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Jornada sobre Posibilidades de la
Espectrometría de Masas
en Laboratorios de Investigación.
“El poder” del análisis comparativo de
muestras en Alimentación,
Proteómica y Metabolómica.
Organizado por: Miguel Angel Martínez
e Inmaculada Álvarez
ICTAN-CSIC
Madrid,
5 de Julio del 2012 10:30-11:15
PCiTAL - UDL
Isidro Masana
Especialista Productos LC/MS
Agilent Technologies
Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas.
Página 2 Página 2
Programa:
1.- Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y
Validación de Biomarcadores en Metabolómica.
2.-Estrategias en el Descubrimiento de
Biomarcadores en Proteómica.
3.- Estrategía de Biología Integrada: Análisis
Multi-ómicos.
4.- Bases de datos y Bibliotecas de Espectros
para la identificación de Metabolitos.
5.- Conclusiones
Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas.
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Metabolómica: es el estudio sistemático de las pequeñas
moléculas orgánicas (metabolitos) presentes en un sistema biológico
DNA
RNA
CH2OH
Metabolitos
Proteinas
GENÓMICA
TRANSCRIPTÓMICA
PROTEÓMICA
La Importancia del Metaboloma
Metaboloma ~ Expresión final de las “-omicas”
METABOLÓMICA
Página 3
Página 4
El estudio de cambios en rutas metabólicas generados por agentes internos/externos permite:
• Conocer mejor la biología del organismo
• Prevenir futuras enfermedades.
• Prever efectos indeseados /deseados de fármacos, dietas,…
• Mejorar la salud.
•…..
Genoma
Proteoma
La Importancia del
Metaboloma y la
Alimentación
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Página 5 Página 5
2 Tipos de Estudios Comparativos Metabolómicos: Genéricos y Específicos
Comparación de Perfiles Genéricos del
Metaboloma (metabolitos conocidos
+ desconocidos)
Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo
espectral con masa exacta
Típico para Descubrimiento de
Nuevos Biomarcadores
Comparación de Perfiles Específicos (metabolitos concretos)
Se trabajará con QTOF/QqQ en modo MS/MS o en MS en
modo selectivo
Típico para Validación de Biomarcadores y
diagnóstico
Evaluar cambios en ciclos concretos del
metabolismo
LC/MS-QTOF
GC/MS-QTOF
LC/MS-QqQ
GC/MS-QqQ
5-40m
Página 6
Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de
Perfilado Genérico (Descubrimiento/ “Un-Targeted Metabolomics”)
Extraer automáticamente la información para cuantificar
relativamente MILES de compuestos desconocidos
Soft. Deconvolución: MFE
PCA
El mismo flujo de trabajo puede aplicarse a Proteómica
(excepto GC/MS y soft. Identificación)
GC-QTOF
MS m/z exacta
GC-MSD
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Aplicaciones no “-ómicas” de las estrategias de
análisis metabolómico
04 de julio de 2012
La Clave para una Buena Comparación de la
Composición de las Muestras
Se debe asegurar la comparación de respuestas de los mismos compuestos entre las diversas
poblaciones comparadas
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Fase Comparación Perfiles: Selectividad Cuantitativa
de Cromatogramas de Iones con Masa Exacta. Ejemplo: 2ng/ml (2ppb) Clenbuterol en Orina
IC: 277.1 m/z - Ventana Extración 1 Da
Clenbuterol S/N = 14
Rango extracción típico Cuadrupolo
IC: 277.087 m/z - Ventana Extración 0.016 Da +/- 30ppm
S/N = 102
LC/MS-TOF Agilent 6210
Exactitud
Masa (ppm)
Nº posibles
fórmulas
empíricas
Tecnología
165 ppm 209 QUAD/TRAP
10ppm 13
5 ppm 7
2 ppm 2 TOF /Q-TOF
Comp.: Reserpina (C33H40N2O9). [M+H]+: 609.281 m/z
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¿Qué masas extraer en un análisis NO dirigido?
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Deconvolución Cromatográfica (3-D) con AMDIS (GC/MS) y
Mass Hunter “Molecular Feature Extractor”(LC/MS)
TIC (suma de los 3)
Componente 1
Componente 2
Componente 3
“Deconvolución”
Picos deconvolucionados y espectros
Componente 1
Componente 2
Componente 3
TIC & Espectro
En muestras complejas 1 pico (TIC) suele estar formado por varios
compuestos no resueltos y algunos del propio fondo
[M+H]+
[M+Na]+
[M+H]+
[M+Na]+ [2M+H]+
[M+H]+
E.C.C.: Suma de intensidades de sus
iones específicos
10-35m
Página 10
Avanzado Algoritmo de Deconvolución “LC/MS Mass Hunter
Molecular Feature Extractor” para obtener por la Masa Exacta
de ”todos” los Compuestos Ionizados en la Muestra
Espectros Deconvolucionados
TIC ECC’s 0
Forma parte del soft. de TOF y Q-TOF
Para cada analito exporta MPP:
m/z, Tr, Intensidad
Página 11
Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de
Perfilado Genérico (“Un-Targeted Metabolomics”)
Buscar Correlaciones entre Grupos de Complejos Datos Espectrales
PCA
• Normalizar datos.
• ANOVA
GC-QTOF
MS m/z exacta
Mass Profiler Profesional: Herramientas de Comparación Estadística de Conjuntos de Muestras
Análisis
Estadístico
Admite Experimentos:
• Estudios simples (A vs. B)
• Estudios en función del tiempo, de condiciones múltiples, de dosificaciones varias, ….
• Clasificación (/ Autentificación) de muestras,…
Proporciona Muy Potentes Herramientas Estadísticas y de Visualización Comparación: • Filtrado simple (test de frecuencia)
• Test de relevancia (t-test, ANOVA 1 o 2 vías)
• Análisis de Componentes Principales (PCA)
• Agrupación (“Clustering” K-means, SOM, QT clustering),
• Predicción de Clases (K-nearest neighbors / SVM)
• Árboles jerárquicos Complete, average and single linkage (w. bootstrapping)
• Gráficos Volcano, Diagramas de Venn, ……
• Incluye Herramientas de visualización de datos (cromatogramas, espectros,…),…..
Página 12
• Con MS Agilent facilita reaprovechar la información obtenida (gran cantidad de datos) para mejorar la calidad de los resultados, p.e.:
• Flujos de trabajo recursivos para reinterrogar muestras con la información obtenida de otras (análisis NO dirigido Dirigido). • Exportar la programación en el tiempo de los MS/MS de los compuestos relevantes para facilitar su identificación con Q-TOF’s de Agilent. • …..
Página 13
“Mass Profiler Profesional”: Ejemplo combinación
de Análisis de PCA con ANOVA
Proporciona una mucha mejor diferenciación
de clases
3 Ensayos con Arroz salvaje 4 Ensayos con Arroz transgénico 1
2
3-INF
4
5
6-RES
7-INF
3-INF
7-INF 6-RES
5
2
3-INF 7-INF
6-RES
5
2
mod. genet.
“bacteria salvaje”
“control”
“sin tratar”
+info: Nota de Aplicación Metabolomic Profiling of Bacterial Leaf Blight in Rice: 5989-6234EN
LCMS-ESI: ~ 1900 compuestos/mta
ANOVA replicados 564 estadísticamente fiables
Permitiría evaluar si un tratamiento tiene un claro impacto en la composición de una muestra
16-29m
Página 14
Flujo de Trabajo RECURSIVO de Agilent en Estudios
Comparativos Perfilado Genérico Específico
Identificación metabolitos relevantes
PCA
Interpretación
Resultados
GC-QTOF
MS m/z exacta
Flujo
Trabajo
RECURSIVO “Untarget” “Target”
Flujo Trab.
RECUR- SIVO
Ver sección 4
Página 15
0
500
1000
1500
2000
2500
L-ornithine
[IRBC_pH9] avg :Raw
[NRBC_pH9] avg :Raw
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
L-arginine
[IRBC_pH9] avg :Raw
[NRBC_pH9] avg :Raw
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
citrulline
[IRBC_pH9] avg :Raw
[NRBC_pH9] avg :Raw0
500
1000
1500
2000
2500
L-ornithine
[IRBC_pH9] avg :Raw
[NRBC_pH9] avg :Raw
Arginine Ornithine Citrulline
Pathway Analysis Showing Differential Abundances For Three Metabolites In The Arginase Pathway In Malaria
Infected Erythrocytes
Células sangre
Infectada
No infectados
L-Arg
Citrul.
Ornit.
Ver en que rutas
metabolicas están
involucrados los
metabolitos
relevantes del
estudio diferencial
Ciclo de la Urea
Nota de Aplicación An LC/MS Metabolomics Discovery Workfl ow for Malaria-
Infected Red Blood Cells Using MPP & LC/QqQ MRM Confirmation 5990-6790EN
Página 16 Página 16
2 Tipos de Estudios Comparativos Metabolómicos: Genéricos y Específicos
Comparación de Perfiles Genéricos del
Metaboloma (metabolitos conocidos
+ desconocidos)
Se trabajará con MS (TOF/QTOF) en modo
espectral con masa exacta
Típico para Descubrimiento de
Nuevos Biomarcadores
Comparación de Perfiles Específicos (metabolitos concretos)
Se trabajará con QTOF/QqQ en modo MS/MS o en MS en
modo selectivo
Típico para Validación de Biomarcadores y
diagnóstico
Evaluar cambios en ciclos concretos del
metabolismo
LC/MS-QTOF
GC/MS-QTOF
LC/MS-QqQ
GC/MS-QqQ
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Flujo de Trabajo de Agilent en Estudios Metabolómicos de
Perfilado Especifico (“Targeted Metabolomics”)
GC-QqQ
LC-QqQ
Página 18
“Pathway to Database Tool”
Convierte la información de los metabolitos involucrados en las rutas seleccionadas en una Agilent “Personal Compound Database” (PCDB). Ésta se utiliza para cuantificar relativamente esos metabolitos en un conjunto de muestras adquiridas con masa exacta (modo MS):
• Permite seleccionar las rutas metabólicas de interés.
• Elimina metabolitos redundantes.
• Búsqueda en la web información adicional de los metabolitos:
• CAS ID, Nombre IUPAC, Estructura
Página 19 Página 19
Seguimiento de Cambios de Expresión en Rutas
Metabólicas en Perfilado Especifico (“Targeted Metabolomics”)
Cambios de concentración entre las 2 poblaciones comparadas
Sin cambios de concentración
Página 20 Página 20
Programa:
1.- Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y
Validación de Biomarcadores en Metabolómica.
2.-Estrategias en el Descubrimiento de
Biomarcadores en Proteómica.
3.- Estrategía de Biología Integrada: Análisis
Multi-ómico.
4.- Bases de datos y Bibliotecas de Espectros
para la identificación de Metabolitos.
5.- Conclusiones
Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas.
25-20 23-22m
Página 21
Sano
Enfermo
Estrategia “Metabolómica” para el Descubrimiento de
Biomarcadores en Proteómica
Off-Gel Electroforesis
Fraccionar por pI
HPLC MS:QTOF
Análisis por LC/MS con masa exacta
Deconvolución cromatográfica de los datos
masas
Análisis Estadístico Multivariante / PCA
entre las diversas poblaciones de muestras
Digestión Tríptica
Identificación Proteínas
Relevantes con Bases de
datos + motor de
Búsqueda
Péptidos Relevantes
HPLC MS:QTOF
Target LC-MS/MS con masa exacta
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Huella Dactilar del Mapa Proteico
Sano
Enfermo
1. Digestión Tríptica “in-gel”
2. MALDI-TOF: mapa masas péptidos
Identificación Proteínas
mediante Bases de datos + motor de
Búsqueda.
Estrategia “Clásica” para Descubrir Biomarcadores:
Proteómica Comparativa Geles-2D + MALDI TOF (TOF/TOF) :
Opción
2D-DIGE: permitirá en 1 Gel combinar varias muestras etiquetadas con distinto colorante fluorescente.
Se analizan las manchas (spots) que muestran
diferencias entre los 2 geles
Gel 2D Separan Proteínas Intactas
por Peso Molecular y pI
Espectro MS -TOF: huella péptídica de
1 mancha (/proteína)
Página 23
La estructura semejante de los péptidos permite etiquetar
X muestras con distintas etiquetas isotópicas para poder
analizarlas conjuntamente y cuantificarlas relativamente con
1 solo análisis (multiplexado).
Técnicas de cuantificación relativa:
• Por metabolización SILAC (MS),
• Etiquetado antes digestión: ICAT (C13, D) (MS) (ver ejemplo en aptdo. 3)
• Después de la digestión: iTRAQ (MS/MS), O 16/18 (MS),…..
* Agilent Spectrum Mill software. Permite cuantificar relativamente con cualquier tipo de etiquetado
HPLC-Chip/QTOF
Cuantificación Relativa Multiplexada de Proteínas
mediante LC/MS con Etiquetado Isotópico
Pep-NH2
184
121
30
5
Pep-NH2
186
119
Pep-NH2
187
118
Pep-NH2
188
117
Mta 1 Mta 2 Mta 3 Mta 4 Pep-NH2
192
113
Mta 8
Reporter Ion
Balance masa
ITRAQ –plex8:
MS/MS plex 4
Página 24 Página 24
Programa:
1.- Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y
Validación de Biomarcadores en Metabolómica.
2.-Estrategias en el Descubrimiento de
Biomarcadores en Proteómica.
3.- Estrategía de Biología Integrada: Análisis
Multi-ómico.
4.- Bases de datos y Bibliotecas de Espectros
para la identificación de Metabolitos.
5.- Conclusiones
Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas.
30-15m
Página 25
Razones y Aportaciones
de la Biología Integrada
• Extrema complejidad y variabilidad de los procesos biológicos.
• La inhibición de una ruta metabólica es habitual que genere la activación de
otras vías alternativas.
• Mutaciones, defectos en la transcripción, modificaciones
postraduccionales,…..
• La Integración de datos experimentales de las diferentes
–ómicas permitirá validar los resultados experimentales a través de
una coherente interpretación biológica de los cambios de expresión
observados entre distintas las distintas poblaciones de individuos/
tratamientos/ enfermedades/…. comparadas en el estudio.
• Alternativa a validación biológica: la validación mono-ómica de biomarcadores requiere
efectuarla con unos miles de individuos de cada población.
Página 26
Proyectos
Experimentos de MS: datos de abundancia de compuestos medidas por MS (LC/MS, GC/MS, CE/MS, ICP/MS),…
Microarray-based, Q-PCR, NSG,… Datos Genómica
Rutas Metabólicas “Pathways”: el nexo de union entre experimentos: transcriptómica /
proteómica/ metabolómica
Mass Profiler Profesional 12: Muy potente Integración de Datos de Múltiples Plataformas para su Análisis Estadístico: Genómica, Proteómica y Metabolómica (LC-GC-CE/MS, ICP/MS),….. Incluyendo plataformas No Agilent.
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Estrategía de Biología Integrada: Análisis Multi-ómico
Integrado de Rutas Metabólicas mediante Mass Profiler
Professional (o GeneSpring GX).
1. Análisis NO Dirigidos de:
1. Transcriptoma (p.e. mediante µ-arrays mRNA)
2. Metaboloma (mediante LC-GC/MS mayoritarios y minoritarios– RMN sólo mayoritarios)
2. Reextraer los datos de TODOS los metabolitos involucrados en las
rutas metabólicas involucradas.
3. Identificar las proteínas involucradas y realizar los ensayos dirigidos (típico
LC/QQQ) para analizar estadísticamente los cambios cuantitativos del
proteoma.
MPP (o GeneSpring)
Análisis NO dirigidos Correlacionar metaboloma
con transcriptoma
Análisis DIRIGIDO
del proteoma
Nuevo MPP 12 permite integrar datos de transcriptómica, metabolómica y proteómica
Página 28
Enrichment Analysis on curated pathways (Wikipaths, KEGG,….) and computationally –
derived networks
Gene Product Data Overlay
Metabolite Data Overlay
Análisis Multi-ómico en Mass Profiler Professional 12-IB:
Cambios expresión representados en las propias rutas
Página 29 Página 29
Programa:
1.- Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y
Validación de Biomarcadores en Metabolómica.
2.-Estrategias en el Descubrimiento de
Biomarcadores en Proteómica.
3.- Estrategía de Biología Integrada: Análisis
Multi-ómico.
4.- Bases de datos y Bibliotecas de Espectros
para la identificación de Metabolitos.
5.- Conclusiones
Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas.
36-9m
Página 30
GC/MS
• Se realiza por búsquedas en bibliotecas universales de espectros de MS
obtenidos por “Impacto Electrónico” (EI: técnica de ionización).
– Genéricas: Wiley (+800.000 espectros/+600.000 compuestos), NIST (+200.000 espectros y compuestos)
– Especificas de Metabolitos: Fiehn Metabolomics GC/MS RTL Library que incluye los espectros y
Tiempos de Retención (+1.000 metabolitos volátiles –algunos previa derivatización: aminoácidos, azúcares, ácidos
orgánicos,....). Utiliza unas condiciones analíticas concretas.
LC/MS
• No existen bibliotecas universales de espectros de
MS o MS/MS.
• Se realiza por búsquedas en bases de datos de
masa exacta/fórmulas empíricas; algunas contienen
Tiempos de Retención de algunos metabolitos (para
unas condiciones analíticas concretas).
– METLIN DB: incluye +25.000 metabolitos endógenos
(unos 8.000 lípidos). Incluye ~700RT’s
• METLIN DL: incluye DB + biblioteca de 9,000 espectros de MS/MS de ~2.300 metabolitos. (en
unas determinadas condiciones de fragmentación con Agilent QTOF).
Identificación de Metabolitos
Página 31
Ejemplo Resultados de Búsqueda en Biblioteca
Universal de Espectros de GC/MS* *ionización por Impacto electrónico (EI)
Página 32
LC/MS: Base de Datos METLIN Batch Search: La importancia
del Tiempo de Retención
Load file for batch search
Active mass
Active metabolite structure
Active mass search results
Algunos metabolitos tienen la misma fórmula empírica se requiere su Tiempo de retención o espectros de MS/MS para poder diferenciar entre ellos.
Página 33
MS/MS y Tiempo de Retención: Una Valiosa
Herramienta para la Identificación de Metabolitos
RT= 3.299
RT= 2.593
Página 34
No identificados: Asignación Estructuras Moleculares
“Mass Structural Correlation” (MSC)
1.-Iones Espectro MS/MS
Requiere la rotura de más enlaces
mayor penalización
1.- MSC busca en internet posibles estructuras asociadas a la fórmula molecular. (p.e. Chemspider ≈ 30millones estructuras) 2.- MSC clasificará las estructuras según el nº de enlaces que hay que romper de la estructura del ión precursor, para encajar con la fórmula de cada uno de los iones producto. La probabilidad será mayor cuanto: • menor sea el nº de enlaces a
romper. • menor nº de dobles enlaces a
romper. • …
3-Representación de la parte de la estructura propuesta
que corresponde al ión remarcado
2.-Propuesta Estructuras
Página 35 Página 35
Programa:
1.- Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y
Validación de Biomarcadores en Metabolómica.
2.-Estrategias en el Descubrimiento de
Biomarcadores en Proteómica.
3.- Estrategía de Biología Integrada: Análisis
Multi-ómico.
4.- Bases de datos y Bibliotecas de Espectros
para la identificación de Metabolitos.
5.- Conclusiones
Flujos de Trabajo en el Descubrimiento y Validación de Biomarcadores en Proteómica y Metabolómica y su Impacto en Rutas Metabólicas.
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Conclusiones • El estudio de cambios en el metaboloma permite evaluar el impacto sobre un organismo, tanto de factores internos (genoma/ proteoma/
enfermedades/…) como externos (fármacos/ dieta, medio ambiente/…).
• El metaboloma/proteoma es una excelente fuente de biomarcadores para diagnóstico, seguimiento de enfermedades, clasificación de pacientes, y estudios de impacto nutricional.
• La espectrometria de masas acoplada a cromatografía (LC/MS y GC/MS) y combinada con Bioinformática constituyen hoy en día la herramienta analítica más potente para proporcionar: PERFILES MASIVOS DE CIENTOS/MILES DE METABOLITOS/PEPTIDOS y correlacionarlos con diversas poblaciones de individuos/ pacientes
• Ya están disponibles comercialmente en el mercado:
– Cromatógrafos, Espectrómetros de Masas y Software para pasar: de IONES a RUTAS METABOLICAS
– Instrumentos y Software bioinformático con una visión multi-omica para abordar un enfoque de Biología Integrada (/Biologia de Sistemas).
Página 38 Página 38
Mass Spec/tacular
Isidre Masana
Especialista de Productos LC//MS
AGILENT TECHNOLOGIES 901.11.68.90
www.metabolomics-lab.com
www.proteomics-lab.com
Estamos a su disposición en:
http://www.chem.agilent.com/es
Tel. 901.11.6890
¿Preguntas?