flavodoxin-like domain
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FLAVODOXIN-LIKE DOMAIN. Carole Bernard Lorena Gómez Carolina Nuñez Lourdes Sanchez-Cid. INTRODUCCIÓN. Flavodoxin-like domain Descubierto en 1960 en cianobacterias y Clostridium. Presente en proteínas de organismos desde procariotas a eucariotas superiores. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
FLAVODOXIN-LIKE DOMAIN
Carole Bernard
Lorena Gómez
Carolina Nuñez
Lourdes Sanchez-Cid
INTRODUCCIÓN
Flavodoxin-like domain
•Descubierto en 1960 en cianobacterias y Clostridium. Presente en proteínas de organismos desde procariotas a eucariotas superiores.
•Las proteínas flavodoxinas (compuesta únicamente por el dominio flavodoxina) solo se encuentran en organismos unicelulares (son proteínas altamente ácidas) sin embargo el dominio flavodoxina se encuentra en proteínas multidominio de eucariotas superiores.
•Ninguna flavodoxina ha sido encontrada en eucariotas superiores, pero la habilidad del producto del gen flavodoxina para unir FMN y participar en reacciones de transferencia de electrones parece que ha sido muy útil para organismos superiores que, a través de eventos de fusión génica, lo han incorporado en proteínas multidominio como la reductasa P450, y la sulfito reductasa, donde la secuencia original flavodoxina y el plegamiento pueden ser trazados claramente.
•Función : unión de flavinas (FMN, FAD) con actividad oxidorreductasa implicadas en el transporte de electrones. (ej: reacciones de fotosíntesis, detoxificación de xenobióticos...)
•Esenciales para la supervivencia de algunos patógenos humanos buenas dianas terapéuticas?
ROSSMAN-FOLD
• Motivo estructural de proteínas de unión a mono/dinucleótidos : NAD, FAD, FMN.
• Lámina compuesta de 5 cadenas paralelas (core central) envuelta por ambos lados por hélices alfa. Las hélices conservadas son 4 : 2 a cada lado y de larga longitud. Pueden haber otras hélices accesorias.
• Estructura en 3 capas / / .
“core” central lámina beta (cinco cadenas betas paralelas)
Hélices alfa (dos largas a cada cara de la lamina beta )
•El centro activo de las flavodoxinas se encuentra según el diagrama de la topología en el “topological switch point” que es donde se une al FMN de cara a su actividad redox
Punto topológico de cambio de orientación
FMN : Mononucleótido de Flavina
N3 N5
N1N10
02
04
CH3
CH3
P032-
Cadena
ribitil
Anillo isoaloxacina
FAD : Dinucleótido de Flavina Adenina
Adenina
Anillo de isoaloxacine
Cadena ribitil
Comparación de proteínas con plegamiento
“flavodoxin-like”de diferentes
SUPERFAMILIAS
Superfamilias / Familia / Proteína /Especie
1. Flavoproteins / Flavodoxin-related / Flavoprotein / Anabaena
2. SGNH hydrolase / Esterase / Esterase / Streptomyces scabies
3. Succinyl-CoA synthetase domains / Succinyl-CoA synthetase domains / Succinyl-CoA synthetase, alpha-chain, C-terminal domain / Escherichia coli
4. Che Y-like / Che Y-related / Che Y-protein / Thermotoga maritima
5. Toll/Interleukin receptor TIR domain / Toll/Interleukin receptor TIR domain / Toll-like receptor 1, TLR1 / Homo sapiens
CONCLUSIONES DEL ALINEAMIENTO DE SECUENCIA Y ESTRUCTURAL DE PROTEINAS DE SUPERFAMILIAS DIFERENTES:
NO SE PARECEN EN SECUENCIA
LOW SCORE
RMS ALTO
NO SE PARECEN EN ESTRUCTURA (STAMP)
ES LO ESPERADO YA QUE LAS PROTEINAS DE SUPERFAMILIAS DIFERENTES COMPARTEN EL TIPO DE PLEGAMIENTO PERO NO SUELEN TENER SIMILARIDAD DE SECUENCIA ENTRE SÍ. ESTAS PROTEÍNAS TAMPOCO COMPARTEN FUNCIÓN Y ALGUNAS NO TIENEN DOMINIO DE UNIÓN PARA EL FMN.
Comparación de
proteínas con
dominio flavodoxina
de diferentes
FAMILIAS
Familia / Proteína /Especie
1. Flavodoxin-related / Flavodoxin / Escherichia coli
2. NADPH-cytochrome p450 reductase FAD-binding domain-like /NADPH-cytochrome p450 reductase / Rattus norvegicus
3. Quinone reductase / NAD(P)H:quinone reductase / Homo sapiens
4. Flavoprotein NrdI / Flavoprotein NrdI / Bacillus subtilis
CONCLUSIONES DEL ALINEAMIENTO DE SECUENCIA Y ESTRUCTURAL DE PROTEINAS DE FAMILIAS DIFERENTES:
SE PARECEN POCO EN SECUENCIA (clustalw)
RMS MEDIO
RMS : +/- 3.14 A
DIFIEREN EN ESTRUCTURA PERO TIENEN UNA SUPERPOSICIÓN ACEPTABLE
ES LO ESPERADO YA QUE LAS PROTEINAS DE FAMILIAS DIFERENTES NO SUELEN TENER UNA GRAN SIMILARIDAD DE SECUENCIA ENTRE SÍ, PERO COMPARTEN MÁS SIMILARIDAD DE ESTRUCTURA.
FUNCIÓN DIFERENTE PERO TODAS TIENEN DOMINIO DE UNIÓN PARA EL FMN O EL FAD.
Familia “FLAVODOXINA – RELATED”
Toda la proteina está formada por un único dominio (dominio flavodoxina)
Proteinas de esta familia son perteneceintes a organismos simples unicelulares eucariotas y procariotas
Función: intervienen en procesos biológicos de transferencia de electrones
Cofactor (FMN) : unen FMN con actividad oxido reductasa, funciona como grupo redox
Actúan como mediadores redox en el metabolismo Intercambibles en su mayoría por ferrodoxinas
Especialmente importantes en la activación de sistemas enzimáticos donde se requieren donadores de electrones
(reacciones flavodoxinas dependientes)
Proteinas de transferencia de electrones
FMN coenzima del grupo prostético de varias flavoproteinas oxido-recutasas.
Familia de Cytochrome p450 reductase N-terminal domain-like
1) NADPH-cytochrome p450 reductase, N-terminal domain-like (homo sapiens)
•Función: proteína donadora de electrones para varias enzimas oxigenasas como el citocromo P450, enzimas involucradas en el metabolismo de muchos fármacos y en la síntesis de hormonas esteroideas.
2) Nitric oxide (NO) synthase FMN domain (rattus norvegicus)
•Función: formación de NO por oxidación de la L-arginina para la señalización y defensa celular. (transfiere electrones)
Proteínas multidominio (unión a FAD,FMN,NADH)
Superposición del dominio flavodoxina
Ejemplo: NITRIC-OXIDE
SYNTHASE REDUCTASE
Glu816
Arg1229
Interacción entre dominio de unión a FMN y FAD por puente salino.
Connecting-domain
Flexible hinge (bisagra)
Residuos no cristalizados
Beta-finger
(Beta-Hairpin)
FAD
FMN3,38 A
En esta posición el FMN esta completamente “sepultado” en la interfase de los dominios impidiendo el flujo de electrones del FMN al aceptor de electrones.
El “flexible hinge” sirve de pivot y le confiere movilidad conformacional al dominio de unión de FMN.
Esta flexibilidad rotacional tiene importantes implicaciones funcionales ya que es la clave del mecanismo de transferencia de electrones
.
Familia: Quinone reductasa
Protein domains:
- NAD(P)H quinone reductase (QR1)
- Quinone reductase type 2 (menandione reductase) (QR2)
- Enzimas citosólicas
-Expresión en corazón, músculo esquelético, hígado y riñon
- Función: reducción de compuestos quinólicos para protección celular. Mediante una reducción de 2e-
- QR1 sobreexpresión en tumores nuevos quimioterápicos
- Donador e- en QR1: NADH o NADPH
Donador e- en QR2: derivdados nicotinamida no P
QR1 vs. QR2
QR2 QR1
Dominio flavodoxina
QR1 QR2
Alineamiento secuencias (48,18% identidad)
Sc: 7.66 RMS:0.76
Tyr126 y 128
Vs.
Phe126 y Ile128
INTERACCIONES CON FAD
Leu103
3A
172,8º
Tyr104
QR1 Gln
2.07A
160.2ºPhe106
2.705A
167.1º
Trp105
Gly1502.74A
150.9º
Gly1493.2A
138.3º
Tyr155
3A
160º
2.47AH?
2.7A
144.2º
Thr147
His112.64A
125.4º
Asn182.7A
112.2º
Phe17
3.5A
112.5º
Arg200
4.47A
135.7º
Glu147
3.9A
148.8º
SITIO ACTIVO
Cambios conformacionales durante la catálisis (QR1)
FAD
Mecanismo de reducción quinones (QR1)
NAD(P)H
NAD(P)+
His161
Tyr155
Quinona HH
FADH2
H
Histidina 161 muy importante
Sin embargo, no esta conservada en QR2:
His161(aromático) Asn161(no aromático)
Mecanismo de reduccion de quinonas (QR2)
Cys222
ZN
Tyr132
His173
Asn161
Tyr155
FAD
Clase Alfa y beta (a/b)Dominio Flavodoxina: existen 15 superfamiliasSuperfamilia Flavoproteínas
“Flavodoxin-related” Cytocromo P450 reductasa Quinona reductasa NADPH-reductasa FMN dep. Flavoproteina NrdI
Clasificación
Familias
ANÁLISIS DE:
- Las regiones, residuos y tipo de interacciones que intervienen en la estabilización del FMN en las proteinas de diferentes familias (del dominio flavodoxina)
- si existe o no conservación en estas interacciones en las proteinas de cada familia y entre familias
- Conservación de secuencia (dentro de cada familia)
- Conservación de estructura (dentro de cada familia)
-Encontrar diferiencias entre familias
Familia 1) “Flavodoxin – related”
Hemos cogido cuatro proteínas flavodoxinas de diferentes especies
-1ahn E. Coli -2fcr Chondrus crispus -1fx1 Desulfobrivio vulgaris -1czn Anacistys nidulans
Toda la proteina es el dominio flavodoxina; pertenecen a organismos simples unicelulares eucariotas y procariotas
E.ColiEJEMPLO: FLAVODOXINA E. Coli
Metilos en contacto con el solvente asomando
Interacciones que intervienen en la estabilización del FMN en la especie E. Coli
Asn14
Thr15
Ser10
Asp11
Thr12
Gly13
Loop1 aa polares que hacen puentes de hidrógeno con los O del grupo fostato
OH del r O 1,2,3 del grupo P
NH (esqueleto o del r) PH
FLAVODOXINA E.Coli
Thr56
Trp57Tyr58
Tyr59
Loop 2 - int. hidrofóbicas
- Thr puente de hidrógeno con la cadena ribitil FLAVODOXINA E.Coli
169º 3,71A
180º2,69 A
oLoop 3 - int. hidrofóbicas - tyr 94 y tyr 97
Tyr94
Tyr97
FLAVODOXINA E.Coli
Sandwich - 2 trp y tyr en situación paralela estabilizan el anillo isoaloxacina mediante interacciones hidrofóbicas
Tyr94
Trp57
FLAVODOXINA E.Coli
¿CONSERVACIÓN DE ESTAS INTERACCIONES EN EL RESTO DE PROTEINAS DE LA MISMA FAMILIA?
β αLOOP 1 LOOP 2
LOOP 3
FAMILIA “FLAVODOXINA-RELATED”
1ahn S D T G N T
2cfr T S T G N T 1fx1 S T T G N T
1czn T Q T G V T
LOOP 1
1ahn T W Y Y
2cfr T W N T
1fx1 T W G D
1czn T W N V
LOOP 2
1ahn Y A E Y F
2cfr Y P D N F
1fx1 _ Y E Y F
1czn Y S D N F
LOOP 3
SANDWICH dos aa hidrofóbicos paralelos estabilizan el anillo isaloxacina mediante interacciones hidrofóbicas. (TIROSIONA Y TRIPTÓFANO)
1ahn Y W 1fx1 W Y
2cfr Y W 1czn W Y
ALTA CONSERVACIÓN EN LAS REGIONES DE UNIÓN A FMN EN LAS 4 PROTEINAS DE MI FAMILIA
CONSERVACIÓN DE LOS TRES LOOPS. - AMINOÁCIDOS SON IDENTICOS - OTROS VARIAN PERO SON DEL
MISMO TIPO Y INTERACCIÓN
LOOP 1 (REGIÓN DE UNIÓN A PO3) ES LA MÁS INVARIABLE Y CONSERVADA DE TODAS DENTRO DE LAS FLAVODOXINAS. LAS INTERACCIONES CON EL ANILLO TIENEN MÁS VARIABILIDAD.
¿ CONSERVACIÓN DE LA SECUENCIA?
Porcentaje de identidad de secuencia
-menor (29,27%) 2fcr y 1akw
-mayor (45,51%) 1ahn y 1czna Media 37,94%
CLUSTALW BASADO EN SECUENCIA
¿CONSERVACIÓN DE LA ESTRUCTURA?
SUPERPOSICIÓN
RMS 1,30
SCORE 7,88
ESTRUCTURA SE CONSERVA MÁS QUE LA SECUENCIA
Hemos cogido dos proteinas
1b1c humano (solo cristalizado el dominio flavodoxina)
1tll rata (multidominios)
Familia 2) Citocromo 450 reductasa N-terminal domain like
Ejemplo:
FMN-BINDING DOMAIN OF HUMAN CYTOCHROME P450 REDUCTASE
Interacciones que intervienen en la estabilización del FMN
Loop1 aa polares que hacen puentes de hidrógeno con los O del grupo fostato
Loop1 aa polares que hacen puentes de hidrógeno con los O del grupo fostato
Ser 26
2,5 A
107º
Gln27
2,68 A
157º
2,8A 2,5A
Thr 28
123º
Asn 115
His 120
Gly 81
Asn 122
FMN
Loop 3 aa polares hacen puentes de hidrógeno con el grupo isoaloxacina
Gly81
FMN
3,04 A
3,80A
115º
150º
3,18 A
2,96A
Asn115
FMN
115º
130º
2,87AFMN
His120
129º
Asn122
FMN
2,9A
134º
Tyr80
Tyr118
Sandwich 2 aa hidrofóbicos estabilizan el anillo isoaloxacina (interacciones hidrofóbicas) paralelos al anillo
Asp148
Oxigeno 4Oxigeno 3
Oxigeno 3Oxigeno 4
Asp148
Asp 147 y 149
¿CONSERVACIÓN DE ESTAS INTERACCIONES EN EL RESTO DE PROTEINAS DE LA MISMA FAMILIA?
¿Y ENTRE ESTA FAMILIA Y LA ANTERIOR?
LOOP 1
LOOP 2
LOOP 3
TRES LOOPS
Loop 1 aa polares que hacen puentes de hidrógeno con el grupo fosfato. Conservación entre proteinas de esta familia y con la familia 1) flavodoxina-related
1ahn S D T G N T
2cfr T S T G N T 1fx1 S T T G N T
1czn T Q T G V T
1b1c S Q T G T A
1tll T E T G K S
Familia 1
Familia 2
Conservación dentro y entre las dos familias
PUENTES DE HIDRÓGENO CON EL GRUPO FOSFATO (PO3)
Loop 2) treonina que interacciona haciendo puente de hidrógeno con la cadena ribitil y aa hidrofóbico que forman parte del sandwich
1ahn T W Y Y
2cfr T W N T
1fx1 T W G D
1czn T W N V
1b1c T Y
1tll T F
Sandwich
Conservación dentro y entre las dos familias
T hace puente de hidrógeno con O de la cadena ribitil
Loop 3) aa hidrofóbico que forma el sandwich y aa polares que interaccionan con el anillo isoaloxacina mediante puente de hidrógeno
1ahn Y A E Y F
2cfr Y P D N F
1fx1 _ Y E Y F
1czn Y S D N F
1b1c N K T Y E H F N
1tll S R A Y P H F C
Aa hidrofóbico que forma parte del sandwichPH con el anillo
isoaloxacina
PH con el anillo isoaloxacina
DIFERENCIAS ENTRE FAMILIA 1 Y 2
AA ACIDOS (-) AA BASICOS (+)
BASICOS +
ACIDOS -
BASICOS +
>15 A
FUERTE MOMENTO DIPOLAR
Cluster 2
(Aspárticos) Cluster 1
(Glu + Asp)
Cluster3 (Glu+ Asp)
Distribución de cargas mixtas
¿ CONSERVACIÓN DE LA SECUENCIA?
Porcentaje de identidad de secuencia 35,71 %-
CLUSTALW BASADO EN SECUENCIA
¿CONSERVACIÓN DE LA ESTRUCTURA?
SUPERPOSICIÓN
RMS 1,03
SCORE 7,02
Familia 3) Quinona reductasa
Hemos cogido dos proteinas
Un único dominio de unión a FAD
1QR2 humano
1D4A humano
EJEMPLO
EJEMPLO QUINONA REDUCTASA HUMANA TIPO 2
Interacciones que intervienen en la estabilización del FAD (solo FMN)
His112.64A
125.4º
Asn182.7A
112.2º
Loop 1 y cadena alfa aa polares hacen puente de hidrógeno con el grupo fosfato
Leu103
3A
172,8º
Tyr104
QR2 Gln
Loop 2) aa hidrofóbicos hacen puente de hidrógeno con el anillo isoaloxacina (cadena principal)
2.07A
160.2ºPhe106
2.705A
167.1º
Trp105
Loop 2) aa hidrofóbicos hacen puente de hidrógeno con el anillo isoaloxacina (cadena principal)
Gly1502.74A
150.9º
Gly1493.2A
138.3º
Loop 3) aa hacen puentes de hidrógeno con el anillo isoaloxacina
2.47AH?
2.7A
144.2º
Thr147
Loop 3) thr hace puente de hidrógeno con la cadena ribitil
Tyr155
3A
160º
Loop 4) tyr hace puente de hidrógeno con O del anillo isoaloxacina
¿CONSERVACIÓN DE ESTAS INTERACCIONES EN EL RESTO DE PROTEINAS DE LA MISMA FAMILIA?
¿Y ENTRE ESTA FAMILIA Y LAS DOS ANTERIORES?
Loop 1 alfa
Loop 2 Loop 3
Loop 4
¿ CONSERVACIÓN DE LA SECUENCIA?
CLUSTALW BASADO EN SECUENCIA
Porcentaje de identidad de secuencia 48,18 %-
¿CONSERVACIÓN DE LA ESTRUCTURA?
SUPERPOSICIÓN
RMS 0,76
SCORE 7,66
CONCLUSIONES
Conservación a nivel de secuencia en las tres familias (identidad 35,71 - 48,18 %)
Conservación a nivel de estructura en las tres familias
RMS ( 0,76 - 1,30)
“La estructura se conserva más que la secuencia” diferentes tipo de aa dan mismo plegamiento”
Interacciones de unión a FMN
-alta conseración dentro de cada familia
-alta conservación entre familias flavodoxina-related y familia citocromo p450 (las dos unen FMN)
- NO existe conservación en la familia quinona reductasa con las anteriores. Hipótesis unión a una flavina diferente FAD
- la familia citocromo p450 presenta una conservación de residuos cargados ausente en las demás familias. Hipótesis importancia de estos residuos en la interacción entre dominios, (proteinas multidominios)
FLAVOPROTEÍNAS CON FMN OXIDADO Y REDUCIDO
Gly 89
Trp 90
Gly 91
Met 56Gly 57
Asp 58
Glu 59
UPPER LOOP
LOWER LOOP
ANILLO ISOALOXAZINA
MET 56
TRP 90
ANILLO ISOALOXAZINA
Asn 11
O’4
O’2
Ala 55
CADENA RIBITIL
Asn 11O’2
Ala 55
O’4
Asn 11
O’4
CADENA RIBITIL
2,69 Å
135,7º
3,24Å
150,14º
Thr 9Gly 10
Asn 11
Thr 12
Gly 8
Ser 7
PO3-
GRUPO FOSFATO
PO32-
Ser 7
NO PUENTE H
O2
2,7 Å109,7 ºC
Gly 8
3,83 Å
135,5º
O2PUENTE H
O3
2,54Å
146,2º
Thr 9
PUENTE H
2,54 Å
146,2º
Gly 10
O3
PUENTE H
2,95 Å
123,5º
Asn 113,02Å
114,5º
O3
NO PUENTE H
2,93Å
137,3ºPUENTE H
Thr 12
O2
Asn 11
Trp 90
Asp 58
Gly 57Met 56
Met 56Gly 57
Asp 58
Asn 11
Trp 90
STAMP
FMN OXIDADO
FMN REDUCIDO
MET 56
C - C - C - N -72,4 -70,1
S - C - C - C -60,1 -67,8
C - S - C - C 114,7 -64,7
ÁNGULOS DIEDROS
ÁNGULOS DIEDROS
ASP 58 FMN OXIDADO
FMN REDUCIDO
C - C - C - N -159,3 -176,7
O1 - C - C - C 63,5 23,2
O2 - C - C - C -94,2 -156,9
ÁNGULOS DIEDROS
TRP 90 FMN OXIDADO
FMN REDUCIDO
C - C - C - N 55,3 51,2
C1 - C - C - C 83,1 79,7
N1 - C1 - C - C -178,9 179,5
ÁNGULOS DIEDROS
ASN 11 FMN OXIDADO
FMN REDUCIDO
C - C - C - N -66,1 -63,6
O1 - C - C - C -21,4 158,4
N2 - C - C - C 156,2 -22,1
DIFERENCIAS EN LAS INTERACCIONES ENTRE FMN
OXIDADO Y REDUCIDO
Asp 58
Gly 57
CONFORMACIÓN TRANS-O-DOWN
FMN OXIDADO
Gly 57
Asp 58FMN REDUCIDO
CONFORMACIÓN TRANS-O-UP
Met 56
FMN OXIDADO
Met 56
FMN REDUCIDO
FMN OXIDADO
Trp 90 Trp 90
FMN REDUCIDO
125,5º 130,7º
FMN OXIDADO
O’4
Asn 11
2,69A
135,7º
NO PUENTE H
Asn 11 FMN REDUCIDO
NO PUENTE H
Asn 11 FMN REDUCIDO
FLAVOPROTEÍNA CON FMN VS SIN FMN
Thr 10 – Gly13
Gly 27 – Val 30
Pro 55 – Gln 63
Leu 133 – Phe 138
CON/SIN LIGANDO
Todos polares
Alternan polares e hidrofóbicos
2 HIDROFÓBICOS FLANQUEAN 2 BÁSICOS Y ÉSTOS A 2 POLARES CENTRALES
Relación estructura-función
El plegamiento del dominio permite la unión de cofactores que son donadores y aceptores de
electrones. El FMN además de poder unirse, es estabilizado por la gran cantidad de puentes de hidrógeno y de interacciones hidrofóbicas que
puede establecer gracias a la repetitiva presencia de anillos aromáticos. Éstos
proporcionan una deslocalización electrónica eficaz, sin la cual no podrían transferir electrones
y ejercer así su función de transportadores de éstos.
Bibliografía1) Ludwig, M L., (1996) Control of Oxidation-Reduction Potencials in Flavodoin from
Clostridium beijerinckii: The Role of Conformation Changes.
2) Frazao, C., Silva G. Structure of a dioxygen reduction enzyme from Desulfovibrio gigas
3) Faig, M., Bianchet. M.A (1999) Structures of recombinant human and mouse NAD(P)H: quinone oxidoreductases: Species comparison and structural changes with substrate and release (1999)
4) Sevrioukova, I.F., Li, H., (1998) Structure of a cytochrome P450-redox partner electron-transfer complex
5) Ludwig, M L, Andersen, R.D. (1969) The Structure of a Clostridial Flavodoxin
6) Sibille, N., Blackledge, M., (2005) Solution Structure of the Sulfite Reductase Flavodoxin-like Domain from Escherichia coli
7) Hubbard, P.A., Shen, A.L., (2001) NADPH-Cytochrome P450 Oxidoreductase, structural basis for hybride nd electron transfer
8) Burnett, R.M., Darling, G.D., (1973) Structure of the Oxidized Form of Clostridial Flavodoxin at 1.9A Resolution
9) Foster, C.E., Bianchet, M.A., (1999) Crystal Structure of Human Quinone Reductase Type 2, a Metalloflavoprotein,
10) Grandori, R.,Khalifah, P. (1997) Biochemical Characterization of WrbA, Founding Member of a New Family of Multimeric Flavodoxin-like Proteins.
PEM1. Sobre les proteïnes flavodoxines, quines respostes son verdaderes?
a) Les proteïnes flavodoxines no es troben en eucariotes superiors.
b) El domini flavodoxina no es troba en organismes procariotes.
c) Les dos anteriors.
d) Uneixen mononucleòtids d’adenina.
e) Totes les anteriors.
2. Sobre el plegament de Rossman, quines respostes son certes?
a) És un plegament format per 5 làmines β paral·leles (core central) envoltada pels dos costats d’hèlix α.
b) És un motiu estructural de proteïnes d’unió a ATP, ADP i AMP.
c) Les dos anteriors.
d) Té una estructura de 3 capes α/ β /α.
e) Totes les anteriors.
3. Senyala la resposta verdadera sobre el FMN:
a) Té un dimetil benzè formant part del anell isoaloxacina.
b) La cadena ribitil és un sucre que uneix l’anell d’isoaloxacina i un grup fosfat.
c) Els N3 i N10 no poden participar en la formació de ponts d’hidrogen.
d) El grup fosfat es troba a uns 8.5 Amstrongs de l’anell d’isoaloxacina.
e) Totes les anteriors.
4. Senyala les verdaderes:
a) Les proteïnes que comparteixen el plegament Flavodoxin-like presenten sempre un domini d’unió a FMN.
b) Les proteïnes que comparteixen el plegament Flavodoxin-like no tenen per què tenir la mateixa funció.
c) Existeix una similaritat de seqüència acceptable entre les diferents superfamílies.
d) Les proteïnes de famílies diferents sempre tenen un domini d’unió a FMN o FAD i la mateixa funció.
e) Totes les anteriors.
5. En la proteïna Nitric-oxide synthase reductase de la superfamília de les flavoproteïnes,
a) Existeix un connecting domain amb regions específiques amb importants implicacions funcionals.
b) El “flexible hinge” confereix mobilitat al domini d’unió a FMN.
c) Les dos anteriors son certes.
d) Les regions específiques son el β finger (que és un β-propeller) i un “flexible hinge”.
e) Totes les anteriors son certes.
6. En relació amb les proteïnes QR1 i QR2 de la família Quinone reductase,
1) QR1 i QR2 s’uneixen tant a FAD com a FMN.
2) QR1 presenta un domini C-terminal, no present en QR2, important per la unió a NAD(P)H/NADH.
3) QR1 i QR2 son heterodímers.
4) L’alineament de les seves seqüències presenta un 48.18% d’identitat.
a) 1, 2, 3
b) 1 i 3
c) 2 i 4
d) 4
e) 1, 2, 3, 4
7. L’estabilització del FMN en el domini flavodoxina:
1) Depèn d’unes interaccions hidrofòbiques en sandwich entre dos arginines.
2) Dèpèn de múltiples interaccions amb molècules d’aigua del solvent, al que es troba exposat el FMN.
3) Depèn d’interaccions iòniques amb aminoàcids del loop 2.
4) Depèn d’interaccions de pont d’hidrogen entre aminoàcids polars i els oxígens del grup fosfat.
a) 1, 2, 3
b) 1 i 3
c) 2 i 4
d) 4
e) 1, 2, 3, 4
8. Sobre els canvis conformacionals que es produeixen quan el FMN està reduït i oxidat, assenyala la/les respostes
certes:
1) Quan el FMN està oxidat el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-up donant lloc a un pont d’hidrogen amb el N3 de l’anell d’isoaloxacina..
2) Quan el FMN està reduït el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-up donant lloc a un pont d’hidrogen amb el N5 de l’anell d’isoaloxacina.
3) Quan el FMN està oxidat el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-down donant lloc a un pont d’hidrogen amb el N10 de l’anell d’isoaloxacina.
4) Quan el FMN està oxidat el pèptid Gly57/Asp58 adopta una conformació trans-o-down.
a) 1, 2, 3
b) 1 i 3
c) 2 i 4
d) 4
e) 1, 2, 3, 4
9. Quina de les regions que intervenen en l’estabilització del grup FMN de les proteïnes flavodoxines és el més
invariable i conservat? Assenyala la resposta correcta.
a) Regió d’unió al grup fosfat. Loop d’aminoàcids polars que fan ponts d’hidrogen amb els tres oxígens del grup fosfat del FMN.
b) Regió d’unió al anell isoaloxacina. Loop d’aminoàcids polars que fan ponts d’hidrogen amb els oxígens i nitrògens del anell.
c) Estructura en sandwich. Dos aminoàcids paral·lels al anell isoaloxacina l’estabilitzen a través d’interaccions hidrofòbiques.
d) Clusters d’aminoàcids carregats (bàsics i àcids) amb distribució asimètrica.
e) Regió de tres aspàrtics consecutius que interaccionen iònicament amb els oxígens del grup fosfat.
10. En quina família dins de la superfamília flavoproteïna, existeix una conservació de clusters d’aminoàcids
carregats amb distribució asimètrica que provoca que el domini sigui un fort dipol, i les interaccions
electrostàtiques del qual son essencials per la unió d’aquestes proteïnes amb el seu substrat?
1) Flavodoxin-related
2) Flavoprotein NrdI.
3) Quinona reductase
4) Cytocromo P450 reductase
a) 1, 2, 3
b) 1 i 3
c) 2 i 4
d) 4
e) 1, 2, 3, 4
ASSAIG1. ¿Com es produeix el mecanisme de transferència d’electrons en las proteïnes QR1 (NAD(P)Hquinone reductase) i QR2 (quinone reductase type2), i quin tipus de cinètica segueixen?Resposta: El mecanisme de transferència d’electrons en aquestes proteïnes es produeix a través d’una cinèticaping-pong. En QR1: arriba el NADH, cedeix un protó al FAD, quedant aquest semireduït, i després el NADH esdesprèn de l’enzim. Posteriorment, per estabilitzar-se, el FAD captura un protó de la tirosina 155, laqual compensa la seva càrrega negativa perquè la histidina 161 li cedeix un protó. En aquest moment elFAD es troba reduït per complet. Aleshores entra la quinona, i interacciona amb la histidina 161 através d’un pont d’hidrogen. El FADH2 li cedeix un protó a la quinona reduint-la, però necessita unsegon protó per reduïr-se completament, i aquest se li cedeix la histidina 161, amb la que estava fent unpont d’hidrogen. Finalment, la quinona ja reduïda surt del lloc catalític, permetent l’entrada demolècules d’aigua que reprotonan la histidina 161.En QR2: al no estar conservada la histidina 161 el mecanisme es diferent. No se sap molt bé, però s’hahipotetitzat una possible via de transferència d’electrons a través d’una sèrie d’aminoàcids específics(histidina173, tirosina132, asparagina161 i tirosina155), l’àtom de zinc endogen i el donadord’electrons, fins arribar al substrat.2. Perquè al realitzar un Stamp pot donar un Score i un RMS baixos? Com ho faries per obtenirun Score alt i un RMS baix?Al comparar proteïnes de longituds molt diferents, encara que stamp pugui superposarsatisfactòriament un número elevat de residus (RMS baix, bo), com queden molts residus que no podensuperposar-se degut a la diferència de longitud, apareix un Score baix (dolent). Per solucionar el fetd’obtenir un Score baix i un RMS bó, podem reduir el tamany d’una proteïna tallant el domini que ensinteressa.
3. Quin tipus de plegament presenten els dominis flavodoxina? Explica tot el que sàpigues sobre aquestplegament.
El domini flavodoxina presenta en tots els seus casos un plegament “Rossman-fold”.El plegament Rossman es un motiu estructural de proteïnes d’unió a mono/dinucleòtids (NAD, FAD, FMN).La seva estructura pertany a la classe alfa/beta (alternança).Té un plegament tridimensional organitzat en tres capes (alfa/beta/alfa). Les seves estructures secundariesson una làmina beta central formada per 5 cadenes beta paral·leles que formaria el “core central” envoltadaper els dos costats per hèlix alfa. Les hèlix més conservades son 4, dos hèlix alfa a cada costat, i poden haveraltres hèlix accessòries.
4. Per quin procés evolutiu el domini flavodoxina apareix en proteïnes multidomini en cèl·luleseucariotes quan en procariotes constitueix la proteïna sencera, i perquè?
Cap flavodoxina ha sigut trobada en eucariotes superiors, però l’habilitat del producte del gen flavodoxinaper unir FMN i participar en reaccions de transferència d’electrons sembla que ha sigut molt útil perorganismes superiors que, a través de processos de fusió gènica, l’han incorporat en proteïnes multidominicom la reductasa P450, i la sulfit reductasa, on la seqüència original flavodoxina i el plegament poden serreconeguts clarament.