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Principios bsicos de la Tcnica de filtracin por Membrana.Mara Jos Salas L. McAsesora comercial Biociencia

Qu son las membranas?Membrana es una barrera fina que pueden separar componentes de fluidos

Para qu filtramos?Separar partculas de fluidos o soluciones Recolectar y/o concentrar una muestra para anlisis.Clarificar un fluido (lquido o gas)EsterilizarProteger de partculas o lquidos la instrumentacin crtica

RETENCION (separacin) DE PARTICULAS PRESENTES EN UN FLUIDO (lquido o gas) A TRAVES DE UN MATERIAL POROSO, FIBROSO O GRANULAR (permeable).

Que significa filtrar?Filtracin MicroporosaFlujo0.45 micras0.45 micrasUnidades de medida Un Micrmetro es una millonsima parte de un metro. O una milsima de milmetro. Tambin denominada como Micra. 1mm = 0,39 diez milsima de una pulgada. El mnimo visible del ojo humano es alrededor de 40 mm.Tamaos moleculares14 mm5 mm3 mm1.2 mm0.45 mm0.22 mm0.1 mm0.025 mmultrafiltracinTAMAOSTIPICOSCabello Humanode 60-80 mmPartculas visibles alojo humano >50 mmClulas rojas de la sangre10-30 mmClulas de levadurasde 5-10 micronesHumo de CigarrilloLa bacteria ms pequeaVirus

HIDROFOBICOSNo son afines con el aguaSe humedecen con lquidos de baja tensin superficialAmplia compatibilidad con solventes orgnicosSe utilizan tambin como filtros de venteoGran variedad de materialesTrabajan a bajas presionesSegn su naturalezaSe usa cuando usted desea que el filtro permanezca seco, ya que el gas no fluir fcilmente cuando los poros estn hmedos (venteos, tanques de fermentacin etc)

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Segn su naturalezaHIDROFILICOSSe humedece con soluciones acuosasEs compatible con soluciones acuosasLa compatibilidad con solventes orgnicos es limitada dependiendo del materialGran variedad de materialesTrabajan a altas presiones

Filtros de ProfundidadFibras entrelazadasTamao de poro nominalSon gruesos por lo que pueden ser adsorbentesAlta capacidad de retencinBaja eficiencia < 95%Trabajan a bajas presionesSon econmicos (fibra de vidrio, polipropileno etc.)

Segn su Retencin

Filtros de SuperficieSu estructura ms compactaMayor eficiencia 99.9%Tamao de poro nominalSon ms delgados que los de profundidad (ligeramente adsorbentes)Retienen las partculas en la superficie y en la matrizPolipropileno, celulosa

Segn su Retencin

Filtros Absolutos o de MembranaTienen estructura geomtrica producida por moldeoSu retencin es en la superficieSon delgados por lo que no adsorben el productoSu eficiencia es del 99,9999999%Hidroflicos o HidrofbicosCelulosa, PVDF, Nylon, PES

Segn su RetencinBacteria Tipo Coco, Staphylococcus sp

http://www.pbrc.hawaii.edu/~kunkel/gallery/Bacillus megabacterium (Bacteria con forma de bastn largo)

http://www.pbrc.hawaii.edu/~kunkel/gallery/Bacteria Tipo Bacilo, E. coli (division)

http://www.pbrc.hawaii.edu/~kunkel/gallery/Filtros de profundidad, superficie y absoluto.Remocin relativa por tamao y eficienciaMicrn Sub micrn 100 m1 m0.05 mFiltros de profundidadFiltros de superficieFiltros Absoluto.95% eficiencia de retencin99.9999999% eficiencia de retencinSegn tamao de poroSEGN COMPOSICION QUIMICAAcrlicoCA (Acetato de celulosa)NC (Nitrocelulosa)MCE (Mezcla de esteres de celulosa)NylonPolietersulfonaPolicarbonatoPolipropilenoPTFE (Tefln (Polytetrafluoroethylene)PVC (Polivinil clorido)PVDF (Fluoruro de polivinilideno))

Factores a tener en cuenta para la eleccin de una unidad de filtracinCompatibilidad QumicaTipo de Muestra.Volumen a filtrar o tamao de la muestraAplicacin.ExtractablesNivel de contaminacin.Si se necesita una filtracin fina o filtracin esterilizante.

COMPATIBILIDAD QUIMICA Y TIPO DE MUESTRASolucinMembranaAcuosa Mezcla de esteres de CelulosaAcuosa con protenasDurapore (PVDF)Acosa ligeramente orgnica Durapore (PVDF),PTFE, NylonOrgnica PTFE Hidrfobo e HidroflicosJerarqua de SeleccinCompatibilidad = MATERIALRetencin = TAMAO DE POROFlujo (Volumen) = POROSIDAD, TIPO Capacidad = AREA SUPERFICIAL

ANLISIS MICROBIOLGICO POR EL MTODO DE FILTRACIN POR MEMBRANAIntroduccinIntroducida hacia finales de los 1950s como alternativa al procedimiento de NMP para el anlisis microbiolgico de agua.

Aceptada por la US EPA para el anlisis de agua potable en la edicin 11 del Standard Methods for Examination of Water and Wasterwater.

Hacia 1978 en la publicacin Mtodos Microbiolgicos para el monitoreo Ambiental, la EPA declar que la tcnica de Filtracin por Membrana (MF) es la preferida para el examen del agua pues permite el anlisis de un gran nmero de muestras en menos tiempo. Indicadores Biolgicos

E. coliIndicadores Biolgicos idealesFciles de aislar, cultivar e identificar en el laboratorio.Su presencia debe estar relacionada cualitativa y cuantitativamente con la de otros microorganismos patgenos y/o de aislamiento ms difcilLa densidad microbiolgica esta directamente relacionada con el grado de contaminacinMejor sobrevivencia que la de los patgenos.Manipulacin segura.

Tipos de anlisisCUANTITATIVOS:

SIEMBRA EN PLACA, CAMARA AL MICROSCOPIO, FILTRACIN POR MEMBRANA, INMUNOLGICAS, GENTICAS O SU COMBINACIN, AUTOMATIZADAS (BIOQUMICA, IMPEDANCIA, ELECTROQUMICA).Metodologas NO APROBADASA partir del 1 de enero del 2001 NMPRECUENTO EN PLACA

TIPOS DE ANLISISCUANTITATIVOS:Algunos facilitan la posterior identificacin de gnero y especie por el aislamiento de los microorganismosFacilitan el seguimiento y elaboracin de estadsticas para realizacin de planes de accin y estandarizacin de procedimientos Filtracin por membrana Metodologa sencilla, fcil de trabajar Muestras pequeas y grandes volmenes Tiempo de incubacin relativamente corto Tambin puede indicar presencia ausencia Ofrece el aislamiento de colonias y su conteo. Verstil para laboratorios con baja frecuencia de muestras as como aquellos con altas frecuencias

Ventajas y LimitacionesVENTAJASFiltrar Muestras completasLavar cualquier sustancia inhibidoraSensitividad para 1 CFUEstadsticamente mas vlidoCuadrcula en la superficie hace el conteo ms fcilDesventajasSlidos grandes pueden taponar la membrana. (realizar diluciones o prefiltrar)Algunas soluciones no pueden ser filtradas (emulsiones con incremento de temperatura)33Principios bsicos Seleccin del equipo y Material adecuado Preparacin del Material Toma y Conservacin de las Muestras Esterilizacin del Material Seleccin del Volumen a Filtrar Placas, Filtracin, Incubacin y Examen Interpretacin de Resultados Identificacin de Problemas341.Seleccin del material y equipo adecuado Material de Toma de Muestras: Vidrio Plstico (No txicos y Resistentes al calor) Bolsas Toma Muestras: vlvulas sanitarias

35Portafiltros desechables y reutilizables

BOMBAS DE VACIO, INCUBADORAS, MEMBRANAS

MEMBRANASDistribucin homognea de poros0.45 m ( bacterias) / 0.8 m (Hongos y/o levaduras)Buena HumectabilidadCuadricula con tinta no txicaEstable durante la esterilizacinRetencin de microorganismos en la superficieSin interferencias qumicas que puedan alterar el crecimiento bacterianoEsters de celulosa Medios de Cultivo

Mayor Permeabilidad de NutrientesMedios LquidosCajas Petri, Pads y Otros MaterialesCajas petri desechables son ideales. Tambin hay de vidrio.Pads Pipetas, pinzas, recipientes, mecheros, lupa.

2. PREPARACION DEL MATERIAL Y REA Material de Toma de Muestras: Limpio y estril Adicionado o no con Tiosulfato (10%) antes de auto clavar. No apretar tapones. Envuelto en papel kraft, autoclavar durante 20 min. 121C, 15lb. Calor hmedo. Calor seco. Horno 1h 180C.

42Continuacin...Preparacin del Material y del rearea: Protocolo de desinfeccin Orden y funcional Material, muestras, medios, desecho (identificado). Cabina de Flujo laminar Escogidas de acuerdo con el tipo de anlisis a realizar y clase de microorganismos que se puedan encontrar.

433. TOMA Y CONSERVACION DE LAS MUESTRAS Primer paso crtico Protocolo normalizado de trabajo Dnde, cmo y frecuencia.Archivo documental: punto de toma, fecha, tamao de la muestra, recuento.Permitir conocer los niveles de contaminacin, su evolucin en el tiempo y controlar la eficiencia de los mtodos de descontaminacin usados.

44Continuacin...Toma y Conservacin de las Muestras Debe ser representativo del momento en que se recolect y de todo el producto que se quiera controlar. Mantener condiciones aspticas. No contaminar boca del frasco. Dejar un espacio vacio de 2-3 cm para facilitar la agitacin de la muestra. Ideal vlvulas sanitarias (ss, facil instalacin, sanitizacin, circulacin interior, no punto muerto). Grifos: dejar correr. No recolecte muestras de una fuga anterior al punto de muestreo (arrastra contaminacin exterior).

Marcar bien Analizar de Inmediato. Max. 1h. Conservar 4C-10C Antes de 6h.454. ESTERILIZACION DEL MATERIAL

SOLUCIONES BUFFER, AGUA PURIFICADA, STERIVEX

465. SELECCIN DE VOLUMEN A FILTRAR Normatividad existente para el tipo de muestra. Volumen total de la fuente o lote. Agua envasada 250 ml. Superficiales y sin tratar menores volmenes (muestras diluidas) Generalmente en agua 100mlMuestras entre 30ml y 250ml directo al embudoMas de 200ufc por membrana, Datos errneos.Mal conteo: hacinamiento Mezcla de colonias: interferencia colorMenos de 10 20 ufc baja fiabilidad47OTROS VOLUMENES DE MUESTRA ORIENTATIVOSTipos de aguaColiformes totalesColiformes fecalesManantiales15,60,100ml30, 100mlLagos, depsitos4,15,60,100ml10, 30, 100mlDe playas0,08; 0,15; 0,5; 1,4ml0,1; 0,3; 1,3; 10mlDe rios0,003; 0,01: 0,02; 0,08ml0,1; 0,03; 0,3; 1mlResiduales cloradas0,003;0,01; 0,02; 0,08ml0,1; 0,03; 0,3; 1mlResiduales sin tratar0,0001; 0,0003, 0,001; 0,003; 0,01ml0,0003; 0,001, 0,003; 0,01; 0,03ml

6. PLACAS,FILTRACION,INCUBACION Y EXAMEN . Placas: Flamear las pinzas en la manipulacin de pads.

Marcar las cajas adecuadamente.

Medio: Distribuirlo en toda la superficie del pad.

49 Filtracin: Verificar el montaje adecuado. Recipiente de seguridad adicional. Portafiltros estril y frio.Pinzas sumergidas en alcohol y flamearlas antes de manipular la membrana.Agitar la muestra en su propio recipiente, aadir el volumen con precisin al Portafiltros.Menos de 100ml agitar suavemente el Portafiltros.Cierre vlvulas, desconecte vaco, retire embudo, membrana cuadricula arriba sin bolsas de aire. Continuacin..placas, filtracin, incubacin y examen.50 Incubacin: Invertidas para evitar que el condensado caiga sobre la superficie de la membrana.Lleve a la temperatura y tiempo adecuado. Examen: Solo cuente las colonias con aspecto caracterstico de acuerdo con el medio y cada tipo de microorganismo. Utilice lupa para una mejor apreciacin de la morfologa. Esterilice desinfecte los portafiltros antes de colocar una nueva membrana y filtrar la siguiente muestra. Al filtrar diluciones filtre las muestras por orden de la mas diluida a la mas concentrada aplicando un lavado con solucin tampn al portafiltro entre muestra y muestra.Continuacin..placas, filtracin, incubacin y examen.517. INTERPRETACON DE RESULTADOS Los tiempos y temperaturas (composicin de los medios) son diferentes, cada fabricante establece los ptimos de crecimiento para sus medios.

52ColiformsNon-coliforms

Coliformes: Color Rojo con brillo metlico color verdeMedio de cultivo Selectivo y DiferencialLactosa: Los coliformes la fermentan formando el complejo cido/aldehdo Peptonas: Nutrientes formadoresFosfato de Potasio: Equilibrio osmticoSulfito de sodio y Fuchina bsica: Inhiben Gram positivas Caldo m-Endo Coliformes Totales

Los coliformes fecales son de color azul, otras colonias presentan un color de gris a cremaSelectivo y DiferencialLactosa: Coliformes fermentan la lactosaPeptonas/Extracto de levadura: Nutrientes Cloruro de Sodio: Equilibrio OsmticoSales Biliares: Inhiben Gram (+)Acido Rosalico: Inhibe Bacteria no Coliformes44.5 C: Temperatura SelectivaAnilina Azul: Indicador cidoMedio M-FCColiformes Fecales en aguas efluentes y residualesColiformesFecales

Medio M-Coliblue 24ColiformeTotalE. coli.E. Coli forma colonias azul y para recuentos de Coliformes totales hay que sumar las colonias azules mas las rojas M-ColiBlue contiene un indicador enzimtico selectivo para E.Coli y por ello no requiere de confirmacinEl medio contiene inhibidores que minimizan el crecimiento de bacterias no Coliformes

IDENTIFICACIN DE E.COLI Y CF EN 24 HRS CON UN SOLO PASO DE T 35c

m-Green Yeast & Mold MediumLas levaduras forman colonias grandes opacas de color verde. Las colonias de mohos son verdes y filamentosasTemperatura de incubacin,C: 2832Tiempo de incubacin, horas: 487257Conteo Completo

Otros microorganismos de inters sanitarioMicroorganismoAplicacinMedio de CultivoGrupo Enterococo (Enterococo intestinal y fecales) (ISO 7899-2:2000)Aguas potables, Aguas de piscinas, en todo tipo de aguas, excepto aquellos con interferencias y materia en suspencinSlanetz-Bartley y agar biliar-esculina-azida. Fecales: agar KFGrupo Pseudomona (EN 12780-2002)Agua mineral natural, , aguas envasadasPseudomona sp, medio que contiene cetrimide.Salmonella Y Shigella(standard Methods)Aguas envasadas, Agar RambachStaphylococcus aureusaguas de piscina

Taphylococcus(Piruvato y glicina)8. Identificacin de Problemas Se citan los problemas ms tpicos que suelen encontrar los usuarios. Se toma principalmente un ejemplo ilustrativo del recuento de coliformes totales sobre el medio endo.60No hay CrecimientoPROBLEMAAlto pH de la muestra Presencia de InhibidoresAlmacenamiento del medioManipulacin de la muestraVolumen de medio insuficienteTemperatura de incubacin incorrectaTiempo de incubacin insuficiente Evaporacin del medio durante la incubacinSOLUCIONDeterminar previamente el pHLavado de la membranaRefrigeracinControl de Calidad GPMVerificar el volumen 1.8-2 ml

Verificar y calibrar los equipos

Demasiadas colonias con aspecto de coliformes (incontables)

Incontable (mala dilucin de la muestra)

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65Zona seca sin crecimiento