familia corynobacteriaceae

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

ÄREA DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

FAMILIA CORYNOBACTERIACEAE.

ASIGNATURA:

BACTERIOLOGÍA.

DOCENTE:

FRANCIA ARANA, OLGA

ALUMNO:

JULON YRIGOIN WHITMAN OMAR.

2011-I7

Familia Corynobacteriacea

ÍNDICE DE CONTENIDO:

2011-I7


FAMILIA CORYNOBACTERIACEAE.

Familia que, según el Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática 2da edición, agrupa sólo al género Corynebacerium.

GÉNERO CORYNEBACTERIUM.

El género Corynebacterium, en la primera edición del Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática, era heterogéneo y hubo propuestas para dividirlo en unos cuantos géneros. Muchas de esas propuestas tienen ahora aceptación general, y en particular el patógeno aeróbico de plantas que contiene ácido 2,4-diaminobutírico en su pared celular fueron ubicados en el nuevo género Clavibacter.

El género Corynecaterium, en la segunda edición del Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática, considera que agrupa a 67 especies diferentes.

El género Corynebacterium fue creado por Lehmann y Neumann (1896) para ubicar taxonómicamente a los bacilos de la difteria. El género fue definido basándose en características morfológicas: Corynebacteria proviene del griego coroni (bastón nudoso) y bacterion (bastoncillo).

1. Características del género.

Bacilos gramnegativo, sin embargo algunas células se tiñen de manera desigual, dando la apariencia de un collar de cuentas. De morfología recta o ligeramente curvada, delgados, miden de 0.3-0.8 x 1.5-8.0 µm; una especie (C. matruchotii) tiene forma de mango de látigo. En oportunidades los bacilos delgados elipsoidale u ovoides con extremos fusiformes o en forma de clava.

Las células se disponen usualmente aisladas o en pares, a menudo en una formación de V o en empalizada o pocas se disponen células paralelas.. Otros autores refieren como disposición en “cerca” o “letras chinas”.

Gránulos metacromáticos de polimetafosfato son comúnmente formados dentro de las células

No móviles, no formadores de espora, no ácido-alcohol resistentes. Son anaerobios facultativos, comúnmente requieren medios enriquecidos como medios con suero o sangre, en los cuales las colonias son usualmente convexas y semi-opacas.

Quimiorganótrofos con metabolismo fermentativo, muchas especies producen ácido sin gas a partir de glucosa y algunos otros carbohidratos. Rara acidifica la lactosa o rafinosa o hidroliza la gelatina.

O/F de la glucosa: F(fermentativos) u O(oxidativos) o inertes.

http://es.wikipedia.org/wiki/Difteria

http://es.wikipedia.org/wiki/Bacilo

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Temperatura óptima: 35-37°C

Catalasa positivos, a excepción de C. pyogenes y C. haemolyticum algunas veces reduce nitratos. No encapsulados.

Lipasa positivos: sólo C. pseudotuberculosis y C. ulcerans.

Poseen en su pared celular ácido micólico en las células, a excepción de: C. amycolatum, C. asperum, las especies vegetales de Corynebacterium no poseen ácidos micólicos. También se encuentran peptidoglucano contiene ácido meso-diaminopimélico (meso-DAP) como el diaminoácido componente, además arabinosa y galactosa.

En membranas celulares distintos ácidos grasos celulares y menaquinonas en sus membranas celulares.

Porcentaje molar de contenido de guanosina más citosina (G+C) en el espectro de 51 a 65.

Berreau y col. y De Briel y col. demostraron que toda bacteria carente de ácido micólico no puede ser clasificada en el género Corynebacterium. Si no poseen ácido micólico pero presenta morfología del tipo de las corinebacterias son denominadas bacterias corineformes; reemplaza el término no difteroide.

Muchos de ellos constituyen parte de la flora normal de la piel y las vías respiratorias altas, membranas mucosas o la piel de mamíferos. Estas mismas especies, así como otras especies de Corynebacterium y bacterias corineformes relacionadas, han comenzado a ser reconocidas como agentes importantes de enfermedad humana, sobre todo en huéspedes imnunocomprometidos. El patógeno clásico C. diphtheriae, el agente causal de la difteria. Algunas especies son patógenas para mamíferos.

Dos sistemas que tratan la identificación de bacilos grampositivos corineformes son el API Coryne y el RapID CB Plus.

2. Especie tipo: Corynebacterium diphtheriae ATTC 27010.

Corynebacterium diphtheriae.

También es conocido como el bacilo de Klebs-Löffler, ya que fue descubierto en 1884 por el alemán bacteriólogos Edwin Klebs (1834 - 1912) y Friedrich Löffler (1852 - 1915).

Corynebacterium diphtheriae es el único patógeno humano importante dentro del grupo de las corinobacterias, que además incluye cierto número de especies oportunistas y saprófitas inofensivas, mal descritas, que con frecuencia se encuentran en la superficie de las membranas mucosas. Por su taxonomía las corinebacterias se relacionan con micobacterias y con las

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nocardias. Existen similitudes en los componentes de sus paredes celulares y presentan reactividad cruzada. Los pepetidoglucanos de los tres géneros contienen ácido meso-α, E-diaminopimélico; los azúcares principales del polisacárido de su pared son arabinosa y galactosa. Los lípidos asociados con la envoltura externa de las corinebacterias también contienen cantidades considerables de ácidos micólicos similares a los ácidos grasos saturados β-hidroxilados y α-ramificados de las micobacterias, pero poseen menos átomos de carbono.

CLASIFICACIÓN.

Según el Manual de Bergey de Bacteriología Sistemática 2da edición, ubica a Corynebacterium diphtheriae en el volumen 4: Bacterias grampositivas con alto G+C. Asignándole las siguientes categorías taxonómicas:

Phylum VIII Firmicutes

Sección XXV Actinobacterias

Clase I Actinobacteria

Subclase V Actinobacteridae

Orden V Actinomycetales

Suborden III Corynebacterineae

Familia I Corynebacteriaceae

Género I Corynebacterium

Especie tipo: Corynebacterium diphtheriae

MORFOLOGÍA.

Es un microorganismo grampositivo delgado con forma de bastón que no es ácido-resitente y no forma espora. Las células miden entre 1.5 y 5 µm de largo y de 0.5 a 1 µm de ancho. En frotis teñido aparecen en empalizadas o como células individuales que yacen en ángulos agudos unas con otras en formaciones en V y en L. Estas presentaciones similares a “letras chinas” son causadas por el movimiento “quebrado” que se produce cuando dos células se dividen. Cuando proliferan en medios de nutrición completos con velocidad máxima, los bacilos diftéricos son uniformes. En cambio, cuando proliferan en medios subóptimos, como por ejemplo suero coagulado de Löffler o medio con huevo coagulado de Pai, las células son pleomórficas y se tiñen de forma irregular con azul de metileno o con azul de toluidina. Son frecuentes las formas en cuentas y en barras, así

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como los engrosamientos en forma de palo de golf. Los gránulos metacromáticos (de Babés-Ernst) responsables del aspecto en cuentas representan cúmulos de polifosfatos polimerizados.

FISIOLOGÍA.

Características de su cultivo. C. diphtheriae es un microorganismo aerobio y anaerobio facultativo pero crece mejor en condiciones aerobias. Se requieren medio complejos para el asilamiento primario y caracterización. La mayor parte de las cepas crecen como una película cérea en la superficie de los medios líquidos. En medio con suero coagulado de Löffler, útil para el asilamiento primario del microorganismo, luego de 12 a 24 horas de incubación a 37°C aparecen diminutas colonias brillantes, de color blanco grisáceo. El medio de Löffler también es útil porque no permite el crecimiento de los estreptococos y neumococos que pueden estar presentes en la muestra clínica.

Cuando se incorporan sales de telurito a los medios utilizados para el aislamiento primario también se reduce el número de contaminantes. En el medio de telurito las colonias de C. diphtheriae adoptan un color negro o gris característico y se puede diferenciar tres tipos principales de colonias: gravis, mitis e intermedius. Las colonias de las cepas gravis son grandes y planas, de color gris a negro y con superficie opaca; los microorganismos mitis producen colonias de tamaño mediano que son más pequeñas, negras, brillantes y más convexas; las colonias de cepas intermedius son muy pequeñas y lisas o rugosos. El ion telurito atraviesa la membrana celular hacia el citoplasma, donde es reducido a telurito metálico y precipitado. No existe una relación constante entre la severidad de la enfermedad y los tres tipos de colonias.

Resistencia. C. diphtheriae es más resistente a la acción de la luz, la desecación y el congelamiento que la mayor parte de los bacilos no formadores de esporas. Los microorganismos pueden resistir por lo menos 14 semanas en fragmentos secos de seudomembranas. Sin embargo, los gérmenes son destruidos con facilidad y rapidez al ser expuestos a 100°C durante 1 minuto o a 58°c durante 10 minutos. Son susceptibles a casi todos los desinfectantes de uso habitual.

ESTRUCTURA ANTIGÉNICA.

C. diphtheriae es una especie heterogénea desde el punto de vista antigénico. En pruebas de aglutinación con suspensiones de células enteras se observa un gran número de tipos serológicos. Los tres tipos principales de colonias –gravis, mitis e intermedius- (otros autores consideran un cuarto biotipo belfanti, aunque otros lo consideran una cepa dentro del biotipo mitis) reflejan diferencias en la superficie celular y constituyen los principales biotipos del microorganismo. Dentro de cada uno de estos biotipos se encuentra un grupo más o menos separado de serotipos aglutinantes. También se han detectado diferencias adicionales en los componentes de la superficie celular por medio de pruebas más sensibles de tipificación con bacteriófagos y producción de bacteriocina. No obstante, y sin importar el tipo, todas las cepas toxigénicas producen una toxina que es idéntica desde los puntos de vista biológico e inmunológico.

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Antígeno K. Los antígenos responsables de la especificidad de tipo de las cepas de C.diphtheriae son proteínas termolábiles, los antígenos K, localizados en las capas superficiales de la pared. Estos antígenos desempeñan un papel importante en la inmunidad antibacteriana y en la hipersensibilidad, aparte de la inmunidad antitóxica. Es probable que la aparición de tipos antigénicos diferentes de C.diphtheriae explique el desarrollo de difteria en pacientes inmunizados que presentan un nivel detectable de antitoxina circulante. Los antígenos K localizados sobre la superficie, junto con el factor cordón glicolipídico, son los principales determinantes de la invasividad y la virulencia de los bacilos diftéricos.

Antígeno O. El antígeno O termoestable de C. diphtheriae es un antígeno de grupo común a las corinebacterias parásitas del ser humano y de los animales. Se trata de un polisacárido que contiene arabinogalactanos y es el antígeno responsable de la reactividad cruzada con micobacterias y nocardias. Las células de las corinebacterias y todos sus componentes subcelulares son antígenos excelentes. Cuando se las administra a los animales con agentes inmunizantes, también actúan como adyuvantes.

DETERMINANTES DE LA PATOGENICIDAD

Invasividad. Dado que tanto cepas toxigénicas como no toxigénicas de C. diphtheriae son capaces de colonizar las membranas mucosas, otros factores además de la toxina contribuyen a la invasividad del microorganismo y a su habilidad para establecerse y mantenerse en el huésped humano. Sin embargo, no se ha definido con precisión la relación entre los rasgos mencionados y la patogenia de la enfermedad. Además de los antígenos K, los microorganismos también contienen un factor cordón que se considera un adyuvante necesario de virulencia. El factor cordón, un glicolípido tóxico, es un 6-6’ diéster de trehalosa que contiene los ácidos micólicos característicos de C.diphtheriae, ácido corinemicólico (C32H62O3) y ácido corinemicolénico (C32H64O3). La actividad farmacológica del factor cordón de C.diphtheriae es similar a la del factor cordón de Mycobacterium tuberculosis. En el ratón provoca la ruptura de las mitocondrias, disminución de la respiración y de la fosforilación, y la muerte.

Otros factores adicionales que probablemente contribuyan al potencial invasor de C.diphtheriaeson la neuraminidasa y la N-acetilneuraminato liasa. Por degradación de los residuos de ácido N-acetilneuramínico clivados de su envoltura mucinosa estas enzimas podrían proporcionar una fuente de energía fácilmente accesible para las bacterias que colonizan las membranas mucosas.

Exotoxina. La mayor parte de las enfermedades que ocurren naturalmente son demasiado complejas a nivel celular como para analizar con éxito y definir con precisión la lesión bioquímica primaria. No obstante, en la difteria la exotoxina producida por C.diphtheriae es el principal determiante bioquímico de la patogenia de la infección y explica casi todos los efectos patológicos sistémicos.

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LISOGENIA Y PRODUCCIÓN DE TOXINA. La toxina sólo es elaborada por cepas de C.diphtheriae infectadas con un bacteriófago temperado que transporta el gen estructural para la producción de toxina. Las cepas no toxigénicas pueden convertirse al estado lisógeno productor de toxina, por infección con un corinebacteriofago tox+ adecuado. Sin embargo, la conversión en toxigénicos no es una propiedad obligatoria de los corinebateriófagos. A pesar de que la mayor parte de los estudios acerca de la producción de toxina se han llevado a cabo con un corinebacteriófago β, el gen tox se ha detectado en cierto número de corinebacteriófagos que difieren tanto en su genética como en su serología.

La producción de toxina por una cepa lisogénica no requiere la multiplicación lítica del fago. El gen tox puede expresarse cuando el corinebacteriofago β se halla presente en C.diphtheriae como un fago en replicación vegetativa, como un profago o como un exogenote sobreinfeccioso que no se replica en las células lisogénicas inmunes. En condiciones experimentales la toxina no parece servir para funciones vitales virales esenciales. Sin embargo, en condiciones naturales tales como la nasofaringe humana el gen tox proporciona valor de supervivencia tanto al fago como a su huésped lisogenizado, C.diphtheriae.

El ciclo vital del corinebacteriófago β es similar al del colifago λ, que crece de forma productiva en la mayor parte de las células infectadas pero lisogeniza a pocas de ellas. Los fagos mutantes que producen proteínas antigénicamente similares pero no tóxicas (proteínas crm), se han utilizado para construir un mapa de los genomas vegetativos y profagos del fago β. El mapa del profago parece ser una permutación clínica del mapa vegetativo, con el gen tox en un extremo del mapa del profago cerca del sitio de inserción en el cromosoma del huésped y el gen de la inmunidad en el otro extremo del mapa. El fago se inserta en el cromosoma bacteriano por un mecanismo similar al que se observa en el colifago λ. La posición del gen tox integrado sugiere que puede haber evolucionado a partir de un gen bacteriano.

REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DEL GEN tox. La regulación de la síntesis de la toxina diftérica abarca factores genéticos y fisiológicos e involucra a la bacteria y el bacteriófago. Las distintas cepas de C. diphtheriae presentan enormes variaciones en lo que respecta a su capacidad para producir toxinas cuando se hallan infectadas pro corinebacteriófagos tox+ específicos. Además, algunos fagos pueden ser no toxigénicos para algunas de las cepas huésped pero ser tox+ para otras C. diphtheriae. El corinebacteriófago λ, un fago no conversor relacionado estrechamente con el fago β, transporta el gen tox en una forma inactiva. En el fago λ se encuentra un genoma de fago completo más una pequeña asa adyacente de DNA bacteriano. Es probable que este DNA adicional represente un elemento de inserción o un transposón y que el gen tox del fago λ haya sido inactivado por su inserción.

La producción de toxina es muy influida por las condiciones de crecimiento, en especial por el contenido de hierro inorgánico del medio. La toxina diftérica sólo se produce en niveles máximos durante la fase de declinación del ciclo de crecimiento bacteriano, cuando el hierro es el sustrato limitante de la velocidad. El agregado de hierro a cultivos de C. diphtheriae lisogénica carentes de

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ese elemento inhibe la producción de toxina casi de inmediato. El empleo exitoso durante muchos años de la cepa Park-Williams N° 8 para la producción comercial de toxina se vincula por su capacidad de crecimiento en medios que contienen niveles muy bajos de hierro. En tales condiciones el crecimiento es lento pero la toxina puede representar casi el 5 % del total de proteína bacteriana.

A nivel molecular la regulación de la producción de toxina diftérica tiene lugar de forma independiente de otras funciones del fago y está dirigida al nivel de la transcripción. De acuerdo con el modelo propuesto, C. diphtheriae, independientemente de su estado lisogénico, transporta un gen que codifica la síntesis del aporrepresor tox diftérico. En presencia de hierro se forma un complejo represor-hierro que se une específicamente al locus operador tox del fago β. En condiciones de limitación del hierro el complejo represor-hierro se disocia y el gen tox diftérico se desreprime. Hasta el momento nada se sabe en relación con la identidad y la función de la proteína represora del huésped.

PROPIEDADES. La toxina diftérica se sintetiza como precursor en los polisomas ligados a la membrana C. diphtheriae y se secreta contraduccionalmente como una cadena polipeptídica simple con un peso molecular de 58kDa. Una vez liberada la molécula de toxina nativa no es tóxica hasta la exposición de los sitios enzimáticos activos por efecto de un tratamiento leve con tripsina. La molécula con actividad biológica está formada por dos cadenas polipeptídicas con funciones diferentes, los fragmentos A y B, unidos por un puente de disulfuro. Ambos fragmentos son esenciales para la citotoxicidad. La porción aminoterminal de la toxina, el fragmento A (21kDa), contiene el sitio enzimático activo de la toxina. El fragmento B (37kDa) del extremo caborxiterminal de la toxina, contiene el dominio de unión a los receptores de las células eucarióticas, así como también dos dominios de asociación lipídica que en apariencia son esenciales para la translocación del fragmento A a través de la membrana hacia el citosol de la célula eucariótica.

INCORPORACIÓN POR LAS CÉLULAS EUCARIÓTICAS. Para expresar la toxicidad debe atravesar la barrera de la membrana y alcanzar su blanco en el citoplasma. A pesar de una profunda investigación sobre el mecanismo de entrada de la toxina diftérica a la célula, el proceso aún no se comprende en su totalidad. No se han identificado el receptor específico de membrana, si bien los datos actuales indican que la unión de la toxina se encuentra involucrados tanto el esqueleto peptídco de una glicoproteína como fofoslípidos de membrana. Existe una hipótesis que sostiene que la toxina es internalizada por un proceso de endocitosis mediado por un receptor y penetra en una vesícula endocítica ácida, donde estimulado por el bajo pH se produce el escape hacia el citoplasma. De acuerdo con este modelo, en apariencia es necesario el transporte de aniones para la entrada del fragmento A en el citoplasma, lo que sucede a través de canales permeables a iones formados por inserción del dominio hidrófobo del fragmento B en la membrana. En algún punto, antes de la translocación o en su transcurso, se requiere la reducción del puente de disulfuro y el clivaje de una o más uniones peptídicas para la separación de los fragmentos A y B.

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MODO DE ACCIÓN. Al llegar al citoplasma el fragmento A altera la síntesis proteica catalizando la transferencia de la fracción adenosina difosforribosa (ADPR) del dinucleótido de nicotinamida-adenina (NAD) hacia la peptidil-tRNA-translocasa eucariótica, el factor de elongación 2 (EF2). Esta difosfato de adenosina (ADP)-ribosilación del EF2 es el blanco primario de la toxina diftérica.

NAD + EF2 ADPR-EF2 + nicotinamida + H+

A pesar de que la reacción es reversible, su equilibrio a pH fisiológico está desplazado hacia la derecha. Solamente el EF-2 soluble puede servir como sustrato y una vez fijado a los ribosomas no puede ser ADP-ribosilado.

El sitos específico de EF2 al cual se une la ADPR de forma covalente es la diftamida, un aminoácido exclusivo que resulta de una modificación postraduccional reciente de un residuo de histidina. La diftamida no ha sido observada en ninguna otra proteína eucariótica. La toxina no tiene efecto sobre la elongación de la cadena polipeptídica en sistemas procarióticos o en mitocondrias, en las cuales una proteína diferente, el factor de elongación G (EFG), reemplaza al EF2.

Si bien ha sido universalmente aceptado que el mecanismo letal de la toxina diftérica tiene estrecha vinculación con su capacidad para inhibir la síntesis proteica, también podrías estar implicado un segundo camino citotóxico. Al ser expuestas a la toxina diftérica las células blanco humanas muestran ampollas generalizadas a lo largo de toda la membrana y un extenso clivaje prelítico del DNA entre los nucleosomas. El descubrimiento de esta actividad de nucleasa sugiere que la lisis de las células inducida por la toxina diftérica no es sólo consecuencia de la inhibición proteica, sino que también se vincula con la degradación cromosómica.

SUSCEPTIBILIDAD DEL HUÉSPED. La susceptibilidad de los animales a la toxina diftérica es muy variable. Dosis de apenas 160ng/kg de peso corporal son letales para el hombre, los conejos, los coballos y las aves. Las ratas y los ratones, en cambio, son muy resistente, salvo que la toxina se les administre por vía intracerebral.

ANTITOXINA. Las fracciones A y B de la toxina contienen cierto número de determiantens antigénicos. Como consecuencia de ello, la antitoxina consiste en una mezcla heterogénea de anticuerpos específicos para diferentes dominios de la molécula de toxina. En la toxina o el toxoide nativos la mayor parte de los determinantes antigénicos del fragmento A están sumergidos profundamente y no se encuentran disponibles para estimular la producción de anticuerpos, ni tampoco para participar en la precipitación de éstos. Además, y a pesar de que el anticuerpo anti-A inhibe la actividad enzimática de la toxina, no protege a los animales o alas células contra la acción letal de la toxina. No obstante, los anticuerpos dirigidos contra el fragmento B neutralizan la toxina de forma muy eficaz, lo que sustenta la teoría que postula que la antitoxina actúa por competencia con la toxina por los receptores de su superficie de las células eucarióticas sensibles y que el fragmento B es necesario para la adherencia inicial.

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Recientemente se ha logrado la inmunización activa contra la toxina diftérica mediante la utilización de un oligopéptido sintético. El antígeno sintético es un tetradecapéptido que consiste en un asa de 14 aminoácidos subtendidos por el puente disulfuro más cercano al extremo N-terminal de la molécula. Este tetradecapéptido cuando está unido de forma covalente con un transportador, induce en los cobayos anticuerpos que no sólo se unen de forma específica con la toxina sino que además neutralizan sus efectos dermonecróticos y letales. Esto representa el primer ejemplo de inmunización activa exitosa contra una toxina bacteriana letal mediante el empleo de un antígeno sintético.

TOXOIDE. El agregado de bajas concentraciones de formaldehido a la toxina diftérica destruye su toxicidad y la convierte en toxoide. La destoxificación por formaldehido altera tanto la actividad enzimática del fragmento A como las propiedades de unión del fragmento B a las células. Las alteraciones pueden ser atribuibles a la modificación química de residuos esenciales en la toxina o a la unión intramolecular cruzada entre lisina y tirosina por medio de puentes de metileno. La mayor estabilidad y resistencia a la proteólisis del toxoide se atribuye a los efectos de las uniones cruzadas. El toxoide no puede ser clivados en fragmentos A y B. No posee actividad ADP-ribosilante y no se une a las membranas de las células.

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIOS.

CULTIVOS. Para el diagnóstico microbiológico de la difteria se requiere el asilamiento del microorganismo. Dado que es fundamental al administración temprana de la antitoxina. La faringitis estreptococócica y la infección de Vincent pueden ser confundidas con la difteria y siempre deben ser consideradas cuando se realiza el diagnóstico de laboratorio. Los hispados faríngeos y de las fauces se pueden inocular en un tubo pico de flauta con medio de Löffler o de Pai, una placa con telurito o una placa con agar sangre.

No se recomienda intentar identificar C. diphtheriae en frotis directos de muestras clínicas. Los tubos pico de flauta con medio de Löffler deben ser examinados después de 16 a 24 horas por tinción con azul de metileno para buscar las formas pleomórficas típicas. Las placas con agar sangre deben ser examinadas en busca de estreptococos β-hemolíticos y cualquier colonia grisácea o negra característica en medios con telurito. Se pueden transferir a tubos inclinados con medio de Löffler. Pueden llevarse a cabo reacciones bioquímicas de confirmación de y la patogenicidad de los microorganismos asilados en medio de Löffler, puede ser estudiada con la prueba de virulencia, in vivo o con la técnica de inmunodifusión in vitro.

PRUEBA IN VIVO. Para los laboratorios que rara vez aíslan C. diphtheriae se aconseja la inoculación en animales. Pueden utilizarse conejos o cobayos y un solo animal es suficiente para la prueba y como control de inoculaciones. La prueba se lleva a cabo inyectando por vía intradérmica, en un animal rasurado 0.2 ml de una infusión de caldo de cultivo de 48 horas del microorganismo en estudio. Después de cinco horas se inyectan 500 unidades de antitoxina diftérica por vía

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intraperitoneal en el cobayo (o en la vena de la oreja del conejo) y transcurridos 30 minutos una segunda muestra de 0.2 ml de caldo se inyecta por vía intradérmica en el área control opuesta al sitio de prueba. En el sitio control sólo se desarrolla un nódulo de coloración rosada que no presenta ulceración posterior debido a la administración previa de antitoxina.

La prueba de difusión en gel para la determinación de la patogenicidad es más rápida que el método in vivo, pero a menos que las placas hayan sido preparadas con sumo cuidado pueden obtenerse resultado falso-negativo. En esta prueba se colocan tiras de papel de filtro embebidas en antitoxina sobre la superficie de un medio con agar-suero y se inocula masivamente la placa por inyección de una línea de inóculo perpendicular a la tira. Las placas deben leerse a diario durante tres días. Si el microorganismo es toxigénico aparece un línea blanca de un precipitado toxina-antitoxina, que se extiende en un ángulo de 45°C desde la intersección entre la línea del inóculo y el frente de antitoxina que difunde desde el papel filtro.

Otros métodos muy similares es el procedimiento de Elek modificado, un método de inmunodifusión. La prueba utiliza agar KL Virulence, un agar con base de proteosa peptona, con suplemento de suero estéril de conejo y con telurito de potasio al 0.03%. este medio se vierte en una placa de petri estéril de 150 mm. Antes de que medio se solidifique, se sumerge una tira de 1 cm x 8 cm de papel de filtro saturado con antitoxina diftérica en el medio se lo orienta cruzando el diámetro de la placa. Después del enfriado, se realiza una estría perpendicular con la cepa por evaluar para la producción de toxina en la tirita de antitoxina sumergida. Equidistante de uno de los lados de esta estría, también se siembra otra estría con un cepa toxigénica conocida de C. diphtheriae de control. Luego se incuba la placa a 35°C y se la examina cada 24 horas durante 3 días. Si la cepa desconocida es toxigénica, se forma líneas de precipitina en ángulos de 45° entre el inóculo y la tira de antitoxina. Estas líneas serán idénticas a la cepa toxigénica conocida de C. diphtheriae control.

También se han creado otros métodos, que incluye inmunoanálisis enzimático y pruebas de aglutinación de látex pasivas inversas para la detección de producción de toxina por C. diphtheria. El EIA rápido desarrollado por Engler y Efstratiou utilizó antitoxina policlonal equina como anticuerpo de captura, y un anticuerpo monoclonal marcado con fosfatasa alcalina dirigido contra el fragmento A de la toxina diftérica como anticuerpo de detección.

También se han implementado métodos moleculares para la detección de producción de toxina por C. diphtheriae. La mayoría de los métodos de PCR han sido dirigidos al gen tox.

VARIEDADES O BIOTIPOS

C. diphtheriae puede aparecer como tres o cuatro tipos (biotipos) de colonias distintas designadas gravis, mitis, intermedius y algunos autores la cuarta variedad belfanti. Estos biotipos también difieren significativamente en la morfología de la coloración de Gram, algunas reacciones bioquímicas y, desde el punto de vista histórico, en la gravedad de los procesos patológicos que producen. Las cepas de C. diphtheriae biotipo gravis y las cepas biotipo mitis producen colonias

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convexas bastante grandes (1-2 mm de diámetro a las 24 horas), colonias convexas con bordes lisios, mientras que las cepas biotipo intermedius producen colinas pequeñas (<1 mm a las 24 horas), más negras y más densas en agar que contiene telurito. La mayoría de las cepas mitis y algunas cepas gravis son débilmente β-hemolíticos en SBA (agar sangre de carnero). Los cuatro biotipos crecen como colinas negras rodeadas por halos pardos en medio de Tinsdale modificado y todos forman colonias blanco grisáceas, lisas y no hemolíticas en SBA. Todos lso biotipos carecen de actividad de pirazinamidasa, no producen fosfatasa alcalina y no hidrolizan escualina ni urea. Se produce ácido a partir de glucosa y maltosa, pero no de sacarosa, manitol o xilosa; se han comunicado raras cepas que fermentan la sacarosa.

OTRAS CORINEBACTERIAS

Corynebacterium pseudotuberculosis. Con la excepción de C. diphtheriae, Corynebacterium pseudotuberculosis es la única especie que produce una exotoxina. Sin embargo, esta exotoxina es diferente desde el punto de vista antigénico de la de C. diphtheriae. Estrechamente relacionada con C. diphtheriae, C. pseudotuberculosis es susceptible a algunos de los bacteriófagos utilizados en la tipificación del bacilo de la difteria y , cuando se lisogeniza con un fago tox+, sintetiza toxina diftérica. C. pseudotuberculosis causa linfarigitis ulcerosa y abcesos en ovejas, caballos, ganado y otros animales de sangre caliente. Las infecciones en el hombre se caracterizan por ocurrir como una linfadenitis aguda o crónica y perecen tener su origen en el contacto con animales infectados.

Corynebacterium pseudodiphtheriticum y Corynebacterium xerosis. Son las dos especies cultivadas con mayor frecuencia de materiales clínicos. C. pseudodiphtheriticum se encuentra en la nasofaringe del hombre. Es un bacilo corto y bastante uniforme que se tiñe de forma pareja excepto por un tabique transversal en la parte media que queda sin teñir. Los gránulos metacromáticos y las formas en palo de golf por lo general están ausentes. C. xerosis vive en la piel y en las membranas mucosas humanas, en particular en las conjuntivas. Las infecciones por estos gérmenes se dan sobre todo en pacientes inmuncomprometidos o en aquellos con defectos mucocutáneos que facilitan la bacteriemia. La endocarditis de válvulas protésicas es una de las infecciones de mayor prevalencia atribuidas a esta especie.

Corynebacterium bovis. La posición taxonómica de C. bovis es incierta, a pesar de lo cual en la actualidad continúa en el género Corynebacterium. Es un microorganismo lipófilo que requiere la presencia de ácidos grasos insaturados de cadena larga. C. bovis es un comensal en la ubre bovina y puede ser causa de mastitis en las vacas. Se han comunicado diversas infecciones humanas generadas por este microorganismo, pero aún no se ha documentado su relación con la fuente animal. Se trata de la especie de Corynebacterium que con mayor frecuencia asocia con “nefritis de shunt” del SNC.

Corynebacterium minutissimum. Es el microorganismo responsable del eritrasma, una enfermedad que aparece en las áreas intertriginosas y que se caracteriza por la presencia de

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placas escamosas que dan una fluorescencia de color rojo coral bajo luz de Wood a 364 nm. C. minutissimum es un microorganismo exigente nutricionalmente. Cuando crece en anaerobiosis en un medio sólido que contiene una base de medio de cultivo tisular y 20% de suero fetal bovino, produce una fluorescencia rojo coral a anaranjada, similar a la de las lesiones de la piel. Las colonia que crecen en agar-sangre no producen esta fluorescencia característica.

Corynebacterium haemoliticum (Arcanobacterium haemoliticum). Es distinta de todas las demás especies de Corynebacterium y Actinomyces y ha sido reclasificada en un nuevo género, Arcanobacterium. Es un bacilo grampositivo corto e irregular, pero después de 18 horas de proliferación en una placa de agar-sangre los microorganismos se convierten en granulares y se asemejan a cocos pequeños e irregulares. En medio de Löffler permanecen como formas bacilares y son pleomórficos a las 48 horas. C. haemoliticum está presente sobre la piel y en la nasofaringe de las personas sanas, aunque también puede ser el agente etiológico de una faringitis aguda similar a la producida por estreptococos del grupo A. A diferencia de la faringitis estreptococócica, la infección por C. haemoliticum afecta sobre todo a adolescentes y adultos jóvenes y en un 50% de los casos se observa una erupción escarlatiniforme. Aún se desconoce la causa de esa erupción, pero se supone que su mecanismo operativo es semejante al de C. diphtheriae.

Corynebacterium pyogenes (Arcanobacterium pyogenes). Es una anaerobio aerotolerante similar desde el punto de vista bioquímico a C. haemoliticum, con la diferencia de que es hemolítico y proteolítico. Produce una amplia variedad de infecciones piógenas en cierto número de animales domésticos, pero informes acerca de infecciones humanas no han sido bien documentados.

Corynebacterium equi (Rhodococcus equi). Es un microorganismo nocardiforme aerobio grampositivo que presenta un ciclo morfogenético de coco-bacilo. Se encuentra en el suelo y en el estiércol de los herbívoros y es el agente causal de diversas zoonosis importantes, incluida la bronconeumonía equina. Se ha informado cierto número de infecciones humanas en adultos jóvenes inmunocomprometidos, con severos transtornos de la inmunidad celular y con antecedentes de exposición a animales. En esos pacientes la enfermedad presenta un curso subagudo y la neumonía necrotizante producida por C. equi se asemeja a la infección por micobacterias y por nocardias.

A continuación una lista de otros ejemplos de especies del género Corynebacterium:

Corynebacterium amycolatum.

C. afermentans

C. accolens

C. appendicis

C. argentoratense

C. atypicum

C. aurimucosum

C. auris

C. confusum

C. coryleae

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C. callunae

C. cystitidis

C. durum

C. falsenii

C. freneyi

C. flavescens

C. glutamicum

C. glucuronolyticum

C. jeikeium

C. kutscheri

C. kutscheri

C. matruchotii

C. mycetoides

C. pilosum

C. renale

C. striatum

C. vitarumen

C. aquaticum

C. ulcerans

C. serosus

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BIBLIOGRAFIA:

BERGEY’S MANUAL OF DETERMINATIVE BACTERIOLOGY. 1994. 9th edition.

FRANCIA. O. 2011. Manual de prácticas de Bacteriología-UNPRG. Lambayeque-Perú.

MACFADDIN, R. 2003. Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. 3era edición. Ed. Médica Panamericana. Buenos Aires. Argentina.

MANDIGAN, M.; MARTINKO, J. y PARKER, J. 2008. Brock Microbiología de los Microorganismos. 10ma edición. Editorial Pearson-Petice Hall. Madrid. España.

WINN, J. et al. 2008. Koneman Diagnóstico Microbiológico. 6ta edición. Ed. Médica Panamericana. Buenos Aires. Argentina.

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ANEXOS:

Anexo 1: Coloración Gram para Corynebacterium diphtheriae.

Anexo 2: Coloración Gram para Corynebacterium diphtheriae. Donde se observa el pleomorfismo en este caso “club shape” (“forma de maso”).

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Anexo 3: Suero coagulado de Löffler por Corynebacterium diphtheriae.

Anexo 4: Corynebacterium diphtheriae en Agar Columbia con 5% de sangre de carnero citratada. Cultivo de 24 horas, 37°C en una atmósfera enriquecida con 5% de dióxido de carbono

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Anexo 5: Corynebacterium diphtheriae gravis en Agar Columbia con 5% de sangre de carnero citratada. Cultivo de 24 horas, 37°C en una atmósfera enriquecida con 5% de dióxido de carbono.

Algunas cepas pueden crecer en agar sangre con β-hemólisis.

Anexo 6: Diagrama de la toxina diftérica y sus fragmentos. La toxina es liberada al medio de cultivo como una cadena polipeptídica única. La molécula intacta contiene dos puentes disulfuro. El asa peptídica contenida dentro del primer puente disulfuro es muy sensible al clivaje proteolítico y se abre luego de la digestión suave con tripsina. La reducción posterior del enlace disulfuro produce una división de la toxina en fragmentos A y B.

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Anexo 7: acción de la toxina diftérica de Corynebacterium dphtheriae. (a) El factor 2 de elongación (EF-2), normalmente se une al ribosoma y transporta al aminoácido en el t-ARN al ribosoma, provocando la elongación de la proteína. (b) La toxina diftérica se une a la membrana, donde es hidrilizada, y el fragmento A es internalizado. El péptido A cataliza la ADP-ribosilación del factor 2 de elongación (EF-2’). El factor modificado no ayuda a la extensión de la cadena polipeptídica, como resultado se interrumpe la síntesis proteica y la célula muere.

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Anexo 8: Corynebacterium diphtheriae cultivada en Agar Tinsdale (TIN). El cual es usado para el aislamiento primario e identificación de Corynebacterium diphtheriae. contiene L-cisteína y tiosulfato sódico que son indicadores de H2S. Telurito de potasio es el agente selectivo (inhibe muchos de la flora normal de vías respiratorias superiors) que cambia el medio marrón-negro como resultado de la reducción del telurito de potasio a telurito metálico.

Cultivo de 24 horas, 37°C en una atmósfera aeróbico (la atmósfera enriquecida con dióxido de carbono puede inhibir su crecimiento)

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Anexo 9: Corynebacterium diphtheriae cultivada en Agar Tinsdale (TIN).

Cultivo de 72 horas, 37°C en una atmósfera aeróbico. El halo oscuro se intensifica si continúa en incubación.

Anexo 10: diferenciación de las especies de Corynebacterium que pueden causar infecciones en los seres humanos, Erypelothrix rhusiopathiae y Listeria monocytogenes. Según MacFaddin.

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Anexo 11: Comportamiento diferencial de las especies de Corynebacterium. Según Francia O.

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Anexo 12: Características morfológicas de las colonias de Corynebacterium. Según Francia O.

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Anexo 13: Algoritmo para la identificación de Corynebacterium diphtheriae. Según Winn et al.

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familia corynobacteriaceae

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