fisiologia sanguinea y rh

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1 LABORATORIO FISIOLOGÍA SANGUÍNEA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA I. INTRODUCCION A. Frotis de Sangre Periférica El frotis de sangre periférica obtenido por punción capilar y coloreado con Wrigth o Giemsa, suministra un medio para estudiar la sangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura, forma y tamaño de los diferentes tipos celulares; así mismo permite por medio de las propiedades de coloración identificar características particulares como el contenido relativo de hemoglobina eritrocitaria. Es útil en el estudio de algunas alteraciones hematológicas y como indicador de la respuesta y los efectos deletéreos de diferentes tratamientos. Permite además observar agrupaciones de plaquetas y los glóbulos blancos, cada uno con su morfología característica. Dado que es un examen fácil de practicar hasta en el lugar más remoto y que está al alcance de cualquier profesional de la salud, el médico debe familiarizarse con la técnica e interpretación para tenerlo como arma diagnóstica cuando las posibilidades de laboratorios más sofisticados no estén a su alcance. A continuación encontrará una breve descripción de los elementos formes que debe observar en el frotis de sangre periférica: Eritrocitos Son células sin núcleo conocidas como glóbulos rojos o hematíes, de forma bicóncava que obtienen su energía principalmente de la glucólisis anaerobia. Su principal función es el transporte de oxígeno desde los pulmones a los diferentes tejidos, gracias a un transportador llamado hemoglobina (en este caso oxihemoglobina) y a su vez transportar desde los tejidos el CO2 producido por el metabolismo hacia el pulmón por medio del mismo transportador (en este caso carbaminohemoglobina). La concentración normal de hemoglobina en sangre se encuentra alrededor de los 15 g/dl (100 ml), con una media para el varón de 16,3 (13,5-18) y para la mujer de 14,5 (11,5-16,4). Los eritrocitos se constituyen en el principal elemento forme de la sangre y por ello la relación porcentual de células sobre el volumen total es una buena medida del porcentaje de eritrocitos. A este parámetro se le denomina Hematocrito y se expresa en volúmenes por ciento. Normalmente en el adulto, las cifras oscilan entre 36 y 50%, con

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LABORATORIO FISIOLOGA SANGUNEA PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA I. INTRODUCCIONA. Frotis de Sangre Perifrica El frotis de sangre perifrica obtenido por puncin capilar y coloreado con Wrigth o Giemsa, suministra un medio para estudiar la sangre y determinar las variaciones y anormalidades de estructura, forma y tamao de los diferentes tipos celulares; as mismo permite por medio de las propiedades de coloracin identificar caractersticas particulares como el contenido relativo de hemoglobina eritrocitaria. Es til en el estudio de algunas alteraciones hematolgicas y como indicador de la respuesta y los efectos deletreos de diferentes tratamientos. Permite adems observar agrupaciones de plaquetas y los glbulos blancos, cada uno con su morfologa caracterstica. Dado que es un examen fcil de practicar hasta en el lugar ms remoto y que est al alcance de cualquier profesional de la salud, el mdico debe familiarizarse con la tcnica e interpretacin para tenerlo como arma diagnstica cuando las posibilidades de laboratorios ms sofisticados no estn a su alcance. A continuacin encontrar una breve descripcin de los elementos formes que debe observar en el frotis de sangre perifrica: Eritrocitos Son clulas sin ncleo conocidas como glbulos rojos o hemates, de forma bicncava que obtienen su energa principalmente de la gluclisis anaerobia. Su principal funcin es el transporte de oxgeno desde los pulmones a los diferentes tejidos, gracias a un transportador llamado hemoglobina (en este caso oxihemoglobina) y a su vez transportar desde los tejidos el CO2 producido por el metabolismo hacia el pulmn por medio del mismo transportador (en este caso carbaminohemoglobina). La concentracin normal de hemoglobina en sangre se encuentra alrededor de los 15 g/dl (100 ml), con una media para el varn de 16,3 (13,5-18) y para la mujer de 14,5 (11,5-16,4). Los eritrocitos se constituyen en el principal elemento forme de la sangre y por ello la relacin porcentual de clulas sobre el volumen total es una buena medida del porcentaje de eritrocitos. A este parmetro se le denomina Hematocrito y se expresa en volmenes por ciento. Normalmente en el adulto, las cifras oscilan entre 36 y 50%, con 1

una media de 43% (en hombres son ms altos con una media de 46% que oscila entre 43% y 49%, mientras que en la mujer la media es de 40% con valores lmite entre 35% y 45%). Finalmente la concentracin normal de eritrocitos en la sangre se encuentra entre 3,55,5 millones/mm3 en mujeres y entre 4,3-5,9 millones/ mm3 en hombres. El mayor nmero en los hombres se debe al efecto eritrognico de los andrgenos. La disminucin numrica de los glbulos rojos por debajo del lmite inferior se le conoce como ANEMIA, que va acompaada por una consecuente disminucin del hematocrito y la hemoglobina. De acuerdo a la proporcin en que disminuya cada parmetro es posible orientar el diagnstico como se revisar ms adelante en la seccin "Interpretacin". Leucocitos Conocidos tambin como glbulos blancos. Su principal funcin es de defensa contra agentes externos mediante dos tipos de respuesta: celular y humoral. Normalmente hay entre 5000 y 10000 leucocitos por mm3 y se habla de leucopenia cuando se encuentran disminuidos y de leucocitosis cuando estn aumentados. De acuerdo a la presencia o ausencia de grnulos especficos, los leucocitos pueden ser clasificados como granulocitos (neutrfilos, eosinfilos, y basfilos) y agranulocitos (linfocitos y monocitos). Existen valores normales de los diferentes tipos de leucocitos en proporcin porcentual y en valores absolutos. Este parmetro se denomina recuento diferencial y permite orientar las causas fisiopatolgicas de una leucopenia o una leucocitosis Las principales caractersticas de los diferentes tipos de leucocitos se presentan en los siguientes cuadros sinpticos: NEUTRFILOS Carctersticas generales Valor normal: 3000-6000 clulas/L 50-70% de los leucocitos. Tamao: 12-14 m. Funcin principal: Respuesta inflamatoria aguda. Poseen un ncleo multilobulado (3-5 lobulaciones) y grnulos azurfilos (lisosomas) en su citoplasma que contienen enzimas hidrolticas, lisozyma y mieloperoxidasa, las cuales le permiten actuar en la fase aguda de la inflamacin.

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EOSINFILOS

Carctersticas generales Valor normal: 150-300 clulas/L 0,5-4% de los leucocitos. Tamao: Similar al de los neutrfilos. Funcin principal: Respuesta contra parsitos. Tienen un ncleo bilobulado y poseen granulaciones acidoflicas que contienen enzimas hidrolticas y peroxidasa que son liberadas en las vacuolas fagocticas. Estn involucrados en mecanismos que desencadenan alergia.

BASFILOS

Carctersticas generales Valor normal: 0 a 100 clulas/L 0,5 % de los leucocitos. Tamao: 10-13m. Poseen un ncleo bilobulado y grandes grnulos esfricos basoflicos y metacromticos dados por heparina e histamina. Liberan adems aminas vasoactivas y sustancia de reaccin lenta de la anafilaxia.

MONOCITOS

Carctersticas generales Valor normal: 300 a 600 clulas/L 2-8 % de los leucocitos. Tamao: 15-20 m. Son las clulas circulantes de mayor tamao. Poseen un ncleo excntrico en forma de U o en forma arrionada. Son los precursores del sistema mononuclear fagoctico, que incluye diferentes tipos de macrfagos: en tejido (histiocitos), en hueso (osteoclastos), en pulmn (macrfagos alveolares), en hgado (clulas de Kupfer) y la microglia en el sistema nervioso central.

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LINFOCITOS

Carctersticas generales Valor normal: 1500 a 4000 clulas/L 20-40 % de los leucocitos. Tamao: 6-10 m. 11-15 m. 16-25 m Generalmente son clulas pequeas que contienen un ncleo circular oscuro y un escaso citoplasma azul claro. Existen dos tipos: Linfocitos T: Se diferencian en el timo y circulan en la sangre perifrica, donde ellos son los principales artfices de la inmunidad celular. Poseen funciones como ayudadores (CD4) supresores (CD8), modulando la respuesta a travs de sus efectos sobre otras clulas. Linfocitos B: se diferencian en la mdula sea y son los principales encargados de la respuesta humoral a travs de la produccin de anticuerpos. Una vez se colocan en contacto con un antgeno se diferencian en clulas plasmticas que sintetizan anticuerpos.

Es importante tener en cuenta tanto los valores porcentuales como absolutos, ya que la variacin total de leucocitos (v.g. leucocitosis leucopenia) puede modificar la proporcin de sus componentes sin afectar el valor absoluto de estos. Plaquetas Son fragmentos citoplasmticos anucleados de clulas gigantes llamadas megacariocitos, originados en la mdula sea. Se observan en el frotis de sangre perifrica como agregados basoflicos. Su principal funcin es la creacin y propagacin del cogulo.

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B. Hemoclasificacin La membrana de los eritrocitos contiene ms de 300 determinantes antignicos distintos, cuya estructura molecular est determinada por gran nmero de genes. Se habla de grupo sanguneo al referirse a cualquier sistema bien definido de antgenos eritrocitarios controlados por un locus que tiene un nmero variable de genes allicos, como lo son A, B y O en el sistema ABO. El tipo de sangre se refiere al fenotipo antignico, que es la expresin serolgica de los genes del grupo sanguneo heredado. Las clasificaciones incluyen los aloanticuerpos, los cuales aparecen en forma natural (es decir en ausencia de estmulo conocido de eritrocitos extraos), en respuesta a la transfusin teraputica o durante el embarazo. La determinacin del tipo sanguneo de un individuos se puede realizar haciendo reaccionar sus glbulos rojos con antisueros especficos para los determinantes antignicos de su superficie. Los glbulos rojos pueden ser clasificados segn los antgenos en A, B, O, Rh(D), MN, Kell, P, Duffy y Kidd (hay muchos otros grupos sanguneos reconocidos hasta la actualidad pero de menor importancia clnica). La hemoclasificacin de rutina solamente verifica los sistemas ABO y Rh, dado que son los que en clnica pueden causar mayor problema, en lo que se refiere a reacciones transfusionales. El sistema antignico ABO permite diferenciar cuatro grupos distintos de sangre: El A, el B, el AB y el O, de acuerdo con el tipo de antgeno presente en la membrana celular. Los antgenos responsables de estos grupos son oligosacridos que se encuentran no slo en los eritrocitos humanos, sino tambin en algunas bacterias entricas y en algunos alimentos vegetales. La produccin de estos antgenos est controlada genticamente por un locus con tres alelos, localizado en el brazo largo del cromosoma 9.

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El sistema Rh cuyo locus se localiza en el cromosoma 1, tiene un juego de tres determinantes antagnicos; C o c, E o e, y D o d. El antgeno D es el ms inmunognico de este sistema. Cerca del 15% de la poblacin carece del antgeno D, por tanto son Rh negativos. Hay aloanticuerpos para el sistema ABO, mientras que es necesaria la sensibilizacin para desarrollar anticuerpos contra los antgenos del sistema Rh. C. Hemostasia La hemostasia tiene como funcin la prevencin de la prdida de sangre y del mantenimiento del flujo sanguneo. Los mecanismos hemostticos que actan en un sangrado incluyen espasmo vascular, formacin del tapn plaquetario, coagulacin de la sangre gracias a la activacin de factores plasmticos, y crecimiento de tejido fibroso dentro del cogulo con el fin de reparar la lesin en forma permanente. Vasoespasmo Existe una proporcin directa entre la magnitud del traumatismo a los tejidos y la aparicin de vasoespasmo (v.g una lesin cortante producir ms sangrado que una lesin contusa). Esta fase esa influenciada por factores neurohumorales como el sistema nervioso simptico o agentes vasoactivos de accin local. Tapn Plaquetario Las plaquetas se agregan en el sitio de la lesin y limitan el sangrado, hasta que se lleve a cabo una reparacin definitiva. Este proceso ocurre de forma secuencial: Adhesin: Por ruptura de pared y exposicin del colgeno, se adhieren plaquetas. Agregacin: La alteracin del vaso comprometido y las primeras sustancias plaquetarios permiten que se agreguen ms plaquetas. Principalmente el ADP y Tromboxano A2 (TxA2) plaquetarios que promueven la agregacin y la Prostaciclina (PGI2) de las clulas endoteliales que inhiben el proceso. Edematizacin plaquetaria: Las plaquetas adheridas sufren cambios en su morfologa (edematizacin y conformacin irregular) para una mejor cohesin. En esta fase se produce liberacin de algunos productos que promueven su mayor adhesin. - Calcio: Aumenta el grado de agregabilidad plaquetaria. - Aminas vasoactivas(serotonina, epinefrina y kininas): Promueven la vasoconstriccin local. - Tromboplastina y factor plaquetario 3 (PF3): Promueven la accin de los factores sricos sobre el cogulo plaquetario. El paso final consiste en la retraccin del cogulo dada por la contraccin de algunas protenas contrctiles como la actina, dentro del cogulo. En el laboratorio realizaremos el tiempo de sangra es decir una prueba para cuantificar la duracin de la hemorragia posterior a una puncin capilar, que es un buen indicio de la funcin plaquetaria y de la integridad vascular. Por ello es una prueba til para la evalacin de la fase vsculoplaquetaria de la coagulacin sangunea.

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Coagulacin Plasmtica Es el tercer mecanismo hemosttico para la formacin del cogulo que comienza en 1 a 2 minutos en lesiones leves y en 15 a 20 minutos en traumas leves. El trauma de los tejidos o de los vasos sanguneos o el contacto de la sangre con el colgeno produce la activacin de dos vas compuestas de protenas plasmticas conocidas como factores de la coagulacin que finalmente producirn la formacin del activador de la protrombina. La va extrnseca que se origina en lesiones de tejidos diferentes al sistema vascular cuyo dao libera tromboplastina tisular (Factor III) y fosfolpidos. Por otra parte la va intrnseca La va intrnseca como su nombre lo indica se inicia con lesin del sistema vascular lo cual condiciona la exposicin del colgeno y la subsiguiente activacin del factor Hageman (Factor XII):

Como puede ver en la figura anterior cada va activa factores distintos, pero ambas convergen en el complejo activador de la protrombina (Factor Xa + Va + Fosfolpidos). Este complejo convierte la protrombina en trombina que aumenta la agregacin plaquetaria, convierte el fibringeno en monmeros de fibrina y activa el factor XIII. Los monmeros forman grandes polmeros de fibrina y el factor XIII cataliza la formacin de enlaces covalentes que finalmente llevan a la formacin de una fuerte malla de tejido que rodea el tapn plaquetario con el fin de iniciar el proceso de reparacin.

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La fibrinolisis se produce cuando el cogulo induce la liberacin del activador del plasmingeno que convierte el plasmingeno en plasmina que a su vez hace protelisis del fibringeno y de la fibrina. En el laboratorio realizaremos el tiempo de coagulacin total que es una de las pruebas ms antiguas pero relativamente tiene baja sensibilidad y es de poco valor. Da un indicio de la integridad del sistema humoral de coagulacin, es decir la fase plasmtica, pero sin ser especfica para la va intrnseca o extrnseca. Esta prueba es popular, pero es la menos efectiva de todas en el diagnstico de desrdenes especficos de coagulacin presentes o potenciales. A pesar de todo, es un arma diagnstica en ausencia de otras pruebas de laboratorio ms especializadas y que se utilizan de rutina como:

PRUEBAS DE COAGULACINNombre de la TTP TP prueba (Tiempo parcial de (Tiempo de protrombina) tromboplastina) Va evaluada Intrnseca Extrnseca Valor normal El valor de referencia oscila entre El valor de referencia oscila entre 20 y 40 segundos. 11 y 13 segundos. Sin embargo debido a la variacin de los reactivos, se cre un ndice de referencia llamado INR (Internacional Normalized Ratio) cuyo valor normal est alrededor de 1.5. Mtodo Valorada gracias a la Tiene una fase similar a la recalcificacin del plasma en anterior (inicialmente se hace estudio, en el cual se sustituye la incoagulable por la adicin del accin del factor III plaquetario citrato y posteriormente se (tromboplastinas) por el recalcifica), con una segunda fase fosfolpido cefalina permitiendo en la cual se aade un exceso de valorar con ello la va intrnseca tromboplastina tisular, razn por (XII, XI, IX y VIII) as como la la cual la formacin del cogulo a va comn (X, V, protrombina y posterior se presume dependiente fibringeno). de los factores de la va extrnseca y de la va comn (VII, X, V, protrombina y fibringeno). Frmacos La HEPARINA altera los La WARFARINA altera los que la resultados de esta prueba. Se resultados de esta prueba. Se modifican administra por va parenteral administra por va oral

C. Resumen componentes sanguneos As que la sangre tiene dos componentes grandes el componente celular (en su mayor parte por eritrocitos) conocido como hematocrito y el componente no celular conocido

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como plasmocrito. El plasma como tal es la porcin lquida de la sangre y corresponde a aproximadamente el 5% del peso corporal de un sujeto adulto sano. Si por alguna razn se deja el plasma en un tubo de ensayo, ste presentar reacciones que llevarn a su coagulacin, de tal forma que slo permanecer lquido si se le aade un anticoagulante. Se puede obtener tambin suero al dejar coagular la sangre y retirar el lquido remanente. Ese lquido en esencia es similar al plasma excepto por la eliminacin de los factores I, II, V y VIII (fibringeno, protrombina, proacelerina y factor antihemoflico respectivamente) y por una elevacin de los niveles de serotonina producto de la ruptura de las plaquetas. A continuacin un cuadro sinptico de los principales componentes sanguneos: Elementos celulares (45%) Leucocitos (5000-10000 mm3) Plaquetas (140.000-400.000 mm3) Hemates (3,5-6millones mm3) Solutos 1,5% Protenas plasmticas 7% Neutrfilos 50-70% Basfilos 0,5% Eosinfilos 0,5-4% Linfocitos 20-40% Monocitos 2-9%

Plasma (55%)

Albminas 54% Globulinas 38% Fibringeno 7% Protrombina y Otras 1%

1 5% 2 9% 13% 11%

Agua 92%

II. OBJETIVOSUna vez finalizada la prctica de laboratorio y el seminario correspondiente el estudiante debe estar en capacidad de: 1. Realizar correctamente un frotis de sangre perifrica, utilizando la coloracin de Wright. 2. Conocer los valores normales de hematocrito y hemoglobina en hombres y mujeres. 3. Aprender a calcular el volumen corpuscular medio y la hemoglobina corpuscular media con base en los datos de hematocrito, hemoglobina y eritrocitos/mm3. Determinar que tipo de anemia se presenta con base en estos parmetros. 4. Identificar y describir los diferentes elementos celulares (tamao, forma, color) del frotis de sangre observados al microscopio.

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5. Realizar un recuento diferencial de clulas blancas (expresado en porcentaje) del extendido en lmina. Determinar que tipo de patologa presenta el paciente de acuerdo a este recuento. 6. Clasificar la muestra de sangre obtenida segn su grupo sanguneo (ABO y Rh). 7. Conocer como se forman bioqumicamente estos grupos y aprender a utilizar los cuadros de Punnett, para demostrar la probabilidad genotpica y fenotpica de heredar determinado grupo sanguneo. 8. Explicar el fenmeno de eritroblastosis fetal y conocer las bases fisiolgicas de las terapias que existen para prevernirla. 9. Calcular y comparar los valores normales de los exmenes de laboratorio ms empleados en la prctica hospitalaria para detectar alteraciones de la coagulacin. 10. Describir y explicar las fases de la coagulacin sangunea y el mecanismo de cada uno de los sistemas inhibidores de la coagulacin. 11. Identificar y reconocer las otras pruebas de coagulacin que no realizamos en nuestro laboratorio de fisiologa, esenciales para la evaluacin de la va intrnseca y extrnseca, adems su utilidad en la evaluacin de la actividad de algunos anticoagulantes utilizados frecuentemente en la prctica clnica. 12. Conocer como se administran estos anticoagulantes.

III. MATERIALESFrotis de sangre perifrica: Lancetas (3), placas de vidrio (5), colorante de Wright, pipetas, aceite de inmersin y microscopio. Hemoclasificacin: Lancetas (una por persona), placas de vidrio y antisueros especficos (anti-A, anti-B y anti-D). Tiempo de Coagulacin: Jeringa desechable, tres tubos de ensayo y cronmetro. Tiempo de Sangra: Lanceta, papel de filtro y cronmetro. NOTA: Cada estudiante debe traer un par de guantes desechables al laboratorio. Por razones de bioseguridad este es un requisito indispensable para asistir a la prctica.

IV. METODOSprimum non nocere Recomendaciones en el momento de tomar la muestra: 1. La posicin: Hay que tener en cuenta que las concentraciones de hemoglobina y protenas son mayores en la posicin vertical que en la horizontal, ya que el agua del plasma sale de los vasos en las partes declives. En pacientes ambulatorios se recomienda la sedestacin en una silla con apoyabrazos. 2. El paciente: Tener en cuenta la contextura (obesidad, caquexia). Si las venas no se ven se pueden palpar debajo de la piel (recordar reparos anatmicos). 3. Ojo con la conservacin de las venas: Los hematomas que despliegan todos los colores del arco iris en las fosas antecubitales, alrededor de las muecas y en 10

otros diversos lugares, son testimonio elocuente de la torpeza o de la falta de sentido comn del operador. Drs. Davidson, Douglas y Nelson. Tcnica: Los siguientes son pasos a considerar para tomar la muestra: 1. Asepsia y antisepsia: aunque es un procedimiento sencillo debemos tener en cuenta que con la venopuncin se producen fenmenos importantes que pueden afectar al paciente o al examinador mismo. Por un lado rompemos la barrera cutnea a las infecciones as que debemos impedir la exposicin de nuestro paciente a cualquier invasor por medio de la desinfeccin del rea de puncin. Nosotros tambin nos exponemos a infecciones de nuestro paciente por lo que debemos utilizar todas las normas de bioseguridad que incluyen como mnimo la utilizacin de guantes e inclusive tapabocas y gafas de proteccin. 2. Mientras se seca el alcohol (o cualquier otro antisptico) se aplica el brazalete o torniquete. En caso de usar brazalete el punto ptimo de presin ser un valor medio entre la presin sistlica y la diastlica. Si se utiliza torniquete de goma se busca primero suprimir el pulso radial y luego se afloja para volver a sentir el pulso radial. 3. Algunos autores no recomiendan el abrir y cerrar el puo varias veces ya que tericamente el ejercicio muscular causa alteraciones del pH y desplazamientos del agua y electrolitos entre los espacios intra y extracelulares. 4. En cuanto al stasis venoso durante 30 o 60 segundos se cree que no modifica de manera importante la determinacin de electrolitos y el equilibrio cido-base. Sin embargo el stasis arterial si debe tenerse en cuenta, por ello el torniquete debe tener una presin adecuada (ver numeral anterior). 5. La puncin venosa no es dolorosa y es un procedimiento relativamente fcil si se hace como un golpe seco y rpido, manteniendo el bisel de la aguja hacia arriba y con un ngulo de inclinacin aproximado de 15. No hay que enterrar la aguja, simplemente seguir el trayecto de la vena y esperar a que salga sangre en el embolo. 6. Luego de penetrar la vena no se recomienda quitar el torniquete porque esto puede generar un flujo de metabolitos desde los lechos estticos y el flujo sanguneo puede disminuir. 7. El torniquete se puede aflojar luego que el flujo sanguneo es continuo o soltar definitivamente. 8. Retiramos la aguja rpidamente y cubrimos con una torunda de algodn humedecida en antisptico (alcohol 70). Verificamos el estado de nuestro paciente y luego si continuamos con el marcado y anlisis de la muestra. Recomendaciones para el manejo de la muestra: Una vez tomada la muestra es importante que se mantenga estable hasta que se realicen los anlisis respectivos. De tal manera que previamente hemos debido tener tubos limpios y listos con diferentes frmacos que evitan situaciones como la coagulacin o hemlisis o especialmente diseados para anlisis especiales como plomo, perfil lipdico, etc.

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Extendido de Sangre, Coloracin y Recuento La informacin obtenida de un frotis de sangre perifrica depende en gran parte de la calidad del extendido. Para realizarla de forma adecuada lea cuidadosamente los siguientes pasos: 1. La gota de sangre se coloca en el extremo de una lmina limpia. 2. Otra lmina de borde liso se coloca en ngulo de 45 sobre la gota dejando que la sangre se extienda sobre el bordo ms angosto e inclinado de sta. 3. Luego se procede a deslizarla suavemente hacia el extremo opuesto tratando de arrastrar la gota en forma constante y uniforme dejando una pelcula fina de sangre homogneamente distribuida. 4. Una vez se logra adecuadamente este procedimiento se dejar secar. 5. Luego se coloca la preparacin en un soporte y se cubre con el colorante de Wright, dejndolo por espacio de 5 minutos. 6. Posteriormente se aade agua en partes iguales hasta obtener un brillo metlico, dejando 6 minutos adicionales. 7. Finalmente se lava con agua corriente y se deja secar. Ahora que se ha finalizado la preparacin de la lmina, se coloca en el microscopio y con el objetivo panormico se revisa la calidad de la coloracin, la cantidad aproximada de glbulos blancos y se escoge el sitio para iniciar el recuento. Se puede ir acercando paulatinamente al rea modificando el aumento (10X, 20X, 40X). Luego coloque una gota de aceite de inmersin y pase a mayor aumento (100x) enfocando simultneamente. La forma de los glbulos rojos se examinar detenidamente, observando adicionalmente el contenido de hemoglobina (color del eritrocito). Se observar la presencia de Plaquetas, su agrupacin y distribucin. Posteriormente se hara un identificacin diferencial de glbulos blancos, para lo cual el estudiante deber conocer las caractersticas tincionales entre neutrfilos, eosinfilos, basfilos, linfocitos y monocitos. Revise la tabla de leucocitos que aparece en la introduccin para recordar las caractersticas especficas de cada uno de ellos. Hemoclasificacin La determinacin de los diferentes grupos sanguneos se basa en la aglutinacin que se produce en los glbulos rojos cuando se ponen en contacto con anticuerpos aglutinantes especficos contra los antgenos de su superficie. Para el sistema ABO, utilizamos sueros anti-A y anti-B. Para el Rh usamos un suero anti-Rh (anti-D).

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Se deben colocar en un porta-objetos previamente marcado A-B-Rh, tres gotas obtenidas por puncin capilar o venosa. A cada una de ellas se aade una gota del respectivo antisuero. Preferiblemente la lmina debe estar a 37C, temperatura ptima para la aglutinacin para el Rh. Las muestras se homogenizan con un palillo y se observa en cul de ellos se ha producido la unin de glbulos rojos que hace que estos se precipiten dando un aspecto grumoso. La presencia de aglutinacin indicar que los glbulos rojos poseen ese determinado antgeno en su superficie. Ej: si hay aglutinacin en la gota A, pero no en la gota B , el grupo sanguneo ser A y as respectivamente. Pruebas de Coagulacin Para el estudio de las funciones hemostticas en nuestro laboratorio utilizamos tres de los mtodos ms antiguos y sencillos. Tiempo de Sangra: La duracin de la hemorragia posterior a una puncin cutnea es muy buen indicio de la funcin plaquetaria y de la integridad vascular: a) Mtodo de Duke: Previa limpieza con alcohol del lbulo de la oreja o del pulpejo del dedo anular, se realiza puncin con lanceta desechable hasta introducir la totalidad de la punta. Recuerde que la puncin debe hacerse con una maniobra rpida y segura disminuyendo el dolor. Una vez realizada sta, se comienza a contabilizar el tiempo. La sangre debe fluir libremente sin ningn tipo de presin, dejando que gotee sobre un papel de filtro el cual se mover de tal manera que cada gota caiga en una rea limpia. Cuando la salida de la sangre se va haciendo lenta y ya no caen ms gotas sobre el papel, se tocar la herida nuevamente, con intervalos de 30 segundos. Cuando la sangre no tia el papel, se registra el tiempo transcurrido. Tiempo de Coagulacin de la Sangre Total: La sangre total al ser extrada del sistema vascular y entrar en contacto con una superficie extraa formar un coagulo firme. El tiempo que toma la formacin de ste, es una medida de la coagulacin. La toma de sangre debe hacerse por puncin venosa directa, que debe ser lo ms limpia posible puesto que los tejidos que se desprenden pueden contaminar el lquido con sustancias que actan como tromboplastinas. La sangre debe fluir libremente y no formar burbujas. Una vez extrada la sangre, se retira la aguja y se coloca 1 ml en cada uno de tres tubos de ensayo secos y limpios. Se llevan a un bao de agua a 37C o a temperatura corporal entre las manos. Pasados tres minutos se inclinarn los tubos con intervalos de 15 segundos observando el flujo hasta el momento de la coagulacin. (La agitacin fuerte modifica los tiempos por tanto el movimiento debe hacerse cuidadosamente). Se toma tiempo desde el momento de la puncin hasta la formacin del cogulo en cada tubo. El tiempo de coagulacin ser el promedio de los tiempos obtenidos en cada uno

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de los tres tubos. Adicionalmente utilizaremos un cuarto tubo, que ser mantenido a temperatura ambiente. Observe si existe o no diferencia en los tiempos de coagulacin de las muestras a temperatura corporal comparadas con ste ltimo. Si existe diferencia investigue cul puede ser la razn. Fragilidad capilar Se dibuja un crculo de 3cm en la cara flexora del antebrazo a 3cm del pliegue del codo luego se coloca el brazalete del esfigmomanmetro con una presin entre 80-100mmHg y se deja por 5 minutos al cabo de los cuales se retira y se cuenta el nmero de petequias en el crculo. (Negativo = 0-10 petequias, Dudoso = 10-20 petequias, Anormal = ms de 20 petequias). Interpretacin = Alteraciones plaquetarias o capilares. Separacin plasmacrito-hematocrito Tome dos muestras de sangre de 5ml y depostelas en tubos de ensayo. Luego lleve a la centrifugadora y someta las muestra por cinco minutos, al cabo de los cuales usted observar las dos fases formadas.

V. INTERPRETACINEn el frotis de sangre perifrica se pretende evaluar morfolgica y cuantitativamente los elementos formes de la sangre. En individuos normales encontraremos glbulos rojos, no excesivamente coloreados o hipercrmicos, ni lo contrario (hipocrmicos), con forma redondeada bicncava, de tamao uniforme, anucleados etc. Cualquier morfologa que se salga de estos parmetros podra considerarse anormal. Recuerde que una disminucin numrica de los glbulos rojos por debajo del lmite inferior se le conoce como ANEMIA, que va acompaada por una consecuente disminucin del hematocrito y la hemoglobina. Una vez se hace el diagnstico de esta enfermedad, se realiza una clasificacin de la misma, de acuerdo al tamao de los glbulos rojos (macrocitosis, normocitosis, microcitosis) y a la coloracin de los mismos (hipercroma, normocroma e hipocroma). El tamao se evala mediante el clculo del Volumen Corpuscular Medio (VCM), mediante la siguiente operacin: VCM = Valor hematocrito (ml/100) / Eritrocitos (millones/ mm3) El resultado se expresa en micrometros cbicos femtolitros y oscila normalmente entre 80 y 94. 94 : macroctica (v.g. anemia perniciosa)

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La coloracin o croma se evala con la Hemoglobina Corpuscular Media (H.C.M), con el siguiente clculo: HCM = Valor hemoglobina (g/dl) / Eritrocitos (millones/ mm3) El resultado se expresa en picogramos, con un valor normal promedio de 29,5 pg. (2732pg) 32pg :hipercrmica (v.g. anemia perniciosa) Recuerde que estos clculos se usan para estimar cual es el volumen y la hemoglobina que en promedio tiene cada glbulo rojo, por lo tanto las cantidades son muy pequeas. En segundo lugar se deben observar los leucocitos. El predominio de neutrfilos con la llamada desviacin a la izquierda es decir, la aparicin de ms de 1% de cayados en sangre perifrica, nos puede indicar la presencia de un proceso bacteriano agudo en nuestro paciente. El predominio de linfocitos, puede indicar la presencia de una infeccin bacteriana crnica, o una enfermedad viral. Cuando son los eosinfilos los que predominan, se puede pensar en infeccin parasitaria. Para la hemoclasificacin, es necesario tener en cuenta, que cuando los glbulos rojos aglutinan con un antisuero determinado, esto indica la presencia de un antgeno de membrana especfico; de manera tal que una muestra que aglutine con anti-A, y no con anti-B es definitivamente grupo A. Debe recordarse que la aglutinacin para el Rh no se logra fcilmente atemperatura ambiente, de manera que es necesario llevar a 37 C esta muestra para obtener un resultado contable. Si definitivamente la muestra no aglutina indica que corresponde a una Rh negativo. El tiempo de sangra por el mtodo de Duke debe ser menor de 4 minutos, mientras que el tiempo de coagulacin normal debe tener una duracin menor de 9 minutos.

VI. PREGUNTAS PARA RESOLVER DURANTE EL SEMINARIO1. Nombre 4 variaciones anormales de la morfologa eritrocitaria en frotis de sangre perifrica y la patologa a que pertenece cada una. 2. Si al hemoclasificar un individuo encuentra que su sangre no aglutina con AntiA ni con Anti-B, pero al transfundirlo con sangre O hace hemlisis, Cul es el grupo sanguneo al que probablemente pertence este paciente? Este grupo se caracteriza por la ausencia de qu antgenos de superficie? 3. es posible que el padre de un nio grupo AB y con madre grupo AB sea grupo O?

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4. Una mujer Rh(-), con su primer embarazo tiene un hijo Rh(+), espera usted que el nio haga o no hemlisis? Por qu? 5. Complete el siguiente cuadro: Grupo Antgenos de superficie Anticuerpos en suero A B AB O 6. Cmo evaluamos el grado de anticoagulacin de un paciente que est recibiendo coumadina? Cul es el mecanismo de accin de esta droga? 7. Cmo evaluamos el grado de anticoagulacin de un paciente que est recibiendo heparina? Cul es el mecanismo de accin de esta droga?

Esperamos que esta gua de laboratorio haya sido una herramienta didctica para su aprendizaje cualquier comentario es bienvenido. Departamento de Ciencias Fisiolgicas

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