fitopatologÍa -...
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Por qué los virus requieren de técnicas especiales de diagnóstico ?
Son parásitos OBLIGADOS e INTRACELULARES
Son parásitos NO CELULARES (ACELULARES)
Son partículas o moléculas de ADN o ARN + proteínas
NO SON VISIBLES con equipos ópticos comunes.
Provocan importantes enfermedades PERSISTENTES E
INCURABLES.
NO SIEMPRE PRESENTAN SÍNTOMAS VISIBLES
(LATENCIA)
REQUIEREN DE MÉTODOS O TÉCNICAS ESPECIALES
PARA SU DIAGNÓSTICO
POSTULADOS DE KOCH
1. EL AGENTE CAUSAL DEBE ESTAR O HABER ESTADO ASOCIADO CON LA ENFERMEDAD Y VICEVERSA. SINTOMATOLOGÍA (PUEDE CONFUNDIRSE CON FITOTOXICIDAD) NO PRESENTAN SIGNOS.
2. EL AGENTE PATÓGENO DEBE SER AISLADO AL ESTADO PURO, ENPLANTAS HOSPEDANTES PARA ESTUDIAR SUS CARACTERÍSTICASMORFOLOGICAS, SEROLÓGICAS, MOLECULARES, PROPIEDADES IN VITRO. No se cultivan, cómo los aíslo? Con qué métodos los detecto o estudio
sus propiedades? MÉTODOS BIOLÓGICOS, SEROLÓGICOS O MOLECULARES
3. UNA PLANTA HOSPEDANTE SANA DE LA MISMA ESPECIE Y EDAD AL SERINOCULADA CON EL AGENTE AISLADO EN CONDICIONES FAVORABLESDEBERÁ REPRODUCIR LOS SÍNTOMAS CARÁCTERISTICOS DE LAENFERMEDAD, Pruebas de patogenicidad? TRANSMISIBILIDAD
4. EL AGENTE FITOPATÓGENO DEBE SER REAISLADO DEL HOSPEDANTEINOCULADO AL ESTADO PURO E IDENTIFICADO CON EL AISLADOPRIMERAMENTE.
1- MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Estudia la ARQUITECTURA DE LAS PARTÍCULAS VIRALES (forma y tamaño)
Requiere de instrumental sofisticado Requiere de técnicos especialistas (capacitación) Es poco sensible Consume mucho tiempo No siempre se puede identificar la especie o el género
2- TÉCNICAS BIOLÓGICAS
SINTOMATOLOGÍA
RANGO DE HOSPEDANTES – PLANTAS INDICADORAS
TRANSMISIBILIDAD
ANÁLISIS DE LAS PROPIEDADES “IN VITRO” Punto de inactivación termal (PIT) Punto de dilución final (PDF) Desecamiento Longevidad “in vitro”
ESTUDIA LAS CARACTERISTICAS DEL VIRUS A TRAVÉS DE SU EXPRESIÓN EN PLANTAS HOSPEDANTES (BIOENSAYOS)
SINTOMATOLOGÍA
•Son indispensables para la valoración de los daños provocados por las virosis.
•Son en muchos casos los únicos recursos para un reconocimiento rápido en el cultivo.
• En pocos casos sirve por si sóla como método de diagnóstico. Ej Corcovo del tabaco causado por GRSV
Peste negra del tomate
i- SISTÉMICOS
(CAMBIOS DE COLOR)
• MOSAICOS (HOJAS)
•MOTEADOS (HOJAS)
•ESTRIADO (TALLOS)
Fotos de otra autoría.
SISTÉMICOS (CAMBIOS DE COLOR)
QUEBRADO (FLORES)ANILLADOS (FRUTOS)
Fotos de otra autoría.
SISTÉMICOS
(DEFORMACIONES)•CORDÓN DE ZAPATOS (HOJAS)
•AMPOLLADURAS
•HENDIDURAS (TRONCOS)
Fotos de otra autoría.
BIOENSAYOS
RANGO DE HOSPEDANTES conjunto de plantas que pueden ser infectadas por un virus determinado.
Plantas indicadoras son aquellas que responden de forma consistente y distintivasfrente a las infecciones virales en condiciones de invernáculo.
Pueden manifestar síntomas locales o sistémicos
RANGO DE HOSPEDANTES
TRANSMISIBILIDAD
EN LA NATURALEZA los VIRUS pueden transmitirse por:
INSECTOS POLEN SEMILLA (Virus del Mosaico del pepino, Mosaico común de la soja) CUSCUTA (holoparásita) ÓRGANOS DE PROPAGACIÓN VEGETATIVA (yemas de citrus CTV,
Psorosis; en tubérculos de papa PVY, en estacas c. de azúcar ScMV) ÁCAROS (Fam. Eriophydae) NEMÁTODES (Nepovirus – Xiphinema, Longidorus, Trichodorus) HONGOS (Olpidium brassicae - necrosis del tabaco) CONTACTO ENTRE PLANTAS ENFERMAS A SANAS (TMV, PVX)
CON LA INTERVENCIÓN DEL HOMBRE:
POR EL HOMBRE (HERRAMIENTAS, LABORES CULTURALES, ETC) INJERTO (TODOS) INOCULACION MECÁNICA (RANGO DE HOSPEDANTES)
TRANSMISIÓN POR INSECTOS
RELACIÓN VIRUS -VECTOR
Adquisición Incubación Transmisión
Persistente
Trips – TSWV
Circulativo propagativo
> 1 HORA Días a Semanas
Toda la vida
No persistente
Pulgón – PVY
No circulativo
No propagativo
Pocos segundos
NO TIENE Pocos minutos
Semi-persistente
Pulgón – CTV
Circulativo
No propagativo
Minutos a horas
Horas a días Depende de la adquisición
PROPIEDADES IN VITRO
•Punto de inactivación termal (PIT)Es la máxima temperatura que soporta el jugo viroso tratado durante 10 minutos sin perder su infectividad.
•Punto de dilución final (PDF)Es la máxima dilución que soporta el jugo viroso sin perder su efectividad.
•Desecamiento Es la capacidad de las partículas virosas de soportar el desecamiento de los tejidos donde se hallan incluidas, sin perder su infectividad.
•Longevidad “in vitro”Es el máximo tiempo que un virus permanece infectivo en el extracto vegetal, mantenidos en tubos cerrados, a temperatura de laboratorio.
Ej. Tobacco Mosaic Virus: PIT 92ºC, PDF 1/1.000.000, Desec. 50 años
Interpretación de los resultados de las técnicas biológicas
Los resultados se comparan con valores o respuestas YADETERMINADAS Y VALIDADAS PARA CADA ENTIDADVIRAL CONOCIDA (BIBLIOGRAFÍA , BANCOS DE DATOS)
SIRVEN PARA CARACTERIZAR UN VIRUS.
Son engorrosas, costosas, insumen mucho tiempo.
Ninguna por si sola permite la identificación de un virus.
Siempre es necesario complementar dos o mas técnicas.
3 - TÉCNICAS SEROLÓGICAS
SERODIAGNÓSTICO = DIAGNÓSTICO MEDIANTESEROLOGÍA = TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS
ESTUDIA LAS PROPIEDADES DE LA CUBIERTAPROTÉICA DE LOS VIRUS.
SE BASAN EN LA IDENTIFICACIÓN DE UN VIRUS(EL ANTÍGENO) A TRAVÉS DE LA REACCIÓNCON SUS ANTICUERPOS ESPECÍFICOS.
ANTÍGENO cualquier sustancia capaz de inducir una respuesta inmune cuando es introducida en un animal apropiado, lo que implica producción de nuevos anticuerpos.
Molécula AJENA al hospedante.
complejidad y de peso molecular.
Proteínas, glúcidos, polímeros de ácidos nucleicos, VIRUS, BACTERIAS, HONGOS O ALGUNOS DE SUS CONSTITUYENTES
REACTIVOS EN SEROLOGÍA
REACTIVOS EN SEROLOGÍA
ANTICUERPOS son moléculas proteicas(inmunoglobulinas) producidas en respuestaal antígeno que las originó. Circulan en elsuero sanguíneo (ANTISUERO) y se unenespecíficamente con el/ los antígenos quelos originaron.
Existen distintos tipos: IgG (80 %), IgA, IgM,
IgD y IgE.
Se localizan en suero sanguíneo
Reaccionan ESPECÍFICAMENTE con “su
Antígeno” mediante uniones no covalentes.
OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS
Los fitopatógenos inoculados en animalesvertebrados desencadenan “respuesta inmune”sin provocar enfermedad a los mismos.
Se pueden producir anticuerpos inyectandovirus fitopatógenos purificados en animales.
Los anticuerpos se emplean en diferentestécnicas.
Para inmunizar el animal se inyecta el virus purificados con un adyuvante (sustancias que estimulan la respuesta inmune, aumenta la producción de anticuerpos).
La sangría del animal se realiza varias semanas después de la inmunización.
La sangre se centrifuga, se precipita la fraccion sólida y se separa el suero (donde están los anticuerpos = antisuero)
PRUEBAS CON MOLÉCULAS INDICADORASO MARCADORES se emplean anticuerposy/o antígenos que están unidos amoléculas que tienen actividad propia yamplifican el poder de la pruebaaumentando su sensibilidad. Marcadores radioactivos Marcadores fluorescentes. Ensayos inmunoenzimáticos
E.L.I.S.A. marcadores enzimáticos
TÉCNICAS SEROLÓGICAS
ELISA (Enzime Linked Inmunosorbent Assay)
ANTICUERPOS:
especificidad para
reconocer al antígeno
que lo originó
CONJUGADO ENZIMÁTICO:
Anticuerpo marcado con una enzima
•La interacción específica Ag - Ac es reconocida por la acción de una
enzima unida a uno de los reactivos.
Distintas técnicas: DAS ELISA, NC ELISA, etc
ENZIMA: actividad
catalítica
E
Anticuerpos
Virus (Antígeno)
Anticuerpos
conjugados con
enzima
ESQUEMA DE LA TECNICA
DAS - ELISA
Celda
Sustrato
(Double sandwich antibody – ELISA)
1- COBERTURA DE LA PLACA CON
ANTICUERPOS (SENSIBILIZACION)2- PREPARACION Y AGREGADO DE LA MUESTRA (ANTIGENO)
3- AGREGADO DEL CONJUGADO ENZIMATICO
4- ADICIÓN DEL SUSTRATO
LAVADO
LAVADO
Lectura de absorbancia a longitud de onda de 405
nm mediante un ESPECTROFOTÓMETRO de
lectura vertical .
LECTURA DE LOS RESULTADOS
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
La presencia de color (mayores valores deabsorbancia) indica la presencia del virus, laintensidad del color puede usarse para estimar laconcentración de virus en la muestra.
VENTAJAS
ALTA ESPECIFICIDAD ALTA SENSIBILIDAD ( 1- 10 NG/ML) SIMPLICIDAD RAPIDEZ (LOS RESULTADOS SE OBTIENEN EN
POCAS HORAS) NUMEROSAS MUESTRAS SIMULTÁNEAMENTE
(96 CELDAS/PLACA) NO REQUIERE TRATAMIENTO ESPECIAL DE LAS
MUESTRAS (EXTRACTO CRUDO) POCO INFLUENCIADA POR LA MORFOLOGÍA DE
LOS PATÓGENOS
EL MÉTODO ELISA ES, POR LEJOS, LA TÉCNICA INMUNOLÓGICA MÁS UTILIZADA EN AGRICULTURA PARA LA IDENTIFICACION DE VIRUS
Baja concentración de patógenos en la muestra
Gran número de muestras (lotes de papa semilla,
semillero de caña de azúcar)
Rigor científico del análisis (Certificación de
yemas de citrus, papa semilla, controles
cuarentenarios)
Análisis de material asintomático (Inapariencia,
latencia)
Urgencia en entrega de los resultados
Concentración o movimiento de los virus en la
planta
TÉCNICAS SEROLÓGICAS: Aplicaciones
4- TÉCNICAS MOLECULARES DE DIAGNÓSTICO
ESTUDIA O DETECTA LOS ÁCIDOS NUCLÉICOS O GENES DE LOS VIRUS
SE BASAN EN LA PRESENCIA DE SECUENCIAS ÚNICASEN LOS ACIDOS NUCLEICOS DEL GENOMA DE CADA VIRUS.
REQUIERE DEL CONOCIMIENTO PREVIO DE LAS SECUENCIAS GENÉTICAS DEL VIRUS A DETECTAR (GENE BANK).
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Es una herramienta de extrema utilidad tanto porsu sensibilidad y especificidad como por susimplicidad.
Consiste en la multiplicación "in vitro" de unao unas pocas cadenas de ácido nucleico (DNA oRNA) de una longitud discreta hasta nivelestales que permitan su fácil detección en geles deagarosa.
Se fundamenta en los mecanismos naturalesde la replicación del ácidodesoxirribonucleico (DNA)
1- Es semi-conservativa, REQUIERE UNA HEBRA MOLDE (ADN VIRAL)
2- Requiere de CEBADORES (FRAGMENTOS DE ADN ESPECÍFICO Y COMPLEMENTARIO AL ADN VIRAL) para comenzar
3- La enzima POLIMERASA SINTETIZA LAS NUEVAS CADENAS
REPLICACIÓN
H
O
H H
HH
PO
O
O
-
-
H
OCH2
H
HO
H
HH
PO
O
O
-
H
OCH2
H
HO
H
HH
PO
O
O -
PO
O -
O
PO
O -
-
O
5' O
CH2
OH
P
O
O O-
O
O
O
O
H
Base Base
Base
O
CH2
P
O
O O-
O
H
Base
Base Base
O
CH2
P
O
O O-
O
H
O
CH2
P
O
O O-
O
H
Base
O
CH2
P
O
O O-
O
H
Base
Base
O
CH2
P
O
O O-
O
H
3'
HH
H
H
H
H
H
H
H
H
OH
H
OH
A T
G C
Deoxiribonucleósido 5' trifosfato a ser incorporado.
Nueva hebra sintetizada Hebra molde
O
H
H
OH
Pirofosfato inorgán ico l iberado
Dirección de síntesis de la nueva cadena
de DNA
Síntesis de DNA: La adic ión de deoxiribonuclótidos al extremo 3' de una cadena polinucleotídica es la reacción fundamental para la síntesis de DNA. El apareamiento de bases entre los deoxiribonucleótidos incorporados y la cadena molde es la guía para la formación de la nueva cadena que tendrá una secuencia nucleótidica complementaria.
CH2
La secuencia ADN VIRAL a detectar(amplificar) se somete a 30 ciclos decopiado en un pequeño tubo deensayo.MOLDE.
Fragmentos cortos de ADN(cebadores) complementarios aporciones específicas del acidonucleico viral se adhieren al ADNVIRAL.
La polimerasa termoestable es la quesintetiza múltiples copias de una hebrade ADN complementaria a la porciónde ADN comprendida entre los doscebadores
ETAPAS DE CADA CICLO 1-Desnaturalización del DNA, 2-hibridación de cebadores y 3-extensión de la nueva
cadena
5' 3'
3' 5'
DNA con sus cadenas
complementarias
desnaturalizadas
Primers
específicos
5' 3'
5'3'
Síntesis de DNA
Materiales necesarios
Para desarrollar una reacción de PCRse colocan en un tubo de microcentrífuga los siguientes reactivos:
DNA molde (ADN VIRAL)CEBADORES (DISEÑADOS EN FUNCIÓN AL
VIRUS A DETECTAR) DNA polimerasa, Desoxirribonucleósidos trifosfato (A,T,C,G) Tampón adecuado
TERMOCICLADOR
Para visualizar la reacción GELES DE AGAROSA CUBA ELECTROFORESIS TRANSILUMINADOR
N° de ciclos
3510203031
32
N° de doble cadenas con la
longitud prevista28
256262.144
268.435.456536.870.912
1.073.741.824
Partiendo de una molécula de DNA y asumiendo
una eficiencia del 100% en cada ciclo se obtienen:
EL PRODUCTO DE LA PCR PUEDE DETECTARSE USANDO ELECTROFORESIS EN GEL, POR CORRIENTE ELECTRICA SE SEPARAN A LAS MOLECULAS DE DISTINTOS TAMAÑOS.
LUEGO LOS FRAGMENTOS SE TIÑEN EN EL GEL CON UN PIGMENTO ESPECÍFICO PARA ACIDOS NUCLEICOS.
INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Calles 1: marcador de peso molecular
Calle 2: Testigo positivo TMV
Calles 3-5: muestras problema infectadas con TMV
Calle 6: muestra sin infeccion de TMV
1 2 3 4 5 6
LA VISUALIZACION DE UNA BANDA DEL TAMAÑO APROPIADO INDICA LA PRESENCIA DEL VIRUS PARA EL CUAL SE DISEÑARON LOS CEBADORES