
biológicos son estudiados por microscopía óptica.
Figura 2.2 Esquema básico de un microscopio de hoja de luz (Modificado de O. E. Olarte et al. ,2018)
La característica fundamental de esta técnica es, como se muestra en la figura 2.2, el
desacople de los caminos ópticos de iluminación y detección, ubicándolos
generalmente de forma ortogonal. La separación de los sistemas permite que cada
parte tenga libertad en cuanto a las técnicas que se usan para iluminar/detectar la
muestra. Por esto a continuación se hablará de las tres partes del microscopio
individualmente, y se presentaran algunas, dentro de la gran variedad actual, de las
técnicas usadas a la hora de construir un microscopio de hoja de luz.
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2.2.1. Sistemas de Iluminación y Tipos de Hoja de Luz
Quizás el componente más importante de esta técnica de microscopía es, como su
nombre lo indica, la hoja de luz. Esta es la que proporciona la mayoría de
características que destacan a la técnica, en específico la que produce el
seccionamiento óptico de la muestra mencionado anteriormente. Sin embargo,
existen varias maneras de crear esta hoja de luz, y dependiendo del método que se
use para formarla, habrá diferentes beneficios y desventajas.
En primera instancia, es importante aclarar que, así como no es posible enfocar un
haz de luz en un punto infinitesimal, tampoco se puede crear una hoja de luz
perfectamente plana, lo que se puede hacer es hablar de una hoja de luz plana en un
rango en el cual el ancho de la hoja es relativamente homogéneo. Este ancho de la
cintura de la hoja (𝑤𝑤0) es el que posteriormente determinará la resolución axial del
sistema. Para un haz de luz de perfil Gaussiano como el que se usará en este proyecto
se tiene[14]
𝑤𝑤0 = 𝑛𝑛𝑛𝑛𝜋𝜋𝜋𝜋𝜋𝜋
donde n es el índice de refracción del medio, λ es la longitud de onda de la luz de
excitación de la fluorescencia, y NA es la apertura numérica del objetivo de
iluminación. Ahora bien, el rango de Rayleigh , definido como [22]
2𝑧𝑧𝑟𝑟 =2𝜋𝜋𝑤𝑤02
𝑛𝑛
Y es la distancia desde la cintura de la hoja, a lo largo del eje de propagación, hasta
el punto en que el ancho de la hoja aumente por un factor de √2 como se muestra en
la figura 2.3. Esta característica es la que define el campo de visión efectivo (FOV)
del microscopio, y por ende la más importante para saber qué tipo de muestra es la
que se quiere observar. Como es claro, idealmente se querría un ancho de hoja menor
14
para mejor seccionamiento óptico y un FOV amplio para lograr visualizar más
elementos. Sin embargo, debido a la relación entre las dos medidas lo impide, por lo
que es necesario encontrar el balance indicado que cada muestra requiera.
Figura 2.3 Geometría de la hoja de luz con respecto a los sistemas de iluminación y detección. D es el diámetro del lente del objetivo, 𝑧𝑧𝑟𝑟 el rango de Rayleigh, 𝑤𝑤0 el ancho de la hoja en su cintura, 𝑓𝑓 y 𝑓𝑓𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 son las distancias focales del objetivo de iluminación y detección respectivamente. (Modificado de O. E. Olarte et al. ,2018)
Ahora bien, como se expuso anteriormente existen distintas maneras de construir
una hoja de luz, siendo una de las más comunes el uso de un lente cilíndrico en
combinación con un objetivo de iluminación para hacer converger el haz d luz en un
solo eje[19]. Otro acercamiento usado para el estudio de embriogénesis y biología
del desarrollo ha sido el escaneo de un haz gaussiano para formar una hoja de luz
digital[23]. En este, un rápido barrido en el eje ortogonal a ambos caminos ópticos
del haz genera una hoja de luz, que a su vez puede recorrer la muestra haciendo uso
de un lente f-theta, esta técnica es conocida como DSLM (Digital Scanned Laser Light
Sheet Microscopy).
15
Además, los haces gaussianos no son los únicos que pueden producir hojas de luz,
haces de tipo Bessel[22] y tipo Airy[24] generan diferentes características que
producen beneficios a la hora de iluminar las muestras. En la actualidad siguen
surgiendo diferentes técnicas de iluminación aplicables a LSFM que pueden aportar
mejoras al sistema. Por ejemplo, el uso de más de una hoja que contrarreste las
sombras que se formarían si se ilumina de una sola dirección, y el uso de iluminación
estructurada con diferentes elementos ópticos (sección 2.3) entre otros.
2.2.2. Montura de la Muestra
Debido a su estructura intrínseca, la montura de las muestras en LSFM es un
problema del cual surgen distintas soluciones para distintas aplicaciones. En
general, las muestras deben poder situarse entre los caminos de iluminación y
detección, trasladarse para obtención de volúmenes y en ocasiones rotarse, lo cual
puede introducir diferentes aberraciones con las que se tienen que lidiar. También
se tiene que tener en cuenta que las muestras que se quieren estudiar con esta técnica
tienden a ser relativamente grandes y en ocasiones deben seguir vivas dependiendo
del objetivo del estudio. Por esto, es necesario darles importancia a propiedades el
medio en que los especímenes se encuentran, tales como temperatura y pH. En
general, se usan celdas de aguas en conjunto con objetivos de iluminación/detección
de inmersión para disminuir aberraciones y aumentar las opciones de NA del
sistema. Posteriormente dependiendo de la muestra y las aplicaciones, los medios
que se sumergirían en estas celdas podrían ser geles de agarosa, microambientes de
colágeno fibroso [25]. Más recientemente el uso de materiales FEP y sistemas de
microfluidica han optimizado sistemas de montura reduciendo aberraciones
esféricas debido a su índice de refracción y agilizando y facilitando el proceso de
montura [26], [27].
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En resumen, esta es una técnica que permite variadas soluciones en cuanto a
montura de muestras se refiere. Por ende, se tiene una alta flexibilidad que permite
investigar con diferentes tipos de muestras.
2.2.3. Sistemas de Detección y Adquisición de Datos
Al igual que las anteriores partes de LSFM los sistemas de detección adquisición de
datos presentan una gran variedad de técnicas que se diferencian a medida que las
necesidades de las investigaciones cambien. Más aún, cuando hasta hace poco no
existían microscopios comerciales de hoja de luz, por lo que investigadores
construían parte por parte los sistemas de acuerdo a sus objetivos. Esto ha generado
diferencias incluso hasta en la posición del microscopio con respecto a las mesas
ópticas, siendo unos paralelos a ellas como SPIM [21] y otros perpendiculares como
iSPIM y diSPIM [26], [27]en los cuales usan monturas de muestras de microscopios
convencionales como laminillas, y en donde ambos objetivos ópticos se pueden usar
como de detección o iluminación.
En las configuraciones más comunes se usa un objetivo de detección junto a su
respectivo lente de tubo y filtro de fluorescencia para llevar la imagen de la muestra
al sensor de la cámara. Sin embargo, la óptica del sistema de detección puede hacerse
más complicada introduciendo más objetivos como se tiene en el sistema MuVi-
SPIM [28], donde se usan dos objetivos de iluminación y detección.
Ahora bien, tomar volúmenes de muestras a altas velocidades es uno de los objetivos
principales de la técnica, y de nuevo existen varios métodos para hacerlo. El más
convencional siendo un escaneo mecánico de la muestra, en el cual la montura de la
muestra se traslada para hacer el seccionamiento óptico requerido para obtener el
volumen [29]. Por otro lado, se encuentran casos en que mover la muestra no es
ideal, por lo que es mejor hacer un escaneo optomecánico, en donde la hoja de luz
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junto con el sistema de detección se desplace de manera sincrónica para mantener
sus puntos focales alineados y así escanear la muestra [26], [27]. Sin embargo, estos
dos modos pueden no ser lo suficientemente veloces debido a que los escaneos
mecánicos tienen limitaciones claras, por lo que también se encuentran métodos en
los que el escaneo es completamente óptico. Entre estos se encuentran técnicas en las
que se usa un lente sintonizable eléctricamente (ETL) entre el objetivo de detección
y la cámara para para así poder ajustar la distancia focal del sistema mientras la hoja
de luz se traslada sincrónicamente haciendo uso de un escáner galvanométrico [30].
Asimismo, se encuentran métodos más avanzados en los se puede ampliar la
profundidad de campo para no variar constantemente la distancia focal de la
detección (ver sección 2.3), o en los que se codifica in formación de manera qué
volúmenes puedan ser reconstruidos de una sola imagen bidimensional como en
técnicas de campo de luz [8], [31] o Deep-learning [32]
Sumado a las técnicas de adquisición de datos, procesos de deconvolución y/o
reconstrucción son necesarios para mejorar los resultados obtenidos, en muchos
casos para aumentar el SNR y la cuantificación de los datos.
18
2.3. Técnicas de Extensión de Profundidad de Campo
Como se discutió en la sección anterior, uno de los métodos usados para mejorar la
velocidad de escaneo de la muestra es la extensión de profundidad de campo. Para
entender cómo y por qué funciona este método es necesario entender qué es la
profundidad de campo (DOF por sus siglas en inglés). Esta es la propiedad de un
sistema de detección que habla del rango espacial en el que un objeto se encuentra
enfocado. En otras palabras, es la distancia entre el objeto más cercano, y el más
lejano, que se encuentran enfocados por el sistema de detección. Ahora bien,
dependiendo de los elementos que contenga el sistema, el DOF puede ser alargado,
lo cual produce beneficios en el contexto de LSFM. Como se observa en la figura 2.4,
extender el DOF del sistema es positivo al mezclarse con LSFM pues permite hacer
un escaneo completamente óptico de la muestra aumentando así la resolución
temporal del sistema [10].
Del mismo modo, la extensión del DOF afecta diferentes características del sistema,
entre ellas la función de dispersión de punto (PSF), la cual describe como detecta el
sistema de detección a una fuente puntual. Como sería de esperarse, a medida que
el DOF se extiende, el PSF se alarga en el eje axial, y por ende la resolución en este
eje disminuye. A pesar de esto hay maneras en las que este inconveniente puede ser
tratado (ver sección 2.4).
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Figura 2.4 (A) Escaneo optomecánico estándar donde el objetivo de detección y la hoja de luz se mueven sincrónicamente para obtener el volumen. (B) Escaneo completamente óptico en el que la hoja de luz hace un barrido dentro de la profundidad de campo extendida para obtener el volumen de la muestra. En ambos imagenes la profundidad de campo se representa por la línea verde que atraviesa las cinturas de la hoja de luz (Modificado de R. Tomer et al. ,2015)
Ahora bien, actualmente existen distintas configuraciones experimentales que
permiten obtener un EDOF (profundidad de campo extendida), tales como el uso de
un espejo deformable para codificar frentes de onda [33], o el uso de Deep-learning
para aumentar el DOF en el procesamiento de los datos [32]. Sin embargo, para fines
de este proyecto se hará uso de aberraciones esféricas inducidas para extender el
DOF [10]. Esto se logrará usando un objetivo de detección diseñado para uso en aire,
y ubicando un líquido de diferente índice de refracción entre la muestra y dicho
objetivo. Al hacer lo descrito anteriormente, se introducen aberraciones esféricas al
sistema pues la luz cambia de medio antes de ser detectada, y por ende la distancia
de trabajo del objetivo de detección, cambia como se puede ver en la figura 2.5.
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Figura 2.4 (A) Escaneo optomecánico estándar donde el objetivo de detección y la hoja de luz se mueven sincrónicamente para obtener el volumen. (B) Escaneo completamente óptico en el que la hoja de luz hace un barrido dentro de la profundidad de campo extendida para obtener el volumen de la muestra. En ambas imágenes la profundidad de campo se representa por la línea verde que atraviesa las cinturas de la hoja de luz (Modificado de R. Tomer et al. ,2015)
Al usar esta técnica en la detección, se abren puertas para diferentes soluciones en
el camino óptico de la iluminación del microscopio. A continuación, se expone la
que será usada en el presente proyecto.
La iluminación estructurada es una técnica usada generalmente en microscopía de
fluorescencia para mejorar la resolución espacial del sistema. Esto se logra
iluminando a la muestra con patrones de luz que generan a su vez patrones de
interferencia conocidos como efecto Moiré[34]. Esta técnica puede mejorar la
resolución espacial hasta al doble, manteniendo una buena resolución temporal y
una baja fototoxicidad[35]. Sin embargo, para propósitos de este proyecto, se usará
una manera más básica de la técnica, se formará un patrón de más de una hoja de
luz que ilumine al tiempo distintos planos de la muestra, tal como se muestra en la
figura 2.6.
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2.4. Iluminación Estructurada
La iluminación estructurada es una técnica usada generalmente en microscopía de
fluorescencia para mejorar la resolución espacial del sistema. Esto se logra
iluminando a la muestra con patrones de luz que generan a su vez patrones de
interferencia conocidos como efecto Moiré[34]. Esta técnica puede mejorar la
resolución espacial hasta al doble, manteniendo una buena resolución temporal y
una baja fototoxicidad[35]. Sin embargo, para propósitos de este proyecto, se usará
una manera más básica de la técnica, se formará un patrón de más de una hoja de
luz que ilumine al tiempo distintos planos de la muestra, tal como se muestra en la
figura 2.6.
Figura 2.5 Esquematica de iluminación estructurada por franjas. Cada franja sería una hoja de luz.
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Como este tipo de iluminación no es posible haciendo uso de un sistema
convencional i.e. con un lente cilíndrico, es necesario el uso de un elemento óptico
especial, en este caso, un DMD (dispositivo digital de microespejos) del cual se
hablará a continuación.
2.4.1. DMD
Un DMD es un dispositivo que contiene un arreglo de miles de microespejos tipo
pixeles que pueden reflejar o descartar luz dado cualquier patrón binario que se le
introduzca[36]. Este dispositivo es usado principalmente en aplicaciones donde se
necesiten proyecciones ya que es un excelente modulador espacial de luz.
Desde ya hace un tiempo se ha usado en técnicas de microscopía de iluminación
estructurada logrando resultados de super resolución[37]. En el caso de LSFM, este
elemento resulta particularmente útil provee una solución interesante para formar
hojas de luz. Gracias a su adaptabilidad en sistemas de proyección, puede formar
hojas de luz haciendo que el arreglo de microespejos reflejen una línea vertical, la
cual se verá en la muestra como una hoja de luz tradicional. Esto dispone de varias
ventajas, siendo las más importantes la capacidad de cambiar la posición de la hoja
para poder escanear la muestra, y también la capacidad de variar el ancho de la hoja,
lo cual se lograría aumentando o disminuyendo el número de microespejos
encendidos que tiene el ancho de la línea que se proyecta.
23
3. Sistema de Iluminación
El sistema de iluminación se encarga de generar la hoja de luz para excitar la
fluorescencia de la muestra iluminándola transversalmente. El seccionamiento
óptico y, en este caso, el escaneo de la muestra son labores que se llevan a cabo en
esta parte del microscopio. Este capítulo habla del diseño y la configuración del
sistema de iluminación.
3.1. Diseño y Configuración del Sistema
El microscopio que se implementa en este proyecto tiene como base el microscopio
SPIM 2 de la Universidad de los Andes, el cual manejó distintas configuraciones en
versiones anteriores [31], [38]. En base a lo anterior, se diseñó y modificó la
iluminación del SPIM 2 con un principal objetivo en mente: seccionamiento óptico
bueno y rápido que reduzca la exposición de las muestras a altas intensidades de
luz. El seccionamiento óptico se logra gracias al DMD, el cual logra proyectar varias
hojas de luz al tiempo y, si se quiere, de anchos distintos, lo cual será determinado
por el tamaño de la muestra. Además, se hará uso del método de iluminación
estructurada descrito en la figura 2.5. Esto aumentará la velocidad de escaneo a más
del doble y mejorará la resolución axial del sistema.
Para lograr lo anterior se usaron dos fuentes de luz(secciones 3.1.1 y 3.1.2), las cuales
se manipularan con el objetivo de optimizar la intensidad de luz y la forma del haz
que se hará llegar al DMD (DLP6500FYE de Texas Instruments)[39] el cual
proyectará el patrón a través de un lente de tubo de 350mm y el objetivo de
iluminación(10x N PLAN, NA=0.25, distancia de trabajo = 17.5mm, corrección a
infinito, Leica).
24
En la figura 3.1 se presentan los caminos de iluminación para las diferentes fuentes
de luz, de las cuales se hablará a continuación.
Figura 3.1 Esquema de caminos del sistema de iluminación. De arriba abajo se muestran: primero la iluminación 4f Koehler usada para colectar y colimar la luz proveniente del LED. Segundo la iluminación con láser Cobolt 488nm en el que se usa un BE para aumentar el área de iluminación. Por último, se muestra el camino de proyección y creación de la hoja de luz, desde que el DMD refleja el patrón de líneas verticales hasta la formación de las hojas de luz en la muestra a la distancia focal del objetivo de iluminación. Estos tres caminos se conectan dirigiendo con espejos los dos primeros por separado hacia el DMD.
En cuanto al uso del DMD para la proyección de patrones, se debe tener en cuenta
la demagnificación del sistema, que para este caso es 17.5x por el lente de tubo
usado. Esto significa que una línea de 10 microespejos de ancho produce
teóricamente una hoja de luz de 4,34µm de ancho, pues cada microespejo tiene
dimensiones de 7,6 µm. Sin embargo, si se quiere hacer cada vez la hoja más delgada,
el tope no va estar definido por el tamaño del microespejo, sino por el límite de
difracción del sistema el cual está dado por
25
𝑑𝑑 =1.22𝑛𝑛2𝜋𝜋𝜋𝜋
Lo que indicaría que disminuir el ancho de las líneas proyectadas por el DMD a
menos de 3 microespejos, no tendría sentido.
Ahora bien, para la alineación del sistema, se fue muy cuidadoso y repetitivo, pues
debido el estricto ángulo de incidencia que debían tener los haces de luz al llegar al
DMD, cualquier pequeño corrimiento en algún el elemento óptico del sistema
interfería e impedía la correcta proyección de la hoja de luz. Se hizo uso extensivo
de irises a lo largo del camino óptico para monitorear el camino de los haces de luz.
3.1.1. Iluminación con Láser
En primer lugar, se tiene la iluminación con un láser continuo de perfil gaussiano, el
cual es una fuente de luz monocromática, monodireccional y principalmente
coherente. Estas características permiten que se dé fluorescencia eficiente y que el
haz sea fácilmente redireccionado sin que pierda gran intensidad. Sin embargo, la
coherencia del haz genera patrones de interferencia no deseados(speckles) creados
gracias a la relación de fase que conserva el haz[40].
Teniendo cuenta lo anterior, se hace uso de un Láser Cobolt 488nm, el cual produce
un frente de onda plano gaussiano de un diámetro bastante limitado. Por esta razón
se hace pasar el haz por un beam expander (BE) que tiene como objetivo aumentar el
área de iluminación del láser (ver figura 3.2). Este BE está formado por dos lentes
esféricos plano convexos de diferentes distancias focales (𝑓𝑓1=8mm 𝑓𝑓2 = 40𝑚𝑚𝑚𝑚)
colocados de manera que los lados planos se enfrenten entre sí y, más importante
aún, que sus puntos focales coincidan. Como el haz llega colimado por las
propiedades del láser, significa que al salir del BE seguirá estando colimado pero
esta vez con un diámetro mayor, el cual permitirá posteriormente llenar la apertura
numérica del objetivo de iluminación para obtener hojas de luz que provean un
26
mejor seccionamiento. Al salir del BE, el haz es direccionado haciendo uso de cuatro
espejos, los cuales tienen como objetivo enviar el haz expandido por el BE al DMD.
Para que la proyección del arreglo de microespejos sea efectiva, es necesario que la
luz incidente al DMD llegue a un ángulo especifico [38], [39], lo cual requiere que
los espejos que dirigen el haz sean cuidadosamente alineados.
Esta fuente de iluminación tiene ventajas y desventajas. Entre las primeras se
encuentran la fácil colimación del haz, el control de intensidad del mismo a través
de software y la cantidad de intensidad que se conserva al ser reflejada por el DMD
y llevada a la muestra. Sin embargo, debido a su naturaleza gaussiana, la
homogeneidad no es la mejor, lo cual podría llevar a desigualdades de intensidad
en diferentes posiciones de la hoja de luz.
3.1.2. Iluminación con LED
Por otro lado, se usó una fuente LED (Light-Emitting Diode) monocromática
caracterizada por emitir luz no coherente, lo cual evitará interferencia entre ondas
no deseada. Sin embargo, a diferencia de las fuentes láser, la luz emitida en los LED
diverge rápidamente ya que esta se propaga isotrópicamente en el espacio,
generando así problemas de colimación.
Para esta parte de la iluminación se agregó a la configuración anterior del
microscopio una fuente LED de un solo color (490nm, Thorlabs M490L4) con la
intención de tener una iluminación lo más homogénea posible. Con esto en mente,
se implementó un sistema de iluminación 4f Koehler, en el cual se captura la luz
emitida del LED y posteriormente se colima. Para esto se siguieron los pasos
presentados por J. Madrid-Wolff y M. Forero-Shelton en su publicación “Simple and
open 4f Koehler transmitted illumination system for lowcost microscopic imaging and
27
teaching”, donde se explica paso a paso la construcción y alineación del sistema[41].
Para nuestro sistema se usó un lente colector de 𝑓𝑓=20mm para colectar, valga la
redundancia, la mayor cantidad de luz posible, ya que entre menor distancia focal
tuviera este lente, menos luz se perdía. Posteriormente se usaron dos lentes esféricos,
el primero de 𝑓𝑓=200mm y el segundo que actuaría como condensador de 𝑓𝑓=100mm.
Las distancias focales de estos lentes fueron elegidos cuidadosamente para lidiar con
varias situaciones. La primera era el espacio limitado que se disponía en la mesa
óptica debido a que en la mesa se ubica otro microscopio sumado al camino óptico
de la iluminación con láser, la segunda era la necesidad de ubicar el LED lo más
cerca posible al arreglo de microespejos para evitar pérdidas no deseadas de luz, y
por último se requería que el área iluminada fuera lo suficientemente amplia para
llegar a cada uno de los microespejos y así usar con libertad cualquier posición de
los mismos.
Al final, para incluir este sistema de iluminación se usó un espejo abatible para poder
intercambiar entre ambos sistemas; el del láser y el LED.
3.2. Resultados y Conclusiones
Después de probar ambos caminos de iluminación sobre microesferas fluorescentes
y a pesar de la intención de querer incluir dos fuentes de iluminación distintas, nos
dimos cuenta que cuando existen las condiciones para las que una funciona, la otra
no lo hará. En específico, este montaje fue diseñado en primera instancia para el uso
del láser, por lo que el lente de tubo de larga distancia focal era necesario para
aprovechar por completo la apertura numérica del objetivo de iluminación. Sin
embargo, esto requiere que la distancia que la luz tiene que recorrer para llegar a la
muestra es considerable, para la cual el sistema de iluminación LED, a pesar de
28
contar con un máximo de 240mW de potencia, no logra activar la fluorescencia de
las muestras por la altísima perdida de luz que es intrínseca del LED sumada a la
eficiencia del DMD. Como solución se proponen dos opciones, aumentar la
magnificación del BE para aumentar en gran medida el área de iluminación del láser
y no tener que lidiar con los problemas de no homogeneidad que presenta por su
forma gaussiana o cambiar el lente de tubo del sistema para que no se pierda tanta
luz a la hora de ilumina con el LED. En cualquiera de los dos casos, si se elige esa
opción, la otra forma de iluminación queda completamente no funcional.
29
4. Montaje de la Muestra
En este capítulo se discute la montura de la muestra, parte particularmente
importante para la implementación de este microscopio, pues depende de esta la
efectividad de la extensión de la profundidad de campo que se quiere lograr.
Siguiendo lo descrito en la sección 2.3 se diseñó una celda, con la ayuda de Luis
Gómez y Jorge Guzmán del taller de micromecánica, en la que se pudiera ubicar la
muestra, el “bloque” de índice de refracción distinto al aire, y que a su vez se
acoplara a los caminos ópticos de iluminación y detección del microscopio.
4.1. Diseño de la Celda
A pesar de que el objetivo de este proyecto no es completar estudios biológicos, se
esperaría que un futuro el microscopio fuera funcional y de gran ayuda para
diferentes estudios de esta rama. Por ende, las medidas calculadas para este sistema
se hicieron teniendo en cuenta uno de los organismos modelo más comunes en la
biología del desarrollo, Caenorhabditis elegans, una especie de nemátodo. Lo anterior
era importante tenerlo en mente ya que, dependiendo de la muestra, se va a querer
una profundidad de campo más larga o corta. Las principales variables que agregan
aberraciones esféricas y por ende elongan el PSF del sistema son: la apertura
numérica del objetivo de detección, el índice de refracción del material que esté en
el bloque entre la muestra y el objetivo, y el grosor del bloque [10].
Para esto se diseñó una celda en la que se pudieran ajustar las variables de grosor e
índice de refracción del bloque. Se partió de la idea de insertar una cubeta
(Fisherbrand Disposable Cuvette, PMMA) dentro de la celda, que pudiera
trasladarse sobre el eje axial haciendo así posible la variabilidad del grosor del
30
bloque del material de distinto índice de refracción. Dentro de la celda y fuera de la
cubeta estaría el material de índice de refracción mayor a uno, entonces lo que se
llamaba “bloque” va a ser simplemente el material que se encuentre en medio de la
cubeta y el objetivo. En cuanto a la muestra, se ubica dentro de la cubeta llena de
agua, montada sobre un capilar de agarosa que a su vez se encuentra sujeto a un
micromanipulador traslacional. Teniendo esto en mente, se calcularon las medidas
de la celda haciendo uso de las siguientes ecuaciones:
𝜋𝜋𝜋𝜋 = 𝑛𝑛 sin𝜃𝜃
𝑛𝑛1 sin𝜃𝜃1 =𝑛𝑛2 sin𝜃𝜃2
La primera, la apertura numérica de los objetivos de iluminación y detección para
encontrar los ángulos de los conos de luz de iluminación y detección con los que se
estarían trabajando. Luego se tiene la ley de Snell que se modificó para obtener las
distancias de trabajo deseadas de los objetivos de iluminación y detección, teniendo
en cuenta que el haz de luz atravesaba varios cambios de medio. Lo anterior se hizo
teniendo como objetivo optimizar el uso del líquido de índice de refracción (𝑛𝑛 =
1.454) usado por Tomer en una configuración parecida[10], es decir minimizando al
máximo el volumen de la celda sin comprometer el rango de movimiento de la hoja
de luz y la distancia de trabajo del objetivo de detección. . El producto final, después
de varias iteraciones, consistió en una celda hecha a partir de impresora 3D (PLA)
con sus respectivas ventanillas (laminillas de microscopio convencional) para la
entrada y salida de luz. El montaje y la celda impresa se observan en la figura 4.1.
31
Figura 4.1 Montaje de la muestra. Diferentes perspectivas de la celda y la cubeta en donde se ubica la muestra en el microscopio.
32
5. Sistema de Detección El sistema de detección se encarga de recoger la información que emite la muestra
al ser excitada y presentar fluorescencia. Este capítulo se centrará en explicar el
diseño del sistema y el procedimiento usado para alinearlo.
Figura 5.1 Esquema del sistema de detección. El sistema empieza con el objetivo de detección (Nikon 10x, NA=0.3) seguido del filtro de fluorescencia que impide que luz residual de excitación sea capturada. Luego se pasa por un BS que refleja el 10% de la luz, y el resto es transmitido. Al final la luz pasa por cada lente de tubo para lograr una detección por corrección al infinito y formar la imagen de la muestra en los sensores de las cámaras. El lente de tubo 1 tiene una distancia focal de 100mm mientras que el lente de tubo 2 la tiene de 150mm.
33
5.1. Diseño y Configuración del Sistema
Se ha diseñado el sistema de detección para cumplir dos objetivos: una alta
resolución temporal del sistema para disminuir fotoblanqueamiento y una óptima
resolución transversal que permita distinguir a células individuales. El primero se
cumple con ayuda del sistema de iluminación, y el segundo depende de la
configuración y alineación de cada elemento óptico perteneciente al sistema.
Como principal elemento del sistema, se usa un objetivo 10x NA=0.3 de aire
corregido al infinito. El objetivo captura la luz proveniente de la muestra, y después
de pasar por el debido filtro de fluorescencia, un beam splitter divide la luz en dos
caminos, los cuales funcionan esencialmente igual (ver figura 5.1). El primer camino
nace del 10% de luz reflejada por el BS y está conformado por un lente de tubo de
𝑓𝑓=100mm y una cámara CMOS BlackFly PGE-31S4M, mientras que el camino de la
luz transmitida por el BS (con el 90% de la luz) se conforma de un lente de tubo de
𝑓𝑓=150mm y una cámara Hamamatsu ORCA-Flash4.0 C11440-22CU también de
sensor CMOS. Es de suma importancia la diferencia entre las distancias focales de
los lentes de tubo, pues estas cambiarán la magnificación efectiva de las imágenes
en los dos sensores. Siguiendo la fórmula de magnificación efectiva:
𝑀𝑀𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒𝑒 = 𝑀𝑀𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 �𝑓𝑓𝑟𝑟𝑒𝑒𝑟𝑟𝑟𝑟𝑓𝑓𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜
�
Donde 𝑀𝑀𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 es la magnificación de fabricante del objetivo, 𝑓𝑓𝑟𝑟𝑒𝑒𝑟𝑟𝑟𝑟 es la distancia focal
del lente de tubo que se usa en el montaje y 𝑓𝑓𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜𝑜 la distancia focal para la que esta
corregido originalmente el objetivo. Usando lo anterior se obtienen unas
magnificaciones de 5x y 7.5x para el primer y segundo camino respectivamente.
Como es lógico la cámara principal del microscopio será la Hamamatsu, a la que
llega más luz y la que tiene un sensor más grande. La cámara BlackFly se usará para
hacer una identificación rápida de la muestra.
34
Ahora bien, la alineación del sistema consistió en dos partes, la primera,
encontrando la posición relativa exacta entre el primer lente de tubo y la cámara
BlackFly, lo cual se logró encontrando el punto en que un objeto que se encontrara
a gran distancia estuviera enfocado en la cámara. Después de acoplar esta parte del
sistema al objetivo, al filtro de fluorescencia, al BS y al otro lente de tubo haciendo
uso del sistema de cage plates de Thorlabs, se tuvo que alinear la cámara Hamamatsu
para que la imagen que esta estuviera capturando fuera igual a la de la cámara del
otro camino.
35
6. Microscopio de EDOF con Iluminación
Estructurada Teniendo claro el funcionamiento de los sistemas de iluminación y detección por
separado podemos unir todo para completar el Microscopio de EDOF con
Iluminación Estructurada (figura 3.4)
Figura 6.1 Esquema de Microscopio de EDOF de Iluminación Estructurada. Esquema del montaje completo del microscopio. La figura no representa exactamente la posición de cada elemento en la mesa óptica, esta simplifica la configuración del microscopio para mejor entendimiento.
36
6.1. Acople de Sistema de Iluminación y Detección
Para el acople de ambos sistemas fue necesario una alineación precisa haciendo uso
de microesferas fluorescentes como muestra. Estas microesferas servían como guías
para lograr que los puntos de foco de ambos sistemas coincidieran, el proceso
consistió en, primero encontrar las esferas a través del sistema de detección haciendo
uso de iluminación transmitida (luz blanca ubicada opuesta y paralela a la
detección). Luego, encendiendo el sistema de iluminación láser, se hacía un escaneo
para encontrar en que punto las microesferas emitían luz y al mismo tiempo se
desplazaba el sistema de detección para encontrar el punto en que la fluorescencia
de las microesferas estuviera enfocada en la cámara. Por último, se hacía un ajuste
fino para estar seguro que la cintura de la hoja de luz estuviera iluminando las
esferas que estaban enfocadas.
6.2. PSF del Sistema
Después de la calibración del sistema se tomaron dos PSFs de dos diferentes
configuraciones del sistema para corroborar la extensión de la profundidad de
campo del mismo. Para esto se usaron microesferas fluorescentes de 1 µm de
diámetro que en este caso funcionaban como objeto puntual. Para el primer PSF se hizo la
captura de las imágenes sin hacer uso del bloque de índice de refracción distinto al aire,
teniendo solo la cubeta (donde se ubica la muestra en agar) llena de agua. Para el segundo
caso, se llenaron ambas la celda y la cubeta de agua, generando así un bloque de índice de
refracción n=1.33 de 8±1mm de ancho. En ambos casos se hizo un barrido mecánico en el
que la muestra se desplazaba con pasos de 1µm, que a su vez era iluminada por la fuente
láser a una potencia de 10mW y haciendo uso de una hoja de luz de 10 microespejos de
ancha. Los stacks fueron capturados por el sensor de la cámara BlackFly.
Como se observa en las figuras 6.2 y 6.3, a pesar de la saturación del sensor, se aproxima un
largo de 50 µm del PSF en la primera configuración y 200 µm en la segunda, siendo medidos
37
al FWHM de su dimensión axial. Lo anterior confirma la extensión de la profundidad de
campo haciendo uso de un bloque de índice de refracción mayor al del aire pues el largo del
PSF cambia considerablemente para ambas configuraciones. Cabe aclarar que este es un
resultado preliminar que por falta de tiempo en el laboratorio tiene que ser corroborado en
futuros experimentos en los que se usen diferentes sustancias de distintos índices de
refracción.
Figura 6.2 Vistas ortogonales de PSF del sistema teniendo la cubeta llena de agua y sin bloque de índice de refracción. Imagen de una microesfera de 1µm de diámetro y sus vistas ortogonales. Barra de escala de 20 µm.
38
Figura 6.3 Vistas ortogonales de PSF del sistema teniendo la cubeta y la celda llenas de agua. Imagen de una microesfera de 1µm de diámetro y sus vistas ortogonales. Barra de escala de 20 µm
6.3. Toma de Datos
La toma de datos del microscopio se logra sincronizando la exposición de la cámara
con la proyección e iluminación del DMD. Esto se logra haciendo uso de un software
implementado previamente al este proyecto[38]. En este caso, la velocidad de
adquisición de datos será limitada por la velocidad de captura y readout de la
cámara, ya que el software de manejo del DMD puede cambiar patrones en tiempos
de tan solo 105µs. Al final los datos deben ser idealmente procesados con software
de reconstrucción y deconvolución para lograr optimizar las imágenes aumentando
la SNR del sistema
39
7. Conclusiones En este proyecto se aprendió a diseñar e implementar un sistema de iluminación y
detección basado en los principios de la microscopia de fluorescencia de hoja de luz.
Se afianzaron conceptos y técnicas de microscopia que a su vez fueron aprovechados
para implementar técnicas relativamente nuevas en el mundo de la microscopía de
luz. Además, se determinó que existe una incompatibilidad entre los dos sistemas
de iluminación usados y se tomaron PSFs del sistema que dan las primeras pruebas
de la extensión de profundidad de campo por inducción de aberraciones esféricas.
Debido al poco tiempo en los laboratorios, provocado por situaciones externas e
impredecibles, hicieron falta calibraciones y medidas para comprobar la hipótesis
de que la combinación de las técnicas de iluminación y detección usadas suponen
varias mejoras en cuanto al bajo fotoblanqueamiento que sufre la muestra, con
respecto a otras técnicas de microscopía de fluorescencia. Sin embargo, se espera que
el proyecto continúe, haciendo uso del conocimiento expuesto en el presente
documento.
40
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