fauna de felbotomÍneos (dipteraregião nordeste do município de manacapuru - am, foi analisado...
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS -UFAM
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA
FAUNA DE FELBOTOMÍNEOS (DIPTERA:
PSYCHODIDAE) E INFECÇÃO NATURAL POR
Leishmania sp.
(KINETOPLASTIDA:TRYPANOSOMATIDAE) NA REGIÃONORDESTE DO MUNICÍPIO DE MANACAPURU-AM
DÍLVIA ferreira DA SILVA
>4
Manaus - AM
2005
UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS -UFAM
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA - INPA
"ilS"
FAUNA DE FELBOTOMÍNEOS (DIPTERA;
PSYCHODIDAE) E INFECÇÃO NATURAL POR
Leishmania sp.
(KINETOPLASTIDA:TRYPANOSOMATIDAE) NA REGIÃOnordeste do município de MANACAPURU-AM
DILVIA FERREIRA DA SILVA
Orientadora: Dra. Antonla Maria Ramos Franco
Tese apresentada ao programa de Pós-
Graduação em Bioiogia Tropicai e Recursos
Naturais do Convênio iNPA/UFAM, área de
concentração em Entomoiogia, como parte dos
requisitos para obtenção do títuio de Doutor em
Ciências Biológicas.
<
Manaus - AM
2005
FICHA CATALOGRAFICA
Ferreira Silva, Dílvia
Fauna de Flebotomíneos (DIpteraiPsychodidae) e Infecção Natural por
Leishmania sp. (Klnetoplastlda:Trypanosomatldae) na Região Nordeste do
Município de Manacapuru-AM.
Ferreira Silva, Dílvia - Manaus, 2005.
xvll, 105 f.: II.
Tese (Doutorado) - INPA/UFAM, Manaus, 2005
1- Lutzomyia 2- Diversidade 3- Infecção Natural 4- Método Molecular
5. Manacapuru 6. Leishmaniose
Código Cataloqráfico CDD 19 ed. 616.9364
Sinopse:
O estudo da fauna de flebotomíneos em áreas de mata de terra firme da
Região Nordeste do Município de Manacapuru - AM, foi analisadoobservando sua (/) diversidade, (//) abundância em diferentes estratos, bem
como, (///) o estudo da Infecção natural destes Insetos através de métodos
tradicionais e moleculares e a caracterização dos flagelados Isolados, com oobjetivo de obter Informações a respeito das espécies do gênero Lutzomyia,
dos vetores e dos tripanosomatídeos circulantes na área. Neste trabalho sao
apresentados resultados referentes às primeiras Informações da epidemiologia
dos vetores da leishmaniose tegumentar no município de Manacapuru.
Palavras- Chave: 1. Fauna Flebotomínica, 2. Diversidade, 3. Abundância,
4. Lutzomyia, 5. Infecção Natural, 6. Manacapuru.
(Dedicatória
j^jos tnetis pciis Antônio e 'EUenira
peío carinfiOj amor e paciênciadedicados e a minha irmã (Divani
peCa força e estímuío até o fim da
jornada.
ii
AGRADECIMENTOS
> A Deus pela força nas horas de desânimo e cansaço;
> À minha família, que mesmo distante, me incentivaram e dedicaram
todo o amor;
> A Dra. Antonia Maria Ramos Franco, por ter aceito a orientação num
momento bastante delicado, pelos conselhos, amizade e compreensão
na superação dos muitos obstáculos;
> Ao Lourival Maciel Castro, que pacientemente esclarecia as minhas
grandes dúvidas no trabalho e pelo acompanhamento no árduo trabalho
de campo;
> Ao Artêmio Coelho da Silva, que nos acompanhou no trabalho de campo
e ilustrou a tese com mapas;
> Ao pesquisador Rui Alves de Freitas, pela dedicação e auxílio na
identificação dos insetos e pela paciência em ensinar;
> À Luanda de Paula Figueira, pelo auxilio na realização das corridas de
eletroforese de isoenzimas para a caracterização dos parasitos;
^ À amiga Raquel Borges pelas palavras de incentivo, colaboração e
amizade nos momentos de aflição;
> A Francimeire Gomes Pinheiro pela paciência e colaboração nos
trabalhos de laboratório;
> Aos amigos Marcelo Bezerra e Eneida Colares pela colaboração e
momentos de lazer junto a sua família;
> Ao Sr. Júlio César Lang Beck e Sra. Socorro Bezerra pela hospedagem
da nossa equipe de campo em sua casa em Manacapuru;
111
> Ao Sr. José Bastos por me acolher em sua casa durante o período de
coleta;
> À turma de 2002 pelo companheirismo e acolhida durante o curso;
> À amiga Niviane Fraga pela atenção e paciência, sempre ajudando a
vencer os obstáculos;
> Aos meus mais novos amigos Susy Araújo, Rejane Simões e Ricardo
Passos;
> Aos colegas do Laboratório de Leishmaniose e Doença de Chagas,
INPA: Paulo Eduardo, Ana Cleide, Risonilce, Plínio, Cândido, Francisco,
Liliane, Karina, Gerson, Helaine, Altides Cristina, Michele, Sônia, FIávia
e Maricleide pela amizade;
> À Dra. Gina Aguiar, Departamento e Vigilância em Saúde do Estado do
Amazonas, pelos dados epidemiológicos do município de Manacapuru;
> Ao Sr. Otávio, gerente de endemias de Manacapuru, por disponibilizar o
carro para coleta de material de campo e aos funcionários da FUNASA
pela atenção dispensada;
> Ao Sr. Amoldo por ter conduzido várias vezes o veículo no auxílio ao
trabalho de campo;
> Ao Juracy de Freitas Maia pela paciência e dedicação no
acompanhamento do processo de quantificação do DNA das amostras
coletadas;
> A Dra. Suely de Souza Costa pelas sugestões estatísticas;
> A Dra. leda Leão do Amaral por disponibilizar dados sobre a flora
existente em Manacapuru;
IV
> Ao Jorge A. Lopes da Costa (Siglab), pelas Imagens de satélite do
município de Manacapuru utilizadas neste trabalho;
> Ao Dr. Toby Barrett por ter disponibilizado dados sobre algumas coletas
realizadas no município de Manacapuru há 10 anos e não publicados;
> Ao Jorge Antunes pelo auxílio nos textos em inglês;
> Ao Dr. Alexander Sibajev, pelo auxílio na identificação dos frangmentos
dos parasitos na reação de POR;
> À Coordenação do Curso de Entomologia e seus professores pelos
ensinamentos;
> Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e a
Universidade Federal do Amazonas (UFAM) pela oportunidade da
realização deste trabalho;
> A CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior) pela bolsa de estudo concedida;
> A FAPEAM pelo apoio financeiro, pelo projeto Amazônia Verde-Projeto
temático;
> A todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste
trabalho.
LISTA DE TABELAS
Capítulo 1 Página
Tabela 1. Total de flebotomíneos do gênero Lutzomyia coletados em área
de mata do Ramal do Acajatuba, Nova Esperança e Reserva Ecológica
Floresta da Vida, Manacapuru, Amazonas -Brasil 29
Tabela 2. Número de espécies e índice de diversidade encontradas na
Reserva Ecológica Floresta da Vida (Km51), Ramal Nova Esperança (Km 60) e
Ramal do Acajatuba (Km 66), município de Manacapuru, AM 30
Tabelas. Distribuição vertical de flebotomíneos coletados com armadilha
luminosa nas três áreas de mata da Região Nordeste do Município de
Manacapuru, AM-Brasil, no período de Abril/2003 a
Junho/2004 35
Capítulo II
Tabela 1. Condições de corrida eletroforética para cada sistema
enzimático 54
Tabela 2. Total de flebotomíneos dissecados para a presença de flagelados
no Ramal Nova Esperança (Km 60), Manacapuru AM 57
VI
Tabela 3. Distribuição dos flagelados no trato digestivo dos flebotomíneos e
isoladas em cultivo, capturados no Ramal Nova Esperança (Km 60),
Manacapuru, AM 58
Tabela 4. Eletromorfos presentes em cada um dos zimodemas encontrados
nos flagelados isolados de Lutzomyia spp 65
Tabela 5. Origem e Identificação das cepas de referencia de Leishmania e
Endotrypanum e 16 isolados do município de Manacapuru-AM, Brasil,
caracterizadas através do perfil de isoenzimas 66
vil
LISTA DE FIGURAS
Capítulo I Página
Rgura 1. Imagem de satélite com a localização do Município dè
Manacapuru (Landsat 7 ETM+, 2003) 20
Figurai. Localização das áreas de estudo ao longo da Rodovia Manuel
Urbano, Município de Manacapuru no Estado do Amazonas, (a) disposição do
Município de Manacapuru; (b) disposição dos ramais; (b1) Ramal do
Acajatuba; (b2) Ramal Nova Esperança; (b3) Reserva Ecológica Floresta da
Vida 21
Figuras. Desenho dos transectos onde foram colocadas as armadilhas
luminosas (ODO) dispostas a 2 e 10 metros de altura, demonstrando a trilha
principal, as trilhas secundárias A, B, 0 e D a 50 metros da borda e os pontos
de coleta 23
Figura 4. Proporção de Machos e Fêmeas de flebotomíneos coletados nas
áreas de mata de terra firme da Região Nordeste do município de
Manacapuru,AM-Brasil 25
Figura 5. Abundância de espécies do gênero Lutzomyia (Diptera:
Psychodidae) do Km 51, em área de mata de terra firme da Região Nordeste
do município de Manacapuru, AM-Brasil 26
Vlll
Figura 6. Abundância de espécies do gênero Lutzomyia (Diptera:
Psychodidae) do Km 60, em área de mata de terra firme da Região Nordeste
do município de Manacapuru, AM-Brasil 27
Figura 7. Abundância de espécies do gênero Lutzomyia (Diptera:
Psychodidae) do Km 66, em área de mata de terra firme da Região Nordeste
do município de Manacapuru, AM-Brasil 28
Figura 8. Percentual dos subgêneros Nyssomyia e Psychodopygus
coletados a 2 e 10 metros de altura nas três áreas de mata da Região Nordeste
do Município de Manacapuru, Am-Brasil 31
Figura 9. Estratificaçâo vertical das espécies do subgênero Nyssomyia
coletadas nas três áreas de mata da Região Nordeste do Município de
Manacapuru, AM-Brasil 33
Figura 10. Estratificaçâo vertical das espécies do subgênero Psychodopygus
coletadas nas três áreas de mata da Região Nordeste do Município de
Manacapuru, AM-Brasil 34
Capítulo 11
Figura 1. Eletroforese a 2% de agarose de produtos após a amplificação da 1®
Reação (Nested-PCR) de amplificação do DNA de "pool" de flebotomíneos
coletados no Ramal Nova Esperança. PM, Peso Molecular/Ladder lOOpb; 1-
controle positivo do sub-gênero Viannia (amostra L (\/.) guyanensis -
MHOM/BR/75/M4147); 2- controle positivo L (L) amazonensis
IX
(MHOIVI/BR/77/LTB0016); 3- controle negativo macho L umbratilis; 4 a 8 produto
da amplíficação do DNA do "pool" de L umbratilis 47
Figura 2. Coleta de base de árvore realizada no Ramal Nova Esperança,
município de Manacapuru, AM
Figura 3. Distribuição mensal da precipitação e taxa de infecção natural por
tripanosomatídeos em Lutzomyia umbratilis (a) e dendrophyia (b) no período de
junho a novembro de 2004 e abril e maio de 20005 no Ramal Nova Esperança
(Km 60), Manacapuru, Amazonas, Brasi 61
Figura 4. Zimograma dos padrões eletroforéticos analisados por seis enzimas,
com 9 cepas de referência e 2 grupos de parasites isolados de
flebddotomíneos: 1- L(L) mexicana-, 2- L (L) deaner, 3- L (V) panamensis-,
4- L (V) guyanensis-, 5- L (V) braziliensis-, 6- L (V) amazonensis-, 7- L (V) naiff,
8- L(V) lainsoni; 9- Endotrypanum schaudinnr, 10- INPA-1; INPA-2.
67
Figura 5. Dendrograma obtido por análise de similaridade pelo coeficiente de
"Simple Matching" das amostras isoladas de Lutzomyia umbratilis (IM5255,
IM5260, IM5261, IM5262, IM5263, IM5264, IM5265, IM5268, IM5270, IM5271,
IM5272 e 1M5273) e L dendrophyia (IM 5254, IM 5256. IM5257 e IM
5259)
ABREVIATURAS
L = Lutzomyia
L = Leishmania
V = Viannia
LIA = Leishmaníose Tegumentar Americana
G6PDH = Gllcose-6-Fosfato Desidrogenase
IDH NAD = Isocitrato Desidrogenase - p- Nicotinamida Adenina Dinucleotideo
IDH NADP = Isocitrato Desidrogenase - Nicotinamida Adenina Dinucleotideo
Fosfato
* ME = Enzima Málica
MDH = Malato Desidrogenase
HK = Hesoquinase
PCR = Reação em Cadeia da Polimerase
ITS = Espaço Transcrito Interno
kDNA = DNA do cinetoplasto
RAPD = Amplificação Aleatória do DNA Polimórfico
RFLP = Polimorfismo no Comprimento de Fragmentos de Restrição
XI
RESUMO
O Município de Manacapuru (3°17'49" e 60°37'28") situado no Amazonas, está
localizado à margem esquerda do Rio Solimões com uma área de 7.335 Km^.
O objetivo deste estudo foi o de determinando a diversidade e abundância de
espécies da fauna flebotomínica, verificando a taxa de infecção natural por
Leishmania em fêmeas de Lutzomyia spp. e identificando os parasitos isolados
destes insetos através de métodos bioquímicos e moleculares. As coletas
foram realizadas em 3 áreas de mata de terra firme ao longo da Rodovia
Manuel Urbano no período de abril/2003 a junho/2004, utilizando 16 armadilhas
luminosas tipo CDC, das 18:00 às 6:00 do dia seguinte, com um dia de coleta
mensal para cada área. Foram coletados 10.446 espécimes, distribuídos em 43
espécies pertencentes ao gênero Lutzomyia França 1924, divididas em 10
subgêneros e 6 grupos. Quanto a estratificação vertical, os subgêneros mais
representativos tanto a 2m quanto a lOm de altura foram Nyssomyia com
45,7% e 43,1% e Psychodopygus 24% e 31%, respectivamente. As coletas de
base de árvore foram realizadas no período de junho a novembro/2004 e abril e
maio/2005 durante 8 meses, entre 9:00 e 10:00. Foram coletadas 2.113
espécimes, das quais 1.174 (55,5%) fêmeas foram dissecadas. A taxa de
infecção natural encontrada nas fêmeas foi de 8,2% para L umbratilis, 22% L.
dendrophyla e 1,2% L anduzei Um total de 1.400 espécimes divididos em
"pool" de 20 insetos foram ensaiados para presença de infecção natural por
Leishmania sp. pelo Nested-PCR. Apresentaram positividade para o subgênero
Viannia (242 pb) apenas em L umbratilis 8,3% (100/1.200) e L dendrophyla
33,3% (20/60). A análise do perfil isoenzimático de 16 amostras de parasitos
isolados de L umbratilis e L dendrophyla, demonstrou que dois zimodemas
(INPA-1 e INPA-2) estão circulando na região, representados pelos subgêneros
Viannia e Leishmania. É provável o envolvimento de L. umbratilis e L.
dendrophyla na transmissão da leishmaniose em Manacapuru, sugerindo-se a
realização de estudos futuros mais aprofundados, como por exemplo, a
identificação de isolados obtidos de humanos, dando maior suporte quanto a
dinâmica da transmissão da LTA no município de Manacapuru.
Xll
ABSTRACT
Manacapuru Municipality, in Amazonas State, is located on the Soümoes River
left bank covering an area of 7,335 Km^ in the co-ordinates of 3®17'49"S and
60®37'28'' W. The main goal of this study is determining the phlebotomine
species fauna abundance, verifying the natural infection rate by Leishmania in
Lutzomyia spp. female and identifying the parasites isolated in these insects
through biochemicals and molecular methods. The collections were carried out
in three Terra-firme Forest areas along the Highway Manuel Urbano from April
2003 to June 2004, using 16 CDC type light traps from 18:00 to 6:00 with one
day of monthly collection for each area. A total of 10,446 specimens, distributed
into 43 species belonging to genus Lutzomyia França 1924, divided into 10
subgenera and six groups, were collected. As to the vertical stratification the
most representative subgenera both at the height of 2m and lOm were
Nyssomyia with 45.7% and 43.1%, and Psychodopygus 24.6% and 31%,
respectivelly. The collections at the base of the trees were carried out from June
to November/2004 and Aril to May /2005 during 8 months, between 9:00 and
10:00. 2,113 specimens, of which 1,174 (55.5%) were female were desiccated.
The natural infection rate found on the females was 8.2% for L. umbratilís, 22%
for L. dendrophyla and 1.2% for L. anduzei. A total of 1,400 specimens were
tested in pool of twenty insects for the presence of natural infection to
Leishmania sp. by Nested-PCR. Were positive to the subgenus Viannia (242
pb) only L umbratilis 8,3% (100/1,200) and L dendrophyla 33,3% (20/60). The
isoenzyme electrophoresis profile of 16 samples of parasites isolates from L
umbratilis e L dendrophyla, showed two zymodemes (INPA-1 e INPA-2) that
are circulating in this region, named as Viannia and Leishmania subgenus. It's
probable the involvement of L. umbratilis and L dendrophyla in the Manacapuru
leishmaniasis transmission, suggesting the necessity of future studies to better
understanding the dinamics of the ATL in the Manacapuru muncipaility.
xm
índice
Página
LISTA DE TABELAS vi
LISTA DE FIGURAS viii
ABREVIATURAS xi
RESUMO xii
ABSTRACT xiii
I. INTRODUÇÃO GERAL 01
II. OBJETIVOS 14
III. TRABALHOS ANEXOS
3.1 - Capítulo I
Fauna Flebotomínica: Diversidade, Abundância e Estratificaçâo Verticai de
Lutzomyia França 1924 (Diptera:Psychodidae) em Áreas de Mata de Terra
Firme da Região Nordeste do Município de Manacapuru - AM, Brasii.
1. Introdução 43
2. Material e Métodos 46
3. Resultados 56
4. Discussão 69
XIV
3.2 - Capítulo II
Detecção de Infecçâo Natural por Leishmania sp. (Kínetoplastida:
Trypanosomatidae) em flebotomíneos (Diptera:Psychodldae) através do
método tradicional e molecular X análise isoenzimática em Área de Mata de
Terra Firme da Região Nordeste do Município de Manacapuru, AM.
1. Introdução 43
2. Material e Métodos 46
3. Resultados 56
4. Discussão 69
IV. CONCLUSÕES GERAIS 75
V. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 79
V. ANEXOS 105
XV
1. INTRODUÇÃO GERAL
A floresta tropical oferece condições ecológicas estáveis e uniformes
para várias espécies de animais e, apresenta a maior do planeta
(Haffer, 1992). A Amazônia é caracterizada por alta diversidade biológica, mas
ainda pouco se sabe sobre as espécies que a compõe e suas relações
filogenéticas. Algumas hipóteses relacionam eventos geoclimáticos para
explicar o grande número de espécies encontrado na região, assim como, os
padrões de distribuição e endemismo das espécies (Ribeiro et ai, 1999).
Nos últimos vinte anos. Intensificaram-se as pesquisas na Amazônia
para tentar compreender as causas que permitiram o desenvolvimento da
maior biodiversidade conhecida do planeta. Diferentes teorias como as de
"Estabilidade do Tempo" e "Refúgios Florestais" foram baseadas em dados
atuais de fauna e flora e tiveram o clima como eixo fundamental regulador dos
fatores biológicos. No primeiro caso, considerando um clima equatorial
constante durante milhões de anos e no segundo, especulando que as
drásticas trocas climáticas do Quaternário (período geológico que compreende
os últimos dois milhões de anos da história da terra) afetaram a Amazônia
(Latrubesse e Franzinelli, 1993).
Pode-se dizer que quanto mais especializada uma espécie, menor a sua
área de dispersão ou maior a sua dependência de microclimas também
especializados. Por outro lado, quanto mais generalizada a espécie, maior sua
área de distribuição, devido a sua adaptação a microclimas menos
especializados ou mais diversificados (Martins & Morales-Farias, 1972).
Os flebótomos, pequenos nematóceros (Insecta, Dlptera), são
encontrados em todas as regiões zoogeográficas, com cerca de 400 espécies e
subespécies descritas no gênero Lutzomyia França 1924 (Kettie, 2000; Rangel
& Lainson, 2003). Estes insetos possuem grande importância devido à
capacidade de algumas espécies transmitirem a leishmaniose. As espécies de
flebotomíneos do Novo Mundo são diferentes do Sul para o Norte, embora
apresentem grandes áreas de superposição, formando áreas de endemismo,
com alto índice de diversidade e adaptação a diversos biótipos (Martins &
Morales-Farias, 1972; Christensen ef a/., 1983; Barrett ef a/., 1996).
Martins & Morales-Farias (1972), propuseram sete áreas de endemismo
para as espécies de flebotomíneos, entre as quais a Região Amazônica
delimitada pela Cordilheira dos Andes e Oceano Atlântico. Esta área estende-
se desde as Guyanas até o Oeste do Maranhão e Mato Grosso.
A epidemiologia das leishmanioses é extremamente complexa, variando
em diferentes regiões geográficas (Lainson, 1983). Elas estão amplamente
distribuídas nas zonas tropicais e temperadas. Há aproximadamente 350
milhões de pessoas estão expostas e 15 milhões infectadas por esta doença
em 88 países em torno do mundo, apresentando-se como um problema de
saúde pública (Desjeux, 2001; OMS, 2001).
Na Bacia Amazônica, a Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA)
aparece como um dos principais problemas de saúde pública durante a fase
inicial de grandes projetos como construção de hidroelétricas, estradas e
conjuntos habitacionais, quando freqüentemente ocorre a chegada de
Imigrantes. Relatórios entomológicos demonstraram que o hábito de Lutzomyia
umbratilis Ward & Frahia 1977, e a prevalência da doença em diferentes
tiabitats são compatíveis não apenas com o principal vetor da Leishmania
(Viannia) guyanensis Fíoch 1954, como também com o reservatório primário,
que são os animais silvestres (Ready et a/., 1986).
Recentes estudos baseados na investigação epidemiológica e
caracterização molecular dos parasitos das leishmanioses do Novo Mundo têm
revelado que o gênero Leishmania Ross, é muito mais complexo do que se
imaginava. O gênero compreende diferentes espécies de parasitos que
infectam um grande número de reservatórios e vetores de diferentes
subgêneros (Grimaldi et ai, 1991; Ishikawa et ai, 2002; Rodriguez-Bonfante et
ai, 2003; Zemanová et ai, 2004).
Vários métodos bioquímicos estão disponíveis para a identificação e
classificação de Leishmania, mas nenhum deles é considerado como padrão,
ouro ("gold standard"). Análise de Isoenzimas tornou-se a técnica padrão
contudo, requer um grande volume de cultura in vitro de parasitos e de
reagentes (Motazedian et ai, 1996).
Nas últimas décadas, a reação em cadeia da polimerase (PCR) tem
sido sucessivamente utilizada e comprovou ser uma ferramenta sensível e
poderosa para detectar diretamente Leishmania em amostras clinicas, assim
como, para a caracterização do parasito (Schonian et ai, 2003).
1.1 Aspectos Ecológicos e Comportamentals dos Flebotomíneos
Os flebotomíneos (Diptera; Psychodidae) constituem um grupo bem
definido de insetos e, provavelmente monofilético (Kettie, 2000). Informações
biológicas e sistemáticas destes insetos foram se acumulando até o século XX,
desde a primeira descrição de duas espécies de flebotomíneos americanos
realizada por Coquillett (1907) até uma nova classificação de Phlebotominae
proposta por Galati (1995) (Sherlock, 2003). França (1924) a partir de
características morfológicas criou o gênero Lutzomyia. Young & Duncan
(1994), realizaram uma revisão do gênero Lutozomyia, enfatizando a
existência deste como o único com representantes de espécies vetoras da
leishmaniose na região Neotropical, com cerca de 400 espécies descritas.
A diversidade do gênero Lutzomyia França 1924 é atribuída à radiação
de aiguns ancestrais que migraram e se estabeleceram em áreas ricas em
nichos ecológicos. A maioria das espécies do Novo Mundo habita áreas de
florestas primárias e/ou secundárias. Em função das modificações ambientais
impostas peio homem, algumas espécies vêm se adaptando a ambientes rurais
e periurbanos (Lima, 1986; Gomes et ai., 1986; Andrade Filho et aí., 2001).
Insetos adultos têm sido encontrados em condições naturais com vários
parasitos associados, incluindo protozoários do gênero Leishmania, do qual
são vetores (Noyes, 1998).
Estes insetos vivem parte do seu ciclo escondidos em abrigos úmidos e
protegidos da luz e do vento, em tocas de animais siivestres, troncos ocos,
espaços entre as raízes de árvores ou outros locais com acúmulo de matéria
orgânica (Forattini, 1973; Cabaniiias e Castelión, 1999). De hábito crepuscuiar
e noturno, permanecem nesses abrigos durante as horas iuminosas do dia,
abandonando-os ao cair da tarde ou à noite, quando iniciam a alimentação, ou
em ocasiões de mudanças ambientais (Forattini, 1973).
As formas Imaturas desenvolvem-se em criadouros constituídos por
solos úmidos, ricos em matéria orgânica, entre raízes expostas, embaixo de
folhas caídas, pedras e ambientes antrópicos como chiqueiros, galinheiros e
estábulos, sempre que existam condições adequadas (Young & Duncan, 1994)
Na Região Amazônica têm sido encontradas larvas de flebotomíneos,
principalmente, entre as raízes das árvores (Lane, 1993; Alencar & Queiroz,
2002).
Os machos são fitófagos, alimentando-se de seiva vegetal. O hábito
hematofágico restringe-se às fêmeas e o horário de maior atividade se dá entre
18:30 e 23:00 na Amazônia. As fêmeas apresentam baixa sensibilidade a
estímulos externos, quando os hospedeiros tentam espantá-las durante a
sucção. Quando ingurgitadas de sangue, tendem a pousar em locais mais
elevados, á custa de vôos curtos (Lainson et al., 1986; Andrade Filho et ai,
2001).
Os flebotomíneos praticam a hematofagia em diversas espécies de
animais silvestres, tais como: mucura ou gambá, tatu, rato silvestre, preguiça e
tamanduá. Porém, com a invasão e devastação da mata pelo homem, existem
indícios de que animais domésticos como o cão e o cavalo podem ser
infectados e infectar flebótomos, desconhecendo-se porém, as implicações
epidemiológicas (Alexander et al., 1992).
1.2 A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA)
O gênero Leishmania, no Novo Mundo, ocorre desde a península de
Yucatã, no México, até o norte da Argentina, por onde se distribuem pelo
menos 17 táxons, causando diversas formas clínico-epidemiológicas. Dez
táxons são assinalados parasitando o homem, no Brasil são apenas sete: (/)
Leishmania (Leishmania) amazonensis Lainson & Shaw 1972, nas regiões
norte e nordeste, (//) Leishmania (Viannia) guyanensis Floch 1954, (iii) L (V.)
shawi Lainson et ai., 1989, (iv) L (V.) naiffi Lainson & Shaw, 1989, (v) L (V.)
iainsoni Silveira et ai. 1987 e (vi) L (V.) iindenbergi Silveira et ai., 2002 na
região norte, (v//) L (V.) braziliensis Vianna 1911 da região norte até o sul
(Lainson et ai., 1987; Dedet et ai., 1989; Silveira et ai., 2002; Altamirano-
Enciso et ai., 2003; Basano & Camargo, 2004)
A Leishmaniose é uma zoonose causada por protozoários parasitos do
gênero Leishmania, cujo ciclo tem a participação de um hospedeiro definitivo -
mamífero, e um intermediário - flebotomíneo (Forattini,1973). Esta enfermidade
tem distribuição mundial, com número estimado de 350 milhões de pessoas
vivendo em regiões endêmicas correndo o risco de contrair a infecção (OMS,
2001).
Na epidemiologia da leishmaniose, o hospedeiro silvestre, considerado
como reservatório natural das leishmânias, raramente desenvolve a doença.
Em hospedeiros acidentais, incluindo o homem e animais domésticos, a
infecção produz comumente lesões na pele. Contudo, não apresentam papel
na cadeia de manutenção ou disseminação de parasitos na natureza (Lainson,
1983; Neves, 1998; Rey, 2001).
Apesar da leishmaniose encontrar-se amplamente distribuída nas
Américas, entender seus aspectos epidemiológicos constitui-se tarefa
extremamente complexa. Requerendo a obtenção de um conjunto de
informações para uma eventual proposta de medidas de controle, levando-se
em consideração as peculiaridades de cada região (Grimaldi et ai., 1989).
No Brasil, a leishmaniose cx)nsiste de uma zoonose endêmica, de difícil
controle, cujas estatísticas oficiais mostram que o crescimento progressivo e os
registros ocasionais de surtos epidêmicos ocorreram nas últimas décadas
(Sampaio & Paula, 1999). A doença é um importante problema de saúde
pública em muitos estados do Brasil, possuindo uma alta incidência na região
Amazônica, acometendo pessoas de todas as faixas etárias e de ambos os
sexos. A população mais acometida é de lavrador em atividade de
desmatamento ou extração de madeira, coletores de látex e outros produtos
naturais da floresta e aqueles que trabalham na construção de estradas
(Lainson et al., 1981; Brazil ef a/., 2000).
É uma enfermidade que apresenta cadeia de transmissão complexa,
estando sujeita, numa mesma região, a diversos determinantes tais como:
desequilíbrio ecológico produzido pela invasão do homem aos nichos naturais
da doença, variações sazonais e susceptibilidade da população (Dourado et al.,
1989).
O papel biológico dos flebotomíneos na transmissão da leishmaniose
encontra-se bem definido, porém estudos sobre competência vetorial para
Leishmania (Viannia) brazillensis ainda são escassos (Silva & Gomes, 2001).
Considerando a importância da transmissão durante o dia de Leishmania (V^.)
guyanensis para o homem, quando este perturba os locais de descanso dos
insetos, foi demonstrado que apenas L. anduzei Rozeboom 1942 e L umbratiíis
Ward & Fraiha 1977 são geralmente abundantes tanto durante a estação seca
quanto no período chuvoso, quando ocorrem muitas transmissões (Ready et
ai., 1986).
Apenas em parte da Bacia Amazônica a infecção é transmitida ao
homem, primariamente, por L umbratilis tendo como agente etiológico a L
(Viannia) guyanensis, que é mantida naturalmente em alguns desdentados
como: Choloepus didactylus e Tamandua tetradactyla (Ready et ai, 1983).
Ready et ai (1986), demonstraram que o hábito de L umbratilis e a prevalência
da doença em diferentes habitats são compatíveis não apenas com o principal
vetor da L (V.) guyanensis como também com o reservatório primário, que são
os animais silvestres.
1.3 Investigação da Infecção Natural
1.3.1 Método Tradicional
O número de flebotomíneos naturalmente infectados em áreas
endêmicas e a identificação correta da Leishmania infectando uma
determinada espécie são de principal importância no estudo epidemiológico e
vetorial de leishmaniose (Tesh et ai, 1984).
O método mais comumente utilizado para investigação de infecção em
flebótomos é o laboratorial, com o exame do parasito in loco, depois da
dissecção do trato digestivo do inseto, porém, a infecção natural de Lutzomyia
spp. com Leishmania em áreas endêmicas têm sido muito baixas (Tesh et ai,
1984; Miranda ef a/., 2002).
1.3.2 Método Molecular
Diversos métodos bioquímicos são utilizados na identificação e
classificação das leishmânias (Motazedian et ai, 1996), mas nenhum deles
ainda é considerado como totalmente eficaz, específico e/ou sensível o
suficiente para ser utilizado isoladamente. Na maioria das vezes são
necessários diversos métodos para se chegar a confirmação de espécie.
Análise isoenzimática têm sido considerada como padrão técnico, contudo
requer o isolamento e a amplificação dos parasitos em cultura in vitro, além de
reagentes variados e de alto custo (Motazedian et ai, 1996).
Anticorpos monoclonais têm sido empregados para identificação das
espécies de Leishmania, a partir do desenvolvimento de testes diagnósticos
associados a investigações moleculares da virulência e/ou patogenicidade dos
parasitos. Resultando na caracterização de antígenos leishmânias que podem
ser úteis para produzir imunoproteção seguida de vacinação contra a
leishmaniose humana (Grimaldi & MacMahon-Pratt, 1996). Muitas informações
a respeito da epidemiologia de várias leishmânias do Novo Mundo têm sido
obtidas por meio da aplicação de técnicas empregando anticorpos
monoclonais Estes são critérios moleculares que identificam e classificam
leishmânias isoladas do campo comparando-as com cepa padrão de referência
(Grimaldi et ai, 1987» 1989 e 1991; Ardehali et ai, 2000; Romero et ai, 2002;
Fróes et ai, 2004; Andrade et ai. 2005).
O ácido desoxirribonuclélco (DNA) é quimlcamente mais estável do que
enzimas e anticorpos, tendo sido objeto de intensas pesquisas para
marcadores genéticos apropriados na identificação de Leishmania (EIlis &
Crampton, 1988; Guevara et ai, 1992). Inicladores obtidos do DNA do
cinetoplasto (kDNA) específico têm sido usados para hibridízaçâo de DNA de
flebotomíneos, com o intuito de identificar e detectar infecçâo natural nestes
insetos por parasitos do gênero Leishmania. Esta técnica tem sido útil em
estudos epidemiológicos de campo com grande número de amostras que
podem ser manuseadas ao mesmo tempo (Ready et ai, 1988).
Nos últimos dez anos, métodos moleculares têm sido desenvolvidos
para Identificação de certas espécies de Leishmania Isoladas em cultivo ou
originadas de biópsias de pacientes, assim como, na detecção do parasito em
"pool" de espécimes de flebotomíneos (Motazedian et ai., 1996; Silva &
Grunewaid, 1999; FIsa et ai, 2001; Rodrigues et al, 2002; Marfurt et al, 2003;
Paiva et ai., 2004).
A PCR (Reação em Cadela da Pollmerase) oferece maior sensibilidade,
porém a resolução é menor do que a tipagem com Isoenzimas, que fornece
ampla Informação genética sem a necessidade de uma amostragem mais
detalhada do genoma (Ibrahim et al., 1994).
O método RAPD (Ampllficação Aleatória do DNA Polimórfico) - PCR tem
atraído multo Interesse por ser relativamente simples para executar, não
requerendo conhecimento prévio do genoma do parasito e a utilização de
mínima concentração de parasitos. O RAPD pode ser útil para Identificação dos
membros do complexo de espécies de flebotomíneos e para Identificar e
classificar os membros do complexo de lelshmânia (Noyes et al, 1995). No
entanto devido a dificuldade quanto a sua reprodutibilidade o método tem sido
mais utilizado para o estudo de variações intraespecíficas (Mukhopadhyay et
ai., 2000).
10
Diversos métodos baseados na PCR têm sido utilizados como
ferramentas úteis na caracterização de leishmânias, tais como: PCR - RFLP,
Nested-POR, MultIplex-PCR, RT-POR, incluindo sequenciamentos de regiões
intergênicas. Seqüências alvo para caracterização de leishmánia incluem: DNA
nuclear como pequenas subunidades de rRNA (SSU rRNA), genes repetidos
de mini-exon ("spliced leader"), espaço interno transcrito (ITS), microsatelite
DNA nuclear e DNA do cinetoplasto (kDNA) (Heid et ai, 1996; Fisa et ai, 2001;
Cupolillo et ai, 2003; Marfurt et ai, 2003; Volpini et ai, 2004; Jorquera et ai,
2005; Parvizi et ai, 2005).
1.4 A Leishmaníose no município de Manacapuru, Amazonas
O município de Manacapuru, 68 Km distante domunicípio de Manaus,
está localizado à margem esquerda do rio Solimões, na confluência com a foz
do rio Manacapuru. Este município possui uma área de 7.335 Km^ altitude
média de 34 m, com latitude 3®17'49''S e longitude 60®37'28'' W. Sua população
é de 78 785 habitantes. Seu clima étropical chuvosoe úmid, com temperatura
média de 26» C (IBGE, 2000).
O município de Manacapuru-AM apresenta uma baixa incidência para a
Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) com uma média anual de
27 5/100 000 hab. casos entre os anos de 1995 e 2004. A média de idade das
pessoas infectadas pela LTA neste município foi de 31,8, sendo a maior
incidência entre o sexo masculino, a qual exercem trabalhos na agricultura
(FVS, 2005).
11
Esta enfermidade encontra-se distribuída em todo o município, sendo
até o momento desconhecido o vetor e a espécie de leishmânia circulante na
área (SUSAM, 2002).
Informações referentes à população de flebotomíneos já registradas no
município de Manacapuru demonstram a existência de cerca de 42 espécies na
área, apresentando L anduzei Rozeboom 1942, L chagasi Theodor 1965, L
longispina Mangabeira 1942 e L umbratilis Ward & Frahia 1977 como mais
abundantes (comunicação pessoal, Toby Barrett, 2003).
Até o momento, o vetor de L (V.) guyanensis existente a leste do
sistema fluvial do Rio Negro é L umbratilis. Porém, esta mesma espécie
capturada no município de Manacapuru, ainda não foi encontrada infectada
com Leishmania, apesar dos casos de leishmaniose registrados no município.
Acredita-se que o Sistema Fluvial do Rio Negro atue como barreira geográfica
no ciclo vetor/parasita/homem, possibilitando o encontro de outras espécies de
flebotomíneos como prováveis vetores de espécies de Leishmania
necessariamente não relacionada a L (V.) guyanensis (Árias & Freitas, 1978).
Justiniano et ai. (2001, 2004), verificaram que populações diferentes de
L umbratilis capturadas em Manaus e Manacapuru (leste e oeste do Rio Negro
respectivamente), apontaram diferenças de comportamento em laboratório
quanto ao ciclo de vida, fecundidade, fertilidade , longevidade e emergência
dos adultos, atribuindo a isso o isolamento geográfico ocasionado pelos
grandes rios. Também foi verificada ausência de infecção nos insetos
coletados a oeste do Rio Negro. Entre as duas populações, a melhor
candidata a futuras tentativas de criação em massa em laboratório foi a de
Manaus.
12
Nos últimos 20 anos foram realizados vários estudos evidenciando a
fauna flebotomínica, sua diversidade e abundância nos municípios do
Amazonas localizados à margem direita do Rio Sollmões. Assim como,
flagelados de tripanosomatídeos isolados de várias espécies de flebotomíneos
e os prováveis vetores da leishmaniose e seus parasites infectando o homem
(Árias & Freitas, 1977; Árias et aL, 1987; Barrett et ai, 1996; Cabanillas &
Castellón, 1999; Dias-Lima et ai, 2002). Entretanto, pouco se conhece a
respeito destes mesmos insetos e seus parasites no município de Manacapuru.
Dessa forma parece-nos oportuno realizar um estudo sobre a fauna
flebotomínica, infecçâo natural por tripanosomatídeos e caracterização dos
protozoários isolados destes insetos, na tentativa de contribuir com o
conhecimento da epidemiologia dos prováveis vetores e parasites da
leishmaniose neste município.
13
3. OBJETIVOS
3.1 - GERAL:
> Estudar a fauna flebotomínlca e averiguar o(s) provável transmlssor(es) da
Leishmaniose Tegumentar Americana (LIA) em áreas de comunidades locais
na região nordeste do município de Manacapuru, Amazonas.
3.2 - ESPECÍFICOS
- Capítulo I
>• Determinar a diversidade e abundância de espécies de flebotomíneos
existentes em áreas de comunidades da região nordeste do Município de
Manacapuru;
> Analisar as diferenças existentes entre a densidade de machos e fêmeas
coletados na área de estudo;
> Listar as espécies encontradas nos diferentes estratos arbóreos;
> Analisar as diferenças existentes a 2 e 10 metros de altura nos
diferentes pontos de coleta;
- Capítulo II
> Utilizar os métodos moleculares na detecção da infecção natural nos
flebotomíneos, avaliando o uso da reação em cadeia da polimerase (POR) na
área de incidência da LIA;
14
Determinar a taxa de ínfecçao natural por tripanosomatídeos nas fêmeas de
Lutzomyia coletadas no município de Manacapuru;
^Isolar e caracterizar os parasitos encontrados nos flebotomíneos
dissecados coletados em base de árvore;
Indicar a provável espécie de flebotomíneo transmissora da Infecção
humana e caracterizar a espécie de Leishmania envolvida na transmissão da
LTA nas comunidades locais da região nordeste do município de Manacapuru;
15
CAPÍTULO I
FAUNA FLEBOTOMÍNICA: DIVERSIDADE, ABUNDÂNCIA E
ESTRATIFICAÇÀO VERTICAL DE LUTZOMYIA FRANÇA 1924(DIPTERA:PSYCHODIDAE) EM ÁREAS DE MATA DE TERRA
FIRME DA REGIÃO NORDESTE DO MUNICÍPIO DE
MANACAPURU - AM, BRASIL.
1. INTRODUÇÃO
Os flebotomíneos apresentam distribuição pantropical, com algumas
espécies sendo encontradas nas regiões temperadas (Lewls, 1971). A
distribuição destas espécies pode ser restrita, regional ou local, ou ampla com
distribuição continental, resultando em largas faixas de superposição (Martins &
Morales-Farlas, 1972; Rebêlo et ai, 1996). A maioria das espécies do Novo
Mundo habita áreas de florestas primárias e ou secundárias, sendo estes locais
os possíveis criadouros (Andrade-FIlho et ai, 1997).
A composição vegetal da floresta tropical Influencia na distribuição das
espécies de flebótomos pelas características das raízes e cascas dos troncos.
O solo e a copa das árvores podem ser vistos como diferentes habitats, com
componentes físicos e biológicos distintos, onde existem diferenças nos
microcllmas tais como! temperatura, umidade relativa, Intensidade da luz,
movimento do ar e níveis de CO2 (Chaniotis et ai, 1971; Cabanillas &
Castellón, 1999).
A distribuição dos flebótomos em vários níveis de estratificação vertical, é
uma resposta as diferenças físicas e biológicas destes Insetos (Chaniotis et ai,
16
1971). As espécies vetores encontradas em diferentes níveis de estratificação,
são parâmetros que servem para determinar o grau de interação com seu
hospedeiro vertebrado (Dias-Lima et al., 2002).
Diversos estudos de estratificação vertical têm sido realizados na
Amazônia, contribuindo para determinar o risco de exposição humana as
espécies vetoras de lelshmaniose na região (Biancardi, 1981; Árias & Freitas,
1982; Castellón ef a/., 1994).
É possível verificar que a maioria das espécies de flebótomos na região
de Manaus são encontradas na copa da floresta, onde espécies como
Lutzomyia umbratilis e L anduzei dominantes nestes estratos, funcionam
como vetores de Leishmania {Viannia) guyanensis (Árias & Freitas, 1982;
Ready efa/., 1986).
Dependendo mais de microclimas, que das condições climáticas gerais da
região, certas espécies de flebótomos podem ultrapassar barreiras eficientes
para outros grupos de animais, ligando faunas de diferentes regiões
zoogeográficas (Martins & Morales-Farias, 1972). Estas barreiras geográficas,
como rios e montanhas, são muito Importantes para determinar diferenças na
diversidade da fauna de uma região (Haffer,1992).
O conhecimento da fauna flebotomínica mostrou-se de grande importância
devido à capacidade desses insetos de transmitir patógenos. No Novo Mundo,
o gênero Lutzomyia França (1924) é o de maior importância, com algumas
espécies implicadas na transmissão dos agentes causais das leishmanioses,
bartoneloses e arboviroses (Rebêlo et al., 1996; Andrade-Filho et ai, 2001;
Wolff et ai, 2003; Peterson & Shaw, 2003).
17
Em todo o Brasil, vários estudos têm sido realizados demonstrando a
grande variedade das espécies de flebotomíneos, enfocando a sua distribuição
geográfica, ecologia e epidemiologia (Biancardi et al., 1982; Aguiar et a/., 1985;
Sherlock et al., 1996; Ferreira et ai., 2001; Rebêlo & Oliveira-Pereira, 2001; Gil
et al. 2003).
Na região Amazônica, diversos estudos enfatizando os aspectos
biológicos, taxonômicos e ecológicos dos flebotomíneos foram realizados nas
últimas décadas. Foram observadas que as alterações ocorridas em áreas de
floresta influenciam na composição e comportamento da fauna destes insetos
(Árias & Freitas, 1982; Ready et al., 1983; Cabanillas & Castellón., 1999;
Castellón etal., 2000).
A riqueza e diversidade de espécies pertencentes a diferentes grupos
apresentam padrões distintos de distribuição. Algumas espécies são restritas
ao ambiente silvestre e outras registradas em áreas profundamente alteradas
pela ação do homem. O desenvolvimento do processo de modificação
ambiental provavelmente alterou o hábito dos flebotomíneos, resultando no
agravamento da Leishmaniose Tegumentar, causando sérios danos à
população (Rebêlo etal., 1996, 1999, 2000).
O município de Manacapuru, localizado do lado direito do Rio Negro,
apresenta distribuição e diversidade da fauna flebotomínica pouco conhecida,
se fazendo necessário um estudo entomológico em diferentes pontos de mata
de terra firme. Este estudo é de fundamental importância para o controle da
doença na área, não existindo nenhuma publicação com dados consistentes
sobre estes insetos.
18
Com base na carência de tais informações objetivamos com este trabalho
determinar a distribuição em diferentes estratos, sua diversidade e abundância
das espécies da fauna flebotomínica, observando seus aspectos biológicos em
condições naturais na região Nordeste do Município de Manacapuru,
Amazonas.
19
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Área de Estudo
As coletas foram realizadas em áreas de mata de terra firme ao longo da
Rodovia Manuel Urbano do Município de Manacapuru (3°17'49"S e
60°37'28''W) (Fig. 1), restringindo-se a três ramais: Ramal do Acajatuba
(03°14'08" S e 60°34'28° W), Ramal Nova Esperança (03°14'51" S e 60°31'41"
W) e Reserva Ecológica Floresta da Vida (03°13'2r S e 60°27'01" W) (Fíg.2).
\Novo Airão
Rio Ne
nacapuru
g kn "O km 1Skm 2C knO km km
Figura 1 - Imagem de satélite com a localização do Município de
Manacapuru, Amazonas, Brasil (Landsat 7 ETM+, 2003).
20
(a)
ROM ackSo
OLINdAooNOurt
90 lOOkm
d
L (b3)RESeRVA
EcouteiCAFLOREtTAOA ..VlOA
■Ano
Figura 2- Localização das áreas de estudo ao longo da Rodovia ManuelUrbano, Município de Manacapuru no Estado do Amazonas, (a) disposição doMunicípio de Manacapuru; (b) disposição dos ramais; (b1) Ramal doAcajatuba; (b2) Ramal Nova Esperança; (b3) Reserva Ecológica Floresta daVida.
21
2.2 Coleta e identificação dos insetos
O levantamento da fauna flebotomínica foi realizado no período de abril
de 2003 a junho de 2004. Os flebotomíneos foram coletados com armadilhas
luminosas tipo CDC (CDC "miniature" - Haueberr* Machine Works, New Jersey,
EUA). Em cada área foram utilizadas 16 armadilhas que permaneceram ligadas
no período das 18:00 às 6:00 horas, estabelecendo-se um dia de coleta mensal
para cada área.
Inicialmente, foi demarcada uma trilha principal em cada área onde
foram delineados dois transectos paralelos com comprimento de cinqüenta
metros da borda para a direita (trilhas A e 0) e para a esquerda (trilhas B e D).
Após os cinqüenta metros de ambos os lados foram demarcados oito pontos de
coleta onde as armadilhas foram dispostas a 2 e lOm em árvores diferentes,
estabelecendo uma distância de três metros entre os pontos (Fig. 3).
O material coletado foi triado no Laboratório da Fundação Nacional de
Saúde do município e acondicionados em frascos de vidro contendo álcool
70%. Este material foi levado para o Laboratório de Leishmaniose e Doença de
Chagas-CPGS/INPA para clarificação em NaOH (VETEC®) e diafanizado em
Fenol P.A. (VETEC®) para identificação, utilizando-se a chave de classificação
de Young & Duncan (1994).
Utilizou-se o teste estatístico não-paramétrica Qui-Quadrado para
verificar se havia diferenças de densidade entre os sexos. A diversidade de
espécies encontradas no município foi calculada através do índice de Fisher-
Willíanis (Southwood, 1980).
22
índice de Flsher-Wílliams=s
a g S-1
InN
onde:
a= índice de diversidade
S= número de espécies
N = número total de indivíduos
Para verificar a diferença nos estratos entre 2 e 10 metros de altura do
solo, foi utilizado o teste estatístico Mann-Whitney. Este teste foi aplicado
apenas para as espécies mais abundantes.
Representantes de cada uma das espécies foram etiquetadas e
encaminhadas para a Coleção de Invertebrados do IN PA.
23
Trilha C
Trilha A
6 3m
A
Trilha D
N
\
Trilha B
Figura 3 - Desenho esquemático dos transectos onde foram colocadas as
armadilhas luminosas (CDC) dispostas a 2 e 10 metros de altura, indicando a
trilha principal, as trilhas secundárias A, B, C e D a 50 metros da borda e os
pontos de coleta.
24
3. RESULTADOS
3.1 Diversidade de espécies
No período de 13 meses (abril a dezembro de 2003 e março a junho de
2004) um total de 10.446 espécimes de flebotomíneos foram coletados nos três
Ramais localizados ao longo da Rodovia Manuel Urbano, no Município de
Manacapuru. As coletas foram realizadas no período chuvoso (abril a junho de
2003 e março a junho de 2004) e no período seco 0'ulho a dezembro de 2003).
O índice pluviométrico foi de 705,7mm para o período chuvoso em 2003 e
820,6mm em 2004 e 487,1 mm no período seco em 2003.
Estes flebotomíneos estão distribuídos em 43 espécies pertencentes ao
gênero Lutzomyia França (Tab.1). O índice de diversidade geral calculado para
a região Nordeste do município de Manacapuru foi de a=5,7. Para a Reserva
Ecológica Floresta da Vida (Km 51) o índice foi a=5,3. Ramal Nova Esperança
(Km 60) a=5,1 e Ramal do Acajatuba (Km 66) a=4,8 (Tab. 2).
3.2- Abundância de espécies
Dentre os 10.446 espécimes coletados, 3.908 eram machos (38%) e
6.465 fêmeas (62%), ocorrendo uma diferença significante na abundância
entre ambos os sexos (p< 0,05) (Fig. 4).
25
Percentual de machos e fêmeas
62%
38%
□ {3â)ü (ÇÇ)
Figura 4 - Proporção de machos e fêmeas de flebotomíneos coletados noperíodo de abril a dezembro/2003 e março a junho/2004, nas áreas de mata deterra firme da Região Nordeste do município de Manacapuru, AM-Brasil.
As espécies mais abundantes para o Km 51 foram: Lutzomyia davisi
Root, 1934 22,9% (869), seguida de L eurypyga Martins, Falcão & Silva, 1963
22,6% (855). L anduzei com 17,6% (666), L longispina 6,2% (236), L
chagasi 5,6% (210), L umbratilis 5,5% 0,(208), L ayrozai Barreto & Coutinho,
1940 3,6% (135), L olmeca nociva Young & Árias, 1982 3,5% (133). As
demais espécies totalizaram 12,4% da amostra (Fig. 5).
25.0%
20.0%
uj 15.0%
10.0%
^
y/yyyyy/
Figura 5- Abundância de espécies do gênero Lutzomyia (Diptera:
Psychodidae) do Km 51 no período de abril a dezembro/2003 e março a
junho/2004, em área de mata de terra firme da Região Nordeste do município
de Manacapuru, AM-Brasü.
Para o Km 60 foram; Lutzomyia anduzei 44,3% (2.231), seguida de L.
umbratilis 13,7% (690). L davisi com 10,1% (509), L longispina 9,1% (457),
L ayrozai 5,2% (2S4), L ofmeca nociva 3,7% (189), L chagasi 2,5% (125),.
As demais espécies totalizaram 11,3% da amostra (Fig. 6).
45.0%
^ 40.0%
^ 35.0%«o
& 30.0%0)
« 25.0%
^ 20.0%« 15.0%
§ 10.0%
y ̂
</ •
Figura 6 - Abundância de espécies do gênero Lutzomyia (Díptera:
Psychodidae) do Km 60 no período de abril a dezembro/2003 e março a
junho/2004, em área de mata de terra firme da Região Nordeste do município
de Manacapuru, AM-Brasil.
Para o Km 66 foram: Lutzomyia davisi 25,5% (416), seguida de L
anduzei 16,7% (273), L octavioi 14,2% (232), L chagasi 8.6% (141). L
amazonensis 7,2% (118), L longispina 6.4% (105), L umbratilis 6,3% (103).
As demais espécies totalizaram 14,9% da amostra (Fig. 7).
30.0%
26.0%(A
.2
*§. 20.0%V)0
"S 15.0%'5c
1 10.0%3
^ 5.0%
/ / / y /■*.íJ? .o<í^ .0<^V
Figura 7 - Abundância de espécies do gênero Lutzomyia (Diptera:Psychodidae) do Km 66 no período de abril a dezembro/2003 e março ajunho/2004, em área de mata de terra firme da Região Nordeste do municípiode Manacapuru, AM-Brasil.
Tabela 1- Total de flebotomíneos do gênero Lutzomyia coletados em área de
mata do Ramal do Acajatuba, Nova Esperança e Reserva Ecológica Floresta
da Vida, Manacapuru, Amazonas -Brasil.
mdéí
Evandromyia Lutzomyia georgli 48
L monstruosa 94
Lutzomyia sp* 11
Lutzomyia L araracuarensis 7
L gomezi 3
L marinkeilei 6
Nyssomyia L anduzei 3.170
L antunesi 13
L fiaviscuteiiata 49
L oimeca nociva 378
L umbratiiis 1.001Psathyromyia L abonnenci 3
L dendrophyia 15
L iutziana 14
L punctigenicuiata 1
L shannoni 11
L cuiteiiata 3
L cuzquena 1
L scaffi 5Psychodopygus L amazonensis 255
L ayrozai 474
L ciaustrei 9
L chagasi 476
L davisi 1.794
L genicuiata 47
L paraensis 41Pressatia L choti 44
SciopemyiaL tríspinosa 28
L servuioiimai 120
L sordeiiii 90Trichophoromyia L eurypyga 911
L gibba 1
L octavioi 342Trichopygomyla L. iongispina 798
Viannamyfa L furcata 31
L tubercuiata 2
Aragaoi L aragaoi 21
Baityi L baityi 1
Migonei L waikeri 5
L wiiiiamsi 12
Oswaidol L rorotaensis 78
Pilosa L piiosa 1
Saulensis L sauiensis 32
^pécie nova em fase de descrição (Com. pessoal Rui A Freitas).ÉÉBBBÉÉÉBBÍBBãnâiiín
30
Tabela 2- Número de espécies e índice de diversidade encontradas naReserva Ecológica Floresta da Vida (Km51), Ramal Nova Esperança (Km 60) eRamajdoA^j^u^^^i662j^unicígodeM^^
Lutzomyia abonnenci {floch & Chassignet, 1947)Lutzomyia amazonensis (Root, 1934)Lutzomyia anduzeí (Rozeboom, 1942)Lutzomyia antunesi {Couünho, 1939)Lutzomyia aragaoi (Costa Uma, 1932)Lutzomyia araracuarensis (Morales & Minter,1981)Lutzomyia aymza/(Barreto & Coutinho, 1940)Lutzomyia óa/iy/(Damasceno ef a/., 1946)Lutzomyia (Evandromyia) sp.Lutzomyia claustrei (Abonnenc et ai, 1979)Lutzomyia chagasi (Costa Lima, 1941)Lutzomyia chotí (Floch & Abonnenc, 1941)Lutzomyia cuteliata (Banrett et ai., 1996)Lutzomyia cuzquena (Martins et ai., 1975)Lutzomyia davisi {Roút, 1934)Lutzomyia dendrophyía (Mangabeira, 1942)Lutzomyia eurypyga (Martins et ai, 1963)Lutzomyia flaviscutellata (Mangabeira, 1942)Lutzomyia furcata (Mangabeira, 1941)Lutzomyia geniculata (Mangabeira, 1941)Lutzomyia georgii (Freitas & Barrett, 2002)Lutzomyia gibba (Young & Árias)Lutzomyia gomez/(Nitzulescu, 1931)Lutzomyia iongispina (Mangabeira, 1942)Lutzomyia lutziana (Costa Lima, 1932)Lutzomyia marinkellei Çfoung, 1979)Lutzomyia monstruosa (Floch & Abonnenc, 1944)Lutzomyia ocfav/o/(Vargas, 1949)Lutzomyia oimeca nociva (Young & Árias, 1982)Lutzomyia paraensis (Costa Lima, 1941)Lutzomyia pilosa (Damasceno & Causey, 1944)Lutzomyia punctigeniculata {Foranml 1944)Lutzomyia rorotaensis (Floch & Abonnenc, 1944)Lutzomyia saulensis (Floch & Abonnenc, 1944)Lutzomyia scaffí (Damasceno & Arouck, 1956)Lutzomyia servulolimai (Damasceno & Causey,1945)Lutzomyia shannoni {Dyar, 1929)Lutzomyia sordellii (Shannon & Dei Ponte, 1927)Lutzomyia tubercuiata (Mangabeira, 1941)Lutzomyia trispinosa (Mangabeira, 1942)Lutzomyia umbratilis (Ward & Fraiha, 1973)Lutzomyia walkeri {Hewsieaó, 1914)Lutzomyia wiliiamsi (Damasceno, Causey &
5
mrnmmmKfmi
0
46
666
6
1
0
135
1
8
O
210
39
0
1
869
4
855
18
23
47
21
I
O
238
5
0
33
35
133
II
1
O
40
31
5
27
5
46
0
1
208
5
8
mmm
3
91
2.231
6
9
7
264
0
1
2
125
2
3
O
509
6
19
24
5
O
24
0
1
457
4
6
61
75
189
29
O
0
37
1
O
86
6
34
2
21
690
O
3
0
118
273
1
11
O
75
O
2
7
141
3
O
O
416
5
37
7
3
O
3
O
2
105
5
O
0
232
56
1
0
1
1
O
O
7
O
10
O
6
103
0
1
3
255
3.170
13
21
7
474
I
II
9
476
44
3
1
1.794
17
911
49
31
47
48
1
3
798
14
6
94
342
378
41
1
1
78
32
5
120
11
90
2
28
1.001
5
12
31
3.3- Estratificaçâo vertical
Foram coletadas 43 espécies distribuídas nos subgêneros Nyssomyia
{44,^%), Psychodopygus (29,6%l Trichophoromyia (^2%) e Tríchopygomyia
(7,6%). Os subgêneros mais representativos tanto a 2 quanto à 10m de altura
foi Nyssomyia com 45,7% (1698) e 43,1% (2900), Psychodopygus 24,6% (916)
e 31% (2083) respectivamente (Fig. 8).
45%
2 40%
«S 35%O)
3 30%CO
g 25%
I 20%I 15%-
15%-
B Nyssomyia
□ Psychodopygus
Figura 8- Percentual dos subgêneros Nyssomyia e Psychodopygus coletados a
2 e 10 metros de altura no período de abril a dezembro/2003 e março a
junho/2004, nas três áreas de mata ao longo da Rodovia Manuel Urbano na
Região Nordeste do Município de Manacapuru, Am-Brasil.
Na Reserva Ecológica Floresta da Vida (Km 51), oito espécies foram
dominantes tanto a 2 quanto a lOm de altura, representando respectivamente
81,1% (993) e 90,7% (2.319) do total dos flebótomos coletados em cada
estrato: Lutzomyia anduzeí 12,5% (153) e 20,1% (2.191), L ayrozai 4% (49) e
3,4% (86), L chagasi 6,9% (85) e 4,9% (125), L davisi 16,7% (204) e 26%
(665), L eurypyga 17,9% (219) e 24,9% (636), L longispina 4,5% (55) e 7,1%
(181), L olmeca nociva 7,4% (91) e 1,6% (42) e L umbraíilis 2,8% (71) e
11,2% (137).
Quando comparados os níveis de estratificação vertical entre 2 e lOm de
altura verificou-se que as espécies acima citadas foram mais abundantes a
lOm, demonstrando uma diferença significante (p<0,01), com exceção de L
olmeca nociva onde o maior número de indivíduos coletados foi a 2m de altura
(Tab. 3).
O Ramal Nova Esperança (Km 60) apresentou sete espécies
dominantes para os dois estratos (2m e lOm), representando 81,9% (1.492) e
92,6% (2.973), respectivamente: L anduzei 30% (547) e 52,4% (1.684), L
ayrozai 3,5% (63) e 6,3% (201), L chagasi 3,6% (65) e 1,9% (60), L davisi
4,9% (90) e 13% (419). L longispina 9,4% (171) e 8,9% (286), L olmeca
nociva 6,4% (116) e 2,3% (73) e L umbratilis 7,8% (250) e 24,2% (440). Para
os indivíduos coletados a 10m a diferença significante (p<0,01) (Tab. 3).
Apenas cinco espécies no Ramal do Acajatuba foram dominantes em
ambos estratos (2m e lOm), representando 60,3% (406) e 79,1% (759),
respectivamente: L anduzei 11,3% (76) e 20,5% (197), L chagasi 11,9% (80)
e 6 4% (61). L' ® (324), L octavioi 13,2% (89) e
14 9% (143) e umbratilis 3,5% (34) e 10,3% (69). Neste ramal o número de
33
indivíduos cx»letados para os dois estratos foi muito pequeno, observou-se a
presença de L eurypyga apenas em armadilhas colocadas a 2m de altura. A
diferença foi significante (p<0,01) para os indivíduos coletados a 10m, com
exceção de L chagasi (Tab. 3).
Nas três áreas trabalhadas, espécies do subgênero Nyssomyia: L
anduzei e L umbratilis foram mais abundantes a 10m de altura. L
flaviscutellata, considerada vetor da L (Leíshmania) amazonensis, foi coletada
em pequena quantidade nestas áreas, enquanto que L olmeca nociva foi mais
expressiva a 2m de altura (Fig. 9).
2500
.£
í. 2000
s. 1500
1 1000
/
B2m
□ lOm
Figura 9- Estratificação vertical das espécies do subgênero Nyssomyiacoletadas no período de abril a dezembro/2003 e março a junho/2004, nas três
áreas de mata aolongo da Rodovia Manuel Urbano na Região Nordeste doMunicípio de Manacapum, AM-Brasil.
As espécies do subgênero Psychodopygus: L ayrozai, L chagasi e
L davisi foram coletadas com maior freqüência a 10m de altura, apresentando
uma diferença slgnificante (p<0,01) em relação a 2m. L amazonensis foi mais
expressiva a 2m e as outras espécies não demonstraram diferenças
estatísticas significantes comparando os dois níveis de estratificação (Fig. 10).
1600
1 14008 1200
° 1000
/>" J>- /■ Jy / / V V-
Figura 10- Estratificação vertical das espécies do subgênero Psychodopyguscoletadas no período de abril a dezembro/2003 e março a junho/2004, nas trêsáreas de mata ao longo daRodovIa Manuel Urbano da Região Nordeste doMunicípio de Manacapuru, AM-Brasil.
Tabela 3- Distribuição vertical de fiebotomíneos coletados com armadilha luminosanas três áreas de mata da Região Nordeste do Município de Manacapuru, AM-Brasil. no período de Abril/2003 a Junho/2004.
Lutzomyia abonnenciLutzomyia amazonensisLutzomyia anduzeiLutzomyia antunesiLutzomyia aragaoiLutzomyia araracuarensisLutzomyia ayrozaiLutzomyia baityiLutzomyia (Evandromyia) sp.Lutzomyia claustreiLutzomyia chagasiLutzomyia chotiLutzomyia cutellataLutzomyia cuzquenaLutzomyia davisiLutzomyia dendrophylaLutzomyia eurypygaLutzomyia flaviscutellataLutzomyia furcataLutzomyia genicujataLutzomyia georgiiLutzomyia gibbaLutzomyia gomeziLutzomyia longispinaLutzomyia lutzianaLutzomyia marínkelleiLutzomyia monstruosaLutzomyia octavioiLutzomyia olmeca nocivaLutzomyia paraensisLutzomyia pilosaLutzomyia punctigeniculataLutzomyia rorotaensisLutzomyia sauiensisLutzomyia scaffiLutzomyia servuiolimaiLutzomyia shannoniLutzomyia sordeiliiLutzomyia tubercuiataLutzomyia tríspinosaLutzomyia umbratilisLutzomyia waikeríI lÊtrnmvia williamsi
E2EEI lorhiIKmieol
í2m iOMi0
20
153
4
1
O
49
O
6
O
85
14
O
0
204
2
219
11
10
16
13
1
O
55
5
O
15
22
91
5
O
O
23
15
5
12
2
26
O
0
71
3
1
O
26
513
2
O
0
86
1
2
O
125
25
0
1
665
2
636
7
13
31
8
O
O
181
O
0
18
13
42
6
1
O
17
16
O
15
3
20
0
1
137
2
7
O
52
547
2
5
5
63
O
0
1
65
1
1
O
90
6
10
14
4
O
14
O
0
171
1
6
42
32
116
16
O
0
21
1
0
56
5
20
1
12
250
0
1
3
39
1.684
4
4
2
201
0
1
1
60
1
2
O
419
0
9
10
1
O
10
0
1
286
3
O
19
43
73
13
O
O
16
O
0
30
1
14
1
9
440
O
2
O
72
76
0
1
O
44
O
O
4
80
3
O
0
92
4
37
5
1
O
O
O
O
40
3
O
O
89
39
O
0
1
1
O
O
2
O
5
O
4
34
0
1
m
0
46
197
1
10
O
31
O
2
3
61
O
O
0
324
1
O
2
2
O
3
O
2
65
2
O
0
143
17
1
O
O
O
O
O
5
O
5
O
2
69
O
O
m
36
4. DISCUSSÃO
A Amazônia representa uma das últimas fronteiras onde existem
condições que podem se comportar como favoráveis para a qualidade de vida
no mundo, representada por um conjunto de ecossistemas (Alecrim, 2001).
Na região Nordeste do Municipio de Manacapuru foi encontrada uma
fauna flebotomínica diversificada e abundante, sendo identificada 43 espécies
do gênero Lutzomyia, com algumas espécies ainda não registradas para o
município de Manaus, AM. Segundo Forattini (1973), diferenças na paisagem e
caracteristicas ecológicas, bem como as barreiras geográficas existentes
podem influenciar no comportamento e distribuição dos flebotomíneos.
O índice de diversidade encontrado para o município de Manacapuru
(a=5,7), apresentou-se próximo dos índices encontrados por Rebêlo & Oliveira-
Pereira (2001) para o Estado do Pará (a=6,8), Freitas et al. (2002) no Estado
do Amapá (a=6,8) e Nery (2003) no município de Manaus (a=6,4).
As diferenças na diversidade de flebotomíneos encontrada nos três
ramais foi muito pequena, não sendo considerada significante. No ramal Nova
Esperança e na Reserva Ecológica, as alterações no ambiente silvestre tem
sido menos intensas, com matas mais preservadas, observando-se que os
flebotomíneos apresentam maior riqueza e abundância quando comparada
com o ramal do Acajatuba, onde o ambiente antrópico apresenta-se acentuado
com um maior número de habitações e modificações da flora original com
cultivo de mandioca.
Estudando a estratificação vertical e abundância das espécies coletadas
neste município, observou-se que os dois subgêneros predominantes foram
37
Nyssomyia e Psychodopygus, com representantes vetores, demonstrando um
maior risco para as pessoas adquirirem a leishmaniose nas matas de
Manacapuru. Ambos os subgêneros são predominantes na região amazônica,
com uma diversidade maior do que em outras regiões do Brasil (Azevedo et
ai, 2002).
Quatro das cinco espécies coletadas em Manacapuru do subgênero
Nyssomyia, L anduzei, L flaviscutellata, L olmeca nociva e Lumbratilis já
foram incriminadas anteriormente em outras localidades como vetores de
Leishmania, baseado no encontro de flagelados no trato digestivo destes
insetos (Árias & Freitas, 1978; Árias et ai, 1982; Freitas et ai, 2002).
Observando-se L anduzei e L umbratilis, verificou-se que estas
espécies foram mais abundantes a 10 m de altura, corroborando com dados
obtidos por Castellón et ai (1989), para o Estado de Roraima e Rangei et ai
(1999), no Estado do Mato Grosso.
Quanto às espécies L flaviscuteliata e L olmeca nociva foram
coletadas em maior número nas armadilhas colocadas a 2m, corroborando com
as observações realizadas por Árias & Freitas (1982) e Dias-Lima et ai (2002)
na Amazônia Central e Castellón et ai (1989 e 1991) em Roraima.
Das sete espécies coletadas do subgênero Psychodopygus, apenas L
davisi apresentou uma maior densidade, estando esta envolvida na
transmissão de Leishmania naiffí, uma leishmánia isolada do tatu Dasypus
novencictus, na região amazônica (Lainson & Shaw, 1989).
As espécies Layrozai, Lchagasi e L davisi consideradas antropofílicas,
foram coletadas em maior quantidade a 10m de altura do solo, indicando que
38
estas espécies estejam a procura de vertebrados que habitam mais ao nível do
solo para realização da hematofagia.
Segundo Barrett (1993), a concentração do subgênero Psychodopygus
em baixas alturas, pode ajudar nas buscas dos sítios de repouso das fêmeas
oníparas, facilitando as observações das relações parasito-vetor e vetor-
hospedeiro.
Foi observado que as espécies L dendrophyla, L scaffi e L shannoni
pertencentes ao subgênero Psathyromyia, foram pouco atraídas em armadilhas
de luz, fato este confirmado por outros autores (Dias-Lima et al., 2002). Árias
et ai (1985), chamam a atenção para o fato destas espécies, principalmente L
shannoni, ter sido associada à transmissão de Endotrypanum schaudinnl
Mesnil & Brimont 1908, tripanosomatídeo exclusivo de preguiças.
Segundo Árias & Freitas (1982), existem evidências da preferência dos
flebotomíneos da Amazônia Central pelas copas das árvores em relação ao
solo da floresta. Em nossos estudos foi observado que o maior número de
espécimes foi coletado a lOm de altura, corroborando com as observações dos
autores acima citados.
A razão total fêmeas/machos das espécies coletadas encontra-se
próxima de 2:1. Aguiar et ai (1985), acreditam que coletas com armadilha
luminosa possa atrair um maior número de machos, visto que estes formam
um agregado com o propósito de acasalamento. Em nossas coletas foi
observado que o número de machos foi Inferior ao número de fêmeas, não
corroborando com o pressuposto observado pelos autores anteriormente
citados.
39
Os resultados obtidos por este trabalho no Município de Manacapuru
nas três áreas de mata ao longo da Rodovia Manuel Urbano, demonstram que
a distribuição dos flebotomíneos em diferentes estratos variou em diversidade e
abundância de espécies, o que pode ser explicado pelas diferenças ambientais
com a existência de áreas desmatadas em alguns pontos de coleta, pela
preferência alimentar de espécies como L umbratilis e L anduzei por preguiça
aonível da copa das árvores, L flaviscutellata e L olmeca nociva por roedores
ao nível do solo (Genaro et aí., 1986).
Foi observado anteriormente que a densidade de Lutzomyia umbratilis
nas três áreas foi inferior em abundância comparada a L anduzei, incriminada
como vetor secundário da leishmaniose na região amazônica (Árias & Freitas,
1977). As quantidades encontradas nos diferentes níveis de estratificação,
bem como a sua presença em ambientes com características mais antrópicas,
são importantes para a compreensão da epidemíologia de propagação das
doenças transmitidas pelos flebótomos para o homem.
Estas são as primeiras informações publicadas sobre a fauna
flebotomínica e sua distribuição nos diferentes estratos para a região nordeste
de Manacapuru, contribuindo para a compreensão da epidemíologia dos
vetores da leishmaniose neste município.
40
CAPITULO II
DETECÇÃO DE INFECÇÃO NATURAL POR LEISHMANIA sp.
(KINETOPLASTIDA:TRYPANOSOMATIDAE) EM
FLEBOTOMÍNEOS (DíPTERA:PSYCHODIDAE) ATRAVÉS DO
MÉTODO TRADICIONAL E MOLECULAR X ANÁLISE
ISOENZIMÁTICA EM ÁREA DE MATA DE TERRA FIRME DA
REGIÃO NORDESTE DO MUNICÍPIO DE MANACAPURU, AM.
1. INTRODUÇÃO
O papel biológico dos flebotomíneos na transmissão das leishmanioses e
bartoneloses foi estudado no início do século XX por Adier & Theodor (1925).
Algumas espécies de flebotomíneos que vivem ao nível do solo, podem vir a
atuar como vetores em potencial de leishmânias para mamíferos, incluindo o
homem (Lainson, 1983; Ready et ai, 1986; Dias-Lima atai, 2002).
Na Região Amazônica, várias espécies do gênero Lutzomyia apresentam
infecção natural por diferentes gêneros de tripanosomatídeos. L shannoni foi
encontrada naturalmente infectada por Endotrypanum schaudinni, L ayrozai
por Leptomonas sp., L paraensis e L davisi estão envolvidas na transmissão
de Leishmania {Víannia) naiffí e L flaviscutellata e L olmeca nociva infectadas
com L {Leishmania) amazonensis (Shaw et ai., 1972; Árias et ai., 1985;
Lainson et ai, 1990; Silveira et al, 1991; Franco et ai, 1997; Franco &
Grimaldi, 1999; Sousa, 2000).
43
o método mais utilizado para a investigação de infecçâo em flebótomos
é o laboratorial, com o exame do parasito in loco, depois da dissecçâo do trato
digestivo do inseto, porém, a infecçâo naturai de Lutzomyia com Leishmania
em áreas endêmicas geralmente é muito baixa (Tesh et ai., 1984; Miranda et
ai, 2002).
Técnicas moleculares tomaram-se ferramentas importantes no estudo
genético de populações naturais de vários organismos (Oliveira et ai, 2002).
Com os avanços destas técnicas, um número de marcadores moleculares e
protocolos de POR para detecção ou identificação de Leishmania em diferentes
níveis taxonômicos têm sido descrito (Degrave et ai., 1994). Esta abordagem
tem permitido diagnósticos baseados em POR, que são normalmente
representados por seqüências de genes repetidos como mini-exon e kDNA ou
gene ribossomal (Aransay et ai, 2000; Michaisky et ai, 2002; Miranda et ai,
2002).
A reação em cadeia da polimerase (POR) é uma técnica in vitro que
permite a amplificação de seqüências específicas de DNA e RNA (Mesquita et
ai, 2001). A POR foi originaimente descrita por Saiki et ai (1985) e desde
então tem sido utilizada em vários campos da Ciência. É uma técnica com alta
especificidade e aplicabilidade, com centenas de métodos descritos. A
característica mais importante da PCR é a capacidade de amplificar cópias de
DNA a partir de pouca quantidade de material.
A técnica de "Nested-PCR" foi desenvolvida para amplificar a região
variável dos minicírculos do cinetoplasto de todas as espécies de Leishmania
infectam mamíferos (Cruz, et ai, 2001). Ensaios empregando-se estaque
técnica onde seqüências de inicladores originados da região de mini-exon,
44
são específicos para discriminar subgêneros de Leishmania, têm sido
utilizados atualmente, com resultado eficaz, na tentativa de evidenciar infecçâo
natural por leishmânias em flebotomíneos (Pinheiro, 2004).
Outros métodos bioquímicos são utilizados na identificação e
classificação das leishmânias (Motazedian et ai, 1996), entretanto, nenhum
deles ainda é considerado como totalmente eficaz, específico e sensível o
suficiente para ser utilizado isoladamente, na maioria das vezes são
necessários diversos métodos para se chegar à espécie. A análise com
isoenzimas tem sido considerada como padrão técnico, contudo requer o
isolamento em cultura dos parasitos in vitro e uma variedade de reagentes
(Motazedian et ai, 1996). Outros métodos têm sido utilizados para uma melhor
avaliação ao nível de espécie, sendo importante a correlação destas
informações, sejam elas biológicas, bioquímicas ou moleculares.
Com o intuito de averiguar o(s) provável transmissor(es) da LTA, no
município de Manacapuru, este estudo objetivou verificar a taxa de infecção
natural por tripanosomatídeos em fêmeas de Lutzomyia spp., através de
métodos tradicionais e moleculares, e identificar os parasitos isolados dos
flebotomíneos dissecados coletados em base de árvore em um ramal ao longo
da Rodovia Manuel Urbano no município de Manacapuru, Amazonas.
45
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Coleta dos Insetos
As coletas foram realizadas em base de árvore no ambiente silvestre
durante oito meses Ounho a novembro/2004 e abril e maio/2005), entre 9:00 e
10:00, utilizando-se CDG (CDG "miniature" - Hausherr' Machine Works, New
Jersey, EUA) modificada e adaptada à aspiração, no Ramal Nova Esperança
(03®14'5r S e 60®31'4r W), localizado ao longo da Rodovia Manuel urbano,
município de Manacapuru. As fêmeas foram colocadas em frascos contendo
álcool etílico (100%), e estocadas a 4®G. Para identificação das fêmeas foram
retirados os dois últimos segmentos do abdome para visualização da
espermateca e dos machos analisada a genitália externa. Após a identificação,
cada espécie foi acondicionada em microtubos plástico para posterior extração
do DNA.
2.2 Dissecção e Isolamento de Flagelados
No laboratório instalado em Manacapuru, foram registradas informações
referentes à espécie, características da Infecção e condições dos ovários. As
fêmeas foram transferidas para placas de Petri contendo água com uma gota
de detergente, para quebra da tensão superficial, favorecendo a retirada das
cerdas. A seguir, foram transferidas para uma lâmina contendo uma gota de
solução salina 0,9% e visualizadas em microscópio estereoscópio. A cabeça foi
separada do corpo sendo retirado o 6® e 7® segmentos do abdome para
exposição do intestino e espermateca. Em seguida foi feita observação e46
localização dos parasitos em microscópio óptico. O conteúdo estomacal dos
espécimes Infectados foi semeado em meio de cultura bifásico NNN-Difco B45
(Novy & MacNeal, 1904; Nicolle, 1908) acrescido de 0,5mL de solução salina
estéril (NaCI) a 0,9%. Os tubos de meio de cultura bifásico NNN foram
encaminhados, para manutenção e caracterização, no Laboratório de
Leishmaniose e Doença de Chagas-CPCS/INPA em Manaus. No laboratório, o
material existente no meio de cultura que obteve um bom crescimento foi
inoculado (0,1mL) na região do focinho de dois hamsters {Mesocrícetus
auratus), de sexos diferente.
Figura 1- Coleta de base de árvore realizada
no Ramal Nova Esperança, município de
Manacapuru, AM.
47
2.3 Obtenção da massa parasitária
Para obtenção da massa parasitária, as amostras de flagelados foram
amplificadas em meio de cultura bifásico NNN-Difco B45 (Novy & MacNeal,
1904; Nicolle, 1908) sendo transferidas para garrafas de 250mL contendo meio
de cultivo RPMI (GIBCO®) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino
(GIBCO®) e gentamicina (gentaron, 200ul/mL).
As formas promastigotas foram centrifugadas na concentração de
10®/mlL (5000 rpm a 4® C) e lavadas duas vezes em PBS (Phosphate Buffered
Saline) para extração do DNA, e uma vez em tampão próprio para preparo de
massa para análise de isoenzimas (0,85% NaCI, 0,01 M EDTA). O "pellet"
parasitário foi estocado a -20® C para PCR e -70® C para isoenzima.
2.4 Controles para reação de PCR
Nas amplificações (PCR) foram utilizadas cepas de referência L (V.)
guyanensis e L (L.) amazonensis, representantes dos subgêneros Viannia e
Leishmania, respectivamente como controles da reação.
2.5.Extração de DNA
2.5.1. Insetos
O DNA foi extraído de acordo com o protocolo de Pinheiro (2004), com
algumas modificações. Os insetos acondicionados em álcool etílico foram
48
rehidratados em água destilada por 10 minutos para retirar o excesso de álcool
em temperatura ambiente. Foram utilizados "pool" de 20 insetos das espécies
L umbratilis] L anduzéi e L deridrophyla, macerados é homogeneizados em
tampão de lise "Blender Buffer" (5M NaCI, 0,2M sucrose, 2M Tris-HCI, 0,5M
EDTA pH 9,1 e H2O deionizada), acrescido de Sulfato Dodecil de Sódio 0,5M
(SDS, Sigma Company LTDA) e incubado a 65® C. Foi adicionada proteinase K
(0,1 mg/mL). Em seguida, foi adicionado acetato de potássio 8M (KAC) 4®C,
homogeneizado e incubado em gelo. O sobrenadante foi coletado após a
centrifugaçâo a 14.000 rpm, sendo descartado o "pellef, adicionando-se
RNAse (0,05mg/mL). O sobrenadante foi coletado após a centrifugaçâo,
acrescentado-se ETHO 100®/o ao sobrenadante para precipitação do DNA. O
sobrenadante foi descartado após centrifugaçâo, adicionando-se TE (lOmM
TRIS-HCI pH 8.0, 1 mM EDTA). Este foi mantido em geladeira até a reação da
POR.
2.5.2. Parasites
O DNA foi extraído de acordo com o protocolo de Marfurt (2003), com
algumas modificações. A cultura de células foi centrifugada a 14.000 rpm e
desprezado o sobrenadante. Foi adicionado tampão de lise "Blender Buffer"
(5M NaCI, 0,2M sucrose, 2M Tris-HCI, 0,5M EDTA pH 9,1 e H2O deionizada),
acrescentado proteinase K (0,5 mg/mL) e incubadas a 56®C. Acrescentou-se
fenol 1:1, centrifugado a 14.000 rpm 4®C, transferiri para outro tubo a fase
superior. Adicionar igual volume de fenol/clorofórmio e centrifugar a 14.000
rpm 4®C.Transferir novamente para outro tubo a fase superior e adicionar igual
49
volume de clorofórmio, centrifugar novamente e transferir para outro tubo. O
DNA foi precipitado com etanol absoluto, centrifugado a 14.000 rpm e o "pellef
lavado com etanol 75%, adicionando-se TE (lOmM TRIS-HCL pH 8.0, 1 mM
EDTA) para precipitar o DNA.
2.6. Quantificação do DNA
O DNA das amostras foi quantificado através de medições em
espectrofotômetro utilizando-se o "Gene-Quantpro (Pharmacia)" nos
comprimentos de onda de 260, 280 e 320nm, nas diluições de 2:70 em água
MiliQ.
2.7. Padronização da concentração de DNA parasitário e de fiebotomíneos
para utilização na PCR
Antes da amplificaçâo do DNA dos fiebotomíneos coletados no campo e
dos flagelados, foram realizados testes com diferentes concentrações de DNA
das amostras de L (V.). guyanensis (MHOM/BR/75/M4147) cultivadas em
laboratório e DNA de "poor de machos de fiebotomíneos da espécie L
umbratilis com o intuito de verificar quais concentrações apresentavam melhor
amplificaçâo na reação de PCR.
50
Flebotomíneos
O DNA total extraído do "pool" de 20 flebotomíneos machos de L
umbratilis foi utilizado para preparação da solução padrão contendo 2pL do
DNA diluído em 18pL de TE (10mM TRIS-HCI pH 8.0, 1 mM EDTA). A partir da
solução padrão foram obtidas diferentes concentrações, 50ng e 70ng, 100ng,
200ng e 300ng/uL.
Parasites
O DNA total de L (V.) guyanensis foi utilizado para preparação da
solução padrão contendo DNA da amostra diluído em TE (10mM TRIS-HCI pH
8.0, 1 mM EDTA), obtendo-se concentrações de 0,1ng, 0,3ng, 0,5ng, 1ng, 5ng,
10ng, 20ng e 30ng/ML
2.8. Ampíificaçâo do DNA
Após a extração do DNA dos flebotomíneos e da massa parasitária dos
flagelados, estes foram adicionados na reação da POR (Nested-PCR),para
amplificação das regiões de mini-exon de flagelados do gênero Leishmania
(subgêneros Leishmania e Viannia) com o objetivo de detectar infecção nos
insetos coletados.
A reação de "Nested" - POR tem como princípio a amplificação,
através de duas reações de POR, utilizando-se dois iniciadores em cada uma
das reações. Tem como objetivo aumentar a sensibilidade e permitir detectar
51
especificamente o DNA de Leishmania, principalmente, quando este estiver
presente em flebotomíneos naturalmente infectados, onde a concentração de
flagelados é baixa, amplificando a região de mini-exon de pelo menos três
grupos de leishmânia dos subgêneros Leishmania e Viannia (Pinheiro, 2004).
Os fragmentos obtidos após a amplificação referem-se aos tamanhos de
302 pb para o subgênero Leishmania e 242 pb para Viannia.
A PCR foi processada pela mistura de 10 pL de cada amostra de DNA
de flebotomíneos ou dos flagelados, tampão 2 mM MgCb 10 X, MgCb 10 mM,
DMSO, deoxinucleotídeos 10 mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), lU/pL de Tth
DNA polimerase (marca Promage), 15 pmol/pL de cada iniciador para 50 pL de
reação. Os iniciadores utilizados para a primeira reação de PCR foram: SIrev
e SL2 descritos por Cruz et ai. (2002), os quais anelam nas regiões de mini-
exon de Leishmania para amplificação dos fragmentos. A reação foi realizada
em microtubos próprios para evitar a evaporação, em 35 ciclos de amplificação
realizados em um termociclador automático (Thermo Electron Corporation -
PX2 Thermal Cycler). As condições das reações foram: desnaturação do DNA
a 85° C por 4 minutos, 94° C por 7 min, 94° C por 20 segundos, anelamento
dos iniciadores a 50° C por 30 segundos e extensão a 72° C por 20 seg. (com
etapa final de 10 min.), terminando a 4° C.
Na segunda reação de PCR foram utilizados os Iniciadores SLM1 e
SLM2 (Pinheiro, 2004).
Nas etapas de preparo do DNA e misturas da reação da PCR utilizou-
se controle negativo com amostras de flebotomíneos machos além dos
controles positivos de cultivo parasitário de amostras de representantes dos
subgêneros Leishmania e Viannia.
52
2.9. Análise Eíetroforética da Reação em Cadeia da Poiimerase (POR)
Alíquotas de 10 pL das amostras de POR foram adicionadas a 2 pL de
tampão de carga (0,25% (v/v) azul de bromofenol, 0,25% (v/v) de xilenocianol
em 40% de solução aquosa de sacarose) e fracionadas por eletroforese em gel
de agarose a 2%, com tampão de corrida TAE (40mM de Tris-Acetato e ImM
de EDTA pH 8,0) durante 1 hora e meia a 90 Volts. Foi utilizado marcador de
peso molecular lOOpb "ladder" (Life Technologies, Gaithrsburg, MD, USA) para
a averiguação do tamanho dos amplicóns. Os géis corados com Brometo de
Etídio (2pL) foram fotografados em trans-iluminador a um comprimento de onda
de 312 nm de comprimento usando o sistema fotográfico "Eagie Eye"
(Stratagen, La Joila, USA).
2.10. Caracterização e tipagem dos isoiados de tripanosomatídeos
. Análise isoenzimática
As amostras de parasites isolados de flebotomíneos foram tipadas através da
análise de eletroforese de enzimas, de acordo com método descrito em Franco et al.
(1996). Foram utilizados seis sistemas enzimáticos: G6PDH (glicose - 6 - fosfato
desidrogenase, Enzyme Comission = E.C. 1.1.1.49), IDH NAD e IDH NADP
(isocitrato desidrogenase, 2 loci, E.C. 1.1.1.42), ME (enzima málica, E.C. 1.1.1.40),
MDH (malato desidrogenase, E.C.1.1.1.37) e HK (hesoquinase, E.C. 2.7.1.1).
53
Preparo de géis:
O gel de agarose foi preparado a 1% em água destilada e solução tampão
(1:2, v/v) específica, e guardado em geladeira a 4°C em recipiente fechado para ser
usado no dia seguinte. Antes da corrida, os géis foram secados com papel filtro. A
fita de aplicação é colocada na base do gel e aplicado 2 pi do marcador de corrida
nos poços das extremidades. Para cada poço foi aplicado 2 pi de cada amostra,
deixar secar e logo após retirar a fita. Colocar o gel sobre a placa fria e posicionar
as esponjas que servirão de ponte entre o tampão e o gel.
Corrida de eietroforese de isoenzimas
O gel foi colocado em cuba de eietroforese horizontal (Amersham Pharmacia
Biotech) e a corrida feita durante um período de, no mínimo, 2 horas, em condições
adequadas de corrente e temperatura, mantida constante por um sistema de
refrigeração (10°C) [Tab.1].
Tabeia 1- Condições de corrida eletroforética para cada sistema enzimático
Enzimas Tampão Voltagem Amperagem
G6PDH Fosfato 0,1 M 118 V 200 mA
IDH NAD Fosfato 0,1 M 118 V 200 mA
IDH NADP Fosfato 0,1 M 118V 200 mA
ME Fosfato 0,1 M 118 V 200 mA
MDH Fosfato 0,1 M 118 V 200 mA
HK Tris-Citrato 50 V 108 mA
54
Análise dos géis
As bandas alélicas (eletromorfos) separadas foram reveladas no gel com
sistemas específicos, constituídos de substratos e cofatores em solução tampão
adequada (Franco et aL, 1996). A reação enzimática foi interrompida com ácido
acético glacial a 5% e posteriormente seco a temperatura ambiente para análise.
Cepas contendo os mesmos perfis isoenzimáticos das cepas de referência foram
classificadas no mesmo zimodema (código INPA-No.), representando assim uma
determinada espécie ou variante.
Análise fenética
A análise fenética foi realizada utilizando-se os coeficientes de
similaridade de "Jacccard" e "Simple Matching". Para esta análise uma matriz
de presença/ausência de bandas foi construída e analisada utilizando o
programa NTSYS (versão 1.70, Exeter Software). As matrizes de similaridade
foram transformadas em fenogramas pelo algorítimo UPGMA (Unweighted Pair
- Group Method using Arithmetic Averages).
55
3. RESULTADOS
3.1 Isolados de Flebotomíneos
Foram coletados 2.113 espécimes, dos quais 1.174 (55,5%) fêmeas
foram dissecadas (Tab.2). A taxa de infecção natural encontrada nas fêmeas
foi de 8,2% (84/1.030) para L umbratilis, 22% (9/41) para L dendrophyla e
1,2% (1/86) para L anduzei,
O conteúdo estomacal da maioria (n=75) das fêmeas positivas de L
umbratilis apresentava sangue fresco, com número de flagelados variando de
5 a 20 por campo, algumas sem sangue (n=4), com os parasites presos a
parede do epitélio localizado próximo ao tubo de Malpighi, e as outras
apresentavam sangue em decomposição (n=5). Dos exemplares de L
dendrophyla, algumas apresentavam sangue fresco (n=3), e outras com
sangue em decomposição (n=5) e sem sangue (n=1). O único exemplar de L
anduzei, apresentava sangue em decomposição (Tab. 3).
Verificando a relação da infecção dos insetos com os índices
pluviométricos, foi observado que em fêmeas de L umbratilis ocorreu um taxa
de infecção de 9% (12/133) no mês de agosto e 16,4% (23/140) no mês de
setembro, com períodos de baixa precipitação. Para L dendrophyla a taxa de
infecção foi de 42,9% (3/7) nos meses de novembro e abril, com baixa e alta
precipitação (Fig. 2).
56
Tabela 2- Total de flebotomíneos dissecados para a presença de flagelados no
Ramal Nova Esperança (Km 60), Manacapuru-AM.
ibm mmmm
L umbratilis 84 946 377 648 1.030
L anduzei 1 85 43 43 86
L flaviscutellata 0 1 0 1 1
L antunesi 0 1 0 1 1
L olmeca nociva 0 3 0 3 3
L dendrophyla 9 32 24 17 41
L longispina 0 4 0 4 4
L eurypyga 0 5 1 4 5
L davisl 0 3 0 3 3
Total 94 1.080 445 724 1.174
Pos.: presença de flagelados: Neg.: ausência de flagelados; P.: presença desangue; A.: ausência de sangue.
57
Tabela 3- Distribuição dos flagelados no trato digestivo dos flebotomíneos
isolados em cultivo, capturados no Ramal Nova Esperança (Km 60),
Manacapuru, AM.
ífôWrK'
PWM\
IDEN/BR/2004/IM5254 (+) SF 1 X X
IUMB/BR/2004/IM5255 (++) SF 2 X X
IDEN/BR/2004/IM5256 (++) SD 3 X X X
IDEN/BR/2004/IM5257 (++) SF 3 X X
IDEN/BR/2004/IM5258 (+) SS 2 X X
IDEN/BR/2005/IM5259 (++) SD 2 X X X
IUMB/BR/2005/IM5260 (+) SD 2 X X
IUMB/BR/2005/IM5261 (+) SD 2 X X
IUMB/BR/2005/IM5262 (+) SF 1 X
IUMB/BR/2005/IM6263 (+) SF 2 X X
IUMB/BR/2005/IM5264 (+) SD 2 X X
IUMB/BR/2006/1M5265 (+) SD 2 X X
IUMB/BR/2005/IM5266 (+) SD 2 X X
IAND/BRy2006/IM5267 (+) SD 3 X X
IUMB/BR/2005/IM5268 (++) SD 2 X X X
IUMB/BR/2005/ll\/l5270 (+) SS 2 X X
IUMB/BR/2005/IM5271 (++) SD 2 X X X
IUMB/BR/2005/II\/l5272 (+) SD 2 X X
IUMB/BR/2006/IM5273 (+++) SD 2 X X X
Lutzomyia dendrophyla/Pals de origem/Ano de isolamento/Código original; AP
Triângulo posterior; EA: Estômago anterior; EP: Estômago posterior; SD
Sangue em decomposição; SS: Sem sangue; SF: Sangue fresco; 1: Ovários
em desenvolvimento; 2: Ovos pequenos; 3: Ovos grandes; Quantidade de
flagelados observados no exame: 1 a 5 (+); 6 a 20 (++); 21 a 40 (+++).
58
(a)Fstíirãn sena F.st;ícãn chuvosa
18 j ^16 --
^ 14-o 12-
% 10 --V
•S 8 -
<i>CA
.£ 4 4-
300 -P
250 ̂
200 ̂(0
150 ,S-
100 5.
■/■ Cf" /2004
I Insetos Infectados —♦—Precipitação
(b) Fstacão sftoa F.stacao chuvosa
50 -r
45 --
40 -
g 35 -•i 30 --
25 -
o 20 --%c 1®
10 --
-- 350
- 200 ^
-- 150 ü
^ ̂cr
[Insetos Infectados —♦—Precipitação
Figura 2 - Distribuição mensal da precipitação e taxa de infecção natural portripanosomatídeos em Lutzomyia umbratilis (a) e L dendrophyla (b) no períodode junho a novembro de 2004 e abril e maio de 2005, no Ramal NovaEsperança (Km 60), Manacapuru, Amazonas, Brasil.
59
3.2 Concentração de DNA de parasítos e flebotomíneos
O resultado deste estudo baseou-se inicialmente na padronização da
concentração de DNA de parasites e flebotomíneos ideais para utilização na
reação de POR.
Para detectar a menor concentração de DNA do parasito encontrada nos
insetos infectados foram realizados testes obtendo-se os seguintes resultados:
(1) foram visualizadas em gel de agarose a 2% todas as concentrações (0,1ng
a SOOng), sendo escolhidas as de menor concentração para amplificação em
POR; (2) nenhuma das menores concentrações escolhidas para o DNA
parasitário (0,1ng a SOng), foi amplificada na 1® reação de POR.
3.3 Detecção da infecção
Um total de 1.400 espécimes divididos em pool de 20 insetos foram
testados inicialmente, representado pelas espécies L umbratilis, L
dendrophyla, L anduzei, L davisi, L amazonensis e L chagasi.
Apresentaram positividade apenas L umbratilis 8,3% (100/1.200) e L
dendrophyla 33,3% (20/60). Utilizaram-se para controles positivos parasitos do
subgênero Leishmania e Viannia, os quais foram comparados aos amplicons
obtidos das amostras dos insetos.
Os resultados apresentaram semelhanças com bandas do subgênero
Viannia (242 pb), tanto para L umbratilis (poços 4 e 5; 7 a 11), quanto para L
dendrophyla (poço 6) (Fig. 01). Verificou-se que a concentração de DNA para
L umbratilis variou de 112 a 266ng/|jL e L dendrophyla 94,5ng/|jL. Todas as
60
amostras positivas encontravam-se com presença de sangue no trato digestivo.
A presença de sangue das fêmeas foi observada em microscópio
estereoscópio, quando da identificação antes da extração do DNA. Todas as
bandas amplificaram apenas na 2® reação de PCR.
PM 1 2 3 4 5 6 7 8
302 Db242 pb
100 pb
242 Db
Figura 3 - Eletroforese a 2% de agarose de produtos após a ampiificação da
1® Reação (Nested-PCR) de ampiificação do DNA de "pool" de flebotomíneos
coletados no Ramal Nova Esperança. PM. Peso Moiecuiar/Ladder lOOpb; 1-
controie positivo do subgênero Viannia (amostra L (\/.) guyanensis -
MHOM/BR/75/M4l47):2-control6 positivo L (L) amazonensis
(MHOM/BR/77/LTB0016): 3- controle negativo macho L umbratHis; 4 a 8 produto
da ampiificação do DNA do "pool" de L umbratilis.
3.4-Caracterízaçâo dos isolados
3.4.a Características biológicas (em cultivo e animal de laboratório)
As formas observadas em cultivo após Isolamento foram as
promastigotas. Até o momento, não foram observadas lesões cutâneas nos
locais de inóculo nos animais experimentais (hamsters). No entanto, deve-se
esperar um maior espaço de tempo para que se possa visualizar os resultados.
3.4.b Perfil de Eletroforese de Isoenzimas
As 16 amostras de protozoários isoladas em cultivo do trato digestivo dos
flebotomíneos do gênero Lutzomyia, capturados no Ramal Nova Esperança
(Tab.4), foram identificadas pela análise de isoenzimas utilizando seis sistemas
enzimáticos.
Como demonstrado na tabela 5, os 16 isolados obtidos de flebotomíneos
agruparam-se em dois únicos zimodemas (INPA-1 e INPA-2), cada um
representado por um único perfil enzimático.
Baseado nos valores obtidos para cada eletromorfo, construiu-se uma
matriz de dados com os caracteres (enzimas) e os táxons (zimodemas). A matriz
foi analisada numericamente com auxilio do programa NTSYS, utilizando-se o
coeficiente de Jaccard (Sj) e o coeficiente de concordância simples, conhecido
como coeficiente de "Simple Matching" (Ssm).
Com a utilização dos coeficientes se estabeleceu uma matriz de
similaridade entre as cepas. Esta foi transformada em um dendrograma
62
(fenograma) pelo método não ponderado de agrupamento aos pares por média
aritmética (UPGMA) [Fig. 04].
O zimodema INPA-1 agrupou nove amostras representadas por isolados
de L umbratilis (seis amostras) e L dendrophyla (três), e o INPA-2, sete
amostras, sendo uma de L dendrophyla e seis de L umbratilis. As outras
amostras são cepas de referência, Leishmania mexicana, Leishmania
guyanensis, Leishmania braziliensis, Leishmania amazonensis, Leishmania naiff,
Leishmania lainsoni, Leishmania deanei, Leishmania panamensis e
Endotrypanum schaudinni.
Os seis loci enzimáticos analisados foram polimórficos, e de acordo com a
análise numérica os isolados não apresentaram similaridade quanto ao perfil
enzimático com as cepas de referência utilizadas. No entanto, as amostras
agruparam-se dentro do gênero Leishmania, sendo o zimodema INPA-1 junto as
amostras de Leishmania do subgênero Leishmania e o zimodema INPA-2 no
subgênero Viannia.
Os resultados referentes à análise fenética dos perfis isoenzimáticos dos
isolados de flebotomíneos apresentaram correlação com o perfil biológico. A
amostra de flagelado isolada do flebótomo L. umbratilis
(IUMB/BR/2005/IM5270) não apresentava sangue no trato digestivo ao ser
dissecada e os parasitos foram detectados na região anterior, no piloro e
intestino posterior. Estas características sugerem infecção por Leishmania do
subgênero Viannia ou por parasitos do gênero Endotrypanum, que também
podem ser encontrados colonizando estes locais. No entanto, os perfis
eletroforéticos demonstraram maior similaridade com o gênero Leishmania do
que com o Endotrypanum. Da mesma forma, este isolado foi compatível com o
63
agrupamento no subgênero Viannia, sendo Incluído no zimodema INPA-2. Neste
zlmodema, foi isolada uma amostra com o mesmo perfil de L dendrophyla
(IDEN/BR/2004/IM5257) que apresentava sangue fresco. Neste grupo, esta foi a
única espécie distinta das outras que eram L umbratilis. Apesar dos isolados
serem em sua maioria de L umbratHis, seja no zimodema INPA-1 ou INPA-2,
nenhum deles apresentou perfil similar às espécies de Leishmania, comumente
encontradas ou utilizadas como cepas de referência.
64
Tabela 4- Origem e Identificação das cepas de referência de Leishmania e
Endotrypanum e 16 isolados do município de Manacapuru-AM, Brasil,
caracterizadas através do perfil de isoenzimas.
Cepa deReferência
L561 MNYC/B2762/M379 L mexicana Belice
L562 MHOM/PA/71/LS94 L panamensis Panamá, Zona do Canal
L566 MHOM/BR/75/M4147 L guyanensis Brasil, Pará
L566 MHOM/BR/00/M2903 L braziliensis Brasil, Pará
LTB0016 MHOM/BR/77/LTB0016 L amazonensis Brasil, Bahia
LI 385 MDAS/BR/79/M5533 L naiffí Brasil, Pará
LI 367 MCOE/BR/82/M1367 L lainsoni Brasil, Rondônia
LI 530 MCOE/BR/00/M5088 L deanel Brasil, Pará
E5725 MCHO/BR/79/M5725 Endotrypanum
schaudinni
Brasil, Pará
No. IsoladosINPA-16 IDEN/BR/2004/IM5254 Brasil, Amazonas
INPA-73 ÍUMB/BR/2004/IM5255 Brasil, Amazonas
INPA- 25 ÍDEN/BR/2004/IM5256 Brasil, Amazonas
INPA-108 IDEN/BR/2004/IM5257 Brasil, Amazonas
INPA-04 IDEN/BR/2a05/IM5259 Brasil, Amazonas
INPA-06 IUMB/BR/2005/IM5260 Brasil, Amazonas
INPA-12 IUMB/BR/2005/IM5261 Brasil, Amazonas
INPA-65 IUMB/BR/2005/IM5262 Brasil, Amazonas
INPA-71 IUMB/BR/2005/IM5263 Brasil, Amazonas
INPA-132 IUMB/BR/2005/IM5264 Brasil, Amazonas
INPA-134 IUMB/BR/2005/IM5265 Brasil, Amazonas
INPA-189 IUMB/BR/2005/IM5268 Brasil, Amazonas
INPA-192 IUMB/BR/2005/IM5270 Brasil, Amazonas
íNPA-193 IUMB/BR/2005/IM5271 Brasil, Amazonas
INPA-203 IUMB/BR/2005/IM5272 Brasil, Amazonas
INPA-207 IUMB/BR/2005/IM5273 Brasil, Amazonas
M:Mammaiia; CHO: Choloepus didactylus', DAS: Dasypus novemcinctus', COE:Coendou sp.; I: ínsecta; UMB: Lutzomyia umbratilis; DEN: Lutzomyia dendrophyla /país de orígem/Ano de isolamento/Código originai.
65
Tabela 5. Eletromorfos presentes em cada um dos zimodemas encontrados
nos flagelados isolados de Lutzomyia spp.
Zlmodema'
Enzimas'
Código da amostraG6PDH IDH
NAD
IDH
NADP ME MDH HK
100-6 MNY0/BZ/62/M379 2.4 0 4 5 4 3
100-21 MHOM/PA/71/LS94 4.6,8 5 2 2 2 2
100-23 MHOM/BR/75/M4147 4.6,8 5 2 3 2 3
100-28 MHOM/BR/00/M2903 5.7 5.6 1 4 2 3
100-7 IVIHOM/BR/77/LTB0016 2.4 6 4 5 4 4
IOO-36 MDAS/BR/79/M5533 3,4,6 5 2 4 2 3
100-15 MCOE/BR/82/M1367 6 3 2 2 2 3
100-16 MCOE/BR/00/M5088 2 2 2 5 3,5 3
EZ-05 MCHO/BR/79/M5725 3 1 6 A.4 3.8 6
INPA-1 IDEN/BR/2004/ÍM6254 2
IUMB/BR/2004/IM5255 2
IDEN/BR/2004/IM5256 2
IDEN/BR/2004/IM5258 2IUMB/BR/2005/IM6260 2
IUMB/BR/2005/IM5262 2IUMB/BR/2005/IM5263 2
IUMB/BR/2005/IM5264 2
IUMB/BR/2005/IM5265 2
IUMB/BR/2005/IM5261 3IDEN/BR/2004/IM5257 3
IUMB/BR/2006/IM5268 3
IUMB/BR/2005/IM6270 3IUMB/BR/2006/IM5271 3
IUMB/BR/2005/IM5272 3IUMB/BR/2005/IM5273 3
6
6
6
6
6
6
6
6
6
5
5
5
5
5
5
5
5
5
1,51,51,51,51,5
1,51,5
1,51,5
4,74.74.74.74.74.74.74.74.7
INPA-2 5
5
5
5
5
5
5
4
4
4
4
4
4
4
2.6
2.62.62.62.62,62.6
2
2
2
2
2
2
2
3.63.63.63.63.63.63.6
* Zimodemas caracterizados como 100, determinados por Cupolillo et ai (1994) e com ocódigo EZ por Franco et ai (1996). **G6PDH = glicose 6 fosfato desidrogenase; IDH =isocitrato desidrogenase; ME = enzima málica; MDH = malato desidrogenase; HK =hesoquinase; A = banda de mobilidade anódica menor do que a posição 1.
66
G6PDH IDH NAD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 34 56 7 8 9 10 11
IDH NADP ME
1 2 3 4 567 8 9 10 11 1 2 34 56 7 8 9 10 11
MDH HK
1 2 34 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 56 7 8 9 10 11
Figura 4 - Zlmograma dos padrões eletroforétícos analisados por seis
enzimas, com 9 cepas de referência e 2 grupos de parasitos isolados de
fiebddotomíneos: 1- L(L) mexicana', 2- L (L) deanei; 3- L (V) panamensis',
4- L (V) guyanensis', 5- L (V) braziliensis', 6- L (V) amazonensis', 7- L (V) naiff',
8- LW íBinsoni', 9- Endotrypanum schaudinnr, 10- INPA-1; INPA-2.
67
mrcnOí ü» cn oncnwrrr"r-
í{ *>' cfí SI3 fo - o ®
üi wi ü« üi o» oj o» otüt r" n r"N) ív) N f\> rj ro IN) row a o a<yv o>o> <J>o> <5ü>üitn =»Cfl JSkO' i\)o
Figura 5. Dendrograma obtido por análise de similaridade pelo coeficiente
de "Simple Matching" das amostras isoladas de Lutzomyia umbratilis (IM5255,
IM5260, IM5261, IM5262, IM5263, IM5264. IM5265, IM5268. IM5270, IM5271,
IM5272 e IM5273) e L dendrophyla (IM 5254, IM 5256, IM5257 e IM 5259).
68
4. DISCUSSÃO
4.1 Infecção Natural dos Flebotomíneos
Em pesquisas de Infecção natural em flebotomíneos no Estado do
Amazonas, Árias & Freitas (1977) isolaram L {V.) guyanensis de L umbratilis e
L anduzei, incriminando-as como vetores da LTA. A maior concentração de L
umbratilis foi verificada pelo método de coleta em base de árvore, de acordo
com o descrito por Young & Duncan (1994) e Cabanillas & Castellón (1999).
Em nossos estudos, realizados no Ramal Nova Esperança (Km 60), município
de Manacapuru, utilizando aspiração em base de árvore, sugerem que a
espécie mais abundante foi L umbratilis, corroborando observações realizadas
na região amazônica por Lainson et ai. (1976), Árias et aí. (1985) e Freitas et
ai. (2002).
A taxa de infecção para L umbratilis foi de 8,2% (84/1.030), de 22%
(9/41) para L dendrophyla e 1,2% (1/86) para L anduzei. Rangel et aí. (1984),
em coletas realizadas no Estado do Rio de Janeiro, verificaram um índice muito
baixo na taxa de infecção para L intermedia (0,1%). Silva & Grunewaid (1999),
no Rio Grande do Sul, após investigar 920 fêmeas de flebotomíneos de
diferentes espécies, encontraram uma taxa de infecção de 0,3%. Ready et aí.
(1985), registraram uma taxa de infecção em L umbratilis de 7% em área
periurbana da cidade de Manaus. Silveira et ai (1991), em estudos realizados
no estado do Pará, isolaram L {V.) lainsoni de L ubiquitalis com taxa de
infecção de 1,9%. No Amapá, Freitas et ai (2002) encontraram uma alta taxa
de infecção para L umbratilis, com 26,5% dos espécimes infectados. Pinheiro
(2004), trabalhando no Estado do Amazonas em área de treinamento militar
69
(BI1) e no Tarumã-Mirim, encontrou uma taxa de infecção de 1,04% para L
umbratilis. Gomes (2003), em trabalhos realizados em área de treinamento
militar, na Estrada Manaus-ltacoatiara, encontraram uma taxa de infecção em
L umbratilis de 1,9%. Pereira (2003), estudando infecção natural em L
umbratilis numa área de assentamento no Iporá, cidade de Manaus, verificou
uma taxa de infecção de 2,58%.
De 21 a 40 (+++) flagelados foram observados no tubo digestivo dos
insetos ainda em processo de digestão do sangue, não podendo assim ser
incriminado como provável transmissor de infecção na área. Também
observou-se que a concentração de flagelados no tubo digestivo dos insetos foi
baixa, verificando-se uma média de 20 (++) flagelados por campo. Pinheiro
(2004), observou em L umbratilis elevada carga parasitária (++++) com o trato
digestivo sem sangue, deduzindo que estes parasites conseguiram ultrapassar
todas as barreiras biológicas conseguindo colonizar o trato digestivo, sendo
assim, um vetor em potencial.
Observando-se os índices pluviométricos nos meses de junho e julho de
2004 (69,3mm e 119,6mm) verificou-se que não foram observadas fêmeas
infectadas. L umbratilis manteve uma alta taxa de infecção no mês de
setembro, no qual observou-se baixa precipitação. Entretanto, L dendrophyla
demonstrou uma alta taxa de infecção nos meses de abril e maio de 2005, com
diferentes níveis de precipitação.
Silveira et ai. (1991) no Pará, verificaram uma baixa taxa de infecção
em L ubiquitalis na estação seca. Ao norte do rio Amazonas, L umbratilis é
encontrada em grande quantidade na estação chuvosa (Lainson et ai., 1986).
Pinheiro (2004), em trabalhos realizados em área militar BI-1 observou que nos
70
períodos de menor precipitação ocorreu uma elevação na taxa de infecção
para L umbratilis.
O método tradicional de dissecção demonstra que nem sempre pode ser
encontrada uma grande quantidade de insetos infectados, ou talvez, a sua
carga parasitária encontra-se tão baixa, que impossibilita a observação da
infecção durante a dissecção.
Dos isolamentos feitos, detectou-se total digestão do sangue nos
flebótomos L dendrophyla (IDEN/BR/2004/1M5258) e L umbratilis
IUMB/BR/2005/IM5270. Os parasites estavam localizados na região anterior do
tubo digestivo em L dendrophyla e na região posterior em L umbratilis.
4.2. Detecção da Infecção através da técnica PCR
O maior problema da epidemiologia da leishmaniose é a identificação do
vetor e do parasito circulante. Contudo, o encontro de flebotomíneos
naturalmente infectados é essencial na identificação do vetor em estudos de
infecção da leishmaniose em áreas endêmicas.
A alta sensibilidade da técnica da PCR tem sido usada para verificar a
presença de DNA de Leishmania em flebotomíneos do Novo Mundo. Através
desta técnica é possível detectar a menor concentração de parasites
encontrados nos flebotomíneos que pode ser amplificada (Aransay et ai.,
2000). Rodriguez et ai. (1994), acreditam que o DNA purificado de pelo menos
cinco flagelados de L (V) braziliensis seja o mínimo requerido para
amplificaçâo por PCR.
71
utilizando-se experimentalmente reduzidas concentrações de DNA de
L(V.) guyanensis (0,1ng a 30ng) acrescidas a concentrações padrões de DNA
(ensaios com 50 a 200ng) de machos de fiebotomíneos, na reação de Nested-
PCR, verificou-se produto amplificado após a 1®. reação, numa concentração
de 10 ng de DNA por este método. Pinheiro (2004), obteve resuitados para
amplificação por este método nesta mesma concentração. Aransay et ai
(2000), em Atenas na Grécia, avaiiou a sensibilidade e especificidade da
técnica de Semi-nested/PCR, utilizando iniciadores (LINR4, LIN17 e LIN19) da
região de minicírcuios de kDNA detectando e identificando DNA de L (L)
infantum em fiebotomíneos naturalmente infectados, em área endêmica de
leishmaniose visceral. Com esta técnica foi possível detectar uma
concentração de 0,25ng de parasites por reação.
A detecção de infecção natural em cinco grupos de L umbratilis e um
grupo de pool de L dendrophyla, mostrou positividade apenas na 2® reação da
POR para o parasito, apresentando bandas de 242 pb, simiiares ao controie
positivo, para o subgênero Viannia. Este fato, vem corroborar com os obtidos
por Pinheiro (2004), visualizando resultados positivos na segunda reação da
POR com a reampiificação das seqüências de DNA alvo que não foram visíveis
na primeira reação.
Perez et ai (1994), em estudos de infecção natural em Lutzomyia spp.
no Peru, sugeriram que a utilização da técnica de POR em áreas com
ocorrência de ieishmaniose aumenta as chances de detectar infecção por
leishmânia em fiebotomíneos. O uso da POR para diagnóstico da leishmaniose
apresenta muitas vantagens, entre as quais, a possibilidade da precisa
72
identificação de parasites infectando o inseto vetor (De Bruijn et ai, 1992;
Eresh ef a/., 1994).
Embora a técnica de PCR não conduza ao aumento da detecção de
flebotomíneos infectados, ela permite o exame de um maior número de
flebotomíneos com considerável redução de tempo, comparada a dissecção
manual através de exame por microscópio que requer pessoal qualificado para
identificação do parasito. Usando este método é possível identificar a
Leistimania ao nível de subgênero ou de espécie, dependendo do "primer" e da
região amplificada (Miranda et al, 2002).
Este estudo apresenta resultados satisfatórios com relação a detecção
do provável(s) inseto(s) envolvido(s) na transmissão da LTA no município de
Manacapuru. Apesar da presença de sangue no trato digestivo dos espécimes
testados, verificou-se produtos de DNA parasitário do subgênero Viannia para
os "pool" testados de L umbratilis e L dendrophyla. Estas observações são
comprovadas quando analisados os parasitos isolados de flebótomos de
exemplares destas espécies pela análise de eletroforese de isoenzimas.
4.3. Perfil de Eletroforese de Isoenzimas
O presente estudo foi baseado na análise do perfil Isoenzimático de 16
amostras de parasitos isolados de L umbratilis e L dendrophyla. Verificou-se
que dois zimodemas (INPA-1 e INPA-2) estão circulando na região,
representados pelos subgêneros Leishmania e Viannia. Apesar de cerca de
85,7% das fêmeas de L umbratilis apresentarem-se infectadas por Leishmania
do subgênero Viannia, nenhum espécime foi encontrado naturalmente
73
infectado por L (\/.) guyanensis, comumente encontrado em L umbratilis.
Apesar do outro zlmodema encontrado ser do subgênero Leishmania, apenas
um exemplar de L dendrophyla não apresentava sangue no trato digestivo,
sugerindo que esta espécie funcionar como vetor da LTA na área. Como
nenhuma dessas amostras isoladas apresentaram perfil enzimático similar às
espécies utilizadas como cepas de referência, consideramos a necessidade de
outros métodos ou um maior número de enzimas a fim de determinar a espécie
que circula na região. Freitas et al. (2002) em publicação sobre a diversidade e
infecçâo natural da fauna do Amapá, encontraram 47 espécies, das quais L
umbratilis, L whitmani, L spathotríchia e L dendrophyla estavam naturalmente
infectadas com flagelados. Pelo observado, é possível o envolvimento de L
umbratilis e L dendrophyla na transmissão de Leishmania no município de
Manacapuru, apesar do flagelado envolvido ainda não ter sido identificado ao
nível de espécie. O envolvimento de L umbratilis na Amazônia tem sido
relacionado à transmissão da L (V.) guyanensis e existem suspeitas quanto ao
envolvimento de L dendrophyla na transmissão da leishmaniose no Amapá
(Freitas et ai., 2002). É bem provável que estas espécies de flebotomíneos
participem na transmissão da leishmaniose na região de Manacapuru e que
uma outra espécie ou cepa ainda não determinada (Zimodema INPA-1 ou
INPA-2?) possa estar circulando nesta localidade. Estudos mais aprofundados,
como a comprovação da capacidade vetorial, o isolamento de amostras
humanas e de outros mamíferos, assim como a descrição destes dois
zimodemas ao nível de espécie, irá dar um maior suporte ao conhecimento da
transmissão da LTA no município de Manacapuru.
74
IV. CONCLUSÕES GERAIS
> A fauna flebotomínica no município de Manacapuru apresentou-se
diversificada (índice de diversidade de 5,7). Observou-se que os dois
subgêneros predominantes foram Nyssomyia e Psychodopygus com
maior abundância de espécies. O número de machos foi inferior ao
número de fêmeas, não corroborando com resultados encontrados por
outros autores para a região Amazônica que acreditam que como o
macho emerge mais cedo alcançando a maturidade sexual mais rápido,
estes encontram-se em maior número a procura de fêmeas para o
acasalemanto, sendo assim coletados em maior quantidade.
> Quanto à estratificação vertical das espécies, Lutzomyia anduzei e
Lutzomyia umbratilis ocorreram nos dois estratos, sendo mais
abundantes a 10 metros de altura do solo onde são encontrados os
mamíferos, preguiças, que são a fonte alimentar destas espécies.
> As espécies de flebotomíneos encontradas naturalmente infectadas por
tripanosomatídeos pelo método de dissecção tradicional, no Ramal Nova
Esperança (Km 60) município de Manacapuru, foi Lutzomyia umbratilis
com taxa de infecção de 6,2% (84/1.030), Lutzomyia dendrophyla com
22% (9/41) e L anduzei com 1,2% (1/86).
75
> Quanto à correlação das taxas de Infecção com a precipitação, ocorreu
uma diferença na variação mensal das taxas de infecção natural por
tripanosomatídeos. L umbratilis manteve uma alta taxa de infecção no
mês com baixa precipitação e L dendrophyla uma alta taxa de infecção
nos meses com alta taxa de precipitação.
> Foi detectada infecção natural por Leishmania sp. nas espécies L
umbratilis e L dendrophyla capturadas no Ramal Nova Esperança,
localizado ao longo da Rodovia Manuel Urbano, município de
Manacapuru. A infecção natural foi determinada pelo método molecular
(Nested-PCR) amplificando-se as regiões de mini-exon do parasito,
demonstrando-se produtos amplificados de 242pb (característicos do
subgênero Viannia) em "pool" de flebotomíneos por grupo de L
umbratilis e L dendrophyla.
> Com base nos dendrogramas (fenogramas) construídos pelo método
UPGMA (método não ponderado de agrupamento aos pares por média
aritmética), obtidos pelas análises numéricas de coeficientes de
similaridade (Simple Matching e Jaccard) dos eletromorfos visualizados
nos géis de isoenzimas, os 16 isolados de flebotomíneos puderam ser
agrupados em dois zimodemas. O zimodema INPA-1 agrupou 9
amostras representadas por isolados de L umbratilis (6 amostras) e L
dendrophyla (03) e o INPA-2, 7 amostras, sendo 1 (uma) de L
dendrophyla e 6 de i. umbratilis. Os perfis agruparam-se com as cepas
de referência dos subgêneros Leishmania (INPA-1) e Viannia (INPA-2).
76
> Resultados referentes a análise fenética dos perfis isoenzimáticos dos
isolados de flebotomíneos, apresentaram correlação com o perfil
biológico. A amostra de flagelado isolada de um flebótomo L umbratilis
(IUMB/BR/2005/IM5270) que não apresentava sangue no trato digestivo
ao ser dissecada tendo os parasitos localizados na região anterior, no
piloro e intestino posterior do trato digestivo, agrupou-se no subgênero
Viannia pela análise de isoenzimas (zimodema INPA-2), resultado este
compatível com o dado biológico. O mesmo foi observado para a
espécie L dendrophyla (IDEN/BR/2004/IM5258) que não apresentava
sangue em seu trato digestivo e os parasitos só foram observados na
região anterior do tubo digestivo do inseto, agrupando-se no zimodema
INPA-1, representado pelo subgênero Leishmania.
> Quando analisados em conjunto os resultados biológicos, bioquímicos e
moleculares para a detecção de infecção natural por flagelados em
flebotomíneos, o que se verifica é que as espécies L umbratilis e L.
dendrophyla apresentaram infecção por Leishmania sp. causadas por
representantes dos subgêneros Viannia e Leishmania, respectivamente.
Apesar da infecção natural demonstrada nestas espécies ser por
Leishmania sp., verifica-se a possibilidade de pelo menos duas espécies
do gênero Leishmania, não similares com nenhuma das cepas padrões
utilizadas, sugerindo-se ser uma espécie nova circulando nas
localidades estudadas. É evidente que a dinâmica da infecção pela LIA
ainda não foi elucidada, mas o encontro de flagelados de ambos os
subgêneros de Leishmania circulando entre as espécies L umbratilis e
77
L dendrophyla é um passo para a busca no sentido de esclarecer qual
espécie de leishmânia está circulando entre os indivíduos humanos e os
animais.
> Apesar de ser comum o encontro de L umbratilis naturalmente infectada
por L (1/.) guyanensis na margem direita do Rio Negro, no Amazonas,
os flagelados isolados na área do município de Manacapuru (margem
esquerda do Rio Solimões) não apresentaram perfil de isoenzimas
compatível com a espécie L (\/.) guyanensis, fato que sugere realização
de futuras investigações nesta área.
78
V. REFERÊNCIAS BÍBLIOGRÀFICAS
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104
VI. ANEXOS
Anexo 1. Ficha de dissecção dos flebotomíneos
EA FLEBOTOMOS EXAMINADOS
LOCAL:
MÉTODO DE CAPTURA:DATA: / /
irrr
o
R
D
E
VI
Conteúdo
EstomacalCondições dos ovâríos EXAM Locais Parasitados
SF SD 88 AÇ1 - em desenvolvimento
+ / - AP TM EA EP INT DIV PB G8
Ident do flebõtomo
2- ovos pequenos
3- ovos grandes
+
++
+++
++++
01 à 05 p/ campo06 à 20 p/ campo21 â 40 p/ campo41 à N p/ campo
Obs: AP - Triângulo Posterior; TM - Tubo de Maípighí; EA - Estômago Anterior; INT - Intestino;
EP - Estômago Posterior; DIV - DIvertfculo; PB - Peças Bucais; GS - Glândulas sallvares
SF - Sangue fresco; SP - Sangue em Decomposição; SS - Sem Sangue; AÇ - Açúcares
105