facultad de medicina y odontología - core.ac.uk · el amor por los niños, que son la base de mi...

Facultad de Medicina y Odontología

Departamento de Pediatría, Obstetricia y Ginecología

Capacidad protectora de la leche materna

frente a las infecciones por norovirus

Tesis Doctoral presentada por:

Parisá Khodayar Pardo

(Lda. Medicina. F. E. Pediatría)

Dirigida por:

Profa. Cecilia Martínez Costa

Prof. Javier Buesa Gómez

290E PEDIATRÍA

Valencia 2012

Dña. Cecilia Martínez Costa, Doctora en Medicina por la Universidad de Valencia y Profesora

Titular del Departamento de Pediatría, Obstetrica y Ginecología de la Facultad de Medicina de la

Universidad de Valencia.

D. Javier Buesa Gómez, Doctor en Medicina por la Universidad de Valencia y Catedrático de

Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Valencia.

CERTIFICAMOS:

Que el trabajo titulado “Capacidad protectora de la leche materna frente a las infecciones por

norovirus” ha sido realizado íntegramente por Dña. Parisá Khodayar Pardo bajo nuestra supervisión.

Dicho trabajo está concluido y, en nuestro criterio, reúne todos los méritos necesarios para optar al

Grado de Doctor por la Universidad de Valencia.

Y para que así conste a los efectos oportunos, firmamos la presente certificación en Valencia a 24 de

abril de 2012.

Fdo. Profa. Cecilia Martínez Costa Fdo. Prof. Javier Buesa Gómez

A mi familia, pues son lo que más quiero, lo único imprescindible para mí.

A mis padres, Isabel y Jahangir, mi referencia en todos los aspectos de la vida.

Gracias por haberme enseñado el respeto a la diversidad del ser humano y

el amor por los niños, que son la base de mi profesión.

A mi hermana Sami y a mi cuñado Paco por su fortaleza y generosidad.

A mi hermano Víctor por su madurez y nobleza.

AGRADECIMIENTOS

A la Profa. Martínez Costa, mi maestra y amiga, de la que admiro el conocimiento profundo que

tiene de su especialidad y la enorme dedicación a sus pacientes. Gracias por creer en mí y apoyarme

siempre. Gracias por permitirme aprender de Gastroenterología y Nutrición Pediátrica y darme la

oportunidad de realizar esta Tesis Doctoral que es parte de mi realización personal.

Al Prof. Javier Buesa, al que considero un profesional de excelencia, he de agradecer el

haberme integrado en su laboratorio y ayudado a desarrollar una nueva faceta como Médico: la

investigación.

Al Prof. Brines, al que conozco desde hace 11 años, como estudiante, alumna interna, residente

y Pediatra. Gracias por la sinceridad de sus consejos, por su generosidad al compartir su experiencia

con los más jóvenes y por orientarme sabiamente a comprender la Pediatría.

A mis compañeros del Hospital Clínico con los que comparto tantas horas y vivencias

diferentes. Gracias porque con ellos he aprendido mucho más que Pediatría en mis años de trabajo.

A las enfermeras de la Cocina Dietética por haber colaborado en la recogida de las muestras y

datos clínicos.

A mis compañeros de laboratorio por su compañía en las largas horas que he pasado allí.

Al Prof. Francisco Núñez, compañero Pediatra del Hospital Clínico, y al Prof. José Bermúdez,

de la Facultad de Matemáticas, por ayudarme con amabilidad en el tratamiento estadístico de los

resultados.

A todas las madres participantes por haber entendido el interés de esta investigación. Y, muy

especialmente, a todos los niños que he tratado estos años pues siempre han sido capaces de hacerme

sonreir en los momentos más difíciles y porque son la única razón para continuar con mi esfuerzo

diario.

ÍNDICE.

______________________________________________________________________

I

ÍNDICE

ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................. 1

ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................... 5

ÍNDICE DE ABREVIATURAS ................................................................................................. 8

INTRODUCCIÓN

1. LA DIARREA AGUDA EN LA INFANCIA

1.1. EPIDEMIOLOGÍA

1.1.1. Impacto de la diarrea aguda en la infancia ........................................................................ 11

1.1.2. Agentes etiológicos principales ......................................................................................... 11

1.1.3. Morbilidad ......................................................................................................................... 13

1.1.4. Mortalidad ......................................................................................................................... 15

1.1.5. Factores de riesgo .............................................................................................................. 17

1.2. PATOGENIA Y FISIOPATOLOGÍA

1.2.1. Fisiología del transporte intestinal .................................................................................... 18

1.2.2. Tipos de diarrea aguda ...................................................................................................... 18

1.3. MANIFESTACIONES CLÍNICAS

1.3.1. Diferencias geográficas ..................................................................................................... 20

1.3.2. Características del huésped ............................................................................................... 21

1.3.3. Características del patógeno infectante ............................................................................. 21

1.4. TRATAMIENTO

1.4.1. Rehidratación oral ............................................................................................................. 22

1.4.2. Realimentación precoz ...................................................................................................... 24

1.4.3. Otros tratamientos ............................................................................................................. 25

1.4.4. Micronutrientes ................................................................................................................. 27

2. PRINCIPALES VIRUS ENTÉRICOS

2.1. ROTAVIRUS ...................................................................................................................... 28

2.2. CALICIVIRUS ................................................................................................................... 29

2.3. ASTROVIRUS .................................................................................................................... 31

ÍNDICE.

______________________________________________________________________

II

2.4. ADENOVIRUS ENTÉRICOS .......................................................................................... 32

2.5. OTROS VIRUS ENTÉRICOS .......................................................................................... 33

3. CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS

3.1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS ................................................................................... 34

3.2. TAXONOMÍA .................................................................................................................... 35

3.3. ESTRUCTURA

3.3.1. Estructura tridimensional del virión nativo ....................................................................... 36

3.3.1.1. Estructura del genoma .................................................................................................... 36

3.3.1.2. Proteínas virales estructurales ........................................................................................ 37

3.3.1.3. Proteínas virales no estructurales ................................................................................... 38

3.3.2. Estructura de las partículas pseudovíricas ......................................................................... 40

3.4. BIOLOGÍA DEL VIRUS

3.4.1. Cultivos celulares .............................................................................................................. 41

3.4.2. Modelos animales .............................................................................................................. 42

3.4.3. Avances moleculares ......................................................................................................... 43

3.4.3.1. Clonación del genoma .................................................................................................... 43

3.4.3.2. Producción de partículas pseudovíricas ......................................................................... 43

3.4.3.3. Aplicación de la genética reversa ................................................................................... 45

3.4.4. Desarrollo de vacunas ....................................................................................................... 45

3.5. DIAGNÓSTICO

3.5.1. Diagnóstico presuntivo ...................................................................................................... 46

3.5.2. Diagnóstico de laboratorio ................................................................................................ 46

3.5.2.1. Microscopía electrónica directa e inmunomicroscopía electrónica ................................ 46

3.5.2.2. Ensayo de hemaglutinación por inmunoadherencia y radioinmunoensayo.................... 47

3.5.2.3. Enzimoinmunoensayos ................................................................................................... 47

3.5.2.4. Reacción en cadena de la polimerasa tras transcripción reversa .................................... 49

3.6. EPIDEMIOLOGÍA

3.6.1. Distribución geográfica ..................................................................................................... 50

ÍNDICE.

______________________________________________________________________

III

3.6.1.1. Situación a nivel mundial ............................................................................................... 50

3.6.1.2. Situación en Europa ....................................................................................................... 52

3.6.1.3. Situación en España ....................................................................................................... 53

3.6.2. Posibles huéspedes ............................................................................................................ 54

3.6.3. Propiedades físico-químicas del virus ............................................................................... 55

3.6.4. Mecanismos de transmisión .............................................................................................. 55

3.6.4.1. Brotes transmitidos por alimentos .................................................................................. 56

3.6.4.2. Brotes transmitidos por agua .......................................................................................... 57

3.6.4.3. Brotes transmitidos persona a persona ........................................................................... 58

3.7. PATOGENIA

3.7.1. Entrada y periodo de incubación ....................................................................................... 59

3.7.2. Replicación ........................................................................................................................ 59

3.7.3. Excreción y diseminación de NoV por el huésped ............................................................ 60

3.8. INMUNIDAD ...................................................................................................................... 61

3.8.1. Respuesta innata ................................................................................................................ 62

3.8.2. Respuesta adaptativa ......................................................................................................... 63

3.8.2.1. Humoral .......................................................................................................................... 63

3.8.2.2. Celular ............................................................................................................................ 64

3.9. SUSCEPTIBILIDAD DEL HUÉSPED ............................................................................ 64

3.9.1. Polimorfismo del sistema HBGA humano ........................................................................ 65

3.9.2. Diversidad de los NoV en el reconocimiento de los receptores HBGA ............................ 68

3.9.3.Modelos de interacción de los NoV-HBGA....................................................................... 70

3.9.4. Múltiples redes de interacción entre NoV y receptores HBGA ........................................ 72

3.9.5. Participación de los HBGA en la inmunidad del huésped frente a NoV ........................... 73

3.9.6. Los HBGA de la leche materna como receptores señuelo para NoV ................................ 74

3.10. MECANISMO DE ADAPTACIÓN EVOLUTIVA ...................................................... 75

4. INMUNIDAD DE LA LECHE MATERNA

4.1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS ................................................................................... 76

ÍNDICE.

______________________________________________________________________

IV

4.2. MECANISMOS DE PROTECCIÓN

4.2.1. Factores probióticos .......................................................................................................... 78

4.2.2. Anticuerpos secretores ...................................................................................................... 79

4.2.3. Otros componentes defensivos de la leche materna .......................................................... 82

4.2.3.1. Inhibidores del metabolismo de los patógenos ............................................................... 82

4.2.3.2. Enzimas .......................................................................................................................... 84

4.2.3.3. Mucina ............................................................................................................................ 84

4.2.3.4. Lactadherina ................................................................................................................... 85

4.2.3.5. Fibronectina .................................................................................................................... 85

4.2.3.6. Componentes del complemento ..................................................................................... 85

4.2.3.7. Lípidos ............................................................................................................................ 85

4.2.3.8. Leucocitos ...................................................................................................................... 86

4.2.4. Agentes antiinflamatorios y antioxidantes ........................................................................ 88

4.2.4.1. Factores promotores del crecimiento epitelial y de las barreras mucosas ...................... 88

4.2.4.2. Agentes antioxidantes .................................................................................................... 89

4.2.4.3. Enzimas que degradan mediadores de la inflamación .................................................... 89

4.2.4.4. Citoquinas antiinflamatorias .......................................................................................... 89

4.2.5. Factores inmunomoduladores ........................................................................................... 90

4.2.6. Glicanos: oligosacáridos y glicoconjugados ..................................................................... 92

4.3. LOS OLIGOSACÁRIDOS Y GLICOCONJUGADOS DE LA LECHE MATERNA

4.3.1. Diversidad estructural ....................................................................................................... 92

4.3.2. Concentración ................................................................................................................... 94

4.3.3. Efectos locales de los glicanos .......................................................................................... 96

4.3.4. Capacidad protectora frente a las infecciones por NoV .................................................. 100

4.3.4.1. Expresión constitutiva .................................................................................................. 100

4.3.4.2. Resistencia a los enzimas digestivos ............................................................................ 102

4.3.4.3. Efectividad clínica de la protección de los oligosacáridos ........................................... 103

4.3.4.4. Efectos sistémicos de los glicanos ............................................................................... 104

ÍNDICE.

______________________________________________________________________

V

5. HIPÓTESIS ......................................................................................................................... 107

6. OBJETIVOS ........................................................................................................................ 108

7. MATERIAL Y MÉTODOS

7.1. DISEÑO ............................................................................................................................ 109

7.2. MUESTRA POBLACIONAL ......................................................................................... 109

7.3. MUESTRAS CLÍNICAS

7.3.1. Leche materna ................................................................................................................. 109

7.3.2. Suero ............................................................................................................................... 110

7.3.3. Saliva ............................................................................................................................... 110

7.4. ANTICUERPOS

7.3.1. Anticuerpos monoclonales .............................................................................................. 111

7.3.2. Otros anticuerpos............................................................................................................. 111

7.5. MÉTODOS

7.5.1. Producción y purificación de partículas pseudovíricas (VLPs) de NoV GII.4 mediante

baculovirus recombinantes ........................................................................................................ 112

7.5.1.2. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil-sulfato sódico (SDS-PAGE) y

tinción con azul de Coomassie .................................................................................................. 113

7.5.1.3. Observación al microscopio electrónico tras tinción negativa con ácido fosfotúngstico

................................................................................................................................................... 116

7.6. ENSAYOS DE UNIÓN DE VLPs DE NoV GII.4 A SALIVA ...................................... 117

7.7. ENSAYOS DE BLOQUEO DE LA UNIÓN DE VLPs DE NOROVIRUS A SALIVA

7.7.1. Método de Bradford ........................................................................................................ 120

7.8. ANÁLISIS POR ELISA DE ANTICUERPOS EN SUERO Y LECHE MADURA

FRENTE A NOROVIRUS ..................................................................................................... 121

7.9. DETERMINACIÓN POR PCR DEL GENOTIPO SECRETOR (FUT2)

7.9.1. Extracción del ADN total de las muestras de leche materna........................................... 123

7.9.2. Análisis por PCR del gen FUT2 ...................................................................................... 124

7.10. DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS LEWIS ......................................................... 127

8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS .................................................... 128

ÍNDICE.

______________________________________________________________________

VI

RESULTADOS

1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA MUESTRA POBLACIONAL .............. 129

2. GRUPOS SANGUÍNEOS, GENOTIPO FUT2 Y ANTÍGENOS LEWIS

2.1. GRUPOS SANGUÍNEOS ................................................................................................ 130

2.2. GENOTIPO FUT2 ........................................................................................................... 131

2.3. ANTÍGENOS LEWIS ...................................................................................................... 132

3. ANÁLISIS REALIZADOS EN LECHE MATERNA ..................................................... 137

3.1. ACTIVIDAD BLOQUEANTE DE MUESTRAS DE LECHE MATERNA SOBRE LA

UNIÓN DE VLPS DE NoV GII.4 A SALIVA

3.1.1. Ensayos de bloqueo de la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo no secretor

(sese) ......................................................................................................................................... 138

3.1.2. Ensayos de bloqueo de la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo secretor

homocigoto (SeSe) .................................................................................................................... 139

3.1.3. Análisis estadístico de los resultados de porcentaje de inhibición (PI) de muestras de leche

humana sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva según las características de las madres

participantes ............................................................................................................................. 140

3.1.3.1. Diferencias del PI según la edad materna en el momento del parto ............................ 140

3.1.3.2. Diferencias en el PI según la edad gestacional ............................................................ 141

3.1.3.3. Diferencias en el PI según el origen geográfico materno ............................................ 142

3.1.3.4. Diferencias en el PI según el grupo sanguíneo materno .............................................. 142

3.1.3.5. Diferencias en el PI según el genotipo FUT2 materno ................................................ 143

3.1.3.6. Diferencias en el PI según los antígenos Lewis maternos ........................................... 145

3.1.3.7. Diferencias según la etapa madurativa de la leche materna ........................................ 147

3.1.3.8. Diferencias en el PI según el tipo de saliva empleada ................................................. 148

3.2. DETERMINACIÓN DE IgA ANTI NoV EN LM MADURA/TRANSICIÓN

3.2.1. Descripción y análisis estadístico del PI de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV

GII.4 en función del título de IgA anti-NoV láctea .................................................................. 150

3.2.2. Descripción y análisis estadístico del origen geográfico, edad gestacional, grupo

sanguíneo, genotipo FUT2 y antígenos Lewis maternos en función del título de IgA anti-NoV

láctea ........................................................................................................................................ 151

ÍNDICE.

______________________________________________________________________

VII

3.2.3. Estudios de correlación del título de IgA anti-NoV en leche madura/de transición, la edad

materna y PI de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva ....................... 153

4. ANÁLISIS REALIZADOS EN SUERO .......................................................................... 154

4.1. ACTIVIDAD BLOQUEANTE DE MUESTRAS DE SUERO FRENTE A LA UNIÓN

DE VLPs DE NoV GII.4 A SALIVA .................................................................................... 154

4.2. DETERMINACIÓN DE IgG ESPECÍFICA ANTI-NoV GII.4 EN SUERO

MATERNO

4.2.1. Descripción y análisis estadístico del PI de suero y de la leche materna sobre la unión de

VLPs de NoV GII.4 en función del título de IgG anti-NoV en suero ...................................... 155

4.2.2. Descripción y análisis estadístico del origen geográfico, edad gestacional, grupos

sanguíneos, genotipo FUT2 y antígenos Lewis en función del título de IgG anti-NoV en suero

................................................................................................................................................... 156

4.2.3. Estudios de correlación del título de IgG anti-NoV en suero con la edad materna en el

momento del parto, el PI del suero y de la leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4

a saliva ...................................................................................................................................... 158

4.3. DETERMINACIÓN IgA ESPECÍFICA ANTI-NoV EN SUERO

4.3.1. Descripción y análisis estadístico de la edad materna en el momento del parto, edad

gestacional y PI de suero y leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 en función del

título de IgA anti-NoV en suero ................................................................................................ 159


sanguíneos, genotipo FUT2 y antígenos Lewis en función del título de IgA anti-NoV en suero

................................................................................................................................................... 160


momento del parto, el PI del suero y de la leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4

a saliva ...................................................................................................................................... 162

DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 165

CONCLUSIONES ................................................................................................................... 185

ANEXOS .................................................................................................................................. 187

BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 191

ÍNDICE.

______________________________________________________________________

VIII

TABLAS.

______________________________________________________________________

1

TABLAS

Tabla 1. Agentes etiológicos de gastroenteritis aguda más frecuentes según la edad (Guarino et

al., 2008).

Tabla 2. Soluciones de rehidratación oral.

Tabla 3. Recomendaciones de tratamiento antibiótico de la AAP en las gastroenteritis agudas

bacterianas.

Tabla 4. Prevalencia de los principales virus entéricos en la especie humana

Tabla 5. Clasificación taxonómica de Calicivirus.

Tabla 6. Proteínas no estructurales de Calicivirus (Sosnovtsev et al., 2006).

Tabla 7. Criterios de Kaplan (Kaplan et al., 1982a).

Tabla 8. Principales receptores “Toll-like” y afinidad.

Tabla 9. Unión de oligosacáridos/HBGAs sintéticos a VLPs de NoV (Huang et al., 2005).

Tabla 10. IgA secretora en leche materna frente a patógenos microbianos comunes.

Tabla 11. Proteínas y glicoproteínas de la leche materna (Kunz et al., 1999).

Tabla 12. Mecanismos de acción de diversos agentes defensivos de la leche materna.

Tabla 13. Antiinflamatorios y antioxidantes de la leche materna.

Tabla 14. Agentes inmunomoduladores de la leche materna.

Tabla 15. Concentración (g/dL) de ciertos componentes de la leche materna en las diferentes

etapas de la lactancia (Kunz et al., 1999).

Tabla 16. Estructura de los principales oligosacáridos de la leche materna (Chaturvedi et al.,

2001a).

Tabla 17. Concentración de los principales oligosacáridos de la leche materna (Chaturvedi et

al., 2001a).

Tabla 18. Oligosacáridos de la leche materna como receptores microbianos (Kunz et al., 2000).

Tabla 19. Interacciones proteína-carbohidrato de los glicanos de la leche materna.

Tabla 20. Genotipo FUT2 y antígenos Lewis de las muestras de saliva.

Tabla 21. Anticuerpos monoclonales empleados para la determinación de antígenos Lewis.

Tabla 22. Anticuerpos conjugados empleados en ensayos de bloqueo, de análisis de anticuerpos

y determinación de Ag Lewis.

TABLAS.

______________________________________________________________________

2

Tabla 23. Preparación del gel PAGE inferior (“resolving gel”, RG).

Tabla 24. Preparación del gel PAGE superior (“stacking gel”, SG).

Tabla 25. Composición del tampón de electroforesis (5 x).

Tabla 26. Azul de Coomassie.

Tabla 27. Solución decolorante.

Tabla 28. Concentración proteica de muestras de saliva empleadas.

Tabla 29. Diluciones de las muestras de suero y leche madura para el análisis de anticuerpos

frente a NoV.

Tabla 30. Secuencia de oligonucleótidos sintéticos empleados para la amplificación del gen

secretor humano, FUT2 (Lindesmith et al., 2003).

Tabla 31. Edad en el momento del parto de las madres participantes y edad gestacional.

Tabla 32. Características de grupos de RN pretérmino (semanas de gestación).

Tabla 33. Origen geográfico de las madres.

Tabla 34. Grupos sanguíneos de las madres.

Tabla 35. Genotipo FUT2 de las madres.

Tabla 36. Genotipo FUT2 según origen geográfico materno.

Tabla 37. Genotipo FUT2 según edad gestacional.

Tabla 38. Grupos sanguíneos de las madres según genotipo FUT2.

Tabla 39. Antígenos Lewis de las madres.

Tabla 40. Antígenos Lewis materno según su origen geográfico, grupo de edad gestacional y

sanguíneo.

Tabla 41. Análisis antígenos Lewis según el origen geográfico materno y edad gestacional

(estudio de regresión logística).

Tabla 42. Antígenos Lewis de las madres según su genotipo FUT2.

Tabla 43. Antígenos Lewis según el genotipo FUT2 materno (estudio de regresión logística).

Tabla 44. Actividad bloqueante de muestras de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV

GII.4 a saliva de individuo no secretor (sese).

Tabla 45. Análisis de diferencias de PI de muestras de leche materna sobre la unión de VLPs de

NoVs GII.4 a saliva de individuo no secretor según la concentración (W de Wilcoxon).

TABLAS.

______________________________________________________________________

3

Tabla 46. Actividad bloqueante de muestras de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV

GII.4 a saliva de individuo secretor homocigoto (SeSe).

Tabla 47. Comparación PI de muestras de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV a

saliva en función de la edad materna en el momento del parto (prueba de correlación de

Pearson).

Tabla 48. Comparación PI de muestras de LM sobre la unión de VLPs de NoV a saliva en

función de la edad gestacional (prueba de Kruskal-Wallis).

Tabla 49. Comparación PI de muestras de leche materna sin diluir sobre la unión de VLPs de

NoV a saliva en función del origen geográfico materno (prueba de Kruskal-Wallis).

Tabla 50. Comparación PI de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva en

función del grupo sanguíneo materno (Kruskal-Wallis).

Tabla 51. PI de muestras de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva según

el genotipo FUT2 materno.

Tabla 52. Comparación PI de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva en

función del genotipo FUT2 materno (prueba de Mann-Whitney).

Tabla 53. Descripción y comparación PI de muestras de LM sobre la unión de VLPs de NoV

GII.4 a saliva según los antígenos Lewis (Kruskal-Wallis).

Tabla 54. Comparación genotipo FUT2 y antígenos Lewis maternos con PI de muestras de

leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de no secretor y secretor

homocigoto (estudio de regresión logística).

Tabla 55. Comparación PI leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva según

la etapa madurativa de la leche (Friedman).

Tabla 56. Comparación PI leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de

secretor según la etapa madurativa de la leche (prueba W de Wilcoxon).

Tabla 57. Comparación PI de muestras de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4

a saliva según el tipo de saliva empleada (prueba de Friedman).

Tabla 58. Comparación PI de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva

según el tipo de saliva empleada (W de Wilcoxon).

Tabla 59. Títulos de IgA anti-NoV en leche madura/de transición.

Tabla 60. Comparación de PI de LM sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva en función

del título de IgA anti-NoV en leche madura/de transición (prueba de Kruskal-Wallis).

TABLAS.

______________________________________________________________________

4

Tabla 61. Comparación origen geográfico, grupo de edad gestacional, grupo sanguíneo y

genotipo FUT2 maternos en función del título de IgA anti-NoV en L mad/LT (Chi cuadrado).

Tabla 62. Comparación antígenos Lewis según el contenido de IgA en LM madura/de

transición (estudio de regresión logística).

Tabla 63. Comparación títulos IgA anti-NoV en leche madura/de transición con edad materna

en el momento del parto y PI muestras LM sobre la unión de NoV GII.4 a muestras de saliva

(prueba de correlación de Spearman).

Tabla 64. Actividad bloqueante de muestras de suero de la unión de VLPs de NoV GII.4 a

saliva de no secretor.

Tabla 65. Frecuencia y porcentaje de títulos de IgG anti-NoV en suero.

Tabla 66. Comparación de edad materna en el parto, edad gestacional y PI de suero y LM sobre

la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva en función del título de IgG anti-NoV en suero (prueba

de Kruskal-Wallis).


genotipo FUT2 maternos en función del título de IgG anti-NoV en suero (Chi cuadrado).

Tabla 68. Comparación antígenos Lewis maternos en función del contenido de IgG anti-NoV en

suero (estudio de regresión logística).

Tabla 69. Comparación títulos IgG anti-NoV en suero con edad materna en el momento del

parto y PI muestras LM sobre la unión de NoV GII.4 a muestras de saliva (prueba de

correlación de Spearman).

Tabla 70. Nº de casos y porcentaje de títulos de IgA anti-NoV suero.

Tabla 71. Comparación de edad materna en el parto, edad gestacional y PI de suero y LM sobre

la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva en función del título de IgA anti-NoV en suero (prueba

de Kruskal-Wallis).


genotipo FUT2 maternos en función del título de IgA anti-NoV en suero (Chi cuadrado).

Tabla 73. Comparación antígenos Lewis maternos en función del contenido de IgA anti-NoV en

suero (estudio de regresión logística).

Tabla 74. Comparación títulos IgA anti-NoV en suero con edad materna en el momento del

parto, PI suero y PI muestras LM sobre la unión de NoV GII.4 a muestras de saliva (prueba de

correlación de Spearman).

FIGURAS.

______________________________________________________________________

5

FIGURAS

Figura 1. Distribución de causas de mortalidad en niños menores de 5 años, incluyendo el

periodo neonatal (modificado de WHO, 2008).

Figura 2. Distribución de la carga de enfermedad por edades según el nivel socioeconómico

(Parashar et al., 2003a).

Figura 3. Tasa de incidencia de episodios diarreicos por grupos de edad por niño y año a partir

de datos obtenidos de tres estudios prospectivos realizados en países en desarrollo (Kosek et al.,

2003).

Figura 4. Mortalidad asociada a diarrea aguda (casos por 1000 habitantes) por grupos de edad a

partir de tres estudios de investigación epidemiológica realizados en países en desarrollo (Kosek

et al., 2003).

Figura 5. Tasas de mortalidad infantil por causa y región. Fallecimientos cada 1000 niños de 0-

4 años (WHO, 2008b).

Figura 6. Representación esquemática de los mecanismos patogénicos principales de la diarrea

aguda (Walker et al., 2004).

Figura 7. Microfotografía electrónica de viriones de rotavirus procedentes de un filtrado de

muestras de heces de un niño con gastroenteritis (Kapikian et al., 1974).

Figura 8. Microfotografía electrónica de viriones de norovirus (izquierda) y sapovirus

(derecha).

Figura 9. Microfotografía de partículas de astrovirus de aproximadamente 30 nm de diámetro

en el contenido intestinal de cordero (Mendez et al., 2007).

Figura 10. Microfotografía electrónica de adenovirus teñido negativamente (Philipson et al.,

1975).

Figura 11. Organización genómica de Calicivirus (Green et al., 2007).

Figura 12. Estructura de la cápside y proteínas estructurales de norovirus (Green et al., 2007).

Figura 13. Correspondencia entre dominios del genoma y secuencia aminoacídica (Green et al.,

2007).

Figura 14. Tinción específica de MNV-1 en células de estirpe macrofágica (Wobus et al.,

2004).

Figura 15. Microfotografías electrónicas de tinción negativa de la partícula P.

FIGURAS.

______________________________________________________________________

6

Figura 16. Brotes de gastroenteritias aguda por NoV GII.4 en el segundo semestre de 2004,

2005 y 2006 en Europa (modificado de Kroneman et al., 2006).

Figura 17. Distribución geográfica según comunidades autónomas de brotes de norovirus

declarados en España en el año 2003 (Boletín epidemiológico semanal, 2005).

Figura 18. Tinción inmunohistoquímica de la unión de extractos hepáticos de RHDV a HBGAs

tipo 2 de células traqueales de conejo (Ruvoen-Clouet et al., 2000).

Figuras 19, 20 y 21. Vías de síntesis de HBGAs (modificado de Hutson et al., 2004).

Figura 22. Inhibición de la unión de NoV por leche materna (modificado de Jiang et al.,

2004a).

Figura 23. Representación gráfica de la interacción de NoV y HBGA basada en la clasificación

en dos grupos de unión de NoV con los HBGAs: el grupo de unión ABO y Lewis (Tan et al.,

2005b).

Figura 24. Detección por inmunofluorescencia de la expresión de Ag VP1 (de cápside) de NoV

GII.4 en células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante.

Figura 25. Western blot de VLPs de NoV GII.4 tras electroforesis de gel de poliacrilamida con

SDS-PAGE y revelado por quimioluminiscencia con antisuero de conejo anti-NoV.

Figura 26. Imagen de VLPs de NoV GII.4 tras tinción negativa con ácido fosfotúngstico.

Figura 27. Esquema de los ensayos de bloqueo de la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva

mediante leche materna o suero.

Figura 28. Ley de Beer-Lambert.

Figura 29. Esquema de los análisis por ELISA de anticuerpos en suero y leche madura frente a

NoV.

Figura 30. Imagen de electroforesis de los productos de amplificación por PCR del gen FUT2

sometidos a digestión enzimática por Ava-II.

Figura 31. Cromatogramas del gen FUT2: (A) secretor heterocigoto, (B) secretor homocigoto y

(C) no secretor.

Figura 32. Mediana, intervalo intercuartílico y rango de edad gestacional (semanas de

gestación) de la muestra de estudio.

Figura 33. Origen geográfico.

Figura 34. Grupos sanguíneos.

Figura 35. Genotipo FUT2.

FIGURAS.

______________________________________________________________________

7

Figura 36. Antígenos Lewis.

Figura 37. Algoritmo de los análisis realizados en leche materna y nº de muestras empleadas.

Figura 38. Títulos IgA anti-NoV en leche madura/de transición.

Figura 39. Algoritmo de los análisis realizados en suero y nº de muestras empleadas.

Figura 40. Títulos de IgG anti-NoV en suero.

Figura 41. Títulos de IgA anti-NoV en suero.

ABREVIATURAS.

_____________________________________________________________________________

8

ABREVIATURAS

2’-FL: 2-fucosilactosa.

AAP: “American Academy of Pediatrics” (Academia americana de Pediatría).

Ag HBs: antígeno de superficie del virus de la hepatitis B.

Ala: alanina.

AMPc: adenosín-monofosfato cíclico.

Arg: arginina.

BSA: seroalbúmina bovina.

CSF: “colony-stimulating factor” (factor estimulante de colonias).

DC-SIGN: “dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin”

(célula dendrítica específica para la adhesión intercelular de la no-integrina captadora de

molécula 3).

EBHSV: “European brown hare syndrome virus” (virus del síndrome de la liebre parda

europea).

ESPGHAN: “European Society of Pediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition”

(Sociedad europea de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición Pediátrica).

FBVE: “Foodborne viruses in Europe” (virus transmitidos por alimentos en Europa).

FCV: “feline calicivirus” (calicivirus felino).

Fe: felino.

Fuc: L-fucosa.

FUT: fucosiltransferasa.

Gal: D-galactosa.

GEA: gastroenteritis aguda.

Glc: D-glucosa.

GlcNAc: N-acetilgalactosamina.

GMPc: guanosín-monofosfato cíclico.

Ha: liebre.

HBGAs: “histo-blood group antigens” (antígenos histo-sanguíneos humanos).

ABREVIATURAS.

_____________________________________________________________________________

9

Hu: humano.

HV: Hawaii virus.

IFN: interferón.

IgAs: inmunoglobulina A secretora.

IL: interleuquina.

LaV: lagovirus.

LDFH-I: lactosa N-difucohexosa.

Le: Lewis.

Lys: lisina.

MFGE-8: “milk fat globule-8” (globule graso de la leche nº 8).

MNV: NoV murino.

MxV: Mexico virus.

NeuAc: ácido siálico / ácido N-acetilneuramínico.

NoV: norovirus.

NTPasa: nucleótido-trifosfatasa.

OMS: Organización Mundial de la Salud.

OPD: orto-fenilenediamina dihidroclorato.

ORF: “open reading frame” (pauta abierta de lectura).

PAF: “platelet activating factor” (factor de activación plaquetario).

PBS: tampón fosfato salino.

PCR-RFLP: reacción en cadena de la polimerasa de polimorfismos de longitud de los

fragmentos de restricción (“restriction fragments length polymorphisms”).

PiV: Parris island virus.

Pol: polimerasa.

Pro: proteinasa.

Ra: conejo.

RHDV: “Rabbit haemorrhagic disease virus” (virus de la enfermedad hemorrágica del conejo).

RIA: “radio immune assay” (radioinmunoensayo).

ABREVIATURAS.

_____________________________________________________________________________

10

RT-PCR: “reverse transcription polymerase chain reaction” (reacción en cadena de la

polimerasa tras transcripción reversa).

SaV: sapovirus.

SDS-PAGE: gel de poliacrilamida con dodecil-sulfato sódico.

Ser: serina.

SeSe: secretor homocigoto.

Sese: secretor heterocigoto.

sese: no secretor.

Sf9: Spodoptera frugiperda.

SMV: Snow Mountain virus.

SRSV: “small round structured virus” (virus pequeños y redondos).

ssRNA: “single stranded RNA” (ARN de cadena única).

Sw: cerdo.

Thr: treonina.

TLR: receptores “toll-like”.

TNF: “tumoral necrosis factor” (factor de necrosis tumoral).

UNICEF: “United Nations Children´s Fund” (Fundación para la Infancia de las Naciones

Unidas).

VEE: virus de la encefalitis equina venezolana.

VESV: “vesicular exanthema swine virus” (virus del exantema vesicular porcino).

VeV: vesivirus.

VHA: virus hepatitis A.

VIH: virus de la inmunodeficiencia humana.

VLPs: “virus-like particles” (partículas pseudovíricas).

VP: “viral protein” (protein viral).

VPg: “viral protein genome-linked” (proteína unida al genoma viral).

WHO: “World Health Organization” (Organización Mundial de la Salud).

LA DIARREA AGUDA EN LA INFANCIA. Epidemiología.

_____________________________________________________________________________

11

INTRODUCCIÓN

1. LA DIARREA AGUDA EN LA INFANCIA

1.1. EPIDEMIOLOGÍA

1.1.1. Impacto de la diarrea aguda en la infancia

Si bien es cierto que la mortalidad en la infancia ha declinado claramente desde los 15

millones de defunciones en 1980 hasta los 9 millones en 2007, condiciones prevenibles y

tratables como la neumonía, la diarrea, la malaria y el sarampión siguen encabezando las causas

de mortalidad en los niños menores de 5 años (Parashar et al., 2003a), figura 1. De ellas, la

diarrea aguda continúa siendo un problema de salud que afecta a la infancia en todo el mundo

siendo la responsable del fallecimiento de 1,8 millones de niños cada año en este grupo de edad

(Kosek et al., 2003).

Figura 1. Distribución de causas de mortalidad en niños menores de 5 años, incluyendo el periodo

neonatal (modificado de WHO, 2008b).

1.1.2. Agentes etiológicos principales

Los episodios de diarrea aguda tienen un origen principalmente infeccioso (Guandalini et

al., 2004), siendo los principales agentes etiológicos Vibrio cholerae, Salmonella sp., Shigella

sp., amebas y patógenos virales diversos, principalmente rotavirus y calicivirus. La frecuencia

Mortalidad neonatal (37%)

Inf. respiratorias (17%)

Enf. diarreicas (16%)

Malaria (7%)

Sarampión (4%)

VIH (2%)

Otras infecciones (9%)

Enf. no comunicables (4%)

Traumatismos (4%)


_____________________________________________________________________________

12

relativa de cada patógeno difiere ampliamente según la zona geográfica, el estado inmunitario y

la edad del huésped.

En relación con la localización geográfica, existe un predominio de infecciones

intestinales bacterianas y protozoarias en los países en desarrollo, en comparación con los países

desarrollados donde es más frecuente un origen viral (Greenberg et al., 1992). En los países

desarrollados las infecciones intestinales son habitualmente esporádicas, pero continuamente se

identifican y declaran epidemias que ocurren con más frecuencia de octubre a mayo (con un

pico de incidencia de enero a marzo), tratándose en la mayoría de los casos de diarreas virales,

por rotavirus y norovirus (NoV) principalmente, si bien Campylobacter jejuni y Salmonella sp.

presentan picos de incidencia de mayo a junio y de septiembre a octubre (Guarino et al., 2008).

Los parásitos son una causa infrecuente en niños sanos, identificándose Cryptosporidium sp. y

Giardia lamblia como los más prevalentes (Pickering et al., 1984; Lacroix et al., 1987; Guerrant

et al., 1990; Ish-Horowicz et al., 2003). Los NoV y los virus de la hepatitis A (VHA) se

reconocen en la actualidad como los patógenos de transmisión por agua o alimentos más

importantes, en relación a las epidemias que producen y al número de personas afectadas a nivel

global (Breese et al., 2002; Koopmans et al, 2004).

Hay que considerar que en pacientes con alteraciones de la inmunidad, como los

enfermos por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), enfermedades oncológicas y otras

situaciones análogas, se observa una gama más amplia de patógenos, tales como Isospora belli,

Cryptosporidium parvum y Cyclospora cayetanensis (Cohen et al., 2001).

Respecto a las diferencias por edad (tabla 1), rotavirus es el agente etiológico de diarrea

en la infancia más frecuente en todo el mundo y presenta un pico de incidencia entre los 6 y 24

meses, a diferencia de las bacterias que suelen ser más comunes en los primeros meses de vida y

en los años escolares (Guandalini et al, 2004).

Por otra parte, es preciso considerar que aunque las infecciones intestinales son con

mucho la causa más común de diarrea aguda en la infancia, esta puede ser generada por muchas

otras condiciones, tales como infecciones extraintestinales (otitis media aguda, neumonía e

infecciones del tracto urinario), fármacos (implicando al Clostridium difficile como responsable

de muchos de los casos de diarrea asociada a antibióticos de amplio espectro. McFarland et al.,

2000), alergias alimentarias (afectan a un 3% de los niños, siendo la alergia a la proteína de

leche de vaca la más frecuente), alteraciones de los procesos de digestión y absorción (tales

como el déficit de sacarasa-isomaltasa y la intolerancia a la lactosa en el contexto de un proceso

malabsortivo), la quimioterapia y/o radioterapia (resultado de la alteración de la función

absortiva de la mucosa intestinal), el abdomen agudo (es el caso de la apendicitis aguda. Enab et


_____________________________________________________________________________

13

al., 2002) y otras alteraciones más infrecuentes (como el déficit de niacina o la ingesta de

metales pesados).

Tabla 1. AGENTES ETIOLÓGICOS DE GASTROENTERITIS AGUDA

MÁS FRECUENTES SEGÚN LA EDAD (Guarino et al., 2008)

< 1 año 1-4 años > 5 años

Rotavirus

Norovirus

Adenovirus

Salmonella sp.

Rotavirus

Norovirus

Adenovirus

Salmonella sp.

Campylobacter sp.

Yersinia sp.

Campylobacter sp.

Salmonella sp.

Rotavirus

Norovirus

1.1.3. Morbilidad

Al estimar la frecuencia global de la diarrea aguda es probable que se subestime en los

países en desarrollo. En ellos tienen lugar un 98% de las muertes de niños menores de 5 años,

sin embargo carecen de sistemas de registro vital que permitan conocer con exactitud las causas

de defunción en este grupo de edad. Los datos disponibles al respecto tienen una cobertura muy

variable, oscilando del 12 al 81% (Stenberg et al., 2007). En China, por ejemplo, existe un

sistema de registro vital que aporta datos de causas de fallecimiento de forma sistemática, pero

su exhaustividad para los menores de 5 años es cuestionable (Boschi-Pinto et al., 2008). Esta

carencia de datos fidedignos es el principal obstáculo para diseñar los planes de salud para los

menores de 5 años de estas áreas por parte de los organismos nacionales e internacionales

(Boschi-Pinto et al., 2008).

En nuestro medio, la información rutinaria de los episodios de diarrea aguda infecciosa

tiende a ser heterogénea pues la mayoría de los casos no precisan asistencia hospitalaria y son

atendidos en atención primaria o simplemente en el domicilio. Además, la diarrea puede

aparecer asociada a una gama muy amplia de otras enfermedades, lo que dificulta el diagnóstico

diferencial.

A pesar de la imprecisión de las fuentes de información, podemos afirmar que la diarrea

es la enfermedad más prevalente a nivel mundial en todas las edades, incluso en las regiones de

la Organización Mundial de la Salud (OMS) que incluyen a los países más ricos (WHO, 2008b).

En general se observa que en las revisiones del tema la morbilidad de la diarrea aguda en la

infancia ha aumentado ligeramente en todo el mundo desde 1990 hasta el año 2000, lo que


_____________________________________________________________________________

14

puede deberse a que el crecimiento de la población mundial ha tenido lugar a expensas de los

países más pobres.

Figura 2. Distribución de la carga de enfermedad por edades según el nivel socioeconómico

(Parashar et al., 2003a).

La prevalencia de enfermedad en los diferentes grupos de edad se ve muy afectada por el nivel

socioeconómico de la población, de forma que los ingresos altos implican una esperanza de vida

mayor y morbilidad en etapas tardías de la vida, a diferencia de los ingresos bajos que implican una

morbi-mortalidad más precoz.

Para los niños menores de 5 años de edad en los países en desarrollo se cuantifica una tasa

de incidencia de 3,2 episodios por niño y año, aunque entre los 6 y 11 meses alcanza 4,8

episodios por niño y año (Kosek et al., 2003), como muestra la figura 3. No debemos ignorar

que las formas generalizadas de malnutrición, el marasmo y el kwashiorkor, así como los

déficits minerales y vitamínicos que los acompañan pueden influir en la función inmunitaria del

huésped (Beisel, 1982), incrementando el riesgo de cronificación y las secuelas de esta afección

(Baqui et al., 1993; Duncan et al., 1997), tales como la talla baja, las disfunciones físicas y

cognitivas e incluso la defunción (Guerrant et al, 1999a), consecuencias comunes en los niños

malnutridos que padecen diarrea aguda. La malnutrición, de hecho, es una condición que

aparece asociada a un 35% de los fallecimientos por diferentes causas en los niños menores de 5

años (Black et al., 2008; WHO., 2008a).

En los países desarrollados la mortalidad por diarrea es excepcional, en cambio son

enormes los costes directos (gastos médicos) e indirectos (pérdida de días de trabajo de los

padres) por la elevada prevalencia de la enfermedad (Tucker et al., 1998). En Estados Unidos,

Ingresos altos

0-4 años(5%)

5-14 años(4%)

15-59 años(56%)

60 años omás (35%)

Ingresos medios y bajos

0-4 años(31%)

5-14 años(8%)

15-59 años(48%)

60 años omás (13%)


_____________________________________________________________________________

15

la tasa de incidencia de la diarrea se ha estimado en 1-2,5 episodios por niño y año (Ho et al.,

1988) generando un 10% de las hospitalizaciones en menores de 5 años (Glass et al., 1991). En

Europa, la tasa de incidencia es bastante similar pues oscila de 0,5 a 1,9 episodios por niño y

año en menores de 3 años (Tompkins et al., 1992; Caprioli et al., 1996; Guandalini et al., 2000;

De Wit et al., 2001b; Maltezou et al., 2001; Olesen et al., 2005).

Figura 3. Tasa de incidencia de episodios diarreicos por niño y año por grupos de edad a partir de

datos obtenidos de tres estudios prospectivos realizados en países en desarrollo (Kosek et al., 2003).

1.1.4. Mortalidad

La mortalidad de la infancia asociada a la diarrea ha disminuido de forma lenta pero

constante en las últimas décadas. Los datos publicados por Kosek et al. indican que en los

países en desarrollo las muertes anuales de menores de 5 años por diarrea cayeron de 4,6

millones en 1982 a 3 millones en 1992 y 2,5 millones en el 2003, a pesar del crecimiento de la

población y la inclusión de China en los análisis más recientes. Las estimaciones de mortalidad

del año 2003 revelaron que 4,9 de cada 1000 niños por año fallecieron como consecuencia de la

diarrea aguda en los primeros 5 años de vida en estas áreas, lo que supone un descenso respecto

a las cifras previas de 13,6 de cada 1000 niños por año en el periodo de 1955 a 1979 y 5,6 de

cada 1000 niños por año de 1992 al 2000, siendo esto más pronunciado en los menores de 1 año

(figura 4). Supone una media de un 21% de todas las muertes de niños por debajo de 5 años en

estas áreas (Kosek et al., 2003). Parashar et al. aportan datos muy similares, cuantifican en 2,1

0

1

2

3

4

5

6

0-5 m 6-11 m 1 año 2 años 3 años 4 años

1955-1979

1980-1990

1990-2000


_____________________________________________________________________________

16

millones las muertes en la infancia debidas a diarrea aguda (Parashar et al., 2003b), en cambio

Boschi-Pinto et al. obtienen una cifra menor 1,87 millones de muertes de menores de 5 años por

año (intervalo de confianza al 95%: 1,56-2,19), aproximadamente un 19% de todas las muertes

de niños menores de 5 años.

Figura 4. Mortalidad asociada a diarrea aguda (casos por 1000 habitantes) por grupos de edad a

partir de tres estudios de investigación epidemiológica realizados en países en desarrollo (Kosek et

al., 2003).

Las regiones de la OMS de África y el Sudeste asiático incluyen el 78% (1,46 millones)

de todas las muertes por diarrea que tienen lugar en el mundo en desarrollo, un 73% de ellas

tienen lugar en tan solo 15 países (Boschi-Pinto et al., 2008), figura 5. La disminución

progresiva de las cifras de mortalidad en las últimas décadas puede atribuirse a la generalización

del uso de soluciones de rehidratación oral, junto con el apoyo a la lactancia materna, la

educación femenina y las mejoras sanitarias en los países en desarrollo (Victoria et al., 2007;

Forsberg et al., 2007).

0

5

10

15

20

25

30

< 1 año 1-4 años 0-4 años

1955-1979

1980-1990

1990-2000


_____________________________________________________________________________

17

Figura 5. Tasas de mortalidad infantil por causa y región. Fallecimientos cada 1000 niños de 0-4

años (WHO, 2008b).

1.1.5. Factores de riesgo

La elevada morbi-mortalidad asociada a la diarrea aguda en la infancia es conocida por

las organizaciones sanitarias internacionales, por lo que entre los Objetivos de Desarrollo para el

Nuevo Milenio de las Naciones Unidas se ha incluido la disminución en dos tercios de la tasa de

mortalidad por diarrea aguda en los niños menores de 5 años entre 1990 y 2015 (WHO, 2009).

La OMS recalca la responsabilidad que tiene la falta de acceso al agua potable y los

medios sanitarios inadecuados, así como las prácticas de higiene insuficientes de gran parte de

la población mundial en la morbilidad de la enfermedad. Se estima que un 88% de los casos de

diarrea aguda son atribuibles a estos tres factores y su mejora podría prevenir al menos un 9,1%

de la carga de enfermedad mundial y un 6.3% de todas las muertes por diarrea aguda,

especialmente de niños en países en desarrollo (Stenberg et al., 2007).

Esfuerzos dirigidos por la OMS durante el periodo de 1990 a 2006 permitieron el

acceso al agua potable a más de un billón de personas en el mundo y extendieron mejoras en los

medios de evacuación a aproximadamente 1,1 billones de personas (WHO, 2009); sin embargo,

como se ha concluido en la Cumbre Mundial sobre los Objetivos del Tercer Milenio de 2010,

todavía estamos lejos de haber completado estos propósitos.

0 10 20 30 40

África

Oriente Medio

SE asiático

Europa

Pacífico occidental

América

Factores perinatales

Enf. diarreicas

Enf. respiratorias

Malaria

Otras

LA DIARREA AGUDA EN LA INFANCIA. Patogenia y fisiopatología.

_____________________________________________________________________________

18

1.2. PATOGENIA Y FISIOPATOLOGÍA

1.2.1. Fisiología del transporte intestinal

Bajo circunstancias fisiológicas el intestino delgado absorbe grandes cantidades de sodio,

cloro y bicarbonato, secreta hidrogeniones y en menor medida cloro y bicarbonato, el agua sigue

de forma pasiva el transporte de solutos. Existe absorción y secreción tanto en el villi como en

las criptas, aunque mayoritariamente la absorción tiene lugar en la región vellosa y la secreción

en la críptica (Veereman-Wauters et al., 2006). Debido a que la capacidad absortiva de los

enterocitos supera con creces la secretora el resultado neto es a favor de la absorción

(Guandalini e al., 2004).

El transporte intestinal de agua y electrolitos es un proceso finamente regulado que

resulta de la interacción de diferentes mecanismos: el sistema nervioso entérico, las células de la

lámina propia, y las células epiteliales. Los agentes reguladores liberados, responsables del

mantenimiento de la homeostasis, incluyen péptidos hormonales, aminas activas, metabolitos

del ácido araquidónico y óxido nítrico.

1.2.2. Tipos de diarrea aguda

En la diarrea aguda existe un disbalance del funcionamiento de los procesos de absorción

y secreción en el intestino delgado y/o grueso. Puede ser el resultado de un efecto osmótico que

actúa en el lumen (diarrea osmótica) o bien de un estado de secreción activa inducida por los

enterocitos (diarrea secretora), ambos conducen a una disminución de la consistencia de las

heces y/o a un incremento de la frecuencia de las mismas por lo general mayor o igual a 3 en 24

horas (Figura 6). La diarrea aguda es por definición autolimitada, con una duración menor a 7

días (Guarino et al., 2008).

En la diarrea osmótica la eliminación fecal no suele ser masiva, guarda una proporción

directa con la cantidad ingerida de nutrientes no absorbibles y mejora cuando se interrumpe

dicha ingesta. La osmolaridad de las heces es elevada, excediendo los 100 mOsm/kg, a lo que

contribuyen el contenido electrolítico, los nutrientes no absorbibles y sus productos de

degradación.

Se observa por ejemplo, tras la ingesta de azúcares no absorbibles como la lactosa en los

intolerantes a estos carbohidratos o bien de forma secundaria a las infecciones intestinales. Los

virus muestran un fuerte tropismo por las células epiteliales del intestino delgado y destruyen

selectivamente un gran número de enterocitos maduros con capacidad absortiva, por medio de

lisis y/o apoptosis, lo que lleva a una inadecuada absorción de fluidos, electrolitos y nutrientes

intraluminales (Bass et al., 2004).

LA DIARREA AGUDA EN LA INFANCIA. Patogenia y fisiopatología.

_____________________________________________________________________________

19

En la diarrea secretora, los rasgos clínicos más característicos son el elevado ritmo de

deposiciones, la falta de respuesta al ayuno y una osmolaridad fecal normal.

Esta situación puede ocurrir como consecuencia de muchos trastornos, aunque la causa

más frecuente es la infección por determinadas bacterias intestinales. Tras su colonización,

suelen adherirse o invadir el epitelio intestinal (el intestino delgado proximal en el caso de

bacterias enterotoxigénicas y el distal y colon en las citotóxicas) y producen enterotoxinas

(exotoxinas que permiten la secreción incrementando un segundo mensajero intracelular como

el AMPc, GMPc o protein-kinasa C o citotoxinas como el Vibrio cholerae), lo que desencadena

la liberación de citoquinas proinflamatorias que inducen la liberación de prostaglandinas o

factores activadores de plaquetas con acciones hipersecretoras (Guerrant et al., 1999b). El papel

del colon en la diarrea secretora es diferente según la causa (Field et al., 1989; Kunzelman et al.,

2002), de forma general la capacidad de absorción de la mucosa colónica está maximizada para

compensar parcialmente la pérdida de agua del intestino delgado, sin embargo hay situaciones

en las cuales el colon está directamente implicado en el estímulo secretor: cuando la diarrea es

el resultado de una infección por una bacteria citotóxica (Clostridium difficile, E. coli

enterohemorrágica y Shigella sp.) o cuando es hiperestimulado a través del sistema nervioso

entérico tras la liberación de una enterotoxina en el intestino delgado (enterotoxina colérica,

toxinas termoestable y termolábil de Klebsiella sp., enterotoxina y toxina enteroagregante de E.

coli. Field et al., 1989).

Figura 6. Representación esquemática de los mecanismos patogénicos principales de la diarrea

aguda (Walker et al., 2004).

LA DIARREA AGUDA EN LA INFANCIA. Manifestaciones clínicas.

_____________________________________________________________________________

20

A pesar de que los casos de diarrea puramente osmótica o puramente secretora existen, en

la mayoría de procesos ambos mecanismos conviven y se trata de cuadros mixtos desde el punto

de vista patogénico y fisiopatológico. En la diarrea por rotavirus, existe una alteración grave de

la función absortiva tras la invasión masiva de los enterocitos maduros que explica la diarrea

osmótica y además una hipersecreción de las criptas desencadenada por una enterotoxina, la

proteína no estructural NSP4, que genera la secreción de cloro transepitelial calcio-dependiente

produciendo la diarrea.

Si bien el mecanismo de diarrea osmótica descrito previamente es aplicable a los agentes

clásicos de la enteritis viral como rotavirus, astrovirus, calicivirus y adenovirus entéricos, virus

como citomegalovirus, virus de Ebstein-Barr y el virus de la inmunodeficiencia humana pueden

asociarse a diarreas que probablemente se deban a otros mecanismos, como citoquinas

inflamatorias locales o sistémicas.

1.3. MANIFESTACIONES CLÍNICAS

La presentación clínica y el curso de la enfermedad son enormemente variables y

dependen del medio geográfico, de las características del huésped y del patógeno infectante.

1.3.1. Diferencias geográficas

Las diferencias geográficas son determinantes en dos aspectos principales: la gravedad

del episodio diarreico y su probabilidad de evolución a la cronicidad.

La diarrea aguda en los países desarrollados es casi invariablemente una enfermedad

benigna y autolimitada que se resuelve en poco tiempo si hay una correcta reposición del agua y

electrolitos y se mantiene un buen aporte nutricional, sin embargo existen casos de mayor

gravedad como deshidrataciones y septicemias, principalmente en lactantes y por ciertos agentes

como rotavirus y algunas bacterias intestinales (por ej. Salmonella sp.), respectivamente. En

cambio, en los países en desarrollo un episodio diarreico suele minar a un paciente con un

estado nutricional ya comprometido previamente y tiene un efecto deletéreo en la salud del niño

que es más susceptible a la deshidratación, la caquexia y la muerte.

Aunque es algo excepcional en nuestro medio, hasta un 3% de las diarreas agudas

evolucionan hacia la cronicidad. La infrecuente aparición de una diarrea prolongada en un niño

sano por lo demás, suele deberse a una sensibilización a las proteínas alimentarias. En la fase

aguda de la infección intestinal, este estado de sensibilización obedece a un aumento del paso de

antígenos secundario a la mucosa dañada y al aumento de su permeabilidad. Se ha descrito que

en los niños, las proteínas de la leche de vaca son la causa más frecuente de sensibilización

LA DIARREA AGUDA EN LA INFANCIA. Manifestaciones clínicas.

_____________________________________________________________________________

21

proteica (Walker-Smith, 1994). En contraposición, en los países en desarrollo en caso de superar

la enfermedad, la malnutrición y el estado inmunitario debilitado favorecen la evolución de la

diarrea a la cronicidad (WHO, 1985) hasta en un 20% de los episodios (Bhandari et al., 1992;

Bhandari et al., 1994).

1.3.2. Características del huésped

En relación con el huésped, la edad y el estado nutricional son los factores más

importantes.

En cuanto a la edad, cuanto más pequeño sea el niño, mayor será el riesgo para una

deshidratación más grave y amenazante para la vida, como consecuencia de su mayor porcentaje

de agua corporal total y la limitada capacidad de compensación renal de los lactantes. La

influencia de la edad en la evolución a la cronicidad es una cuestión no resuelta de forma

definitiva, sin embargo en países en desarrollo, se ha observado que la enteritis postdiarrea

guarda una correlación inversa con la edad (Victoria et al., 1992; Fauveau et al., 1991).

En referencia al estado nutricional, aproximadamente un 80% de niños normonutridos

que padecen diarrea aguda evolucionan favorablemente, a diferencia de los malnutridos que

suelen presentar mayor gravedad del episodio diarreico (Guandalini et al., 2000). Entre los

factores que pueden condicionar esta evolución se encuentran (Kukurozovic et al., 2002) la

reducción de la secreción gástrica (Gracey et al., 1977), la alteración de la motilidad intestinal,

la disminución de la síntesis de anticuerpos secretores y la alteración inmunitaria, puesto que

favorecen el sobrecrecimiento bacteriano en el tramo intestinal proximal (Mata et al., 1972).

Asimismo, con frecuencia se produce un déficit de inmunidad celular en los niños malnutridos y

con diarrea como consecuencia de un déficit de micronutrientes como la vitamina A, la

piridoxina, el ácido fólico y/o el zinc (Beisel et al., 1982) o de infecciones bacterianas o virales

previas (Kauffman et al., 1976; Kantor, 1975). Además, la malnutrición implica un recambio

epitelial intestinal disminuido y por tanto déficits enzimáticos y un retraso en la recuperación de

la diarrea infecciosa, lo que contribuye a la malabsorción y prolonga la diarrea (Gracey et al.,

1972) incrementando la mortalidad en estos niños.

1.3.3. Características del patógeno infectante

Cuando se analizan los niños con diarrea por diferentes agentes patógenos se observan

diferencias en relación a su duración y manifestaciones clínicas.

En cuanto a su duración, la diarrea aguda generalmente suele prolongarse de 5 a 10 días.

Las diarreas bacterianas tienden a declinar desde el principio debido a que las toxinas se unen de

una forma irreversible a los enterocitos y se eliminan con la renovación de estas células de la

cripta al villi, en cambio las diarreas víricas tienden a intensificarse durante varios días debido a

LA DIARREA AGUDA EN LA INFANCIA. Tratamiento.

_____________________________________________________________________________

22

la extensión de la atrofia de las vellosidades y suelen tener un curso más prolongado

(Guandalini et al., 2004).

En relación con las manifestaciones clínicas, la fiebre, el dolor abdominal en forma de

calambres y la sangre mezclada con las deposiciones son más frecuentes en pacientes con

patógenos bacterianos enteroinvasivos como Salmonella sp., Shigella sp., Yersinia sp.,

Campylobacter sp. y Entamoeba histolityca (Guandalini et al, 1988), mientras que los niños

afectados por Escherichia coli enterotóxica (Guarino et al., 1989) y agentes víricos,

especialmente rotavirus, sufren mayor deshidratación, vómitos y deposiciones más líquidas.

Asimismo, se ha descrito en los últimos años la asociación entre ciertos agentes causantes

de diarrea aguda y manifestaciones extraintestinales, en ocasiones de gravedad. Es el caso de

Campylobacter jejuni, especialmente el serotipo O:19, con el síndrome de Guillain-Barré

(Nachamkin et al., 1998; Mishu et al., 1993) y de Escherichia coli productora de una toxina

similar a Shigella sp. con el síndrome hemolítico-urémico (Myers et al., 1997).

1.4. TRATAMIENTO

Esencialmente, los principios del tratamiento de la diarrea aguda consisten en prevenir y

revertir la deshidratación y minimizar las consecuencias nutricionales del daño de la mucosa

intestinal (Veereman-Wauters et al., 2006).

1.4.1. Rehidratación oral

El riesgo mayor en la diarrea aguda es la pérdida de agua y electrolitos con la

consiguiente deshidratación y pérdida de la homeostasis del equilibrio ácido-base y del sodio.

Hasta mediados de los años 60, se asumía que la vía intravenosa era la única adecuada

para la rehidratación. Posteriormente, se demostró que las bacterias enterotoxigénicas dejan

intacta la mucosa del intestino delgado, por tanto sus funciones absortivas, y que el transporte

de sodio acoplado a glucosa queda indemne en las diarreas secretoras inducidas por AMPc

(Cash et al, 1970; Hirschhorn et al., 1968), así como en aquellas mediadas por GMPc

(Guandalini et al., 1982). De esta manera, los procesos de absorción de sodio y glucosa son

respetados compensando la pérdida masiva de fluidos que tiene lugar en este tipo de diarreas.

Estos hechos constituyeron las bases fisiopatológicas para el programa conjunto de la

OMS y la Fundación para la Infancia de las Naciones Unidas (UNICEF) con el objetivo de

diseñar soluciones de rehidratación oral como tratamiento principal de la diarrea aguda.

Mostraron tal eficacia que llegaron a catalogarse como “el avance médico más importante de

este siglo” (WHO, 2006; Elliot et al., 1989; International Study Group on Reduced Osmolality


_____________________________________________________________________________

23

Solutions, 1995) al estimar que han evitado más de 1 millón de muertes tanto en países en

desarrollo como en países desarrollados (Walker-Smith, 1990).

Inicialmente la OMS recomendó una fórmula estándar con 90 mmol/L de sodio y 111

mmol/L de glucosa, con una osmolaridad total de 311 mOsm/L, para todas las causas de diarrea

aguda y edades. Sin embargo, muchos estudios in vitro e in vivo en los años 80 y 90

demostraron que concentraciones más bajas de sodio y glucosa (sodio: 60-75 mmol/L y glucosa:

75 y 100 mmol/L, con una osmolaridad total de 225-260 mOsm/L. Wapnir et al., 1985; Sandhu

et al., 1989; Booth et al., 1992) incrementaban la absorción de agua inducida por solutos y por

tanto eran más eficaces que las soluciones más osmolares favoreciendo una mayor rehidratación

y disminuyendo el número de deposiciones (Mahalanabis et al., 1996; Desjeux et al., 1997;

Thillainayagam et al., 1998), sin riesgo añadido de padecer alteraciones del sodio (Hahn et al.,

2002).

Actualmente la OMS, la ESPGHAN (“European Society of Pediatric Gastroenterology,

Hepatology and Nutrition”, la Sociedad Europea de Gastroenterología, Hepatología y Nutrición

Pediátrica. Sjazewska et al., 2000) y la AAP (“American Academy of Pediatrics”, Academia

americana de Pediatría) consideran que las soluciones de rehidratación oral de baja osmolaridad

constituyen la forma más segura, fisiológica, y efectiva de proporcionar rehidratación y

mantener la hidratación en niños con diarrea aguda (Provisional Comité on Quality

Improvement Subcomité of Acute Gastroenteritis, 1996; Hahn et al., 2001; Murphy et al.,

2004). No obstante, la solución de rehidratación oral original de la OMS resulta todavía

preferible en las áreas donde la prevalencia de cólera es alta (Hahn et al., 2001), dado que sigue

siendo una causa fundamental de morbilidad y mortalidad en determinadas partes del mundo e

induce las mayores pérdidas de sodio en las heces de las infecciones intestinales conocidas,

alrededor de 90 mmol/L (Seas et al., 1996).

En la tabla 2 se detalla la composición de los dos tipos de soluciones comercializadas en

nuestro país.

Tabla 2. SOLUCIONES DE REHIDRATACIÓN ORAL

Na+

(mMol/L)

Cl+

(mMol/L)

K+

(mMol/L)

Citrato (mMol/L)

Bicarbonato (mMol/L)

Glucosa (mMol/L)

Osmolaridad (mOsm/L)

Sueroral

90

90

20

10

-

111

311

Sueroral

hiposódico 60-75 41 20 - 30 75-100 225-260


_____________________________________________________________________________

24

1.4.2. Realimentación precoz

Se considera que los niños lactados al pecho que padecen diarrea aguda deben continuar

con la lactancia materna sin ningún tipo de interrupción. De hecho, la lactancia materna no sólo

tiene un conocido efecto protector contra la infección intestinal (Wyatt et al., 1969; Mata et al.,

1969a; Glass et al., 1976; Clemens et al., 1986; McLean et al., 1986; Glass et al., 1989; Golding

et al., 1997; Morrow et al., 1999; Kramer et al., 2001), sino que además promueve una

recuperación más rápida y proporciona una mejor nutrición en el lactante en estas circunstancias

(Brown, 1994a). Esto es incluso más importante en los países en desarrollo, donde la retirada de

la lactancia materna en un medio donde las alternativas de alimentación para un lactante son

limitadas ha demostrado exacerbar la deshidratación y desnutrición en los niños con diarrea

aguda (Battacharaya et al., 1995).

En los lactantes alimentados artificialmente, el tema es mucho más controvertido. Durante

años, el remedio popular de la diarrea aguda ha sido el ayuno, dada la interpretación de que el

“reposo” del intestino podría ser beneficioso. Esta visión fue inicialmente planteada por Powers

en 1926 que en su revisión de la diarrea en la infancia recomendaba un ayuno absoluto durante

el periodo de enfermedad y una reintroducción de la fórmula a concentraciones progresivamente

crecientes, lo que ha sido puesto en duda por numerosos autores a lo largo del siglo pasado

(Chung et al., 1948; Rees et al., 1979; Dugdale et al., 1982). Actualmente la evidencia a favor

de la realimentación precoz es arrolladora (Isolauri et al., 1986; Brown et al., 1991; Brown et

al., 1994b), de hecho muchos estudios han proporcionado evidencias de que en niños sin

deshidratación grave ni acidosis metabólica un reinicio de la alimentación tras haber completado

la rehidratación oral en las primeras 4 a 6 horas es bien tolerada (Isolauri et al., 1985; Isolauri et

al., 1986; Chew et al., 1993), es más, permite una restauración más rápida de la permeabilidad

intestinal debido a la enteritis (Isolauri et al.,1989; Nanulescu et al.,1995).

Por otra parte, aunque se pensó que la intolerancia secundaria a la lactosa era una

circunstancia limitante en los niños con diarrea y que había que retrasar la reintroducción de las

fórmulas lácteas, hoy en día a pesar de la presencia de sustancias reductoras en las heces de

niños con diarrea, no se recomienda el retraso de la introducción de los lácteos como se hace

con frecuencia y de forma errónea en los países desarrollados en las diarreas leves y moderadas.

A modo de resumen, el grupo de trabajo de ESPHGAN recomienda como tratamiento

óptimo de los niños con deshidratación leve a moderada en Europa, el uso de soluciones de

rehidratación oral en las 4-6 primeras horas y la rápida reintroducción de la alimentación

normal, incluyendo la lactosa a continuación (Walker-Smith et al., 1997; Sandhu, 2001).


_____________________________________________________________________________

25

1.4.3. Otros tratamientos

Probióticos. Los probióticos han formado parte de la nutrición humana durante siglos

(Bengmarrk, 1998), pero ha sido en las últimas décadas cuando ha nacido un interés creciente

acerca de su utilidad en la prevención y tratamiento de la diarrea aguda.

Son microorganismos vivos que al ser ingeridos en cantidades específicas ejercen efectos

beneficiosos para la salud más allá de la nutrición (Guarner et al., 1998). Se les atribuye la

propiedad de estimular la resistencia inespecífica a patógenos microbianos y potenciar las

defensas gastrointestinales del huésped a través de la síntesis de sustancias antimicrobianas, la

competición por nutrientes necesarios para el crecimiento de patógenos y/o la modificación de

toxinas o sus receptores (Sjazewska et al., 2001; Veereman-Wauters et al., 2006). Se ha descrito

que ciertos probióticos favorecen la proliferación linfocítica, estimulan la fagocitosis e

incrementan la secreción de citoquinas, incluído el IFN-gamma (interferón-gamma. Sjazewska

et al, 2006).

Lactobacillus rhamnosus de la cepa GG (ATCC 53103) es con diferencia el probiótico

investigado más ampliamente. En diversos ensayos clínicos ha demostrado su efectividad en la

prevención (Du Pont, 1997; Hi et al., 1997) y tratamiento (Vanderhoof et al., 2002; Guandalini

et al., 2002) de la diarrea aguda en niños y adultos. El efecto es más pronunciado en la diarrea

por rotavirus (Isolauri et al., 1991; 1994) y en la prevención de la diarrea prolongada

(Guandalini et al., 2000), pues reduce el tiempo de eliminación de partículas víricas (Guarino et

al., 1997). De hecho tras muchos ensayos clínicos doble ciego, randomizados y controlados con

diversas especies de Lactobacillus sp. en niños con diarrea aguda (Guandalini et al., 2000), los

ensayos clínicos más recientes corroboran su seguridad y eficacia (Huang et al., 2002; Van Niel

et al., 2002; Sjazewska et al., 2007). Saccharomyces boulardii también ha demostrado beneficio

aunque con un grado de evidencia menor (Szajewska, 2001).

Terapia antimicrobiana. En las infecciones bacterianas, la decisión de tratar a un niño con

antibióticos no es fácil, puesto que los patógenos bacterianos han demostrado un aumento de

resistencia a los tratamientos antibióticos habituales, su efectividad es variable y su uso puede

prolongar el estado de portador. En la tabla 3 se resumen las principales indicaciones y

fármacos según el Comité de Enfermedades Infecciosas de la AAP.


_____________________________________________________________________________

26

Tabla 3. RECOMENDACIONES DE TRATAMIENTO ANTIBIÓTICO

DE LA AAP EN LAS GASTROENTERITIS AGUDAS BACTERIANAS

ETIOLOGÍA INDICACIONES FÁRMACOS

Campylobacter sp. Diagnóstico precoz

Formas graves

Macrólidos

Cefalosporinas de 3ª generación

Salmonella no typhi Lactantes menores de 3 meses

Pacientes con MCP (malnutrición

calórico-proteica)

Inmunodeprimidos

Ampicilina

Cotrimoxazol


Shigella sp. Diarrea sintomática Cotrimoxazol

Ampicilina


Yersinia sp. Septicemia

Pacientes inmunodeprimidos

Pacientes con talasemia mayor

Cotrimoxazol


Aminoglucósidos

Fármacos antisecretores. Considerando la gran prevalencia de la diarrea aguda, es obvio

que disponer de un fármaco antisecretor seguro y eficaz sería muy útil. Esta búsqueda ha sido

muy infructuosa y todas las guías actuales advierten de que el uso de fármacos antisecretores en

esta entidad sería más dañino que beneficioso. La mayoría de los nuevos agentes antisecretores

(clorpromazina, loperamida y octeótrido) tienen un efecto limitado y no se libran de potenciales

efectos adversos debido a sus propiedades inhibidoras de la motilidad intestinal (Veereman-

Wauters et al., 2006).

En cambio, el racecadotrilo ha demostrado ser un fármaco seguro y eficaz en el

tratamiento de la diarrea aguda (Farthing et al., 1999; Matheson et al., 2000). Es un inhibidor

específico de las encefalinasas, peptidasas de membrana celular localizadas principalmente en el

epitelio de yeyuno e íleon, previene la degradación de las encefalinas a nivel intestinal

permitiendo su acción de reducción intracelular de AMPc y GMPc lo que evita la secreción

electrolítica (Salazar-Lindo et al., 2000).


_____________________________________________________________________________

27

1.4.4. Micronutrientes

En los últimos años, ha despertado un gran interés el posible papel de la suplementación

con zinc en la prevención y el tratamiento de la diarrea aguda en los países en desarrollo. Un

ensayo clínico controlado y doble ciego en Bangladesh demostró que la suplementación con 20

mg/d de zinc elemental condujo a una menor duración del proceso, menor volumen de heces y

una mejor recuperación ponderal en lactantes desnutridos mayores de seis meses con diarrea

aguda (Roy et al., 1997; Bhutta et al., 2000; Bahl et al., 2001).

Respecto a su utilidad en la prevención de la diarrea aguda, ensayos clínicos doble-ciego,

aleatorizados y controlados con placebo en niños de 6 meses a 3 años mostraron que en los

países en desarrollo la suplementación diaria de zinc conduce a una reducción sustancial de la

incidencia de la enfermedad de un 37 % y de la diarrea persistente en un 20 % de los pacientes

(Sachdev et al., 1988; Sazawal et al., 1995).

A la luz de estos resultados, se asume que la suplementación de zinc debe administrarse a

niños malnutridos, mayores de seis meses que viven en áreas con un elevado riesgo de padecer

infecciones intestinales, tanto antes como durante la diarrea aguda (WHO, 2004; Lukacik et al.,

2008; Black et al., 2001). Publicaciones en lactantes menores de 6 meses (Walker et al., 2007;

Lazzerini et al., 2008) y en niños sin deficiencias nutricionales no muestran una disminución de

la gravedad o de la duración de la diarrea (Boran et al., 2006).

Está siendo estudiado también, el papel que puedan desempeñar otros micronutrientes en

la prevención y tratamiento adyuvante de la diarrea aguda, tales como la vitamina A, el ácido

fólico, el selenio, el manganeso y el magnesio (Bahn et al., 1998), aunque por el momento no se

han obtenido conclusiones definitivas sobre su posible utilidad.

PRINCIPALES VIRUS ENTÉRICOS. Rotavirus.

__________________________________________________________________________

28

2. PRINCIPALES VIRUS ENTÉRICOS

Si bien desde mediados del siglo XX se sospechaba de los virus como agentes causantes

de infecciones intestinales, no fue hasta 1972 cuando Kapikian et al. identificaron un virus

redondo de pequeño tamaño (virus Norwalk) en muestras fecales procedentes de afectados por

un brote de GEA, gastroenteritis aguda (Kapikian et al., 1972). Un año más tarde, Bishop et al.

observaron la presencia de rotavirus en la mucosa duodenal de niños con diarrea aguda (Bishop

et al., 1973), a lo que siguió la identificación de astrovirus y adenovirus entéricos en muestras

de heces de niños enfermos (Madeley et al., 1975; Morris et al., 1975).

Actualmente, se reconoce que los principales virus causantes de diarrea aguda en el ser

humano son rotavirus, calicivirus (norovirus y sapovirus), astrovirus, adenovirus, torovirus,

coronavirus, picobirnavirus, virus Aichi y bocavirus (tabla 4).

Tabla 4. PREVALENCIA DE LOS PRINCIPALES VIRUS

ENTÉRICOS EN LA ESPECIE HUMANA

Rotavirus

Norovirus

Astrovirus

Adenovirus

30-50%

17,3%

15%

1-9%

2.1. ROTAVIRUS

Rotavirus (figura 7) es el principal agente causal de diarrea aguda infecciosa en lactantes

y niños pequeños (especialmente entre los 6 y 24 meses), siendo responsable de un 30 a un 50%

de los episodios en los países desarrollados (Lynch et al., 2003; Dormitzer et al., 2005). Provoca

139 millones de casos y 2 millones de hospitalizaciones al año, es la causa más común de

deshidratación en niños (Glass et al., 1997) y se asocia a un 6% de todas las defunciones que se

producen en niños menores de 5 años y a cerca de medio millón en personas de todas las edades

(Glass et al., 1997; Parashar et al., 2003b).

PRINCIPALES VIRUS ENTÉRICOS. Calicivirus.

__________________________________________________________________________

29

Figura 7. Microfotografía electrónica de viriones de rotavirus procedentes de un filtrado de

muestras de heces de un niño con gastroenteritis (Kapikian et al., 1974).

La cápside externa aparece como un reborde fino que rodea a las protuberancias formadas por las

estructuras de VP6. Las partículas vacías con centro oscuro están exentas de ARN genómico.

2.2. CALICIVIRUS

Los norovirus (NoV) y sapovirus (SaV) son los géneros de la familia Caliciviridae que

pueden producir infecciones intestinales en el hombre.

Los norovirus se han relacionado tanto con episodios esporádicos de diarrea aguda (Pang

et al., 2000), como con epidemias de vómitos y diarrea en campamentos (Jenkins et al., 1985),

residencias infantiles (Tsugawa et al., 2006) y salas de hospitalización (Sder et al., 1986).

Son la principal causa de diarrea aguda epidémica no bacteriana en todas las edades,

excepto en la infancia donde son los segundos en frecuencia tras rotavirus (Moreno-Espinosa et

al., 2004; Treanor et al., 2005). Provocan de un 7 a un 12% de las hospitalizaciones por diarrea

aguda en niños menores de 3 años (Marie-Cardin et al., 2002; Zintz et al., 2005; Murata et al.,

2007) y hasta un 17,3% de los casos en niños menores de 5 años (Junquera et al., 2009), lo que

equivale a 64.000 casos de diarrea aguda que precisan hospitalización, 900.000 visitas médicas

en los países desarrollados y 200.000 fallecimientos en los países en desarrollo en menores de 5

años (Manish et al., 2008).

En España hay pocos datos epidemiológicos de significación clínica en niños, estudios

realizados en Madrid mostraron que NoV fue el responsable de un 11,5% de las diarreas agudas

de origen nosocomial en una Unidad de Lactantes, ocupando el segundo lugar tras rotavirus

(Román et al., 2004), asimismo se obtuvo una incidencia de 7,7% de casos de diarrea aguda

esporádica por NoV en niños menores de 5 años (Román et al., 2002). Otro estudio realizado en

Levante obtiene una incidencia un poco superior, un 14,2% (Buesa et al., 2002).

PRINCIPALES VIRUS ENTÉRICOS. Calicivirus.

__________________________________________________________________________

30

El genogrupo GII es el hallado con mayor frecuencia tanto en éstos como en otros

estudios epidemiológicos. Principalmente el genotipo GII.4, seguido por GII.3, GII.1, GII.7,

GII.2 y GII.16 (Galera Castilho et al., 2006; Khamrin et al., 2007; Nguyen et al., 2007b).

La diarrea aguda por NoV (figura 8) se caracteriza clínicamente por la aparición brusca

de nauseas (79%), vómitos (69%), principalmente en los mayores de un año (Kaplan et al.,

1982a; Gotz et al., 2002) debido a un retraso marcado en el vaciamiento gástrico (Meeroff et al.,

1980), diarrea no sanguinolenta (66%), fiebre (37%) y dolor abdominal (30%). Estudios de la

enfermedad por NoV inducida experimentalmente muestran afectación duodenal, pues revelan

una malabsorción transitoria de grasa, D-xylosa, y lactosa (Blacklow et al., 1972; Schreiber et

al., 1973), una disminución de los niveles enzimáticos del borde en cepillo (trehalasa y fosfatasa

alcalina), estando conservada la actividad de adenilato-ciclasa en el yeyuno (Agus et al., 1973;

Levy et al., 1976) y la secreción gástrica de ácido clorhídrico, pepsina y factor intrínseco

(Meeroff et al., 1980). Se han descrito diferencias notables en cuanto a la gravedad clínica

(Ruuska et al., 1990) y al tiempo de excreción de partículas virales en los niños menores de 2

años y los niños entre 2 y 5 años, siendo los primeros los más afectados (Murata et al., 2007).

En general, las manifestaciones clínicas suelen durar 48 a 72 horas, raramente tienen

consecuencias graves y no evolucionan a cronicidad, salvo en determinados grupos de riesgo.

En pacientes con enfermedades cardiovasculares, tras transplante renal o que reciben terapia

inmunosupresora por otros motivos, la infección por NoV puede producir hipocaliemia, un

incremento de la proteína C reactiva y de la creatinín-fosfoquinasa (Mattner et al., 2006). En el

caso de la enfermedad inflamatoria intestinal se ha relacionado con brotes de la misma (Khan et

al., 2009). Además se ha descrito la persistencia de la infección sintomática durante más de un

año en pacientes pediátricos oncológicos (Simon et al., 2006) y adultos inmunodeprimidos

(Nilsson et al., 2003; Kauffman et al., 2003; Mattner et al., 2006). Así como fallecimientos en

las edades extremas de la vida, recién nacidos (Turcios-Ruiz et al., 2008) y ancianos (Chadwick

et al., 2000).

La aplicación de las técnicas de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa tras

transcripción reversa) para el diagnóstico de NoV ha permitido la identificación de un número

creciente de nuevos diagnósticos. Son cada vez más numerosas las publicaciones acerca de la

infección por NoV en el periodo neonatal (Wiechers et al., 2008; Sommer et al., 2009): el

genotipo GII.3 de NoV ha mostrado una asociación causal con una epidemia de enterocolitis

necrosante (Stuart et al., 2010) y diversas cepas del genogrupo II se han relacionado con la

aparición de apneas en recién nacidos prematuros (Kalmaludden et al., 2009). Además, se ha

notificado la asociación con manifestaciones extraintestinales como episodios convulsivos

(Chen et al., 2009), meningismo y coagulación intravascular diseminada en pacientes de mayor

edad (MMWR, 2002).

PRINCIPALES VIRUS ENTÉRICOS. Astrovirus.

__________________________________________________________________________

31

En cambio, el impacto de los sapovirus (figura 8) como agentes causales de diarrea aguda

en humanos no ha sido del todo establecido. Las publicaciones muestran que los sapovirus

humanos sólo se han encontrado en casos esporádicos y en algún brote epidémico de causa

mixta en la infancia, se ha descrito su asociación a niños con diarrea aguda que acuden a

guarderías (Matson et al., 1990; Grohmann et al., 1991) y escuelas (Miyoshi et al., 2010).

Sin embargo en los últimos años, ha acontecido un cambio epidemiológico en la

infección por sapovirus habiéndose identificado brotes epidémicos también en adultos en

diferentes países: Holanda, Suecia, Eslovenia, Taiwan, Japón y Rusia (Svraka et al., 2010).

Figura 8. Microfotografía electrónica de viriones de norovirus (izquierda) y sapovirus (derecha).

2.3. ASTROVIRUS

Actualmente se conoce que los astrovirus (figura 9) suman hasta un 15% de los casos de

diarrea aguda en la edad pediátrica (Glass et al., 1996; Pang et al., 1999; Dennehy et al., 2001;

Wilhelmi et al., 2003).

Las diarreas por astrovirus suelen ser leves y autolimitadas, se presentan en forma de

casos esporádicos o bien brotes epidémicos en comunidades, hospitales y guarderías (Dalton et

al., 2002; Guix et al., 2002; Espul et al., 2004; Victoria et al., 2007), siendo responsables de

entre un 4,5 a un 16% de la GEA nosocomial (Shastri et al., 1998). Si bien también se han

relacionado con casos de enteritis hemorrágica, diarrea sanguinolenta e incluso enterocolitis

necrosante en recién nacidos pretérmino y a término (Bagci et al., 2010).

Los astrovirus se clasifican en serotipos-genotipos, mostrando muy buena correlación

entre ellos (Wilhelmi et al., 2003). Hasta la fecha se han descrito 8 serotipos-genotipos, de los

cuales el serotipo 1 es el más frecuentemente detectado en la mayoría de estudios (Wilhelmi et

al., 2003), de hecho en España ha sido identificado en un 64% de los casos, seguido por los

serotipos 2 (21%) y 3 (7%), (Guix et al., 2002; Dalton et al., 2003).

PRINCIPALES VIRUS ENTÉRICOS. Adenovirus.

_____________________________________________________________________________

32

Figura 9. Microfotografía de partículas de astrovirus de aproximadamente 30 nm de diámetro en el

contenido intestinal de cordero (Mendez et al., 2007).

2.4. ADENOVIRUS ENTÉRICOS

Los adenovirus entéricos (figura 10) presentan tasas muy variables de infección,

oscilando entre un 1 y un 20% de los casos de diarrea en la infancia (Hermann et al., 1988;

Kotloff et al., 1989; Baum et al., 2005; Farkas et al., 2007), las cifras publicadas en España son

de un 1 a un 9%.

La mayoría de las infecciones intestinales por adenovirus son leves (Wold et al., 2007),

no obstante se han notificado casos de diarrea prolongada por adenovirus 40 y 41 en pacientes

inmunodeprimidos (Treviño et al., 2001). Estos serotipos pertenecen al grupo F y se han

asociado a infecciones intestinales con mayor frecuencia, si bien los serotipos 31, 12 y 18 del

grupo A, así como, 1, 2, 5 y 6 del grupo C también se han visto implicados en estos procesos,

aunque de una forma más excepcional (Brown et al., 1996).

Figura 10. Microfotografía electrónica de adenovirus teñido negativamente (Philipson et al., 1975).

PRINCIPALES VIRUS ENTÉRICOS. Otros virus entéricos.

__________________________________________________________________________

33

2.5. OTROS VIRUS ENTÉRICOS

Los géneros Torovirus y Coronavirus, pertenecientes a la familia Coronaviridae se han

asociado con casos de GEA en humanos.

Los torovirus, descubiertos por primera vez en las heces de niños con gastroenteritis en

1984, se han asociado tanto con casos de diarrea aguda como crónica y podrían ser agentes

etiológicos de la diarrea aguda de origen nosocomial (Beards et al., 1986; Wilhelmi et al.,

2003).

Los coronavirus se identificaron como agentes de diarrea en 1975, lo que ha sido

corroborado en estudios sucesivos hasta el momento actual (Madeley et al., 1975; Widdowson

et al., 2005a; Farkas et al., 2007).

Los picobirnavirus se han encontrado en las heces de una amplia variedad de especies

animales, así como en las de niños y adultos con diarrea, habiéndose descrito su aparición en las

muestras fecales de pacientes inmunodeprimidos (Wilhelmi et al., 2003; Farkas et al., 2007).

Los virus Aichi, pertenecientes al género Kobuvirus de la familia Picornaviridae, se

identificaron por primera vez en las heces procedentes de un brote alimentario en Japón en

1989. En estudios posteriores se han encontrado anticuerpos séricos en población sana en todas

las edades (Yamashita et al., 2000; Ribes et al., 2010).

Los bocavirus humanos, conocidos previamente como agentes de infección respiratoria, se

han asociado recientemente a casos de diarrea aguda en niños. Se plantea que podrían ser

responsables de hasta un 9,1% de los casos de diarrea aguda en niños españoles (Vicente et al.,

2007).

CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS. Antecedentes históricos.

__________________________________________________________________________

34

3. CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS

3.1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS

La identificación de los virus gastrointestinales como agentes etiológicos de la diarrea

aguda fue un largo proceso que requirió varias décadas. Los estudios en voluntarios sanos

desarrollados en los años 40 y 50 en Estados Unidos y Japón cumplieron un papel fundamental

al demostrar que la administración de heces filtradas y libres de bacterias de individuos

enfermos a voluntarios sanos podía desencadenar infección intestinal (Reinman et al., 1945;

Gordon et al., 1947; Kojima et al., 1948; Fukumi et al., 1957; Jordan et al., 1953), numerosos

intentos para cultivar virus a partir de esos filtrados de heces fueron infructuosos y una gran

proporción de las GEA quedaba sin filiar en esa época (Reinman et al., 1945).

En 1972 Kapikian et al., tras investigar un brote de GEA sucedido en un centro escolar de

Norwalk (Ohio) en 1968 (Adler et al., 1969), describieron por primera vez el prototipo de

calicivirus, el virus Norwalk. Estudiaron las deposiciones de voluntarios a los que se había

administrado heces libres de bacterias procedentes de las muestras recogidas a pacientes afectos

en dicho brote (Dolin et al., 1971) e identificaron unas partículas pequeñas (de 27 nm en su

diámetro menor y 32 nm en el mayor), redondeadas y con unas indentaciones en forma de copa

en su superficie. Estas partículas se agregaron mediante suero de un convaleciente usando la

inmunomicroscopía electrónica que permite la observación directa de complejos antígeno-

anticuerpo recubriendo las partículas víricas y facilita su detección (Kapikian et al., 1972). Otras

descripciones posteriores fueron realizadas por Madeley y Cosgrove en 1976 en heces de niños

con gastroenteritis (Madeley et al., 1976), Flewett y Davies en una epidemia de vómitos en una

escuela londinense el mismo año (Flewett et al., 1976) y Cubitt et al. en el intestino delgado de

un niño fallecido por GEA en 1979 (Cubitt et al., 1979; Walker-Smith et al., 1999).

Mediante la inmunomicroscopía electrónica se identificaron otras partículas víricas de

morfología similar pero distintas antigénicamente que se denominaron Hawaii (Thornhill et al.,

1977), Montgomery County, Tawton (Caul et al., 1979) y Snow Mountain (Dolin et al., 1982),

de acuerdo con las regiones geográficas donde se produjeron los brotes epidémicos. Además,

esta técnica permitió la titulación antigénica y la demostración de la relación existente entre las

partículas identificadas en heces y las manifestaciones clínicas (Kapikian et al., 1972). En 1977,

Chiba et al. describieron calicivirus en un brote de GEA en preescolares y escolares residentes

en una casa de acogida en Sapporo (Japón) e identificaron diferencias antigénicas de género con

los virus Norwalk por medio de la inmunomicroscopía electrónica (Nakata et al., 1996), la

producción de suero hiperinmune en cobayas frente a partículas víricas purificadas de virus

Sapporo/82/Japón fue fundamental en su caracterización antigénica. Los virus Sapporo se

convertirían de esta forma en los agentes prototipo del actual género Sapovirus (SaV).

CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS. Taxonomía.

__________________________________________________________________________

35

La laboriosidad de la técnica de la inmunomicroscopía electrónica promovió el desarrollo

del radioinmunoensayo (RIA), inicialmente para el virus Norwalk (Greenberg et al., 1981) y

posteriormente para las partículas de Snow Mountain (Dolin et al., 1986). Asimismo en 1986,

Treanor et al. desarrollaron un anticuerpo monoclonal para el agente Snow Mountain (Treanor

et al., 1986) y a continuación para el virus Norwalk y otros, lo que simplificó los métodos de

detección.

3.2. TAXONOMÍA

El denominado virus Norwalk, se considera actualmente el prototipo del género

Norovirus. Pertenece a la familia Caliciviridae junto con los géneros Sapovirus, Lagovirus y

Vesivirus (Tabla 5), recientemente se ha propuesto la inclusión del género Nebovirus (Patel et

al., 2002).

Los principales agentes patógenos humanos de esta familia son NoV y SaV, como

patógenos exclusivamente animales se incluyen lagovirus (LaV) que causan enfermedad

hemorrágica letal en conejos (RHDV, “Rabbit haemorrhagic disease virus”) y vesivirus (VeV),

como los calicivirus felinos (FCV), que causan infección respiratoria en gatos.

Tabla 5. CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE CALICIVIRUS

GÉNERO ESPECIE CEPA REPRESENTATIVA

Norovirus (NoV) Norwalk virus (NV) Hu/NoV/GI.1/Norwalk/1968/US

Sapovirus (SaV) Sapporo virus (SV) Hu/SaV/GI.1/Sapporo/1982/JP

Lagovirus (LaV)

Virus de la enfermedad

hemorrágica del conejo

(RHDV)

Ra/LaV/RHDV/GH/1988/DE

Virus del síndrome de la

liebre parda europea

(EBHSV)

Ha/La/EBHSV/GD/1989/FR

Vesivirus (VeV)

Virus del exantema

vesicular porcino

(VESV)

Sw/VeV/VESV/A48/1948/US

Calicivirus felino (FCV) Fe/VeV/FCV/F9/1958/US

CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS. Estructura del virión.

__________________________________________________________________________

36

En la tabla 5 los criptogramas están organizados de la siguiente forma: especie huésped

de la cual se ha obtenido el virus / género / especie (o genogrupo) / nombre de la cepa / año de

detección / país de origen. Las siglas correspondientes a las abreviaturas en inglés de las

especies huésped y los países son las siguientes: Fe (felino), Ha (liebre), Hu (humano), Sw

(cerdo), Ra (conejo), DE (Alemania), FR (Francia), JP (Japón) y US (Estados Unidos).

3.3. ESTRUCTURA DEL VIRIÓN

3.3.1. Estructura tridimensional del virión nativo

Los viriones de calicivirus exhiben una simetría icosaédrica con T=3. La cápside contiene

90 dímeros de la proteína de cápside y forma una cubierta compuesta por 90 capsómeros

dispuestos a modo de protuberancias arciformes (Prasad et al., 1994a; 1994b; Prasad et al.,

1996; Prasad et al., 1999; Chen et al., 2004), formando 32 cavidades que dan apariencia de

cálices a la superficie de la partícula viral.

La crioinmunomicroscopía electrónica, la cristalografía con rayos X y los estudios de

procesamiento de imagen de calicivirus han mostrado diferencias sutiles en la estructura de las

cápsides de los diferentes géneros de calicivirus (Chen et al., 2004). No obstante, todos ellos

responden a la apariencia de “virus pequeños y redondos” enunciada a partir de las imágenes

clásicas por microscopía óptica de campo oscuro (Prasad et al., 1994a; 1994b).

3.3.1 1. Estructura del genoma

Los virus de la familia Caliciviridae tienen un genoma constituído por una sola cadena de

ARN (ssRNA, “single stranded RNA”) de sentido positivo, de un tamaño aproximado de 7,3 a

8,5 Kb. Poseen dos o más pautas abiertas de lectura (ORF, “open reading frame”) según el

género, que contienen los genes que codifican las proteínas estructurales y no estructurales,

como muestra la figura 11 (Meyers et al., 1991; Herbert et al., 1996; Morales et al., 2004; Neill

et al., 2002).

En cuanto a los NoV, el ORF1 codifica la poliproteína precursora de las proteínas no

estructurales, mientras que los ORF2 y ORF3 codifican la proteína mayor de la cápside (VP1) y

la proteína menor de la cápside (VP2), respectivamente. Los VeV también codifican VP1 en una

ORF separada (ORF2), mientras que los SaV y LaV lo hacen en un locus contiguo al de las

poliproteínas grandes no estructurales del ORF1 (Cauchi et al., 1992; Seah et al., 1999; Cauchi

et al., 1999).


__________________________________________________________________________

37

Figura 11. Organización genómica de Calicivirus (Green et al., 2007).

3.3.1.2. Proteínas virales estructurales

En los viriones maduros de calicivirus se identifican tres proteínas, denominadas VP

(“viral protein”, proteína viral): VP1, VP2 y VPg (“viral protein genome-linked”, proteína unida

al genoma viral), figura 12 (Sosnovtsev et al., 2000).

La principal proteína estructural es VP1, de aproximadamente 60.000 daltons (Da) y

presente en 180 copias (90 dímeros) por virión. El predominio de VP1 en la formación de la

estructura de la cápside vírica explica su papel como sitio de unión a los receptores de las

células del huésped, lo que se atribuye a su fracción P2 (Green, 2007).

La VP2 es variable en tamaño entre los calicivirus (12.000 a 29.000 Da) y también difiere

en su secuencia genética entre los diferentes géneros (Cauchi et al., 1992; Seah et al., 1999). Es

considerada una proteína estructural menor porque sólo está presente en una o dos copias por

virión y su función no se conoce con exactitud (Wirblich et al., 1995; Glass et al., 2000;

Sosnotsev et al., 2000; Glass et al., 2003), aunque se cree que la presencia de VP2 aumenta la

eficiencia de la expresión de VP1 y mejora la estabilidad (Sosnovtsev et al., 2005) y maduración


__________________________________________________________________________

38

de dicha partícula (Bertolotti-Ciarlet et al., 2003). De hecho, se ha descrito la interacción entre

las proteinas VP1 y VP2 tanto para NoV (Glass et al., 2003) como para calicivirus felinos

(Kaiser et al., 2006), lo que apoya su participación en estas funciones. Además, se han

identificado diferencias entre las VP2 de las VLPs recombinantes y los viriones nativos en

cuanto a peso molecular (PM), 23 KDa y 35 KDa, respectivamente. Lo que sugiere que las

proteínas de los viriones nativos podrían desempeñar otras funciones que desconocemos

(Bertolotti-Ciarlet et al., 2003).

Figura 12. Estructura de la cápside y proteínas estructurales de norovirus (Green et al., 2007).

La VPg se halla unida por enlace covalente al ARN genómico y subgenómico de las

células infectadas (Dunham et al., 1998), su presencia es minoritaria con una o dos copias por

virión (Schaffer et al., 1980; Sosnovtsev et al., 2002) y aunque se encuentra integrada en la

partícula viral es probable que su función sea principalmente la de una proteína no estructural

durante la replicación.

3.3.1.3. Proteínas virales no estructurales

Las proteínas no estructurales de los calicivirus (tabla 6) provienen de la escisión de una

gran poliproteína codificada en el ORF1 cuyo PM es de 200 KDa (Liu et al., 1999b;

Sosnovtseva et al., 1999). Los procesos de escisión son mediados por una proteinasa específica,

la 3C proteinasa (Boniotti et al., 1994), que actúa en puntos de restricción concretos descritos en

cepas del género Norovirus (Liu et al., 1996; Liu et al., 1999b), Vesivirus (Sosnovtsev et al.,

2002), Lagovirus (Wirblich et al., 1996; Konig et al., 1998) y Sapovirus (Oka et al., 2005).


__________________________________________________________________________

39

Se observan algunas variaciones entre las diferentes estrategias de proteolisis de los

calicivirus, pero de forma global coinciden en el orden genómico de las proteínas no

estructurales: (a) en el caso de los NoV, estudios en el virus Southampton han permitido definir

cinco puntos de corte en la poliproteína ORF1 por lo que se ha descrito que liberan seis

productos maduros (Liu et al., 1996; Liu et al., 1999b), (b) los lagovirus, representados por el

RHDV, tienen el máximo número de puntos de escisión: seis, lo que resulta en siete fragmentos

finales denominados NS1 a NS7 (NS, “non structural”, no estructural).

Tabla 6. PROTEÍNAS NO ESTRUCTURALES DE CALICIVIRUS (Sosnovtsev et al., 2006)

PROTEÍNA FUNCIÓN

NS1 Desconocida

NS2 Desconocida

NS3 NTPasa

NS4 Desconocida

NS5 VPg

NS6 Proteinasa

NS7 ARN-polimerasa ARN dependiente

La disponibilidad de los mapas de escisión de las proteínas no estructurales de calicivirus

ha permitido dilucidar la estructura tridimensional y la función de estas proteínas

individualmente (Hardy et al., 2005). Las funciones de las tres proteínas no estructurales

principales de los calicivirus se infirieron a partir de secuencias de picornavirus, la 2C helicasa,

la 3C proteinasa y la 3D ARN-polimerasa dependiente de ARN (Neil et al., 1990). Los estudios

bioquímicos confirmaron actividades análogas en las proteínas de calicivirus que corresponden

a las proteínas NS3 NTPasa (función nucleótido-trifosfatasa), NS6 Pro (con función proteinasa.

Prasad et al., 1999), NS5 (con función VPg) y la NS7 Pol (con función ARN-polimerasa

dependiente de ARN). Tanto la similitud en cuanto al orden genómico de las proteínas no

estructurales, como la fuerte homología en ciertos fragmentos sugieren un ancestro común para

calicivirus y picornavirus.


__________________________________________________________________________

40

3.3.2. Estructura de las partículas pseudovíricas

El ensamblaje de la proteína de la cápside VP1 en partículas pseudovíricas (VLPs) es un

proceso eficiente que no requiere ni ARN (Jiang et al., 1992b) ni la proteína menor de la cápside

VP2 (Laurent et al., 1994; Leite et al., 1996). Se ha descrito que la proteína de la cubierta S de

NoV contiene todo lo necesario para iniciar el ensamblaje de la cápside de la partícula

pseudovírica, mientras que el dominio protuberante P contribuye a incrementar la estabilidad de

la cápside añadiendo contactos intermoleculares entre las subunidades diméricas y limitando su

tamaño (Bertolotti-Ciarlet et al., 2002).

La estructura atómica de las VLPs (“virus like particles”, partículas pseudovíricas)

recombinantes de NoV se ha determinado mediante cristalografía con rayos X, definiendo dos

dominios principales en VP1, la cubierta S y la protuberancia P (Prasad et al., 1999).

El dominio S forma la parte interna de la cápside que envuelve al genoma de ARN y

mantiene los contactos icosaédricos de la estructura en T=3 y el dominio P forma las

protuberancias arciformes que surgen de la cubierta y contienen los dímeros de contacto (Prasad

et al., 1999).

Al comparar las secuencias de aminoácidos correspondientes a estos dominios en

diferentes genotipos de NoV (figura 13) se observa que el dominio S (región N-terminal de

VP1: aminoácidos 1-225) está relativamente conservado, mientras que el dominio P (fracción

C-terminal de VP1: aminoácidos 226-530) presenta una naturaleza aminoacídica más variable.

Además, el dominio P se encuentra dividido en el subdominio P1 (aminoácidos 226-278 y 406-

530) y el subdominio P2 (aminoácidos 279-405). Este último es la región de VP1 con mayor

variabilidad secuencial, por lo que se le atribuye la especificidad antigénica y la unión a

receptores (Hardy et al., 1996; White et al., 1996; Prasad et al., 1999; Nilsson et al., 2003; Tan

et al., 2003; Lochridge et al., 2005).

Figura 13. Correspondencia entre dominios del genoma y secuencia aminoacídica (Green et al.,

2007).

CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS. Biología del virus.

_____________________________________________________________________________

41

3.4. BIOLOGÍA DEL VIRUS

3.4.1. Cultivos celulares

La clasificación inicial para los denominados virus pequeños, redondos y estructurados

(SRSV, “small round structured virus”) fue descrita por Caul y Appleton en 1982 (Caul et al.,

1982), basándose en su tamaño y morfología. Sin embargo, la imposibilidad de aislar el virus en

cultivo celular no permitió progresar en su conocimiento hasta el desarrollo de técnicas

moleculares. No obstante, podemos afirmar que actualmente no existe ningún cultivo celular

para el aislamiento de NoV, a pesar de los grandes esfuerzos realizados durante décadas para

mimetizar la fase exacta de diferenciación de las células epiteliales intestinales y de reproducir

las condiciones ambientales originarias en un sistema de cultivo celular para NoV (Duizer et al.,

2004b) y SaV humanos, asimismo tampoco hay un modelo animal disponible, lo que dificulta

su estudio.

El reciente descubrimiento de que un miembro del género NoV, el NoV murino (MNV),

es capaz de replicarse en cultivos celulares y de infectar ratones (Karst et al., 2003) ha supuesto

un avance indudable en el conocimiento de este género de virus. El NoV murino crece en

células dendríticas y macrófagos de origen murino y forma placas en células RAW264.7, una

línea celular continua de estirpe macrofágica, figura 14 (Wobus et al., 2004). Sin embargo, su

replicación no constituye un modelo experimental de la patogenia de los NoV humanos

(Chaudry et al., 2007).

Figura 14. Tinción específica de MNV-1 en células de estirpe macrofágica (Wobus et al., 2004).

La aplicación de técnicas de inmunohistoquímica a secciones de hígado de ratones STAT1 -/- dos

días tras la infección oral mostró una tinción específica para MNV-1 en las células de Kupfer de los

hígados infectados al exponerse a suero de MNV-1 inmune y no preinmune.


_____________________________________________________________________________

42

Se planteó que la creación de un sistema de células epiteliales intestinales que reprodujera

las condiciones fisiológicas del huésped in vivo, permitiría el desarrollo de un modelo

patogénico para los NoV humanos. Esta hipótesis llevó a diseñar un sistema tridimensional para

propagar NoV, mediante el crecimiento de células en tres dimensiones sobre una estructura de

colágeno adyacente a un sistema rotatorio. Se basaba en el principio de que órganos y sistemas

funcionan en un ambiente tridimensional y que este contexto espacial es necesario para el

desarrollo de cultivos celulares que mimeticen los tejidos y órganos de los que proceden (Straub

et al., 2007). Los resultados descritos por este estudio fueron aparentemente muy satisfactorios,

sin embargo no han podido ser reproducidos en otros laboratorios posteriormente.

Respecto a otros géneros, el calicivirus entérico porcino (PEC), un SaV, puede

propagarse en líneas celulares pero para una replicación óptima es necesario un medio de

crecimiento que incluya el contenido intestinal de un cerdo gnotobiótico (Flynn et al., 1988b).

Los ácidos biliares son un factor esencial entre los componentes de dicho contenido intestinal,

pues adicionados en exclusiva al medio de cultivo celular son capaces de mantener su

replicación (Chang et al., 2004). Es también el caso del calicivirus canino que precisa la adición

de tripsina para su crecimiento (Schaffer et al., 1985). En cuanto a los vesivirus crecen en

cultivo celular de fibroblastos de riñón, pero los lagovirus no crecen en líneas celulares aunque

se ha conseguido infectar in vitro hepatocitos de conejo (Konig et al., 1998).

3.4.2. Modelos animales

Se han realizado numerosos intentos para desarrollar un modelo animal de enfermedad

que permita el estudio de las GEA humanas por NoV. Repetidos ensayos no fueron capaces de

inducir enfermedad tras su introducción en el tracto alimentario de ratones, cobayas, conejos,

gatos, terneros y diferentes especies de primates salvajes (Blacklow et al., 1972; Dolin et al.,

1972; Wyatt et al., 1977; Wyatt et al., 1978), de hecho en chimpancés a los que se inocularon

NoV se identificó una respuesta serológica por medio de radioinmunoensayo y antígeno en

heces, pero no desarrollaron enfermedad clínica en ningún momento (Wyatt et al., 1978; Jiang

et al., 2004a; 2004b; Rockx et al., 2005a). Se planteaba que esto podía deberse a que las cepas

virulentas de NoV fueran endémicas en primates salvajes.

Sin embargo, estudios más recientes sí han demostrado el desarrollo de enfermedad

sintomática en animales expuestos oralmente a NoV humanos. Macacos de cola de cerdo recién

nacidos expuestos oralmente con filtrado de heces humanas con NoV GII.3 presentaron diarrea

(Subekti et al., 2002), al igual que lechones gnotobióticos expuestos a NoV humanos GII.4 en

los que además se encontraron evidencias de replicación del virus en los enterocitos (Cheetham

et al., 2006).


_____________________________________________________________________________

43

Otra aproximación en el desarrollo de un modelo patogénico animal para NoV se ha

centrado en el estudio de la infección animal por calicivirus homólogos. Se han detectado NoV

en las heces de ratones (cepa MNV-1. Karst et al., 2003), cerdos (cepa SW418. Sugieda et al.,

1998) y ganado bovino (virus Jena. Liu et al., 1999a), lo que sugiere que existe replicación en su

tracto intestinal. A raíz de ello se ha podido emplear un modelo de NoV bovino para la

evaluación de las vacunas candidatas con VLPs de NoV (Han et al., 2006).

3.4.3. Avances moleculares

El desarrollo de las técnicas de biología molecular ha constituido el punto de partida para

aumentar nuestro conocimiento acerca de los mecanismos de replicación y el impacto real de la

enfermedad por NoV.

3.4.3.1. Clonación del genoma

Uno de los avances más importantes lo constituyó en 1990 la clonación del genoma del

virus Norwalk por Jiang et al. a partir de viriones parcialmente purificados de material fecal

humano (Jiang et al., 1990). Esto permitió aplicar las técnicas de reacción en cadena de la

polimerasa tras transcripción reversa (RT-PCR) y de secuenciación al estudio de estos virus,

además de expresar in vitro proteínas víricas en sistemas de procariotas y eucariotas.

Basándose en estas técnicas, se segregaron los NoV en dos grupos filogenéticos que se

denominaron genogrupos I (GI) y II (GII), Norwalk formaba parte del GI y Hawaii y Snow

Mountain pertenecían al GII (Lew et al., 1994b; 1994c; Wang et al., 1994). Actualmente, se

clasifican los NoV en cinco genogrupos con 29 genotipos o clusters: 8 en GI, 17 en GII, 2 en

GIII y 1 en GIV y GV, basándose en el análisis filogenético de las secuencias de aminoácidos

para la proteína de cápside de 164 cepas de NoV (Zheng et al., 2006; Buesa et al., 2008). Las

cepas que infectan a los seres humanos pertenecen a los genogrupos I, II y IV, mientras que a

los genogrupos III y V pertenecen las cepas que infectan a los animales.

Las cepas de cada genotipo, definidos por tener al menos un 80% de identidad de los

aminoácidos sobre la secuencia total de la cápside, se pueden subdividir a su vez en variantes

según las secuencias y los análisis filogenéticos. Análisis efectuados en Europa con más de mil

NoV asociados a brotes han mostrado una marcada variación genética y es el genogrupo II y en

particular el genotipo GII.4 el predominante (Noel et al., 1999).

3.4.3.2. Producción de partículas pseudovíricas

Otro de los grandes avances en la investigación de los NoV lo constituye la replicación de

la proteína viral 1 (VP1) de la cápside en sistemas de expresión, como la producción de

partículas pseudovíricas en células de insecto de Spodoptera frugiperda (Sf9) con baculovirus

recombinantes expresando la proteína VP1 (ORF2) de NoV, figura 15 (Jiang et al., 1992b) o


_____________________________________________________________________________

44

con un vector del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE. Harrington et al., 2002)

mediante la expresión del dominio P de la cápside en Escherichia coli (Tan et al., 2005c; Tan et

al., 2004).

Las partículas pseudovíricas (VLPs) muestran una morfología (Prasad et al., 1994a;

1994b) y antigenicidad (Green et al., 1993) similares a las del virión infectivo. Además, ha sido

posible expresar VLPs de diferentes genogrupos lo que ha permitido demostrar sus diferencias

antigénicas (Jiang et al., 1995a; 1995b), dada la imposibilidad de desarrollar ensayos de

neutralización (Hansman et al., 2005).

Las VLPs recombinantes se han utilizado en muchas áreas de la investigación de NoV: el

desarrollo de métodos diagnósticos (Jiang et al., 2000), los estudios estructurales de la cápside

(Venkataram et al., 2000), el análisis de la unión e interacciones con el receptor (White et al.,

1996; Marionneau et al., 2002; Hutson et al., 2003), la investigación de las relaciones

antigénicas (Hansman et al., 2006) y el desarrollo de vacunas (Estes et al., 2000).

Figura 15. Microfotografías electrónicas de tinción negativa de la partícula P.

(A) Partícula P del mutante de VA387 H/P-CDCRGDCFC purificada por FPLC (“Fast protein

liquid chromatography”). Las flechas indican la típica estructura del anillo pentagonal de la

partícula P. La parte central de la imagen A se ha ampliado en la imagen B. (C) VLPs de VA387

purificadas por gradiente de sacarosa.


_____________________________________________________________________________

45

3.4.3.3. Aplicación de la genética reversa

La aplicación de la genética reversa al estudio de los NoV supone un gran avance, pues la

habilidad de generar NoV definidos genéticamente en cultivos tisulares podría proporcionar una

oportunidad para comprender la relación entre los mecanismos básicos de replicación del NoV

en cultivo tisular y su patogénesis en el huésped natural, así como entre sus características

estructurales y propiedades funcionales (Sosnovtsev et al., 1995; Sosnovtsev et al., 1998; Neil et

al., 2000; Sosnovtsev et al., 2002; Thumfarte et al., 2002; Chang et al., 2005).

El sistema de genética reversa se desarrolló inicialmente para el calicivirus felino

(Sosnovtsev et al., 1995), el calicivirus entérico porcino (Chang et al., 2002) y el recientemente

identificado NoV murino (Karst et al., 2003). Sin embargo, hasta la fecha, ningún sistema de

genética reversa ha sido descrito para NoV humanos. Las publicaciones en relación con NoV

murino describen un sistema de expresión por medio del virus vacuna (Anasaka et al., 2005;

Katayama et al., 2006), este sistema (basado en la ARN-polimerasa T7) no permite la

recuperación del NoV murino debido a un efecto inhibitorio de la infección del virus vacuna en

su replicación. En cambio, el sistema de ARN-polimerasa del virus de la viruela aviar, que ha

resultado efectivo para la recuperación del virus de la gripe aviar (Casais et al., 2001), el virus

de la enfermedad de Newcastle (Peeters et al., 1999), el virus de la peste bovina (Das et al.,

2000) y el virus de la bursitis infecciosa aviar (Boot et al., 1999) sin mostrar un efecto deletéreo

en su replicación, ha demostrado también ser útil en la recuperación de NoV murinos definidos

genéticamente en cultivo tisular (Chadry et al., 2007). Gracias a ello han podido identificarse

estructuras genómicas importantes para su replicación (Simmonds et al., 2008), determinantes

de virulencia de su cápside (Bailey et al., 2008) y la región 3’ de su genoma viral (Bailey et al.,

2010).

Recientemente se ha publicado una nueva estrategia para obtener NoV murinos

modificados genéticamente mediante técnicas de genética reversa que se basan en la

transfección con transcritos de ARN con “cap” directamente en las células (Yunus et al., 2010).

3.4.4. Desarrollo de vacunas

Una de las estrategias más prometedoras en cuanto al desarrollo de vacunas protectoras

frente a NoV, consiste en el desarrollo de VLPs recombinantes de NoV producidas en células

Sf9 y plantas. Estas vacunas han mostrado ser inmunógenas y seguras en ratones y humanos tras

su administración oral e intranasal, mostrando una respuesta de producción de anticuerpos tanto

a nivel local como sistémico, sin riesgo de desarrollar la enfermedad (Ball et al., 1999; Tacket et

al., 2003; Tacket et al., 2000; Herbst-Kralovetz et al., 2010).

Otro aspecto a considerar en cuanto al diseño de estas vacunas es el de los genotipos de

NoV que son diana de protección por la vacuna, parece que la vacunación multivalente podría

CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS. Diagnóstico.

_____________________________________________________________________________

46

proporcionar una mayor protección frente a un espectro más amplio de NoV que la vacunación

monovalente (LoBue et al., 2006). Además, la respuesta vacunal implica la proliferación de las

células T CD4+, T CD8

+ y B de forma específica según los tejidos (Chachu et al., 2008).

Por tanto, todavía existen muchos retos en el desarrollo de una vacuna efectiva y segura,

como son nuestro insuficiente conocimiento de la relación entre inmunidad y protección, la

breve duración de la inmunidad, la ausencia de protección cruzada y la existencia de múltiples

tipos genéticos y antigénicos de NoV.

3.5. DIAGNÓSTICO

3.5.1. Diagnóstico presuntivo

Ante la ausencia de procedimientos diagnósticos certeros, en 1982 Kaplan y sus

colaboradores establecieron unos criterios epidemiológicos que han demostrado su utilidad para

sospechar de los NoV como causa de un brote de gastroenteritis aguda, tabla 7 (Kaplan et al.,

1982a). Estos criterios han sido validados al resultar razonablemente sensibles y altamente

específicos para diferenciar clínicamente los brotes por NoV de los debidos a otras causas

(Turcios et al., 2006).

Tabla 7. CRITERIOS DE KAPLAN (Kaplan et al., 1982a)

Más de la mitad de los afectados evolucionan con vómitos

El periodo de incubación es de 24-48 horas

La duración de la enfermedad es de 12 a 60 horas

No se identifican patógenos bacterianos en los coprocultivos

3.5.2. Diagnóstico de laboratorio

3.5.2.1. Microscopía electrónica directa e inmunomicroscopía electrónica

Si bien la microscopía electrónica directa fue inicialmente el único método disponible

para el diagnóstico de los calicivirus, presenta una serie de limitaciones que la han relegado hoy

en día a un uso excepcional para el diagnóstico: (a) la detección de virus en muestras fecales

requiere concentraciones del orden de 106 partículas por ml (Doane et al., 1994). El escaso

número de viriones presentes en las heces de niños mayores de 2 años y adultos explica la baja

sensibilidad en ellos, por lo que es recomendable el empleo de la inmunomicroscopía

electrónica o la inmunomicroscopía electrónica en fase sólida en este grupo de edad (Kapikian


_____________________________________________________________________________

47

et al., 1980), si bien dado que tanto rotavirus como NoV son eliminados en grandes cantidades

en las heces de los niños de entre 6 y 24 meses podría utilizarse en el diagnóstico etiológico de

la GEA en este rango de edad (Brandt et al., 1981) (b) asimismo, precisa de microscopistas

experimentados y de un equipo caro, por lo que no es factible para estudios epidemiológicos o

clínicos extensos. No obstante, podría ocupar un lugar como herramienta diagnóstica de casos

esporádicos; (c) el momento de la recogida de las heces es crítico en el éxito de la detección

vírica, es posible detectar los virus en gran parte de las muestras recogidas durante las primeras

72 horas tras el establecimiento de la enfermedad, pero solamente en un número mínimo de

muestras fecales recogidas superado dicho periodo (Thornhill et al., 1975).

La inmunomicroscopía electrónica presenta limitaciones similares, a pesar de que fue

inicialmente diseñada para la detección de NoV. Es capaz de identificar NoV en tan sólo la

mitad de las muestras fecales provenientes de estudios de voluntarios sanos que desarrollaron

enfermedad clínica tras la exposición a NoV (Thornill et al., 1975) y en un tercio de las heces

obtenidas de brotes epidémicos de GEA por NoV en individuos que presentaron respuesta

serológica frente a él (Kaplan et al., 1982b), lo que puede explicarse por una concentración de

virus insuficiente en las muestras y/o el momento de la recolección de las mismas.

3.5.2.2. Ensayo de hemaglutinación por inmunoadherencia y radioinmunoensayo

El ensayo de hemaglutinación por inmunoadherencia frente a NoV se desarrolló para

permitir la evaluación de los niveles de anticuerpos en un número amplio de muestras de suero

y permitir el desarrollo de estudios epidemiológicos de seroprevalencia (Kapikian et al., 1978).

Fue rápidamente reemplazado por el radioinmunoensayo pues precisa menos antígeno y es más

sensible (Greenberg et al., 1978a; 1978b; Kapikian et al., 1996).

El radioinmunoensayo emplea suero preinfección y de estado de convalecencia de un

voluntario infectado experimentalemente con NoV del que se conoce que presenta una alta

titularidad de anticuerpos (por medio de inmunomicroscopía electrónica o hemaglutinación por

inmunoadherencia) para capturar el virus en pocillos. Emplea IgG purificada de dicho individuo

marcada con I125

para detectar las partículas virales de la muestra problema.

3.5.2.3. Enzimoinmunoensayos

La producción de VLPs recombinantes de calicivirus humanos ha permitido el desarrollo

de nuevos métodos de inmunoensayo (Jiang et al., 2000; Atmar et al., 2001).

El enzimoinmunoensayo para la detección de antígenos de NoV en muestras fecales

presenta una sensibilidad similar a la observada en el radioinmunoensayo (Hermann et al., 1985;

Madores et al., 1986; Glass et al., 2000), con la ventaja adicional de la mayor estabilidad de los

reactivos empleados. El desarrollo de las técnicas de enzimoinmunoensayo mediante la


_____________________________________________________________________________

48

producción de suero policlonal hiperinmune, tras la inmunización de diferentes especies

animales con VLPs, se ha utilizado para la detección de antígenos en diferentes muestras

clínicas (Jiang et al., 1995a; 1995b; Hale et al., 1999). El suero policlonal hiperinmune es

bastante específico, pues permite la detección de VLPs recombinantes inmunizantes homólogas,

pero no heterólogas, y además los ensayos en que se emplea alcanzan una sensibilidad

comparable a la de la RT-PCR (Graham et al., 1994; Jiang et al., 1995c ; Kamata et al., 2005).

Una limitación de estos ensayos aparece en su aplicación a muestras clínicas, es el caso del

ensayo de detección que utiliza suero hiperinmune frente a VLPs de virus Norwalk pues sólo

detecta algunos de los virus de genogrupo I y no es capaz de detectar los de genogrupo II (Lew

et al., 1994a; Jiang et al., 1995a; 1995b), además no existe ningún enzimoinmunoensayo que

emplee suero policlonal comercializado en la actualidad.

En los últimos años, se ha avanzado enormemente en el desarrollo de anticuerpos

monoclonales específicos para cada genogrupo de NoV para su aplicación en los ensayos de

detección de antígenos virales en muestras clínicas (Hermannn et al., 1995; Hardy et al., 1996;

Hale et al., 2000; Kitamoto et al., 2002; Yoda et al., 2003; Parker et al., 2005). Estos han

mostrado tanto una elevada especificidad frente al genotipo concreto de NoV inmunizante,

como una sensibilidad que duplica la alcanzada por las técnicas de enzimoinmunoensayo que

emplean suero policlonal hiperinmune (Herrman et al., 1995). Recientemente se ha descrito un

epítopo común para el genogrupo I de NoV, que ha permitido la detección antigénica con una

reactividad amplia para todos los NoV de este genogrupo (Hale et al., 2000), sería deseable el

mismo objetivo en los NoV de genogrupo II pues permitiría la valoración de un gran número de

muestras de una forma rápida y eficiente.

Asimismo, existen kits comerciales basados en la detección de antígenos de NoV por

métodos inmunoenzimáticos. Poseen una elevada especificidad, pero una moderada

sensibilidad, y resultan especialmente útiles cuando hay que diagnosticar brotes de

gastroenteritis de los que se dispone de muchas muestras, en esta situación la detección fiable

del virus en unos pocos casos es suficiente para la confirmación de la etiología de la enfermedad

(Gray et al., 2007), en caso contrario, se recomienda el estudio por técnicas de RT-PCR si se

mantiene un alto índice de sospecha. En España existen dos ensayos inmunoenzimáticos

comercializados para diagnosticar infecciones por NoV, IDEIA Norovirus (Oxoid, Thermo

Fisher Scientific) y RIDASCREEN Norovirus (R-Biopharm). En comparación con la RT-PCR

la especificidad de estos ensayos fue de 93,91 y 96,37% y la sensibilidad de 58,93 y 43,81%,

respectivamente. Más reciente es un método rápido consistente en un ELISA de membrana que

detecta cepas de los genogrupos I y II (RIDA QUICK Norovirus, R-Biopharm).


_____________________________________________________________________________

49

Debido a las dificultades técnicas, hasta ahora no se había desarrollado ninguna técnica

inmunocromatográfica para el diagnóstico rápido de NoV, como las existentes para rotavirus.

Los kits recientemente desarrollados muestran una sensibilidad cercana al 100% y una

especificidad del 75% (Nguyen et al., 2007a; Khamrin et al., 2009).

En cuanto a los ensayos de ELISA que utilizan las VLPs recombinantes para la detección

de anticuerpos destacar su sensibilidad y especificidad para detectar la respuesta inmunitaria

frente a calicivirus humanos. Se encuentran títulos de anticuerpos totales anti-NoV hasta 40

veces superiores por enzimoinmunoensayo con VLPs recombinantes que por medio del

radioinmunoensayo o la inmunomicroscopía electrónica (Green et al., 1993; Monroe et al.,

1993). El ensayo de ELISA con VLPs de virus Norwalk es capaz de detectar respuestas de

anticuerpos en voluntarios a los que se administraron virus Norwalk, Hawaii, y Snow Mountain

(Monroe et al1993; Treanor et al., 1993; Graham et al., 1994), pero no permite discernir entre

genotipos de NoV por la existencia de anticuerpos con reactividad cruzada (Noel et al., 1997;

Belliot et al., 2001).

3.5.2.4. Reacción en cadena de la polimerasa tras transcripción reversa

Hasta 1993 el principal método diagnóstico disponible era la microscopía electrónica, sin

embargo el conocimiento del genoma del virus Norwalk condujo rápidamente al diseño de los

cebadores de la región polimerasa que permitieron la amplificación de fragmentos de otros

calicivirus y la secuenciación de los mismos (De Leon et al., 1992; Jiang et al., 1992a).

En la actualidad la reacción en cadena de la polimerasa tras transcripción reversa (RT-

PCR) se ha convertido en la técnica de referencia para el diagnóstico de NoV, pues permite una

rápida detección en muestras clínicas (heces o vómitos) y ambientales (alimentos contaminados,

agua o fómites. Moe et al., 1994; Atmar et al., 2001), así como la comparación de los niveles de

ARN (Kageyama et al., 2003).

No sólo es extremadamente sensible sino específica, ya que permite detectar y diferenciar

entre genogrupos I y II. Además, la secuenciación de los amplificados permite identificar el

genotipo del aislado al comparar la secuencia con otras que han sido depositadas en bases de

datos como la base europea de NoV disponible en <https://hypocrates.rivm.nl/bnwww/Divine-

Event/index.html>. Por ello resulta particularmente útil en los estudios epidemiológicos para

descubrir el origen de un brote o caracterizar cepas y se ha utilizado ampliamente en este

contexto.

Hay varias consideraciones para el desarrollo óptimo de estas técnicas (Atmar et al.,

2001): (a) en primer lugar, el procedimiento de extracción de ARN debe permitir la purificación

del ARN viral sin haber sufrido degradación y estar libre de inhibidores de la reacción, para ello

https://hypocrates.rivm.nl/bnwww/Divine-Event/index.html

https://hypocrates.rivm.nl/bnwww/Divine-Event/index.html

CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS. Epidemiología.

_____________________________________________________________________________

50

se recomienda usar en el ensayo controles internos de ARN que evitarían la aparición de falsos

negativos (Schwab et al., 1997; Parshionikar et al., 2004); (b) en segundo lugar, la elección de

los cebadores es fundamental pues de ellos depende la sensibilidad y especificidad del ensayo.

La mayoría de los cebadores han sido diseñados para detectar la región más conservada de la

ARN-polimerasa ARN-dependiente (Moe et al., 1994; Wang et al., 1994; Ando et al., 1995;

Green et al., 1995; Matson et al., 1995; Le Guyader et al, 1996; Berke et al., 1997; Jiang et

al.,1999; Schwab et al., 2000), aunque otras regiones del genoma viral han sido también objeto

de amplificación como la 2C-helicasa, la región de la cápside y el ORF3 (Matsui et al., 1991;

De Leon et al., 1992; Moe et al., 1994; Wang et al., 1994; Green et al., 1997; Hafliger et al.,

1997; Noel et al., 1997); (c) el uso de la PCR “nested o semi-nested” es un método que permite

aumentar la probabilidad de detectar NoV (Sugieda et al., 1996; Green et al., 1998; Ohyama et

al., 1999), utiliza dos rondas de amplificación de PCR empleando uno (“semi-nested”) o ambos

(“nested”) cebadores en la segunda ronda dirigidos hacia la región del genoma objetivo en la

amplificación inicial. Resulta 10 a 1.000 veces más sensible que la RT-PCR de una ronda única

(Green et al., 1998) y ha sido empleada para detectar la presencia de múltiples cepas virales en

una única muestra (Sugieda et al., 1996; Ohyama et al., 1999); (d) en relación con la

confirmación de los productos de PCR se han empleado muchos métodos. Uno de los más

sencillos es la electroforesis en gel, que asocia un gran número de falsos positivos (Atmar et al.,

1993; Atmar et al., 1996). Como alternativa más segura se encuentran los ensayos de

hibridación, aunque dada la variabilidad de las secuencias genómicas de los NoV resulta difícil

seleccionar una sonda única o un pequeño número de ellas que sean capaces de detectar todas

las secuencias posibles de NoV (Le Guyader et al., 1996). Actualmente, la secuenciación del

ADN de los productos de la RT-PCR es el método más fiable para interpretar estos ensayos

(Green et al., 1997; Maunula et al., 1999). No obstante es costoso y laborioso, lo que impide su

aplicación a un número amplio de muestras. Es por ello por lo que también se han desarrollado

la hibridación en blot de línea reversa (RLBH, “reverse line blot hybridization”. Vinjé et al.,

2000b) y el análisis de la movilidad de híbridos (HMA, “heteroduplex mobility assay”. Green et

al., 2004) en laboratorios de referencia pues permiten analizar simultáneamente un elevado

número de cepas.

3.6. EPIDEMIOLOGÍA

3.6.1. Distribución geográfica

La prevalencia de NoV como causa de gastroenteritis esporádica y epidémica ha sido

subestimada durante largo tiempo debido a que no se realiza de rutina su diagnóstico (Patel et

al, 2008). De hecho, sólo un 5% de los profesionales de la Salud Pública en Estados Unidos

identifica a los NoV como uno de los patógenos causantes de brotes de diarrea aguda


_____________________________________________________________________________

51

transmitidos por agua y alimentos (Jones et al., 2001), si bien un estudio retrospectivo de los

brotes por agua y alimentos notificados en EEUU durante el periodo 1998-2000 aplicando los

criterios de Kaplan (Kaplan et al., 1982b) concluyó que, como mínimo un 28% de ellos los

cumplían y podían atribuirse a NoV (Turcios et al., 2006).

Estudios de prevalencia en la población general obtienen un 73,3% de resultados

positivos en 3.250 muestras de suero estudiadas por EIA para virus Norwalk (un 24,6% de niños

de 6 a 11 meses y un 89,7% de personas mayores de 60 años. Gray et al., 1993). Además, la

reciente aplicación de las técnicas de RT-PCR ha demostrado que los NoV son la causa más

frecuente de diarrea aguda no bacteriana en todo el mundo, salvo en la infancia. En los niños

menores de 5 años se estima que representan aproximadamente el 12% (4,4-30,7%) de los casos

de diarrea aguda (Patel et al., 2008), lo que significa que son la segunda causa de diarrea aguda

en la infancia tras rotavirus.

Los brotes de gastroenteritis por NoV se producen durante todo el año, aunque existe una

mayor incidencia durante los meses más fríos en los países de clima más templado (Mounts al.,

2000), recientemente se ha descrito un incremento de brotes por NoV en primavera y verano en

estas regiones (Lopman et al., 2003a).

En la mayoría de los brotes las cepas más comunes son los clusters del genogrupo II,

especialmente el genotipo GII.4 que ha predominado durante los últimos 20 años en todo el

mundo, causando pandemias de diarrea aguda por NoV (Noel et al., 1999; Marshall et al., 2001;

Fankhauser et al., 2002; Buesa et al., 2002; Marshall et al., 2005; Donaldson et al., 2008;

Lindesmith et al., 2008). También ha sido identificado en España como el más prevalente

(Dominguez et al., 2008; Buesa et al., 2008).

En los últimos 15 años se han descrito diversos subtipos o variantes de este genotipo que

han infectado a la población mundial de forma secuencial (Lopman et al., 2004b; Siebenga et

al., 2007). Se plantea que la persistencia de NoV GII.4 año tras año pueda deberse a las

variaciones antigénicas que experimenta. Estudios experimentales en los que se enfrentaban

Ac Mo y cepas de NoV GII.4 de diferentes estaciones epidémicas han demostrado que se

producen tanto variaciones sutiles como cambios evolutivos en los epítopos antigénicos de las

cepas de NoV, proporcionando una evidencia directa de que los NoV GII.4 están sometidos a

una variación antigénica, probablemente como respuesta a la presión ejercida por la respuesta

inmunitaria de la población, tal como sucede con virus Influenza, VIH y hepatitis C. La

variación antigénica de los NoV podría influir significativamente en el diseño de vacunas o de

terapia inmunológica eficaz frente a estos importantes patógenos humanos (Lindesmith et al.,

2011).


_____________________________________________________________________________

52

3.6.1.1. Situación a nivel mundial

En Estados Unidos se han publicado estudios epidemiológicos que identifican a los

calicivirus como los agentes etiológicos de brotes epidémicos de diarrea aguda no bacteriana en

un 81% de los casos (Blanton et al., 2006), de los cuales el 40% tiene un origen alimentario

(Mead et al., 1999; Olsen et al., 2000; Lynch et al., 2006).

Estudios realizados en otros países nos muestran los siguientes datos: (a) Brasil: 20% de

las diarreas agudas (Borges et al., 2006; Victoria et al., 2007), (b) Chile : 45% de las diarreas

agudas (Vidal et al., 2005), (c) Tailandia : 14% de las diarreas agudas (Guntapong et al., 2004 ;

Khamrin et al., 2007), (d) Australia : 50% de las diarreas agudas no bacterianas de aparición

epidémica (Marshall et al., 2001) y 20,5% del total de las diarreas agudas (OzFood Network,

2004; Tu et al., 2007), (e) Japón : 77% de la diarreas agudas no bacterianas de aparición

epidémica (Inouye et al., 2000; Hamano et al., 2005), (f) en Argentina la incidencia de

gastroenteritis por NoV, tanto en brotes epidémicos como casos esporádicos, ha estado

ligeramente por debajo de rotavirus (24,2% vs 25,2%) en niños menores de 3 años, sin embargo

estudios más recientes revelan que NoV ha alcanzado el primer puesto como causa de brotes

epidémicos de diarrea aguda no bacteriana en la infancia (Gomes et al., 2007).

3.6.1.2. Situación en Europa

Un estudio europeo con más de 3.700 brotes de diarrea aguda no bacteriana ocurridos

entre 1995 y 2000 muestra una relación causal con NoV en un 85% de ellos (Lopman et al.,

2003b; Goutam et al., 2005). Ante estos resultados, en el año 2001 se constituyó la Red Europea

de Vigilancia de Infecciones Víricas Transmitidas por Alimentos (FBVE, “Foodborne Viruses

in Europe”), formada por trece países, para analizar la información epidemiológica y de

laboratorio obtenida de los centros colaboradores y poder abordar el incremento observado en la

incidencia de los brotes epidémicos por NoV, estudiar los genotipos causantes y su evolución a

lo largo del tiempo.

Los datos que se obtuvieron mostraron que el incremento acaecido en el año 2002 fue

concomitante con la aparición de una nueva variante de NoV (Lopman et al., 2004b). Durante el

periodo 2004-2005 se observó un incremento de brotes notificados al FBVE con importantes

diferencias según los distintos países: Alemania, Inglaterra y Gales notificaron más de mil

brotes, mientras que Francia notificó sólo seis (Kroneman et al., 2006). En el periodo 2005-

2006 de nuevo se observó un incremento en el número de brotes alimentarios y la aparición de

nuevas variantes de GII.4 (Kroneman et al., 2008).

Existen otras muchas publicaciones que proporcionan datos específicos por países, en

Holanda de un 86 a un 91% de los brotes epidémicos de diarrea aguda no bacteriana (Vinjé et

al., 1996) y un 10% del total de las GEA se atribuyen a NoV (de Wit et al., 2001a; Siebenga et


_____________________________________________________________________________

53

al., 2007) y en Finlandia un 60,6% de los brotes epidémicos de diarrea aguda no bacteriana se

deben a NoV (Maunula et al., 2005).

Figura 16. Brotes de gastroenteritis aguda por NoV GII.4 en el segundo semestre de 2004, 2005 y

2006 en Europa (modificado de Kroneman et al., 2006).

La recopilación de datos por medio de la FBVE permite observar la estacionalidad de los brotes

epidémicos por NoV en Europa. Aparecieron principalmente en los meses de diciembre de 2004 y

enero y febrero de 2005, así como en diciembre de 2005 y enero y febrero de 2006.

3.6.1.3. Situación en España

En España, de 1999 a 2003 se observó un incremento en el número de brotes de diarrea

aguda por NoV respecto a los datos de años previos. La distribución por comunidades

autónomas no fue homogénea, mostrando una mayor incidencia en Cataluña (0,32/100.000 en el

año 2003 y 752 personas afectadas por NoV GII.4 en 2004; Domínguez et al., 2008), seguida

por Galicia, Castilla y León, Madrid, Comunidad Valenciana e Islas Baleares. En cambio en

Cantabria, Navarra, La Rioja, Extremadura, Ceuta y Melilla no se notificó ningún brote por

NoV durante ese periodo, figura 17.

Disponemos de datos más específicos por regiones: en Asturias el NoV se ha identificado

en un 8,6% de los niños hospitalizados por diarrea aguda (Boga et al., 2004) y en la zona

oriental de España, Cataluña y la Comunidad Valenciana ha sido identificado como agente

causal de un 87,1% de las diarreas agudas de aparición epidémica (Buesa et al., 2008).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

2004 2005 2006

enero

febrero

marzo

abril

mayo

junio

julio

agosto

septiembre

octubre

noviembre

diciembre


_____________________________________________________________________________

54

Figura 17. Distribución geográfica según comunidades autónomas de brotes de norovirus

declarados en España en el año 2003 (Boletín epidemiológico semanal, 2005).

El ámbito en que aparecieron los brotes fue mayoritariamente el de las residencias

geriátricas y el mecanismo de transmisión más frecuente el interpersonal, con una creciente

aportación de la transmisión alimentaria en los últimos dos años: un 24,2%, con una diferencia

estadísticamente significativa (p < 0,009) en Cataluña, donde un 60% de brotes por NoV fueron

transmitidos por alimentos (Grupo de Vigilancia Epidemiológica y Diagnóstico de Norovirus,

2004; Grupo de Vigilancia Epidemiológica y Diagnóstico de Norovirus, 2005).

En cuanto a la estacionalidad se aprecia que existe una distribución homogénea a lo largo

de todo el año con un pico entre los meses de mayo y octubre (Lopman et al., 2003a), aunque en

el año 2003 tuvo lugar un incremento puntual en el mes de febrero (Grupo de Vigilancia

Epidemiológica y Diagnóstico de Norovirus, 2005).

3.6.2. Posibles huéspedes

El hombre es el único reservorio de NoV confirmado, aunque no se puede descartar el

reservorio animal (Van der Poel et al., 2000; Oliver et al., 2004; Farkas et al., 2005), pues los

calicivirus son lo suficientemente divergentes como para esperar una posible adaptación a ellos.

Existen varios datos que podrían apoyar esto: (a) el descubrimiento reciente de calicivirus

humanos y animales genéticamente relacionados sugiere que dicha transmisión puede haber

ocurrido en algún momento de su evolución (Van der Poel et al., 2000), (b) asimismo, la

descripción de casos de transmisión de calicivirus interespecies en lugares donde el nicho


_____________________________________________________________________________

55

ecológico de los virus se ha alterado. Es el caso de la transmisión de calicivirus marinos del

género VeV a cerdos domésticos en los Estados Unidos en los años 30 a partir de la ingesta de

desperdicios crudos o la infección de un técnico de laboratorio por el virus del león marino de

San Miguel tras la manipulación de muestras contaminadas (Smith et al., 1998).

3.6.3. Propiedades físico-químicas del virus

Los NoV son virus estables dentro de un amplio rango de temperatura, sobreviven a la

congelación, la refrigeración y el calentamiento hasta 60ºC. De aquí, que se puedan encontrar en

hielos elaborados con agua contaminada (Cannon et al., 1991; Khan et al., 1994).

Además, se muestran resistentes a los medios de desinfección habituales, tales como: (a)

éter al 20% a 4ºC, (b) incubación a 60ºC durante 30 minutos o (c) tratamiento con hipoclorito

sódico entre 3,75-6,25 g/L (cloro libre residual 0,5 a 1 mg/L), una concentración que sería

suficiente para inactivar otros virus entéricos del agua potable de consumo (rotavirus y

poliovirus). Requieren para su inactivación tratamientos con 10 mg/L de cloro libre, que sería la

concentración utilizada para descontaminar un agua considerada no potable (Barker et al., 2004;

Duizer et al., 2004a; Green et al., 2007). Es por ello que pueden permanecer en una gran

variedad de superficies que se constituyen como reservorio de los virus y facilitan su

propagación, especialmente cuando se trata de entornos cerrados.

Asimismo, se ha demostrado la resistencia de los NoV al medio ácido. Un estudio

reciente ha puesto de manifiesto que el ARN de NoV permanece intacto después de 30 minutos

a pH 2 y temperatura corporal, lo que explica que sobrevivan al paso por el estómago (Dolin et

al., 1972; Duizer et al., 2004a).

3.6.4. Mecanismos de transmisión

El medio de transmisión más importante es la ruta fecal-oral. Los primeros casos de un

brote suelen aparecer frecuentemente tras la exposición al agua o a los alimentos contaminados.

En cuanto a la diseminación de la infección, existen dos factores que tienen una gran

responsabilidad: (a) la dispersión del virus a través de los vómitos, tanto por la formación de

aerosoles como por la contaminación de fómites (Marks et al., 2003) y (b) la contaminación de

los aseos públicos (Cheesbrough et al., 2000).

Además, los NoV poseen una serie de características que facilitan su propagación en

brotes epidémicos: (a) su dosis infectiva es muy baja, se calcula que 10 partículas víricas son

suficientes para causar una infección, (b) la excreción viral suele ser muy intensa durante un

periodo de tiempo prolongado, incluso después de que hayan desaparecido los síntomas, (c)

como se ha comentado en el apartado anterior, la resistencia medioambiental de sus viriones es

muy alta y (d) una persona puede sufrir múltiples reinfecciones, pues la respuesta inmunitaria


_____________________________________________________________________________

56

confiere una protección de corta duración. Por estos motivos, la infección por NoV se extiende

muy rápidamente en entornos como hospitales, colegios, guarderías, hoteles y residencias

(Parashar et al., 2001; Evans et al., 2002; Marks et al., 2003).

El estudio de los brotes epidémicos de gastroenteritis permite destacar la importancia que

tiene el NoV como agente causal y conocer el mecanismo de transmisión por el cual se ha

llegado a producir el brote, cosa que no sucede con los casos esporádicos. Sin embargo, no se

puede obviar que los brotes representan sólo la parte más pequeña de todos los casos, ya que

incluyen exclusivamente los que han consultado con los servicios sanitarios, se han podido

relacionar epidemiológicamente, notificado a los servicios de Salud Pública y finalmente

investigado. Estos pueden clasificarse según su mecanismo de transmisión en brotes

transmitidos por medio de alimentos o agua y de persona a persona.

3.6.4.1. Brotes transmitidos por alimentos

La falta de notificación de brotes, referida previamente (Glass et al., 2000; Cowden et al.,

2002) impide ofrecer datos exactos; sin embargo las tendencias observadas indican que los

brotes por NoV transmitidos por alimentos son cada vez más frecuentes, relacionándose con

hasta un 90% de gastroenteritis asociadas al consumo de alimentos contaminados, motivo por el

cual la Unión Europea los ha escogido (junto con el virus de la hepatitis A) para el control

específico en alimentos de riesgo.

Existe una gran diversidad de alimentos que pueden ser vehículo para los NoV (Cliver et

al., 2006), bien por estar contaminados en origen o haberse contaminado durante el proceso de

preparación. Estudios elaborados por diversos autores indican que el consumo de marisco

ocasiona la mayoría de brotes por NoV. Las ostras, moluscos y bivalvos con su sistema de

filtrado concentran las partículas virales presentes en el agua y al ser consumidos tras un

tratamiento con vapor suponen un gran riesgo de transmisión de virus entéricos como los NoV

(Kageyama et al., 2004; Doyle et al., 2004; Hamano et al., 2005), por ello se recomienda que se

sometan a un proceso de cocción que alcance una temperatura en el interior del molusco

superior a 90ºC durante 1,5 minutos como mínimo. Adicionalmente, se deben emplear medidas

para evitar la contaminación de moluscos en áreas de cultivo de bivalvos como la identificación

de fuentes de contaminación en las costas o la prohibición del vertido de aguas fecales desde

barcos (Millard et al., 1987; Simmons et al., 2001; Koopmans et al., 2004; Widdowson et al.,

2005b; Le Guyarder et al., 2006; Françoise et al., 2006).

Los alimentos que han sido preparados por un manipulador infectado y no se someten a

tratamiento térmico posterior, como los bocadillos y ensaladas, o los alimentos que se pueden

contaminar por lavado con agua con material fecal, como frutas y verduras crudas envasadas,

pueden ocasionar brotes (Parashar et al., 2001; Sala et al., 2005). La contaminación de los


_____________________________________________________________________________

57

alimentos a partir de un manipulador que no ha cumplido con las normas higiénicas es muy

difícil de evitar ya que la excreción del virus en una persona infectada puede producirse incluso

antes de iniciar los síntomas (Goller et al., 2004), permanecer asintomático o con síntomas muy

leves (Hedberg et al., 1993; Morbidity and Mortality Weekley Report, 2006) y prolongarse

incluso semanas o meses después de la recuperación (Kauffman et al., 2003; Gallimore et al.,

2004). Se recomienda que los trabajadores que hayan sufrido una gastroenteritis no se

incorporen al trabajo hasta 48-72 h después de su recuperación; una alternativa podría ser la

asignación temporal del trabajador a una labor que no implique la manipulación de alimentos

(Parashar et al., 2001).

La detección de NoV en los alimentos es compleja. Los métodos como la microscopía

electrónica o el enzimoinmunoanálisis requieren al menos una concentración de 105-10

6

partículas víricas por mililitro, niveles muy superiores a las dosis infectivas de 10 unidades por

gramo de alimento, lo que hace necesarios métodos diagnósticos más sensibles como la RT-

PCR (Green et al., 1998; Vinjé et al., 2003; Jothikumar et al., 2005; Morton et al., 2009).

3.6.4.2. Brotes transmitidos por agua

Aunque menos frecuentes que los propagados por alimentos, se han descrito brotes por

consumo de agua procedente de la red de distribución pública, pozos (Beller et al., 1997),

fuentes o hielos comerciales (Cannon et al., 1991) y algunos relacionados con el baño en lagos y

piscinas (Craig et al., 1993; Bosch. 1998).

En Estados Unidos, durante el periodo 2000-2004, de un total de 226 brotes de

gastroenteritis por NoV estudiados, sólo 12 (5%) fueron transmitidos por agua (Blanton et al.,

2006). La contaminación de las aguas de consumo puede ser resultado de filtraciones en el

sistema de alcantarillado, en inundaciones y lluvias torrenciales o defectos en el sistema de

cloración (Bosch et al., 1998; Morbidity and Mortality Weekley Report, 2005). Asimismo, se

han descrito brotes asociados al consumo o contacto en zonas recreativas con aguas

contaminadas (Khan et al., 1994; Fankhauser et al., 2002; Maunula et al., 2005).

Hasta hace poco, los métodos analíticos no permitían detectar la presencia de NoV en el

agua por lo que se utilizaba como método de aproximación la detección de microorganismos

indicadores de contaminación fecal como el recuento de coliformes (Parashar et al., 2001). Por

este motivo, el primer brote documentado en el cual se detectó NoV en el agua se remonta a

1997 (Beller et al., 1997). Actualmente las técnicas de RT-PCR se pueden aplicar para evaluar

la contaminación del agua, pero es necesaria la concentración de grandes volúmenes para poder

detectar la presencia del virus (Bosch et al., 2006; Morton et al., 2009). Por ello hay que tener

en cuenta que su identificación en una muestra de agua que puede haber sido el mecanismo de

transmisión en un brote de gastroenteritis por NoV confirmaría el brote, pero su ausencia no lo


_____________________________________________________________________________

58

excluiría siempre que los datos epidemiológicos indicaran que el consumo de dicha agua fuera

la explicación más plausible de su origen.

3.6.4.3. Brotes de transmisión persona a persona

Uno de los motivos por los cuales algunos autores consideran que las infecciones por

NoV son un problema emergente es porque, debido a los cambios en el estilo de vida de los

países desarrollados y al envejecimiento de la población, existe un mayor número de personas

que viven en residencias geriátricas (Green et al., 2002; Widdowson et al., 2004; Wu et el.,

2005; Centers for Disease Control and Prevention and National Center for Health Statistics.

National Nursing Home Survey, 1999). La infección por NoV tiene un gran riesgo de

complicaciones en este grupo (Mattner et al., 2006) y se relaciona con elevadas tasas de

mortalidad (Goodgame et al., 2006; Okada et al., 2006).

En los centros sanitarios la duración del proceso es más largo y en estas instituciones los

brotes se transmiten muy rápidamente, presentan elevadas tasas de ataque y son especialmente

difíciles de controlar (Parashar et al., 2001), siendo los costes generados de consideración

(Lopman et al., 2004a; Zingg et al., 2005). Estos hechos avalan la importancia de implementar

medidas de prevención de la infección nosocomial por NoV (Barker et al., 2004).

En cuanto a las infecciones sucedidas en el domicilio, en algunos países no es obligada la

notificación, pero sería conveniente, pues a partir de su estudio epidemiológico podrían llegar a

identificarse casos con un origen común fuera de la familia y esto permitiría estimar mejor la

extensión del problema.

En los últimos años han adquirido especial importancia los brotes en cruceros (Smolinski

et al., 2003; Enserik et al., 2006; Koopmans et al., 2006), en los cuales la infección se adquiere a

partir de una fuente común (agua o alimentos contaminados) y posteriormente tiene lugar la

transmisión de persona a persona de manera rápida y sencilla (Rooney et al., 2004). La

prevención de estos brotes debe constar de varias medidas como el control de la fuente de

infección, medidas de desinfección ambiental adecuadas, precauciones de contacto con las

personas enfermas y promoción del lavado de manos en la tripulación y los pasajeros (Isakbaeva

et al., 2005). Un problema adicional que plantean es que no suele estar claro quién ha de ser el

responsable de la investigación y de las actuaciones de control, se plantea que se deberían regir

por una normativa de ámbito internacional (Widdowson et al., 2004; Isakbaeva et al., 2005;

Takkinen et al., 2006; Takkinen et al., 2006. Enserik et al., 2006).

CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS. Patogenia.

_____________________________________________________________________________

59

3.7. PATOGENIA

3.7.1. Entrada y periodo de incubación

Los calicivirus humanos penetran en el cuerpo humano por la vía oral, vehiculizados por

agua, alimentos, tras contacto con fómites o tras su aerosolización en los vómitos (Caul et al.,

1994; Chadwick et al., 1994; Paterson et al., 1997; Marks et al., 2000; Marks et al., 2003).

Estudios realizados en voluntarios infectados por NoV muestran que el periodo de

incubación es corto, de 10 a 50 horas, con una media de 24 horas (Dolin et al., 1971; Blacklow

et al., 1972; Dolin et al., 1972; Wyatt et al., 1974; Steinhoff et al., 1980; Kaplan et al., 1982a).

En el caso del virus Snow Mountain, el periodo de incubación en una enfermedad inducida

experimentalmente fue de 19 a 41 horas con una media de 27 horas (Dolin et al., 1982).

3.7.2. Replicación

El lugar de replicación de los calicivirus humanos es el tracto gastrointestinal superior.

Las biopsias duodenales de enfermos muestran un ensanchamiento y acortamiento de las

vellosidades intestinales, hipertrofia críptica y signos inflamatorios, tales como infiltración por

células mononucleares y vacuolización citoplasmática. En muestras de yeyuno de voluntarios

que desarrollaron la enfermedad tras la administración oral de virus Norwalk o Hawaii también

se observaron estas lesiones histopatológicas (Dolin et al., 1971; Agus et al., 1973; Schreiber et

al., 1973; Schreiber et al., 1974), lo que coincide con hallazgos procedentes de estudios de

experimentación animal en los que se identificaron lesiones en el intestino delgado de cerdos

infectados con calicivirus entérico porcino (PEC) y SaV (Flynn et al., 1988a). Además, los virus

se han detectado por microscopía electrónica en las células epiteliales de la mucosa del intestino

delgado. El estudio de biopsias intestinales de voluntarios a los que se administraron virus

Norwalk y Hawaii, pero que se mantuvieron asintomáticos, también mostró estas lesiones

mucosas (Schreiber et al., 1973; Schreiber et al., 1974; Meeroff et al., 1980). En el caso de

pacientes pediátricos, el examen de las biopsias intestinales de niños a los que se ha practicado

un transplante intestinal y están infectados por NoV ha permitido observar un aplanamiento de

las vellosidades y un aumento de los infiltrados mononucleares en la lámina propia, cuando se

compararon con controles sanos (Morotti et al., 2004).

El hecho de que los hallazgos microscópicos referidos no aparecieran en otros tramos del

aparato digestivo (fundus gástrico, antro o recto) de voluntarios infectados y sintomáticos

(Widerlite et al., 1975) planteó la posible existencia de un tropismo celular. La información

acerca de los tropismos celulares y tisulares de los calicivirus humanos es limitada, un estudio al

respecto mostró que VLPs recombinantes de NoV marcadas con radioisótopos eran capaces de

unirse a diversos tipos celulares con una eficiencia diferente de internalización en cada una

CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS. Patogenia.

_____________________________________________________________________________

60

de ellas (White et al., 1996). Los ensayos de unión de estas VLPs con 13 líneas celulares de

diferentes orígenes, incluyendo enterocitos humanos (células Caco-2 diferenciadas e

indiferenciadas) y células de insecto (Spodoptera frugiperda 9), mostraron que las células

diferenciadas Caco-2 unieron significativamente más VLPs recombinantes que ninguna otra

línea celular. Por otra parte los NoV murinos muestran un tropismo por las células macrofágicas

y dendríticas del sistema inmunitario de ratón (Wobus et al., 2004), si bien los NoV humanos no

coinciden en dicha afinidad.

Las conclusiones obtenidas de los estudios acerca del tropismo celular de las VLPs

recombinantes de NoV indujeron a pensar en la existencia de receptores determinados

genéticamente, que mediarían la unión de las partículas virales a ciertos tipos celulares (Kreutz

et al., 1994; Maeda et al., 2002). Tras la interacción del virión con la célula huésped mediante

estos receptores, la partícula penetra y el ARN genómico se libera de la cápside y pasa al

citoplasma. La traducción inicial del genoma introducido es mediada por interacciones entre la

proteína estructural VPg, ligada al ARN genómico y subgenómico, la proteína no estructural

NS5 y los mecanismos de traducción de la célula (Goodfellow et al., 2000; Daughenbaugh et

al., 2003). Una vez transcrito el ORF1 para producir la poliproteína no estructural, la NS6-Pro la

escindirá en varios sitios de restricción obteniéndose como productos las proteínas no

estructurales que permitirán las siguientes etapas del proceso (Sosnovtsev et al., 2002). A

continuación, se inicia la síntesis de una hebra de ARN complementaria (negativa) a partir de la

estructura del ARN genómico empezando por el extremo 3’ de la hebra de ARN con sentido

positivo (Gutiérrez-Escolano et al., 2003), que servirá a su vez como molde para transcribir más

ARN genómico y subgenómico de sentido positivo (Neill et al., 1998) que se empleará para

codificar la síntesis de las proteínas estructurales VP1 y VP2 (proceso en el que participa la

proteína no estructural NS7-Pol. Herbert et al., 1996).

3.7.3. Excreción y diseminación de NoV por el huésped

Los calicivirus humanos se liberan del tracto intestinal del huésped a través de las heces.

También se han detectado en muestras de vómitos, por inmunomicroscopía electrónica y

reacción en cadena de la polimerasa tras transcripción reversa (RT-PCR), (Greenberg et al.,

1979; Kilgore et al., 1996; Mc Evoy et al., 1996; Green et al., 1998).

Se ha demostrado que la capacidad de trasmisión de los calicivirus es muy alta, de modo

que los individuos infectados tienen una probabilidad elevada de contagiar a sus contactos

domiciliarios o muy cercanos, así, en brotes de exposición única son muy frecuentes los casos

secundarios. En la infección experimental de voluntarios se observa por inmunomicroscopía

electrónica su diseminación desde el momento del establecimiento de la enfermedad hasta no

más de 72 horas después de los primeros síntomas (Thornhill et al., 1975; Dolin et al., 1982).

CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS. Inmunidad.

_____________________________________________________________________________

61

Técnicas más sensibles como la RT-PCR han demostrado que la diseminación de los

NoV puede suceder desde antes del establecimiento de los síntomas (Gaulin et al., 1999; Goller

et al., 2004) y durar varios días o semanas, incluso tras la resolución de la enfermedad clínica

(Graham et al., 1994; Okhuysen et al., 1995; Rockx et al., 2005a). Este aspecto lo corroboran

estudios de la historia natural de la infección por NoV en una comunidad que muestran que el

26% de 99 pacientes examinados eliminaban virus (detectados por RT-PCR) hasta tres semanas

tras el establecimiento de la enfermedad, con la tasa máxima de diseminación prolongada (38%)

en niños menores de un año (Rockx et al., 2002). Estas observaciones sugieren que los

individuos infectados que se recuperan de la infección por NoV pueden continuar eliminando

partículas virales más allá del periodo sintomático.

Asimismo, existen estudios que ponen de manifiesto que hay infecciones en individuos

que permanecen asintomáticos y sin embargo propagan el virus de una forma silente (Centers

for Disease Control and Prevention and National Center for Health Statistics. National Nursing

Home Survey, 1999). Desde el punto de vista epidemiológico, este es un hallazgo con grandes

implicaciones concretamente en relación a la actitud frente a los brotes epidémicos que pueden

causar los manipuladores de alimentos convalecientes de la enfermedad (Curry et al., 1987;

Parashar et al., 1998; Reid et al., 1988; White et al., 1986).

3.8. INMUNIDAD

Sobre la respuesta inmunitaria frente a los NoV en humanos se conoce muy poco.

Diversas observaciones clínicas y serológicas de individuos infectados en brotes epidémicos y

de grupos de voluntarios expuestos experimentalemente a NoV sugieren que no parece seguir el

patrón que se observa frente a otros virus (Matsui et al., 2000).

Los humanos demuestran un alto grado de susceptibilidad tanto a las infecciones

naturales como a las inducidas experimentalmente por NoV, ya que en algunas epidemias por

NoV más de un 80% de los voluntarios adultos resultan enfermos (Kaplan et al., 1982b) y

aproximadamente un 50% desarrollan repetidamente enfermedad tras varios contactos con NoV,

sugiriendo que la respuesta inmunitaria desarrollada en infecciones previas proporciona una

protección escasa (Dolin et al., 1972; Wyatt et al., 1974; Steinhoff et al., 1980; Blacklow et al.,

1982).

Sin embargo, existe un porcentaje de la población que no es susceptible a la infección por

NoV tras el primer contacto ni los sucesivos, lo que hace plantearnos la existencia de otros

factores diferentes a la inmunidad tradicional que determinan la resistencia frente a ellos.


_____________________________________________________________________________

62

3.8.1. Respuesta innata

El rápido aclaramiento de la infección por NoV murino en los ratones

inmunocompetentes indica el importante papel que desempeña el sistema inmunitario innato

hasta el momento en que el sistema inmunitario adaptativo es capaz de generar una respuesta

efectiva (Mumphrey et al., 2007). De hecho, la infección por NoV murino al ratón que carece de

los receptores de Interferón tipo I y II (IFNα/β/gamma) o de la molécula STAT-1 resulta letal

(Karst et al., 2003; Mumphrey et al., 2007).

Diversas proteínas inician la respuesta de IFN frente a los virus (Takeuchi et al., 2007),

son los receptores “Toll-like” (TLR, tabla 8. Iwasaki et al., 2004), las helicasas Rig-I-like

(RLHs. Sumpter et al., 2005; Pichlmair et al., 2007), PKR (Garcia et al., 2007) y RNasa L

(Malathi et al., 2007). Sin embargo, los sensores iniciales que específicamente reconocen los

NoV y son responsables de su subsiguiente activación son desconocidos.

Los TLRs se localizan en la membrana plasmática y los compartimentos endosomales, los

TLR 7 y 8 reconocen el ARN de cadena única (Lund et al., 2004; Heil et al., 2004; Diebold et

al., 2004), el TLR 9 reconoce el ADN (Bauer et al., 2001; Hemmi et al., 2000) y el TLR 3 el

ADN de doble cadena. Los RLHs son sensores localizados en el citoplasma (Pichlmair et al.,

2007), incluyen Rig-I y MDA-5 (Takeuchi et al., 2007; Fujita et al., 2007; Yoneyama et al.,

2004). Rig-I reconoce preferentemente el ARN 5’-fosforilado (Hornung et al., 2006; Pichlmair

et al., 2006), mientras que MDA-5 el ADN de doble cadena (Yoneyama et al., 2005).

Recientemente se ha descubierto que la carencia de Rig-I confiere resistencia frente a

NoV in vitro (Guix et al., 2007). MDA5 es el sensor predominante de los NoV murinos e inicia

la respuesta inmunitaria frente a estos virus, TLR3 también interviene en la respuesta a los NoV

murinos en ciertos tejidos (McCartney et al., 2008).

Tabla 8. PRINCIPALES RECEPTORES “TOLL-LIKE” Y AFINIDAD

RECEPTOR “TOLL-LIKE” AFINIDAD

TLR 3 ADN doble cadena

TLR 7 ARN de cadena única

TLR 8 ARN de cadena única

TLR 9 ADN

Rig-I ARN 5’ fosforilado

MDA-5 ADN de doble cadena


_____________________________________________________________________________

63

3.8.2. Respuesta adaptativa

3.8.2.1. Humoral

La mayoría de la información acerca de la respuesta inmunitaria humoral frente a los

NoV, tanto sistémica como local, proviene de estudios en voluntarios (Dolin et al., 1972; Wyatt

et al., 1974; Parrino et al., 1977; Lindesmith et al., 2010).

Respecto a la respuesta sistémica, se han descrito dos etapas: (a) la inmunidad a corto

plazo es posiblemente específica para cada genogrupo viral, probablemente para cada genotipo.

Los estudios realizados con voluntarios demuestran que los individuos infectados por un NoV

concreto desarrollan una respuesta inmunitaria después de la infección que, aunque de corta

duración (entre 6 y 14 semanas), confiere protección frente a una nueva exposición al mismo

virus durante dicho periodo (Wyatt et al., 1974; Parrino et al., 1977; Johnson et al., 1979). Esta

es una respuesta intensa de tipo IgG, IgM e IgA a nivel sérico frente al genotipo homólogo y

débil frente a genotipos heterólogos dentro del mismo genogrupo (Hale et al., 1998; Rockx et

al., 2005c; Iritane et al., 2007); (b) la inmunidad a largo plazo se desvía del patrón tradicional.

Doce voluntarios expuestos al NoV en dos ocasiones, con una diferencia de 27 a 42 meses,

mostraron dos patrones diferentes de respuesta a la exposición secuencial (Parrino et al., 1977):

seis desarrollaron enfermedad gastrointestinal tras la exposición inicial y nuevamente tras ese

periodo de 27 a 42 meses, sin embargo los otros seis no enfermaron tras la exposición inicial ni

tras la segunda exposición 27 a 42 meses después (Iritani et al., 2007). Los estudios serológicos,

en los que los anticuerpos séricos antes de la primera exposición fueron medidos por

inmunomicroscopía electrónica y radioinmunoensayo, no proporcionan una explicación para la

diferente susceptibilidad (Parrino et al., 1977; Greenberg et al., 1981; Cukor et al., 1982). Se

observó la paradoja de que los voluntarios que no enfermaron tenían muy pocos o casi ningún

anticuerpo específico anti-NoV medible en suero antes del primer contacto experimental

(Parrino et al., 1977), es más, no eran capaces de desarrollarlos tras el segundo contacto. En

cambio, los voluntarios que enfermaron tras dicha exposición y que fueron evaluados

serológicamente presentaban altos niveles de anticuerpos específicos previos al primer contacto,

que incluso se incrementaron más tras el contacto posterior.

La observación de que los anticuerpos séricos frente a NoV se correlacionan con una

susceptibilidad a la infección por NoV y proporcionan una protección de escasa duración se ha

realizado en muchos otros estudios en voluntarios sanos (Johnson et al., 1990; Graham et al.,

1994; Lindesmith et al., 2003). Una posible explicación podría ser que la carencia de

anticuerpos frente a una cepa determinada de NoV se debería a una ausencia de susceptibilidad

a la infección de carácter constitucional.

CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS. Susceptibilidad del huésped.

_____________________________________________________________________________

64

En relación con la respuesta local, un estudio reciente realizado en voluntarios ha

demostrado el desarrollo de una respuesta rápida de tipo IgA a nivel de la mucosa intestinal tras

la exposición experimental a estos virus (Lindesmith et al., 2003). Queda por determinar la

capacidad protectora que confiere y durante cuánto tiempo ya que hasta el momento se ha

observado repetidamente una discordancia entre los niveles de anticuerpos a nivel yeyunal y los

coproanticuerpos con la susceptibilidad a la infección (Blacklow et al., 1979; Greenberg et al.,

1981; Baron et al., 1984; Johnson et al., 1990; Madore et al., 1990). Es decir, en aquellos

individuos que presentaban mayores niveles de estos anticuerpos previos a la exposición se ha

observado una mayor susceptibilidad a la infección.

3.8.2.2. Celular

La respuesta inmunitaria mediada por células se ha estudiado en voluntarios tras la

inmunización oral con VLPs recombinantes de NoV. Las VLPs recombinantes de Norwalk

desencadenan una respuesta inmunitaria celular que induce procesos de proliferación celular

virus-específicos, un incremento de IFN-gamma en ausencia de producción de IL-4, patrón

predominante tipo Th-1 de producción de citoquinas (Tacket et al., 2003). Esto se ha observado

también en un estudio de 15 voluntarios infectados con Snow Mountain, en los que se identifica

un incremento significativo de los niveles de IFN-gamma e IL-2, pero no IL-6 o IL-10, en el

segundo día tras la exposición mostrando nuevamente un predominio de la respuesta Th-1

(Lindesmith et al., 2005).

3.9. SUSCEPTIBILIDAD DEL HUÉSPED

Las discrepancias observadas entre los estudios clínicos y serológicos llevaron durante

años a plantear la hipótesis de la existencia de un factor constitucional, determinado

genéticamente que pudiera condicionar la susceptibilidad o resistencia frente a las infecciones

por NoV (Parrino et al., 1977; Blacklow et al., 1982; Koopmans et al., 1982; Baron et al., 1984;

Cukor et al., 1984).

El estudio inicial que profundizó en esta hipótesis fue publicado por Ruvoen-Clouet et al.

en el año 2000. En él describe cómo los virus de la enfermedad hemorrágica del conejo (RHDV,

LaV) y sus VLPs recombinantes son capaces de unirse a los antígenos histosanguíneos humanos

(HBGAs), carbohidratos complejos expresados en las células epiteliales del tracto respiratorio,

genito-urinario y digestivo, así como en los hematíes de conejos y humanos, como muestra la

figura 18 (Ruvoen-Clouet et al., 2000; Lindesmith et al., 2003).

Los HBGAs referidos son codificados por los genes FUT2, en un 80% de la población

caucásica del N de Europa y América, lo que coincide con la tasa de ataque media en los brotes


_____________________________________________________________________________

65

epidémicos por NoV. Esto podría sugerir que el gen FUT2 se asocia con una susceptibilidad a

las infecciones esporádicas y a los brotes epidémicos causados por NoV (Thorven et al., 2005).

Por ello se diseñaron estudios con el virus Norwalk, en los que se demostró que las VLPs

recombinantes del virus eran capaces de unirse a los HBGAs de saliva y enterocitos de

individuos productores de FUT2 (secretores), pero no de no productores (no secretores) in vitro

(Marionneau et al., 2002). Esta misma asociación se confirmó in vivo por medio de estudios en

voluntarios sanos donde se observó susceptibilidad a la infección en los individuos secretores y

resistencia a la misma en la mayoría de los no secretores (Marionneau et al., 2002; Hutson et al.,

2002; Lindesmith et al., 2003; Hutson et al., 2004; Le Pendu et al., 2004; Hutson et al., 2005;

Tan et al., 2005a; 2005b). Posteriormente se han publicado numerosas investigaciones de brotes

epidémicos, así como estudios de prevalencia de otros representantes de NoV (Meyer et al.,

2004; Dai et al., 2004; Rockx et al., 2005b; Fretz et al., 2005) desprendiéndose de ellos

resultados similares.

Figura 18. Tinción inmunohistoquímica de la unión de extractos hepáticos de RHDV a HBGAs tipo

2 de células traqueales de conejo (Ruvoen-Clouet et al., 2000).

3.9.1. Polimorfismo del sistema HBGA humano

Los HBGAs son carbohidratos complejos presentes en la parte más protruyente de

muchas glicoproteínas o glicolípidos de la superficie de los hematíes y del epitelio mucoso del

tracto digestivo, respiratorio y genitourinario humanos (Ravn et al., 2002; Le Pendu et al.,


_____________________________________________________________________________

66

2004). También están presentes como oligosacáridos libres en fluidos biológicos como la leche

materna, la saliva, el contenido intestinal y la sangre.

Los determinantes antigénicos HBGAs parten de cuatro tipos principales de estructuras

sacarídicas precursoras. Las principales, tipo 1 y 2, se diferencian en las uniones entre Gal y N-

acetilglucosamina, 1-3 y 1-4 respectivamente. Las enzimas FUT1 y FUT2 (α-1,2

fucosiltransferasas) son responsables de la síntesis de los antígenos H a partir de ellas por la

adición de un grupo fucosa (Fuc), como muestran las figuras 19 y 20. De forma que FUT1 actúa

preferentemente sobre las cadenas sacarídicas tipo 2 generando el antígeno H tipo 2, mientras

que FUT2 actúa sobre las tipo 1 generando el antígeno H tipo 1, si bien también se ha descrito

su acción sobre las cadenas tipo 2 y 3 (Barry et al., 2005).

Se han observado diferentes patrones de expresión para FUT1 y FUT2 según los tejidos

(Morgan et al., 2000; Ravn et al., 2001). Los precursores tipo 1 se encuentran principalmente en

el tracto digestivo y el aparato respiratorio y los precursores tipo 2 se encuentran

fundamentalmente en la superficie de los eritrocitos. En la superficie de los enterocitos el gen

FUT2 controla la expresión del antígeno H tipo 1, el ligando principal para la unión de las VLPs

recombinantes a las células epiteliales intestinales (Mariounneau et al., 2002) y el receptor

principal de NoV. También se ha descrito la unión de las VLPs recombinantes de virus Norwalk

al antígeno H tipo 3 (Clausen et al., 1986a; 1986b), procedente de otros cadenas precursoras

(Stanley et al., 2008).

Figura 19. Vías de síntesis de antígenos HBGAs (modificado de Hutson et al., 2004).


_____________________________________________________________________________

67

La fucosiltransferasa 3 (FUT3) adiciona un grupo Fuc mediante enlaces α-1,3 o α-1,4

(Grollman et al., 1969). Su acción sobre el precursor tipo 1 tiene como resultado un trisacárido

denominado antígeno Lewis a (Le a) y sobre el antígeno H tipo 1 el antígeno Lewis b (Le b),

figura 19. De forma análoga la acción de la enzima FUT3 sobre el precursor tipo 2 tiene como

resultado el antígeno Lewis x (Le x) y sobre el antígeno H tipo 2 el Lewis y (Le y), figura 20.


El antígeno H sirve como sustrato para las glucosiltransferasas A y B, que unirán los

epítopos A, B o ambos, es decir, una N- acetilgalactosamina (GlcNAc) y/o una galactosa (Gal)

en el punto de unión α-1,3 a los trisacáridos H de tipo 1 o tipo 2 para producir un tetrasacárido

A tipo 1 o tipo 2, B tipo 1 o tipo 2 o AB tipo 1 o tipo2, respectivamente (Tan et al., 2005b). La

acción de la enzima FUT3 sobre los antígenos A o B tipo 1 resulta en un antígeno tetrasacárido

denominado A Lewis b (A Le b) y B Lewis b (B Le b), respectivamente (Tan et al., 2005b),

como vemos en la figura 21.


_____________________________________________________________________________

68


Cada una de las familias de genes ABO, Lewis y secretor pueden contener alelos silentes

que llevarían a fenotipos nulos de los loci, la presencia o ausencia de alelos de los genes FUT1,

FUT2 y FUT3 que codifican las enzimas que glucosilan de forma secuencial distintos

precursores de los receptores HBGA determina si un individuo es susceptible a la infección por

una cepa determinada de NoV: (a) el gen recesivo FUT1 (“Bombay”) ocurre con una frecuencia

muy baja (10-5

a 10-6

individuos), si bien no ha sido bien establecido cuál es su significado

clínico (Marionneau et al., 2001), (b) el estado denominado “secretor” depende de la expresión

del gen FUT2 que codifica la enzima α-1,2 fucosiltransferasa, es el principal determinante de la

susceptibilidad a las infecciones por NoV de forma que los individuos con dos alelos mutados

FUT2 carecen del antígeno H tipo 1 en sus células epiteliales intestinales y son denominados

“no secretores” y muestran una resistencia a la infección por determinados NoV (Rockx et al.,

2005b; Thorven et al., 2005), (c) el gen silente FUT3 se encuentra en aproximadamente un 10-

20% de la población, los individuos que no lo expresan no producirán Lea o Le

b en sus

superficies mucosas (Marionneau et al., 2001), (d) asimismo, las mutaciones inactivadoras de la

familia ABO son comunes y presentan una amplia variación entre las diferentes poblaciones y

razas (Le Pendu et al., 2004).

3.9.2. Diversidad de los NoV en el reconocimiento de los receptores HBGA

Los NoV difieren considerablemente en su capacidad de reconocimiento de los receptores

HBGA humanos (Figura 22). Usando un panel de muestras de saliva bien caracterizadas


_____________________________________________________________________________

69

representando diferentes grupos sanguíneos Huang et al. describieron 7 patrones de unión de

NoV al receptor de acuerdo con el tipo ABO, Lewis y secretor de los donantes (Huang et al.,

2003; Huang et al., 2005). Posteriormente, Harrington et al. describieron un patrón adicional

(Harrington et al., 2002; Harrington et al., 2004). Además, se identificaron dos genotipos de

NoV (VA115 y virus Desert Shield, DSV) que no se unieron a ninguno de los HBGA humanos

(Huang et al., 2005). Estos mismos resultados se obtuvieron usando VLPs recombinantes de

NoV generadas con un vector del VEE (Harrington et al., 2002) mediante la expresión del

dominio P de la cápside en Escherichia coli (Tan et al., 2004; Tan et al., 2005c).

Los estudios basados en saliva han sido confirmados por medio de ensayos de unión y

bloqueo usando oligosacáridos sintéticos análogos a los HBGA (Huang et al., 2005). En el caso

del prototipo de NoV, el virus Norwalk, se observa su unión a la saliva de los tipos secretores A

y O, pero no a la de los secretores B ni a los no secretores. De forma análoga se une a los

oligosacáridos sintéticos tipo A, Le b, B Le b, H1 y H3, que son los productos HBGA esperados

para los secretores A y O, pero no se une a los oligosacáridos producidos por los individuos de

grupo B (Huang et al., 2005). Respecto a otros NoV, el genotipo VA387 (NoV GII.4) se une a

los secretores A, B y O, pero se une muy excepcionalmente a los no secretores y por tanto

reconoce los oligosacáridos sintéticos A, B, Le b, B Le b, H1 y H3, pero no Le a ni Le b.

Asimismo, se han descrito comportamientos imprevisibles en la unión de los NoV a saliva y a

oligosacáridos sintéticos, existen cepas que sólo reconocen A y B o bien A o bien B. Además

los genotipos VA207, Boxer y OIF (Operation of Iraqi Freedom) se unen a la saliva de los

secretores y no secretores con una afinidad variable (Huang et al., 2005), muestran actividades

de unión impredecibles con los oligosacáridos sintéticos Lewis: OIF reacciona con Lea, VA207

con Le b y B Le b, y Boxer con Le b y B Le b, pero ninguno de los tres genotipos reconoce los

oligosacáridos A o B (Huang et al., 2005; Tan et al., 2005b).

Figura 22. Inhibición de la unión de NoV por leche materna (modificado de Jiang et al., 2004a).


_____________________________________________________________________________

70

La actividad bloqueante de la leche materna de las primeras semanas postparto de 60 mujeres

frente a la unión de 2 genotipos de NoV (VA387 y Norwalk) a receptores específicos se midió

mediante ensayos de unión a receptores en saliva en presencia o ausencia de leche materna. La

propiedad bloqueante se calculó en base a las diferencias de densidad óptica en presencia o

ausencia de leche materna.

Los tipos de antígenos histosanguíneos se detallan en la parte superior de la figura.

Se han desarrollado muy diferentes aproximaciones al estudio de la especificidad de

unión NoV-receptor HBGA como el bloqueo de la unión por leche humana o por anticuerpos

monoclonales específicos de los antígenos H, los ensayos de hemaglutinación y la lisis de la

unión mediante el tratamiento con glucosidasas específicas (Marionneau et al., 2002; Harrington

et al., 2002; Hutson et al., 2003; Huang et al 2003; Harrington et al., 2004; Huang et al., 2005).

Hay que tener en cuenta también que se han identificado discrepancias menores en los

resultados obtenidos por diferentes métodos (Huang et al., 2005). Por ej. Hawaii, que no se une

a ninguno de los HBGAs en los ensayos de saliva, reacciona con los oligosacáridos sintéticos A,

B y Leb. De forma similar, BUDS reacciona con los oligosacáridos sintéticos A y B, pero se une

solamente a la saliva tipo A (Huang et al., 2005). Parris island (PiV), Mexico (MxV) y Hawaii

no se unen a la saliva tipo O, pero sí al antígeno sintético Le b (Huang et al., 2005; Tan et al.,

2005ª; 2005b). Snow Mountain se une a los antígenos tipo B, pero un estudio en voluntarios no

muestra una correlación con la infección clínica en estos individuos (Lindesmith et al., 2005). A

pesar de lo imprevisible de estas actividades de unión, han demostrado ser reproducibles y

dosis-dependientes.

Asimismo, se ha descrito la influencia de ciertos factores del huésped en la actividad de

unión al receptor, por ej. la adición de extractos de heces resulta en un incremento significativo

de la unión de ciertos genotipos a la saliva humana (Harrington et al., 2004).

3.9.3. Modelos de interacción NoV-HBGA

La gran susceptibilidad que muestra la población a diferentes cepas de NoV (Harrington

et al., 2002; Huang et al., 2003; Harrington et al., 2004; Huang et al., 2005; Tan et al., 2005a) a

pesar de la existencia de una especificidad en la unión de cada cepa de NoV a receptores HBGA

(Parrino et al., 1977), plantea la hipótesis de la existencia de otros receptores adicionales o unas

interacciones de un nivel de complejidad mayor al conocido en la unión de NoV-HBGA

(Carlsson et al., 2009).

En relación a esto, los patrones de interacción NoV-HBGA referidos pueden dividirse en

dos grandes grupos: los grupos de unión ABO y Lewis (Huang et al., 2005), como muestra la

tabla 9. Todos los genotipos de los grupos de unión ABO (VA387, Grimsby, Norwalk, C59,


_____________________________________________________________________________

71

MOH, PiV, MxV, BUDS, HV y SMV) se unen a los tipos A y/o B y O de saliva de los

secretores, pero no parecen unirse a los no secretores. A diferencia de esto, los genotipos del

grupo de unión Lewis (VA207, Boxer y OIF) se unen a los HBGAs de los no secretores y a los

de tipo O de los secretores y no se unen o lo hacen débilmente a los tipos A y B de los

secretores. Estas actividades débiles de unión de estos genotipos a los tipos A y B en saliva no

se deben a la unión con los oligosacáridos A ni B, sino a los epítopos Lewis o H de las

moléculas precursoras de los antígenos A o B de estos individuos, VA207 y Boxer podrían tener

dos sitios de unión (uno para cada uno de los epítopos Lewis y H) mientras que OIF podría

tener un sitio para el epítopo Lewis solamente (figura 22). Como se ha comentado previamente,

estos genotipos no reconocen los epítopos A y B, de hecho su presencia podría tener un efecto

negativo (de enmascaramiento de epítopo) que justificaría la baja actividad de unión de los

genotipos Lewis con los tipos A y B de secretores en saliva en comparación con la saliva de los

no secretores o de los secretores tipo O, en los cuales la unión podría resultar de las moléculas

precursoras como A Le b o B Le b antes de que se convirtieran en los antígenos maduros A y B,

respectivamente. Este efecto de enmascaramiento de epítopo es más aparente en el genotipo

VA207, en el cual las VLPs revelan una típica interacción en tres pasos que muestra una unión

más fuerte a la saliva de los no secretores, de intensidad intermedia a la saliva de los secretores

tipo O y más débil a los de tipo A y B. En el caso de Boxer, el epítopo H podría tener un papel

más importante, pero el enmascaramiento de los epítopos ABO también existe. Al comparar los

perfiles de unión de los tres genotipos Lewis, el efecto de enmascaramiento del epítopo B

parece más fuerte ya que ninguno se une a saliva de individuos secretores tipo B.

Tabla 9. UNIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS/HBGAS SINTÉTICOS A VLPS DE NOV (Huang et al., 2005)

OLIGOSACÁRIDOS/

HBGAs

GENOTIPOS DE NOV

GRUPO DE UNIÓN ABO GRUPO DE UNIÓN

LEWIS

VA387 Norwalk MxV PiV HV MOH BUDS OIF VA207 Boxer

Lea (tri-) - - - - - - - + - -

Leb (tetra-) + + + + + + + - - - - + +

Lex (tri-) - - - - - - - - + + + + +

Ley (tetra-) ++++ + - - - - - - + + + + +

H-1 (tri-) + + + + - - - - - - - -

H-2 (tri-) - - - - - - - - - -

H-3 (di-) ++++ + - - - - - - - -

A (tri-) ++++ + + + + + + + + + + + + + - - -

B (tri-) ++++ - + + + + + + + + + + + - - -


_____________________________________________________________________________

72

Para dilucidar la relación entre los dos grupos de unión se ha propuesto un modelo de

interacción del NoV al HBGA (Huang et al., 2005; Tan et al., 2004), que asume que la proteína

de la cápside de cada genotipo tiene una superficie de unión que puede acoplar uno o dos

epítopos de los tres HBGAs mayores (ABO, H o Lewis), como muestra la figura 23. Cada uno

podría unirse a esta superficie de forma independiente y la participación de ambos epítopos en

la unión puede resultar en una ampliación de las especificidades del huésped para los diferentes

genotipos.

Por ejemplo, todas las cepas del grupo de unión ABO tienen un sitio común para los

epítopos ABO, mientras que las cepas VA387, GrV y Norwalk tienen un sitio adicional para el

epítopo H por lo que estos genotipos tienen un rango más amplio de posibles huéspedes que

aquellos con un solo sitio de unión a los epítopos ABO, como MOH, BUDS y SMV.

Figura 23. Representación gráfica de la interacción de NoV y HBGA basada en la clasificación en

dos grupos de unión de NoV con los HBGAs: el grupo de unión ABO y Lewis (Tan et al., 2005b).

La estructura de cinco círculos mostrada en la esquina superior derecha representa el

pentasacárido, producto final de la vía de síntesis de los HBGAs. Asimismo, se indican los sitios

potenciales de unión de los diferentes géneros de NoV para los epítopos de los HBGAs.

3.9.4. Múltiples redes de interacción entre NoV y los receptores HBGA

Recientemente se han obtenido por cristalografía de alta resolución los detalles

estructurales del dominio P de VA387 unido al receptor HBGA (Cao et al., 2007), lo que nos

proporciona un conocimiento mucho más profundo de la estructura establecida para la


_____________________________________________________________________________

73

interacción de ambos y permite una correlación con los estudios de funcionalidad por medio de

ensayos de mutagénesis dirigida (Prasad et al., 1994a; 1994b; Prasad et al., 1999; Tan et al.,

2006; Tan et al., 2005c; Tan et al., 2003; Tan et al., 2004; Chakravarti et al., 2005).

Los HBGAs nativos de la superficie celular y los sitios de unión al receptor de las

cápsides virales son multivalentes y podrían formar una gran red con diferentes niveles de

interacción que proporcionarían una gran afinidad en las interacciones del virus con el huésped.

Los estudios de densidad electrónica han descrito extensas redes de enlaces hidrogenados entre

la cápside y los ligandos sacarídicos. Una de las principales cadenas laterales de los receptores

de ligandos, la α-1,3-Fuc (el epítopo H), interacciona de forma intensa con una cavidad abierta

en la superficie de interacción de la unión al receptor que se compone de tres integrantes: (1)

Ser343, Thr344 y Arg345 sobre una cadena β-laminar que forma el fondo de la cavidad, (2)

Asp374 mediante una curvatura larga forma un muro en la cavidad y (3) Ser441, Gly442 y

Tyr443 por medio de otra curvatura forman otro muro en la misma. Los epítopos A y B (N-

acetilgalactosamina y galactosa, respectivamente) probablemente interaccionan con Ala346,

Lys348 y Ser441 (Cao et al., 2007), un sitio de interacción más lejano del anillo de β-1,3-Gal

junto a los epítopos A y B cercano a Asp391, cuya unión podría favorecer la afinidad de

interacción a los receptores. La superficie de interacción de unión al receptor se encuentra en los

dímeros P, indicando que la dimerización del dominio P no es sólo importante para la formación

de la cápside sino también esencial para el funcionamiento de la unión al receptor. Además de

las interacciones específicas descritas, podrían ocurrir otras para estabilizar la unión del NoV al

receptor específico (Tan et al., 2003; Tan et al., 2004; Chakravarti et al., 2005; Tan et al.,

2005c). En ellas podrían intervenir aminoácidos alrededor de la superficie de interacción de

unión con los residuos glucídicos y moléculas diferentes de los HBGAs como la proteína de

membrana de 105 KDa y el heparán sulfato (Tamura et al., 2000; Tamura et al., 2004).

3.9.5. Participación de los HBGA en la inmunidad del huésped frente a NoV

El descubrimiento de la asociación entre HBGAs específicos y la infección clínica por

NoV ha supuesto un avance muy significativo en la investigación de estos virus, pues explica

una serie de cuestiones controvertidas acerca de sus mecanismos de infección y respuesta

inmunitaria que han desconcertado a los científicos durante décadas.

En primer lugar, en los estudios con voluntarios sanos se observaba mayor susceptibilidad

a la infección en aquellos individuos con títulos de anticuerpos específicos más altos previos a

la exposición (Parrino et al., 1977; Greenberg et al., 1979; Black et al., 1982; Blacklow et al.,

1982; Baron et al., 1984; Blacklow et al., 1987; Kapikian et al., 1996) y resistencia a la misma

en los que carecían de ellos (Parrino et al., 1977). Además, al analizar los brotes epidémicos era


_____________________________________________________________________________

74

característica la existencia de un enclaustramiento del virus en una misma familia y no la

habitual propagación por razones de cercanía o contacto (Kappus et al., 1982).

En base a estas observaciones se formuló la hipótesis de la existencia de un factor

genético que participaría en los mecanismos de especificidad del huésped y determinaría su

susceptibilidad o resistencia, lo que llevó al descubrimiento de la participación de los HBGAs

en el reconocimiento de los NoV por el huésped.

Actualmente se interpreta que aquellos voluntarios que nunca se infectaron con NoV tras

la exposición no debían tener receptores en su mucosa intestinal que permitieran su

internalización y posterior replicación. En cambio aquellos individuos con niveles elevados de

anticuerpos frente a NoV serían susceptibles a estas infecciones al indicar estos anticuerpos una

exposición e infección en el pasado por los viriones, debido a la presencia de receptores HBGA

en los enterocitos.

Sin embargo, los anticuerpos producidos no serán protectores si los genotipos de NoV

que han desencadenado su producción guardan una relación antigénica débil con los

responsables del nuevo contacto (Kitamoto et al., 2002; Lochridge et al., 2005; Hansman et al.,

2006) o, en caso de tratarse de genotipos homólogos, si ha transcurrido un periodo superior a 14

semanas. En consecuencia, los niveles elevados de anticuerpos sólo sirven como un marcador

de exposición en el pasado a ciertos genotipos de NoV pero no condicionan inmunidad

protectora en el sentido clásico de la misma.

3.9.6. Los HBGA de la leche materna como receptores señuelo para NoV

Las evidencias clínicas observadas en estudios retrospectivos de niños lactados al pecho

frente a niños que toman fórmula (Newburg et al., 1995b; Jiang et al., 2004a; 2004b; Morrow et

al., 2005; Newburg et al., 2005a; 2005b; Marionneau et al., 2005; Newburg et al., 2009), así

como en estudios prospectivos de cohortes de madre-hijo que analizan la incidencia de la

infección por NoV en estos niños (Morrow et al., 2004) muestran que, además de los nutrientes

que proporciona, la leche materna contiene elementos beneficiosos que protegen a los niños

frente a enfermedades infecciosas.

La leche humana contiene cientos de oligosacáridos con complejas estructuras y

diferentes tamaños (Kunz et al., 2000), que pueden ser una rica fuente de receptores que

actuarían como señuelo para muchos patógenos.

La composición de dichos oligosacáridos viene dada por diferentes factores

constitucionales de las madres, que podrían explicar la variabilidad existente en su unión a los

NoV. Jiang et al. diseñaron un panel de muestras de leche de madres sanas para estudiar su

capacidad de bloqueo de la unión de las VLPs de NoV a los antígenos HBGA y describieron

CALICIVIRUS. EL GÉNERO NOROVIRUS. Mecanismos de adaptación evolutiva.

_____________________________________________________________________________

75

actividades bloqueantes significativamente diferentes en relación con los grupos sanguíneos de

las madres donantes y los genotipos de NoV usados en los ensayos (Jiang et al., 2004a; 2004b),

figura 22.

3.10. MECANISMOS DE ADAPTACIÓN EVOLUTIVA

El género NoV presenta una enorme variabilidad genética que se explica por mutaciones

puntuales y por recombinación entre diferentes fragmentos homólogos de ARN que por

coinfección han entrado en una misma célula (Oliver et al., 2004). Asimismo, se ha descrito la

recombinación genética entre fragmentos heterólogos, es decir entre diferentes genogrupos,

genotipos y subgenotipos, incluso entre los genogrupos de NoV que producen infecciones en

animales (II, III y V), lo que sugiere la posibilidad de infecciones zoonóticas en humanos (Phan

et al., 2007). En relación con esto, se ha publicado una clasificación de NoV que, a diferencia de

los esquemas existentes (basados en los análisis filogenéticos convencionales), organiza los

virus en diferentes genogrupos y genotipos según sus propiedades funcionales, resultado de las

sutiles variaciones evolutivas que han experimentado (Chakravarty et al., 2005).

El estudio de los mecanismos evolutivos de persistencia de los NoV se ha realizado,

fundamentalmente, con el genogrupo GII.4, el genotipo predominante a nivel mundial en los

últimos 20 años. Se ha propuesto que GII.4 ha sufrido un proceso de evolución secuencial

similar al ocurrido con los virus gripales (Donaldson et al., 2008). La mayor parte de sus

variaciones ocurren cerca del dominio de unión al receptor, en la proteína VP1, y consisten en

cambios de aminoácidos de la región P2 (Nilsson et al., 2003) y en zonas adyacentes de la

región P1 (Donaldson et al., 2008), no obstante también se han descrito cambios en la región

altamente conservada de la ARN-polimerasa (Vinjé et al., 2000a). Estas variaciones permitirían

escapar a los virus del reconocimiento por los anticuerpos y originarían nuevos patrones de

unión a los receptores HBGA (Donaldson et al., 2008; Lindesmith et al., 2008), lo que

explicaría la posibilidad de infección a individuos no secretores descrita en numerosas

publicaciones (Jiang et al., 2004a; 2004b; Carlsson et al., 2009; Tan et al., 2009).

Las variaciones antigénicas no son la única razón para la alta prevalencia de los NoV.

Como se ha comentado previamente, el hecho de que un NoV específico sea capaz de reconocer

diferentes antígenos histosanguíneos y, por tanto, un amplio espectro de huéspedes también

contribuye a ello (Tan et al., 2005a; 2005b).

INMUNIDAD DE LA LECHE MATERNA. Antecedentes históricos.

_____________________________________________________________________________

76

4. INMUNIDAD DE LA LECHE MATERNA

4.1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS

Paul von Ehrlich publicó en 1891 las primeras evidencias de que la lactancia materna

podía conferir una protección inmunitaria al lactante tras realizar estudios en modelos animales

de experimentación (Von Ehrlich., 1891, citado por Cheeda et al., 1998). Sin embargo, no fue

hasta la primera mitad del siglo XX cuando se desarrollaron estudios en humanos para

investigar esta hipótesis. Entonces Woodbury y Grulee et al. observaron que la incidencia y la

gravedad de las enfermedades diarreicas era mucho menor en los niños lactados al pecho frente

a aquellos alimentados con fórmula (Woodbury., 1922; Grulee et al., 1934; Grulee et al., 1935).

En los años 50, debido a la mejora en la composición de las fórmulas lácteas artificiales y a la

mayor ganancia de peso de los niños alimentados con ellas, muchos recomendaron la

alimentación con fórmula de modo preferente a la leche materna lo que se relacionó con una

morbilidad y mortalidad crecientes debido a diarrea aguda y enfermedades respiratorias en los

lactantes. A raíz de ello resurgió el interés acerca del estudio de las posibles propiedades

protectoras de la leche materna frente a estas entidades.

Se publicaron numerosas descripciones acerca de la diferente morbi-mortalidad en los

lactantes alimentados al pecho o con fórmula, tanto en países en vías de desarrollo como en

países desarrollados (Wyatt et al., 1969; Mata et al., 1969b; Glass et al., 1976; Clemens et al.,

1986; McLean et al., 1986; Glass et al., 1989) y se demostró que el espectro de protección

proporcionado por la lactancia materna incluía tanto las infecciones intestinales bacterianas

como víricas, incluyendo Shigella sp. (Mata et al., 1969a; Clemens et al., 1986; Glass et al.,

1989), Salmonella sp. (Glass et al., 1989), Escherichia coli (Glass et al., 1989), Vibrio cholerae

(Glass et al., 1983), rotavirus (Totterdell et al., 1976; McLean et al., 1981; Duffy et al., 1986) y

poliovirus. Además, la diferente susceptibilidad a la adquisición de infecciones en niños

lactados al pecho y alimentados con fórmula también se observó en relación con las infecciones

respiratorias (Downham et al., 1976; Kramer et al., 1988; Howie et al., 1990; Pullan et al., 1990;

Hamosh et al., 1991; Grulee et al., 1991).

Para explicar estos hallazgos se plantearon inicialmente diversas hipótesis: (a) que la

leche materna, al tener menor grado de contaminación por microorganismos patógenos que la

fórmula, transmitía menos infecciones a través de ella, (b) que debido al espaciamiento entre los

nacimientos que implica el efecto contraceptivo de la lactancia la existencia de niños

susceptibles a agentes infecciosos comunes era menor en familias donde se practicaba la

lactancia materna y (c) que los niños lactados al pecho se encontraban con menor probabilidad

en residencias infantiles y por tanto tenían una menor exposición a otros niños, portadores de

patógenos microbianos (Wyatt et al., 1969).

INMUNIDAD DE LA LECHE MATERNA. Antecedentes históricos.

_____________________________________________________________________________

77

Sin embargo, la resistencia natural frente a infecciones intestinales y respiratorias

observada en los niños lactados al pecho no parecía explicarse completamente por estas

circunstancias epidemiológicas, se planteó que debían existir componentes con propiedades

protectoras en la leche materna responsables de tal propiedad. Así, Wyatt y Mata describieron

una menor incidencia de infecciones en los niños que tomaban lactancia materna incluso cuando

ciertas bacterias como Shigella sp. se identificaban en la leche (Wyatt et al., 1969) y

demostraron que la cercanía a otros niños no explicaba por completo las diferencias de

incidencia de infecciones en los lactantes.

Además, la leche materna ha demostrado sus propiedades protectoras en un grupo de

niños especialmente susceptibles a la infección como son los recién nacidos pretérmino. En

ellos el retraso madurativo del sistema inmunitario, los problemas médicos que presentan (las

enfermedades pulmonares, digestivas y los trastornos nutricionales) y la necesidad de

procedimientos clínicos invasivos incrementan el riesgo de adquisición de infecciones por

agentes oportunistas (Aerde, 1991). Winberg et al. en Suecia fueron los primeros en publicar

que el riesgo de sepsis disminuye en los recién nacidos pretérmino alimentados con leche

humana (Winberg et al., 1971). Estas observaciones fueron confirmadas por Yu et al. en

Australia y Narayanam et al. en la India, quienes encontraron una relación directa entre la

administración de suplementos alimenticios extraídos de la leche materna y una menor

frecuencia de infección en recién nacidos de muy bajo peso (Yu et al., 1981; Narayanam et al.,

1980).

Los estudios epidemiológicos sugieren que la leche humana protege frente a la

enterocolitis necrosante (Eibl et al., 1988) y, aunque se han desarrollado múltiples

investigaciones para esclarecer los factores responsables de esta protección, estos no han sido

completamente elucidados (Lucas et al., 1990a). Además, existen evidencias experimentales de

que uno de los componentes antiinflamatorios de la leche humana (la α-1-antitripsina) previene

frente a muchas de las alteraciones vasculares y pulmonares que suceden como consecuencia de

la exposición a un ambiente hiperóxico en ratas recién nacidas, tales como la elevación de la

actividad elastolítica pulmonar (Koppel et al., 1994). En cuanto a los efectos de la lactancia

materna en los recién nacidos pretérmino tras la hospitalización inicial, Malloy y Graubard

revisaron la relación entre el tipo de alimentación y diferentes factores biológicos y sociales en

la tasa de rehospitalización de los niños que habían nacido prematuramente y demostraron que

la alimentación con leche materna fue un factor predictor independiente para un menor riesgo de

rehospitalización en estos niños (Malloy et al., 1994).

La adquisición de conocimientos acerca del sistema inmunitario de la leche materna fue

un proceso lento que se inició en la última parte del siglo XVII, cuando Van Leeuwenhoek

INMUNIDAD DE LA LECHE MATERNA. Mecanismos de protección.

_____________________________________________________________________________

78

observó unas estructuras en la leche materna que no fue capaz de identificar (Van Leeuwenhoek

et al., 1695, citado por Cheeda et al., 1998). En 1837 Alfred Donné describió unos glóbulos y

corpúsculos granulares en la leche humana (Donné et al., 1837, citado por Cheeda et al., 1998),

pero debido a la falta de extensiones citológicas adecuadas no se identificaron como células

hasta principios del siglo XX ni como leucocitos hasta 1968 (Smith et al., 1968).

En la década de los 70 se conocían los siguientes aspectos generales del mismo (Goldman

et al., 1973; Goldman et al., 1986): (a) gran similitud al sistema inmunitario de las mucosas, (b)

adaptación de sus componentes a resistir en un ambiente hostil del tracto gastrointestinal, al no

modificarse por los enzimas digestivos ni los cambios de pH, (c) actividad sinérgica de sus

agentes efectores en la destrucción de ciertas bacterias, (d) protección independiente de la

activación de cascadas inflamatorias y (e) relación inversa de la producción diaria de diferentes

factores y su secreción a través de la leche materna con la habilidad del niño lactado para

generar dichos agentes en sus mucosas, es decir una evolución coordinada de la maduración del

sistema inmunitario del niño y la habilidad de la madre para producir y secretar factores

inmunitarios de la glándula mamaria a la leche.

El sistema inmunitario de la leche materna, sus características y la mayoría de sus

componentes se han conocido en las cuatro últimas décadas. En la actualidad, se conoce con

mucha mayor extensión su organización y mecanismos de acción.

4.2. MECANISMOS DE PROTECCIÓN

4.2.1. Factores probióticos

En 1905 Tissier et al. (Cheeda et al., 1998), documentaron la diferencia de composición

de la microflora intestinal entre los niños lactados al pecho y los alimentados con fórmulas

lácteas. Los niños que tomaban leche materna mostraban un predominio de lactobacilos, en

particular Lactobacillus bifidus (conocido actualmente como Bifidobacterium bifidum) en sus

heces (György et al., 1974; Nichols et al., 1975; Bezkorovainy et al., 1979; Bezkorovainy et al.,

1981), en cambio en la microbiota intestinal de los niños alimentados con fórmulas adaptadas y

de los adultos se aisló Escherichia coli principalmente (Tissier, 1905).

Debido a que Lactobacillus sp. produce grandes cantidades de ácido acético y láctico a

partir de lactosa, la presencia de estos ácidos junto con la baja capacidad tampón de la leche

humana hace que el pH en el intestino distal sea de aproximadamente 5, lo que puede impedir la

colonización por muchos patógenos (Fomon, 1995). Además las cepas de Lactobacillus GG

colaboran en la recuperación de la gastroenteritis aguda por rotavirus (Isolauri et al., 1991) y

podrían incrementar la formación de anticuerpos IgA, IgM, e IgG específicos frente a estos


_____________________________________________________________________________

79

virus entéricos (Kaila et al., 1992). Es por ello por lo que se planteó la hipótesis de que la leche

materna podría mediar la protección del niño lactado frente a ciertos patógenos intestinales a

través de componentes promotores de la colonización por Lactobacillus bifidus.

Sin embargo, no fue hasta 1974 cuando se aisló un glicano de la leche materna con

propiedades promotoras del crecimiento de Lactobacillus bifidus y se identificó con el

previamente denominado “factor bifidus” (Gyorgy et al., 1974). Posteriormente se han

reconocido otros glicanos, especialmente en la fracción de caseínas, no digeribles y capaces de

modificar la microflora intestinal actuando como una fuente nutricional para la microbiota

saprofita (Macfarlane et al., 1997), es decir con un efecto prebiótico (Bezkorovainy et al.1979;

Bezkorovainy et al., 1981).

4.2.2. Anticuerpos secretores

Los anticuerpos secretores se encuentran, junto con la lactoferrina, la lisozima, las

mucinas y la lactadherina, entre las principales proteínas de la leche materna que presentan

actividad antimicrobiana directa.

Tras el descubrimiento de la IgA secretora (IgAs) en la leche humana por Hanson en

1961 este anticuerpo ha sido considerado el componente protector principal de la leche materna

(Hanson et al., 1961; Hanson et al., 1962), puesto que las elevadas concentraciones de IgA en el

calostro parecían explicar un mecanismo de transmisión de factores inmunitarios de la madre al

niño adicional al paso transplacentario de IgG durante la gestación.

La IgA constituye más del 95% de las inmunoglobulinas de la leche materna (Goldman et

al., 1989), está integrada por dos monómeros idénticos de IgA formados por cadenas ligeras λ

que se encuentran unidos por un polipéptido de 75 KDa denominado cadena de unión a

diferencia de las inmunoglobulinas del suero humano en las que predominan las cadenas ligeras

κ (Brown et al., 1976). La IgA dimérica sufrirá varias modificaciones que la transformarán en

IgAs in situ.

El descubrimiento de anticuerpos tipo IgA en la leche materna con especificidad frente a

patógenos inusuales (tabla 10) y las investigaciones sobre su origen han permitido conocer que

los eventos desencadenantes de la producción de IgA secretora específica frente a ciertos

patógenos podrían ser las infecciones maternas por estos agentes (Goldblum et al., 1975). Se

plantea que los patógenos que producen estas infecciones podrían estimular las células

mononucleares de las placas de Peyer del intestino delgado distal (en el caso de las infecciones

intestinales) y otros centros linfoides (en el caso de infecciones de diferente origen). Como

consecuencia, tendría lugar una liberación de citoquinas (Erle et al., 1994) que inducirían a los

linfocitos B IgM+

a transformarse en células B IgA+ o a completar su diferenciación final a

células secretoras de IgA (Beagley et al., 1989; Schultz et al., 1991; Kono et al., 1991;


_____________________________________________________________________________

80

Whitmore et al., 1991). Estas células, probablemente, migrarían secuencialmente a través de los

canales intestinales linfáticos, el conducto torácico y la circulación vascular, gracias a hormonas

lactogénicas y otros factores no conocidos completamente, (Roux et al., 1978; Weisz-

Carrington et al., 1978) hasta la glándula mamaria y el árbol bronquial (Fishaut et al., 1981;

Streeter et al., 1988). Al parecer su diferenciación hacia células plasmáticas tendría lugar a su

llegada y con esta configuración permanecerían en la lámina propia de la glándula mamaria. Los

dímeros de IgA producidos por aquellas células plasmáticas se transformarían en IgAs en este

momento y se unirían a los receptores de polímeros de inmunoglobulinas de la pared basolateral

de las membranas celulares del epitelio de la glándula mamaria (Brown et al., 1976; Brandtzaeg

et al., 1978; Mostov et al., 1982; Crago et al., 1982; Bakos et al., 1991). El complejo resultante

receptor-dímero de IgA sería transportado al extremo apical de la célula, donde la porción

intracitoplasmática original del receptor se retiraría y la molécula resultante, la IgA secretora se

secretaría a la leche (Brandtzaeg et al., 1978; Mostov et al., 1982).

Es conocido que la primera subclase de IgA (IgA1) es susceptible a las proteasas

intestinales que atacan la región bisagra de la molécula (Gilbert et al., 1983) y la desestructuran,

pero la segunda subclase (IgA2) es resistente a ellas y su abundancia en la leche materna

garantiza el aporte suficiente al recién nacido (Lindh et al., 1985; Goldman et al., 1989). La

leche materna además contiene anticuerpos de tipo IgAs frente a las proteasas anti-IgA que

ayudan a evitar la destrucción de esta inmunoglobulina (Gilbert et al., 1983). Un dato que

confirma la resistencia de la IgA de la leche materna a los enzimas digestivos es la presencia de

IgA en las heces de los recién nacidos, aproximadamente 30 veces mayor a la encontrada en los

niños alimentados con fórmula (Schanler et al., 1986; Prentice et al., 1987; Goldblum et al.,

1989). Cuando es ingerida por el lactante, la resistencia de la IgA secretora a los enzimas

digestivos permite que alcance el intestino delgado donde se une a los patógenos entéricos y así

protege al niño lactado (Hanson et al., 1991), de forma análoga sucede en el caso del árbol

bronquial y las infecciones respiratorias (Goldman et al., 1985; Slade et al., 1987).

En resumen, las vías enteromamaria y broncomamaria podrían ser los medios por los que

se confiere una protección inmunitaria mediada por IgAs frente a patógenos específicos

intestinales y respiratorios a los recién nacidos que toman lactancia materna, lo que es relevante

porque los anticuerpos de la mucosa intestinal y respiratoria y el repertorio de inmunoglobulinas

de unión al antígeno no se producen de forma óptima durante la infancia más precoz (Adderson

et al., 1992).


_____________________________________________________________________________

81

Tabla 10. IgA SECRETORA EN LECHE MATERNA FRENTE A

PATÓGENOS MICROBIANOS COMUNES

BACTERIAS Y TOXINAS VIRUS OTROS

Escherichia coli

Shigella sp.

Salmonella sp.

Campylobacter sp.

Vibrio cholerae

Haemophillus influenzae

Streptococcus pneumoniae

Clostridium difficile

Clostridium botulinum

Klebsiella pneumoniae

Helicobacter pylori

Rotavirus

Virus respiratorio sincitial

Poliovirus

Otros Enterovirus

Virus Influenza

Citomegalovirus

VIH

Giardia lamblia

Candida albicans

La concentración de IgAs en la leche materna es mayor en el calostro (Goldblum et al.,

1982) y declina progresivamente hasta un nivel de 1 mg/ml aproximadamente en etapas

posteriores de la lactancia (Asensi et al., 2006; Goldman et al., 1982). Se estima que la media

aproximada de ingesta diaria de IgA en el recién nacido a término, sano, lactado al pecho es de

125 mg/kg/día con un mes de vida y 75 mg/kg/día a los 4 meses (Butte et al., 1984), cantidades

suficientes para garantizar las mencionadas propiedades protectoras al niño en todas las etapas

de la lactancia (Goldblum et al., 1982; Goldman et al., 1982; Goldman et al., 1983; Butte et al.,

1994).

La protección por la IgA parece ser un mecanismo efectivo principal para proteger a los

niños de los patógenos a los que la madre se ha expuesto previamente. Sin embargo, el decalaje

temporal existente entre la exposición materna a un nuevo patógeno y la aparición de IgAs en su

leche supone un tiempo suficiente para que el patógeno pueda establecer la infección en el niño

si éste se expone a él, por lo que se planteó que debían de existir otros factores protectores en la

leche materna que explicaran las evidencias clínicas observadas.

Tras el descubrimiento de la IgAs de la leche materna, se identificaron otros tipos de

inmunoglobinas en la leche humana. Se ha descrito la presencia de IgM en la leche materna

aunque en mucha menor concentración que en el suero (Mata et al., 1971; Jatsyk et al., 1985).

Además existen diferencias estructurales entre la IgM láctea y sérica, pues si bien ambas

presentan una estructura pentamérica, algunas moléculas de IgM de la leche humana presentan


_____________________________________________________________________________

82

componentes secretores asociados (Goldman et al., 1989). En cuanto a su especificidad, parece

desarrollarse de forma similar a lo descrito para la IgA.

La IgG está también presente en pequeñas cantidades en la leche materna (Mata et al.,

1971; McClelland et al., 1978; Keller et al., 1984; Jatsyk et al., 1985; Goldman et al., 1989), de

hecho todas las subclases de IgG han sido detectadas en ella (Keller et al., 1983), observándose

una mayor proporción de IgG4 en la leche humana que en el suero (Keller et al., 1983).

Asimismo, existen pequeñas cantidades de IgD en la leche materna (Keller et al., 1984). En

cambio la IgE está prácticamente ausente (Underdown et al., 1976).

4.2.3. Otros componentes defensivos de la leche materna

Se ha detectado un grupo heterogéneo de componentes de la leche materna que presentan

una acción sinérgica y complementaria a la de los anticuerpos secretores y otros factores

inmunitarios de la leche materna (Tabla 11).

4.2.3.1. Inhibidores del metabolismo de los patógenos

La lactoferrina es una glicoproteína de cadena única con dos componentes globulares, cada

uno de los cuales presenta un sitio de unión al hierro (Anderson et al., 1980).

Posee reconocidas propiedades antimicrobianas: (a) un 90% de la lactoferrina presente en

la leche materna se une a ciertas bacterias y hongos y tras quelarlos con hierro impide su

proliferación (Bullen et al., 1972; Stephens et al., 1980; Spik et al., 1982; Sturat et al., 1984),

proceso que favorece el bicarbonato, principal tampón de la leche materna; (b) uno de sus

fragmentos (la lactoferricina) destruye ciertos microorganismos dañando sus membranas

externas, para lo que requiere Ca2+

, Mg2+

y Fe3+

(Arnold et al., 1977; Bellamy et al., 1993;

Yamauchi et al., 1993); (c) además, existe alguna evidencia de que isoformas de lactoferrina

podrían proteger frente a ciertos retrovirus por medio de un proceso independiente a la

quelación del hierro (Furmanski et al., 1989), (d) asimismo, las actividades promotoras del

crecimiento epitelial que inicia la lactoferrina contribuyen a la defensa del niño lactado (Nichols

et al., 1987).

La concentración media de la lactoferrina en el calostro humano está entre 5 y 6 mg/ml

(Goldblum et al., 1982). En las siguientes etapas de la lactancia el aumento de volumen de

producción de leche aumenta y la concentración de lactoferrina cae aproximadamente a 1 mg/ml

a los 2 o 3 meses de lactancia (Goldman et al., 1982). De esta forma la ingesta media de

lactoferrina en un niño sano, a término y lactado al pecho es de 260 mg/kg/día al mes de vida y

de 125 mg/kg/día a los 4 meses, aproximadamente (Butte et al., 1984).

Debido a la resistencia natural a la proteolisis de la lactoferrina (Samson et al., 1980;

Brines et al., 1983; Spik et al., 1966) su excreción fecal es muy superior en niños lactados al


_____________________________________________________________________________

83

pecho respecto a los alimentados con fórmula (Spik et al., 1982; Schanler et al., 1986; Davidson

et al., 1987). La cantidad de lactoferrina excretada en las heces de niños alimentados con leche

materna es cercana a 185 veces la excretada por los niños alimentados con fórmula (Wyatt et al.,

1969), aunque hay que considerar que esta cifra podría sobreestimar la realidad debido a la

presencia de fragmentos inmunorreactivos de lactoferrina en las heces de los niños lactados al

pecho (Goldman et al., 1990).

Además, se ha cuantificado un aumento de la excreción urinaria de lactoferrina intacta y

fragmentada (Schanler et al., 1986; Goldman et al., 1990), habiéndose demostrado mediante

estudios isotópicos que procede de la leche ingerida que tras ser absorbida a nivel intestinal,

alcanza la circulación vascular y es filtrada en el riñón (Hutchens et al., 1991).

La κ-caseína es una proteína altamente glicosilada con residuos de ácido siálico cargados

(Brignon et al., 1985).

La infección por Helicobacter pylori aparece en individuos cada vez menores pero la

leche materna parece que provee de cierta protección, pues junto con la IgAs y la lactoferrina

podría evitar la unión de Helicobacter pylori a la mucosa gástrica humana (Strömquist et al.,

1995). La κ-caseína también ha demostrado su capacidad de bloquear la unión de ciertas

bacterias a la mucosa actuando debido a su analogía estructural con los receptores de mucosas

(Nweburg et al., 1997).

Muy pocos estudios se han centrado en la potencial actividad antimicrobiana de

la α-lactoalbúmina. Sin embargo, recientemente se han encontrado 3 fragmentos polipeptídicos

con esta propiedad frente Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis, Streptococcus sp. y Candida albicans (Pelligrini et al., 1999).

Estos fragmentos son producto de la digestión de la α-lactoalbúmina en el tracto

gastrointestinal.

La haptocorrina o proteína ligadora de la vitamina B12 es sensible a la digestión

proteolítica en el tracto gastrointestinal del lactante (Goldman et al., 1985), lo que impide que

inhiba el crecimiento de patógenos. No obstante, es capaz de impedir el crecimiento de bacterias

en la mama y favorecer el transporte de la vitamina B12 desde la circulación a la leche de

mujer.

La proteína ligadora de folato se encuentra en muchos tejidos y líquidos corporales.

Puede actuar concentrando el folato en la leche o bien facilitando su captación por los

receptores de la mucosa con lo que se evita su captación por las bacterias intestinales (Scott et

al., 1990). No obstante, no hay pruebas in vivo de que ninguno de estos mecanismos tenga

ninguna repercusión para la madre o el niño (Scott et al., 1990).


_____________________________________________________________________________

84

4.2.3.2. Enzimas

La lisozima es una enzima formada por fragmentos proteicos de cadena única de 15 KDa

de peso molecular.

Tiene la propiedad de lisar ciertas bacterias con puntos de unión susceptibles, como son

las uniones β-1,4 entre el ácido N-acetilneuramínico y los residuos de 2-acetilamino-2-deoxi D-

glucosa presentes en sus paredes celulares (Chipman et al., 1969).

Existen concentraciones relativamente altas de lisozima en la leche humana (Chandall et

al., 1964; Jolles et al., 1967; Peitersen et al., 1975; Goldblum et al., 1982; Goldman et al., 1982;

Goldman et al., 1983; Butte et al., 1983), siendo su concentración media de 70 mcg/ml en el

calostro (Goldblum et al., 1982), 20 mcg/ml al mes de vida y 250 mcg/ml a los 6 meses de

lactancia (Goldman et al., 1982). Así, la ingesta media aproximada diaria de lisozima en el niño

sano, a término, lactado al pecho es de 3 a 4 mg/kg/día al mes de vida y de 6 mg/kg/día a los 4

meses (Butte et al., 1984).

La lisozima es resistente a la digestión por la tripsina y a la desnaturalización debida al

ácido, por lo que la cantidad de lisozima excretada en las heces de niños lactados al pecho es

ocho veces mayor que en las heces de niños que toman fórmula (Schaneler et al., 1986). Sin

embargo, a diferencia de la IgAs y la lactoferrina, la excreción urinaria de esta proteína no se ha

detectado en los niños lactados al pecho (Goldblum et al., 1989).

La peroxidasa de la leche humana deriva de los leucocitos de la leche y se trata, por tanto,

de una mieloperoxidasa y no de una lactoperoxidasa. Cataboliza la oxidación de los iones de

tiocianato para dar productos con actividad bacteriostática (Reiter et al., 1978; Hamosh et al.,

1985).

4.2.3.3. Mucina

La mucina de la leche humana es un glicoconjugado de elevado peso molecular (1.000 a

10.000 KDa). Se compone de los extremos amino y carboxiterminal que están escasamente

glicosilados, pero son ricos en cisteína (responsable de establecer los enlaces sulfurados entre

sus monómeros) y una región central formada por secuencias de 10 a 80 residuos de

aminoácidos (aproximadamente un 50% serina y treonina) repetidas en tándem, que se saturan

con cientos de oligosacáridos con uniones de tipo O principalmente.

La mucina ha demostrado tener propiedades protectoras frente a dos agentes infecciosos,

principalmente: (a) inhibe la unión de las fimbrias S de Escherichia coli a las células epiteliales

bucales humanas (Scroten et al., 1992) y (b) ha demostrado evitar la infección por rotavirus en

un modelo experimental en ratones (Yolken et al., 1992), pues tras su deglucosilación es capaz


_____________________________________________________________________________

85

de causar la hidrólisis del ácido N-acetilneuramínico y con ello inactivar este virus (Yolken et

al., 1992).

4.2.3.4. Lactadherina

La MFGE-8 (“Milk fat globule-8”), también denominada lactadherina de la leche

materna, es una glicoproteína sialilada de 46 KDa que se asocia a la mucina (Yolken et al.,

1992).

Es capaz de inhibir la infección de las células MA104 por rotavirus in vitro, propiedad

dosis dependiente y que pierde cuando se retira la fracción de ácido siálico de la molécula

(Yolken et al., 1992). Efectos similares se han observado in vivo en niños lactados al pecho

expuestos a rotavirus, donde se aprecia una mayor presencia en el contenido de lactadherina de

la leche materna que toman los niños asintomáticos frente a los que padecen la infección

(Newburg et al., 1998).

4.2.3.5. Fibronectina

La fibronectina es una molécula de alto peso molecular presente con una concentración

de 13,4 mg/l en el calostro (Friis et al., 1988).

Facilita la captación de muchos tipos de partículas por las células mononucleares

fagocíticas in vitro. No obstante, no se conocen con detalle los efectos in vivo de esta opsonina.

4.2.3.6. Componentes del complemento

Los componentes de la vía clásica y alternativa del complemento están presentes en la

leche materna. Pero su concentración, excepto la del C3, es extremadamente baja lo que sugiere

una funcionalidad biológica inexistente o irrelevante (Ballow et al., 1974; Nakajima et al.,

1977).

4.2.3.7. Lípidos

Los ácidos grasos y monoglicéridos, generados por la digestión de los sustratos lipídicos

más complejos, de la leche humana inhiben in vitro la infectividad de ciertos virus encapsulados

como herpes simple tipo 1, sarampión, estomatitis vesicular, visna, el virus productor del tumor

de mama en el ratón, virus de dengue, citomegalovirus, virus del bosque de Semliki y

coronavirus (Welsh et al., 1979; Resta et al., 1985; Isaacs et al., 1986; Thromar et al., 1987;

Isaacs et al., 1990). También afectan a parásitos intestinales, como la Giardia lamblia y la

Entamoeba histolytica (Gillin et al., 1985).

Sin embargo el papel in vivo de estos productos lipídicos en la resistencia del huésped es

desconocido.


_____________________________________________________________________________

86

Tabla 11. PROTEÍNAS Y GLICOPROTEÍNAS DE LA LECHE MATERNA

(Kunz et al., 1999)

PROTEÍNA

PESO

MOLECULAR

(KDA)

CONCENTRACIÓN

(G/L)

PORCENTAJE DE

CARBOHIDRATOS

Caseína

β-Caseína 24 3-5 -

κ-Caseína 30 1-3 40-60

Proteínas del suero

lácteo

α-Lactoalbúmina 14,2 2-3 -

Seroalbúmnina 68 0,3 -

IgAs 420 0,5-1 12

IgG 160 0,1 7-11

IgM 900 0,02 12

Lactoferrina 78 1-3 6

Lisozima 15 Calostro: 70 mcg/ml

Transición: 20mcg/ml

Madura: 250 mcg/ml

No hay datos exactos

Mucina 1000-10.000 No hay datos exactos Altamente glicosilada

Lactadherina 46 No hay datos exactos Ligada a ácido siálico

4.2.3.8. Leucocitos

Ya en el año 1968 se describió la existencia de leucocitos vivos en la leche humana

(Smith et al., 1968). A diferencia de las células B que llegan a través de la vía enteromamaria y

broncomamaria a la glándula y se transforman en células plasmáticas que permanecen en sus

células epiteliales, los leucocitos atraídos atraviesan el epitelio mamario y pasan a formar parte

de la secreción láctea.

Parece probable que los leucocitos de la leche humana proporcionen una marcada

protección frente a la infección de la mama, lo que podría ser particularmente importante al

principio de la lactancia cuando las mamas están repletas y no se vacían por completo durante

cada toma.

Las mayores concentraciones de leucocitos en la leche materna se encuentran en el

calostro, donde alcanzan 1-3 x 106/ml (Tsuda et al., 1984a), siendo la distribución porcentual de


_____________________________________________________________________________

87

neutrófilos, macrófagos y linfocitos en la leche humana de aproximadamente un 80, 15 y 4%,

respectivamente (Wirt et al., 1992; Kenney et al., 1993).

Neutrófilos y macrófagos. Los neutrófilos y macrófagos de la leche materna son células

fagocíticas pues tras su estimulación pueden procesar y presentar antígenos a las células T

(Tsuda et al., 1984b; Oksenberg et al., 1985).

La capacidad de los leucocitos polimorfonucleares de la leche humana para destruir y

fagocitar microbios es menor que la de los leucocitos sanguíneos, si bien en algunos casos su

función fagocítica llega a igualar a la de los neutrófilos de la sangre (Buescher et al., 1986). Se

ha observado que tras la exposición a agentes quimiotácticos, los neutrófilos de la leche

humana, a diferencia de los sanguíneos, no aumentan su adherencia, polaridad, migración

directa (Thorpe et al., 1986) ni deformabilidad (Buescher et al., 1991). En cambio, la motilidad

de los macrófagos de la leche humana está aumentada en comparación con sus análogos en la

sangre (Özkaragoz et al., 1988). Otra diferencia que muestran los macrófagos del calostro

humano, respecto a los fagocitos de otras localizaciones, es que tienen elevadas concentraciones

de IgAs que se libera rápidamente durante la fagocitosis (Weaver et al., 1981), pueden sintetizar

lisozimas, componentes del complemento, lactoferrina y prostaglandina E2 (Faden et al., 1981;

Blau et al., 1983). Si bien no es seguro que la capacidad tampón del calostro o de la leche

definitiva permita su viabilidad tras su paso por el estómago, parece que sus productos sí

podrían seguir actuando dentro del intestino.

Los neutrófilos y macrófagos de la leche humana suelen ligarse a lípidos, lo que dificulta

su identificación por los métodos de tinción habituales. Existen en cambio métodos alternativos

para ello, como el estudio de su contenido de mieloperoxidasa (Crago et al., 1979) o esterasa no

específica (Crago et al., 1979) y la identificación de los CD14 (Keeney et al., 1993). Además

presentan marcadores fenotípicos de activación y son características una expresión

incrementada de CD11b/CD18 y una expresión disminuída de L-selectina (Keeney et al., 1993).

Linfocitos. La proporción de células T y B en las secreciones lácteas más precoces es de

un 83% frente a un 6%, respectivamente (Wirt et al., 1992). El reducido número de células B es

una consecuencia de su transformación terminal a células plasmáticas.

Tanto las subpoblaciones T CD4+ (colaboradoras) como las T CD8

+ (citotóxicas y

supresoras) están presentes en la leche humana (Wirt et al., 1992; Bertotto et al., 1990), sin

embargo existe una mayor presencia del fenotipo citotóxico y supresor (CD8+) en la leche

materna en comparación con la sangre (Wirt et al., 1992), al igual que sucede en las mucosas.

Los linfocitos T presentes en la leche humana han mostrado una respuesta in vitro frente a

diversos antígenos virales (Faden et al., 1981) y pueden verse implicados en la producción de

IFN (Goldman et al., 1985), así como en la modulación del desarrollo del sistema IgA a nivel de


_____________________________________________________________________________

88

las mucosas (Slade et al., 1987). No obstante el papel in vivo de las células T en la leche humana

es desconocido y aunque algunas observaciones sugieren que podría transmitirse cierta

protección inmunitaria frente a la tuberculosis al niño lactado a través de la lactancia materna

esto es controvertido (Keller et al., 1987; Pabst et al., 1989).

Todas las células T CD4+ y T CD8

+ de la leche humana portan la isoforma de CD45

(CD45 RO) asociada con la memoria inmunológica (Bertotto et al., 1990; Wirt et al., 1992). Las

células CD45 RO+ son la principal fuente de citoquinas en la leche materna (Dohlsten et al.,

1988) y producen característicamente IFN-alfa (Bertotto et al., 1990; Bertotto et al., 1990; Wirt

et al., 1992). Las células T de la leche humana son capaces de producir otras citoquinas como

los factores inhibitorios de la migración macrofágica (Keller et al., 1981) y los factores

quimiotácticos de las células tumorales (Keller et al., 1981), además de otros marcadores

fenotípicos de activación (Wirt et al., 1992). Sin embargo, no hay evidencia de que produzcan el

factor de necrosis tumoral α (TNF-α), la interleuquina 6 (IL-6) ni la interleuquina 10 (IL-10)

(Skansén-Saphir et al., 1993).

Tabla 12. MECANISMOS DE ACCIÓN DE DIVERSOS AGENTES DEFENSIVOS DE LA LM

LACTOFERRINA Quelación por Fe3+

LISOZIMA Degradación de peptidoglicanos

MUCINAS

Análogos de receptores

Degradación de peptidoglicanos

FIBRONECTINA Opsonina de fagocitos

LÍPIDOS Destrucción de virus envueltos

NEUTRÓFILOS Y MACRÓFAGOS Presentación de antígenos y fagocitosis

LINFOCITOS Producción de citoquinas

4.2.4. Agentes antiinflamatorios y antioxidantes

A diferencia de la escasez de agentes proinflamatorios, la leche humana contiene una

gran variedad de agentes antiinflamatorios (Goldman et al., 1973) y antioxidantes (Tabla 13).

4.2.4.1. Factores promotores del crecimiento epitelial y de las barreras mucosas

Las hormonas y factores de crecimiento epitelial en la leche humana incluyen el cortisol

(Kulski et al., 1981), el factor de crecimiento epitelial (Carpenter et al., 1980), la lactoferrina,


_____________________________________________________________________________

89

que interfiere con ciertos componentes del complemento (Morgan et al., 1975; Veerhuis et al.,

1982; Kijlstra et al., 1982; Nichols et al., 1987) y las poliaminas (Sanguansermsi et al., 1974;

Romain et al., 1992).

Entre sus mecanismos de acción se postula que podrían afectar al crecimiento, la

diferenciación y el recambio de las células epiteliales, limitar la penetración de antígenos libres

y microorganismos patógenos e intervenir en otras funciones de las barreras del tracto intestinal

(Grosvenor et al., 1993). Se han observado diferencias estructurales y funcionales significativas

de estas barreras en adultos y neonatos (Pang et al., 1983; Chu et al., 1986) por lo que se plantea

que su maduración podría acelerarse con la leche materna (Widdowson et al., 1976; Heird et al.,

1984; Teichberg et al., 1992).

4.2.4.2. Agentes antioxidantes

Componentes similares al ácido ascórbico (Buescher et al., 1992), el α-tocoferol (Chapell

et al., 1985; Ostrea et al., 1986) y el β-caroteno (Chapell et al., 1985; Ostrea et al., 1986) son los

principales antioxidantes de la leche humana. Los niveles sanguíneos de estos dos últimos son

mayores en los niños lactados al pecho que en los niños alimentados con fórmula no

suplementada con ellos (Ostrea et al., 1986).

4.2.4.3. Enzimas que degradan mediadores de la inflamación

Ciertos enzimas de la leche materna degradan los mediadores inflamatorios que dañan el

tracto intestinal (Lindberg et al., 1982). Es el caso de la asociación del factor de activación

plaquetario (PAF) y la enterocolitis necrosante. La administración de PAF a animales de

experimentación produce una inflamación intestinal que se asemeja a la enterocolitis necrosante

(Caplan et al., 1992), asimismo los niveles séricos de PAF están incrementados en neonatos con

esta afección. La producción endógena de PAF-acetilhidrolasa está retrasada en el desarrollo

(Caplan et al., 1990; Lucas et al., 1990a), sin embargo la leche humana la contiene (Furukawa et

al., 1993) por lo que su ingesta podría prevenir o disminuir los procesos inflamatorios que

culminan en la enterocolitis necrosante en los recién nacidos.

4.2.4.4. Citoquinas antiinflamatorias

Ciertas citoquinas antiinflamatorias inhiben las funciones de leucocitos seleccionados

(Stigbrand et al., 1976; Kemp et al., 1980; Horne et al., 1983; Hooton et al., 1991), es el caso de

las prostaglandinas E1, E2 y F2α, que presentan propiedades citoprotectoras (Reid et al., 1980;

Neu et al., 1988; Chapel et al., 1983; Alzina et al., 1986; Shimizu et al., 1992).

Estudios en modelos animales con deficiencias genéticas sugieren que las citoquinas

antiinflamatorias de la leche humana podrían ser importantes en la prevención de alteraciones

debidas a procesos inflamatorios. Los ratones homocigotos para el gen nulo de TGF-β1


_____________________________________________________________________________

90

presentan infiltraciones espontáneas a nivel multifocal de macrófagos y células T en muchos

órganos, principalmente en los pulmones, corazón y glándulas salivares (Kulkarni et al., 1993;

Shull et al., 1992; Hines et al., 1994; Christ et al., 1994). Además, existen evidencias

experimentales de que los efectos de la deficiencia del factor de crecimiento tumoral β1 (TGF-

β1) se retrasan con la ingesta de citoquinas provenientes de leche murina (Letterio et al., 1994),

(b) el patrón de enfermedad de los animales deficientes en IL-10 se limita, en cambio, al tracto

digestivo y depende del establecimiento de una flora intestinal bacteriana (Kühn et al., 1993). A

diferencia del caso anterior los efectos del aporte de citoquinas por medio de la leche materna

necesitan más estudio.

Tabla 13. ANTIINFLAMATORIOS Y ANTIOXIDANTES DE LA LECHE MATERNA

FACTORES PROMOTORES DEL

CRECIMIENTO EPITELIAL Y DE LAS

BARRERAS MUCOSAS

Cortisol

Factor de crecimiento epitelial

Lactoferrina

Poliaminas

AGENTES ANTIOXIDANTES

Ácido ascórbico

α-tocoferol

ENZIMAS QUE DEGRADAN

MEDIADORES DE LA INFLAMACIÓN

PAF-acetilhidrolasa

CITOQUINAS ANTIINFLAMATORIAS Prostaglandinas E 1, E 2 y F 2α

4.2.5. Factores inmunomoduladores (tabla 14)

Diversas observaciones han proporcionado las bases para plantear la existencia de agentes

inmunomoduladores en la leche humana: (a) en primer lugar, investigaciones epidemiológicas

sugieren que los niños lactados al pecho tienen un menor riesgo de desarrollar diabetes tipo 1

(Meyer et al., 1988), linfoma (Davis et al., 1988) o enfermedad de Crohn (Koletzko et al., 1989)

en los años posteriores; (b) los niveles aumentados de ciertos factores inmunitarios propios de

los niños lactados al pecho no pueden ser atribuidos a su ingesta a través de la leche materna. La

lactancia materna induce al receptor a producir mayores niveles de IFN-alfa en respuesta a la

infección por virus respiratorio sincitial (Chiba et al., 1987), asimismo los incrementos de los

niveles sanguíneos de fibronectina que se observan en los niños lactados al pecho no guardan

relación con la cantidad de dicha proteína en la leche materna (Friss et al., 1988), además se ha

observado que la lactancia materna lleva a un desarrollo más rápido de las respuestas de


_____________________________________________________________________________

91

anticuerpos sistémicas (Stephens et al., 1984) y de IgAs en las secreciones (Schanler et al.,

1986; Stephens et al., 1986a; 1986b; Prentice et al., 1987; Goldblum et al., 1989), incluyendo la

orina (Prentice et al., 1987; Goldblum et al., 1989); (c) la tercera línea de estudio ha sido el

descubrimiento de que todos los tipos de leucocitos de la leche humana son activados. La leche

humana favorece el movimiento de los monocitos sanguíneos in vitro y gran parte de dicha

movilidad puede ser anulada por anticuerpos anti-TNFα (Mushtaha et al., 1989).

Además del TNFα, otras citoquinas, como la interleuquina (IL)-1β (Munoz et al., 1990),

la IL-6, (Saito et al., 1991; Rudloff et al., 1993; Bocci et al., 1993), el INF-alfa, la IL-8,

(Palkowetz et al., 1994), el factor de crecimiento β (TGF-β. Noda et al., 1984; Palkowetz et al.,

1994; Saito et al., 1993), el factor estimulante de granulocitos (G-CSF. Gilmore et al., 1994), el

factor estimulante de macrófagos (M-CSF. Hara et al., 1995) y la IL-10 (Garofalo et al., 1995)

han sido identificados en la leche materna. Sin embargo, la extensión de sus efectos en el

lactante no se conoce con detalle.

Otros elementos de la leche humana a los que se atribuye un efecto inmunomodulador

incluyen las β-casomorfinas (Brantl et al., 1985), la prolactina (Grosvenor et al., 1993), los

anticuerpos antiidiopáticos (Hahn-Zoric et al., 1993) y nutrientes como el α-tocoferol (Chapell

et al., 1985; Ostrea et al., 1986), así como una variedad de nucleótidos que incrementan las

células NK, los macrófagos y la actividad de las células T-colaboradoras (Carver et al., 1990;

Janas et al., 1992; Jyonouchi et al., 1993; Barness et al., 1994).

Tabla 14. AGENTES INMUNOMODULADORES DE LA LECHE MATERNA

TNF-α Favorece la producción de Ig y complemento

TGF-β Favorece el cambio de isotipo de las células B IgA+

IFN-α Favorece la actividad macrofágica de las células NK

y la migración leucocitaria

IL-1β Activa las células T

IL-6 Incrementa la producción de IgA

IL-8 Quimiotaxis de PMN y células T CD8+

IL-10 Modula la producción de otras citoquinas

G-CSF Incrementa la producción de granulocitos

M-CSF Incrementa la producción de macrófagos

β-CASOMORFINAS, PROLACTINA,

α-TOCOFEROL Y NUCLEÓTIDOS

Incrementan la actividad macrofágica, de las células

NK y de las células T-colaboradoras

INMUNIDAD DE LA LECHE MATERNA. Los oligosacáridos y glicoconjugados.

_____________________________________________________________________________

92

4.2.6. Glicanos: oligosacáridos y glicoconjugados

Los glicanos de la leche materna son oligosacáridos libres que se encuentran solubles en

ella, así como carbohidratos más complejos como los glicoconjugados: glicoproteínas,

glicopéptidos, glicolípidos, glicosamínglicanos o mucinas.

En los últimos años, los oligosacáridos y glicoconjugados de la leche materna han ganado

un interés creciente como componentes de la leche materna con propiedades antiinfecciosas. Se

plantea que por medio de su habilidad de inhibir la unión de los patógenos a sus receptores

específicos en las células huésped intestinales y bronquiales representan un mecanismo, hasta el

momento subestimado, por medio del cual proporcionan una protección eficaz al niño lactado.

Tabla 15.CONCENTRACIÓN (g/dL) DE COMPONENTES DE LA LECHE MATERNA

EN LAS DIFERENTES ETAPAS DE LA LACTANCIA (KUNZ ET AL., 1999)

Fase de lactancia CALOSTRO TRANSICIÓN MADURA

Días de lactancia 1 4-5 8-10 14 > 36

LACTOSA 4,1 ± 1 5,1 ± 0,5 5,4 ± 0,5 5,4 ± 0,8 6,8 ± 0,6

OLIGOSACÁRIDOS - 2,4 - - 1,3

GRASA 2,1 ± 0,9 3,1 ± 0,8 3,7 ± 0,7 3,9 ± 0,7 4 ± 1,2

PROTEINA TOTAL 3,1± 0,6 - - 0,9 ± 0,2 0,8 ± 0,2

IgA 0,8 0,2 0,1 0,1 -

LACTOFERRINA 0,5 0,2 0,2 0,2 -

4.3. LOS OLIGOSACÁRIDOS Y GLICOCONJUGADOS DE LA LECHE MATERNA

4.3.1. Diversidad estructural (tabla 16)

Si bien la lactosa de la leche materna se aisló en el año 1633, no fue hasta 1933 cuando se

describió la existencia de una fracción glucídica de la leche diferente a la lactosa y en 1950

cuando los glicanos de la leche materna comenzaron a describirse (Newburg et al., 1995b).

Actualmente se piensa que existen cientos e incluso miles de oligosacáridos (Stahl et al., 1994),

pues más de un centenar de estructuras han sido aisladas e identificadas en la leche humana y

continuamente son reconocidas nuevas moléculas (Grönberg et al., 1992).

La mayoría de los oligosacáridos de la leche humana son formaciones derivadas de la

adición de monosacáridos a la molécula de lactosa por glicosiltransferasas específicas de la

glándula mamaria (Egge et al., 1993). La combinación de D-glucosa (Glc), D-galactosa (Gal) y


_____________________________________________________________________________

93

N-acetilglucosamina (GlcNAc) por medio de cuatro tipos de uniones terminales de L-fucosa

(Fuc) y tres tipos de uniones de ácido siálico/ácido N-acetilneuramínico (NeuAc), genera una

amplia variedad de componentes que coinciden mayoritariamente en presentar lactosa en su

región reductora terminal y fucosa o ácido siálico en la región no reductora terminal.

En base a su composición química los oligosacáridos de la leche materna pueden

agruparse en: (a) oligosacáridos básicos que representan las estructuras fundamentales para la

síntesis de oligosacáridos más complejos: formados por Glc, Gal y GlcNac, (b) fucosil-

oligosacáridos que derivan de la adición a esta estructura básica de una o más moléculas de Fuc,

(c) sialil-oligosacáridos, resultantes de la adición a la estructura básica de una o más moléculas

de NeuAc y (d) sialilfucosil-oligosacáridos, que contienen tanto Fuc como NeuAc (Coppa et al.,

1999).

Los glicoconjugados asocian a esta estructura básica una molécula proteica

(glicoproteínas y glicopéptidos), lipídica (glicolípidos) o glucídica de otra naturaleza

(glicosamínglicanos).

La adición de los residuos de fucosa depende de la acción de fucosiltransferasas en un

proceso genéticamente determinado: (a) la α 1,2-fucosiltransferasa (FUT2) se encuentra en un

80% de los individuos caucásicos del N de Europa y América, los denominados individuos

secretores. La leche materna de las madres secretoras se caracteriza por la presencia de 2-

fucosilactosa (Fuc α1,2-Gal β1,4 Glc), lacto-N-fucopentosa I (Fuc α1,2-Gal β1, 3-GlcNAc β1,3-

Gal β1,4-Glc) y oligosacáridos más complejos que poseen residuos Fuc α1,2-Gal β1,3-GlcNAc,

(b) la fucosiltranferasa dependiente del gen que codifica el antígeno Lewis (FUT3) está presente

en aproximadamente un 90% de la población (Kindberg et al., 2007), une los residuos Fuc por

medio de uniones tipo α 1,4 a un residuo GlcNAc de las cadenas tipo 1.

En la leche de las mujeres no secretoras que poseen el gen FUT3 el oligosacárido

fucosilado principal es la lacto-N-fucopentosa II (Gal β-1,3-Fuc α-1,4-GlcNAc β-1,3-Gal β-1,4-

Glc). Si ambos genes, FUT2 y FUT3 están presentes, uno de los oligosacáridos mayores es la

lacto-N-difucohexosa I (Fuc α1,2-Gal β1,3-Fuc α1,4-GlcNAc β1,3-Gal β-1,4-Glc). En caso de

carecer de ambos genes el oligosacárido principal en la leche de estas madres es la lacto-N-

fucopentosa III (Gal β1,4- Fuc α1,3-GlcNAc β1,3-Gal β1,4-Glc).

Además de las fucosiltransferasas, diversas sialiltransferasas podrían unir NeuAc en

diferentes posiciones a los oligosacáridos de la leche materna (Kunz et al., 2000).


_____________________________________________________________________________

94

Tabla 16. ESTRUCTURA DE LOS PRINCIPALES OLIGOSACÁRIDOS

DE LA LECHE MATERNA (Chaturvedi et al., 2001a)

NOMENCLATURA ESTRUCTURA

FUCOSIL-OLIGOSACÁRIDOS

2’-Fucosil-lactosa (2’-Fuc-Lac)

Lacto-N-fucopentosa I (LNF-I)

Lacto-N-difucohexosa I (LDFH)

Lactodifucotetraosa (LDFT)

Fuc α1,2-Gal β1,4-Glc

Fuc α1,2-Gal β1,3-GlcNAc β1,3-Gal β1,4-Glc

Fuc α1,2- Fuc α1,4-Gal β1,3-GlcNAc β1,3-Gal β1,4-Glc

Fuc α1,2-Gal β1,4-Glc-Fuc α,1-3

SIALIL-OLIGOSACÁRIDOS

Lacto-N-fucopentosa-II (LNF-II)

3-Fucosil-lactosa (3-FucLac)

Lacto-N-fucopentosa-III (LNF-III)

Lacto-N-difucohexosa-II (LNDFH-II)

Gal β1,3- Fuc α1,4-GlcNAc β1,3-Gal β1,4-Glc- Gal β1,4

Gal β1,4-Glc-Fuc α1,3

GlcNAc β1,3-Gal β1,4-Glc-Fuc α1,4

Gal β1,3-Fuc α1,4-GlcNAc β1,3-Gal β1,4-Glc-Fuc α1,3

OTROS

Lacto-N-tetraosa (LNT)

Lacto-N-neotetraosa (LNneoT)

Monofucosil-lacto-N-hexosa-III

(MFLNH-III)

Difucosil-lacto-N-hexosa-a (DFLNHa)

Gal β1,3-GlcNAc β1,3-Gal β1,4-Glc

Gal β1,4-GlcNAc β1,3-Gal β1,4-Glc

Fuc α1,3-Gal β1,4-GlcNAc β1,6-Gal β1,4-Glc-Fuc α1,2-Gal

β1,3-GlcNAc β1,3

Fuc α1,3-Gal β1,4-GlcNAc β1,6-Gal β1,4-Glc-Fuc α1,2-Gal

β1,3-GlcNAc β1,3

4.3.2. Concentración (tabla 17)

Existen muchas publicaciones acerca de la concentración total de oligosacáridos en la

leche materna (Coppa et al., 1990; Thurl et al., 1996; Nakhla et al., 1999; Erney et al., 2000).

Los datos obtenidos por grupos diferentes deberían compararse con precaución por las

siguientes razones: (a) en primer lugar, no hay todavía métodos rutinarios disponibles para

investigar el patrón de los diferentes oligosacáridos de la leche materna, es decir cada método

tiene una forma diferente de separación de los oligosacáridos (por ej., la cromatografía por


_____________________________________________________________________________

95

intercambio iónico o la filtración en gel) lo que puede ofrecer resultados muy dispares y (b) en

segundo lugar, en algunos artículos no se especifica el método empleado por lo que no se puede

averiguar si toda o parte de la lactosa se ha eliminado de la fracción de oligosacáridos lo que

modifica ampliamente los resultados. Además, los residuos proteicos pueden contaminar

fracciones con oligosacáridos neutros o ácidos.

En la leche materna se identifican de 20 a 23 g/l en el calostro y de 12 a 14 g/l en la leche

madura, de forma que desde el punto de vista cuantitativo los oligosacáridos representan el

tercer componente de la leche materna, tras la lactosa y los lípidos (Newburg et al., 1995b), a

diferencia de la leche de vaca en la que sólo se detectan pequeñas cantidades (Newburg et al.,

1992a).

Las concentraciones de los diferentes oligosacáridos en la leche materna diferen de unos

grupos geográficos a otros, si bien parece que el oligosacárido principal es la lacto-N-trehalosa

(LNT, presente de 0,5 a 1,5 g/l) que junto con sus derivados monofucosilados llega a suponer de

un 50 a un 70% del total de los oligosacáridos de la leche materna (a diferencia de la leche de

vaca donde predomina la sialilactosa). Le siguen la lacto-N-fucopentosa I o II.

De los componentes sialilados la sialilactosa (NeuAc α 2,6 Lac y NeuAc α 2,3 Lac) es la

más abundante, aproximadamente 1 g/l, seguida por los isómeros de la LNT monosialilada

(LST a, b y c) y diasialilada (disialil-LNT).

Las escasas publicaciones que existen acerca del tema no han identificado diferencias

cuantitativas ni cualitativas en los oligosacáridos de la leche de madres que han presentado un

parto pretérmino o a término (Kunz et al., 2000), aunque son necesarios más estudios sobre esto.


_____________________________________________________________________________

96

Tabla 17. CONCENTRACIÓN (G/L) DE LOS PRINCIPALES OLIGOSACÁRIDOS

DE LA LECHE MATERNA (Chaturvedi et al., 2001a)

FUCOSIL-OLIGOSACÁRIDOS

2’-Fucosil-lactosa (2’-Fuc-Lac)

Lacto-N-fucopentosa I (LNF-I)

Lacto-N-fucohexosa I (LDFH-I)

Lactodifucotetraosa (LDFT)

2,43 ± 0,26

1,14 ± 0,18

0,50 ± 0,06

0,43 ± 0,04

SIALIL-OLIGOSACÁRIDOS

3-Fucosillactosa (3-FucLac)

Lacto-N-fucopentosa-II (LNF-II)

Lacto-N-fucopentosa-III (LNF-III)

Lacto-N-difucohexosa-II (LNDFH-II)

0,86 ± 0,10

0,77 ± 0,07

0,77 ± 0,07

0,09 ± 0,01

OTROS

Lacto-N-trehalosa (LNT)

Lacto-N-neotetraosa (LNneoT)

Difucosil-lacto-N-hexosa-a (DFLNHa)

Monofucosil-lacto-N-hexosa-III (MFLNH-III)

0,55 ± 1,45

0,17 ± 0,03

0,15 ± 0,04

0,11 ± 0,02

4.3.3. Efectos locales de los glicanos

Tras el descubrimiento de los oligosacáridos de la leche materna se planteó que carecían

de funcionalidad debido a diversas cuestiones: (a) dada la analogía estructural a los

glicoconjugados se pensó inicialmente que eran productos metabólicos resultantes de un exceso

de funcionalidad de las enzimas que intervienen su síntesis, (b) además, se encontraron en gran

cantidad en las heces de los niños lactados al pecho, lo que llevó a plantear que no eran

digeribles y por tanto no tenían una contribución nutricional. A pesar de ello se planteó que el

hecho de que los oligosacáridos de la leche materna desempeñaran un papel biológico era

plausible, por lo que se desarrollaron diversas investigaciones para conocer los procesos en los

que podían intervenir (Newburg et al., 1986).

Los oligosacáridos de la leche materna ingeridos resisten la acidez del intestino (Gnoth et

al., 2000), la degradación de las enzimas pancreáticas y del borde en cepillo de los enterocitos

(Gnoth et al., 2000; Engfer et al., 2000). Intactos alcanzan el colon donde se convierten en

nutrientes de la flora bacteriana colónica y ejercen un efecto prebiótico a través de la promoción

del crecimiento de Bifidobacterium bifidum (György et al., 1954).


_____________________________________________________________________________

97

Además, los oligosacáridos de la leche materna y algunos glicoconjugados son

sintetizados por los mismos tipos de glicosiltransferasas responsables de la síntesis de los

glicanos de las superficies celulares (HBGAs), empleados por la mayoría de los patógenos

entéricos y respiratorios para la identificación y unión a células diana como paso crítico para su

infectividad. Dada la analogía estructural entre ambas moléculas se planteó que los

oligosacáridos de la leche materna podrían actuar competitivamente con los receptores

celulares, impidiendo la unión de los patógenos y anulando sus mecanismos de infección. Esto

supondría en el caso de los patógenos entéricos la inhibición de su capacidad de unión a los

enterocitos y la protección del niño lactado al pecho de ciertas infecciones intestinales y en el

caso de los patógenos respiratorios el bloqueo de la unión a las células bronquiales y por tanto la

infección pulmonar (tabla 18).

Numerosas investigaciones se han dirigido a estudiar la hipótesis de que los

oligosacáridos y glicoconjugados de la leche materna actúan como señuelos que compiten con

la unión de ciertos patógenos bacterianos y virales, entéricos y respiratorios, así como de

algunas toxinas a sus receptores específicos impidiendo el desarrollo de infección (Holmgren et

al., 1981; Cleary et al., 1983; Otnaess et al., 1986; Andersson et al., 1986; Laegreid et al.,

1986a; 1986b; Holmgren et al., 1987; Laegreid et al., 1987; Newburg et al., 1990; Newburg et

al., 1991; Oatness et al., 1982; Cleary et al., 1983; Nerwburg et al., 1990).

En el caso de la adherencia bacteriana tiene lugar una unión del tipo ligando-receptor

entre estructuras de la superficie bacteriana y otras complementarias de la superficie mucosa del

huésped. Algunas de las adhesinas mejor caracterizadas de las bacterias son las de Escherichia

coli, que posee fimbrias tipo 1 (complementarias a residuos de manosa), fimbrias S

(complementarias a galactósidos sialilados) o factores de colonización (un grupo heterogéneo

con diferentes especificidades de receptor), Leffler et al., 1986; Mirelman et al., 1986; Ofek et

al., 1990; Karlsson et al., 1995; Brand Miller, 1999. Las especificidades de unión de los

ligandos de las diferentes cepas de Escherichia coli podrían explicar las diferencias de

colonización intestinal entre los niños lactados al pecho y alimentados con fórmula. En 1983

Parkkinen et al. demostraron que los oligosacáridos sialilados de la leche materna eran capaces

de inhibir la actividad de unión de las cepas de Escherichia coli que causaban meningitis y

sepsis neonatal (Parkkinen et al., 1983). Debido a que las fimbrias S de las cepas de la bacteria

presentan una especificidad de unión con los galactósidos silalilados podría especularse que la

leche materna con su alto contenido de estos epítopos podría ser responsable de un menor

número de infecciones por Escherichia coli en los niños lactados al pecho frente a los

alimentados con fórmula. Los gangliósidos GM1, glicoesfingolípidos monosialilados (GlcNAc

β1,3), también son receptores análogos de las toxinas termolábiles producidas por Vibrio

cholerae y Campylobacter jejuni (Oatness et al., 1983; Laegreid et al., 1987; Cravioto et al.,


_____________________________________________________________________________

98

1991). Además, se ha descrito la unión de un glucolípido a la toxina de Shigella y a la Shiga-

like de Escherichia coli. Aproximadamente un 70% de los casos de otitis media en los recién

nacidos son causados por infecciones por Streptococcus pneumoniae y Haemophillus

influenzae. En 1986, Andersson et al. fueron capaces de demostrar que la adhesión de estos

microorganismos a estructuras carbonadas específicas de las células epiteliales faríngeas o

bucales era inhibida por la leche materna, las subunidades Gal-disacárido parecen ser las

responsables de este efecto protector (Andersson et al., 1986).

Es posible que algunos oligosacáridos y glicoconjugados de la leche materna también

tengan la propiedad de interferir con la unión de ciertos virus a dianas epiteliales (Kumar et al.,

1984; Baron et al., 1989). Buen ejemplo de ello son los virus influenza A, B y C, que reconocen

bien NeuAc α 2,6-Lac y NeuAc α 2,3-Lac (ambos componentes principales de la leche

humana). En cuanto a los virus entéricos, la leche materna ha demostrado una capacidad

protectora frente a las infecciones por rotavirus (Asensi et al., 2006), recientemente parece que

una de las situaciones más plausibles donde los oligosacáridos podrían ejercer una acción

protectora es en evitar la infección intestinal por NoV en los niños lactados al pecho (Morrow et

al., 2005). Asimismo, se ha descrito la existencia de una interferencia de la leche materna con la

unión del antígeno gp120 del virus de la inmunodeficiencia humana a las moléculas CD4 sobre

las células T, pero esta se debe a componentes diferentes a los oligosacáridos y glicoconjugados

(Newburg et al., 1992b; 1995a).


_____________________________________________________________________________

99

Tabla 18. OLIGOSACÁRIDOS DE LA LECHE MATERNA

COMO RECEPTORES MICROBIANOS (Kunz et al., 2000)

RECEPTORES MICROORGANISMOS

GLICANOS FUCOSILADOS

Oligosacáridos fucosilados Escherichia coli (enterotoxina estable)

Campylobacter jejuni

Tetra y pentasacáridos fucosilados Escherichia coli

Epítopos Fuc α 1,2 Gal Candida albicans

GLICANOS SIALILADOS

Glicoproteínas y sialil (α 2,3) lactosa Escherichia coli (fimbria S)

Mucinas sialil (α 2,3) galactósidos Escherichia coli (fimbria S)

Sialil-lactosa

Streptococcus sanguis

Helicobacter pylori

Glicoproteínas sialiladas Helicobacter pylori

Mycoplasma pneumoniae

Poli-N-acetillactosamina sialilada Mycoplasma pneumoniae

Poli-acetil-lactosaminglicanos sialilados α

2,3

Streptococcus suis

Sialil (α 2,6) lactosa Virus Influenza A

Sialil (α 2,3) lactosa Virus Influenza B

OTROS

Glicoproteinas que contienen manosa Escherichia coli (fimbria tipo 1)

Oligosacáridos neutros (LNT, neo-LNT) Streptococcus pneumoniae

Gal (β 1,4) GlcNAc o Gal (β 1,3) GlcNAc

9-O-Ac de NeuAc (α 2,3) R

Pseudomonas aeruginosa

Virus Influenza C

Lactadherina Rotavirus


_____________________________________________________________________________

100

4.3.4. Capacidad protectora de los oligosacáridos de la leche materna frente a las

infecciones por NoV

Una de las evidencias crecientes acerca de la capacidad protectora de los oligosacáridos y

glicoconjugados de la leche materna frente a las infecciones por ciertos virus entéricos es la

observada frente a NoV.

Esta hipótesis parte de la observación de que existe un grupo de individuos que muestra

una resistencia natural frente a las infecciones por NoV: los individuos no secretores. Estos

tienen en común que carecen del gen FUT2 y por tanto de la actividad α 1,2-fucosiltransferasa.

Lo que hace pensar que el epítopo α 1,2-Fuc (antígeno H tipo 1) es esencial para la unión de

NoV a los enterocitos. Diversas investigaciones han apoyado esto: (a) la pérdida de la actividad

de las dianas celulares para NoV tras el tratamiento con α 1,2-fucosidasa, (b) la inhibición

competitiva de la unión de NoV al antígeno H por anticuerpos monoclonales de H tipo 1,

glicanos que contienen fucosa en posición α 1,2 y leche materna de un secretor y (c) los

resultados del ensayo de transfección del ADNc de la enzima α 1,2-fucosiltransferasa (FUT2) a

las células de ovario de hámster chino, a las que NoV en condiciones normales no es capaz de

unirse, permitiendo la unión de las VLPs de Norwalk (Marionneau et al., 2002).

La diferente dotación genética de los individuos determina el tipo de glicanos que expresa

en las superficies celulares de sus enterocitos y en sus fluidos biológicos, como la leche materna

y la saliva. Si bien el antígeno H tipo 1 es reconocido como receptor principal de NoV en los

enterocitos, existen receptores menos estudiados que se unen específicamente a diferentes cepas

de NoV. Esto hace que la interacción de los NoV con el huésped sea de un nivel de complejidad

elevado y ciertos genes podrían determinar el perfil de susceptibilidad o resistencia de cada

individuo frente a los diferentes géneros de NoV.

Dadas estas dos cuestiones, se plantea la hipótesis de que los glicanos fucosilados de la

leche materna podrían ser un componente efector de inmunidad inespecífica por medio de los

cuales la madre confiere unas propiedades protectoras a su niño. En caso de ser así, se esperaría

encontrar en los glicanos de la leche materna tres características: (a) expresión constitutiva, es

decir, serían sintetizados en la leche materna independientemente de la historia de exposición a

patógenos de la madre, (b) resistencia a la digestión intestinal para poder alcanzar el sitio de

infección, (c) relación entre la presencia de estos glicanos fucosilados en la leche materna y un

menor riesgo de enfermedad por ciertos patógenos en los niños lactados al pecho.

4.3.4.1. Expresión constitutiva

Los individuos secretores y no secretores se definen por la presencia o ausencia del gen

FUT2, que codifica la actividad α 1,2-fucosiltransferasa, y en consecuencia la presencia de

glicanos con uniones α 1,2 en la leche materna y determinados receptores HBGAs celulares.


_____________________________________________________________________________

101

Esta variación genética y de expresión de glicanos en la leche materna ha sido establecida

en términos de individuos secretores homocigotos (poseen altos niveles de glicanos con uniones

α 1,2), secretores heterocigotos (muestran niveles intermedios de glicanos con uniones de α 1,2)

y no secretores (no poseen glicanos con uniones de fucosa α 1,2), Grollman et al., 1969;

Viverge et al., 1990. Su distribución difiere en las poblaciones según el origen étnico (Erney et

al., 2000; Musumeci et al., 2006; Leo et al., 2010).

Sin embargo se ha observado que la expresión de oligosacáridos cambia durante la

lactancia independientemente de la dotación genética: es el caso de los individuos no secretores

que si bien carecen del gen FUT2 que codifica la producción de α 1,2-fucosiloligosacáridos, tras

aproximadamente medio año de lactancia estos se convierten en los componentes principales de

su leche. Además, se observa que los individuos secretores producen leche que contiene

principalmente α 1,2-fucosiloligosacáridos durante todo el curso de la lactancia, pero las

cantidades absolutas y relativas de estos respecto a los otros tipos (los α 1,3/4-

fucosiloligosacáridos) oscilan a lo largo de las diferentes etapas de la misma: la relación de los α

1,2 y de los α 1,3/4-fucosiloligosacáridos declina exponencialmente, desde un factor cinco en el

primer mes a aproximadamente una relación 1:1 al final del primer año (Coppa et al., 1993;

Coppa et al., 1999; Erney et al., 2000; Chaturvedi et al., 2001a).

Los antígenos Lewis también parecen participar en la variación de la expresión de los

oligosacáridos fucosilados en la leche materna así como en los HBGAs celulares. Se ha podido

observar que de los individuos secretores (FUT2+) aquellos con el fenotipo sanguíneo Le a- b+

no expresan el gen FUT3 que codifica la α 1,3/4 fucosiltransferasa, mientras que los individuos

del fenotipo sanguíneo Le a+ b+ sí expresan el FUT3 y esto podría relacionarse fuertemente con

la expresión de fucosiloligosacáridos de su leche. De hecho, la leche de las madres FUT2–

FUT3+ (Le a+ b-) contiene más lactosa N-fucopentosa II (LNF-II) y 3-fucosilactosa (3-FL),

oligosacáridos que están exclusivamente fucosilados con uniones α 1,3 o α 1,4, que las madres

FUT2+ FUT 3– (Le a-b+) . Estas últimas, en cambio contienen más lactosa N-fucopentosa I

(LNF-I, denominado H 1) y 2-fucosilactosa (2’-FL, denominado antígeno H tipo 2),

oligosacáridos que han sido exclusivamente fucosilados con uniones α 1,2 (Coppa et al., 1993;

Coppa et al., 1999; Erney et al., 2000; Chaturvedi et al., 2001a).

Se ha planteado que dada la relación existente entre la dotación del gen FUT2 y el

antígeno Lewis con el contenido de los oligosacáridos de la leche materna una alternativa para

conocer el genotipo materno podría ser estudiar el perfil de oligosacáridos de la leche materna,

evitando con ello realizar determinaciones genéticas complejas y costosas (Newburg et al.,

2004). Desafortunadamente, los datos sugieren que este esquema sólo representa una pequeña

aproximación a la expresión de los oligosacáridos de la leche materna debido a las variaciones


_____________________________________________________________________________

102

en su concentración a lo largo de la lactancia, tanto en individuos secretores como no secretores,

sugiriendo una mayor complejidad a la conocida en el proceso de producción de los

oligosacáridos de la leche materna y una posible intervención de otros agentes diferentes a las α

1,2/3/4 fucosiltransferasas (FUT1, 4, 5, 6, 7 y probablemente 9).

4.3.4.2. Resistencia a los enzimas digestivos

Para que la inhibición de patógenos entéricos por la leche humana sea biológicamente

relevante, los glicanos deben permenecer intactos durante su tránsito a través del canal

alimentario hacia las regiones intestinales donde tiene lugar la infección. Existen evidencias de

que se mantienen íntegros y pueden actuar en el tracto digestivo y respiratorio: (a) algunos

oligosacáridos se mantienen intactos debido a que las uniones de carbohidratos en los complejos

de glicanos son completamente diferentes de aquellas encontradas en los carbohidratos que

asimilamos como nutrientes, dificultando la posibilidad de digestión por los enzimas

intestinales, (b) además, los componentes proteicos podrían desarrollar su función en las partes

proximales del tracto digestivo y respiratorio donde las enzimas proteolíticas no se producen,

(c) asimismo, el tiempo de tránsito para la leche materna digerida a través del aparato digestivo

es bastante rápido, del orden de pocas horas, lo que minimiza la oportunidad para su

destrucción, y (d) podrían escapar a la digestión intragástrica e intraduodenal del lactante porque

existe un retraso en la producción de ácido gástrico y proteasas prancreáticas (Koldovsky et al.,

1985), (e) además, la capacidad tampón de la leche humana ayudaría a proteger a algunos de sus

componentes ácido-lábiles de la leche como las antiproteasas (Lindberg et al., 1982; Rudloff et

al., 1992; Rudloff et al., 1993; Garofalo et al., 1995).

Una aproximación para conocer el mantenimiento de la integridad estructural de los

oligosacáridos de la leche materna en el intestino podría ser su medición en la leche humana

consumida y la eliminada por heces y orina del lactante. De forma que, si el patrón de

oligosacáridos en las heces y en la orina fuera similar al de la leche sería esto una evidencia de

que los oligosacáridos sobreviven al tránsito intestinal. El desarrollo de técnicas de

cromatografía líquida de alta resolución para el estudio de los oligosacáridos neutros ha

permitido analizar esto revelando una gran similitud cualitativa de los oligosacáridos de la leche

materna, las heces y la orina de los niños lactados al pecho. Desde un punto de vista cuantitativo

se observan grandes diferencias, pues la cantidad total de oligosacáridos es menor en orina que

en leche y existen aproximadamente diez veces más en heces que en leche (Chaturvedi et al.,

2001b). Este último aspecto plantea dos cuestiones: en primer lugar, si los oligosacáridos se

absorben o son excretados en su totalidad por las heces y, además, el motivo por el que han

alcanzado concentraciones superiores a las ingeridas.


_____________________________________________________________________________

103

En relación al primer aspecto, se llevaron a cabo estudios con oligosacáridos marcados

con isótopos estables para conocer su destino y se demostró que sí existía una absorción parcial

en el intestino (de un 9% de lo ingerido) así como un filtrado renal de aproximadamente un 1%

(Obermeier et al., 1999), de forma que aproximadamente un 90% de los oligosacáridos parecían

superar intactos el tránsito a través del intestino.

En referencia a la segunda cuestión, podría explicarse la mayor presencia de

oligosacáridos en las heces respecto a lo ingresado con la alimentación por proceder de aquellos

ingeridos y no absorbidos, así como por ser producto de la digestión de glicoconjugados durante

su paso a través del canal alimentario.

4.3.4.3. Efectividad clínica de la protección de los glicanos

Un tercer aspecto es conocer si existe una correlación clínica entre la presencia de

oligosacáridos con propiedades protectoras y el riesgo de infecciones intestinales dado que a

pesar de que oligosacáridos y glicoconjugados específicos han demostrado su capacidad de

inhibir patógenos concretos cuando son evaluados de forma aislada in vitro, la relevancia clínica

de este hecho no ha sido analizada. Esto es fundamental pues es posible que no sean efectivos

en la compleja matriz del contenido intestinal e incluso su efecto cuantitativamente irrelevante

en el contexto de otros muchos componentes protectores de la leche materna.

La variación en la expresión de glicanos de la leche materna proporciona la oportunidad

para evaluar la efectividad de estos inhibidores de patógenos entéricos en la población (Morrow

et al., 2004; Newburg et al., 2004). Un estudio prospectivo estudió 93 parejas de madres e hijos

lactantes desde su nacimiento hasta los dos años de edad, tomando datos de la alimentación del

niño y la aparición de diarrea de forma semanal, asimismo se recogió una muestra de leche de

estas madres en las primeras 1 a 5 semanas postparto y se analizó su contenido de

oligosacáridos. Los niños que desarrollaron diarrea asociada con la toxina estable de

Escherichia coli estaban ingiriendo leche con una ratio de fucosiloligosacáridos con uniones

α 1,2 y α 1,3/4 menor que aquellos sin diarrea de este tipo. Asimismo, la diarrea por

Campylobacter sp. ocurrió con menor frecuencia en los niños cuyas madres presentaban leche

con un alto contenido de 2’-FL (fucosiloligosacárido con uniones α 1,2 que inhibe a

Campylobacter sp.) y la diarrea por NoV afectó en menor medida a los niños cuyas madres

presentaban leche con altos niveles de lactosa N-difucohexosa I (LDFH-I), un α 1,2-

fucosiloligosacárido que contiene un epítopo, una fracción Lewis b, que se une a NoV in vitro.

En conclusión, la diarrea moderada a grave por estas causas ocurrió menos frecuentemente en

aquellos niños cuya leche contenía altos niveles de fucosiloligosacáridos con uniones de tipo α

1,2 respecto al contenido total de oligosacáridos, la concentración de todos los oligosacáridos

con uniones α 1,2 fue un fuerte predictor de la diarrea de todas las causas y la concentración


_____________________________________________________________________________

104

total de fucosiloligosacáridos se relacionó de forma inversa con el riesgo de diarrea en los niños

lactados al pecho. Estos resultados condujeron a la afirmación de que los fucosiloligosacáridos

con uniones α 1,2 podrían unirse a a patógenos específicos y evitar su unión a los receptores de

sus células huésped en la mucosa intestinal protegiendo de este modo al niño de desarrollar

diarrea leve a moderada (Newburg et al., 2008).

4.3.5. Efectos sistémicos de los glicanos

El hecho de que los oligosacáridos de la leche materna se absorban parcialmente intactos

en el intestino delgado del lactante y aparezcan en su orina, a diferencia del niño alimentado con

fórmula (Rudloff et al., 1996; Obermeier et al., 1999; Gnoth et al., 2001), es una observación

relevante y proporciona las bases para dos hipótesis: (a) en primer lugar, los oligosacáridos de la

leche materna podrían ejercer una acción como receptores análogos con efecto antiadherente

para los patógenos urinarios; (b) en segundo lugar, a pesar de que la detección directa de

oligosacáridos en la sangre no ha sido publicada por el momento, su presencia en la orina podría

probar de forma indirecta su presencia en la circulación sistémica. Se estima una concentración

de oligosacáridos séricos de 100 a 200 mg/l, en base a la concentración de oligosacáridos en la

leche humana, la ingesta diaria media por el lactante, su volemia y la cantidad excretada en la

orina (Obermeier et al., 1999).

Si asumimos que los oligosacáridos de la leche materna alcanzan la circulación general

podríamos plantear que podrían intervenir en las interacciones proteína-carbohidrato a nivel

sistémico. Por ejemplo, las selectinas participan en la reacciones célula-célula del sistema

inmunitario (Ley et al., 2003), la P y la E-selectina median la deceleración leucocitaria en las

células endoteliales activadas e inician la extravasación leucocitaria hacia los lugares de la

inflamación (Springer et al., 1994), además la P-selectina también participa en la formación de

los complejos plaqueta-neutrófilo, una subpoblación de neutrófilos altamente activados

responsables de la adhesión, fagocitosis y producción incrementada de especies reactivas de

oxígeno (Peters et al., 1999). Las selectinas se unen a oligosacáridos fucosilados y sialilados

(Varki, 1997) de forma que son capaces de reducir la adhesión de los leucocitos humanos a las

células endoteliales activadas, a diferencia de los oligosacáridos no fucosilados ni sialilados que

carecen de estos efectos (Bode et al., 2004a). Además los oligosacáridos inhiben la formación

de complejos plaqueta-neutrófilo y reducen la subsiguiente activación neutrofílica (Bode et al.,

2004b).

Asimismo, se plantea la cuestión de si los efectos inmunomoduladores de los

oligosacáridos de la leche materna podrían suponer un compromiso del sistema inmunitario del

niño o bien una protección frente a respuestas inmunitarias exacerbadas como la enterocolitis

necrosante. Es conocido que la incidencia de la enterocolitis necrosante es de hasta un 85% más


_____________________________________________________________________________

105

baja en los niños lactados al pecho que en los alimentados con fórmula (Lucas et al., 1990a), a

pesar de que los mecanismos patogénicos de la enterocolitis necrosante no han sido del todo

descifrados parece que los propios leucocitos invasores y la hiperproducción de especies

reactivas de oxígeno son los responsables de la propagación de la enfermedad tras ser

desencadenada por una noxa inicial (Hsueh et al., 2003). La capacidad de los oligosacáridos de

inhibir la adhesión de los leucocitos en los lugares de inflamación y reducir la formación de

complejos plaqueta-neutrófilo altamente activados podría explicar la protección de los niños

alimentados al pecho frente a la enterocolitis necrosante y otras enfermedades inflamatorias

(Lucas et al., 1990a; Kunz et al., 2000; Rudloff et al., 2002; Bode et al., 2004a; Bode et al.,

2004b).

Debido a similitudes estructurales los oligosacáridos de la leche materna también podrían

interferir con otras interacciones tipo proteína-carbohidrato (tabla 19): (a) las galectinas,

lectinas que unen galactósidos, se unen a β-galactósidos y glicanos enriquecidos con poli-N-

acetilactosaminas (Kunz et al., 2000) y así regulan el crecimiento celular, la proliferación y

apoptosis, así como la compleja matriz de interacciones célula-célula (Perillo et al., 1998), (b)

los siglecs, lectinas Ig-like que unen el ácido siálico terminal en los puntos de unión α 2,3 o

α 2,6 (Cracker, 2002) y (c) DC-SIGN, célula dendrítica específica para la adhesión intercelular

de la no-integrina captadora de la molécula 3, podría ser otra diana potencial de los

oligosacáridos. Se expresa en las células dendríticas del intestino y de otros tejidos y participa

en la captura de diferentes patógenos, incluyendo VIH, hepatitis C, Ébola, citomegalovirus,

virus del dengue, Mycobacterium sp. y Candida albicans (van Kooyk et al., 2003). Además,

componentes no identificados en la leche materna se unen a DC-SIGN e inhiben la transferencia

del VIH a los linfocitos T CD4+ (Naarding et al., 2005), lo que aún requiere más estudios.

Tabla 19. INTERACCIONES PROTEÍNA-CARBOHIDRATO DE LOS GLICANOS DE LA LM

P y E-selectinas unidas a

oligosacáridos fucosilados y sialilados

Reducción de la adhesión de los leucocitos humanos

a células endoteliales activadas.

Inhibición de la formación de complejos plaqueta-

neutrófilo y activación neutrofílica.

Galectinas unidas a β-galactósidos y glicanos

enriquecidos con poli-N-acetilactosaminas

Regulación del crecimiento celular e interacciones

célula-célula.

Siglecs (lectinas Ig-like) unidas a ácido siálico en

los puntos de unión α 2,3 o α 2,6

Son necesarios más estudios para determinar su

función.

DC-SIGN unidas a oligosacáridos fucosilados Captura de diferentes patógenos.

_____________________________________________________________________________

106

HIPÓTESIS

_____________________________________________________________________________

107

HIPÓTESIS

En la actualidad se asume que la leche materna es el alimento de elección para el lactante

hasta los seis meses de vida, recomendándose que se ofrezca más allá de este periodo junto con

la alimentación complementaria.

Las ventajas nutricionales de la lactancia materna han sido ampliamente estudiadas, si

bien son menos conocidas sus propiedades defensivas. La capacidad protectora frente a la

adquisición de infecciones es una propiedad que ofrece un gran beneficio al niño amamantado,

especialmente frente a las infecciones producidas por norovirus (causa frecuente de infección

intestinal en la infancia).

Entre los efectores de esta función defensiva parecen estar implicados agentes de

inmunidad específica, como los anticuerpos de clase IgA, y componentes de la inmunidad

inespecífica, como los factores probióticos, la lactoferrina, la lisozima, la mucina, la

lactadherina, ciertos agentes antiinflamatorios, antioxidantes e inmunomoduladores, los

oligosacáridos y los glicoconjugados de la leche materna.

Los oligosacáridos de la leche materna, presentes libres o conjugados como

glicoproteínas o glicolípidos, presentan una gran similitud estructural con los antígenos

histosanguíneos humanos que actúan como receptores de norovirus en los enterocitos. Esto

podría explicar que al competir con ellos por la unión a las células diana pudieran impedir la

infección por NoV.

El hecho de que los oligosacáridos de la leche materna estén codificados por genes

relacionados con el grupo ABO, FUT2 y antígenos Lewis podría traducirse en una diferente

capacidad protectora de la leche materna según la dotación genética de la madre. Otras

características podrían también condicionar esta propiedad como, la etapa madurativa de la

leche materna (calostro, transición o madura) y la duración de la gestación (parto pretérmino o a

término).

OBJETIVOS

_____________________________________________________________________________

108

OBJETIVOS

General:

Analizar la capacidad protectora de la leche materna frente a las infecciones por norovirus y los

agentes responsables de ella.

Específicos:

1. Analizar la actividad bloqueante de muestras de leche humana sobre la unión de partículas

pseudovíricas de norovirus a saliva.

2. Evaluar la diferente actividad bloqueante de la leche humana de madres de recién nacido

pretérmino y a término. En el primer caso, analizar las diferencias existentes según la edad

gestacional.

3. Relacionar la actividad bloqueante de la leche humana con la fase madurativa de la misma:

calostro, transición y madura.

4. Relacionar los resultados con el grupo sanguíneo ABO, el genotipo secretor (FUT2) de la

madre y los antígenos Lewis.

5. Evaluar la capacidad bloqueante de muestras de suero sobre la unión de partículas

pseudovíricas de norovirus a saliva.

6. Analizar la presencia de anticuerpos específicos de norovirus en la leche y en el suero de las

mujeres lactantes que puedan ser responsables de la actividad bloqueante.

_____________________________________________________________________________

109

MATERIAL Y MÉTODOS

1. DISEÑO

Se ha realizado un estudio longitudinal prospectivo de muestras de leche materna

recogidas secuencialmente durante los 3 periodos de lactancia (calostro, leche de transición y

leche madura), así como de muestras de suero de las mismas mujeres (procedentes de los

estudios que se realizan de forma sistemática durante el embarazo).

Para la realización del estudio se contó con madres puérperas hospitalizadas en la Sala de

Maternidad del Hospital Clínico Universitario de Valencia y con madres cuyos hijos se

trasladaron para ser tratados en el Centro Neonatal del Servicio de Pediatría del mismo hospital.

Las muestras de suero y leche materna se analizaron en el Departamento de Microbiología y

Ecología de la Universidad de Valencia.

El estudio fue aprobado por el Comité Ético del Hospital Clínico de Valencia.

2. MUESTRA POBLACIONAL

El estudio se ha realizado mediante la colaboración de 111 madres puérperas durante el

periodo comprendido entre diciembre de 2006 y diciembre de 2009.

Las madres recibieron información escrita, completa y detallada de las características del

estudio (anexo 1) y expresaron su interés en participar voluntariamente a través de la firma de

un documento de consentimiento informado (anexo 2).

Para su inclusión en el estudio sólo se estableció como condición su interés en participar

y una buena disposición para acudir al hospital para completar la recogida de muestras de leche

materna durante el resto de la lactancia, en caso de no haberse recogido todas las muestras

durante su ingreso hospitalario.

Las características de las madres participantes en el estudio se describirán en el apartado

1 de Resultados.

3. MUESTRAS CLÍNICAS

3.1. LECHE MATERNA

Se obtuvieron 287 muestras de leche materna en los 3 periodos de lactancia: calostro (1º -

7º día), 106 muestras; leche de transición (8º - 14º día), 98 muestras; y leche madura (15º día y

sucesivos), 83 muestras.

_____________________________________________________________________________

110

De las 111 madres participantes en el estudio 5 no aportaron muestra de calostro por

haber decidido incorporarse al estudio transcurridos los 7 primeros días después del parto.

Asimismo, 13 no aportaron leche de transición por abandonar el estudio la segunda semana de

lactancia. En relación a las muestras de leche madura, aportaron muestra 83 de las madres.

Los motivos por los que algunas de las madres decidieron no proseguir con el estudio

fueron diversos: éxitus del niño, sectorización tras el alta de la Unidad de Cuidados Intensivos

Neonatales, interrupción de la lactancia materna o no querer trasladarse al hospital para aportar

la muestra.

Para la recogida de las muestras de leche se utilizó el siguiente material: (a) sacaleches

automático con regulador de vacío (Medela Symphony, Barr, Suiza), (b) embudos de succión

fabricados en poliestireno y (c) frascos con cierre de rosca acoplados a los embudos de succión

para la recogida directa de la leche materna. Los frascos y los embudos de succión se

esterilizaron en autoclave antes de su uso.

La muestra succionada con el sacaleches se recogió en los frascos, para posteriormente

ser alicuotada utilizando material estéril, y congelada a -20ºC, en los congeladores destinados al

almacenaje en frío de leche materna del Servicio de Pediatría del Hospital Clínico Universitario

de Valencia hasta la realización de los ensayos.

3.2. SUERO

De cada madre participante se recuperó una muestra de suero obtenida durante la

gestación para la determinación de Ag HBs (antígeno de superficie del virus de la hepatitis B) y

otros estudios que se realizan de forma sistemática durante el embarazo.

Se obtuvieron 71 muestras de suero que se almacenaron a -40ºC en el laboratorio del

Servicio de Microbiología del Hospital Clínico Universitario de Valencia. Los motivos por los

que no se obtuvo suero de 40 de las madres fueron los siguientes, en la mayoría de los casos

fueron desechadas tras un tiempo de almacenamiento en el laboratorio de Microbiología del

Hospital Clínico. Otras razones fueron el rechazo de algunas madres a cualquier tipo de control

serológico durante la gestación o bien la procedencia de áreas sanitarias diferentes al HCUV.

3.3. SALIVA

Se recogieron muestras de saliva de tres personas de nuestro grupo investigador. El

análisis del gen FUT2 estableció que correspondían a un individuo secretor homocigoto (SeSe),

a un individuo secretor heterocigoto (Sese) y a un individuo no secretor (sese), de idéntico

grupo sanguíneo (B +). La tipificación de antígenos Lewis se muestra en la siguiente tabla

(tabla 20).

_____________________________________________________________________________

111

Tabla 20. GENOTIPO FUT2 Y ANTÍGENOS LEWIS DE LAS MUESTRAS DE SALIVA

Genotipo FUT2 Lewis a Lewis b Lewis x Lewis y

No secretor (sese) Positivo Negativo Positivo Negativo

Secretor heterocigoto (Sese) Positivo Positivo Positivo Positivo

Secretor homocigoto (SeSe) Positivo Positivo Positivo Positivo

4. ANTICUERPOS

4.1. ANTICUERPOS MONOCLONALES

Se produjeron anticuerpos monoclonales frente a VLPs de norovirus genotipo GII.4

siguiendo los protocolos descritos por Harlow et al., 1998. El anticuerpo monoclonal resultante,

denominado 4C5C10, fue producido por un hibridoma obtenido de linfocitos de un ratón

BALB/c inmunizado con VLPs de genotipo GI.5 y seleccionado con VLPs de genotipo GII.4.

Este anticuerpo reconoce un dominio estructural en la región P2 de la proteína VP1 de la

cápside de NoV (Carmona et al., 2010). El isotipo al que corresponde es IgG1 λ.

Se emplearon anticuerpos monoclonales en los ensayos de ELISA destinados a la

determinación de los antígenos Lewis en muestras de leche materna. Estos anticuerpos de origen

comercial se detallan en la siguiente tabla (tabla 21).

Tabla 21. ANTICUERPOS MONOCLONALES EMPLEADOS PARA LA

DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS LEWIS

Ag Lewis a (Covance, nº de ref. SIG-3314)

Ag Lewis b (Covance, nº de ref. SIG-3315)

Ag Lewis x (Covance, nº de ref. SIG-3339)

Ag Lewis y (Covance, nº de ref. SIG-3317)

4.2. OTROS ANTICUERPOS

Se utilizaron anticuerpos conjugados con peroxidasa para la realización de los ensayos de

ELISA que analizaban el bloqueo de la unión de VLPs de NoV a saliva, anticuerpos frente a

NoV en leche materna y saliva y frente antígenos Lewis en leche materna. Estos anticuerpos, de

origen comercial, se especifican en la siguiente tabla (tabla 22).

_____________________________________________________________________________

112

Tabla 22. ANTICUERPOS CONJUGADOS EMPLEADOS EN ENSAYOS DE BLOQUEO, DE

ANÁLISIS DE ANTICUERPOS Y DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS LEWIS

IgG anti-IgG de ratón marcada con peroxidasa, producida en cabra (Sigma Immunochemicals, ref. nº A-4416)

IgG anti-IgG humana marcada con peroxidasa, producida en cabra (Sigma Immunochemicals, ref. nº G-3010)

IgG anti-IgA humana marcada con peroxidasa, producida en cabra (Sigma Immunochemicals, ref. nº A-0295)

IgG anti-IgM humana marcada con peroxidasa, producida en cabra (Sigma Immunochemicals, ref nº A-8786)

5. MÉTODOS

5.1. PRODUCCIÓN DE PARTÍCULAS PSEUDOVÍRICAS (VLPs) DE NOROVIRUS

GII.4 MEDIANTE BACULOVIRUS RECOMBINANTES

Se cultivaron células Sf9 (células de insecto Spodoptera frugiperda) en medio Sf-900 II

SFM (Gibco Invitrogen, ref. nº 10.902), sin suero bovino fetal y suplementado con penicilina,

estreptomicina y fungizona (0,5%), en frascos de poliestireno (Costar) de 75 cm2 de área a 27ºC.

Cuando la monocapa celular era confluente se procedía a la propagación del cultivo celular de

Sf9, para ello se despegaban las células golpeando el frasco suavemente para desprenderlas de

su superficie interna y se repartían en nuevos frascos añadiendo medio a cada uno de ellos.

Se infectaban células Sf9 con baculovirus recombinante que expresaba la proteína VP1

(ORF 2) de NoV de genotipo GII.4 (procedente de una muestra clínica, variante 2006b), con

una multiplicidad de infección de 5-10, y se mantenía el cultivo durante 5 días, según el

procedimiento de Jiang et al., 1992b.

Tras despegar las células y centrifugarlas a 600g 10 min. se lisaban las células del

sedimento con 100 mM de NaCl 1%, Tritón X-100 y 0,1% de inhibidor de proteasas (Protesase

Inhibitor Cocktail, Sigma Immunochemicals, ref. nº P-8849) en PBS durante 30 min a 4ºC en

hielo. Se centrifugaba el lisado obtenido a 15.000 g durante 10 min en el rotor A-14 (Beckman).

La producción de antígeno de cápside de norovirus en las células Sf9 infectadas se

confirmó por inmunofluorescencia indirecta utilizando el anticuerpo monoclonal 4C5C10

(descrito en el apartado 4.1 de Material y métodos), como vemos en la siguiente figura.

_____________________________________________________________________________

113

Figura 24. Detección por inmunofluorescencia de la expresión de Ag VP1 (de cápside) de NoV GII.4

en células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante.

A continuación se centrifugaba el sobrenadante sobre un colchón de sacarosa al 40%

(sacarosa en PBS con 100 mM de NaCl) a 120.000 g durante 3 h a 10ºC en rotor SW41Ti en

ultracentrífuga Beckman y se resuspendía el sedimento en 100 μl de PBS con 100 mM de NaCl.

Eventualmente, se purificaban las VLPs en gradientes de CsCl de 0-50% (índice de

refracción = 1,3678 a 33ºC) en tampón Tris HCl-NaCl (pH 7,5), preparado con 4,55 mg de ClCs

en 10 ml de H2O mQ.

Tras esto, se analizaban las VLPs mediante electroforesis en gel de poliacrilamida

(PAGE) y tinción con azul de Coomassie (apartado 5.1.1 de Material y métodos), así como

observación al microscopio electrónico tras tinción negativa con ácido fosfotúngstico pH 6,4

(apartado 5.1.2 de Material y métodos).

5.1.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil-sulfato sódico (SDS-PAGE) y

tinción con azul de Coomassie

La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil-sulfato sódico (SDS-PAGE) y

tinción con azul de Coomassie se empleaba para analizar el resultado de la producción y

purificación de partículas pseudovíricas (VLPs) de norovirus GII.4 mediante baculovirus

recombinantes. Las muestras solubilizadas se sometían a electroforesis en gel de poliacrilamida

al 10% con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE) según el método de Laemmli et al., 1970.

Mediante esta técnica, las proteínas se desnaturalizaban a 100ºC en presencia de SDS, el

cual se unía a los polipéptidos convirtiéndolos en polianiones. Al adquirir todas las proteínas la

_____________________________________________________________________________

114

misma densidad de carga, en presencia de un campo eléctrico migraban en un gel poroso

exclusivamente en función de su peso molecular.

Tabla 23. PREPARACIÓN DEL GEL PAGE INFERIOR (“RESOLVING GEL”, RG)

40% acrilamida (Bio-Rad)

Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8)

SDS 10% (Bio-Rad)

Temed (Bio-Rad)

Persulfato amónico 20%

Agua desionizada

1,25 ml

1,25 ml

50 μl

4 μl

25 μl

2,42 ml

El gel superior (“stacking gel”, SG) con 5% de acrilamida, se dispensaba en segundo

lugar y a través de él migraban inicialmente las proteínas para que llegasen todas al mismo

tiempo al RG y así se obtuviera una mejor resolución.

Tabla 24. PREPARACIÓN DEL GEL PAGE SUPERIOR (“STACKING GEL”, SG)

Acrilamida 40% (Bio-Rad)

Tris-HCl 1,5M (pH 6,8)

SDS 10% (Bio-Rad)

Temed (Bio-Rad)

Persulfato amónico 20%

Agua desionizada

312 μl

210 μl

25 μl

2,5 μl

12,5 μl

1,94 ml

A continuación se rellenaba la cubeta con tampón de electroforesis, utilizando un equipo

Mini-Protean II (Bio-Rad Laboratories).

Tabla 25. COMPOSICIÓN DEL TAMPÓN DE ELECTROFORESIS (5 X)

Tris base 0,3%

Glicina 1,44%

SDS 0,1%

_____________________________________________________________________________

115

Se realizaba un tratamiento previo de las muestras mediante la adición de azul de

bromofenol (concentración final 0,01%) y calentamiento a 100ºC durante 5 minutos, seguido de

centrifugación a 1.000 rpm 1 minuto. A continuación se cargaban los pocillos, incluyendo un

marcador de pesos moleculares para proteínas (Pre-stained SDS-PAGE Standard, Broad Range,

nº ref 72,807, Bio-Rad) con voltaje constante a 150 V durante 60 minutos (EC-105, Apparatus

Corporation).

El gel se teñía con azul de Coomassie durante 5 a 10 min. en agitación constante y se

sumergía en solución decolorante hasta la correcta visualización de las bandas.

Tabla 26. AZUL DE COOMASSIE Tabla 27. SOLUCIÓN DECOLORANTE

Coomassie Blue R-250 1 g

Metanol 450 ml

H2O 450 ml

Ácido acético glacial 100 ml

Metanol 100 ml

Ácido acético glacial 100 ml

H2O 800 ml

A continuación, se transfería a una membrana de nitrocelulosa y se realizaba un Western

blot para analizar la expresión de las VLPs. El revelado por quimioluminiscencia permitía

observar imágenes como las mostradas en la figura 25.

Figura 25. Western blot de VLPs de NoV GII.4 tras electroforesis de gel de poliacrilamida con

SDS-PAGE y revelado por quimioluminiscencia con antisuero de conejo anti-NoV.

_____________________________________________________________________________

116

La flecha señala la banda correspondiente a la proteína VP1 de cápside de NoV (aprox. 55 KDa).

Carriles 1 y 2: lisados de células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante expresando VLPs de

NoV GII.4.

Carril 3: células Sf9 sin infectar.

Carril 4: VLPs semipurificadas por centrifugación a través de colchón de sacarosa al 40%.

Carril 5: lisado de células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante expresando VLPs.

5.1.2. Observación al microscopio electrónico tras tinción negativa con ácido

fosfotúngstico

La observación al microscopio electrónico tras tinción negativa con ácido fosfotúngstico,

requería la preparación previa de rejillas de microscopía electrónica que se impregnaban con

Formvar disuelto al 1% en cloroformo y se recubrían con carbono por medio de un vaporizador

(Polaron P650A). A continuación las muestras se teñían con ácido fosfotúngstico al 2% en agua

destilada, pH 6,7.

La visualización se realizó en el microscopio electrónico del “Servei Central de Suport a

la Investigació Experimental” (Servicio central de apoyo a la investigación experimental,

SCSIE) del Campus de Burjassot de la Universidad de Valencia. En la figura 26 se muestra una

imagen de las VLPs obtenidas.

Figura 26. Imagen de VLPs de NoV GII.4 tras tinción negativa con ácido fosfotúngstico.

_____________________________________________________________________________

117

5.2. ENSAYOS DE UNIÓN DE VLPs DE NoV GII.4 A SALIVA

Se realizaron ensayos de unión de las VLPs de NoV GII.4 a las diferentes muestras de

saliva para conocer la afinidad existente entre ellas.

Las muestras de saliva se calentaban a 100ºC durante 5 min y centrifugaban a 10.000 g

durante 10 min. Se determinaba su concentración proteica por el método de Bradford (apartado

4.2.1 de Material y métodos) y se diluían a una concentración 1/500 en tampón 0,1 M

carbonato-bicarbonato pH 9,6 (NaHCO3 0,045 M y Na2CO3 0,018 M), o concentración final de

2,27 μg/ml.

Se tapizaban pocillos de placa de microtitulación con 100 μl de esta dilución de saliva, se

incubaban a 37ºC 2 h y durante la noche a 4ºC. Se estableció un tiempo límite para su uso de

hasta 10 días después de su incubación, manteniéndose siempre a 4ºC.

Posteriormente, se lavaba la placa con tampón de lavado (PBS-Tween 0,01%) y se

bloqueaban los pocillos con PBS-T 0,05%-seroalbúmina bovina 3% (PBS-T-BSA) a 37ºC 1 h.

A continuación se añadían 100 μl por pocillo de la supensión de VLPs a 200 μg/ml en

tampón carbonato-bicarbonato pH 9,6 (20 μg/pocillo) y se incubaba a 37ºC durante 2 h.

Completadas las 2 h de incubación, se lavaba 3 veces con PBS-T 0,01%, se añadían

100 μl de anticuerpo monoclonal 4C5C10 anti-VLPs diluído 1/100 producido en nuestro

laboratorio (según se describe en el apartado 4.1 de Material y métodos) y se incubaba a 37ºC

durante 1 hora.

Tras el lavado de la placa, se añadían 100 μl de IgG anti-IgG de ratón marcada con

peroxidasa, producida en cabra, (Sigma Immunochemicals, ref. nº A-4416) diluída 1/2000. Tras

un nuevo lavado, la reacción se revelaba con solución de OPD: 5 mg de OPD (orto-

fenilenediamina dihidroclorato, Sigma Immunochemicals, ref. nº P-3804) y 50 μl de H2O2 3%,

en tampón citrato/fosfato pH 5 (ácido cítrico 0,47 g, Na2HPO4 0,73 g y H2O c.s.p. 100 ml) y se

incubaba 15 minutos. La adición de 50 μl por pocillo de H2SO4 3M permitía detener la reacción.

A continuación se medía la absorbancia mediante lectura en espectrofotómetro (Multiskan FC,

Thermo Scientific) a 492 nm.

Los resultados de este ensayo mostraron una mayor afinidad de las VLPs de NoV GII.4 a

saliva de individuo no secretor, a continuación de individuo secretor homocigoto y por último

de secretor heterocigoto. Motivo por el cual se seleccionaron las muestras de saliva de individuo

no secretor y secretor homocigoto para los ensayos que se describen a continuación.

_____________________________________________________________________________

118

5. 3. ENSAYOS DE BLOQUEO DE LA UNIÓN DE VLPs DE NoV GII.4 A SALIVA

Los ensayos de bloqueo de la unión de VLPs de norovirus GII.4 a saliva se realizaron

mediante técnica de ELISA. Se siguió el procedimiento descrito por Thorven et al. (2005) con

modificaciones.

La preparación de las muestras de saliva y la sensibilización de las placas de

microtitulación se realizó según lo descrito en el apartado previo (apartado 5.2 de Material y

métodos).

Posteriormente, se lavaba la placa con tampón de lavado (PBS-Tween 0,01%) y se

bloqueaban los pocillos con PBS-T 0,05%-seroalbúmina bovina 3% (PBS-T-BSA) a 37ºC 1 h.

Simultáneamente, se incubaban 50 μl por pocillo de la supensión de VLPs a 200 μg/ml en

tampón carbonato-bicarbonato pH 9,6 (10 μg/pocillo) con 50 μl de las diferentes muestras de

leche materna (calostro, leche de transición y madura) y suero. Las muestras de leche materna

se emplearon sin diluir y diluidas 1/100 en PBS, si bien las muestras de suero no se sometieron

a ninguna dilución, sino que se añadieron sin diluir tras un proceso de descomplementación

mediante calentamiento a 56ºC durante 30 min. Tras lavar las placas de microtitulación con

PBS-T 0,01% se añadían 100 μl por pocillo de estas supensiones e incubaban a 37ºC durante 2

horas.

Los valores de referencia de cada ELISA, es decir los valores máximos esperados de cada

ensayo, se obtuvieron mediante la adición de 100 μl de la suspensión de VLPs (200 μg/ml) a un

número de pocillos, sin preincubación con leche materna o suero (para evitar que estas muestras

pudieran interferir con la unión a la saliva). Los valores mínimos de cada ensayo se obtuvieron

con la adición de 100 μl de PBS-T 0,01% a otros pocillos.

Completadas las 2 h de incubación, se lavaba 3 veces con PBS-T 0,01%, se añadían

100 μl de anticuerpo monoclonal 4C5C10 anti-VLPs diluído 1/100 producido en nuestro

laboratorio (según se describe en el apartado 4.1 de Material y métodos) y se incubaba a 37ºC

durante 1 hora.

Tras el lavado de la placa, se añadían 100 μl de IgG anti-IgG de ratón marcada con

peroxidasa, producida en cabra, (Sigma Immunochemicals, ref. nº A-4416) diluída 1/2000. Tras

un nuevo lavado, la reacción se revelaba con solución de OPD: 5 mg de OPD (orto-

fenilenediamina dihidroclorato, Sigma Immunochemicals, ref. nº P-3804) y 50 μl de H2O2 3%,

en tampón citrato/fosfato pH 5 (ácido cítrico 0,47 g, Na2HPO4 0,73 g y H2O c.s.p. 100 ml) y se

incubaba 15 minutos. La adición de 50 μl por pocillo de H2SO4 3M permitía detener la reacción.

_____________________________________________________________________________

119

A continuación se medía la absorbancia mediante lectura en espectrofotómetro

(Multiskan FC, Thermo Scientific) a 492 nm.

Figura 27. Esquema de los ensayos de bloqueo de la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva mediante

leche materna o suero.

En la representación gráfica de la izquierda se muestra la unión de las VLPs de NoV GII.4 (2) a los

receptores en saliva (1). Esta unión es detectada por el AcMo 4C5C10 anti-VLPs (3) y marcada con

IgG anti-IgG de ratón marcada con peroxidasa (5), que permite su revelado con OPD.

En la representación gráfica de la derecha los receptores en saliva (1) han sido bloqueados por

componentes de la leche materna o suero (6), de estructura análoga a las VLPs de NoV GII.4 (2),

impidiendo su unión in vitro.

En espectroscopía, la absorbancia (А) es definida como: Аλ = - log10 ( I / I0 )

Donde “I0” es la intensidad de la luz antes de que incida en una muestra (intensidad de la luz

incidente), con una longitud de onda específica “λ”, e “I” es la intensidad de esta luz que pasa

por dicha muestra (intensidad de la luz transmitida).

El término es frecuentemente intercambiable con densidad óptica, si bien éste último se refiere a

la absorbancia por unidad de longitud. Las medidas de absorbancia son frecuentemente usadas

http://es.wikipedia.org/wiki/Espectroscopia

http://es.wikipedia.org/wiki/Longitud_de_onda

http://es.wikipedia.org/wiki/Densidad_%C3%B3ptica

_____________________________________________________________________________

120

en química analítica ya que la absorbancia es proporcional al grosor de una muestra y la

concentración de una sustancia en ella. En contraste a la transmitancia (I / I0) que varía

exponencialmente con el grosor y la concentración (Ley de Beer-Lambert, figura 30).

Figura 28. Ley de Beer-Lambert.

La actividad bloqueante de las muestras de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV

GII.4 a saliva se determinó mediante técnica de ELISA. Se calculó a partir de una relación entre

los valores de absorbancia obtenidos tras la lectura con espectrofotómetro a 492 nm de los

pocillos de los ensayos de ELISA. Se creó el parámetro “porcentaje de inhibición” que

relacionaba los valores de absorbancia obtenidos de cada una de las muestras problema, el valor

de referencia (valor de absorbancia máximo de cada ensayo, resultante de la unión de VLPs a

saliva sin leche materna que pudiera interferir en la unión) y el ruido de fondo (valor de

absorbancia mínimo de cada ensayo, resultante de la adición de PBS a un pocillo tapizado con

saliva), expresándose en tanto por cien (Forthal et al., 1998; Forthal et al., 2001).

5.3.1. Método de Bradford

Con el fin de conocer la concentración de proteínas en las muestras de saliva empleadas

se aplicó el test de Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Bio-Rad Laboratories).

A partir de una solución de seroalbúmina bovina (BSA) de concentración 1,4 mg/ml, se

preparaban soluciones conteniendo 1, 5, 10, 15, 20 y 25 μg/ml de BSA en suero fisiológico. De

la siguiente manera:

http://es.wikipedia.org/wiki/Transmitancia

http://es.wikipedia.org/wiki/Ley_de_Beer-Lambert

_____________________________________________________________________________

121

Solución A (100 μg/ml) = 72 μl BSA + 928 μl de SF

Solución 1 (20 μg BSA/ml): 200 μl de solución A + 600 μl de SF






Blanco (por duplicado): 800 μl de SF

A continuación, se tomaban 0,8 ml de cada una de las soluciones preparadas en tubos

estériles, así como 0,8 ml de la muestra a cuantificar. Se añadía a cada tubo 0,2 ml de reactivo

colorante Serva Blue G Dye® y se agitaba intensamente, evitando la formación de burbujas.

Transcurridos 5 minutos se realizaban lecturas espectrofotométricas de los tubos a 595 nm en

espectrofotómetro (UNICAM modelo Helios α), utilizando el tubo de suero fisiológico como

blanco. Con las lecturas de las soluciones preparadas inicialmente se elaboraba una curva patrón

y se extrapolaban los resultados obtenidos en la muestra.

Tabla 28. CONCENTRACIÓN PROTEICA DE MUESTRAS DE SALIVA EMPLEADAS

Saliva FUT2 positivo (SeSe) 1.134,8 μg/ml

Saliva FUT2 negativo homocigoto (sese) 826,6 μg/ml

Saliva FUT2 negativo heterocigoto (Sese) 928,2 μg/ml

5.4. ANÁLISIS POR ELISA DE ANTICUERPOS EN LECHE MADURA/DE

TRANSICIÓN Y SUERO FRENTE A NoV

La determinación de los Ac anti-NoV en leche madura/de transición y suero se realizó

mediante técnica de ELISA. Se sensibilizaban placas de poliestireno de microtitulación de 96

pocillos (Costar, nº ref. 3.590) con 100 μl de una suspensión de VLPs a 200 μg/ml en tampón

carbonato-bicarbonato pH 9,6 para estudio por ELISA de anticuerpos frente a dichas VLPs (20

μg/pocillo). Para ello se incubaban a 37ºC durante 2 horas y conservaban una noche a 4ºC (hasta

un máximo de 10 días antes de su utilización).

Se realizaron diluciones de las muestras a estudio en PBS-T 0,01%-BSA 1%. Las

muestras de suero se analizaron a las siguientes diluciones: 1/50, 1/100, 1/500, 1/1.000 y

_____________________________________________________________________________

122

1/5.000. Las muestras de leche madura, y en caso de carecer de ella, de leche de transición, se

diluyeron a 1/100, 1/500 y 1/1.000 (tabla 29).

Tabla 29. DILUCIONES DE LAS MUESTRAS DE SUERO Y LECHE

MADURA PARA EL ANÁLISIS DE ANTICUERPOS FRENTE A NoV

SUERO LECHE MADURA

1/50

1/100

1/500

1/1.000

1/5.000

1/100

1/500

1/1.000

Tras vaciar los pocillos y lavar 3 veces con 200 μl de PBS-T 0,01%, se añadían 100 μl de

estas diluciones de suero o leche materna e incubaban 2 horas a 37ºC.

A continuación, se añadían 100 μl de dilución 1/2000 de IgG anti-IgG humana marcada

con peroxidasa producida en cabra (Sigma Immunochemicals, ref. nº G-3010) para la

determinación de IgG específica anti-NoV en suero y leche materna, e IgG anti-IgA humana

marcada con peroxidasa producida en cabra (Sigma Immunochemicals, ref. nº A-0295) en los

análisis de IgA anti-NoV en leche materna.

Se vaciaban los pocillos, se lavaban 4 veces con 200 μl de PBS-T 0,05% y revelaban con

100 μl de la solución sustrato OPD. La absorbancia se leía en espectrofotómetro (Multiskan FC,

Thermo Scientific) a 492 nm.

Los valores de referencia de los ensayos, los valores máximos esperados, se diseñaron de

la siguiente manera: (a) para los ensayos de determinación de IgG anti-NoV en suero y leche

materna se tomó una muestra de suero de un individuo convaleciente en un brote epidémico por

NoV con una titulación elevada de estos Ac, y (b) para los análisis de IgA en leche materna, se

seleccionó la muestra de leche materna del primer ensayo de ELISA realizado que presentó el

valor de absorbancia más elevado y así sirvió como valor de referencia en los análisis sucesivos.

Los valores mínimos del ensayo se diseñaron sustituyendo la muestra problema (suero o leche

materna) por PBS-T 0,05%.

Se consideraron resultados valorables aquellas mediciones de absorbancia que triplicaban

el valor mínimo esperado.

_____________________________________________________________________________

123

El título de anticuerpos se definió como la dilución más elevada cuya absorbancia

mostraba un resultado positivo.

Figura 29. Esquema de los análisis por ELISA de anticuerpos en suero y leche madura frente a

NoV.

El análisis por ELISA de anticuerpos IgG anti-NoV en suero y leche madura (2) e IgA anti-NoV en

leche madura (3) se realiza incubando las muestras en pocillos de placas de microtitulación

tapizadas con VLPS de NoV GII.4 (1).

La unión resultante se detecta mediante IgG anti-IgG humana (4) e IgG anti-IgA humana (5)

marcadas con peroxidasa (6), respectivamente. El revelado se realiza con OPD.

5.5. DETERMINACIÓN POR PCR DEL GENOTIPO SECRETOR (GEN FUT2)

Para determinar el estado secretor, definido por la presencia del antígeno H tipo 1, se

amplificó un fragmento del gen FUT2, codificante de la enzima α 1,2-fucosiltransferasa,

siguiendo la metodología de PCR-RFLP descrita por Lindesmith et al. en 2003 y Serpa et al. en

2004, con ciertas modificaciones.

5.5.1. Extracción del ADN total de las muestras de leche materna

Se realizó mediante el método QIAamp DNA Mini (50) Kit de Qiagen (catálogo nº

51.304. Hilden, Alemania). El ADN obtenido se utilizaba posteriormente para la amplificación

por PCR del gen FUT2.

Para ello, en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml se añadían 20 μl de la proteasa Qiagen

(proteinasa K), 200 μl de leche materna y 200 μl del tampón AL del kit, mezclándolos mediante

_____________________________________________________________________________

124

vórtex durante 15 s. A continuación se incubaba la solución resultante a 56ºC durante 10 min.

Tras centrifugar brevemente el tubo, se añadían 200 μl de etanol 96% a la muestra y se

mezclaba y centrifugaba nuevamente. Con cuidado se introducía la solución en una “QIAamp

Mini spin column”, diseñada para realizar un filtrado de la muestra, en un tubo de colección de

2 ml y se centrifugaba a 6.000 g (8.000 rpm) durante 1 min. Tras esto, se colocaba la “QIAamp

Mini spin column” en un tubo de 2 ml nuevo, descartando el tubo que contenía el filtrado

resultante.

Los pasos sucesivos consistían en la adición de 500 μl de tampón AW1, 500 μl de tampón

AW2 y 200 μl de tampón AE (todos ellos del kit) o agua destilada, centrifugando a 6.000 g

1 min, 20.000 g 3 min y 6.000 g 1 min tras cada adición, respectivamente, colocando la

“QIAamp Mini spin column” en tubos nuevos tras cada paso y descartando el filtrado resultante.

5.5.2. Análisis por PCR del gen FUT2

Completada la extracción de ADN, el procedimiento fue el siguiente. A cada tubo de

reacción se le añadieron 5 μl del ADN y 5 μl de la mezcla de tampón de PCR 10X (Tris-HCl

200 mM, pH 8,4, y KCl 500 mM de Invitrogen), 2,4 mM de MgCl2, 0,2 mM de dNTPs, 20

pmoles de cada uno de los cebadores, 2,5 U de Taq DNA polimerasa (Invitrogen, ref. nº 10.342)

y agua destilada y autoclavada (libre de ADNasas y ARNasas).

La reacción de PCR se llevó a cabo de la siguiente manera: un paso de desnaturalización

inicial a 95ºC durante 5 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 30 s,

hibridación a 70ºC durante 30 s y extensión a 72ºC durante 1 min, por último, un paso de

extensión final a 72ºC 10 min. Los cebadores o “primers” empleados se detallan en la siguiente

tabla (Tabla 30).

Tabla 30. SECUENCIA DE OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS EMPLEADOS PARA LA

AMPLIFICACIÓN DEL GEN SECRETOR HUMANO, FUT2 (LINDESMITH ET AL., 2003)

Secuencia 5’-3’ Ubicación

(nt.) Tm (ºC) Tamaño

% G

C

GAGGAATACCGCCACATCCCGGGGGAGTAC 403-432 72,9 30 63,3

ATGGACCCCTACAAAGGTGCCCGGCCGGCT 568-597 77,2 30 66,7

% GC: porcentaje guanina-citosina.

_____________________________________________________________________________

125

Los productos de amplificación de 195 pares de bases (pb), fueron observados mediante

electroforesis en geles de agarosa al 2% (Agarosa DS de Pronadisa, ref. nº 8.046) en tampón

Tris-borato (TBE) con bromuro de etidio (EtBr) 0,5 μg/ml (Anexo 7). La migración

electroforética se realizó a 90 voltios durante 60 min en cubetas Minicell Primo EC320. Se

visualizaron y fotografiaron las bandas y se estimó su tamaño utilizando como referencia de

peso molecular el marcador 1kb Plus DNA ladder (Invitrogen), utilizando un equipo Gelprinter

TDI.

Una vez obtenidos los productos de amplificación por PCR, fueron sometidos a una

digestión enzimática empleando la enzima de restricción Ava II (New England Biolabs, Inc.,

Beverly, MA, EEUU). Un producto no digerido por la enzima define a la persona como “no

secretor” o Se– (sese), por el contrario, cuando ocurre la digestión, se evidencian dos fragmentos

(59 pb y 136 pb) que permiten clasificar a las personas como “secretores”, homocigotos (SeSe)

o heterocigotos (Sese), como muestra la figura 30.

Figura 30. Imagen de electroforesis de los productos de amplificación por PCR del gen FUT2

sometidos a digestión enzimática por Ava-II.

Carril 1: marcador de pesos moleculares (MW) 100 bp DNA Ladder (Invitrogen).

Los carriles 1, 3, 4 y 7 presentan 3 bandas de 195, 136 y 59 pb y corresponden a individuos

secretores heterocigotos.

Los carriles 2 y 6 presentan 2 bandas de 136 y 59 pb y corresponden a individuos secretores

homocigotos.

El carril 5 presenta una banda de 195 pb y corresponde a un individuo no secretor.

_____________________________________________________________________________

126

Para tal fin, se tomaron 7 μL del ADN amplificado, 1,5 μL de tampón 4 (50 mM acetato

de potasio, 20 mM Tris-acetato, 10 mM acetato de magnesio, 1 mM DTT a pH 7,9), 10 U de la

enzima Ava II y H2O miliQ c.s.p. 15 μL. Tras una incubación de 3 horas a 37ºC, las muestras

fueron analizadas en geles de agarosa al 2% teñidos con EtBr (0,5 μg/ml).

Para la preparación del gel de agarosa, se vertían 30 ml del tampón de electroforesis Tris-

borato (TBE) y agarosa (Agarosa DS de Pronadisa, ref. nº 8.046) para una concentración final

de 2% en un matraz. A continuación, se fundía la solución de agarosa en un microondas o placa

calefactora y dejaba enfriar la suspensión hasta alcanzar unos 50ºC aproximadamente. Se

sellaba con cinta adhesiva el soporte donde se iba a verter el gel de agarosa y se colocaba el

peine que serviría para formar los pocillos del gel.

Una vez que la solución de agarosa alcanzaba los 50ºC, se le añadía bromuro de etidio

para concentración final de 0,5 μg/ml y se mezclaba bien. Se vertía la solución de agarosa con

bromuro de etidio en el soporte, previamente sellado y dejaba solidificar durante unos 30

minutos.

Mediante esta técnica, el ADN en presencia de un campo eléctrico migraba en un gel

poroso en función de su peso molecular. La migración electroforética se realizaba a 90 voltios

durante 60 min. Se visualizaban y fotografiaban las bandas y se estimaba su tamaño utilizando

como referencia de peso molecular la 100 bp DNA Ladder (Invitrogen, ref. nº 31.006).

En ciertas muestras, la determinación del gen FUT2 se realizó mediante la secuenciación

directa de los amplicones obtenidos en la prueba de PCR. Para ello, los amplicones fueron

purificados siguiendo las instrucciones del sistema QIAquick PCR purification kit (Qiagen) y se

utilizó el cebador antisentido para la reacción de secuenciación, que se llevó a cabo en el

Servicio de Secuenciación de la Universidad de Valencia.

Para determinar la homocigosidad o heterocigosidad de un individuo en relación con el

gen FUT2 (mutación G428A, 385 A > T), se ubicó el polimorfismo del gen en la siguiente

secuencia 5’…AAGGTCCAGGAGC…3’. El análisis del cromatograma indicó la presencia de

un doble pico en la posición del polimorfismo para aquellos individuos secretores heterocigotos

(figura 31 A), mientras que se observó un solo pico en pacientes secretores homocigotos (figura

31B) y ninguno en no secretores (figura 31 C).

_____________________________________________________________________________

127

Figura 31. Cromatogramas del gen FUT2: (A) secretor heterocigoto, (B) secretor homocigoto y (C)

no secretor.

5.6. DETERMINACIÓN DE ANTÍGENOS LEWIS

La caracterización de los antígenos Lewis se realizó en las muestras de saliva empleadas

en el estudio (tabla 20), así como en las muestras de leche madura (y en su defecto de

transición) de cada una de las madres participantes en el estudio.

Para ello se sensibilizaban pocillos de placa de microtitulación con 100 μl de una dilución

en tampón carbonato/bicarbonato pH 9,6 de cada una de las muestras de saliva a una

concentración de 2 μg/ml o de leche madura (en su defecto de leche de transición) diluídas 1/10.

Se incubaban las placas durante 2 horas a 37ºC y guardaban a 4ºC durante la noche.

Tras lavar 3 veces con tampón PBS-T 0,05%, se bloqueaban las placas con 100 μl de

PBS-T 0,05%-BSA 0,5% durante 1 hora a 37ºC. Tras 3 nuevos lavados, se añadían 100 μl de

una dilución 1/100 en PBS-T 0,05%-BSA 0,5% del AcMo frente el antígeno Lewis a, b, x, y

(detallados en la tabla 21), incubando posteriormente durante 2 h a 37ºC. Los valores mínimos

esperados de cada ensayo serían aquellos en los que se añadía PBS-T 0,05% en sustitución del

AcMo específico.

Tras lavar de nuevo, se añadían 100 μl de dilución 1/2000 de anti-IgG de ratón producida

en cabra marcada con peroxidasa en los ensayos de determinación de Ag Lewis a/b (Sigma

Immunochemicals, ref. nº G-3010) y anti-IgM de ratón producida en cabra marcada con

_____________________________________________________________________________

128

peroxidasa (Sigma Immunochemicals, ref. nº A-8786) en los ensayos de determinación de Ag

Lewis x/y. Tras esto se incubaba nuevamente 1 hora y media.

La adición de 100 μl de solución de OPD en tampón citrato/fosfato pH 5 con H2O,

seguido de 50 μl H2SO4 15 minutos después (para frenar la reacción), permitía el revelado y la

lectura en espectrofotómetro a 492 nm nos proporcionaba el resultado.

6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS RESULTADOS

En primer lugar se realizó una descripción de los resultados obtenidos. En el caso de las

variables cualitativas se expresaron como número de casos y porcentaje (origen geográfico,

grupo de edad gestacional, grupo sanguíneo, genotipo FUT2, antígenos Lewis y títulos de Ig) y

las variables cuantitativas como nº de casos, media y desviación típica, mediana e intervalo

intercuartílico, mínimo y máximo (edad materna, edad gestacional, porcentajes de inhibición de

leche materna y de suero).

En cuanto al análisis estadístico se aplicó la prueba de Chi cuadrado para las variables

cualitativas y pruebas no paramétricas en el caso de las variables cuantitativas, tras demostrar

que no seguían una distribución normal con la prueba de Shapiro-Wilks. Para establecer

comparaciones entre múltiples variables cuantitativas continuas independientes y variables

cualitativas se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis y en caso de hallar diferencias

estadísticamente significativas se buscaron los pares responsables de estas diferencias con la

prueba de Mann-Whitney. De forma análoga, para múltiples variables cuantitativas continuas

apareadas se empleó la prueba de Friedman y la W de Wilcoxon para las comparaciones dos a

dos. Realizándose una selección de datos según lista que no excluye ningún dato, con lo que no

se pierde información.

En los estudios de correlación se empleó la correlación de Pearson entre variables

cuantitativas continuas que no seguían una distribución normal y la correlación de Spearman si

al menos una de ellas era una variable cuantitativa discreta ordenada. Realizándose una

selección de datos según pareja que iguala el número de casos de cada variable, para una mayor

corrección.

El nivel de significación estadística empleado en todos los análisis ha sido del 5% (p-

valor < 0,05), excepcionalmente de 10% (p-valor < 0,1). En los casos en que debía aplicarse la

corrección de Bonferroni el p-valor resultaba del cociente de 0,05 y el nº de comparaciones

realizadas.

Para estos análisis se ha utilizado el software SPSS 19.0 (Lead Technologies, Inc.).

_____________________________________________________________________________

129

RESULTADOS

1. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LA MUESTRA POBLACIONAL

Se analizaron las siguientes características generales de la muestra poblacional: edad

materna en el momento del parto, edad gestacional y origen geográfico materno.

Las edades maternas en el momento del parto y las semanas de gestación se recogen en la

tabla 31. Se expresan como nº de casos y porcentaje (%), media y desviación típica (DT),

mediana e intervalo intercuartílico (I.Q.), mínimo y máximo. La edad materna promedio fue de

31 años, oscilando de 16 a 40 años. En relación con la duración de la gestación, 62 fueron

gestaciones a término y 49 finalizaron de forma prematura (figura 32). Estas últimas se

dividieron en 3 subgrupos atendiendo al grado de prematuridad, como se muestra en la tabla 32.

Tabla 31. EDAD EN EL MOMENTO DEL PARTO

DE LAS MADRES PARTICIPANTES Y EDAD GESTACIONAL

N

(%)

Media

(DT)

Mediana

(I.Q.: P25 - P75)

Mínimo -

máximo

EDAD MATERNA (años) 109 31 (5,6) 31,3 (27,1 – 35,2) 16,2 – 40,6

EDAD

GESTACIONAL

(semanas de

gestación)

Todos 111 36,2 (4,6) 38 (33 – 38) 24 - 42,3

RN a término 62 (55,9%) 39,7 (1,2) 40 (38,8 – 40,3) 37,1 - 42,3

RN pretérmino 49 (44,1%) 31,8 (3,4) 32,4 (30 – 34,4) 24 – 36,6

Figura 32. Mediana, intervalo intercuartílico y rango de edad gestacional (semanas de gestación) de

la muestra de estudio.

22

27

32

37

42

RN a término RN pretérmino

Máximo

p75

p25

Mínimo

_____________________________________________________________________________

130

Tabla 32. CARACTERÍSTICAS DE GRUPOS DE RN PRETÉRMINO (semanas de gestación)

PREMATURIDAD N

(%)

Media

(DT)

Mediana

(I.Q. : P25 – P75) Mín.-máx.

Leve (≥ 32 y < 37 semanas) 33

(67,3%) 33,8 (1,6) 34 (32,4 – 35) 32,9 - 36,7

Moderada ( ≥ 28 y < 32 semanas) 9

(18,4%) 30,1 (1) 30 (29,6 – 31) 29 - 31,9

Extrema (< 28 semanas) 7

(14,3%) 25,9 (1,4) 26 (24,6 – 27,3) 24 - 27,7

Respecto al origen geográfico de las madres participantes, como se muestra en la tabla 33

y en la figura 33, el origen español, como era esperable, fue el predominante (64,8%), seguido

del origen latinoamericano (19,8%).

Tabla 33. ORIGEN GEOGRÁFICO DE LAS

MADRES

ORIGEN GEOGRÁFICO N (%)

España 72 (64,9%)

Latinoamérica 22 (19,8%)

Europa del Este 11 (9,9%)

Marruecos 5 (4,5%)

China 1 (0,9%)

2. GRUPOS SANGUÍNEOS, GENOTIPO FUT2 Y ANTÍGENOS LEWIS

2.1. GRUPOS SANGUÍNEOS

Los grupos sanguíneos más frecuentes, A y 0, representaron un 85,5% de las muestras.

Tabla 34. GRUPOS SANGUÍNEOS DE LAS

MADRES

GRUPO SANGUÍNEO N (%)

Grupo A 51 (45,9%)

Grupo O 44 (39,6%)

Grupo B 11 (9,9%)

Grupo AB 2 (1,8%)

Desconocido 3 (2,8%)

Figura 33. Origen geográfico

España

Latinoamérica

Europa del Este

Marruecos

China

Figura 34. Grupos sanguíneos

Grupo A

Grupo O

Grupo B

Grupo AB

Nodeterminado

_____________________________________________________________________________

131

2.2. GENOTIPO FUT2

El nº de casos y porcentaje del genotipo FUT2 de las madres participantes en el estudio se

muestra en la tabla 35 y figura 35. Se observa que las madres con genotipo FUT2 secretor, tanto

homocigotas (SeSe) como heterocigotas (Sese) fueron un 86,5% de la totalidad, frente al 13,5%

de las madres no secretoras (sese).

Analizamos la proporción de madres secretoras y no secretoras según su origen

geográfico (tabla 36), edad gestacional (tabla 37) y grupo sanguíneo (tabla 38).

Encontramos que el grupo geográfico predominante de madres españolas presentó una

proporción de mujeres secretoras (homocigotas y heterocigotas) de un 83,3 % de los casos.

Además, encontramos diferencias estadísticamente significativas en la proporción de madres

secretoras y no secretoras según su origen geográfico (tabla 36).

Tabla 35. GENOTIPO FUT2 DE

LAS MADRES

GENOTIPO FUT2 N (%)

Secretor homocigoto 24 (21,6%)

Secretor heterocigoto 72 (64,9%)

No secretor 15 (13,5%)

Tabla 36. GENOTIPO FUT2 SEGÚN ORIGEN GEOGRÁFICO MATERNO

Madres no secretoras

(sese)

Madres secretoras

(SeSe / Sese) Chi cuadrado*

N Porcentaje** N Porcentaje** p-valor

España 12 16,7% 60 83,3% 0,000

Latinoamérica 2 9,1% 20 90,9%

Europa Este 1 9,1% 10 90,9%

Marruecos - - 5 100%

China - - 1 100%

** Para cada origen geográfico; * Nº de casillas con valor esperado < 5 es de 0.

_____________________________________________________________________________

132

Los grupos de madres con partos pretérmino y a término fueron homogéneos en relación

con la proporción de madres secretoras y no secretoras, como muestra la tabla 37.

No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en la proporción de madres

secretoras y no secretoras de los grupos sanguíneos más frecuentes: A y O (tabla 38).

La proporción de los diferentes antígenos Lewis (Le a/b y Le x/y) en madres secretoras y

no secretoras se mostrará en el siguiente epígrafe (tabla 42).

Tabla 37. GENOTIPO FUT2 SEGÚN EDAD GESTACIONAL


(sese)

Madres secretoras

(SeSe / Sese) Chi cuadrado*


A término 5 7,9% 58 92,1% 0,155

Pretérmino 10 20,8% 38 79,2%

** Para cada grupo de edad gestacional; * Nº de casillas con valor esperado < 5 es de 0.

Tabla 38. GRUPOS SANGUÍNEOS DE LAS MADRES SEGÚN GENOTIPO FUT2


(sese)

Madres secretoras

(SeSe / Sese)

Chi

cuadrado*


Grupo A 7 13,7% 44 86,3% 0,473

Grupo O 4 9,1% 40 90,9%

Grupo B 3 27,3% 8 72,7%

Grupo AB 1 50% 1 50%

Desconocido - - 3 100%

** Para cada grupo sanguíneo; * Nº de casillas con valor esperado < 5 es de 0.

2.3. ANTÍGENOS LEWIS

Los resultados de la determinación de los antígenos Lewis se muestran a continuación:

Los datos se presentan agrupados como parejas (Le a/b y Le x/y) atendiendo a la relación

existente en las vías de síntesis de los mismos (según se expuso en el apartado 3.9.1 de

Introducción).

_____________________________________________________________________________

133

En la siguiente tabla (tabla 39) se muestran todas las opciones posibles y el nº de mujeres

integrantes de cada una de estas posibilidades.

Tabla 39. ANTÍGENOS LEWIS DE LAS MADRES

Le x+ y

+ Le x

+ y

- Le x

– y

– Le x

– y

+

Le a+ b

+ 12 (10,8%) 6 (5,4%) 7 (6,3%) 24 (21,6%)

Le a+ b

– 11 (9,9%) 9 (8,1%) 4 (3,6%) 3 (2,7%)

Le a– b

– 4 (3,6%) 0 0 5 (4,5%)

Le a- b

+ 10 (9%) 0 3 (2,7%) 13 (11,8%)

Los antígenos Lewis más frecuentes fueron las combinaciones de Lewis a+

b+ y Lewis x

-

y+ (21,6%), seguidas por Lewis a

- b

+ y Lewis x

- y

+ (11,7%) y Lewis a

+ b

+ y Lewis x

+ y

+ (10,8%),

como se muestra en la figura 36.

A continuación se muestran dos tablas que recogen: el número de casos de los diferentes

antígenos Lewis según su origen geográfico, edad gestacional y grupos sanguíneos maternos

(tabla 40). Los antígenos Lewis más frecuentes en las mujeres españolas estudiadas fueron

Lewis a+ b

+ y Lewis x

- y

+ (25,8%), seguidas por Lewis a

+ b

- y Lewis x

- y

+ (12,9%), a diferencia

0

5

10

15

20

25

a+b+x+y+

a+b+x+y-

a+b+x-y-

a+b+x-y+

a+b-x+y+

a+b-x+y-

a+b-x-y-

a+b-x-y+

a-b-x+y+

a-b-x-y+

a-b+x+y+

a-b+x-y-

a-b+x-y+

Figura 36. Antígenos Lewis.

_____________________________________________________________________________

134

del grupo de madres de origen latinoamericano en las que los antígenos Lewis a+b

+ y Lewis x

+y

+

coincidieron con los Lewis a-b

+ y Lewis x

+y

+ en la frecuencia de casos: 22,7%. En relación a la

edad gestacional, en el grupo de RNPT destacaron los Lewis a+b

+ y Lewis x

-y

+ con un 30,8% de

los casos. En los RNAT fueron los Lewis a+b

+ y Lewis x

+y

+, junto con los Lewis a

+b

+ y Lewis x

-

y+ los más frecuentes con un 16,7% de casos cada uno. Para cada uno de los grupos sanguíneos

los antígenos Lewis más frecuentes fueron muy variables, no apreciándose un predominio claro

salvo en el grupo sanguíneo A donde los Lewis a+b

+ y Lewis x

- y

- supusieron el 14,9% de los

casos.

Tabla 40. ANTÍGENOS LEWIS MATERNO SEGÚN SU ORIGEN GEOGRÁFICO,

GRUPO DE EDAD GESTACIONAL Y SANGUÍNEO

Origen geográfico (N)

Edad

gestacional (N) Grupos sanguíneos (N)

1 2 3 4 5 RNPT RNAT A O B AB

a+ b+

x+y+ 6 5 0 0 1 4 8 6 5 1 0

x+ y– 4 1 0 1 0 5 1 2 3 1 0

x– y– 5 1 0 1 0 6 1 4 2 0 0

x- y+ 16 3 3 2 0 16 8 13 8 2 0

a+ b-

x+y+ 7 3 1 0 0 6 5 5 3 2 0

x+ y– 8 0 1 0 0 3 6 4 2 2 1

x– y– 1 1 2 0 0 1 3 3 1 0 0

x- y+ 2 0 1 0 0 1 2 1 2 0 0

a– b–

x+y+ 3 1 0 0 0 3 1 4 0 0 0

x+ y– 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

x– y– 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

x- y+ 5 0 0 0 0 2 3 1 2 2 0

a– b+

x+y+ 4 5 1 0 0 5 5 4 6 0 0

x+ y– 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

x– y– 1 1 1 0 0 1 2 0 2 1 0

x- y+ 0 1 1 1 0 10 3 4 8 0 1

1: España; 2: Latinoamérica; 3: Europa del Este; 4: Marruecos; 5: China.

RNAT: recién nacido a término; RNPT: recién nacido pretérmino.

_____________________________________________________________________________

135

Dado que muchas de las opciones mostraron un valor esperado < 5 no fue posible aplicar

una prueba de Chi cuadrado para buscar diferencias en la proporción de antígenos Lewis para

cada uno de los subgrupos de cada variable. Por tanto, se aplicó un estudio de regresión

logística que permitió analizar el origen geográfico y la edad gestacional al tratarse de variables

dicotómicas (madres españolas y latinoamericanas; pretérmino y a término). Sin embargo, no

fue posible su aplicación al estudio de los grupos sanguíneos puesto que ninguno de ellos se

podía excluir para convertir la variable en dicotómica. Los antígenos Lewis se analizaron

individualmente (por ej: Lewis a+/a

-, b

+/b

-, etc.). No se hallaron diferencias en la proporción de

antígenos Lewis en función de su origen geográfico ni grupo de edad gestacional, salvo en el

caso del antígeno Lewis x que sí presenta diferencias en función del origen geográfico materno

para p-valor de 0,05 (tabla 41). La prueba de Chi cuadrado confirmó tal diferencia.

Tabla 41. ANÁLISIS ANTÍGENOS LEWIS SEGÚN EL ORIGEN GEOGRÁFICO

MATERNO Y EDAD GESTACIONAL (estudio de regresión logística)

ORIGEN GEOGRÁFICO EDAD GESTACIONAL

España

(N)

Latinoamérica

(N)

p-valor RNPT

(N)

RNAT

(N)

p-valor

Resultado Ag Lewis Resultado Ag Lewis

+ - + - + - + -

Lewis a 14 8 8 3 0,73 34 14 42 21 0,81

Lewis b 17 5 6 5 0,11 28 20 47 16 0,07

Lewis x 15 7 3 8 0,03 26 22 26 37 0,37

Lewis y 18 4 7 4 0,88 35 13 47 16 0,86

En la tabla 42 se muestra la proporción de los antígenos Lewis según el genotipo FUT2.

Se observa que la gran mayoría de las madres secretoras son Lewis b+

(78,1% de los casos) y la

totalidad de las madres no secretoras fueron Lewis b- . Lo que es esperable debido a que el gen

FUT2 se considera imprescindible para la síntesis del antígeno Lewis b, por lo que no se aplicó

ninguna prueba estadística para su valoración. Además las madres no secretoras fueron todas

Lewis a+.

La aplicación de la prueba de regresión logística al estudio de la proporción de los

diferentes antígenos Lewis en madres secretoras y no secretoras mostró diferencias en el Lewis

x, lo que confirmó la prueba de Chi cuadrado (p-valor = 0). Los resultados se muestran en la

tabla 43.

_____________________________________________________________________________

136

Tabla 42. ANTÍGENOS LEWIS DE LAS MADRES SEGÚN SU GENOTIPO FUT2

Madres no secretoras (sese) Madres secretoras (SeSe / Sese)

N Porcentaje* N Porcentaje**

a+ b+

x+y+ 0 - 12 12,5 %

x+ y– 0 - 6 6,3%

x– y– 0 - 7 7,3%

x- y+ 0 - 24 25%

a+ b-

x+y+ 8 53,3% 3 3,1%

x+ y– 6 40% 3 3,1%

x– y– 0 - 4 4,2%

x- y+ 1 6,7% 2 2,1%

a– b–

x+y+ 0 - 4 4,2%

x+ y– 0 - 0 -

x– y– 0 - 0 -

x- y+ 0 - 5 5,2%

a– b+

x+y+ 0 - 10 10,4%

x+ y– 0 - 0 -

x– y– 0 - 3 3,1%

x- y+ 0 - 13 13,5%

* Porcentaje del grupo de madres no secretoras; ** Porcentaje del grupo de madres secretoras.

Tabla 43. ANTÍGENOS LEWIS SEGÚN EL GENOTIPO FUT2 MATERNO

(estudio de regresión logística)

GENOTIPO FUT2

No secretoras (N) Secretoras (N) p-valor

Resultado Ag Lewis

+ - + -

Lewis a 15 0 61 35 0,1

Lewis b 0 15 75 21 *

Lewis x 14 1 38 58 0,04

Lewis y 9 6 73 23 0,26

* No aplicable.

_____________________________________________________________________________

137

3. ANÁLISIS REALIZADOS EN LECHE MATERNA

Se analizaron con carácter longitudinal muestras de leche materna procedentes de 111

madres, evaluadas en los 3 periodos de secreción: calostro, leche de transición y leche madura.

Se recogieron un total de 287 muestras de leche materna: 106 muestras de calostro, 98 muestras

de leche de transición y 83 muestras de leche madura.

En cada una de las muestras se cuantificó la actividad bloqueante sobre la unión de VLPs

de NoV GII.4 a saliva de individuo no secretor (sese) y secretor homocigoto (SeSe) y el título

de anticuerpos específicos tipo IgA anti-NoV GII.4. Los resultados pormenorizados se exponen

en los siguientes epígrafes.

Para facilitar el seguimiento de los resultados en la figura 37 se muestra un algoritmo con

el diseño del estudio y el nº de muestras empleadas en cada ensayo. Para la realización de los

ensayos de bloqueo se utilizaron muestras de las 3 etapas madurativas, diseñándose ensayos

frente a saliva de individuo no secretor (sese) y secretor homocigoto (SeSe). El análisis de Ac

anti-NoV tipo IgA en leche materna se realizó en muestras de leche madura y, en caso de no

disponerse de dicha muestra, en leche de transición.

Figura 37. Algoritmo de los análisis realizados en leche materna y nº de muestras empleadas.

_____________________________________________________________________________

138

3.1. ACTIVIDAD BLOQUEANTE DE MUESTRAS DE LECHE MATERNA SOBRE LA

UNIÓN DE VLPS DE NOROVIRUS GII.4 A SALIVA

Los ensayos de bloqueo de la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva se realizaron

mediante técnica de ELISA. A partir de ellos se calculó el porcentaje de inhibición de cada

muestra, según se describe en el apartado 5.3 de Material y métodos.

Se estableció un valor de porcentaje de inhibición (PI) del 60% para delimitar si las

muestras de leche materna presentaban capacidad bloqueante (PI > 60%) o no (PI < 60%),

según referencias de Ward et al., 1990 y Coulson et al., 1990.

En el análisis de los resultados se diferenciaron los ensayos de bloqueo de la unión de

VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo no secretor (sese) y de secretor homocigoto (SeSe). A

su vez se subdividieron según la etapa madurativa.

Los resultados obtenidos fueron los siguientes:

3.1.1. Ensayos de bloqueo de la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo no

secretor (sese)

Los resultados de los ensayos realizados en muestras de calostro, leche de transición y

madura sin diluir y diluídas 1/100 fueron los siguientes:

De las 106 muestras de calostro analizadas, 103 muestras sin diluir (97,1% del total) y

102 muestras diluídas 1/100 (96,2% del total) mostraron un PI superior al 60%.

Analizamos 98 muestras de leche de transición, de las cuales, 94 muestras sin diluir (96%

del total) y 96 diluídas 1/100 (98% del total) mostraron un PI superior al 60%.

En relación con las muestras de leche madura, de las 83 muestras evaluadas, 82 sin diluir

(98,7% del total) y 81 de leche diluída 1/100 (97,6% del total) mostraron capacidad inhibitoria.

Así pues, se observó que prácticamente la totalidad de las muestras de leche materna eran

capaces de inhibir la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo no secretor (sese), lo

que se muestra en la tabla 44.

_____________________________________________________________________________

139

Tabla 44. ACTIVIDAD BLOQUEANTE DE MUESTRAS DE LECHE MATERNA SOBRE

LA UNIÓN DE VLPs DE NoV GII.4 A SALIVA DE INDIVIDUO NO SECRETOR (sese)

Etapa Dilución N Muestras

que inhiben

Media PI

(DT) %

Mediana

(I. Q.: P25 – P75)

Mínimo -

máximo

Calostro

Sin

diluir 106

103 (97,2%) 97 (12,4) 100 (100 – 100) 55 - 100

1/100 102 (96,2%) 96,2 (14) 100 (100 – 100) 0 - 100

Leche de

transición

Sin

diluir 98

94 (95,9%) 96 (14,2) 100 (100 – 100) 0 - 100

1/100 96 (98%) 97,7 (11,2) 100 (100 – 100) 5 - 100

Leche

madura

Sin

diluir 83

82 (98,8%) 98,1 (10,1) 100 (100 – 100) 19 - 100

1/100 81 (97,6%) 97,4 (12,7) 100 (100 – 100) 0 - 100

PI: porcentaje de inhibición; DT: desviación típica; I. Q.: intervalo intercuartílico.

3.1.2. Ensayos de bloqueo de la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo secretor

homocigoto (SeSe)

Estos ensayos se realizaron con muestras de calostro, leche de transición y madura

exclusivamente sin diluir. La necesidad de limitar los ensayos en este sentido partió del progresivo

agotamiento de las muestras y llevó a plantear una prueba W de Wilcoxon que no halló diferencias

estadísticamente significativas entre los PI de leche sin diluir y leche diluída 1/100 en los ensayos

de bloqueo de LM frente a saliva de no secretor, por lo que esto no supuso un menoscabo para el

estudio.

Tabla 45. ANÁLISIS DE DIFERENCIAS DE PI DE MUESTRAS DE LECHE MATERNA

SOBRE LA UNIÓN DE VLPs DE NOVs GII.4 A SALIVA DE INDIVIDUO NO SECRETOR

SEGÚN LA CONCENTRACIÓN (W de Wilcoxon)

COMPARACIÓN N MEDIANA E I. Q. DE LA

DIFERENCIA DE LOS DATOS p-VALOR

C sin diluir – C diluído 1/100 106 0 (0-0) 0,72

LT sin diluir – LT diluída 1/100 98 0 (0-0) 0,26

L Mad sin diluir – L Mad diluída 1/100 81 0 (0-0) 0,72

C: calostro; LT: leche de transición; L Mad: leche madura.

_____________________________________________________________________________

140

De las 99 muestras de calostro analizadas, 91 mostraron un PI superior al 60% (91,9% del

total de muestras). En el caso de las muestras de leche de transición, de las 98 disponibles 74

mostraron un PI superior al 60% (75,5% del total de muestras). En cambio, sólo 21 de las 83

muestras disponibles de leche madura (25,3% del total) lo mostraron. Los resultados se

muestran en la siguiente tabla (tabla 46).

Tabla 46. ACTIVIDAD BLOQUEANTE DE MUESTRAS DE LECHE MATERNA SOBRE

LA UNIÓN DE VLPS DE NOV GII.4 A SALIVA DE INDIVIDUO SECRETOR HOMOCIGOTO

(SeSe)

Etapa N

Muestras que

inhiben

(PI > 60%)

Media PI (DT),

%

Mediana PI

(I. Q.: P25, P75)

Mínimo -

máximo

Calostro 99 91 (91,9%) 78,3 (20) 100 (100 – 100) 0-100

Leche de

transición 98 74 (75,5%) 75,3 (28) 86,2 (60,9 – 95,3) 0-100

Leche

madura 83 21 (25,3%) 43,7 (26) 41,1 (27,4 – 41,1) 0-100

3.1.3. Análisis estadístico de los resultados de porcentaje de inhibición (PI) de muestras de

leche humana sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva según las características de las

madres participantes

Se aplicó una prueba de Shapiro-Wilks para conocer si las variables cuantitativas continuas

del estudio seguían una distribución normal. Dado que el p-valor obtenido fue menor a 0,05 en la

comparación de todas las variables, se interpretó que su distribución se alejaba de la normalidad

por lo que se seleccionaron pruebas no paramétricas para responder a las cuestiones estadísticas

planteadas.

3.1.3.1. Diferencias del PI según la edad materna en el momento del parto

Para analizar estadísticamente si los PI de las muestras de leche materna sobre la unión de

las VLPs de NoV GII.4 a saliva variaban según la edad materna en el momento del parto se aplicó

una prueba de correlación de Pearson. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 47.

No podemos afirmar que exista una correlación directa o inversa entre el porcentaje de

inhibición de la leche materna frente a la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo no

secretor o secretor homocigoto y la edad materna en el momento del parto.

_____________________________________________________________________________

141

Tabla 47. COMPARACIÓN PI DE MUESTRAS DE LECHE MATERNA

SOBRE LA UNIÓN DE VLPs DE NoV A SALIVA EN FUNCIÓN DE LA EDAD

MATERNA EN EL MOMENTO DEL PARTO (prueba de correlación de Pearson)

TIPO DE

ENSAYO MUESTRA N

CORRELACIÓN

DE PEARSON p-VALOR

Saliva de no

secretor

Calostro 104 -0,081 0,415

Leche de transición 96 0,100 0,333

Leche madura 83 - 0,105 0,346

Saliva de

secretor

homocigoto

Calostro 97 - 0,181 0,076

Leche de transición 96 0,020 0,850

Leche madura 83 0,130 0,242

3.1.3.2. Diferencias en el PI según la edad gestacional

Para la comparación de los PI de las muestras de leche materna sobre la unión de VLPs de

NoV GII.4 a saliva según la edad gestacional se diferenciaron dos grupos: pretérmino y a término.

El escaso número de datos incluídos en los 3 subgrupos de RN pretérmino impidió establecer

comparaciones atendiendo al grado de prematuridad por lo que se analizaron juntos.

La prueba de Kruskal-Wallis no mostró diferencias estadísticamente significativas en el PI

de muestras de leche materna frente a la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo no

secretor ni secretor homocigoto en función de la duración de la gestación (tabla 48).

Tabla 48. COMPARACIÓN PI DE MUESTRAS DE LM SOBRE LA UNIÓN DE VLPs DE NoV

A SALIVA EN FUNCIÓN DE LA EDAD GESTACIONAL (prueba de Kruskal-Wallis)

TIPO DE

ENSAYO ETAPA N Mediana (I. Q.: P25-P75)

p-VALOR RNPT RNT RNPT RNT

Saliva de no

secretor

C 45 61 100 (100-100) 100 (100-100) 0,65

LT 42 56 100 (100-100) 100 (100-100) 0,34

L Mad 36 47 100 (100-100) 100 (100-100) 0,61

Saliva de

secretor

homocigoto

C 40 59 84,2 (76,9-92,8) 83,8 (71,5-91,4) 0,59

LT 42 56 83,9 (63-95,3) 86,3 (51,5-96,1) 0,73

L Mad 35 48 45,4 (30,5-59) 38,5 (26,8-73,3) 0,57


_____________________________________________________________________________

142

3.1.3.3. Diferencias en el PI según el origen geográfico materno

De igual modo se aplicó la prueba de Kruskal- Wallis para establecer si existían diferencias

en el PI de LM frente a la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva según el origen geográfico

materno. No se incluye a China en el análisis puesto que está integrado exclusivamente por una

madre.

Los resultados obtenidos se muestran en la siguiente tabla (tabla 49). No se aprecian

diferencias estadísticamente significativas en el PI de muestras de leche materna sobre la unión de

NoV GII.4 a saliva de individuo no secretor y secretor homocigoto según su origen geográfico.

Tabla 49. COMPARACIÓN PI DE MUESTRAS DE LECHE MATERNA SIN DILUIR SOBRE

LA UNIÓN DE VLPs DE NoV A SALIVA EN FUNCIÓN DEL ORIGEN GEOGRÁFICO

MATERNO (prueba de Kruskal-Wallis)

TIPO DE

ENSAYO ETAPA

N MEDIANA (I. Q.: P25-P75)

p-VALOR

1 2 3 4 1 2 3 4

Saliva de

no secretor

C 11 21 68 5

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(100-

100)

0,408

LT 9 19 64 5

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(74,5-

100)

0,184

L Mad 8 12 57 5

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(100-

100)

0,408

Saliva de

secretor

homocigoto

C 9 18 66 5

79,2

(60,1-

84,4)

79,8

(66,9-

89,1)

85,6

(76-

93,5)

82,9

(81,2-

91,8)

0,206

LT 9 19 64 5

79,8

(42,1-

97,4)

76,5

(50,2-

87,2)

88,7

(66-

97,4)

82,3

(52-

97,4)

0,309

L Mad 8 12 57 5

59,7

(39-

76,3)

33,4

(22,6-

51,3)

41,1-

(25,6-

63,5)

41,5

(34,4-

70)

0,390

1: Europa del E; 2: Latinoamérica; 3: España; 4: Marruecos.

3.1.3.4. Diferencias en el PI según el grupo sanguíneo materno

La aplicación de la prueba de Kruskal-Wallis para buscar diferencias en el PI de muestras de

leche materna frente a la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva según el grupo sanguíneo materno

_____________________________________________________________________________

143

no mostró diferencias significativas (tabla 50). No se incluyó en las comparaciones a las madres

con grupo sanguíneo AB dado que sólo eran 2 madres y no se consideró que pudieran inferirse

conclusiones a partir del análisis estadístico planteado en una muestra tan pequeña.

Tabla 50. COMPARACIÓN PI DE LECHE MATERNA SOBRE LA UNIÓN DE VLPS DE NoV

GII.4 A SALIVA EN FUNCIÓN DEL GRUPO SANGUÍNEO MATERNO (Kruskal-Wallis)

TIPO DE

ENSAYO MUESTRA

N MEDIANA (I. Q.: P25-P75) p-VALOR

A O B AB A O B AB

Saliva de no

secretor

C sin diluir 47 43 11 2

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(100-

100)

0,472

LT 46 37 10 2

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(100-

100)

0,826

L Mad 42 29 8 2

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(100-

100)

100

(100-

100)

0,408

Saliva de

secretor

homocigoto

C 46 40 8 2

85,7

(70,1-

90)

83,8

(72,2-

91,6)

79,5

(71,6-

89,1)

79,2

(86,3-

86,3)

0,879

LT 46 37 10 2

89,1

(75-99)

83,2

(49,2-

93,6)

70,6

(61,7-

95,9)

36,7

(0-

36,7)

0,202

L Mad 42 30 7 2

42

(26,1-

61)

42,3

(30,1-

74,6)

30,4

(24,1-

74)

34,4

(36,4-

36,4)

0,893


3.1.3.5. Diferencias en el PI según el genotipo FUT2 materno

Los datos de PI de muestras de leche materna frente a la unión de VLPs de NoV GII.4 a

saliva de individuo no secretor y secretor homocigoto según el genotipo FUT2 materno se muestran

en la tabla 51. Se expresan como nº de datos, media y desviación típica, mediana e intervalo

intercuartílico para cada etapa madurativa y tipo de saliva empleada en el ensayo en función del

genotipo FUT2 materno. Se incorpora una columna de datos donde se especifica el nº de casos con

un resultado de porcentaje de inhibición inferior al 60%, valor establecido para diferenciar las

muestras con capacidad de inhibición (PI > 60%) de aquellas que carecen de dicha capacidad (PI <

60%).

_____________________________________________________________________________

144

Tabla 51. PI DE MUESTRAS DE LECHE MATERNA SOBRE LA UNIÓN

DE VLPS DE NoV GII.4 A SALIVA SEGÚN EL GENOTIPO FUT2 MATERNO

TIPO DE

ENSAYO ET

AP

A

MADRES NO SECRETORAS

(sese)

MADRES SECRETORAS

(Sese / SeSe)

N Media /

desviación

típica

(mínimo –

máximo)

Mediana

(P25-P75)

N

PI< 60

N Media /

desviación

típica

(mínimo –

máximo)

Mediana

(P25-P75)

N

PI< 60

Saliva de no

secretor

C 13 92,3 / 27,7

(0-100)

100

(100-100) 1 93

97,7 / 8,5

(55,4-100)

100

(100-100) 2

LT 13 99,7 / 1

(96,2-100)

100

(100-100) 0 85

95,4 / 14,8

(0-100)

100

(100-100) 4

L

Mad 12

100 / 0

(100-100)

100

(100-100) 0 71

97,8 / 10,9

(5,9-100)

100

(100-100) 1

Saliva de

secretor

homocigoto

C 13 79,6 / 25,2

(0-95,3)

88,0

(75,8-92) 2 86

78,1 / 19,8

(0-100)

83,5

(71,9-91,5) 9

LT 13 74,8 / 28,8

(0-98,8)

86,7

(65,2-95,3) 1 85

75,3 / 28,0

(0-100)

86,2

(57-95,8) 18

L

Mad 12

46,2 / 23,8

(5,4- 92,7)

45

(29,1-63,5) 8 71

43,3 / 26,7

(0-100)

38,8

(26,6-60,2) 52

N PI<60: nº de muestras con porcentaje de inhibición < 60.

Para analizar las diferencias en función del genotipo FUT2 materno se aplicó una prueba de

Mann-Whitney, los resultados se muestran en la tabla 52. En ella se observa que no existían

diferencias estadísticamente significativas entre los PI de muestras de leche materna sobre la unión

de VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo no secretor o secretor homocigoto en función del

genotipo FUT2 materno.

_____________________________________________________________________________

145

Tabla 52. COMPARACIÓN PI DE LECHE MATERNA SOBRE LA UNIÓN DE VLPS

DE NoV GII.4 A SALIVA EN FUNCIÓN DEL GENOTIPO FUT2 MATERNO

(prueba de Mann-Whitney)

TIPO DE ENSAYO MUESTRA

N MEDIANA

(I. Q.: P25-P75) p-VALOR

Madres no

secretoras

Madres

secretoras

Madres no

secretoras

Madres

secretoras

SALIVA DE NO

SECRETOR

Calostro

sin diluir 13 93

100

(100-100)

100

(100-100) 0,887

Leche de

transición

sin diluir

13 85 100

(100-100)

100

(100-100) 0,461

Leche

madura

sin diluir

12 71 100

(100-100)

100

(100-100) 0,299

SALIVA DE

SECRETOR

HOMOCIGOTO

Calostro 13 86 88

(75,8-92)

83,5

(71,9-91,5) 0,459

Leche de

transición 13 85

86,7

(65,1-95,3)

86,2

(57-95,8) 0,797

Leche

madura 12 71

45

(29,1-63,5)

38,8

(26,6-60,2) 0,736

3.1.3.6. Diferencias en el PI según los antígenos Lewis maternos

Los datos relativos al PI de muestras de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4

a saliva de no secretor y secretor en función de los antígenos Lewis se muestran en la siguiente

tabla (tabla 53). Para conocer si existen diferencias se aplicó una prueba de Kruskall-Walis.

No se apreciaron diferencias estadísticamente significativas del PI de muestras de leche

materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo no secretor o secretor

homocigoto en función de los antígenos Lewis.

_____________________________________________________________________________

146

Tabla 53. DESCRIPCIÓN Y COMPARACIÓN PI DE MUESTRAS DE LM SOBRE LA UNIÓN

DE VLPs DE NoV GII.4 A SALIVA SEGÚN LOS ANTÍGENOS LEWIS (Kruskal-Wallis)

ANTÍGENOS

LEWIS

SALIVA DE NO SECRETOR

N: mediana (I. Q.)

SALIVA DE SECRETOR HOMOCIGOTO

N, mediana (I. Q.)

C LT L Mad C LT L Mad

a+ b+

x+y+ 12: 100

(100-100)

12: 100

(100-100)

10: 100

(98,6-100)

10: 85,2

(75,7-94,4)

12: 83,9

(65,4-89,7)

10: 37,9

(30,4-47,7)

x+ y– 6: 100

(100-100)

3: 55,9

(100-100)

4: 100

(100-100)

6: 49,8

(39,5-74,6)

3: 86,4

(100-100)

4: 39,8

(18,2-51)

x– y– 7: 100

(100-100)

7: 100

(100-100)

7: 100

(100-100)

7: 87,6

(82,9-93,7)

7: 94,7

(89,3-106,3)

7: 35,5

(24,6-69,7)

x- y+ 24: 100

(100-100)

22: 100

(98,3-100)

19: 100

(100-100)

22: 81,1

(68,9-91,1)

22: 79,2

(37-95,7)

19: 42,8

(22,1-81,8)

a+ b-

x+y+ 9: 100

(100-100)

8: 100

(100-100)

6: 100

(100-100)

9: 86,7

(71,7-94,6)

8: 67,1

(8,9-91,5)

6: 47,9

(19,5-67,4)

x+ y– 8: 100

(100-100)

9: 100

(100-100)

8: 100

(100-100)

9: 89,1

(79,1-92)

9: 77,8

(46,4-95,3)

8: 34,7

(29,1-63)

x– y– 4: 100

(100-100)

4: 100

(76,5-100)

3: 100

(61,3-100)

4: 93,6

(86,1-98,5)

4: 86,6

(80,4-97,4)

3: 35,4

(18,6-35,4)

x- y+ 2: 100

(100-100)

3: 100

(73,5-100)

3: 100

(100-100)

2: 87,7

(85,1-87,7)

3: 88,4

(84,8-88,4)

3: 47,7

(7,9-47,7)

a– b–

x+y+ 3: 100

(100-100)

4: 100

(100-100)

2: 100

(100-100)

3: 86,4

(0-86,4)

4: 92,2

(57,7-99,4)

2: 25,4

(0-25,4)

x+ y– - - - - - -

x– y– - - - - - -

x- y+ 5: 100

(81,7-100)

4: 100

(86,8-100)

4: 100

(83,3-100)

3: 72,8

(53,4-72,8)

4: 71,2

(59,7-81,4)

3: 81,9

(48,4-81,9)

a– b+

x+y+ 10: 100

(100-100)

8: 100

(100-100)

6: 100

(100-100)

10: 80,1

(56,7-87)

8: 89,1

(56,7-87)

6: 33,4

(10,3-77,9)

x+ y– - - - - - -

x– y– 3: 100

(83,2-100)

3: 100

(100-100)

2: 100

(100-100)

2: 93,3

(87,1-93,3)

3: 95,1

(48,1-95,1)

2: 74,9

(74,7-74,9)

x- y+ 3: 100

(83,3-100)

3: 100

(100-100)

2: 100

(100-100)

2: 93,3

(87,1-93,3)

3: 95,1

(48,1-95,1)

2: 74,8

(74,7-74,8)

p-valor 0,924 0,738 0,499 0,055 0,348 0,728

_____________________________________________________________________________

147

Además, se planteó un análisis multivariante mediante un estudio de regresión lineal (con

selección de variables hacia atrás o método de Wald), para buscar posibles influencias de las

covariables genotipo FUT2 y antígenos Lewis maternos en los PI de muestras de leche materna

sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo no secretor y secretor homocigoto, si

bien no se encontró ninguna relación estadísticamente significativa (tabla 54).

Tabla 54. COMPARACIÓN GENOTIPO FUT2 Y ANTÍGENOS LEWIS MATERNOS

CON PI DE MUESTRAS DE LECHE MATERNA SOBRE LA UNIÓN DE VLPs DE

NoV GII.4 A SALIVA DE NO SECRETOR Y SECRETOR HOMOCIGOTO

(estudio de regresión logística)

TIPO DE ENSAYO ETAPA FUT2(p-valor)

Le a (p-valor)

Le b (p-valor)

Le x (p-valor)

Le y (p-valor)

Saliva de no

secretor

Calostro 0,15 0,98 0,65 0,59 0,22

Leche de transición 0,31 0,65 0,85 0,54 0,89

Leche madura 0,47 0,40 0,58 0,26 0,73

Saliva de secretor

Calostro 0,81 0,19 0,41 0,12 0,64

Leche de transición 0,47 0,16 0,24 0,64 0,10

Leche madura 0,35 0,51 0,97 0,21 0,88

3.1.3.7. Diferencias según la etapa madurativa de la leche materna

Para valorar diferencias en el PI de las muestras de leche materna frente a la unión de VLPs

de NoV GII.4 a saliva de individuo no secretor y secretor homocigoto según la etapa madurativa

de la leche se aplicó una prueba de Friedman. Los resultados se muestran en la tabla 55.

Mostraron la existencia de diferencias estadísticamente significativas en los valores de PI de

calostro, leche de transición y madura en los ensayos realizados con saliva de individuo secretor;

no así en los ensayos realizados con saliva de no secretor.

Por este motivo se realizó una prueba W de Wilcoxon para encontrar cuáles eran las

muestras de leche responsables de dichas diferencias, lo que se muestra en la tabla 56. Para

interpretar los resultados obtenidos aplicamos previamente la corrección de Bonferroni

obteniendo un resultado de 0,017, debido a que se realizaron 3 comparaciones. Se encontraron

diferencias estadísticamente significativas entre la leche madura y las otras etapas de la leche

materna: calostro y leche de transición.

_____________________________________________________________________________

148

Tabla 55. COMPARACIÓN PI LECHE MATERNA SOBRE LA UNIÓN DE VLPs de

NoV GII.4 A SALIVA SEGÚN LA ETAPA MADURATIVA DE LA LECHE (Friedman)

TIPO DE ENSAYO MUESTRA N MEDIANA (I. Q.) p-VALOR

Saliva de no

secretor

Calostro sin diluir 106 100 (100-100)

0,53 Leche de transición sin diluir 98 100 (100-100)

Leche madura sin diluir 83 100 (100-100)

Saliva de secretor

homocigoto

Calostro 99 83,8 (72,1-91,7)

0,000 Leche de transición 98 86,2 (61-95,3)

Leche madura 83 41,1 (27,4-60,2)

Tabla 56. COMPARACIÓN PI LECHE MATERNA SOBRE LA UNIÓN DE VLPS DE NOV

GII.4 A SALIVA DE SECRETOR SEGÚN LA ETAPA MADURATIVA DE LA LECHE

(prueba W de Wilcoxon)

COMPARACIÓN N MEDIANA (I. Q.) p-VALOR

Calostro-leche de transición 99-98 83,8 (72,1-91,7) - 86,2 (61-95,3) 0,283

Leche de transición-madura 98-83 86,2 (61-95,3) - 41,1 (27,4-60,2) 0,000

Calostro-leche madura 99-83 83,8 (72,1-91,7) - 41,1 (27,4-60,2) 0,000

3.1.3.8. Diferencias en el PI según el tipo de saliva empleada

Para conocer si existían diferencias entre los PI de muestras de leche materna sobre la unión

de VLPs de NoV GII.4 a saliva según esta fuera de individuo no secretor o secretor homocigoto, se

aplicó una prueba de Friedman. Los resultados se muestran en la tabla 57. Se aprecian diferencias

estadísticamente significativas en el PI de muestras de leche materna sobre la unión de VLPs de

NoV GII.4 a saliva según si esta procedía de un individuo no secretor o secretor homocigoto.

Por este motivo se aplicó la W de Wilcoxon para realizar comparaciones dos a dos que nos

permitieran conocer las parejas responsables de estas diferencias. Los resultados obtenidos se

muestran en la tabla 58. Para la interpretación de los resultados ha de considerarse que el punto de

corte del p-valor precisa la corrección de Bonferroni, por lo que es el resultado del cociente entre

0,05 y el nº de comparaciones realizadas. En este caso se realizaron 3 comparaciones lo que

implica que el p-valor para considerar que existen diferencias estadísiticamente significativas es de

0,017. Hallamos diferencias estadísticamente significativas para todas las etapas madurativas de la

LM al comparar los PI en ensayos realizados con saliva de no secretor y secretor homocigoto,

independientemente del genotipo secretor de la madre.

_____________________________________________________________________________

149

Tabla 57. COMPARACIÓN PI DE MUESTRAS DE LECHE MATERNA SOBRE LA

UNIÓN DE VLPs DE NoV GII.4 A SALIVA SEGÚN EL TIPO DE SALIVA EMPLEADA

(prueba de Friedman)

SALIVA DE NO

SECRETOR

SALIVA DE SECRETOR

HOMOCIGOTO

p-VALOR*

N Mediana

(I. Q.) N

Mediana

(I. Q.)

C

Madres no

secretoras 13 100 (100-100) 13 88 (75,8-92)

0,000 Madres

secretoras 93 100 (100-100) 86 83,5 (71,9-91,5)

LT

Madres no

secretoras 13 100 (100-100) 13 86,7 (65,1-95,3)

0,000 Madres

secretoras 85 100 (100-100) 85 86,2 (57-95,8)

L

mad

Madres no

secretoras 12 100 (100-100) 12 45 (29,1-63,5)

0,000 Madres

secretoras 71 100 (100-100) 71 38,8 (26,6-60,2)


Tabla 58. COMPARACIÓN PI DE LECHE MATERNA SOBRE LA UNIÓN DE VLPs DE NoV

GII.4 A SALIVA SEGÚN EL TIPO DE SALIVA EMPLEADA (W de Wilcoxon)

COMPARACIÓN

MADRES NO

SECRETORAS

(sese)

MADRES

SECRETORAS

(SeSe / Sese)

N p-VALOR* N p-VALOR

*

PI C sin diluir saliva sese - PI C saliva SeSe 12 0,019 78 0,000

PI LT sin diluir saliva sese - PI LT saliva SeSe 12 0,002 65 0,000

PI L Mad saliva sese-PI L Mad saliva SeSe 12 0,002 68 0,000

* Los resultados obtenidos no difieren si no se divide a las madres según su genotipo FUT2.


_____________________________________________________________________________

150

3.2. DETERMINACIÓN DE IgA ANTI

NoV EN LM MADURA/TRANSICIÓN

La cuantificación de IgA en LM se

realizó mediante técnica de ELISA

(apartado 5.4 de Material y métodos) en 83

muestras de leche madura. En caso de

haberse agotado este tipo de muestra y en

aquellas madres que no aportaron leche

madura se empleó la muestra de leche de

transición, por su mayor similitud a la leche

madura que el calostro, con lo que

sumamos un total de 108 muestras.

Consideramos resultado negativo un título de IgA anti-NoV en leche materna inferior a

1/50, de forma que de las 108 muestras de leche materna analizadas, 81 (75%) contenían títulos

significativos de IgA anti-NoV. Los resultados obtenidos se detallan en la figura 38 y tabla 59.

Tabla 59. TÍTULOS DE IgA ANTI-NoV EN LECHE MADURA/DE TRANSICIÓN

TÍTULOS N PORCENTAJE (%)

< 1/50 27 25

1/50 0 0

1/100 41 38

1/500 16 14,8

1/1000 24 22,2

1/5000 0 0

3.2.1. Descripción y análisis estadístico del PI de leche materna sobre la unión de VLPs de

NoV GII.4 en función del título de IgA anti-NoV láctea

En la siguiente tabla (tabla 60) se muestran los datos de mediana e intervalo intercuartílico

del PI de LM sobre la unión de VLPs NoV GII.4 a saliva de no secretor y secretor homocigoto en

función del título de IgA anti-NoV en leche madura o de transición.

Se incluyen los resultados de la prueba de Kruskall-Walis que no hallaron diferencias

estadísticamente significativas en el PI en función del contenido de IgA anti-NoV.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

< 1/50 1/50 1/100 1/500 1/1000 1/5000

Figura 38. Títulos IgA anti-NoV en leche madura/de transición

_____________________________________________________________________________

151

Tabla 60. COMPARACIÓN DE PI DE LM SOBRE LA UNIÓN DE VLPs DE NoV GII.4 A

SALIVA EN FUNCIÓN DEL TÍTULO DE IgA ANTI-NoV EN LECHE MADURA/DE

TRANSICIÓN (prueba de Kruskal-Wallis)

< 1/50 1/100 1/500 1/1000

p-V

AL

OR

N Mediana

(I. Q.)

N Mediana

(I. Q.)

N Mediana

(I. Q.)

N Mediana

(I. Q.)

Ensayos

con saliva

de no

secretor

C 26 100

(100-100) 40

100

(100-100) 14

100

(100-100) 22

100

(100-100) 0,377

LT 25 100

(100-100) 38

100

(100-100) 13

100

(100-100) 20

100

(100-100) 0,696

L

Mad

23 100

(100-100) 29

100

(100-100) 12

100

(100-100) 17

100

(100-100) 0,172

Ensayos

con saliva

de

secretor

C 26 85,4

(72-94) 37

83,1

(74,8-90,1) 13

72,1

(64,1-91,6) 19

86,9

(77,1-91,7) 0,589

LT 25 88,9

(80,6-99,2) 38

86,8

(59-97,9) 13

79,3

(51,1-92,1) 20

78,1

(38,3-95,2) 0,266

L

Mad

23 41,1

(30,5-75) 29

34,4

(20,4-51,2) 12

57,4

(33-78,8) 16

40,5

(24,6-47,4) 0,136

3.2.2. Descripción y análisis estadístico del origen geográfico, edad gestacional, grupo

sanguíneo, genotipo FUT2 y antígenos Lewis maternos en función del título de IgA anti-NoV

láctea

La prueba de Chi cuadrado no halló diferencias estadísticamente significativas en el

contenido de IgA anti-NoV en función del origen geográfico, la edad gestacional, el grupo

sanguíneo ni el genotipo FUT2 materno (tabla 61).

Para el análisis de los antígenos Lewis se empleó un análisis de regresión logística que

comparó la proporción de antígenos Lewis en las muestras de leche materna en función de si

contenían (título > 1/50) o no (título < 1/50) IgA anti-NoV. Los resultados no mostraron

diferencias significativas (tabla 62).

_____________________________________________________________________________

152

Tabla 61. COMPARACIÓN ORIGEN GEOGRÁFICO, GRUPO DE EDAD GESTACIONAL, GRUPO SANGUÍNEO Y

GENOTIPO FUT2 MATERNOS EN FUNCIÓN DEL TÍTULO DE IgA ANTI-NoV EN L Mad/LT (Chi cuadrado)

TÍTULOS IgA ANTI-

NoV EN Lm/LT < 1/50 1/100 1/500 1/1000 Chi cuadrado

ORIGEN GEOGRÁFICO**

Europa del Este 2 (18,2%) 5 (45,4%) 3 (27,3%) 1 (9,1%)

Latinoamérica 4 (18,2%) 11(50%) 5 (22,7%) 2 (9,1%) 0,242

España 19 (27,5%) 22 (31,9%) 8 (11,6%) 20 (29%)

Marruecos 1 (25%) 3 (75%) 0 0

China 1 (100%) 0 0 0

EDAD GESTACIONAL**

RN a término 15 (25%) 23 (38,3%) 7 (11,7%) 15 (25%) 0,175

RN pretérmino 12 (25,5%) 18 (38,3%) 9 (19,1%) 8 (17,1%)

GRUPO SANGUÍNEO**

Grupo A 12 (23,5%) 19 (37,3%) 8 (15,7%) 12 (23,5%) 0,924

Grupo O 13 (31%) 16 (38,1%) 6 (14,3%) 7 (16,6%)

Grupo B 2 (20%) 5 (50%) 2 (20%) 1 (10%)

Grupo AB 0 1 (100%) 0 0

GENOTIPO FUT2**

Secretor 25 (26,9%) 36 (38,7%) 13 (14%) 19 (20,4%) 0,655

No secretor 2 (14,3%) 5 (35,7%) 3 (21,4%) 4 (28,6%)

ANTÍGENOS LEWIS

a+ b+

x+y+ 3 0 5 2

*

x- y+ 2 0 3 1

x– y– 1 0 2 1

x+ y– 5 0 10 7

a– b+

x+y+ 1 0 2 3

x- y+ 3 0 4 1

x– y– 3 0 1 0

x+ y– 0 0 0 2

a– b–

x+y+ 0 0 3 1

x- y+ 0 0 0 0

x– y– 0 0 0 0

x+ y– 4 0 0 1

a+ b-

x+y+ 3 0 5 1

x-y+ 0 0 0 0

x– y– 2 0 1 0

x+ y– 0 0 5 3

Nº de casillas con valor esperado < 5 = 0. * No es posible aplicar la prueba de Chi cuadrado.

** Porcentaje para cada grupo.

_____________________________________________________________________________

153

Tabla 62. COMPARACIÓN ANTÍGENOS LEWIS SEGÚN EL CONTENIDO DE IgA EN LM

MADURA/DE TRANSICIÓN (estudio de regresión logística)

IgA en LM (p-valor)

Lewis a 0,415

Lewis b 0,495

Lewis x 0,431

Lewis y 0,07

3.2.3. Estudios de correlación del título de IgA anti-NoV en leche madura/de transición, la

edad materna y PI de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva

Para conocer si existía una correlación entre el título de IgA anti-NoV en leche materna y la

IgA e IgG anti-NoV en suero, la edad materna y el PI de muestras de leche materna sobre la unión

de VLPs de NoV GII.4 a saliva se aplicó un estudio de correlación de Spearman (tabla 63).

Tabla 63. COMPARACIÓN TÍTULOS IgA ANTI-NoV EN LECHE MADURA/DE TRANSICIÓN CON

EDAD MATERNA EN EL MOMENTO DEL PARTO Y PI MUESTRAS LM SOBRE LA UNIÓN DE NoV

GII.4 A MUESTRAS DE SALIVA (prueba de correlación de Spearman)

COMPARACIÓN N Rho DE SPEARMAN p-VALOR

IgA anti-NoV en suero 68 0,427 0,000

IgG anti-NoV en suero 69 0,005 0,967

Edad materna en el parto 105 -0,085 0,390

Ensayos saliva de no

secretor

C sin diluir

102 0,155 0,119

LT sin diluir 96 -0,071 0,494

Lmad sin diluir 81 0,178 0,111

Ensayos saliva de

secretor homocigoto Calostro 95 0,077 0,459

LT 96 -0,197 0,055

Lmad 80 -0,057 0,617


Se aprecia una correlación directa entre la IgA anti-NoV en leche materna y suero. No así

entre la IgA anti-NoV en leche madura/de transición y la IgG anti-NoV en suero, la edad materna

ni el PI de muestras de LM sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva.

_____________________________________________________________________________

154

4. ANÁLISIS REALIZADOS EN SUERO

Se obtuvieron 71 muestras de suero de las 111 madres participantes en el estudio

procedentes de los estudios de inmunidad realizados en los controles obstétricos.

En estas muestras se cuantificó la actividad bloqueante sobre la unión de VLPs de NoV

GII.4 a saliva de individuo no secretor (sese) y el título de anticuerpos específicos tipo IgG e IgA

frente a NoV GII.4. Los resultados pormenorizados se exponen en los siguientes epígrafes. Para

facilitar su valoración en la figura 39 se muestra un algoritmo con el diseño del estudio y el nº de

muestras empleadas en cada ensayo.

Figura 39. Algoritmo de los análisis realizados en suero y nº de muestras empleadas.

4.1. ACTIVIDAD BLOQUEANTE DE MUESTRAS DE SUERO FRENTE A LA UNIÓN

DE VLPs DE NoV GII.4 A SALIVA

El PI de muestras de suero sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva se realizó

mediante técnica de ELISA, según se describe en el apartado 5.3 de Material y métodos. Se

emplearon muestras de suero sin diluir y se ensayaron sólo frente a saliva de individuo no

secretor.

Tabla 64. ACTIVIDAD BLOQUEANTE DE MUESTRAS DE SUERO DE LA UNIÓN

DE VLPS DE NOV GII.4 A SALIVA DE NO SECRETOR

Muestras

analizadas

Muestras que

inhiben Promedio PI (DT, %) Mediana (I. Q.) Mínimo-máximo

71 64 (90,1%) 88,9 (18,8) 100 (79,93-100) 23,5 - 100

_____________________________________________________________________________

155

4.2. DETERMINACIÓN DE IgG ESPECÍFICA

ANTI-NoV GII.4 EN SUERO MATERNO

La cuantificación de IgG en suero se realizó

mediante la técnica de ELISA en 71 muestras

según se describe en el apartado 5.4 de Material y

métodos. Los títulos obtenidos se detallan en la

tabla 65 y figura 40. Cuarenta de los 71 sueros

(56,3%) mostraron la presencia de IgG anti-NoV.

Tabla 65. FRECUENCIA Y PORCENTAJE DE TÍTULOS DE IgG ANTI-NoV EN SUERO


< 1/50 31 43,7%

1/50 4 5,6%

1/100 9 12,7%

1/500 4 5,6%

1/1000 4 5,6%

1/5000 19 26,8%

4.2.1. Descripción y análisis estadístico del PI de suero y de la leche materna sobre la unión

de VLPs de NoV GII.4 en función del título de IgG anti-NoV en suero

Los valores de PI del suero y de muestras de leche materna sobre la unión de VLPs de NoV

GII.4 a saliva de no secretor y secretor homocigoto en función del contenido de IgG anti-NoV en

suero se muestran en la tabla 66.

La prueba de Kruskal-Wallis encuentra diferencias estadísticamente significativas entre el

PI de leche de transición frente a saliva de individuo no secretor, así como el PI de leche madura

frente a saliva de individuo secretor en función del título de IgG en suero. No así en el resto de

grupos.

0

10

20

30

40

50

<1/50 1/50 1/100 1/500 1/10001/5000

Figura 40. Títulos de IgG anti-NoV en suero

_____________________________________________________________________________

156

Tabla 66. COMPARACIÓN DE EDAD MATERNA EN EL PARTO, EDAD GESTACIONAL Y PI

DE SUERO Y LM SOBRE LA UNIÓN DE VLPs DE NoV GII.4 A SALIVA EN FUNCIÓN DEL

TÍTULO DE IgG ANTI-NoV EN SUERO (prueba de Kruskal-Wallis)

TÍTULOS IgG

ANTI-NoV EN

SUERO

< 1/50 1/50 1/100 1/500 1/1000 1/5000

p-v

alo

r

N

M

(I. Q.)

N M

(I. Q.)

N M

(I. Q.)

N M

(I. Q.)

N M

(I. Q.)

N

M

(I. Q.)

PI suero

28

100

(81,4-

100)

6

97,6

(67,7-

100)

9

100

(100-

100)

4

100

(100-

100)

4

79,2

(67,5-

96,4)

19

100

(74,4-

100)

0,13

Ensayos

con

saliva de

no

secretor

C

26

100

(100-

100)

6

100

(100-

100)

9

100

(100-

100)

4

100

(100-

100)

4

100

(72,5-

100)

19

100

(100-

100)

0,72

LT

24

100

(100-

100)

5

100

(100-

100)

8

100

(100-

100)

4

100

(100-

100)

4

100

(86,8-

100)

18

100

(85-

100)

0,01

L

Mad 18

100

(100-

100)

3

88,8

(100-

100)

8

100

(100-

100)

4

100

(100-

100)

4

100

(100-

100)

16

100

(100-

100)

0,37

Ensayos

con

saliva de

secretor

C

25

88,8

(67,8-

94,4)

5

89,1

(69,5-

93,6)

9

72,8

(69,2-

81,7)

3

75,6

(55,6-

75,6)

4

79,7

(59,5-

82,9)

19

87,2

(79-

94,1)

0,15

LT

24

83,6

(63,4-

97,5)

5

73,4

(49,9-

100)

8

90,9

(82,5-

97,3)

4

86,8

(63,2-

100)

4

90,7

(72,7-

100)

18

88

(42,8-

95,3)

0,62

L

Mad 18

38,7

(25,9-

54,4)

3

30,5

(27,8-

30,5)

8

35,8

(25,7-

66,3)

4

30,3

(16,1-

62)

4

50,5

(11,3-

75,3)

16

60,3

(34,4-

85,5)

0,03


sanguíneos, genotipo FUT2 y antígenos Lewis en función del título de IgG anti-NoV en suero

En la tabla 67 se muestra las características de origen geográfico, edad gestacional, grupos

sanguíneos, genotipo FUT2 y antígenos Lewis según el contenido de IgG anti-NoV en suero.

Aplicando una prueba de Chi-cuadrado se apreciaron diferencias estadísticamente significativas en

el contenido de IgG en suero según el origen geográfico, no así según la edad gestacional, grupos

sanguíneos ni genotipo FUT2. No fue posible su aplicación al estudio de los antígenos Lewis,

debido al elevado número de opciones con un valor esperado < 5. Como alternativa se aplicó un

estudio de regresión logística comparando la proporción de antígenos Lewis de las madres según

su suero contuviera (título > 1/50) o no (título < 1/50) IgG anti-NoV no encontrando diferencias

entre ambos (tabla 68).

_____________________________________________________________________________

157

Tabla 67. COMPARACIÓN ORIGEN GEOGRÁFICO, GRUPO DE EDAD GESTACIONAL, GRUPO SANGUÍNEO Y

GENOTIPO FUT2 MATERNOS EN FUNCIÓN DEL TÍTULO DE IgG ANTI-NoV EN SUERO (Chi CUADRADO)

TÍTULOS IgA

ANTI-NoV EN

Lm/LT

< 1/50 1/50 1/100 1/500 1/1000 1/5000 Chi

cuadrado

ORIGEN GEOGRÁFICO**

Europa del Este 1 (25%) 1 (25%) 0 0 0 2 (50%)

Latinoamérica 8 (50%) 0 3 (18,8%) 3(18,8%) 0 2 (12,4%)

0,037 España 20 (44,4%) 3 (6,7%) 4 (8,9%) 1 (2,2%) 4 (8,9%) 13 (28,9%)

Marruecos 0 1 (20%) 2 (40%) 0 0 2 (40%)

China 0 1 (100%) 0 0 0 0

EDAD GESTACIONAL**

RN pretérmino 11 (52,4%) 2 (9,5%) 2 (9,5%) 1 (4,8%) 2 (9,5%) 3 (14,3%) 0,575

RN a término 18 (36%) 4(8%) 7 (14%) 3 (6%) 2 (4%) 16 (32%)

GRUPOS SANGUÍNEOS**

Grupo A 13 (39,3%) 2 (6,1%) 2 (6,1%) 3 (9,1%) 3 (9,1%) 10 (30,3%) 0,137

Grupo O 13 (44,8%) 2 (6,9%) 5 (17,2%) 0 1 (3,5%) 8 (27,6%)

Grupo B 3 (42,8%) 1 (14,3%) 2 (28,6%) 1 (14,3%) 0 0

Grupo AB 0 1 (100%) 0 0 0 0

GENOTIPO FUT2**

No secretor 4 (66,6%) 0 1 (16,7%) 0 0 1 (16,7%) 0,747

Secretor 25 (38,5%) 6 (9,2%) 8 (12,3%) 4 (6,1%) 4 (6,1%) 18 (27,7%)

ANTÍGENOS LEWIS

a+ b+

x+y+ 3 2 0 1 1 1

*

x- y+ 1 0 1 1 0 1

x– y– 1 0 1 1 0 2

x+ y– 5 0 3 1 1 8

a– b+

x+y+ 2 1 1 0 0 1

x- y+ 2 1 0 0 0 1

x– y– 2 0 0 0 0 0

x+ y– 2 0 0 0 0 1

a– b–

x+y+ 1 0 0 0 0 1

x- y+ 0 0 0 0 0 0

x– y– 0 0 0 0 0 0

x+ y– 0 0 1 0 1 0

a+ b-

x+y+ 5 0 1 0 0 1

x-y+ 0 0 0 0 0 0

x– y– 2 0 0 0 0 0

x+ y– 3 2 1 0 1 2

Casillas con valor esperado < 5 = 0; * No es posible aplicar la prueba de Chi cuadrado; ** % para cada grupo.

_____________________________________________________________________________

158

Tabla 68. COMPARACIÓN ANTÍGENOS LEWIS MATERNOS EN FUNCIÓN DEL

CONTENIDO DE IgG ANTI-NoV EN SUERO (estudio de regresión logística)

IgG ANTI-NoV EN SUERO

Lewis a 0,295

Lewis b 0,298

Lewis x 0,514

Lewis y 0,439


momento del parto, el PI del suero y de la leche materna sobre la unión de VLPs de NoV

GII.4 a saliva

Tabla 69. COMPARACIÓN TÍTULOS IgG ANTI-NoV EN SUERO CON EDAD MATERNA EN

EL MOMENTO DEL PARTO Y PI MUESTRAS LM SOBRE LA UNIÓN DE NoV GII.4 A

MUESTRAS DE SALIVA (prueba de correlación de Spearman)


Edad materna en el parto 71 0,173 0,149

PI suero 70 -0,181 0,133

Ensayos

sobre

saliva de

no secretor

C sin diluir 68 0,042 0,731

LT sin diluir 63 -0,404 0,01

Lm sin diluir 53 -0,123 0,380

Ensayos

sobre

saliva de

secretor

C 65 0,178 0,155

LT 63 -0,063 0,625

L mad 53 0,301 0,029


Si bien los resultados de la correlación entre el título de IgG anti-NoV en suero y el PI de

leche de transición sobre saliva de individuo no secretor y de leche madura sobre saliva de secretor

son estadísticamente significativos, la correlación es débil y no permite extraer conscluiones

plausibles desde el punto de vista biológico.

_____________________________________________________________________________

159

4.3. DETERMINACIÓN IgA ESPECÍFICA

ANTI-NoV EN SUERO

La cuantificación de IgA en suero se realizó

mediante la técnica de ELISA en 71 muestras de

suero según se describe en el apartado 5.4 de

Material y métodos. Los títulos obtenidos se

detallan en la tabla 70 y figura 41. Cuarenta y

cuatro de los 71 sueros analizados (62%) mostraron

la presencia de IgA anti-NoV GII.4.

Tabla 70. Nº DE CASOS Y PORCENTAJE DE TÍTULOS DE IgA ANTI-NoV SUERO


< 1/50 27 38%

1/50 21 29,6%

1/100 9 12,7%

1/500 4 5,6%

1/1000 9 12,7%

1/5000 1 1,4%

4.3.1. Descripción y análisis estadístico de la edad materna en el momento del parto, edad

gestacional y PI de suero y leche materna sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 en función

del título de IgA anti-NoV en suero

En la tabla 71 se muestran los valores de PI del suero y PI de muestras de leche materna

sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de no secretor y secretor homocigoto en función del

contenido de IgA anti-NoV en suero. Se incluye el resultado de la prueba de Kruskal-Wallis que

no fue capaz de apreciar diferencias estadísticamente significativas entre los grupos.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

< 1/50 1/50 1/100 1/500 1/10001/5000

Figura 41. Títulos de IgA anti-NoV en suero

_____________________________________________________________________________

160

Tabla 71. COMPARACIÓN DE EDAD MATERNA EN EL PARTO, EDAD GESTACIONAL Y PI

DE SUERO Y LM SOBRE LA UNIÓN DE VLPs DE NoV GII.4 A SALIVA EN FUNCIÓN DEL

TÍTULO DE IgA ANTI-NoV EN SUERO (prueba de Kruskal-Wallis)

TÍTULOS

IgA ANTI-

NoV EN

SUERO

< 1/50 1/50 1/100 1/500 1/1000 1/5000

p-v

alo

r

N

M

(I. Q.)

N M

(I. Q.)

N M

(I. Q.)

N M

(I. Q.)

N M

(I. Q.)

N

M

(I. Q.)

PI suero 26

100

(95,4-

100)

20

86,2

(66,5-

100)

10

100

(74,6-

100)

4

100

(80,8-

100)

9

100

(92,8-

100)

1

100

(100-

100)

0,2

18

Ensayos

con

saliva de

no

secretor

C 25

100

(100-

100)

20

100

(100-

100)

10

100

(100-

100)

4

100

(100-

100)

7

100

(100-

100)

1

100

(100-

100)

0,9

55

L

T 25

100

(100-

100)

17

100

(95,6-

100)

9

100

(100-

100)

3

100

(84,2-

100)

7

100

(100-

100)

0 -

0,7

73

L

m

a

d

25

100

(100-

100)

15

100

(100-

100)

8

100

(100-

100)

3

100

(100-

100)

6

100

(100-

100) 0 -

0,8

98

Ensayos

con

saliva de

secretor

C 25

88,9

(75,4-

94,1)

17

84,8

(71,2-

90,8)

10

77,2

(65,8-

90,2)

4

77,9

(62-

95,3)

7

83,3

(53,4-

89,1)

1

100

(100-

100) 0

,32

3

L

T 25

85,5

(71,4-

96,1)

17

84,8

(37,8-

94,8)

9

96,4

(86,8-

99,9)

3

55,5

(0-

55,5)

7

82,2

(72,5-

88,4)

0 -

0,3

17

L

m

a

d

20

46,3

(30,4-

84,5)

15

41,5

(27,9-

66,3)

8

24,6

(16,6-

40,5)

3

69,7

(38,8-

69,7)

6

44,4

(30,4-

56,2)

0 -

0,2

17


sanguíneos, genotipo FUT2 y antígenos Lewis en función del título de IgA anti-NoV en suero

Los datos y resultados se muestran en la tabla 72.

_____________________________________________________________________________

161

Tabla 72. COMPARACIÓN ORIGEN GEOGRÁFICO, GRUPO DE EDAD GESTACIONAL, GRUPO

SANGUÍNEO Y GENOTIPO FUT2 MATERNOS EN FUNCIÓN DEL TÍTULO DE IgA ANTI-NoV EN

SUERO (Chi cuadrado)

TÍTULOS IgA ANTI-

NoV EN Lm/LT < 1/50 1/50 1/100 1/500 1/1000 1/5000

Chi

cuadrado

ORIGEN GEOGRÁFICO

Europa del Este 1 (100%) 0 0 0 0 0

Sudamérica 0 3 (75%) 0 1 (25%) 0 0 0,364

España 8 (50%) 3 (18,8%) 2 (12,3%) 1 (6,3%) 1 (6,3%) 1 (6,3%)

Marruecos 13 (40,6%) 13(40,6%) 8 (18,2%) 2 (4,5%) 8 (18,2%) 0

China 4 (80%) 1 (20%) 0 0 0 0

EDAD GESTACIONAL

RN pretérmino 5 (25%) 5 (25%) 4 (20%) 1 (5%) 4 (20%) 1 (5%) 0,357

RN a término 21 (42%) 15 (30%) 6 (12%) 3 (6%) 5 (10%) 0

GRUPOS SANGUÍNEOS

Grupo A 6 (18,8%) 8 (25%) 7 (21,9%) 4 (12,5%) 6 (18,8%) 1 (3%)

0,182 Grupo O 15 (51,7%) 11 (37,9%) 1 (3,4%) 0 2 (7%) 0

Grupo B 4 (57,1%) 1 (14,3%) 1 (14,3%) 0 1 (14,3%) 0

Grupo AB 1 (100%) 0 0 0 0 0

GENOTIPO FUT2

No secretor 1 (16,7%) 0 1 (16,7%) 0 4 (66,7%) 0 0,075

Secretor 25 (39,1%) 20 (31,3%) 9 (14,1%) 4 (6,3%) 5 (7,7%) 1 (1,5%)

ANTÍGENOS LEWIS

a+ b+ x+y+ 2 3 2 0 1 0

*

x- y+ 1 2 2 0 0 0

x– y– 1 2 1 1 0 0

x+ y– 6 4 3 2 2 0

a+ b- x+y+ 1 1 1 0 2 0

x- y+ 3 0 0 0 1 0

x– y– 2 0 0 0 0 0

x+ y– 0 2 0 0 1 0

a– b– x+y+ 1 1 0 0 0 0

x- y+ 0 0 0 0 0 0

x– y– 0 0 0 0 0 0

x+ y– 1 0 0 0 1 0

a– b+ x+y+ 3 1 0 0 1 1

x-y+ 0 0 0 0 0 0

x– y– 1 1 0 0 0 0

x+ y– 4 3 1 1 0 0

_____________________________________________________________________________

162

En la tabla 73 se muestran las características de origen geográfico, edad gestacional, grupo

sanguíneo, genotipo FUT2 y antígenos Lewis según el contenido de IgA anti-NoV en suero.

Se incluye el resultado de la prueba de Chi cuadrado que busca diferencias entre los grupos.

Se aprecian diferencias estadísticamente significativas en el contenido de IgG en suero según el

genotipo FUT2 materno. No es posible su aplicación al estudio de los antígenos Lewis, debido al

elevado número de opciones con un valor esperado < 5. Como alternativa se aplica un estudio de

regresión logística que compara la proporción de antígenos Lewis de las madres según su suero

contenga (título > 1/50) o no (título < 1/50) IgG anti-NoV (tabla 74), el cual no muestra

diferencias significativas entre los grupos.

Tabla 73. COMPARACIÓN ANTÍGENOS LEWIS MATERNOS EN FUNCIÓN DEL

CONTENIDO DE IgA ANTI-NoV EN SUERO (estudio de regresión logística)

IgG ANTI-NoV EN SUERO

Lewis a 0,196

Lewis b 0,562

Lewis x 0,963

Lewis y 0,407


momento del parto, el PI del suero y de la leche materna sobre la unión de VLPs de NoV

GII.4 a saliva

Los resultados muestran una débil correlación inversa entre el título de IgA anti-NoV en

suero y el PI de muestras de calostro sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de individuo

secretor, de lo cual no se pueden extraer conclusiones plausibles biológicamente. No se observa la

existencia de correlación entre los restantes parámetros.

_____________________________________________________________________________

163

Tabla 74. COMPARACIÓN TÍTULOS IgA ANTI-NoV EN SUERO CON EDAD MATERNA EN

EL MOMENTO DEL PARTO, PI SUERO Y PI MUESTRAS LM SOBRE LA UNIÓN DE NoV

GII.4 A MUESTRAS DE SALIVA (prueba de correlación de Spearman)


Edad materna en el parto 70 0,164 0,174

PI suero 70 -0,001 0,996

Ensayos sobre

saliva de no

secretor

C sin diluir 67 -0,015 0,905

LT sin diluir 61 -0,055 0,673

Lm sin diluir 52 0,091 0,520

Ensayos sobre

saliva de

secretor

Calostro 64 -0,258 0,040

LT 61 0,018 0,888

Lmad 52 -0,125 0,377

_____________________________________________________________________________

164

_____________________________________________________________________________

165

DISCUSIÓN

Dado el extraordinario interés que suscita la observación de propiedades defensivas de la

LM y el desconocimiento de muchos de los agentes responsables de las mismas, nuestra

investigación dirigida a conocer su capacidad protectora frente a una de las infecciones más

frecuentes del lactante resulta de plena actualidad.

Entre las primeras referencias acerca de la idoneidad de la LM en la alimentación del

lactante encontramos a Avicena (985-1036), filósofo y médico persa, que en el Canon proponía

que en caso de no disponer de LM la única alternativa adecuada era recurrir a las amas de cría

(Avicena citado por Ptempio, 1658). En la segunda mitad del siglo XVIII y principios del siglo

XIX esta práctica fue muy popular, sin embargo, la falta de acceso a las amas de cría de los

sectores más desfavorecidos de la población y la incorporación masiva de las mujeres al trabajo

con la Revolución industrial llevaron a la sustitución de la lactancia materna por la alimentación

con leche de vaca o cabra a las que se añadían cereales, azúcar y miel. Estas preparaciones no sólo

no cubrían las necesidades nutricionales del lactante, sino que su elevada osmolaridad suponía una

carga renal excesiva que derivó en un incremento de la mortalidad infantil debida a desnutrición y

deshidratación ligada a infecciones intestinales. Este hecho planteó el enorme reto de crear

sustitutos de la LM seguros y con una calidad nutricional suficiente.

En 1865 se presentó la “sopa para lactantes” de Justus von Liebig, profesor de química de la

Universidad de Munich que analizó por primera vez la composición de la LM (von Liebig, J.,

1865). Posteriormente aparecieron numerosas formulaciones como la del farmacéutico Heinrich

Nestle en 1867 (Peiper, A., 1992). En 1891 Paul von Ehrlich publicó las primeras evidencias de

que la LM podía conferir una protección inmunitaria al lactante insustituible por dichos

sucedáneos (Von Ehrlich., 1891, citado por Cheeda et al., 1998), lo que corroboraron Woodbury y

Grulee a principios del siglo XX al observar una menor incidencia y gravedad de las enfermedades

diarreicas en los niños lactados al pecho frente a aquellos alimentados con fórmulas artificiales

(Woodbury., 1922; Grulee et al., 1934; Grulee et al., 1935). Además, la generalización del uso de

estas nuevas fórmulas en los años 50 ofreció la oportunidad de observar a gran escala una mayor

morbi-mortalidad debido a diarrea aguda vírica y bacteriana en los lactantes alimentados

artificialmente en comparación con los que recibían LM (Wyatt et al., 1969; Mata et al., 1969b;

Glass et al., 1976; Clemens et al., 1986; McLean et al., 1986; Glass et al., 1989).

En la actualidad, existe una amplia gama de fórmulas adaptadas cuya composición

nutricional se asemeja al promedio de la LM y que ofrecen una garantía de seguridad para el

lactante, si bien estas preparaciones carecen de los agentes funcionales de la LM a los que se

atribuyen propiedades beneficiosas. Entre ellos podrían mencionarse numerosos elementos que

participan en la inmunidad tanto específica o mediada por IgA, como inespecífica mediada por

_____________________________________________________________________________

166

lactoferrina, lisozima, mucina, lactadherina, factores antiinflamatorios, antioxidantes e

inmunomoduladores, probióticos, oligosacáridos y glicoconjugados. De esta forma el objetivo

actual que se plantea para la mejora de las fórmulas artificiales es imitar sus propiedades

añadiendo algunos de estos biocomponentes.

Se ha ensayado la adición de prebióticos (Sherman, P. et al., 2009), probióticos (Arboleya,

S. et al., 2011), nucleótidos (Gill, B.D. et al., 2007) y aminoácidos esenciales (Agostoni, C. et al.,

2000), sin embargo no se conocen con exactitud sus efectos in vivo ni las cantidades necesarias

para que resulten eficaces. Además no han podido ser determinados los agentes implicados en

algunas de las propiedades de la LM, lo que hace que estas funciones resulten por el momento

inimitables. En este último punto se centra nuestra investigación, pues la observación de que la

LM confiere una capacidad protectora frente a las infecciones intestinales por NoV al lactante ha

sido referida por diversos autores (Newburg et al., 1995b; Jiang et al., 2004a; 2004b; Morrow et

al., 2005; Newburg et al., 2005a; 2005b; Marionneau et al., 2005; Newburg et al., 2009), si bien

los agentes responsables de dicha propiedad son desconocidos.

Hemos de recordar que las infecciones intestinales son la segunda causa, tras las

respiratorias, de morbilidad en la infancia tanto en países en desarrollo como en desarrollados

afectando a casi 1,8 millones de niños menores de 5 años (WHO, 2008b). Los fallecimientos por

diarrea aguda suponen un 21% de la mortalidad en los menores de 5 años en los países más pobres

(Kosek et al., 2003), donde se ha demostrado que una de las estrategias más efectivas en la lucha

contra esta enfermedad ha sido el apoyo a la lactancia materna (Battacharaya et al., 1995).

En nuestro medio son enormes los costes directos e indirectos por la elevada prevalencia de

la enfermedad (Tucker et al., 1998). Rotavirus es el principal agente causal de diarrea aguda

infecciosa en niños entre los 6 y 24 meses, siendo responsable de un 30 a un 50% de los episodios

en los países desarrollados (Lynch et al., 2003; Dormitzer et al., 2005). NoV son los segundos en

frecuencia (Moreno-Espinosa et al., 2004; Treanor et al., 2005), alcanzando hasta un 17,3% de los

casos en los niños menores de 5 años (Junquera et al., 2009). La reciente aplicación de técnicas de

RT-PCR ha permitido la identificación de un número creciente de nuevos diagnósticos, como la

asociación con enterocolitis necrosante (Stuart et al., 2010) y apneas (Kalmaludden et al., 2009) en

el periodo neonatal.

Actualmente no existe ningún cultivo celular para lograr el aislamiento de NoV (Duizer et

al., 2004b), tampoco hay un modelo animal disponible (Chaudry et al., 2007), aspectos que han

dificultado su estudio. Si bien la clonación del virus Norwalk (GI.1), prototipo del género

Norovirus, a partir de viriones parcialmente purificados de material fecal humano (Jiang et al.,

1990) permitió aplicar las técnicas de RT-PCR y de secuenciación al estudio de estos virus.

Basándose en estas técnicas, se ha llegado a la actual clasificación taxonómica de Norovirus en

_____________________________________________________________________________

167

cinco genogrupos con 29 genotipos o clusters (Zheng et al., 2006; Buesa et al., 2008).

Otro de los grandes avances en la investigación de los NoV lo constituye la replicación de la

VP1 de la cápside en sistemas de expresión como la producción de VLPs en células de insecto Sf9

con baculovirus recombinantes (Jiang et al., 1992b), proceso que no requiere ni ARN (Jiang et al.,

1992b) ni la proteína de la cápside VP2 (Laurent et al., 1994; Leite et al., 1996). Las VLPs

muestran una morfología (Prasad et al., 1994a; 1994b) y antigenicidad (Green et al., 1993)

similares a las del virión infectivo, por lo que han demostrado su utilidad en métodos diagnósticos

(Jiang et al., 2000) y en el análisis de la unión con el receptor (White et al., 1996; Marionneau et

al., 2002; Hutson et al., 2003).

El medio de transmisión más importante de los NoV es la ruta fecal-oral, además los NoV

poseen una serie de características que facilitan su propagación en brotes epidémicos: su dosis

infectiva es muy baja, la excreción viral suele ser muy intensa durante un periodo de tiempo

prolongado, la resistencia medioambiental de sus viriones es muy alta y una persona puede sufrir

múltiples reinfecciones (Parashar et al., 2001; Evans et al., 2002; Marks et al., 2003). Respecto a

este último aspecto, se ha observado que en algunas epidemias por NoV más de un 80% de los

voluntarios adultos resultan enfermos (Kaplan et al., 1982b) y aproximadamente un 50%

desarrollan repetidamente enfermedad tras varias exposiciones a NoV, sugiriendo que la respuesta

inmunitaria desarrollada en los contactos previos proporciona una protección escasa. Además,

existe un porcentaje de la población que no es susceptible a la infección por NoV tras el primer

contacto ni los sucesivos (Dolin et al., 1972; Wyatt et al., 1974; Steinhoff et al., 1980; Blacklow et

al., 1982). Ambas observaciones demuestran que la respuesta inmunitaria frente a estos virus no

sigue el patrón tradicional.

Los efectores de la respuesta inmunitaria frente a los NoV no se conocen con detalle, parece

que los receptores “Toll-like” TLR 7 y 8 intervienen en la respuesta innata frente a los virus ARN

de cadena única (Lund et al., 2004; Heil et al., 2004; Diebold et al., 2004). También se ha

observado una respuesta celular de predominio Th-1 de producción de citoquinas (Tackett et al.,

2003; Lindesmith et al., 2005). En relación con la respuesta humoral, los individuos susceptibles a

la infección por NoV presentan niveles mayores de anticuerpos séricos que aquellos que se

muestran resistentes a la infección (Johnson et al., 1990; Graham et al., 1994; Lindesmith et al.,

2003). Esta discrepancia clínico-serológica llevó durante años a plantear la hipótesis de la

existencia de un factor constitucional, determinado genéticamente, que pudiera condicionar la

susceptibilidad o resistencia frente a las infecciones por NoV (Parrino et al., 1977; Blacklow et al.,

1982; Koopmans et al., 1982; Baron et al., 1984; Cukor et al., 1984).

_____________________________________________________________________________

168

El estudio inicial que profundizó en esta hipótesis fue publicado por Ruvoen-Clouet et al. en

el año 2000, describen cómo los virus de la enfermedad hemorrágica del conejo y sus VLPs

recombinantes son capaces de unirse a los antígenos histosanguíneos (HBGAs). Estos son

carbohidratos complejos presentes en la parte más protruyente de muchas glicoproteínas o

glicolípidos de la superficie de los hematíes y del epitelio mucoso del tracto digestivo, respiratorio

y genito-urinario humanos (Ravn et al., 2002; Le Pendu et al., 2004), también están presentes

como oligosacáridos libres en fluídos biológicos como la LM, la saliva, el contenido intestinal y la

sangre.

Los determinantes antigénicos HBGAs parten de cuatro tipos principales de estructuras

sacarídicas precursoras sobre las cuales actúan las fucosiltransferasas 1 y 2 (FUT1 y FUT2) y las

glicosiltransferasas A y B. En la superficie de los enterocitos el gen FUT2 sintetiza la enzima que

permite la expresión del antígeno H tipo 1, el ligando principal para la unión de las VLPs

recombinantes a las células epiteliales intestinales (Marionneau et al., 2002) y el receptor principal

del virus Norwalk. También actúa junto con FUT3 en la síntesis de los antígenos Le a y Le b a

partir del precursor tipo 1, presente en el tracto digestivo y el aparato respiratorio (figura 19) y

junto FUT1 en la síntesis del antígeno H tipo 2 y los antígenos Lewis x e y a partir del precursor

tipo 2, en la superficie de los eritrocitos (figura 20). Las glucosiltransferasas A y B definirán los

grupos sanguíneos permitiendo la adición de los epítopos A y B al antígeno H (figura 21).

Los NoV difieren enormemente en su capacidad de reconocimiento de los receptores

HBGAs humanos. Se ha propuesto un modelo de interacción del NoV al HBGA que asume que la

proteína de la cápside de cada genotipo tiene una superficie de unión que puede acoplar uno o dos

epítopos de los tres HBGAs mayores (ABO, H o Lewis), como muestra la figura 23. De forma que

cada epítopo podría unirse a esta superficie de forma independiente y la participación de ambos en

la unión podría resultar en una ampliación de las especificidades del huésped para los diferentes

genotipos (Huang et al., 2005; Tan et al., 2004).

En relación a los componentes de la LM implicados en la protección frente a las infecciones

por NoV, se consideran de primer orden los oligosacáridos y glicoconjugados (Kunz et al., 2000).

Los oligosacáridos son sintetizados por los mismos tipos de fucosil y glicosiltransferasas

responsables de la síntesis de los HBGAs de las superficies celulares, que emplean la mayoría de

los patógenos entéricos para la unión a los enterocitos. Dada la analogía estructural de ambas

moléculas se planteó que los oligosacáridos de la LM podrían actuar competitivamente con los

receptores de las células intestinales impidiendo la internalización de los patógenos y, por tanto,

protegiendo al niño lactado de ciertas infecciones (Holmgren et al., 1981; Cleary et al., 1983;

Otnaess et al., 1986; Andersson et al., 1986; Laegreid et al., 1986a; 1986b; Holmgren et al., 1987;

Laegreid et al., 1987; Newburg et al., 1990; Newburg et al., 1991; Oatness et al., 1982; Cleary et

_____________________________________________________________________________

169

al., 1983; Nerwburg et al., 1990).

El hecho de que los oligosacáridos de la LM estén codificados por genes relacionados con el

grupo ABO, el genotipo FUT2 y los antígenos Lewis podría explicar una diferente capacidad

protectora de la LM según la dotación genética de la madre. Otras características podrían también

condicionar esta propiedad como la etapa madurativa de la LM (calostro, leche de transición o

madura) y la duración de la gestación (parto pretérmino o a término).

Dados estos preceptos, el interés principal de nuestra investigación se centró en analizar si

la LM presenta una capacidad protectora frente a las infecciones por NoV e investigar los factores

responsables de la misma. Se estudió esta propiedad en función de características como la edad

materna, su origen geográfico, la duración de la gestación y la etapa madurativa de la LM. En

relación con la posible intervención de agentes de inmunidad inespecífica se correlacionaron los

hallazgos con características de las madres como el grupo sanguíneo, el genotipo FUT2 y la

composición de oligosacáridos fucosilados en la LM. También se estudió la participación de la

inmunidad específica de la LM y el suero, estudiando si este último presentaba esta propiedad

inhibitoria y la presencia de Ig específicas anti-NoV GII.4 en ambos fluídos biológicos.

En los siguientes epígrafes se discutirán los resultados obtenidos y compararán con la

literatura actual del tema. El texto se estructurará en cinco apartados: Características de la muestra

poblacional; grupos sanguíneos, genotipo FUT2 y antígenos Lewis; análisis realizados en leche

materna; análisis realizados en suero y conclusiones.

1. Características de la muestra poblacional

El diseño longitudinal prospectivo del presente estudio en el que participaron 111 madres

aportando una muestra de suero durante la gestación y tres muestras de LM de cada una de las

etapas de secreción láctea, junto con el hecho de que las gestaciones a término y pretérmino se

encontraran representadas por igual en la muestra (tabla 31) y que estas últimas abarcaran todo el

rango de prematuridad (tabla 32), la convierten en una muestra relevante y esto confiere gran

valor al presente estudio.

La obtención de 287 muestras de LM demuestra una alta colaboración (figura 37). Las

razones por las que se perdieron muestras fueron, por orden de frecuencia: éxitus del niño,

sectorización tras el alta de la Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales, interrupción de la

lactancia materna o negativa a trasladarse al hospital para aportar la muestra. Además se

consiguieron recuperar 71 muestras de suero (figura 39), no siendo posible en caso de tratarse de

muestras antiguas desechadas por el laboratorio de Microbiología del HCUV, madres que no se

sometieron a los controles serológicos habituales durante la gestación o bien procedentes de áreas

_____________________________________________________________________________

170

sanitarias no dependientes del HCUV.

En relación con la edad (tabla 31) y la procedencia geográfica de las participantes (tabla

33), su variabilidad reflejó las características sociodemográficas de las madres de nuestro medio,

incluyéndose madres desde 16 hasta 40 años de edad, mayoritariamente de origen español y

latinoamericano.

2. Grupos sanguíneos, genotipo FUT2 y antígenos Lewis

La distribución de los diferentes grupos sanguíneos maternos fue similar a la referida para

nuestra región por la Federación Nacional de Donantes de Sangre <www.donantesdesangre.net>,

siendo los más frecuentes el A y el O (tabla 34). En relación a las madres latinoamericanas y de

Europa del Este los grupos sanguíneos observados coincideron con los más frecuentes publicados

para sus países de origen <www.bloodbook.com>.

En relación al estudio de las características de genotipo FUT2 de las madres participantes

(tabla 35), los resultados obtenidos se consideran muy novedosos en nuestro país. Concretamente

para el genotipo FUT2, se han publicado estudios de pequeñas muestras poblacionales de muy

diferentes orígenes geográficos como Portugal (Serpa et al., 2004), Suecia (Thorven et al., 2005),

Turquía y Mongolia (Soejima et al., 2008), Ghana (Soejima et al., 2007), Vietnam (Soejima et al.,

2011), China (Tian et al., 2001; Storry et al., 2006; Yan et al., 2005) y Corea (Park et al., 2005).

Más reciente es un amplio estudio multiétnico que incluye 732 individuos procedentes de 32

orígenes geográficos diferentes en los que analiza el genotipo secretor y las mutaciones del gen

FUT2 responsables del estado de no secretor. La principal conclusión del trabajo es la gran

similitud de las frecuencias del genotipo secretor y no secretor en casi todos los grupos humanos,

80 y 20% respectivamente, a pesar de las diferencias existentes en las mutaciones inactivadoras

del gen FUT2 (Ferrer-Admetlla et al., 2009).

En el estudio de Ferrer-Admetlla se analizan 121 individuos europeos, de los cuales,

solamente 20 son españoles (todos procedentes del País Vasco). Los dos grupos geográficos más

numerosos que hemos analizado fueron el de las madres españolas y de origen latinoamericano

(los grupos de madres de Europa del Este, magrebíes y chinas fueron demasiado pequeños para

poder realizar comparaciones). En ellas observamos pequeñas diferencias en la proporción de

madres secretoras y no secretoras, siendo el genotipo secretor ligeramente más frecuente en el

grupo de madres latinoamericanas (tabla 36). En concreto comprobamos que un 83,3% de mujeres

autóctonas fueron secretoras (16,7% del total de españolas fueron secretoras homocigotas y un

66,6% secretoras heterocigotas), lo que guarda una proporción similar a lo comunicado en

individuos europeos. Asimismo, aportamos datos del genotipo secretor de un grupo de 22 mujeres

latinoamericanas en las que detectamos un porcentaje levemente superior de secretoras (90,9%) en

http://www.bloodbook.com/

_____________________________________________________________________________

171

comparación con las españolas. En ninguno de los estudios de prevalencia del estado secretor se

relaciona esta característica con el sexo, por tanto hay que considerar que nosotros hemos

analizado sólo mujeres.

Por otra parte, en el estudio de Ferrer-Admetlla se plantea que dos polimorfismos son las

causas más comunes del fenotipo no secretor: (a) el alelo no funcionante se428

, que expresa un

codón de parada en la posición 143 y es responsable del fenotipo no secretor de europeos, persas y

africanos, y (b) el se385

, que es la causa más frecuente del fenotipo no secretor en el Sudeste

asiático debido a una mutación en el codón 129.

Dado que la gran mayoría de la población estudiada es europea, lo que nosotros estudiamos

con la digestión por la endonucleasa AvaII de los amplificados por PCR del gen FUT2 fue la

mutación G428A que genera un codón de parada y por tanto una enzima no funcional en los

individuos homocigotos para esta mutación (no secretores).

La secuencia 5’…AAGGTCCAGGAGC…3’ que detectamos en el cromatograma de las

secuencias no refleja directamente esta mutación G428A, pero sí el polimorfismo de este gen y se

correlaciona muy bien con los genotipos de secretores homocigotos (SeSe) y heterocigotos (Sese).

Analizando otras variables como la duración de la gestación, hemos comprobado que la

población estudiada fue homogénea en la proporción de madres secretoras y no secretoras en los

grupos de recién nacidos a término y pretérmino (tabla 37). Además, al comparar madres

secretoras y no secretoras no observamos diferencias para cada grupo sanguíneo (tabla 38).

El estudio sistemático de los antígenos Lewis a/b y x/y en LM mediante técnica de ELISA

realizado se puede considerar inédito. Existen muchas publicaciones acerca de la composición de

oligosacáridos de la LM, si bien ofrecen resultados muy dispares debido a causas relacionadas con

el procedimiento (Coppa et al., 1990; Thurl et al., 1996; Nakhla et al., 1999; Erney et al., 2000).

En primer lugar las técnicas empleadas para la separación de los oligosacáridos de la LM son muy

heterogéneas, por ej. cromatografía por intercambio iónico o filtración en gel. Además, en algunas

publicaciones no se especifica el método empleado por lo que no se puede averiguar si toda o parte

de la lactosa se ha eliminado de la fracción de oligosacáridos, lo que modifica ampliamente los

resultados. Por último, los residuos proteicos pueden contaminar fracciones con oligosacáridos

neutros o ácidos y esto no se ha considerado en muchos de los estudios. Dados los resultados

imprecisos de estas técnicas, que además requieren grandes volúmenes de LM para su estudio, se

decidió la determinación directa de los Ag Lewis en muestras de LM mediante AcMo de origen

comercial cuyo uso se había descrito para el estudio de antígenos Lewis en saliva (Marionneau et

al., 2005b), sangre (Sakamoto et al., 1984) y tejidos (Engelstaedter, 2012).

Los resultados obtenidos de la determinación de los antígenos Lewis en LM se presentan

agrupados en a/b y x/y, en función de la relación existente en las vías de síntesis descritas a partir

_____________________________________________________________________________

172

de los precursores 1 y 2, respectivamente (ver figuras 19 y 20). Las combinaciones más frecuentes

fueron Le a+ b

+ y Le x

- y

+, presentes en un 25,8% de las madres españolas, y Le a

-b

+ y Le x

+y

+, que

hallamos en un 22,7% de las madres latinoamericanas (tabla 40). La diferencia observada entre

ambos grupos fue estadísticamente significativa para Le x reflejando un mayor contenido del Ag

Le x en la LM de las madres latinoamericanas (tabla 41). Esta diferencia en el contenido de Le x

también se apreció al comparar las madres secretoras y no secretoras (tabla 43), las madres

secretoras presentaron una mayor proporción de Le x, sugiriendo la asociación de FUT2+ y

FUT3+ en ellas (ver figura 20).

Por otra parte, los grupos de gestaciones pretérmino y a término fueron homogéneos en el

contenido de antígenos Lewis (tabla 41), lo que coincide con las escasas publicaciones que existen

acerca de la influencia de la edad gestacional en composición de oligosacáridos en la LM (Kunz et

al., 2000).

A pesar de las limitaciones metodológicas en el estudio de la concentración de los

oligosacáridos de la LM planteadas previamente, se ha logrado una aproximación a su

composición. Se plantea que el oligosacárido principal de la LM de las madres FUT2+ es la 2’-

fucosil-lactosa (2’-Fuc-Lac), a diferencia de las madres FUT3+ en las que predomina la lacto-N-

fucopentosa II. En caso de que ambos genes estén presentes la lacto-N-difucohexosa I será el

oligosacárido principal y, si carecen de ambos genes, será la lacto-N-fucopentosa III (Kindberg et

al., 2007). Es decir, las madres FUT2+ tendrán de forma predominante en su LM oligosacáridos

con uniones tipo α 1,2 y las madres FUT3+ de tipo α 1,3. Desafortunadamente, las publicaciones

relacionadas demuestran que este esquema es sólo una aproximación a la expresión de los

oligosacáridos de la LM sugiriendo una mayor complejidad en su producción y la posible

intervención de otros factores (Newburg et al., 2004).

Nosotros hemos constatado una correlación casi completa entre el gen FUT2+ y el antígeno

Le b+, un 78,1% de las madres secretoras son Le b

+, si bien todas las madres no secretoras son Le

b- (tabla 42). Conviene aclarar que, en relación a FUT1 y FUT3 no es fácil deducir su fenotipo en

función de los antígenos Lewis detectados en LM.

Por ej. son necesarios los genes FUT2 y FUT3 para sintetizar el antígeno Le b a partir del

precursor tipo 1, pero sólo es necesario FUT3 para producir al antígenos Le a a partir del precursor

tipo 1 (figura 19). Sin embargo un 27% de las muestras fueron Le b+ y Le a

- (tabla 42). De forma

análoga, es necesaria la acción de las fucosiltransferasas codificadas por los genes FUT1 y FUT3

sobre el precursor tipo 2 para producir Le y. Además la acción directa del FUT3 sobre el precursor

tipo 2 permite la síntesis de Le x (figura 20). Sin embargo, un 45,8% de las muestras fueron Le y+

y Le x- y un 9,4% fueron Le x

+ Le y

- (tabla 42).

_____________________________________________________________________________

173

Dados estos resultados planteamos que no se puede establecer una correlación directa entre

los antígenos Lewis hallados en LM y los genes que codifican para las fucosiltransferasas que

permiten su síntesis. Podemos afirmar que la presencia de un antígeno Lewis indica que el gen

FUT que codifica la enzima necesaria para su síntesis está presente, pero la ausencia de un

antígeno Lewis no descarta la presencia del gen FUT requerido ( Newburg et al., 2004). Esto nos

impide comparar nuestros resultados con los datos de prevalencia descritos para los genes FUT1 y

FUT3. Se ha descrito la presencia de mutaciones recesivas para FUT1 en un 10-5

a un 10-6

de la

población; en relación con el FUT3, la mutación inactivadora se encuentra en un 10% de los

individuos (Marionneau et al., 2001).

Sí hemos constatado una correlación clara entre el genotipo FUT2 y la presencia de Le b en

la saliva de los donantes. La muestra procedente de individuo no secretor fue Le b-, a diferencia de

las muestras de individuos secretores que fueron Le b+

(tabla 20), lo que coincide con lo descrito

por Koda et al., 2001.

3. Análisis realizados en leche materna

Se diseñó un ensayo de ELISA para valorar la capacidad de bloqueo de la LM sobre la

unión de los NoV a sus receptores específicos, eje central de nuestra investigación (figura 27).

Para ello se tapizaron pocillos de placas de microtitulación con una dilución de saliva

procedente de un individuo no secretor y de un individuo secretor homocigoto. Como ensayo

preliminar, se estudió la unión de las VLPs de NoV GII.4 variante 2006b a saliva procedente de

los donantes encontrando una mayor afinidad de las VLPs de NoV GII.4 a la saliva de individuo

no secretor, a continuación de secretor homocigoto y por último de secretor heterocigoto.

Aunque la afinidad de los NoV por los HBGAs se ha desarrollado ampliamente en el

apartado 3.9 de Introducción, sería importante recordar dos aspectos fundamentales: a) la

identificación del dominio P2 de VP1 como sitio de unión con los receptores en las células del

huésped (Green, 2007), y b) la especificidad de unión de los diferentes genotipos de NoV a uno o

varios HBGAs (Huang et al., 2005; Tan et al., 2004).

Con estos conceptos se han planteado diversas aproximaciones al estudio de la interacción

de los NoV y los HBGA. Los primeros ensayos publicados emplearon paneles con muestras de

saliva procedente de individuos de diferentes grupos sanguíneos, genotipo FUT2 y antígenos

Lewis, lo que permitió definir los primeros patrones de unión de NoV a los HBGA (Harrington et

al., 2002; Huang et al., 2003; Harrington et al., 2004; Huang et al., 2005; Marionneau et al.,

2005b). Posteriormente se logró la producción de oligosacáridos sintéticos análogos a los HBGAs,

_____________________________________________________________________________

174

lo que permitió el estudio de muchas más interacciones (Huang et al., 2005).

La observación de que el virus Norwalk (NoV GI.1), considerado prototipo del género

Norovirus y primer genotipo de NoV estudiado, era capaz infectar a individuos secretores pero no

a individuos no secretores constituyó el punto de partida para la hipótesis acerca de la unión de los

NoV a los HBGAs planteada por Ruvoen-Clouet en el año 2000. Esta afinidad de unión se ha

confirmado posteriormente por medio de ensayos con oligosacáridos sintéticos donde se

demuestra su capacidad de unirse a saliva de individuos secretores A y O, pero no a la saliva de

secretores B y no secretores (tabla 9).

En relación con el NoV GII.4, la primera variante estudiada fue VA387 que demostró su

capacidad de unión a saliva de secretores A, B y O, pero muy excepcionalmente a saliva de no

secretores (tabla 9). Los resultados obtenidos con nuestra variante, NoV GII.4-2006b (procedente

de una muestra clínica obtenida en 2006), difieren de forma absoluta del comportamiento descrito

para VA387, pues presentó una mayor afinidad en la unión a saliva de individuo no secretor que

en la unión a saliva de individuo secretor.

El sorprendente hallazgo de que NoV es capaz de unirse a los HBGAs presentes en saliva de

individuo no secretor ha sido publicado por de Rougemont recientemente (de Rougemont et al.,

2011), en dicho estudio analiza la unión de 6 variantes de VLPs de NoV GII.4 (Bristol, US95/96,

Hunter, Yerseke, Den Haag y Osaka) a muestras fenotipadas de saliva y a oligosacáridos

sintéticos. Las seis variantes estudiadas fueron capaces de unirse a saliva de individuos secretores,

independientemente del grupo sanguíneo ABO. Además, las variantes Den Hagg y Osaka se

unieron a los HBGAs presentes en saliva de individuos no secretores con Ag Lewis positivos (de

Rougemont et al., 2011). Estos hallazgos sugieren la adquisición de una habilidad de unión de las

variantes de NoV posteriores al año 2006, esta capacidad de ampliar el espectro de unión de NoV

a más receptores supone un mecanismo adaptativo que permitiría su persistencia infectando a más

individuos.

Un estudio muy reciente publicado por Shanker en el año 2011 profundiza en esta teoría. En

él describe cambios en la secuencia de aminoácidos y en la conformación tridimensional de la

región correspondiente al dominio P2 de la cápside en genotipos de NoV que se suceden en brotes

epidémicos durante varios años consecutivos. Estas modificaciones tienen como resultado nuevas

posibilidades de unión a los receptores HBGAs. El análisis de los patrones de unión de los

genotipos estudiados muestra una evolución de los NoV que supone una ventaja adaptativa al

adquirir la capacidad de infectar a nuevos individuos (Shanker et al., 2011).

Asimismo, ha de destacarse que, a diferencia de la débil capacidad de unión del virus

Norwalk a saliva de individuos de grupo sanguíneo B (Marionneau et al., 2005b) y la capacidad de

_____________________________________________________________________________

175

unión de VA387 a la saliva de grupo sanguíneo B limitada a individuos secretores y no a no

secretores (Huang et al., 2005), la variante 2006b de NoV GII.4 mostró su capacidad de unión a

las tres muestras de saliva empleadas, todas ellas de grupo sanguíneo B, de forma independiente al

genotipo secretor.

Una alternativa posible al empleo de muestras de saliva que potencialmente contienen

HBGAs para el presente estudio, es tapizar los pocillos con células Caco-2 (Murakami et al.,

2010). Durante el cultivo de estas células se polarizan y adoptan una disposición de enterocitos

maduros. Sin embargo, al largo tiempo necesario para su cultivo (15 días) unido a la dificultad que

observamos para conseguir una monocapa celular llevó a la utilización de muestras de saliva para

nuestra investigación.

El siguiente paso en el ensayo diseñado para analizar la capacidad de bloqueo de la LM

sobre la unión de NoV a sus receptores en saliva, fue la adición de suspensiones de VLPs de NoV

GII.4 producidas mediante baculovirus recombinantes. Se seleccionó este genotipo por tratarse del

más prevalente tanto a nivel mundial (Lindesmith et al., 2008) como en nuestro país (Buesa et al.,

2008). Para ello se produjeron VLPs de NoV GII.4 mediante baculovirus recombinantes según el

procedimiento descrito para Norwalk por Jiang et al. en 1992 (Jiang et al., 1992b). El resultado de

esta expresión se comprobó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), así como

observación al microscopio electrónico tras tinción negativa con ácido fosfotúngstico (figuras 25 y

26).

Estas VLPs se preincubaron con las muestras de LM a estudio para valorar si alguno de sus

componentes eran capaces de interferir con la unión de las VLPs de NoV a los HBGAs de saliva,

imitando la competición por la unión al receptor que enfrentaría a los oligosacáridos de la LM y a

los NoV in vivo.

La unión fue detectada por medio del AcMo 4C5C10, producido en nuestro laboratorio por

medio de un hibridoma obtenido de linfocitos de un ratón BALB/c inmunizado con VLPs de NoV

GI.5 y seleccionado con VLPs de NoV GII.4. Este anticuerpo monoclonal era capaz de reconocer

un dominio conformacional de la región P2 de la proteína VP1 de la cápside de NoV (Carmona et

al., 2010).

Por medio de este ensayo se estudió la actividad bloqueante de muestras de LM sobre la

unión de VLPs de norovirus GII.4 a saliva.

En relación con los ensayos de bloqueo de muestras de LM sobre la unión de VLPs de NoV

GII.4 a saliva de individuo no secretor (sese), se observó que prácticamente la totalidad de las

muestras de LM eran capaces de inhibir esta unión (tabla 44). Esta propiedad apareció con una

intensidad máxima en más del 95% del total de muestras de cada grupo. El hecho de que las

_____________________________________________________________________________

176

muestras de LM se ensayaran sin diluir y diluídas 1/100, permitió observar que la intensidad de

este bloqueo no variaba al disminuir la concentración de LM por pocillo, lo que sugiere una

capacidad inhibitoria muy intensa (tabla 45). Además esta actividad se mantuvo en todas las

etapas de la secreción láctea con la misma intensidad y en un número de muestras similar.

Metodológicamente el cálculo del parámetro “porcentaje de inhibición” (P.I.) resultó de

gran utilidad en la comparación de los resultados obtenidos en los diferentes ensayos de ELISA.

La conversión de los valores absolutos de absorbancia de cada muestra de LM, ensayadas en

fechas diferentes y con distintos factores que podían influir en los resultados, en un valor relativo

al valor de referencia permitió unificar y establecer comparaciones.

La obtención de valores de inhibición máxima en casi la totalidad de las muestras de LM en

los ensayos con saliva de individuo no secretor constituyó un resultado inesperado. Sin embargo

dos aspectos confirieron fiabilidad a lo hallado a pesar de su uniformidad: a) en primer lugar la

reproducibilidad de los mismos, pues se repitieron las determinaciones en un 25% de las muestras

obteniéndose iguales resultados, y b) en segundo lugar, la obtención de resultados adecuados en

los valores de referencia de los controles positivos (pocillos a los que se añadía la suspensión de

VLPs sin LM que pudiera interferir su unión con la saliva) pues, como mínimo, triplicaban los

valores de absorbancia de los pocillos indicativos del ruido de fondo o controles negativos

(pocillos tapizados con saliva a los que se añadía PBS exclusivamente).

En los ensayos de bloqueo de muestras de LM sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a

saliva de individuo secretor homocigoto, se observó también que la LM presentaba una capacidad

de bloqueo muy intensa y en casi la totalidad de muestras de calostro. Sin embargo, fue

disminuyendo la intensidad y el número de muestras con esta propiedad en las siguientes fases de

la lactancia (tabla 46).

Se analizó si la capacidad inhibitoria de las muestras de LM se veía modificada por alguna

de las características clínicas de las madres. Para ello se aplicó un estudio de correlación de los

valores obtenidos en estos ensayos con la edad materna en el momento del parto. La hipótesis que

se planteaba era que las madres de mayor edad podrían tener una mayor concentración de

anticuerpos específicos frente a NoV por haber padecido la infección previamente y por tanto

conferirían mayor protección en el bloqueo de la unión de las VLPs a sus receptores. En un

estudio sobre seroprevalencia de anticuerpos IgG frente a NoV en 443 individuos de distintas

edades en Valencia, se encontraron anticuerpos en el 99% de las muestras de suero,

incrementándose los títulos en relación directa con la edad (Carmona et al., 2011). También

pretendía valorarse si la capacidad de inhibición de las muestras de LM disminuía con la edad,

circunstancia que observaríamos en caso de que esta propiedad dependiera de un factor expresado

constitutivamente y que esta síntesis disminuyera en las mujeres con la madurez. No obstante no

_____________________________________________________________________________

177

observamos una correlación directa ni inversa entre ambas variables (tabla 47).

En segundo lugar, se estudiaron las diferencias en el porcentaje de inhibición de las

muestras de LM según procedieran de gestaciones a término o finalizadas de forma prematura.

Conocidas las diferencias en la composición nutricional de la LM procedente de gestaciones

pretérmino y a término, tal vez podrían existir diferencias en los componentes de la LM

responsables de la propiedad protectora frente a las infecciones por NoV en función de la duración

de la gestación. No obstante nuestros resultados demostraron que no existen tales diferencias.

Por último, se realizó un análisis comparativo de la capacidad inhibitoria de la LM en

función del origen geográfico de las madres. Planteando que mujeres de diferentes nacionalidades

pudieran tener una historia de exposición diferente a NoV y, por tanto, mayor o menor

concentración de anticuerpos específicos que pudieran implicar diferencias en esta propiedad. Si

bien no hallamos diferencias significativas (tabla 49).

La relación entre la capacidad protectora de la LM frente a las infecciones por NoV y estos

datos clínicos de las madres no ha sido analizada en ningún estudio previo. Si bien ninguna de las

hipótesis planteadas han sido demostradas, los resultados son muy relevantes, pues demuestran

que la capacidad de inhibición de muestras de LM frente a las infecciones por NoV se mantiene

durante un amplio rango de edad con la misma intensidad, no varía entre las diferentes

poblaciones o razas y la poseen incluso las madres que han presentado partos extremadamente

prematuros.

El análisis de la capacidad de inhibición de muestras calostro, leche de transición y madura

recogidas de forma longitudinal de las mismas mujeres resulta inédito y nos ofrece la oportunidad

de observar que esta propiedad se mantiene con la misma intensidad durante todas las fases de la

secreción láctea en los ensayos de bloqueo con saliva de no secretor. No obstante, la inhibición

disminuye en intensidad y en el número de muestras implicadas en los ensayos de bloqueo frente a

saliva de secretor (diferencia que resulta estadísticamente significativa como muestran las tablas

55 y 56). En los ensayos de bloqueo realizados por Jiang et al. se emplearon muestras de la

primera semana de lactancia (Jiang et al., 2004a). En este mismo artículo se estudia la

concentración de los antígenos Le a y Le b durante las primeras 18 semanas de lactancia no

apreciándose oscilaciones significativas en los resultados lo que, en caso de ser los responsables de

la inhibición, explicaría los resultados observados con saliva de no secretor, no así los resultados

con saliva de secretor.

Para conocer la participación de los anticuerpos específicos de la LM en esta actividad se

estudiaron los grupos sanguíneos, el genotipo FUT2 y los antígenos Lewis en LM de las madres.

En las comparaciones establecidas entre los diferentes grupos sanguíneos se excluyó al grupo

_____________________________________________________________________________

178

sanguíneo AB por estar formado por un número insuficiente de madres. En relación a los restantes

grupos no se observaron diferencias en los valores de porcentaje de inhibición de muestras de LM

sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 2006b a saliva (tabla 50).

Los estudios acerca de la unión de VLPs de NoV de diferentes genotipos a muestras de

saliva clasificadas según el grupo sanguíneo demuestran que este es un factor determinante de

especificidad (Huang et al., 2005; Marionneau et al., 2005b; de Rougemont et al., 2011), si bien

parece secundario en los ensayos de bloqueo por muestras de LM. Esto coincide con los resultados

publicados por Jiang et al., quienes analizan el bloqueo de la unión de cuatro variantes de NoV

(VA387, MOH, Norwalk y VA207) a saliva por muestras de LM. En ellas se observó que el

genotipo FUT2 de las madres y los antígenos Lewis de las muestras de LM son los principales

factores que influyen en esta actividad bloqueante, mientras que el grupo sanguíneo no resulta

decisivo sugiriendo que los antígenos A y B no se expresan en la LM (Jiang et al., 2004a).

La hipótesis planteada tiene relación con la gran inmunogenicidad de estos antígenos como

constatan los casos de anemia hemolítica del RN por incompatibilidad materno-filial o de

transfusiones con hemoderivados de grupos sanguíneos no compatibles entre donante y receptor.

La inhibición de la producción del antígeno A, B o ambos en la LM podría suponer una protección

al recién nacido por motivos obvios (Jiang et al., 2004a). Sabharwal et al. encontraron grandes

cantidades de antígenos de grupo A en muestras fecales de lactantes alimentados con LM, y en

base a la hipótesis previa, estudiaron los grupos sanguíneos de madres y de niños lactados al pecho

así como el contenido de antígeno A en LM. Observaron que sólo los lactantes de grupo A o AB

con madres que eran A o AB presentaban precursores del antígeno A en LM, planteando que estos

podrían sufrir una transformación a nivel digestivo que los convertiría en los tetrasacáridos que se

identificaron en heces (Sabharwal et al., 1991). Esta observación apoyaría que los antígenos de

grupo sólo aparecerían en LM de madres y lactantes del mismo grupo.

De forma contraria a lo que cabría esperar, no se hallaron diferencias en la capacidad de

inhibición de muestras de LM sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva según el genotipo

FUT2 materno (tabla 52). La mayor capacidad protectora de la LM de madres FUT2+ frente a las

infecciones por NoV, se ha estudiado desde diferentes perspectivas. Desde un punto de vista

clínico se ha observado que la LM con un mayor contenido de oligosacáridos con uniones α 1,2 se

relaciona con una menor incidencia de diarrea por calicivirus en los niños lactados al pecho

respecto a los niños alimentados con fórmulas artificiales (Morrow et al., 2004). En dicho estudio

se identificó un mayor contenido de lacto-N-difucohexosa en las muestras de LM, oligosacárido

fucosilado que tiene como epítopo el antígeno Lewis b (de Rougemont et al., 2011). En relación

con los estudios de laboratorio, en el estudio de Jiang se analizó la capacidad de unión de VLPs de

NoV de 4 genotipos diferentes (VA387, Norwalk, VA207 y MOH) a receptores específicos y su

_____________________________________________________________________________

179

bloqueo por 60 muestras de LM de las que se conoce el grupo sanguíneo, el genotipo FUT2 y los

antígenos Lewis. Todos los genotipos de NoV fueron capaces de unirse a saliva de individuo

secretor y solamente VA207 (GII.9) fue capaz de unirse a saliva de no secretor. Asimismo, la LM

procedente de madres secretoras y no secretoras mostró capacidad de bloqueo sobre la unión de las

VLPs de VA207 a saliva, si bien sólo la LM procedente de madres secretoras interfirió en la unión

del resto de genotipos a saliva (Jiang et al., 2004a).

El comportamiento observado en nuestro estudio de las VLPs de NoV GII.4 variante 2006b

en los ensayos de unión a saliva, demostrando su capacidad de unión tanto a saliva de individuo

secretor como de no secretor, podría asemejarse a lo descrito por Jiang para VA207, sugiriendo

que estos genotipos se unen a HBGAs diferentes a los antígenos H tipo 1 y Le b en saliva,

codificados por FUT2.

Es importante conocer esto pues la especificidad de unión de una variante de NoV a los

HBGAs determina cuáles son las muestras de LM que pueden interferir con su unión a receptores

y es necesaria una interacción molecular entre los componentes de la LM y los receptores HBGAs

de saliva para competir por la unión al virus. Por este motivo tanto con las VLPs de NoV GII.4

variante 2006b como con VA207 se observa que las muestras de LM procedente de madres

secretoras y no secretoras son capaces de bloquear su unión a saliva, lo que sugiere que los

componentes de la LM responsables de dicha inhibición son independientes de los oligosacáridos

fucosilados dependientes del gen FUT2 (el antígeno H tipo 1 y el antígeno Lewis b).

Para conocer con mayor detalle la posible intervención de los oligosacáridos fucosilados de

la LM se analizó la correlación entre los Ag Le a/b y x/y y el porcentaje de inhibición de muestras

de LM sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva. No se apreciaron diferencias significativas

para ninguno de los grupos (tabla 53). El hecho de comparar el porcentaje de inhibición de las

muestras de LM con su composición de Ag Lewis a/b y x/y podría requerir un mayor número de

muestras de las analizadas puesto que las combinaciones posibles son 16 y esto dificulta el análisis

estadístico. Además, analizar los antígenos Lewis de forma individual podría resultar incorrecto

pues no contemplaría las interrelaciones entre ellos. Para superar esta limitación se realizó un

análisis multivariante que proporcionó el mismo resultado.

Para confirmar la supuesta independencia de la capacidad de inhibición de las muestras de

LM de su contenido de los antígenos Lewis fucosilados serían necesarios más estudios. Sería útil

diseñar ensayos de bloqueo de la unión de VLPs de NoV GII.4 a salivas fenotipadas por medio de

oligosacáridos sintéticos como se describe en Marionneau et al., 2002 y Huang et al., 2003. Con

ello conoceríamos con exactitud los HBGAs responsables de dicho bloqueo y podríamos ampliar

el estudio a muchos otros componentes de la LM.

_____________________________________________________________________________

180

Al relevante hallazgo de que el genotipo FUT2 materno no determina la mayor o menor

capacidad de bloqueo de las muestras de LM sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva, se

une el resultado de que el genotipo FUT2 de los individuos de los que proceden las muestras de

saliva influye de manera determinante en la mayor o menor capacidad inhibitoria de la leche

humana para todas las etapas de la secreción láctea (tablas 57 y 58).

Una vez comprobada la afinidad de las VLPs estudiadas por las tres muestras de saliva

empleadas (que se unen más intensamente a saliva de no secretor que de secretor), la hipótesis

planteada para explicar las diferencias observadas en los ensayos de bloqueo por muestras de LM

según el tipo de saliva empleada se expone a continuación. La mayor capacidad de bloqueo de las

muestras de LM sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva de no secretor podría deberse a la

existencia en esta saliva de un receptor muy afín al NoV GII.4, a su vez presente en la LM de

forma generalizada permitiendo así la propiedad observada. Por otra parte la saliva de individuo

secretor podría tener un receptor diferente con menor afinidad por esta variante de NoV y por ello

la unión sería menos intensa. Además, las muestras de LM no presentarían componentes con una

analogía estructural suficiente para competir con los receptores en saliva de secretor y por ello

tendrían una capacidad de inhibición menor. Hay que recordar que la inhibición frente a saliva de

secretor es mayor en las muestras de calostro y menor en leche de transición y madura, tanto en

intensidad como en número de muestras que bloquean, lo que sugiere que ese componente

disminuye a medida que avanzan las diferentes etapas de la secreción láctea.

También analizamos la IgA específica anti-NoV en leche madura y, en caso de carecer de

dicha muestra, en leche de transición mediante técnica de ELISA.

Si bien existen publicaciones acerca del contendio de IgA total en LM (Asensi et al., 2006),

los resultados obtenidos en la identificación de IgA específica anti-NoV en LM son prácticamente

inéditos. Constituye el segundo estudio realizado sobre la presencia de IgA anti-NoV en leche

humana, según las búsquedas bibliográficas realizadas por nosotros en Pubmed, y el primero

llevado a cabo en nuestro medio y con esta variante de NoV. En la publicación de Makita et al.

(2007) se analizaron mediante ELISA 239 muestras de LM y se encontró IgA anti-NoV en un 13%

de ellas. La mayoría de estas muestras contenían IgA anti-NoV frente a GII.6 y encontraron IgA

anti-NoV frente a diferentes genotipos en una misma muestra de LM (Makita et al., 2007). En

nuestro estudio analizamos 287 muestras de LM para identificar IgA-anti NoV exclusivamente de

genotipo II.4 variante 2006b. Nosotros encontramos una prevalencia de IgA anti-NoV en LM más

elevada, pues el 75% de las muestras analizadas contenían títulos superiores a 1/100 (figura 38 y

tabla 59).

Con la finalidad de estudiar posibles factores condicionantes de la concentración de IgA

_____________________________________________________________________________

181

anti-NoV en LM estudiamos su correlación con diversas características de las madres, tales como

la edad materna (tabla 63), el origen geográfico y la duración de la gestación (tabla 61). No

hallamos diferencias en los títulos de IgA anti-NoV en LM en función de estas variables.

Tampoco encontramos diferencias en el contenido de IgA anti-NoV en LM según el grupo

sanguíneo y el genotipo FUT2 maternos (tabla 61) ni los antígenos Lewis detectados en LM

(tablas 61 y 62).

El hecho de que sólo un 75% de las muestras de LM analizadas contuvieran IgA anti-NoV

contrasta con la actividad inhibitoria observada en casi el 100% de las muestras de LM de leche de

transición y madura en los ensayos frente a saliva de no secretor, sugiriendo que los anticuerpos

anti-NoV en LM no son responsables por completo de esta propiedad. Además se compararon los

títulos de IgA anti-NoV con el PI de la LM y no se encontró correlación entre ambos (tablas 60 y

63), lo que apoya esta teoría.

4. Análisis realizados en suero

El porcentaje de inhibición de muestras de suero sobre la unión de VLPs de NoV GII.4

variante 2006b a saliva se calculó según los valores de absorbancia obtenidos en los ensayos de

bloqueo realizados mediante técnica de ELISA. Se emplearon muestras de suero

descomplementadas y se ensayaron sólo frente a saliva de no secretor.

Este es el primer estudio en el que se diseña un ensayo de bloqueo de la unión de VLPs de

NoV a saliva empleando muestras de suero. Los resultados obtenidos mostraron que un 90,1% de

las muestras presentaron actividad inhibitoria en la unión de VLPs de NoV GII.4 sobre saliva de

no secretor (tabla 64).

Al analizar la concentración de IgG específica anti-NoV en suero, solamente identificamos

títulos significativos en un 56,3% de las muestras (figura 40 y tabla 65). Además, no hallamos

correlación entre el contenido de IgG anti-NoV en suero y el porcentaje de inhibición de dichas

muestras sobre la unión de VLPs de NoV GII.4 a saliva (tablas 66 y 69), lo que también se

observó en relación con los anticuerpos IgA anti-NoV en suero (tabla 71). Estos hallazgos

sugieren que podrían existir otros componentes en el suero implicados en esta actividad.

La seroprevalencia de IgG anti-NoV en las mujeres estudiadas difiere de la descrita por

Carmona et al. en un estudio de seroprevalencia de anticuerpos frente a NoV GII.4 en Valencia.

En este trabajo un 99,5% de las muestras fueron positivas y se observó un incremento de los

niveles de anticuerpos de forma gradual con la edad alcanzándose el máximo título de anticuerpos

IgG anti-NoV en la década de 41-50 años (Carmona et al., 2011). Si bien este estudio presenta un

aspecto diferencial que podría explicar la disparidad de nuestros resultados, ya que empleó como

_____________________________________________________________________________

182

antígenos el dominio P2 de VP1 de NoV GII.4-2008 expresado en E.coli como proteína

recombinante. Este antígeno probablemente tenía algunos determinantes conservados en diferentes

cepas del genotipo GII.4 lo que explicaría una reactividad cruzada frente a otras variantes y a

seroprevalencia tan generalizada hallada.

De forma análoga a los estudios realizados con IgA anti-NoV en LM se investigó si existía

alguna correlación entre la edad materna en el momento del parto (tabla 69), el origen geográfico

de las madres y la duración de su gestación (tabla 67). El único hallazgo relevante fue la

observación de diferencias en los títulos de IgG anti-NoV en sueros de mujeres españolas y de

mujeres latinoamericanas, lo que hipotéticamente podría reflejar una diferente exposición al virus.

En relación al grupo sanguíneo y al genotipo FUT2 materno (tabla 67) y a los antígenos

Lewis en LM (tabla 68) no se encontraron diferencias según el contenido de IgG anti-NoV en

suero.

La cuantificación de IgA anti-NoV en suero se realizó mediante técnica de ELISA. Se

identificó IgA anti-NoV en un 62% de las muestras de suero (figura 41 y tabla 70).

No se encontraron diferencias en los títulos de IgA anti-NoV en suero en función del origen

geográfico de las madres ni de la duración de la gestación (tabla 72). El grupo sanguíneo, el

genotipo FUT2 y los antígenos Lewis tampoco explicaron el diferente contenido de IgA anti-NoV

en suero (tabla 72).

Un hallazgo relevante fue la marcada correlación encontrada entre la concentración de IgA

anti-NoV en LM y en suero (tabla 63), indicando que la concentración de IgA anti-NoV en suero

probablemente determina la concentración de IgA anti-NoV en LM. A pesar de que sólo un 62%

de las muestras de suero contenían IgA anti-NoV se hallaron títulos superiores a 1/100 en las

muestras de LM analizadas, lo que sugiere que la IgA láctea no procede exclusivamente de la

difundida pasivamente del suero y que deberán existir mecanismos adicionales que contribuyan a

la concentración de IgA en LM. Resultados similares obtienen Asensi et al. al estudiar las

concentraciones de IgA anti-rotavirus en LM y suero, exponiendo tres posibles explicaciones: a) el

acúmulo de células secretoras de IgA en la glándula mamaria, b) un transporte activo local del

suero a la LM favorecido por la ingurgitación mamaria, y c) un mecanismo de difusión facilitada

por el componente secretor de la molécula de IgA (Asensi et al., 2006).

5. Conclusiones

La leche humana es un fluído enormemente complejo, aspecto que sustenta el hecho de que

han sido necesarios dos siglos para lograr fórmulas que supongan una alternativa válida. No

_____________________________________________________________________________

183

obstante, sólo hemos logrado imitar su composición nutricional y ha sido imposible emular sus

ventajas defensivas.

Nosotros hemos demostrado que la LM presenta una capacidad protectora frente a las

infecciones por NoV GII.4, segunda causa de gastroenteritis en la infancia, observando esta

propiedad en madres de distintas edades, de diferentes orígenes geográficos e incluso en caso de

parto extremadamente pretérmino, durante todas las etapas de la lactancia.

Entre los agentes responsables de esta actividad se encuentra la IgA específica anti-NoV

que identificamos en un 75% de las muestras de LM analizadas, si bien no se correlacionan con la

capacidad protectora de la leche humana sugiriendo la intervención de otros factores.

El bloqueo de la unión de los NoV al receptor por los oligosacáridos de la LM es una

hipótesis plausible que podría explicar esta propiedad. Nosotros no observamos diferencias en

relación con los distintos grupos sanguíneos o con el genotipo secretor de las madres, si bien sí

que existieron en función del genotipo secretor del receptor, representado en nuestro ensayo de

inhibición del “binding” por la saliva. Respecto a la participación de los antígenos Lewis son

necesarios más estudios para llegar a una conclusión definitiva.

Son también necesarios más estudios para conocer mejor el comportamiento de otras

variantes de NoV GII.4 y de otros genotipos en relación a los grupos sanguíneos, al genotipo

FUT2 materno y del receptor y a los antígenos Lewis. Recientemente se ha descubierto que los

rotavirus reconocen antígenos histosanguíneos, HBGAs, (H tipo 1 y Le b) y se han identificado los

oligosacáridos en la LM responsables de la interacción de las partículas víricas de rotavirus con el

receptor (Huang et al., 2012).

Es también importante aclarar la participación de otros oligosacáridos (sialilados y sialil-

fucosilados) y glicoconjugados de la LM (lactoferrina, κ-caseína, mucina, lactadherina…) en esta

actividad.

La identificación de los componentes de la LM responsables de estas propiedades,

permitiría la implementación de una nueva generación de agentes antimicrobianos con

propiedades preventivas y terapéuticas frente a las infecciones intestinales que podrían beneficiar a

lactantes alimentados con fórmula artificial o a niños que han finalizado el periodo de lactancia.

_____________________________________________________________________________

184

_____________________________________________________________________________

185

CONCLUSIONES

1. Las muestras de leche materna analizadas inhiben la unión de partículas pseudovíricas

(VLPs) de norovirus de genotipo GII.4-2006b a saliva de individuo no secretor. Esta

actividad se mantiene constante durante las tres etapas de la lactancia. Sin embargo, la

inhibición es menos intensa sobre la unión de VLPs a saliva de individuo secretor y

disminuye progresivamente a lo largo de la lactancia.

2. La inhibición de la unión de las partículas pseudovíricas de norovirus GII.4-2006b a saliva

es independiente de la edad materna, el origen geográfico y la duración de la gestación.

3. Los grupos sanguíneos A, B y O maternos no influyen en la capacidad inhibitoria de la

leche materna sobre la unión de VLPs de norovirus GII.4-2006b.

4. Las VLPs de norovirus GII.4-2006b son capaces de unirse a saliva de individuos no

secretores, mostrando incluso mayor intensidad en esta interacción que con saliva de

individuos secretores.

5. La inhibición de la unión de VLPs de norovirus GII.4-2006b a saliva es independiente del

genotipo FUT2 de la madre y por tanto de los antígenos H tipo 1 y Le b. Serían necesarios

más estudios para conocer la intervención de los antígenos Le a y Le x/y.

6. El 75% de las muestras de leche madura analizadas contienen títulos de > 1/100 de

anticuerpos de IgA específicos anti-norovirus.

7. Las concentraciones de IgA anti-norovirus en leche materna se correlacionan directamente

con los niveles de IgA en suero.

8. El porcentaje de inhibición de la leche materna sobre la unión de VLPs a saliva de

individuo secretor y no secretor no se correlaciona con su concentración de IgA anti-

norovirus.

9. Existen anticuerpos IgG e IgA frente a norovirus GII.4-2006b en el 56 y el 62% de las

muestras de suero analizadas, respectivamente.

10. El porcentaje de inhibición de la leche materna sobre la unión de VLPs a saliva de

individuo secretor y no secretor no se correlaciona con la concentración de anticuerpos

séricos anti-NoV.

_____________________________________________________________________________

186

_____________________________________________________________________________

187

ANEXOS

1. HOJA DE INFORMACIÓN AL PACIENTE

Se le ofrece la posibilidad de participar en el proyecto de investigación titulado

“Capacidad protectora de la leche materna frente a las infecciones por norovirus” que está

siendo dirigido por la Dra. Cecilia Martínez Costa, especialista en Gastroenterología y Nutrición

Pediátrica (Servicio de Pediatría), y el Dr. Javier Buesa Gómez, especialista en Microbiología

(Servicio de Microbiología), y que ha sido evaluado y aprobado por el Comité Ético de

Investigación Clínica del Hospital Clínico Universitario de Valencia.

¿Cuál es el objetivo de este estudio?

La leche materna es considerada el nutriente de referencia para el recién nacido y el lactante por

todas las sociedades científicas pediátricas y se afirma que los niños lactados al pecho tienen

una menor incidencia de enfermedades digestivas (enterocolitis necrosante en recién nacidos

prematuros, infecciones por rotavirus...) y respiratorias (bronquiolitis...). Sin embargo, no han

sido evaluadas las propiedades protectoras de la leche materna frente a las infecciones por

norovirus (uno de los agentes principales de gastroenteritis agudas en la infancia).

¿Por qué se le ha pedido que participe?

Su participación en este estudio permitirá ampliar los fundamentos científicos para la

recomendación de la leche materna a todos los recién nacidos y lactantes. Asimismo, podremos

valorar la importancia de su administración en aquellos con unas necesidades especiales, como

son los recién nacidos prematuros.

¿En qué consiste su participación y qué tipo de pruebas o procedimientos se le

realizarán?

Se necesitará una muestra de leche materna de 5 ml en cada uno de sus estadios madurativos

(calostro, transición y madura), para cuya recogida dispondrá de la ayuda del personal médico

y/o sanitario del Servicio de Pediatría. Además, se empleará parte de la muestra de suero del

cribado inmune realizado durante su embarazo para estudiar determinadas características de su

grupo sanguíneo y sus anticuerpos frente a este agente infeccioso, en su defecto necesitaremos

una muestra de saliva que obtendremos de una forma sencilla de la mucosa bucal.

¿Cuáles son los riesgos generales de participar en este estudio?

La participación en este estudio no conlleva la realización de ninguna prueba sobre su hijo ni

ninguna prueba invasiva sobre usted, por lo que está carente de riesgos.

¿Cuáles son los beneficios de la participación en este estudio?

_____________________________________________________________________________

188

La participación en estos estudios es importante porque permitirá conocer las características

defensivas de la leche materna frente a estos virus gastrointestinales y las propiedades

distintivas de la leche humana en caso de parto prematuro.

¿Qué pasará si decido no participar en este estudio?

La participación en este estudio es totalmente voluntaria. En caso de que decida no participar en

el estudio, esto no modificará el trato ni el seguimiento que recibe su hijo del equipo médico ni

del resto del personal sanitario. Asimismo, podrá retirarse del estudio en cualquier momento, sin

tener que dar explicaciones.

¿A quién puedo preguntar en caso de duda?

Es importante que comente con cualquiera de los investigadores de este proyecto los

pormenores o dudas que surjan antes de firmar el consentimiento para su participación.

Asimismo, podrá solicitar cualquier explicación que desee sobre todos los aspectos del estudio y

sus implicaciones a lo largo del mismo, contactando con los investigadores del proyecto: Dra.

Cecilia Martínez Costa y Dra. Parisá Khodayar Pardo en el teléfono 963987653.

Confidencialidad

Todos los datos, así como toda la información médica relacionada con usted o su hijo, serán

tratados con absoluta confidencialidad por parte del personal encargado de la investigación.

Asimismo, si los resultados del estudio fueran susceptibles de publicación en revistas

científicas, en ningún momento se proporcionarán datos personales de los pacientes que han

colaborado en esta investigación. Tal y como contempla la Ley de Protección de Datos de

carácter Personal, podrá ejercer su derecho a acceder, rectificar o cancelar sus datos contactando

con el investigador principal de este estudio.

¿Qué pasará con las muestras biológicas obtenidas durante la investigación?

Durante su participación en este estudio, se le obtendrán tres muestras de leche materna y se

recuperará una muestra de suero o bien se le solicitará una muestra de saliva. Estas muestras

serán siempre utilizadas con fines científicos, pudiéndose utilizar si usted así lo autoriza, en el

marco de otros proyectos de investigación que tengan objetivos derivados de este y que

previamente hayan sido evaluados y aprobados por el Comité Ético de Investigación Clínica del

Hospital. Además, este material no será bajo ningún concepto ni en ningún momento motivo de

lucro, bien sea por la venta del material o de los derechos para realizar estudios sobre los

mismos.

_____________________________________________________________________________

189

2. DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO INFORMADO

Título del Proyecto

“Capacidad protectora de la leche materna frente a las infecciones por norovirus”

Investigador

Servicio de Pediatría y de Microbiología Hospital Clínico de Valencia

Yo, ......................... he sido informado por la Dra. Parisá Khodayar Pardo, investigadora del

proyecto arriba mencionado, y declaro que:

- He leído la hoja de información que se me ha entregado

- He podido hacer preguntas sobre el estudio

- He recibido respuestas satisfactorias a mis preguntas

- He recibido suficiente información sobre el estudio

Comprendo que mi participación es voluntaria

Comprendo que todos mis datos serán tratados confidencialmente

Comprendo que puedo retirarme del estudio:

- Cuando quiera

- Sin tener que dar explicaciones

- Sin que esto repercuta en mis cuidados médicos

Autorizo a que las muestras obtenidas durante el proyecto de investigación sean utilizadas con

fines científicos en otros proyectos de investigación que tengan por objeto el estudio de mi

enfermedad y que hayan sido aprobados por el Comité de Ética e Investigación Clínica del

Hospital Clínico Universitario de Valencia: Sí No

Quiero que se me pida autorización previa para utilizar mis muestras biológicas para futuros

proyectos de investigación: Sí No

Con esto, doy mi conformidad para participar en este estudio.

Firma del paciente: Firma del investigador:

Fecha: ........................

_____________________________________________________________________________

190

_____________________________________________________________________________

191

BIBLIOGRAFÍA

1. Adak, G. K., Meakins, S. M., Yip, H., Lopman, B. A., O´Brien, S. J. (2005). Diseases Risks

from Foods, England and Wales, 1996-2000. Emerg Infect Dis 11 (3): 365-72.

2. Adderson, E. E., Johnston, J. M., Shackelford, P. G., Carroll, W. L. (1992). Development of the

human antibody repertoire. Pediatr Res 32 (3): 257-63.

3. Adler, J., Zickl, R. (1969). Winter vomiting disease. J Infect Dis 119 (6): 668-73.

4. Aerde, J. E. (1991). Acute respiratoryfailure and bronchopulmonary dysplasia. En “Neonatal

Nutrition and Metabolism”. 1ª ed. (Hay, W. W., ed). Chicago, Mosby Year Book Inc.; 467-506.

5. Agostoni, C. , Carratú, B., Boniglia, C., Riva, E., Sanzini, E. (2000). Free amino acid content in

standard infant formulas: comparison with human milk. J Am Coll Nutr 19 (4): 434-8.

6. Agus, S. G., Dolin, R., Wyatt, R. G., Tousimis, A. J., Northrup, R. S. (1973). Acute infectious

nonbacterial gastroenteritis: intestinal histopathology. Hystologic and enzymatic alterations

during illness produced by the Norwalk agent in man.Ann Intern Med 79 (1): 18-25.

7. Ali, S. A., Hill, D. R. (2003). Giardia intestinalis. Curr Opin Infect Dis 16 (5): 453-60.

8. Alzina, V., Puig, M., de Echániz, L., Villa, I., da Cunha Ferreira, R. (1986). Prostaglandins in

human milk. Biol Neonate 50 (4): 200-4.

9. Amano, J., Oshima, M. (1999). Expression of the H type 1 blood group antigen during

enterocytic differentiation of Caco-2 cells. J Biol Chem 274 (21): 209-16.

10. Ambert-Balay, K., Bon, F., Le Guyader, F., Pothier, P., Kohli, E. (2005). Characterization of

new recombinant noroviruses. J Clin Microbiol 43 (10): 5179-86.

11. Anasaka, M., Atmar, R., Ruvolo, V., Crawford, S. E., Neill, F. H., Estes, M. K. (2005).

Replication and packaging of Norwalk virus RNA in cultured mammalian cells. Proc Natl Acad

Sci USA 102 (29): 10327-32.

12. Anderson, B. F., Baker, H. M., Dodson, E. J., Norris, G. E., Rumball, S. V., Waters, J.

M.,Baker, E. M. (1987). Structure of human lactoferrin at 3.2-A resolution. Proc Natl Acad Sci

USA 84 (7): 769-771.

13. Anderson, B. Porras, O., Hanson, L. A., Lagergard, T., Svanborg-Eden, C., (1986). Inhibition of

attachment of Streptococcus pneumoniae and Haemophillus influenzae by human milk and

receptor oligosaccharides. J Infect Dis 153 (2): 232-7.

14. Anderson, D. C., Abbasi, O., Kishimoto, T. K., Koenig, J. M., McIntire, L. V., Smith, C. W.

(1991). Diminished lectin, epidermal growth factor, complement binding domain-cell adhesión

molecule-1 on neonatal neutrophils underlies their impaired CD18-independent adhesión to

endotelial cells in vitro. J Immunol 146 (10): 3372-9.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10963461


_____________________________________________________________________________

192

15. Ando, T., Monroe, S. S., Gentsch, J., Jin, Q, Lewis, D. C., Glass, R. I. (1995). Detection and

differentiation of antigenically distinct small round-structured viruses (Norwalk-like viruses) by

reverse transcription-PCR and Southern hybridization. J Clin Microbiol 33 (1): 64-71.

16. Ando, T., Noel, J. S., Fankhauser, R. L. (2000). Genetic classification of “Norwalk-like

viruses”. The J of Infect Dis 181 (2): 336-48.

17. Arboleya, S., Ruas-Madiedo, P., Margolles, A., Solís, G., Salminen, S., de Los Reyes-Gavilán,

C. G., Gueimonde, M. (2011). Characterization and in vitro properties of potentially probiotic

Bifidobacterium strains isolated from breast milk. Int J Foof Microbiol 149 (1): 28-36.

18. Armon, K., Stephenson, T., MacFaul, R., Eccleston, P., Werneke, U. (2001). An evidence and

consensus based guideline for acute diarrhoea management. Arch Dis Child 85 (2): 132-42.

19. Arnold, R. R., Bewer, M., Gauthier, J. J. (1977). A bactericidal effect of lactoferrin. Science 197

(4300): 263-5.

20. Arvola, T., Ruuska, T., Keränen, J., Hyöty, H., Salminen, S., Isolauri, E. (2006). Rectal

bleeding in infancy: Clinical, allergological, and microbiological examination. Pediatrics 117

(4): e760-8.

21. Asensi, M. T., Martínez-Costa, C., Buesa, J. (2006) Anti-rotavirus antibodies in human milk:

quantification and neutralization activity. J Pediatr Gastroenterol Nutr 42 (5): 560-7.

22. Ashkenazi, S., Danzinger, Y., Varsano, Y., Peilan, J., Mimouni, M. (1987). Treatment of

Campylobacter gastroenteritis. Arch Dis Child 62 (1): 84-5.

23. Atmar, R. L., Estes, M. K. (2001). Diagnosis of noncultivatable gastroenteritis viruses, the

human caliciviruses. Clin Microbiol Rev 14 (1): 15-37.

24. Atmar, R. L., Neil, F. H., Woodley , C. M., Manger, R., Fout, G. S., Burkhardt, W., Leja, L.,

McGovern, E. R., Le Guyader, F., Metclaf, T. G., Estes, M. K. (1996). Collaborative evaluation

of a method for detection of Norwalk virus in shellfish tissues by PCR. Appl Environ Microbiol

62 (1): 254-8.

25. Atmar, R. L., Neill, F. H., Woodley, Romalde, J. L., Le Guyader, F., Woodley, C. M., Metclaf,

T. G., Estes, M. K. (1995). Detection of Norwalk virus and hepatitis A virus in shellfish tissues

with the PCR. Appl Environ Microbiol 61 (8): 3014-8.

26. Bagci, S., Eis-Hübinger, A. M., Yassin, A. F., Simon, A., Bartman, P., Franz, A. R., Mueller, A.

(2010). Clinical characteristics of viral intestinal infection of preterm and term neonates. Eur J

Clin Microbiol Infect Dis 29 (9): 1079-84.

27. Bahl, R. (2001). Effect of zinc supplementation on clinical course of acute diarrhea. Report of a

Meeting, New Dehli, 7-8 May 2001. J Health Pop Nutr 19 (4): 338-46.

28. Bailey, D., Karakasiliotis, I., Vashist, S., Chung, L. M., Reese, J., Mc Fadden, N., Benson, A.,

Yarovinsky, F., Simmonds, P., Goodfellow, I. (2010). Functional analysis of RNA structures

_____________________________________________________________________________

193

present at the 3´extremity of the murine norovirus genome: the variable polypyrimidine tract

plays a role in viral influence. J Virol 84 (6): 2859-70.

29. Bailey, D., Thackray, L. B., Goodfellow, I. G. (2008). A single amino acid substitution in the

murine norovirus capsid protein is sufficient for attenuation in vivo. J Virol 82 (15): 7725-8.

30. Bakos, M. A., Kurosky, A., Goldblum, R. M. (1991). Characterization of a critical binding site

for human polymeric Ig on secretory component. J Immunol 147 (10): 3419-26.

31. Ball, J. M., Graham, D. Y., Opekun, A. R., Gilger, M. A., Guerrero, R. A., Estes, M. K. (1999).

Recombinant Norwalk virus-like particles given orally to volunteers: phase I study.

Gastroenterology 117 (1): 40-8.

32. Ballow, M., Fang, F., Good, R. A., Day, N. K. (1974). Developmental aspects of complement

components in the newborn. The presence of complement components and C3 proactivator

(properdin factor B) in human colostrum. Clin Exp Immunol 18 (2): 257-66.

33. Baqui, A. H., Black, R. E., Yunus, M., Hoque, A. R., Chowdury, H. R., Sack, R. B. (1991).

Metodological issues in diarrhoeal diseases epidemiology: definition of diarrhoeal episodes. Int

J Epidemiol 20 (4): 1057-63.

34. Baqui, A. H., Sack, R. B., Black, R. E., Chowdury, H. R., Yunus, M., Siddique, A. K. (1993).

Cell-mediated immune deficiency and malnutrition are independent risk factors for persistent

diarrea in Bangladesh children. Am J Clin Nutr 58 (4): 543-8.

35. Barker, J., Vipond, I. B., Bloomfield, S. F. (2004). Effects of cleaning and disinfection in

reducing the spread of Norovirus contamination via environmental surfaces. J Hosp Infect 58

(1): 42-9.

36. Barness, L. A. (1994). Dietary sources of nucleotides- from breast milk to weaning. J Nutr 124

(1): 128-130.

37. Baron, R. C., Greenberg, H. B., Cukor, G., Blacklow, N. R. (1984). Serological responses

among teenagers after natural exposure to Norwalk virus. J infect Dis 150 (4): 531-4.

38. Baron, S., Niesel, D., Singh, I. P., McKerlie, L., Poast, J., Chopra, A., Antonelli, G., Dianzani,

F., Coppenhaver, D. H. (1989). Recently described innate broad spectrum virus inhibitors.

Microb Pathog 7 (4): 237-47.

39. Barry, H., Rockx, G., Vennema, H., Hoebe, C. J, Duizer, E., Koopmans, M. P. (2005).

Association of histo-blood group antigens and susceptibility to norovirus Infections. The J of

Infect Dis 191 (5): 749-54.

40. Bass, D. M., Estes, M. K. (2004). Viral infections. En “Pediatric Gastrointestinal Disease”. 4ª

ed. (Walker, W. A., Goulet, O., Kleinman, R. E., Sherman, P. M., Schneider, B. L., Sanderson, I.

R., eds). Hamilton, Ontario: BC Decker; 666-678.

_____________________________________________________________________________

194

41. Battacharaya, S. K., Battacharaya, M. K., Manna, B., Dutta, D., Deb, A., Dutta, P., Goswami, A.

G., Dutta, A., Sarkar, S., Mukhopadaya, A. (1995). Risk factors for development of dehydration

in young children with acute watery diarrhoea: a case control study. Acta Paediatr 84 (2): 160-

4.

42. Bauer, S. Kirschning, C. J., Hacker, H., Redecke, V., Hausmann, S., Akira, S., Wagner, H.,

Lipford, G. B. (2001). Human TLR9 confers responsiveness to bacterial DNA via species-

specific CpG motif recognition. Proc Natl Acad Sci USA 98 (16): 9237-42.

43. Baum, S. G. (2005). Adenovirus. En “Principles and Parctice of Infectious Diseases”. 6ª ed.

(Mandell, G. L., Bennet, J., Dollin, R., eds.). New York: Churchill Livingstone; 1835-40.

44. Beagley, K. W., Fujihashi, K., Aicher, W., Xu, J., Kiyono, H., Eldridge, J. H., Bruce, M. G.,

Taquchi, T., Green, D. R., Singh, B. (1989). Mucosal homeostasis: role of interleukins, isotype-

specific factors and contrasupression in the IgA response. Immunol Invest 18 (1-4): 77-89.

45. Beards, G. M., Brown, W. G., Green, J., Flewett, T. H. (1986). An enveloped virus in stools of

children and adults with gastroenteritis that resembles the Breda virus of calves. J Med Virol 20

(13): 67-78.

46. Beisel, W. R. (1982). Single nutrients and immunity. Am J Clin Nutr 35 (2): 417-68.

47. Bellamy, W. (1993). Killing of Candida Albicans by lactoferrin B, a potent antimicrobial

peptide derived from the N-terminal región of bovine lactoferrin. Med Microbiol Immunol

(Berl) 182 (2): 97-105.

48. Beller, M., Ellis, A., Lee, S. H., Drebot, M. A., Jenkerson, S. A., Funk, E., Sobsey, M. D.,

Simmons, O. D., Monroe, S. S., Ando, T., Noel, J., Petric, M., Middaugh, J. P., Spika, J. S.

(1997). Outbreak of viral gastroenteritis due to a contaminated well. International

consequences. JAMA 278 (7): 563-8.

49. Belliot, G., Noel, J. S., Li, J. F., Seto, Y., Humphrey, C. D., Ando, T., Glass, R. I., Monroe, S.

S. (2001). Characterization of capsid genes, expressed in the baculovirus system, of three new

genetically distinct strains of “Norwalk-like viruses”. J Clin Microbiol 39 (12): 4288-95.

50. Bengmarrk, S. (1998). Ecological control of the gastrointestinal tract. The role of probiotic

flora. Gut 42 (1): 2-7.

51. Bennish, M. L., Khan, W. A., Begum, M., Bridges, E. A., Ahmed, S., Saha, D., Salam, M. A.,

Acheson, D., Ryan, E. T. (2006). Low risk of hemolytic-uremic syndrome after early effective

antimicrobial therapy for Shigella dysenteriae type 1 infection in Bangladesh. Clin Infect Dis 42

(3): 356-62.

52. Bennish, M. L., Salam, M. A., Haider, R., Barza, M. (1990). Therapy for Shigellosis.

Randomised, double blind comparison of ciprofloxacin and ampicilin. J Infect Dis 162 (3): 711-

6.

_____________________________________________________________________________

195

53. Berke, T, Golding, B., Jiang, X., Cubitt, D. W., Wolfaardt, M, Smith, A. W. Matson, D. O.

(1997). Phylogenetic analysis of the Caliciviruses. J Med Virol 52 (4): 419-24.

54. Bern, C., Martines, J., de Zoysa, I., Glass, R. I. (1992). The magnitude of the global problem of

diarrhoeal disease: a ten-year update. Bull World Health Organ 70 (6): 705-14.

55. Bertolotti-Ciarlet, A., Crawford, S. E., Hutson, A. M, Estes, M. K. (2003). The 3´end of

Norwalk virus mRNA contains determinants that regulate the expression and stability of the

viral capsid protein VP1: a novel function for the VP2 protein. J Virol 77 (21): 11603-15.

56. Bertolotti-Ciarlet, A., White, L. J., Chen, R., Venkataram Prasad, B. V., Estes, M. K. (2002).

Structural requirements for the assembly of Norwalk virus-like particles. J Virol 76 (8): 4044-

55.

57. Bertotto, A. (1990). Human breast milk T cells display the phenotype and functional

characteristics of memory T cells. Eur J Immunol 20 (8): 1877-80.

58. Bezkorovainy, A., Grohlich, D., Nichols, J. H. (1979). Isolation of a glycopeptide fraction with

Lactobacillus bifidus subspecies Pennsylvanicus growth-promoting activity from whole human

milk casein. Am J Clin Nutr 32 (7): 1428-32.

59. Bezkorovainy, A., Topuzian, N. (1981). Bifidobacterium bifidus var. Pennsylvanicus growth

promoting activity of human milk casein and its derivatives. Int J Biochem 13 (5): 585-90.

60. Bhan, M. K., Bhandari, N. (1998). The Role of Zinc and Vitamin A in Persistent Diarrhea

among Infants and Young Children. J of Ped Gastroenterol Nutr 26 (4): 446-53.

61. Bhandari, N., Bhan, M., Sazawal, S. (1992). Mortality associated with acute watery diarrea,

dysentery and protracted diarrea in rural North India. Acta Pediatr 81 (381): 3-6.

62. Bhandari, N., Sazawal, S., Clemens, J. D., Kashiap, D. K., Dhingra, U., Bhan, M. K. (1994).

Association between diarrheal duration and nutritional status decline: implications for an

empirically validated definition of persistent diarrea. Indian J Pediatr 61 (5): 559-66.

63. Bhutta, Z. A., Bird, S. M., Black, R. E., Brown, K. H., Gardner, J. M., Hidayat, A., Khatun, F.,

Martorell, R., Ninh, N. X., Penny, M. E., Rosado, J. L., Roy, S. K., Ruel, M., Sazawal, S.,

Shankar, A. (2000). Therapeutic effects of oral zinc in acute and persistent diarrhoea in

developing countries: pooled analysis of randomized controlled trilas. Am J Clin Nutr 72 (6):

1516-22.

64. Bishop, R. F., Davidson, G. P., Holmes, I. H., Ruck, B. J. (1973). Virus particles in epithelial

cells of duodenal mucosa from children with viral enteritis. Lancet 2 (7841): 1281-3.

65. Black, R. (2008). Time to tackle undernutrition. Lancet 371 (9608): 197.

66. Black, R. E., Greenberg, H. B., Kapikian, A. Z., Brown, K. H., Becker, S. (1982). Acquisition

of serum antibody to Norwalk virus and rotavirus and relation to diarrhea in a longitudinal study

of young children in rural Bangladesh. J Infect Dis 145 (4): 483-9.

_____________________________________________________________________________

196

67. Black, R. E., Sazawal, S. (2001). Zinc and chidhood infectious disease morbidity and mortality.

Br J Nutr 85 (2): 125-9.

68. Blacklow, N. R., Cukor, G. (1982). Norwalk virus: a major cause of epidemic gastroenteritis.

Am J Public Health 72 (12): 1303-21.

69. Blacklow, N. R., Cukor, G., Bedigian, M. K., Echeverria, P., Greenberg, H. B., Schreiber, D. S.,

Trier, J. S. (1979). Immune response and prevalence of antibody to Norwalk enteritis virus as

determined by radioimmunoassay. J Clin Microbiol 10 (6): 903-9.

70. Blacklow, N. R., Dolin, R., Fedson, D. S. (1972). Acute infectious nonbacterial gastroenteritis:

etiology and pathogenesis. A combined clinical staff conference at the Clinical Center of The

National Institutes of Health. Ann Intern Med 76 (6): 993-1008.

71. Blacklow, N. R., Hermann, J. E., Cubitt, W. D. (1987). Immunobiology of Norwalk virus. Ciba

Found Symp 128: 144-161.

72. Blanton, L. H., Adams, S. H., Beard, R. S., Wei, G., Bulens, S. N., Widdowson, M. A., Glass,

R. I., Monroe, S. S. (2006). Epidemiologic and molecular trends of caliciviruses associated with

outbreaks of acute gastroenteritis in the United States, 2000-2004. J Infect Dis 193 (3): 413-21.

73. Blau, H., Passwell, J. H., Levanon, M., Davidson, J., Kohen, F., Ramot, B. (1983). Studies on

human milk macrophages: effect of activation on phagocytosis and secretion of prostaglandin

E2 and lysozyme. Pediatr Res 17 (4): 241-5.

74. Boat, T. F., Kleinerman, J. I., Faranoff, A. A., Stren, R. C. (1977). Human tracheobronchial

secretions: Development of mucous glycoprotein and lysozime-secreting systems. Pediatr Res

11 (9): 977-80.

75. Bocci, V., von Bremen, K., Corradeschi, F., Franchi, F., Luzzi, E., Paulesu, L. (1993). Presence

of interferon-gamma and interleukin-6 in colostrums of normal women. Lymphkyne Cytokine

Res 12 (1): 21-4.

76. Bode, L., Kunz, C., Muhly-Reinholz, M., Mayer, K., Seeger, W., Rudloff, S. (2004a). Inhibition

of monocyte, lymphocyte, and neutrophil adhesion to endothelial cells by human milk

oligosaccharides. Thromb Haemost 92 (6): 1402-10.

77. Bode, L., Rudloff, S., Kunz, C., Strobel, S., Klein, N. (2004b). Human milk oligosaccharides

reduce platelet-neutrophil complex formation leading to a decrease in neutrophil beta 2 integrin

expression. J Leukoc Biol 76 (4): 820-6.

78. Boga, J. A., Melon, S., Nicieza, Y., De Diego, I., Villar, M., Parra, F., De Oña, M. (2004).

Etiology of sporadic cases of pediatric acute gastroenteritis in Asturias, Spain, genotyping and

characterization of norovirus strains involved. J Clin Microbiol 42 (6): 2668-74.

_____________________________________________________________________________

197

79. Boniotti, B., Wirblich, C., Sibilia, M., Meyers, G., Thiel, H. J., Rossi, C. (1994). Identification

and characterization of a 3C-like protease from rabbit hemorrhagic disease virus, a calicivirus. J

Virol 68 (8): 6487-95.

80. Boot, H. J., Ter Huurne, A. A., Peeters, B. P., Gielkens, A. L. (1999). Efficient rescue of

infectious bursal disease virus from cloned cDNA: evidence for involvement of the 3´-terminal

sequence in genome replication. Virology 265 (2): 330-341.

81. Boran, P., Tokuc, G., Vagas, E., Oktem, S., Gokduman, M. K. (2006). Impact of zinc

supplementation in children with acute diarrea in Turkey. Arch. Dis Child 91 (4): 296-9.

82. Borges, A. M., Teixera, J. M., and Costa, P. S., Giugliano, L. G., Fiaccadori, F. S., Franco. R.,

C., Brito, W. M., Leite, J. P., Cardoso, D. D. (2006). Detection of calicivirus from fecal samples

from children with acute gastroenteritis in the West Central region of Brazil. Mem Inst Oswaldo

Cruz 101 (7): 721-4.

83. Bosch A. (1998). Human enteric viruses in the water environment: a minireview. Int Microbiol

1 (3): 191-6.

84. Bosch, A., Pinto, R., Abad, F. X. (2006). Survival and transport in the environment. En “Viruses

in Food”. 1ª ed. (Goyal, S. M., ed.). New York: Springer; 151-87.

85. Boschi-Pinto, C., Velebit, L., Shibuya, K. (2008). Estimating child mortality due to diarrhoea in

developing countries. Bull World Health Organ 86 (9): 710-7.

86. Brand Miller, J., Mc Veagh, P. (1999). Human milk oligosaccharides: 130 reasons to breast feed.

Br J Nutr 82 (5): 333-5.

87. Brandt, C.D., Kim, H. W., Rodriguez, W. J., Thomas, L., Yolken, R. H., Arrobio, J., Kapikian,

A. Z., Parrott, R. H., Chanock, R. M. (1981). Comparison of direct electron microscopy,

immune electron microscopy, and rotavirus enzyme-linked immunosorbent assay for detection

of gastroenteritis viruses in children. J Clin Microbiol 13 (5): 976-81.

88. Brandtzaeg, P. (1978). Polymeric IgA is complexed with secretory component (SC) on the

surface of human intestinal epithellial cells. Scand J Immunol 8 (1): 39-52.

89. Brantl, V. (1985). Novel opioid peptides derived from human-betacasein: human-

betacasomorphins. Eur J Pharmacol 106 (1): 213-4.

90. Breese, J. R., Widdowson, M. A., Monroe, S. S., Glass, R. I. (2002). Foodborne viral

gastroenteritis: challenges and opportunities. Clin Infect Dis 35: 748-53.

91. Brignon, G., Chtorou, A., Ribadeau-Dumas, B. (1985). Preparation and amino-acid sequence of

human kappa-casein. FEBS Lett 188 (1): 48-54.

92. Brines, R. D., Brock, J. H. (1983). The effect of trypsin and chymotrypsin on the in vitro

antimicrobial and iron-binding properties of lactoferrin in human milk and bovine colostrum.

Biochem Biophys Acta 759 (3): 229-35.

_____________________________________________________________________________

198

93. Brown, K. H. (1991). Dietary management of acute childhood diarrhea: optimal timing of

feeding and approppiate use of milks and mixed diets. J Pediatr 118: 92-98.

94. Brown, K. H. (1994a). Dietary management of acute diarrheal disease: contemporary scientific

issues. J Nutr 124 (8): 1455-60.

95. Brown, K. H., Peerson, J. M., Fontaine, O. (1994b). Use of nonhuman milks in the dietary

management of young children with acute diarrea: a metanalysis of clinical trials. Pediatrics 93

(1): 17-27.

96. Brown, M., Grydsuk, J. D., Fortsas, E., Petric, M. (1996). Structural features unique to enteric

adenoviruses. Arch Virol Suppl 12: 301-7.

97. Brown, W. R., Isobe, Y., Nakane, P. K. (1976). Studies on translocation of immunoglobulins

across intestinal epithelium. II. Immunoelectron microscopic localization of immunoglobulins

and secretory component in human intestinal mucosa. Gastroenterology 71 (6): 985-95.

98. Buesa, J., Collado, B., López-Andújar, P., Abu-Mallouh, R., Rodriguez-Diaz, J. (2002).

Molecular epidemiology of caliciviruses causing outbreaks and sporadic cases of acute

gastroenteritis in Spain. J Clin Microbiol 40 (8): 2854-9.

99. Buesa, J., Montava, R., Abu-Mallouh, R., Fos, M., Ribes, J. M., Bartolomé, R., Vanaclocha, H.,

Torner, N., Domínguez, A. (2008). Sequential evolution of genotype GII.4 norovirus variants

causing gastroenteritis outbreaks from 2001 to 2006 in Eastern Spain. J Med Virol 80 (7): 1288-

95.

100. Buescher, E. S. (1991). The effects of colostrums on neutrophil function: decreased

deformatability with increased cytoeskeletal-associated actin. En “Immunology ofMilk and

Neonate”. 1ª ed. (Mestecky, J., Blair, C., Ogra, P., eds.). New York: Plenum Press; 131-6.

101. Buescher, E. S., Pickering, L. K. (1986). Polymorphonuclear leukocytes in human colostrums

and milk. En “Human infant nutrition and health”. 1ª ed. (Howell, R., R., Morris, F. H. Jr.,

Pickering, L. K.., eds.). Springfield, Charles C. Thomas; 160-73.

102. Buescher, S. E., McIlheran, S. M. (1992). Colostral antioxidants: separation and

characterization of two activities in human colostrum. J Pediatr Gastroenterol Nutr 14 (1): 47-

56.

103. Bullen, J. J., Rogers, H. J., Leigh, L. (1972). Iron-binding proteins in milk and resistance of

Escherichia coli infection in infants. Br Med J 1 (5792): 69-75.

104. Burgio, G. R., ed. (1987). En “Immunology of the Neonate”. 1ª ed. Vienna: Springer; 188.

105. Butte, N. F., Goldblum, R. M., Fehl, L. M., Loftin, K., Smith, E. O., Garza, C., Goldman, A. S.

(1984). Daily ingestion of immunologic components in human milk during the first four months

of life. Acta Paediatr Scand 73 (3): 296-301.

_____________________________________________________________________________

199

106. Cairo, M. S., Suen, Y., Knoppel, E., Dana, R., Park, L., Clark, S., van de Ven, C., Sender, L.

(1992). Decreased G-CSF and IL-3 production and gene expression from mononuclear cells of

newborn infants. Pediatr Res 31 (6): 574-8.

107. Cairo, M. S., Suen, Y., Knoppel, E., van de Ven, C., Nguyen, A., Sender, L. (1991). Decreased

stimulated GM-CSF expression and GM-CSF gene expression but normal numbers of GM-CSF

receptors in human term newborns as compared with adults. Pediatr Res 30 (4): 362-7.

108. Cannon, R. O., Poliner, J. R., Hirschhorn, R.B., Rodeheaver, D. C., Silverman, P. R., Brown, E.

A., Talbot, G. H., Stine, S. E., Monroe, S. S., Dennis, D. T. (1991). A multistate outbreak of

Norwalk virus gastroenteritis associated with consumption of comercial ice. J Infect Dis 164

(5): 860-3.

109. Cao, S., Lou, Z., Tan, M., Chen, Y., Liu, Y., Zhang, Z., Zhang, X. C., Jiang, X., Li, X., Rao, Z.

(2007). Structural basis for the recognition of blood group trisaccharides by norovirus. J Virol

81 (11): 5949-57.

110. Caplan, M. S., Hsueh, W., Kelly, A., Donovan, M. (1990). Serum PAF acetylhydrolase

increases during neonatal maturation. Prostaglandins 39 (6): 705-14.

111. Caplan, M. S., Kelly, A., Hsueh, W. (1992). Endotoxin and hipoxia-induced intestinal necrosis

in rats: the role of platelet activating factor. Pediatr Res 31 (5): 428-34.

112. Caprioli, A., Pezzella, C., Morelli, R., Giammanco, A., Arista, S., Crotti, D., Facchini, M.,

Guglielmetti, P., Piersimoni, C., Luzzi, I. (1996). Enteropathogens associated with childhood

diarrea in Italy. The Italian Study Group on Gastrointestinal Infections. Pediatr Infect Dis J 15

(10): 876-83.

113. Carlsson, B., Kindberg, E., Buesa, J., Rydell, G. E., Lidon, M. F., Montava, R., Abu

Mallouh, R., Grahn, A., Rodríguez-Díaz, J, Bellido, J., Arnedo, A., Larson, G., Svensson, L., .

(2009). The G428A nonsense mutation in FUT 2 provides strong but not absolute protection

against symptomatic GII.4 Norovirus infection. PLoS ONE 4 (5): 5593e.

114. Carmona Vicente, N., Fernández Jiménez, M., Rodríguez Díaz, J., Buesa Gómez, J. (2011).

Identificación del epítopo reconocido por un anticuerpo monoclonal frente a norovirus GII4.

Comunicación CP/223 al XI Congreso Nacional de Virología, Granada 29/V-1/VI/2011.

Virología 14 (1): 289-90.

115. Carmona Vicente, N., Fernández-Jiménez, M., Ribes Fernández, J. M., Téllez castillo, C. J.,

Buesa Gómez, J. (2011). Seroprevalencia de anticuerpos frente a norovirus GII.4 en Valencia.

Virología 14 (1): 293.

116. Carpenter, G. (1980). Epidermal growth factor is a major growth-promoting agent in human

milk. Science 210 (4466): 198-9.

117. Carter, M. J., Milton, I. D., Meanger, J., Bennett, M., Gaskell, R. M., Turner, R. C. (1992). The

complete nucleotide sequence of a feline calicivirus. Virology 190 (1): 443-8.

_____________________________________________________________________________

200

118. Carver, J. D., Cox, W. I., Barness, L. A. (1990). Dietary nucleotide effects upon murine natural

killer cell activity and macrophage activation. J Parenteral Enteral Nutr 14 (1): 18-22.

119. Casais, R., Thiel, V., Siddell, S. G., Cavanagh, D., Britton, P. (2001). Reverse genetic system

for the avian coronavirus infectious bronchitis virus. J Virol 75 (24): 12359-69.

120. Cash, R. A., Forrest, J. N., Nalin, D. R., Abrutyn, E. (1970). Rapid correction of acidosis and

dehydration of cholera with oral electrolyte and glucose solution. Lancet 2 (7672): 549-50.

121. Caul, E. O. (1994). Small round structured viruses: airborne transmission and hospital control.

Lancet 343 (8908): 1240-42.

122. Caul, E. O., Appleton, H. (1982). The electron microscopical and physical characteristics of

small round human fecal viruses: an interim scheme for classification. J Med Virol 9 (4): 257-

265.

123. Caul, E. O., Ashley, C., Pether, J. V. (1979). Norwalk-like particles in the epidemic

gastroenteritis in the UK. Lancet 2 (8155): 1292.

124. Centers for Disease Control and Prevention and National Center for Health Statistics. National

Nursing Home Survey. (1999). Selected years (1973-1999). Disponible en URL:

<http://www.cdc.gov/nchs/data/nnhsd>. [Acceso 1 julio, 2010]

125. Centers for Disease Control and Prevention. Multisite outbreak of norovirus associated with a

franchise restaurant-Kent County, Michigan, May 2005. (2006). Morb Mort Weekley Rep 55

(14): 395-7.

126. Centers for Disease Control and Prevention. Norovirus outbreak among evacuees from

hurricane Katrina-Houston, Texas, September 2005. (2005). Morb Mort Weekley Rep 54 (40):

1016-8.

127. Centers for Disease Control and Prevention. Outbreak of acute gastroenteritis associated with

Norwalk-like viruses among British military personnel. Afghanistan, May 2002. (2002). Morb

Mort Weekley Rep 51 (22): 477-9.

128. Chachu, K. A., LoBue, A. D., Strong, D. W., Baric, R. S., Virgin, H. W. (2008). Immune

mechanisms responsible for vaccination against and clearance of mucosal and lymphatic

norovirus infection. PLoS Pathog 4 (12): 1000236e.

129. Chadry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. (2007). Recovery of genetically defined murine

norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase. J of Gen

Virol 88 (Pt 8): 2091-100.

130. Chadwick, P. R., Beards, G., Brown, D., Caul, E. O., Cheesbrough, J., Clarke, I., Curry, A.,

O'Brien, S., Quigley, K., Sellwood, J., Westmoreland, D. (2000). Management of hospital

outbreaks of gastroenteritis due to small round, structured viruses. J Hosp Infect 45 (1): 1-10.

http://www.cdc.gov/nchs/data/nnhsd

_____________________________________________________________________________

201

131. Chadwick, P. R., McCann R. (1994). Transmission of a small round structured virus by

vomiting during a hospital outbreak of gastroenteritis. J Hosp Infect 26 (3): 251-59.

132. Chakravarty, S., Hutson, A. M., Estes, M. K., Prasad, B. V. (2005). Evolutionary trace residues

in noroviruses: importance in receptor binding, antigenicity, virion assembly, and strain

diversity. J Virol 79 (1): 554-68.

133. Chandan, R. C., Shahani, K. M., Holly, R. (1964). Lysozime content of human milk. Nature

204: 76.

134. Chang, K. O., Kim, Y., Green, K. Y., Saif, L. J. (2002). Cell-culture propagation of porcine

enteric calicivirus mediated by intestinal contents is dependent on the cyclic AMP signaling

pathway. Virology 304 (2): 302-10.

135. Chang, K. O., Sosnovtsev, S. V., Belliot, G., Kim, Y., Saif, L. J., Green, K. Y. (2004). Bile

acids are essential for porcine enteric calicivirus replication in association with down-regulation

of signal traducer and activator of transcription 1. Proc Natl Acad Sci USA 101 (23): 8733-38.

136. Chang, K. O., Sosnovtsev, S. V., Belliot, G., Kim, Y., Saif, L. J., Green, K. Y. (2005). Bile

acids are essential for porcine enteric calicivirus, a prototype sapovirus in the Caliciviridae. J

Virol 79 (3): 1409-16.

137. Chapel, J. E., Clandinin, M. T., Barbe, G. J., Armstrong, D. T. (1983). Prostanoid content of

human milk: relationships to milk fatty acid content. Endocrinol Exp 17 (3-4): 351-8.

138. Chapell, J. E., Francis, T., Clandinin, M. T. (1985). Vitamin A and E content of human milk at

early stages of lactation. Early Hum Dev 11 (2): 157-67.

139. Chaturvedi, P., Warren, C. D., Altaye, M., Morrow, A. L., Ruiz-Palacios, G., Pickering, L. K.,

Newburg, D. S. (2001a). Fucosylated human milk oligosaccharides vary between individuals

and over the course of lactation. Glycobiol 11 (5): 365-72.

140. Chaturvedi, P., Warren, C. D., Buescher, C. R., Pickering, L. K., Newburg, D. S. (2001b).

Survival of human milk oligosaccharides in the intestine of infants. Adv Exp Med Biol 501: 513-

23.

141. Chaudry, Y., Skinner, M. A., Goodfellow, I. G. (2007). Recovery of genetically defined murine

norovirus in tissue culture by using a fowlpox virus expressing T7 RNA polymerase. J Gen

Virol 88 (8): 2091-100.

142. Cheda, S., Palkowetz, K. H., Rassin, D. K., Goldman, A. S. (1996). Deficient quantitative

expression of CD45 isoforms on CD4+ and CD8

+ T cells subpoblations and subsets of CD45RA

(low) CD45RO (low) T cells in newborn blood. Biol Neonate 69 (2): 128-32.

143. Cheesbrough, J. S., Green, Y., Gallimore, C. I., Wright, P. A., Brown, D. W. (2000).

Widespread environmental contamination with Norwalk-like viruses (NLV) detected in a

prolonged hotel outbreak of gastroenteritis. Epidemiol Infect 125 (1): 93-8.

_____________________________________________________________________________

202

144. Cheetham, S., Souza, M., Meulia, T., Grimes, S., Han, M. G., Saif, L. J. (2006). Pathogenesis of

a genogroup II human norovirus in gnotobiotic pigs. J of Virol 80 (21): 10372-81.

145. Chen, R., Neil, J. D., Noel, J. S., Hutson, A. M., Glass, R. I., Estes, M. K., Prasad, B. V. (2004).

Inter and intragenus structural variations in caliciviruses and their functional implications. J

Virol 78 (12): 6469-79.

146. Chen, S. Y., Tsai, C. N., Lai, M. W., Chen, C. Y., Lin, K. L., Lin, T. Y., Chiu, C. H. (2009).

Norovirus infection as a cause of diarrhea-associated benign infantile seizures. Clin Infect Dis

48 (7): 849-55.

147. Chew, F., Penna, F. J., Perte-Filho, L. A., Quan, C., Lopes, M. C., Mota, J. A. (1993). Is dilution

of cow´s milk formula necessary for dietary management of acute diarrhoea in infants aged less

than 6 months? Lancet 341 (8839): 194-7.

148. Cheeda, S., Keeney, S. E., Goldman, A. S. (1998). Immunology of human milk and host

immunity. En: “Fetal and Neonatal Physiology”. 2ª ed. (Polin, R. A., Fox., W. W., eds.).

Philadelphia, Saunders Company: 2022-32.

149. Chiba, Y., Minagawa, T., Mito, K. (1987). Effect of breast feeding on responses of systemic

interferon and virus-specific lymphocyte transformation in infants with respiratory syncytial

virus infection. J Med Virol 21 (1): 7-14.

150. Chipman, D. M., Sharon, N. (1969). Mechanism of lysozyme action. Science 165 (3982): 454-

65.

151. Christ, M., McCartney-Francis, N. L., Kulkarni, A. B., Ward, J, M., Mizel, D. E., Mackall, C.

L., Gress, R. E., Hines, K. L., Tian, H., Karlsson, S. (1994). Immune dysregulation in TGF-

beta1-deficient mice. J Immunol 153 (5): 1936-46.

152. Chu, S. W., Walker, W. A. (1986). Developmental changes in the activities of sialyl- and

fucosyltransferases in the rat intestine. Biochem Byophis Acta 883 (3): 496-500.

153. Chung, L. A.W., Viscorova, B. (1948). The effect of oral feeding versus early oral starvation on

the course of infantile diarrea. J Pediatr 33 (1): 14-22.

154. Clausen, H., Levery, S. B., Kannagi, R., Hakomori, S. (1986a). Novel blood group H glycolipid

antigens exclusively expressed in group A and AB erythrocytes (type 3 chain H). Isolation and

chemical characterization. J Biol Chem 261 (3): 1380-87.

155. Clausen, H., Levery, S.B., Kannagi, R., Hakomori, S. (1986b). Novel blood group H glycolipid

antigens exclusively expressed in blood group A and AB erythrocites (type 3 chain H).

Differential conversion of different H substrates by A 1 and A 2 enzymes, and type 3 chain H

expression in relation to secretor status. J Biol Chem 261 (3): 1388-92.

156. Cleary, T. G., Chambers, J. P., Pickering, L. K. (1983). Protection of suckling mice from the

heat-stable enterotoxin of Escherichia coli by human milk. J Infect Dis 148 (1983): 1114-1119.

_____________________________________________________________________________

203

157. Clemens, J. B., Stanton, B., Stoll, B., Shahid, N. S., Banu, H., Chowdury, A. K. (1986). Breast-

feeding as a determinant of severity in shigellosis: evidence for protection throughout the first

three years of life in Bangladeshi children. Am J Epidemiol 123 (4): 710-20.

158. Cliver, D. O., Matsui, S. M., Casteel, M. (2006). Infections with viruses and prions. En

“Foodborne infections and intoxications”. 3ª ed. (Rienmann, H. P., Cliver, D. O., eds).

Amsterdam: Elsevier; 367-448.

159. Cohen, J., West, A., Bini, E. J. (2001). Infectious diarrea in human immunodeficiency virus.

Gastroenterol Clin North Am 30 (3): 637-64.

160. Coppa, G. V., Gabrielli, O., Giorgi, P., Catassi, C., Montanari, M., Varaldo PE, Nichols BL.

(1990). Preliminary study of breast feeding and bacterial adhesion to uroepithelial cells. Lancet

335 (8689): 569-71.

161. Coppa, G. V., Gabrielli, O., Pierani, P., Catassi, C., Carlucci, A., Giorgi, P. L. (1993). Changes

in carbohydrate composition in human milk over 4 months of lactation. Pediatrics 91 (3): 637-

41.

162. Coppa, G. V., Pierani, P., Zampini, L., Carloni, I., Carlucci, A., Gabrielli, O. (1999).

Oligosaccharides in human milk during different phases of lactation. Acta Paediatr Suppl 88

(430): 89-94.

163. Coulson, B., and Masendycz, P. J. (1990). Measurement of rotavirus-neutralizing copronatibody

in children by fluorescent focus reduction assay. J of Clin Microbiol 28 (7): 1652-54.

164. Cowden, J. M. (2002). Foodborne infectious risks: do we need a wide system of data collection

and survey? The lessons learned from the study of infectious intestinal disease in England. Rev

Epidemiol Sante Publique 50 (1): 89-92.

165. Crago, S. S., Kulhavy, R., Prince, S. J., Mestecky, J. (1978). Secretory component on epithelial

cells is a surface receptor for polymeric immunoglobulins. J Exp Med 147 (6): 1832-7.

166. Crago, S. S., Prince, S. J., Pretlow, T. G., McGhee, J. R., Mestecky, J. (1979). Human colostral

cells. I. Separation and characterization. Clin Exp Immunol 38 (3): 585-97.

167. Craig, W., Osterholm, H., Osterholm, M. T. (1993). Outbreaks of Food-borne and waterborne

viral gastroenteritis. Clin Microbiol Rev 6 (3): 199-210.

168. Cravioto, A., Tello, A., Villafan, H., Ruiz, J., del Vedovo, S., Neeser, J. R. (1991). Inhibition of

localized adhesión of enteropathogenic Escherichia coli to Hep-2 cells by immunoglobulin and

oligosaccharide fractions of human colostrum and breast milk. J Infect Dis 163 (6): 1247-55

169. Crocker, P. R. (2002). Siglecs: acid sialic-binding immunoglobulin-like lectins in cell-cell

interactions and signaling. Cur Opin Struct Biol 12 (5): 609-15.

170. Cubitt, W. D., Jiang, X. J., Wang, J., Estes, M. K. (1994). Sequence similarity of human

caliciviruses and small round structured viruses. J Med Virol 43 (3): 252-8.

_____________________________________________________________________________

204

171. Cubitt, W. D., McSwiggam, D. A., Moore, W. (1979). Winter vomiting disease caused by

caliciviruses. J Clin Pathol 32 (8): 786-93.

172. Cukor, G., Blacklow, N. R. (1984). Human viral gastroenteritis. Microbiol Rev 48 (2): 157-79.

173. Cukor, G., Nowak, N. A., Blacklow, N. R. (1982). Immunoglobulin M responses to the

Norwalk virus of gastroenteritis. Infect Immun 37 (2): 463-8.

174. Curry, A., Riordan, T., Craske, J., Caul, E. O. (1987). Small round structured viruses and

persistence of infectivity in food handlers. Lancet 2 (8563): 864-5.

175. D´Andamo, P. J., Kelly, G. C. (2001). Metabolic and immunologic consequences of ABH

secretor and Lewis subtype status. Altern Med Rev 6 (4): 390-405.

176. Dai, Y. C., Nie, J., Zhang, X. F., Li, Z. F., Bai, Y., Zeng, Z. R., Yu, S. Y., Farkas, T., Jiang, X..

(2004). Seroprevalence of antibodies against noroviruses among students in a Chinese military

medical university. J Clin Microbiol 42 (10): 4615-9.

177. Dalton, R. M., Roman, E. R., Negredo, A. A., Wilhelmi, I. D., Glass, R. I., Sanchez-Fauquier,

A. (2002). Astrovirus acute gastroenteritis among children in Madrid, Spain. Pediatr Infect Dis

J 21 (11): 1038-41.

178. Das, S. C., Baron, M. D., Skinner, M. A., Barrett, T. (2000). Improved technique for transient

expression and negative strand virus rescue using fowlpox T7 recombinant virus in mammalian

cells. J Virol Methods 89 (1-2): 119-27.

179. Daughenbaugh, K. F., Fraser, C. S., Hershey, J. W. (2003). The genome linked protein VPg of

the Norwalk virus binds IF3, suggesting its role in translation initiation complex recruitment.

EMBO J 22: 2852-59.

180. Davidson, G., Barnes, G., Bass, D., Cohen, M., Fasano, A., Fontaine, O., Guandalini, S. (2002).

Infectious diarrhea in children: Working Group Report of the First World Congress of Pediatric

Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition. J Pediatr Gastroenterol Nutr 35 (2): 143-50.

181. Davidson, L. A., Lönnerdal, B. (1987). The persistence of human milk proteins in the breast-fed

infant. Acta Paediatr Scand 76 (5): 733-40.

182. Davis, M. K., Savitz, D. A., Graubard, B. I. (1988). Infant feeding in childhood cancer. Lancet 2

(8607): 365-8.

183. De Leon, R., Matsui, S. M., Baric, R. S., Herrman, J. E., Blacklow, N. R., Greenberg, H. B.

Sobsey, M. D. (1992). Detection of Norwalk virus in stool specimens by reverse-transcriptase-

polymerase chain reaction and nonreactive oligoprobes. J Clin Microbiol 30 (12): 3151-7.

184. de Rougemont, A. Ruvoen-Clouet, N., Simon, B., Estienney, M., Elie-Callie, C., Aho, S.,

Pothier, P., Le Pendu, J., Boireu, W., Belliot, G. (2011). Qualitative and quantitative analysis of

the binding of GII.4 norovirus variants onto human blood group antigens. J Virol 85 (9): 4057-

70.

_____________________________________________________________________________

205

185. De Wit, M. A., Koopmans, M. P., Kortbeek, L. M., van Leeuwen, N. J., Vinjé, J., van

Duynhoven, Y. T. (2001a). Etiology of gastroenteritis in sentinel general practices in the

Netherlands. Clin Infect Dis 33 (3): 280-8.

186. De Wit, M. A., Koopmans, M. P., Kortbeek, L. M., Wannet, W. J., Vinjé, J., van Leusden, F.,

Bartelds, A. I., van Duynhoven, Y. T. (2001b). Sensor, a population-based cohort study on

gastroenteritis in the Netherlands: incidence and etiology. Am J Epidemiol 154 (7): 666-74.

187. Dennehy, P. H., Nelson, S. M., Spangenberger, S., Noel, J. S., Monroe, S. S., Glass, I. R.

(2001). A prospective case-control study of the role of astrovirus in acute diarrea among

hospitalized young children. J Infect Dis 184 (1): 10-5.

188. Desjeux, J. F., Briend, A., Butzner, J. D. (1997). Oral rehydration solution in the year 2000:

pathophysiology, efficacy and effectiveness. Bailieres Clin Gastroenterol 11 (3): 509-27.

189. Diebold, S. S., Kaisho, T., Hemi, H., Akira, S., Reis e Sousa, C. (2004). Innate antiviral

responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA. Science 303

(5663): 1529-31.

190. Doane, F. W. (1994). Electron microscopy for the detection of gastroenteritis viruses. En “Viral

infections of the gastrointestinal tract”. 2ª ed. (Kapikian, A. Z., ed.). New York: Marcel Dekker,

Inc.; 101-130.

191. Dohlsten, M., Sjögren, H. O., Carlsson, R. (1988). Two subsets of CD4+ T helper cells differing

in kinetics and capacities to produce interleukin 2 and interferon-gamma can be defined by the

Leu-18 and UCHL1 monoclonal antibodies. Eur J Immunol 18 (8): 1173.

192. Dolin, R., Blacklow, N. R., Du Pont, H., Buscho, R. F., Wyatt, R. G., Kasel, J. A., Hornick, R.,

Chanock, R. M. (1972). Biological properties of Norwalk agent of acute infectious nonbacterial

gastroenteritis. Proc Soc Exp Biol Med 140 (2): 578-83.

193. Dolin, R., Blacklow, N. R., Du Pont, H., Formal., S., Bushcko, R. F., Kasel, J. A., Chames, R.

P., Hornick, R., Chanock, R. M. (1971). Transmission of acute infectious nonbacterial

gastroenteritis to volunteers by oral administration of stool filtrates. J Infect Dis 123 (3): 307-

12.

194. Dolin, R., Reichman, R. C., Roessner, K. D., Tralka, T. S., Schooley, R. T., Gary, W., Morens,

D. (1982). Detection by immune electron microscopy of the Snow Mountain agent of acute

viral gastroenteritis. J Infect Dis 146 (2): 184-9.

195. Dolin, R., Roessner, K. D., Treanor, J. J., Reichman, R. C., Phillips, M., Madore, H. P. (1986).

Radioimmunoassay for the detection of the Snow Mountain agent of viral gastroenteritis. J Med

Virol 19 (1): 11-18.

196. Dominguez, A., Torner, N., Ruiz, L., Martinez, A., Barrabeig, I., Camps, N., Godoy, P.,

Minguell, S., Parrón, I., Pumarés, A., Sala, M. R., Bartolomé, R., Pérez, U., de Simón, M.,

_____________________________________________________________________________

206

Montava, R., Buesa, J. (2008). Aetiology and epidemiology of viral gastroenteritis outbreaks in

Catalonia (Spain) in 2004-2005. J Clin Virol 43 (1): 126-31.

197. Donaldson, E. F., Lindesmith, L. C., Lobue, A. D., Baric, R. S. (2008). Norovirus pathogenesis:

mechanisms of persistence and immune evasion in human populations. Immunol Rev 225 (1):

190-211.

198. Donné, A. (1837). Du Lait en particulier de nourrices, consideré sous le rapport de ses bonnes et

de ses mauvaises qualités nutritives et de ses altérations. Paris, Rue de Condé, Nº 15; Les

Libraires de Médecine, Ch. Chevalier, opticien, Palais Royal, Nº 163.

199. Dormitzer, P. R. (2005). Rotavirus. En “Principles and Parctice of Infectious Diseases”. 6ª ed.

(Mandell, G. L., Bennet, J. E., Dolin, R., eds.). Philadelphia: Elsevier; 1902-13.

200. Downham, M. A., Scott, R., Sims, D. G., Webb, J. K., Gradner, P. S. (1976). Breast-feeding

protects against respiratory syncitial virus infections. Br Med J 2 (6030): 274-6.

201. Doyle, A., Barataud, D., Gallay, A., Thillet, J. M., Le Guyaquer, S., Kohli, E., Vaillant, V.

(2004). Norovirus foodborne outbreaks associated with the consumption of oysters from the

Etang de Thau, France. December 2002. Euro Surveill 9 (3): 24-6.

202. Duffy, L. C., Rieppenhoff-Talty, M., Byers, T. E., La Scolea, L. J., Zielezny, M. A., Dryja, D.

M., Ogra, P. L. (1986). Modulation of rotavirus enteritis during breast-feeding. Am J Dis Child

140 (11): 1164-8.

203. Dugdale, A., Lovell, S., Gibbs, V., Ball, D. (1982). Refeeding after acute gastroenteritis: a

controlled study. Arch Dis Child 57 (1): 76-79.

204. Duizer, E., Bijkerk, P., Rockx, B., de Groot, A., Twisk, F., Koopmans, M. (2004a). Inactivation

of caliciviruses. Appl Environ Microbiol 70 (8): 4538-43.

205. Duizer, E., Schab, K. J., Neil, F. H., Atmar, R. L., Koopmans, M. P., Estes, M. K. (2004b).

Laboratory efforts to cultivate noroviruses. J Gen Virol 85 (1): 79-87.

206. Duncan, B. S., Wood, J. (1997). The Evaluation of delayed-type hypersensivity responsiveness

and nutritional status as predictors of gastro-intestinal and acute respiratory infection: a

prospective field study among traditional nomadic Kenyan children. Journal of Tropical

Pediatrics 43 (1): 25-32.

207. Dunham, D. M., Jiang, X., Berke, T., Smith, A. W., Matson, D. O. (1998). Genomic mapping of

a calicivirus VPg. Arch Virol 143 (12): 2421-2430.

208. DuPont, H. L. (1997). Lactobacillus GG in prevention of traveler´s diarrhoea encouraging first

step. J Travel Med 4 (1): 1-2.

209. Egge, H. (1993). The diversity of oligosaccharides in human milk. Renner, B., Sawatzki, G.

(eds). En “New perspectives in infant nutrition”. 1ª ed. Sttutgart: Georg Thiem; 12-26.

_____________________________________________________________________________

207

210. Eibl, M. M., Wolf, H. M., Fürkranz, H., Rosenkranz, A. (1988). Prevention of necrotizing

enterocolitis in low-birth-weight infants by IgG-IgA feeding. N Engl J Med 319 (1): 1-7.

211. Elliot, E. J., Cunha-Ferreira, R., Walker-Smith, J. A., Farthing, M. J. (1989). Sodium

concentration of oral rehydration solutions: a reappraisal. Gut 30 (11): 1610-21.

212. Enab, B., Mogilner, J., Jaffe, M., Shaoul, R. (2002). Acute apendicitis presenting as secretory

diarrea. J Pediatr Surg 37 (6): 928-9.

213. Engelstaedter, V., Fluegel, B., Kunze, S., Mayr, D., Friese, K., Jeschke, U., Bergauer, F. (2012).

Expression of the carbohydrate tumour marker Sialyl Lewis A, Sialyl Lewis X, Lewis Y and

Thomsen-Friedenreich antigen in normal squamous epithelium of the uterine cervix, cervical

dysplasia and cervical cancer. Histol Histopathol 27 (4): 507-14.

214. Engfer, M. B., Stahl, B., Finke, B., Sawattzki, G., Daniel, H. (2000). Human milk

oligosaccharides are resistant to enzymatic hydrolysis in the upper gastrointestinal tract. Am J

Clin Nutr 71 (6): 1589-96.

215. Enserik, M. (2006). Infectious diseases. Gastrointestinal virus strikes European cruise ships.

Science 313 (5788): 747.

216. Erle, D. J., Briskin, M. J., Butcher, E. C., Garcia-Pardo, A., Lazarovits, A. I., Tidswell, M.

(1994). Expression and function of the MAdCAM-1 receptor, integrin alfa 4beta 7, on human

leukocytes. J Immunol 153 (2): 517-28.

217. Erney, R. M., Malone, W. T., Skelding, M. B., Marcon, A. A., Kleman-Leyer, K. M., O'Ryan,

M. L., Ruiz-Palacios, G., Hilty, M. D, (2000). Variability of human milk neutral

oligosaccharides in a diverse population. J Pediatr Gastroenterol Nutr 30 (2): 181-92.

218. Espul, C., Martinez, N., Noel, J. S. (2004). Prevalence and characterization of astroviruses in

Argentinean children with acute gastroenteritis. J Med Virol 72 (1): 75-82.

219. Estes, M. K., Ball, J. M., Guerrero, R. A., Cuello, H., Abrile, C., Grucci, S., Glass, R., Berke,

T., Matson, D. O. (2000). Norwalk virus vaccines: challenges and progress. J Infect Dis 181 (2):

367-73.

220. Evans, M. R., Meldrum, R., Lane, W., Gardner, D., Ribeiro, C. D., Galimore, C. I.,

Westmoreland, D. (2002). An outbreak of viral gastroenteritis following environmental

contamination at a concert hall. Epidemiol Infect 129 (2): 355-60.

221. Faden, H., Ogr, P. L. (1981). Breast milk as an immunologic vehicle for transport of

immunocompetence. En “Textbook of Gastroenterology and Nutrition in infancy”. 1ª ed.

(Lebenthal, E., ed.). New York, Raven Press; 355-61.

222. Fankhauser, R. L., Monroe, S. S., Noel, J. S., Humphrey, C. D., Bresee, J.S., Parashar, U. D.,

Ando, T., Glass, R. I. (2002). Epidemiologic and molecular trends of “Norwalk-like viruses”

associated with outbreaks of gastroenteritis in the United States. J Infect Dis 186 (1): 1-7.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Engelstaedter%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fluegel%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kunze%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mayr%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Friese%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jeschke%20U%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bergauer%20F%22%5BAuthor%5D


_____________________________________________________________________________

208

223. Farkas, T., Jiang, X. I. (2007). Rotaviruses, caliciviruses, astroviruses, enteric adenoviruses, and

other diarrheic viruses. En “Manual of Clinical Microbiology”. 9ª ed. (Murray, P. R., Baron, E.

J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A., eds.). Washington: ASM Press; 999-1004.

224. Farkas, T., Nakajima, S., Sugieda, M., Deng, X., Zhong, W., Jiang, X. (2005). Seroprevalence

of Norovirus in Swine. J Clin Microbiol 43 (2): 657-61.

225. Farkas, T., Thornton, S. A., Wilton, N., Zhong, W., Altaye, M., Jiang, X. (2003). Homologous

versus heterologous immune responses to Norwalk-like viruses among crew members after

acute gastroenteritis outbreaks on 2 US navy vessels. J Infect Dis 187 (2): 187-93.

226. Farthing, M. J. (1999). Enkephalinase inhibition: a rational approach to antisecretory therapy

for acute diarrhoea. Aliment Pharmacol Ther 13 (6): 1-2.

227. Fauveau, V., Yunnus, M., Zaman, K., Chakraborty, J., Sarder, A. M. (1991). Diarrea mortality in

rural Bangladeshi children. J Trop Pediatr 37 (1): 31-6.

228. Federación Nacional de donantes de sangre. Disponible en URL: <www.donantes.net>. [Acceso

30 marzo, 2012].

229. Ferrer-Admetlla, A., Sikora, M., Laayouni, H., Esteve, A., Roubinet, F., Blancher, A., Calafell,

F., Bertranpetit, J., Casals, F. (2009). A natural history of FUT2 polymorphism in humans. Mol

Biol Evol 26 (9): 1993-2003.

230. Field, M., Rao, M. C., Chang, E. B. (1989). Intestinal electrolyte transport and diarrheal disease.

N Engl J Med 321 (13): 879-83.

231. Fishaut, M., Murphy, D., Neifert, M., McIntosh, K., Ogra, P. L. (1981). Broncho-mammary axis

in the immune response to respiratory syncitial virus. J Pediatr 99 (2): 186-91.

232. Flewett, T. H., Davies, H. (1976). Caliviruses in man. Lancet 1 (7954): 311.

233. Flynn, W. T., Saif, L. J. (1988a). Serial propagation of porcin enteric calicivirus-like virus in

primary porcine kidney cell cultures. J Clin Microbiol 26 (2): 206-12.

234. Flynn, W. T., Saif, L. J., Moorhead, P. D. (1988b). Pathogenesis of porcine enteric calicivirus-

like virus in four-day gnotobiotic pigs. Am J Vet Res 49 (6): 819-25.

235. Fomon, S. J., ed. (1995). Leche humana y lactancia materna. En “Nutrición del Lactante”. 1ª ed.

Mosby, Madrid; 400-414.

236. Forsberg, B. C., Petzold, M.G., Tomson, G., Allebeck, P. (2007). Diarrhoea case management in

low- and middle-income countries: an unfinished agenda. Bull World Health Organisation 85

(1): 42-8.

237. Forthal, D. N., Landucci, G. (1998). In vitro reduction of virus infectivity by antibody-

dependent cell-mediated immunity. J Immunol Meth 220: 129-38.

http://www.donantes.net/

_____________________________________________________________________________

209

238. Forthal, D. N., Landucci, G., Daar, E. S. (2001). Antibody from patients with acute human

immunodeficiency virus (HIV) infection inhibits primary strains of HIV type 1 in the presenc of

natural-killer effector cells. J Virol 75 (15): 6953-61.

239. Fransson, G. B., Lonnerdal, B. (1980). Iron in human milk. J Pediatr 96 (1980): 380.

240. Fretz, R., Svoboda, P., Schorr, D., Tanner, M., Baumgartner, A. (2005). Risk factors for

infections with Norovirus gastrointestinal illness in Switzerland. Eur J Clin Microbiol Infect Dis

24 (4): 256-61.

241. Friss, H. E., Rubin, L. G., Carsons, S., Baranowski, J., Lipsitz, P. J. (1988). Plasma fibronectin

concentrations in breast fed and formula fed neonates. Arch Dis Child 63 (5): 528-32.

242. Fujita, T., Onoguchi, K., Onomoto, K., Hirai, R., Yoneyama, M. (2007). Triggering antiviral

response by RIG-I-related RNA helicases. Biochemie 89 (6-7): 754-60.

243. Fukumi, H., Nakaya, R., Hatta, S., Noriki, H., Yunoki, H., Akagi, K., Saito, T., Uchiyama, K.,

Kobari, K., Nakanishi, R. (1957). An indication to identity between the infectious diarrea in

Japan and the afebrile infectious nonbacterial gastroenteritis by human volunteer experiments.

Jpn J Med Sci Biol 10 (1): 1-17.

244. Furmanski, P., Li, Z. P., Fortuna, M. B., Swamy, C. V., Das, M. R. (1989). Multiple molecular

forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrin that possesses ribonuclease

activity and lacks iron binding capacity. J Exp Med 170 (2): 415-29.

245. Furukawa, M., Narahara, H., Yasuda, K., Johnston, J. M. (1993). Presence of platelet activating

factor-acetyl-hydrolase in milk. J Lipid Res 34 (9): 1603-9.

246. Galera Castilho, J., Munford, V, Reis Resque, H., Fagundes-Neto, U., Vinjé, J., Rácz, M. L.

(2006). Genetic diversity of norovirus among children with gastroenteritis in Sao Paulo State,

Brasil. J Clin Microbiol 44 (11): 3947-53.

247. Gallimore, C. I., Cubitt, D., du Plessis, N., Gray, J. J. (2004). Asymptomatic and symptomatic

excretion of noroviruses during a hospital outbreak of gastroenteritis. J Clin Microbiol 42 (5):

2271-4.

248. Gallimore, C. I., Iturriza-Gomara, M., Xerry, J., Adigwe, J., Gray, J. J. (2007). Inter-seasonal

diversity of norovirus genotypes: emergence and selection of virus variants. Arch Virol 152 (7):

1295-303.

249. Garcia, M. A., Meurs, E. F., Esteban, M. (2007). The dsRNA protein kinase PKR: virus and cell

control. Biochimie 89 (6-7): 799-811.

250. Garofalo, R., Chheda, S., Mei, F., Palkowetz, K. H., Rudloff, H. E., Schmalstieg, F. C., Rassin,

D. K., Goldman, A. S. (1995). Interleukin-10 in human milk. Pediatr Res 37 (4): 444-9.

251. Gaulin, C., Frigon, M., Poirier, D., Fournier, C. (1999). Transmission of calicivirus by a food

handler in the pre-symptomatic phase of illness. Epidemiol Infect 123(3): 475-8.

_____________________________________________________________________________

210

252. Geme, J. W., Hodes, H. L., Marcy, S. M., Pickering, L. K., Rodriguez, W. J., MacCraken, G. H.

Jr., Nelson, J. D. (1988). Consensus management of Salmonella infection in the first year of life.

Pediatr Infect Dis J 7 (9): 615-21.

253. Gerrard, J. W., MacKenzie, J. W., Goluboff, N., Garson, J. Z., Maningas, C. S. (1973). Cow´s

milk allergy: prevalence and manifestations in an unselected series of newborns. Acta Paediatr

Scand 234: 1-21.

254. Gilbert, J. V., Plaut, A. G., Longmaid, B., Lamm, M. E. (1983). Inhibition of bacterial IgA

proteases by human secretory IgA and serum. Ann NY Acad Sci 409: 625-36.

255. Gill, B.D., Indyk, H.E. (2007). Determination of nucleotides and nucleosides in milk and

pediatric formulas: a review. J AOAC Int 90(5): 1354-64.

256. Gillin, F. D., Reiner, D. S., Gault, M. J. (1985). Cholate-dependent killing of Giardia lamblia by

human milk. Infect Immun 47 (3): 619-22.

257. Gilmore, H. S. (1994). Human milk contains granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF).

Eur J Clin Nutr 48: 222-224.

258. Glass, P. J., White, L. J., Ball, J. M., Leparc-Goffart, I., Hardy, M. E., Estes, M. K. (2000).

Norwalk virus ORF3 encodes a minor structural protein. J Virol 74 (14): 6581-91.

259. Glass, P. J., Zeng, C. Q., Estes, M. K. (2003). Two non-overlapping domains on the Norwalk

virus open Reading frame 3 (ORF3) protein are involved in the formation of the phosphorylated

35K protein and in ORF3-capsid protein interactions. J Virol 77 (6): 3569-77.

260. Glass, R. I., Breese, J. S., Parashar, U., Miller, M., Gentsch, J. R. (1997). Rotavirus vaccines at

the threeshold. Nat Med 3 (12): 1324-5.

261. Glass, R. I., Lew, J. F., Gangarosa, R. E., Le Baron, C. W., Ho, M. S. (1991). Estimates of

morbidity and mortality rates for diarrheal diseases in American children. J Pediatr 118 (4-2):

27-33.

262. Glass, R. I., Noel, J., Ando, T., Fankhauser, R., Belliot, G., Mounts, A., Parashar, U. D., Breese,

J. S., Monroe, S. S.(2000). The epidemiology of enteric caliciviruses from humans: a

reassessment using new diagnostics. J Infect Dis 181 (2): 254-61.

263. Glass, R. I., Noel, J., Mitchell, D., Herrmann, J. E., Blacklow, N. R., Pickering, L. K., Denehy,

P., Ruiz-Palacios, G, de Guerrero, M. L., Monroe, S. S. (1996). The changing epidemiology of

astrovirus-associated enteritis: a review. Arch Virol Suppl 12: 287-300.

264. Glass, R. I., Stoll, B. J. (1989). The protective effect of human milk against diarrhea: a review

of studies from Bangladesh. Acta Paediatr Scand 351: 131-6.

265. Glass, R. I., Svennerholm, A. M., Stoll, B. J., Khan, M. R., Hossain, K. M., Huq, M. I.,

Holmgren, J. (1983). Protection against cholera in breast-fed children by antibodies in breast

milk. N Engl J Med 308 (23): 1389-92.

_____________________________________________________________________________

211

266. Glass, R., Breese, J., Parashar, U. (1997). Rotavirus vacines at the threeshold. Nat Med 3 (12):

1324-5.

267. Gnoth, M. J., Kunz, C., Kinne-Saffran, E., Rudloff, S. (2000). Human milk oligosaccharides are

minimally digested in vitro. J Nutr 130 (12): 3014-20.

268. Gnoth, M. J., Rudloff, S., Kunz, C., Kinne, R. K. (2001). Investigations of the in vitro transport

of human milk oligosaccharides by a Caco-2 monolayer using a novel high performance liquid

chromatography-mass spectrometry technique. J Biol Chem 276 (37): 34363-70.

269. Goldblum, R. M., Ahlstedt, S., Carlsson, B., Hanson, L. A., Jodal, U., Lidin-Janson, G., Sohl-

Akerlund, A. (1975). Antibody forming cells in human colostrum after oral immunisation.

Nature 257 (5529): 797-8.

270. Goldblum, R. M., Goldman, A. S., Garza, C., Johnson, C. A., Nichols, B. L. (1982). Human

milk banking II. Relative stability of immunologic factors in stored colostrum. Acta Paediatr

Scand 71 (1): 143-4.

271. Goldblum, R. M., Schanler, R. J., Garza, C., Goldman, A. S. (1989). Human milk feeding

enhances the urinary excretion of immunologic factors in low birth weight infants. Pediatr Res

25 (2): 184-8.

272. Golding, J., Emmett, P. M., Rogers, I. S. (1997). Gastroenteritis, diarrhoea and breast feeding.

Early Hum Dev 29 (49): 83-103.

273. Goldman, A. S., Garza, C., Nichols, B. L., Goldblum, R. M. (1982). Immunologic factors in

human milk during the first year of lactation. J Pediatr 100 (4): 563-7.

274. Goldman, A. S., Garza, C., Nichols, B., Johnson, C. A., Smith, E. O. (1982). Effects of

prematurity upon the immunologic system in human milk. J Pediatr 101 (6): 901-5.

275. Goldman, A. S., Garza, C., Schanler, R. J., Goldblum, R. M. (1990). Molecular forms of

lactoferrin in stool and urine from infants fed human milk. Pediatr Res 27 (3): 252-5.

276. Goldman, A. S., Glodblum, R, M. (1989). Immunoglobulins in human milk. En “Protein and

Non-protein Nitrogen in Human Milk”. 1ª ed. (Atkinson, S. A., Lonnerdal, B., eds.). Boca

Raton, Florida, CRC Press; 43-51.

277. Goldman, A. S., Goldblum, R. M. (1985). Protective properties of human milk. En “Nutrition in

Pediatrics, basic science and clinical application”. 1ª ed. (Walker, W. A., Watkins, J. B., eds.).

Boston, Little Brown; 819-28.

278. Goldman, A. S., Goldblum, R. M., Garza, C. (1983). Immunologic components in human milk

during the second year of lactation. Acta Paediatr Scand 72 (3): 461-2.

279. Goldman, A. S., Smith, C. W. (1973). Host resistance factors in human milk. J Pediatr 82 (6):

1082-90.

_____________________________________________________________________________

212

280. Goller, J. L., Dimitriadis, A., Tan, A., Kelly, H., Marshall JA. (2004). Long-term features of

norovirus gastroenteritis in the elderly. J Hosp Infect 58 (4): 286-91.

281. Gomes, K. A., Stupka, J. A., Gomez, J., Parra, G. I. (2007). Molecular characterization of

calicivirus strains detected in outbreaks of gastroenteritis in Argentina. J Med Virol 79 (11):

1703-9.

282. Goodfellow, I., Chaudry, Y., Gioldasi, I., Gerondopoulos, A., Natoni, A., Labrie, L., Laliberté,

J. F., Roberts, L. (2005). Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg

and IF4. EMBO Rep 6 (10): 969-972.

283. Goodgame, R. (2006). Norovirus gastroenteritis. Curr Gastroenterol Rep 8 (5): 401-8.

284. Gordon, I., Ingraham, H. S., Korns, R. F. (1947). Transmission of epidemic gastroenteritis to

human volunteers by oral administration of fecal filtrates. J Exp Med 86 (5): 409-22.

285. Gotz, H., de Jong, B., Lindbäck, J., Parment, P. A., Hedlund, K.O., Torvén, M., Ekdal, K.

(2002). Epidemiological investigation of a food-borne gastroenteritis outbreak caused by

Norwalk-like virus in 30 day-care centres. Scand J Infect Dis 34 (2): 115-21.

286. Gracey, M., Culity, G. J., Suharjono, S. (1977). The stomach in malnutrition. Arch Dis Child 52

(4): 325-7.

287. Gracey, M., Stone, D. E. (1972). Small intestinal microflora in Australian aboriginal with

chronic diarrhea. Aust N Z J Med 2 (3): 215-9.

288. Graham, D. Y., Jiang, X., Tanaka, T., Opekun, A. R., Madore, H. P., Estes, M. K. (1994).

Norwalk virus infection of volunteers: new insights based on improved assays. J Infect Dis 170

(1): 34-43.

289. Gray, J. J., Jiang, X., Morgan-Capner, P., Desselberger, U., Estes, M. K. (1993). Prevalence of

antibodies to Norwalk virus in England: detection by enzyme-linked immunosorbent assay

using baculovirus-expressed Norwalk virus capsid antigen. (1993). J Clin Microbiol 31 (4):

1022-5.

290. Gray, J. J., Kohli, E., Ruggeri, F. M., Vennema, H., Sanchez-Fauquier, A., Schreier, E.,

Gallimore, C. I., Iturriza-Gomara, M., Giraudon, H., Pothier, P., di Bartoli, I., Inglese, N., de

Bruin, E., van der Beer, V., Moreno, S., Montero, V., de Llano, M. C., Höhne, M., Diedrich, S.

M. (2007). European multicenter evaluation of comercial enzyme immunoassays for detecting

norovirus antigens in fecal samples. Clin Vaccine Immunol 14 (10): 1349-55.

291. Green, . Y. (2007). Caliciviridae: The noroviruses. En “Fields irology”. 5ª ed. (Knipe, D. M.,

Howley, P. M., eds.). Philadelphia: Wolters Kluwer/Lippincott Williams&Wilkins; 949-79.

292. Green, J., Gallimore, C. I., Norcott, J. P., Lewis, D., Brown, D. W. G., Lees, D. N. (1995).

Broadly reactive reverse transcriptase polymerase chain reaction in the diagnosis of SRSV-

associated gastroenteritis. J Med Virol 47: 392-8.

_____________________________________________________________________________

213

293. Green, J., Gallimore, C. I., Shore, J., Sellwood, J., Brown, D. W. (2004). Application of the

heteroduplex mobility assay (HMA) for the investigation of the genomic diversity among

noroviruses in environmental samples. J Virol Methods 120 (1): 59-67.

294. Green, J., Hensilwood, K., Gallimore, C. I., Brown, D. G. W., Lees, N. (1998). A nested reverse

transcriptase PCR assay for detection of small-round structured viruses in environmentally

contaminated molluscan shellfish. Applied and Environment Microbiol 1: 858-63.

295. Green, J., Vinje, J., Gallimore, C. I., Koopmans, M., Hale, A., Brown, D. W., Cleqq, J. C.,

Chamberlain, J. (2000). Capsid protein diversity among Norwalk-like viruses. Virus Genes 20

(3): 227-36.

296. Green, J., Wright, P. A., Gallimore, C. I., Mitchell, O., Morgan-Capner, P., Brown, D. W.

(1998). The role of environmental contamination of small round structured viruses in a hospital

outbreak investigated by reverse-transcriptase polymerase chain reaction assay. J Hosp Infect

39 (1): 39-45.

297. Green, K. Y., Belliot, G., Taylor, J. L., Valdesuso, J., Lew, J. F., Kapikian, A. Z., Lin, F. Y.

(2002). A predominant role for Norwalk-like viruses as agents of epidemic gastroenteritis in

Maryland nursing homes for the elderly. J Infect Dis 185 (2): 133-46.

298. Green, K. Y., Lew, J. F., Jiang, X., Kapikian, A. Z., Estes, M. K. (1993). Comparison of the

reactivities of baculovirus-expressed recombinant Norwalk virus capsid antigen with those of

the native Norwalk virus antigen in serologic assays and some epidemiological observations. J

Clin Microbiol 31 (8): 2185-91.

299. Green, S. M., Lambden, P. R., Caul, E. O., Clarke, I. N. (1997). Capsid sequence diversity in

small round structured viruses from recent UK outbreaks of gastroenteritis. J Med Virol 52 (1):

14-19.

300. Greenberg, H. B., Kapikian, A. Z. (1978a). Detection of Norwalk agent antibody and antigen by

solid-phase radioimmunoassay and immune adherence hemagglutination assay. J Am Vet Med

Assoc 173 (3-2): 620-3.

301. Greenberg, H. B., Matsui, S. M. (1992). Astroviruses and Caliciviruses: emerging enteric

pathogens. Infect Agents Dis 1 (2): 71-91.

302. Greenberg, H. B., Valdesuso, J. R., Kalica, A. R., Wyatt, R. G., McAuliffe, V. J., Kapikian, A.

Z., Chanock, R. M. (1981). Proteins of Norwalk virus. J Virol 37 (3): 994-99.

303. Greenberg, H. B., Valdesuso, J., Kapikian, A. Z., Chanock, R. M., Wyatt, R. G., Szmuness, W.,

Larrick, J., Kaplan, J., Gilman, R. H., Sack, D. A. (1979). Prevalence of antibody to the

Norwalk virus in various countries. Infect Immun 26 (1): 270-3.

304. Greenberg, H. B., Valdesuso, J., Yolken, R. H., Gangarosa, E., Gary, W., Wyatt, R. G., Konno,

T., Suzuki, H., Channock, R. M., Kapikian, A. Z. (1979). Role of Norwalk virus in outbreaks of

nonbacterial gastroenteritis. J Infect Dis 139 (5): 564-8.

_____________________________________________________________________________

214

305. Greenberg, H. B., Wyatt, R. G., Kalica, A. R. (1981). New insights in viral gastroenteritis. En

“Perspectives in Virology XI”. (Pollard, M., ed.). 1ª ed. New York: Alan R. Liss; 163-87.

306. Greenberg, H. B., Wyatt, R. G., Kapikian, A. Z. (1979). Norwalk virus in vomitus. Lancet 1

(8106): 55.

307. Greenberg, H. B., Wyatt, R. G., Valdesuso, J., Kalica, A. R., London, W. T., Chanock, R. M.,

Kapikian, A. Z. (1978b). Solid-phase microtiter radioimmunoassay for detection of the Norwalk

strain of acute nonbacterial, epidemic gastroenteritis virus and its antibodies. J Med Virol 2 (2):

97-108.

308. Grohmann, G., Glass, R. I., Gold, J., James, M., Edwards, P., Borg, T., Stine, S. E., Goldsmith,

C., Monroe, S. S. (1991). Outbreak of human calicivirus gastroenteritis in a day care center in

Sydney, Australia. J Clin Microbiol 29 (3): 544-50.

309. Grollman, E. F., Kobata, A., Ginsburg, V. (1969). An enzymatic basis for Lewis blood types in

man. J Clin Invest 48 (8): 1489-94.

310. Grönberg, G., Lipniunas, P., Lundgren, T., Lindh, F., Nilsson, B. (1992). Structural analysis of

five monosialylated oligosaccharides from human milk. Arch Biochem Biophys 296 (2): 597-

610.

311. Grosvenor, C. E., Picciano, M. F., Baumrucker, C. R. (1993). Hormones and growth factors in

human milk. Endocr Rev 14 (6): 710-28.

312. Grulee, C. G., Sanford, H. N., Swarchtz, H. (1934). Breast and artificially-fed infants. A study

of the age incidence in the morbidity and mortality in twenty thousand cases. JAMA 103 (1934):

735-8.

313. Grupo de Vigilancia Epidemiológica y Diagnóstico de Norovirus. (2004). Brotes de

gastroenteritis por norovirus en España 1999-2002. Bol Epidemiol Sem 12: 1-4.

314. Grupo de Vigilancia Epidemiológica y Diagnóstico de Norovirus. (2005). Brotes de

gastroenteritis por norovirus en España, 2003. Bol Epidemiol Sem 13: 241-52.

315. Guandalini, S. (2004). Acte diarrea. En “Pediatric Gastrointestinal Disease” 4ª ed. Hamilton.

(Walker, W. A., Goulet, O., Kleinman, R. E., Sherman, P. M., Schneider, B. L., Sanderson, I. R.,

eds.). Hamilton, Ontario: BC Decker; 166-79.

316. Guandalini, S., Gupta, P., eds. (2002). The role of probiotics in gastrointestinal disorders in

infancy and childhood. En “Infant formula: closer to the reference”. 1ª ed. Philadelphia:

Lippincott Williams& Wilkins; 29-45.

317. Guandalini, S., Mazzarella, G., Fontana, M. (1988). Childhood acute diarrhoea in Italy. Pediatr

Res 24: 414.

_____________________________________________________________________________

215

318. Guandalini, S., Migiavacca, M., de Campora, E., Rubino, A. (1982). Cyclic guanosine

monophosphate effects on nutrients and electrolyte transport in rabbit ileum. Gastroenterology

83 (1-1): 15-21.

319. Guandalini, S., Pensabene, L., Zikri, M. A., Dias, J. A., Casali, L. G., Hoekstra, H., Holacek, S.,

Massar, K., Micetic-Turk, D., Papadopoulou, A., de Sousa, J. S., Sandhu, B., Szajewska, H.,

Weizman, Z. (2000). Lactobacillus GG administered in oral rehydration solution to children

with acute diarrea: a multicenter European trial. J Pediatr Gastroenterol Nutr 30 (1): 54-60.

320. Guarino, A., Albano, F., Askenazi, S., Gendrel, D., Hoekstra, J. H., Shamir, R., Szajewska, H.

(2008). European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition/European

Society for Pediatric Infectious Diseases. Evidence-based guidelines for the management of

acute gastroenteritis in children in Europe. J Ped Gastroenterol Nutr 46 (2): 81-122.

321. Guarino, A., Alessio, M., Tarallo, L., Fontana, M., Iacono, G., Gobio Casali, L., Guandalini, S.

(1989). Heat-stable enterotoxin produced by Escherichia coli in acute diarrea. Arch Dis Child

64 (6): 808-13.

322. Guarino, A., Canani, N. B., Spagnuolo, M. I., Albano, F., di Benedetto, L. (1997). Oral bacterial

therapy reduces the duration of symptoms and of viral excretion in children with mild diarrhoea.

J Pediatr Gastroenterol Nutr 25 (5): 516-9.

323. Guarner, F., Schaafsma, G. J. (1998). Probiotics. Int J Food Microbiol 39: 237-8.

324. Guerrant, D. I., Moore, S. R., Lima, A. A. M., Patrick, P., Schorling, J. B., Guerrant, R. L.

(1999a). Association of early childhood diarrhea and cryptosporidiosis with impaired physical

fitness and cognitive function four-seven years later in a poor urban community in Northeast

Brazil. Am J of Trop Med Hyg 61 (5): 707-13.

325. Guerrant, R. L., Hughes, J. M., Lima, N. L., Crane, J. (1990). Diarrhea in developed and

developing countries: magnitude, special settings, and etiologies. Rev Infect Dis 12 (1): 41-50.

326. Guerrant, R. L., Steiner, T. S., Lima, A. A., Bobak, D. A. (1999b). How intestinal bacteria cause

disease. J Infect Dis 179 (2): 331-7.

327. Guix, S., Anasaka, M., Katayama, K., Crawford, S. E., Neill, F. H., Atmat, R. L., Estes, M. K.

(2007). Norwalk virus RNA is infectious in mammalian cells. J Virol 81 (22): 12238-48.

328. Guix, S., Caballero, S., Villena, C., Bartolomé, R., Latorre, C., Rabella, N., Simó, M., Bosch,

A., Pintó, R. M. (2002). Molecular epidemiology of astrovirus infection in Barcelona, Spain. J

of Clin Microbiol 40 (1): 133-9.

329. Gunson, R. N., Carman, W. F. (2005). Comparison of two real-time PCR methods for diagnosis

of norovirus infection in otbreak and community settings. J Clin Microbiol 43 (4): 2030-1.

_____________________________________________________________________________

216

330. Guntapong, R., Hansman, G. S., Oka, T., Ogawa, S., Kageyama, T., Pongsuwanna, Y.,

Katayama, K. (2004). Norovirus and sapovirus infections in Thailand. Jpn J Infect Dis 57 (6):

276-8.

331. Gustafsson, L., Boiers, C., Hallgren, O., Mossberg, A. K., Petterson, J., Fischer, W., Aronson,

A., Svanborg, C. (2005). HAMLET kills tumor cells by apoptosis: structure, cellular

mechanisms, and therapy. J Nutr 135 (5): 1301-5.

332. Gutierrez-Escolano, A. L., Brito, Z. U., del Angel, R. M., Jiang, X. (2000). Interaction of

cellular proteins with the 5´end of Norwalk virus genomic RNA. J Virol 74 (18): 8558-62.

333. Gutierrez-Escolano, A. L., Vazquez-Ochoa, M., Escobar-Herrera, J., Hernandez-Acosta, J.

(2003). PTB, and PAB proteins bind to the 3(‘)

untranslated región of Norwalk virus genomic

RNA. Biochem Biophys Res Commun 311 (3): 759-66.

334. Gyorgy, P., Jeanloz, R. W., von Nicolai, H., Zilliken, F. (1974). Undialyzable growth factors for

lactobacillus bifidus var. pennsilvanicus. Protective effect of sialic acid bound to glycoproteins

and oligosaccharides against bacterial degradation. Eur J Biochem 43 (1): 29-33.

335. György, P., Norris, R. F., Rose, C. S. (1954). Bifidus factor I. A variant of Lactobacillus bifidus

requiring a special growth factor. Arch Biochem Biophys 48 (1): 193-201.

336. Häfliger, D., Gilgen, M., Lüthy, J., Hübner, P. (1997). Semineted RT-PCR systems for small

round structured viruses and detection of enteric viruses in seafood. Int J Food Microbiol 37

(1): 27-36.

337. Hahn, S., Kim, Y., Garner, P. (2001). Reduced osmolarity oral rehydration solution for treating

dehydration due to diarrhoea in children: systematic review. BMJ 323: 81-5.

338. Hahn-Zoric, M., Carlsson, B., Jeansson, S., Ekre, H. P., Osterhaus, A. D., Roberton, D.,

Hanson, L. A. (1993). Anti-idiotypic antibodies to polio virus in comercial immunoglobulins

preparations, human serum, and milk. Pediatr Res 33 (5): 475-80.

339. Hale, A. D., Crawford, S. E., Ciarlet, M., Green, J., Gallimore, C. I., Brown, D. W. G., Jiang,

X., Estes, M. K. (1999). Expression and self-assembly of Grimsby virus: antigenic distinction

from Norwalk and Mexico viruses. Clin Diagn Lab Immunol 6 (1): 142-6.

340. Hale, A. D., Lewis, D. C., Jiang, X., Brown, D. W. (1998). Homotypic and heterotypic response

by Ig G and Ig M after Norovirus infection. J Med Virol 54 (4): 305-12.

341. Hale, A. D., Tanaka, T. N., Kitamoto, N., Ciarlet, M., Jiang, X., Takeda, N., Brown, D. W.,

Estes, M. K. (2000). Identification of an epitope common to genogroup 1 “Norwalk-like

viruses”. J Clin Microbiol 38 (4): 1656-60.

342. Haltalin, K. C., Nelson, J. D., Ring, R., Sladoje, M., Hinton, L. V. (1967). Double-blind

treatment study of shigellosis comparing ampicilin, sulfadiazine, and placebo. J Pediatr 70 (6):

970-81.

_____________________________________________________________________________

217

343. Hamano, M., Kuzuya, M., Fujii, R., Ogura, H., Yamada, M. (2005). Epidemiology of acute

gastroenteritis outbreaks caused by noroviruses in Okayama, Japan. J Med Virol 77 (2): 282-9.

344. Hamosh, M., Bitman, J., Wood, L., Hamosh, P., Mehta, N. R. (1985). Lipids in milk in the first

steps in their digestion. Pediatrics 75 (1-2): 146-50.

345. Hamosh, M., ed. (1991). En “Infant Outcomes. Nutrition during lactation”. 1ª ed. Washington

D. C., National Academy Press: 153-96.

346. Han, M. G., Cheetham, S., Azevedo, M., Thomas, C., Saif, L. J. (2006). Immune responses to

bovine norovirus-like particles with various adjuvants and analysis of protection in gnotobiotic

calves. Vaccine 24 (3): 317-26.

347. Hansman, G. S., Natori, K., Shirato-Horikoshi, H., Ogawa, S., Oka, T., Katayama, K., Tanaka,

T., Miyoshi, T., Sakae, K., Kobayashi, S., Shinohara, M., Uchida, K., Sakurai, N., Shinozaki,

N., Okada, M., Seto, Y., Kamata, Y., Nagata, N., Tanaka, K., Miyamura, T., Takeda, N. (2006).

Genetic and antigenic diversity among noroviruses. J Gen Virol 87 (4): 909-19.

348. Hanson, L. A. (1961). Comparative immunological studies of the immune globulins of human

milk and blood serum. Int Arch Allergy Immunol 18: 241-67.

349. Hanson, L. A., Adlerbert, I., Carlson, B. (1989). Immunology of breast-feeding. En: “Nutrition

in preventive pediatrics”. 1ª ed. (Di Toro, R., ed.). Basilea, Karger, 22: 10-9.

350. Hanson, L. A., Jalil, F., Ashraf, R., Bernini, S., Carlsson, B., Cruz, J. R., Gonzalez, T., Hahn-

Zoric, M., Mellandre, L., Minoli, Y., Moro, G., Nave, F., Zaman, S., Mata, L., Karlberg, J.,

Lindbland, B. S. (1991). Characteristics of human milk antibodies and their effects in relation to

the epidemiology of breastfeeding and infections in a developing country. Adv Exp Med Biol

310: 1-15.

351. Hanson, L. A., Johansson, B. G. (1962). Immunological characterization of

chromatographically separated protein fractions from human colostrums. Int Arch Allergy

Immunol 20: 65-79.

352. Hara, T., Irie, K., Saito, S., Ichijo, M., Yamada, M., Yanai, N., Miyazaki, S. (1995).

Identification of macrophage colony-stimulating factor in human milk and mammary epithelial

cells. Pediatr Res 37 (4-1): 437-43.

353. Hardy, M. E. (2005). Norovirus protein structure and function. FEMS Microbiol Letters 253

(1): 1-8.

354. Hardy, M. E., Tanaka, T. N., Kitamoto, N., White, L. J., Ball, J. M., Jiang, X., Estes, M. K.

(1996). Antigenic mapping of the recombinant Norwalk virus capsid protein using monoclonal

antibodies. Virology 217 (1): 252-61.

355. Hardy, S. B., ed. (1999). En “Mother Nature”. 1ª ed. New York: Random House.

_____________________________________________________________________________

218

356. Harlow, E. y Lane, D.,eds. (1998). “Antibodies: a Laboratory Manual”. 1ª ed. Cold Spring

Harbor Laboratory, New York.

357. Harrington, P. R., Lindesmith, L., Yount, B., Moe, C. L., Baric, R. S. (2002). Binding of

Norwalk virus-like particles to ABH histo-blood group antigen is blocked by antisera from

infected human volunteers or experimentally vaccinated mice. J Virol 76 (23): 12335-43.

358. Harrington, P. R., Vinjé, J., Moe, C. L., Baric, R. S. (2004). Norovirus capture with histo-blood

group antigens reveals novel virus-ligand interactions. J Virol 78 (6): 3035-45.

359. Hayward, A. R., Lee, J., Beverley, P. C. L. (1989). Ontogeny of expression of UCHL1 antigen

on TcR-1+ (CD4/8) and TcRᵟ+ T cells. Eur J Immunol 19 (4): 771-3.

360. Head, J. R., Beer, A. E., Billingham, R. E. (1977). Significance of the cellullar component of

the maternal immunologic endowment in milk. Transplant Proc 9 (2): 1465-71.

361. Hedberg, C. W., Osterholm, M. T. (1993). Outbreaks of food-borne and waterborne viral

gastroenteritis. Clin Microbiol Rev 6 (3): 199-210.

362. Heil, F., Hemmi, H., Hochrein, H., Ampenberger, F., Kirschning, C., Akira, S., Lipford, G.,

Wagner, H., Bauer, S. (2004). Species-specific recognition of single-stranded RNA via Toll-like

receptor 7 and 8. Science 303 (5663): 1526-9.

363. Heird, W. C., Schwarz, S. M., Hansen, I. H. (1984). Colostrum-induced enteric mucosal growth

in beagle puppies. Pediatr Res 18: 512-5.

364. Hemmi, H., Takeuchi, O., Kawai, T., Kaisho, T., Sato, S., Sanjo, H., Matsumoto, M., Hoshino,

K., Wagner, H., Takeda, K., Akira, S. (2000). A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA.

Nature 408 (6813): 740-5.

365. Herbert, T. P., Brierly, I., Brown, T. D. (1996). Detection of the ORF3 polypeptide of the feline

calicivirus in infected cells and evidence for its expression from a single, functionally,

bicistronic, subgenomic mRNA. J Gen Virol 77 (1): 123-27.

366. Herbert, T. P., Brierly, I., Brown, T. D. (1997). Identification of a protein linked to the genomic

and subgenomic mRNAs of a feline calicivirus and its role in translation. J Gen Virol 78 (5):

1033-1040.

367. Herbst-Kralovetz, M., Mason, H. S., Chen, Q. (2010). Norwalk virus-like particles as vaccines.

Expert Rev Vaccines 9 (3): 299-307.

368. Hermann, J. E., Blacklow, N. R., Perron, H. D., Clements, E., Taylor, D. N., Echeverria, P.

(1988). Incidence of enteric adenoviruses among children in Thailand and the significance of

these viruses in enteritis. J Clin Microbiol 26 (9): 1783-6.

369. Hermann, J. E., Nowak, N. A., Blacklow, N. R. (1985). Detection of Norwalk virus in stools by

enzyme immunoassay. J Med Virol 17 (2): 127-133.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Herbst-Kralovetz%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mason%20HS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chen%20Q%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

219

370. Herrman, J. E., Blacklow, N. R., Matsui, S. M., Lewis, T. L., Estes, M. K., Ball, J. M., Brinker,

J. P. (1995). Monoclonal antibodies for detection of Norwalk virus antigen in stools. J Clin

Microbiol 33 (9): 2511-3.

371. Hi, E., Kolakowski, P., Singer, C., Smith, M. (1997). Efficacy of Lactobacillus GG as a

diarrhoeal preventive in travelers. J Travel Med 4 (1): 41-3.

372. Hines,K.L.,Kulkarni, A. B., McCarthy, J. B., Tian, H.,Ward, Jerrold M.; Christ, M., McCartney-

Francis, N. L., Furcht, L. T.,Karlsson, S., Wahl, S. M..(1994). Synthetic fibronectin peptides

interrupt inflammatory cell infiltrations in transforming growth factor beta-1 knockout mice.

Proc Natl Acad Sci USA 91 (11): 5187-91.

373. Hirschhorn, N., Kinzie, J. L., Sachar, D. B., Northrup, R. S., Taylor, J. O., Ahmad, S. Z.,

Phillips, R. A. (1968). Decrease in net stool output in cholera during intestinal perfusion with

glucose containing solutions. N Engl J Med 279 (4): 176-81.

374. Ho, M. S., Glass, R. I., Pinsky, P. F., Young-Okoh, N. C., Sappenfield, W. M., Buehler, J. W.,

Gunter, N., Anderson, N. J. (1988). Diarrheal deaths in American children. Are they

preventable? JAMA 260 (22): 3281-85.

375. Holmgren, J. (1987). Inhibition of bactyerial adhesion and toxin binding by glycoconjugate and

oligosaccharide receptor analogues in human milk. En “Human Lactation 3: The effects of

human milk on the recipient infant”. 1ª ed. (Goldman, A., S., Atkinson, S. A., Hanson, L. A.,

eds.). New York London: Plenum Press; 251-9.

376. Holmgren, J., Svennerholm, A. M., Ahrén, C (1981). Nonimmunoglobulin fraction of human

milk inhibits bacterial adhesión (hemagglutination) and enterotoxin binding of Escherichiae

coli and Vibrio cholerae. Infect Immun 33 (1): 136-41.

377. Hooton, J. W. L., Pabst, H. F., Spady, D. W., Paetkau, V. (1991). Human colostrum contains an

activity that inhibits the production of IL-2. Clin Exp Immunol 86 (3): 520-4.

378. Horne, C. H., Armstrong, S. S., Thomson, A. W., Thomson W. D. (1983). Detection of

pregnancy associated alpha-2 glycoprotein (alpha-PAG) in IgA producing plasma cells and in

body secretion. Clin Exp Immunol 51 (3): 631-8.

379. Hornung, V., Ellegst, J., Kim, S., Brzozka, K., Jung, A., Kato, H., Poeck, H., Akira, S.,

Conzelmann, K. K., Schlee, M., Endres, S., Hartmann, G. (2006). 5’-Triphosphate RNA is the

ligand for RIG-I. Science 314 (5801): 994-7.

380. Howie, P. W., Forsyth, J. S., Ogston, S. A., Clark, A., du V Florey, C. (1990). Protective effect

of breast-feeding against infection. Br Med J 300 (6716): 11-16.

381. Hsueh, W., Caplan, M. S., Qu, X. W., Tan, X. D., De Plaen, I. G., Gonzalez-Crussi, F. (2003).

Neonatal necritizing enterocolitis: clinical considerations and pathogenetic concepts. Pediatr

Dev Pathol 6 (1): 6-23.

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Kulkarni,+A&fullauthor=Kulkarni,%20Ashok%20B.&charset=UTF-8&db_key=GEN

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=McCarthy,+J&fullauthor=McCarthy,%20James%20B.&charset=UTF-8&db_key=GEN

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Tian,+H&fullauthor=Tian,%20Hongsheng&charset=UTF-8&db_key=GEN

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Ward,+J&fullauthor=Ward,%20Jerrold%20M.&charset=UTF-8&db_key=GEN

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Christ,+M&fullauthor=Christ,%20Marielle&charset=UTF-8&db_key=GEN

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=McCartney-Francis,+N&fullauthor=McCartney-Francis,%20Nancy%20L.&charset=UTF-8&db_key=GEN

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=McCartney-Francis,+N&fullauthor=McCartney-Francis,%20Nancy%20L.&charset=UTF-8&db_key=GEN

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Furcht,+L&fullauthor=Furcht,%20Leo%20T.&charset=UTF-8&db_key=GEN

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Karlsson,+S&fullauthor=Karlsson,%20Stefan&charset=UTF-8&db_key=GEN

http://adsabs.harvard.edu/cgi-bin/author_form?author=Wahl,+S&fullauthor=Wahl,%20Sharon%20M.&charset=UTF-8&db_key=GEN

_____________________________________________________________________________

220

382. Huang, J. S., Bousvaros, A., Lee, J. W., Diaz, A., Davidson, E. J. (2002). Efficacy of probiotic

use in acute diarrhoea in children: a meta-analysis. Dig Dis Sci 47 (11): 2625-34.

383. Huang, P, Xia, M., Tan, M., Zhong, W., Wei, C., Wang, L., Morrow, A., and Jiang, X. (2012).

Spike protein VP8* of human rotavirus recognizes histo-blood group antigens in a type-specific

manner. J. Virol 86 (9): 4833.

384. Huang, P., Farkas, T., Marionneau, S., Zhong, W., Ruvouen-Clouet, N., Morrow, A. L., Altaye,

M., Pickering, L. K., Newburg, D. S., LePendu, J., Jiang, X. (2003). Noroviruses bind to human

ABO, Lewis, and secretor histo-blood group antigens: identification of 4 distinct strain-specific

patterns. J Infect Dis 188 (1): 19-31.

385. Huang, P., Farkas, T., Zhong, W., Tan, M., Thornton, S., Morrow, A. L., Jiang, X. (2005).

Norovirus and histo-blood group antigens: demonstration of a wide spectrum of strain

specifities and classification of two major binding groups among multiple binding patterns. J

Virol 79 (11): 6714-22.

386. Hutchens, T. W., Henry, J. F., Yip, T. T., Hachey, D. L., Schanler, R. J., Motil, K. J., Garza, C.

(1991). Origin of intact lactoferrin and its DNA.binding fragments found in the urine of human

milk-fed preterm infants. Evaluation of stable isotopic enrichment. Pediatr Res 29 (3): 243-50.

387. Hutson, A. M., Airaud, F., LePendu, J., Estes, M. K., Atmar, R. L. (2005). Norwalk virus

infection associates with secretor status genotyped from sera. J Med Virol 77 (1): 116-20.

388. Hutson, A. M., Atmar, R. L., Estes, M. K. (2004). Norovirus disease: changing epidemiology

and host susceptibility factors. Trends Microbiol 12 (6): 279-87.

389. Hutson, A. M., Atmar, R. L., Graham, D. Y., Estes, M. K. (2002). Norwalk virus infection and

disease is associated with ABO histo-blood group type. J Infect Dis 185: 1335-7.

390. Hutson, A. M., Atmar, R. L., Marcus, D. M., Estes, M. K. (2003). Norwalk virus-like particle

hemagglutination by binding to histo-blood group antigens. J Virol 77 (1): 405-15.

391. Infante, R. M., Ericsson, C. D., Jiang, Z. D., Ke, S., Steffen, R., Riopel, L., Sack, D. A., DuPont,

H. L. (2004). Enteroaggreggative Escherichia coli diarrea in travelers: response to rifaximin

therapy. Clin Gastroenterol Hepatol 2 (2): 135-8.

392. Inouye, S., Yamashita, K., Yamadera, S., Yoshikawa, M., Kato, N., Okabe, N. (2000).

Surveillance of viral gastroenteritis in Japan: pediatric cases and outbreak incidents. J Infect Dis

181 (2): 270-4.

393. International Study Group on Reduced Osmolality ORS. (1995). Multicenter Evaluation of

reduced osmolality oral rehydration salt solution. Lancet 345 (8945): 282-5.

394. Iritani, N., Seto, T., Hattori, H., Natori, K., Takeda, N., Kubo, H., Yamano, T., Ayata, M.,

Ogura, H., Seto, Y. (2007). Humoral immune responses against norovirus infections of children.

J Med Virol 79 (8): 1187-93.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Henry%20JF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yip%20TT%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hachey%20DL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schanler%20RJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Motil%20KJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Garza%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Airaud%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22LePendu%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Estes%20MK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Atmar%20RL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ke%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Steffen%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Riopel%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sack%20DA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22DuPont%20HL%22%5BAuthor%5D


_____________________________________________________________________________

221

395. Isaacs, C. (2005). Human milk inactivates pathogens individually, additively, synergistically. J

Nutr 135 (5): 1288-90.

396. Isaacs, C. E., Thormar, H. (1990). Human milk in lipids inactivate enveloped viruses. En

“Breastfeeding, nutrition, infection, and infant growth in developed and emerging countries”. 1ª

ed. (Atkinson, S. A., Hanson, L. A., Chandra, R. K., eds.). St. John’s Newfoundland, Canada,

ARTS Biomedical Publishers and Distributors; 161-74.

397. Isakbaeva, E. T., Widdowson, M. A., Beard, R. S., Bulens, S. N., Mullins, J., Monroe, S.

S., Bresee, J., Sassano, P., Cramer, E. H., Glass, R. I. (2005). Norovirus transmission on cruise

ship. Emerg Infect Dis 11 (1): 154-8.

398. Ish-Horowicz, M., Korman, S. H., Shapiro, M., Har-Even, U., Tamir, I., Strauss, N.,

Deckelbaum, R. J. (1989). Asymptomatic giardiasis in children. Pediatr Infect Dis J 89 (8):

773-9.

399. Isolauri, E., Juntunen, M., Wiren, S., Vuorinen, P., Koivula, T. (1989). Intestinal permeability

changes in acute gastroenteritis: effects of clinical factors and nutritional management. J

Pediatr Gastroenterol Nutr 8 (4): 466-73.

400. Isolauri, E., Juntunen, M., Rautanen, T., Sillanaukee, P., Koivula, T. (1991). A human

Lactobacillus strain (Lactobacillus GG) promotes recovery from acute diarrea in children.


401. Isolauri, E., Kaila, M., Mykkanen, H., Ling, W. H., Salminen, S. (1994). Oral bacteriotherapy

for viral gastroenteritis. Dig Dis Sci 39 (12): 2595-600.

402. Isolauri, E., Kalia, M., Rautanen, T., Sillanaukee, P., Koivula, T. (1991). A human Lactobacillus

strain (Lactobacillus casei sp. strain GG) promotes recovery from acute diarrhoea in children.


403. Isolauri, E., Vesikari, T. (1985). Oral rehydration, rapid versus gradual refeeding after acute

gastroenteritis. J Pediatr Gastroenterol Nutr 4: 366-74.

404. Isolauri, E., Vesikari, T., Saha, P., Viander, M. (1986). Milk versus no milk in rapid refeeding

after acute gastroenteritis. J Pediatr Gastroenterol Nutr 5 (2): 254-261.

405. Issacs, C. E., Thormar, H., Pessolano, T. (1986). Membrane-disruptive effect of human milk:

Inactivation of enveloped viruses. J Infect Dis 154 (6): 966-71.

406. Iwasaki, A., Medzhitov, R. (2004). Toll-like receptor control of the adaptive immune responses.

Nat Immunol 5 (10): 987-95.

407. Jain, L., Vidyasagar, D., Xanthou, M., Ghai, V., Shimada, S., Blend, M. (1989). In vivo

distribution of human milk leukocytes after ingestion by newborn baboons. Arch Dis Child 64

(7): 930-3.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bulens%20SN%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mullins%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Monroe%20SS%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bresee%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sassano%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cramer%20EH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Glass%20RI%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Har-Even%20U%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tamir%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Strauss%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Deckelbaum%20RJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vuorinen%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Koivula%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Juntunen%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rautanen%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sillanaukee%20P%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ling%20WH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Salminen%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sillanaukee%20P%22%5BAuthor%5D


_____________________________________________________________________________

222

408. Janas, M., Picciano, M. F. (1992). The nucleotide profile of human milk. Pediatr Res 16 (8):

659-62.

409. Jatsyk, G. V., Kuvaeva, I. B., Gribakin, S. G. (1985). Immunologic protection of the neonatal

gastrointestinal tract. The importance of breast-feeding. Acta Paediatr Scand 74 (2): 246-9.

410. Jenkins, S., Horman, J., Israel, E., Cukor, G., Blacklow, N. R. (1985). An outbreak of Norwalk-

related enteritis at boy´s camp. Am J Dis Child 139 (8): 787-9.

411. Jiang, B., McClure, H. M., Fankhauser, R. L., Monroe, S. S., Glass, R. I. (2004). Prevalence of

rotavirus and norovirus antibodies in non-human primates. J Med Primatol 33 (1): 30-3.

412. Jiang, X. (2003). Development of serological and molecular tests for the diagnosis of calicivirus

infections. En “Viral gastroenteritis” 1ª ed. (Desselberg, U., Gray, J., eds.). Amsterdam:

Elsevier Science BV; 505-22.

413. Jiang, X., Cubitt, D., Hu, J., Dai, X., Treanor, J., Matson, D. O. Pickering, L. K. (1995a).

Development of an ELISA to detect MX virus, a human calicivirus in the Snow Mountain agent

genogroup. J Gen Virol 76 (11): 2739-47.

414. Jiang, X., Graham, D. Y., Wang, K., Estes, M. K. (1990). Norwalk virus genome cloning and

characterization. Science 250 (4987): 1580-3.

415. Jiang, X., Huang, P. W., Zhong, W. M., Farkas, T., Cubitt, D. W., Matson, D. O. (1999). Designs

and evaluation of a primer pair that detects both Norwalk- and Sapporo-like caliciviruses by RT-

PCR. J Virol Methods 83 (1-2): 145-54.

416. Jiang, X., Huang, P., Zhong, W., Tan, M., Farkas, T., Morrow, A. L., Newburg, D. S., Ruiz-

Palacios, G. M., Pickering, L. K. (2004a). Human milk contains elements that block binding of

noroviruses to human histo-blood group antigens in saliva. J Infect Dis 190 (10): 1850-9.

417. Jiang, X., Huang, P., Zhong, W., Morrow, A. L., Ruiz-Palacios, G. M., Pickering, L. K.

(2004b). Human milk contains elements that block binding of noroviruses to histo-blood group

antigens in saliva. Adv Exp Med Biol 554: 447-50.

418. Jiang, X., Matson, D. O., Ruiz-Palacios, G. M., Hu, J., Treanor, T., Pickering, L. K. (1995b).

Expression, self-assembly and Antigenicity of a Snow Mountain Agent-like Calicivirus Capsid

Protein. J of Clinical Microbiol 33 (6): 1452-55.

419. Jiang, X., Matson, D. O., Cubitt, W. D., Estes, M. K. (1996). Genetic and antigenic diversity of

human caliciviruses (HuCVs) using RT-PCR and new EIAs. Arch Virol Suppl 12: 251-62.

420. Jiang, X., Wang, J., Estes, M. K. (1995c). Characterization of SRSVs using RT-PCR and a new

antigen ELISA. Arch Virol 140 (2): 363-74.

421. Jiang, X., Wang, J., Graham, D. Y. Estes, M. K. (1992a). Detection of Norwalk virus in stool by

polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 30 (10): 2529-34.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jiang%20X%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Huang%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zhong%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tan%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Farkas%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Morrow%20AL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Newburg%20DS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ruiz-Palacios%20GM%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pickering%20LK%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zhong%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Morrow%20AL%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Matson%20DO%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cubitt%20WD%22%5BAuthor%5D


_____________________________________________________________________________

223

422. Jiang, X., Wang, M., Graham, D. Y., Estes, M. K. (1992b). Expression, self-assembly, and

antigenicity of the Norwalk virus capsid protein. J Virol 66 (11): 6527-32.

423. Jiang, X., Wilton, N., Zhong, W. M., Farkas, T., Huang, P. W., Barrett, E., Guerrero, M., Ruiz-

Palacios, G., Green, K. Y., Green, J., Hale, A. D., Estes, M. K., Pickering, L. K., Matson, D. O.

(2000). Diagnosis of human caliciviruses by use of enzyme immunoassays. J Infect Dis 181 (2):

349-59.

424. Johnson, P. C., Mathewson, J. J., DuPont, H. L., Greenberg, H. B. (1990). Multiple-challenge

study of host susceptibility to Norwalk gastroenteritis in the U.S. adults. J Infect Dis 161 (1):

18-21.

425. Jolles, J., Jolles, P. (1967). Human tear, human milk lysozimes. Biochemistry 6 (2): 411.

426. Jones, T. F., Gerber, D. E. (2001). Perceived etiology of foodborne illness among public health

personnel. Emerg Infect Dis 7 (5): 904-5.

427. Jordan, J. R., Gordon, I., Dorrance, W. R. (1953). A study of illness in a group of Cleveland

families. Transmission of acute nonbacterial gastroenteritis to volunteers: evidence for two

different etiological agents. J Exp Med 98 (5): 461-75.

428. Jothikumar, N., Lowther, J. A., Henshilwood, K., Lees, D. N., Hill. V. R., Vinjé, J. (2005).

Rapid and sensitive detection of noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse

transcription-PCR assay and application to naturally contaminated shellfish samples. Appl

Environm Microbiol 71 (4): 1870-5.

429. Junquera, C. G., De Baranda, C. S., Mialdea, O. G., Serrano, E. B., Sánchez-Fauquier, A.

(2009). Prevalence and clinical characteristics of norovirus gastroenteritis among hospitalized

children in Spain. Pediatr Infect Dis J 28 (7): 604-7.

430. Jyonouchi, H., Zhang-Shanbhag, L., Georgieff, M., Tomita, Y. (1993). Immunomodulating

actions of nucleotides: enhancement of immunoglobulin production by human cord blood

lymphocytes. Pediatr Res 34 (5): 565.

431. Kageyama, T., Kojima, S., Shinohara, M., Uchida, K., Fukushi, S., Hoshino, F. B., Takeda, N.,

Katayama, K. (2003). Broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses

based on real-time quantitative reverse transcription- PCR. J Clin Microbiol 41 (4): 1548-57.

432. Kageyama, T., Shinohara, M., Uchida, K., Fukushi, S., Hoshino, F. B., Kojima, S., Takai, R.,

Oka, T., Takeda, N., Katayama, K. (2004). Coexistence of multiple genotypes, including newly

identified genotypes, in outbreaks of gastroenteritis due to Norovirus in Japan. J Clin Microbiol

42 (7): 2988–95.

433. Kaila, M., Isolauri, E., Soppi, E., Virtanen, E., Laine, S., Arvilommi, H. (1992). Enhancing of

the circulating antibody secreting cell response in human diarrea by a human Lactobacillus

strain. Pediatr Res 32 (2): 141-4.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Huang%20PW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Barrett%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guerrero%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ruiz-Palacios%20G%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Green%20KY%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Green%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hale%20AD%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Matson%20DO%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Uchida%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fukushi%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hoshino%20FB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Takeda%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Katayama%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Isolauri%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Soppi%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Virtanen%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Laine%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Arvilommi%20H%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

224

434. Kaiser, W. J., Chadhry, H., Sosnovtsev, S. V., Goodfellow, I. G. (2006). Analysis of protein-

protein interactions in the feline calicivirus replication complex. J Gen Virol 87: 363-68.

435. Kalmaluddeen, M., Lodha, A., Akierman, A. (2009). Non-rotavirus infection causing apnoea in

neonate. Indian J Pediatr 76 (10): 1051-2.

436. Kamata, K., Shinozaki, K., Okada M., Seto, Y., Kobayashi, S., Sakae, K., Oseto, M., Natori,

K., Shirato-Horikoshi, H., Katayama, K., Tanaka, T.,Takeda, N., Taniguchi, K. (2005).

Expression and antigenicity of virus-like particles of norovirus and their application for

detection of noroviruses in stool samples. J Med Virol 76 (1): 129-36.

437. Kantor, F. S. (1975). Infection, anergy and cell-mediated immunity. N Engl J Med 292 (12):

629-34.

438. Kapikian, A. Z. (1996). Overview of viral gastroenteritis. Arch Virol Suppl 12: 7-19.

439. Kapikian, A. Z., Dienstag, J. L., Purcell, R. H. (1980). Immune electron microscopy as a

amethod for the detection, identification and characterization of agents non cultivatable in an in

vitro system. En “Manual of Clinical Immunology”, 2ª ed. (Rose, N. R., Fielman, H., eds.).

Washington, D. C.: American Society of Microbiology; 70-83.

440. Kapikian, A. Z., Estes, M. K., Chanock, R. M. (1996). Norwalk group of viruses. En “Fields

Virology”. 3ª ed. (Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M., eds.). New York Raven Press;

783-810.

441. Kapikian, A. Z., Greenberg, H. B., Cline, W. L., Kalica, A. R., Wyatt, R. G., James, H. D.,

Lloyd, N. L., Chanock, R. M., Ryder, R. W., Kim, H. W. (1978). Prevalence of antibody to

Norwalk agent by a newly developed immune adherence hemagglutination assay. J Med Virol

26 (1): 281-94.

442. Kapikian, A. Z., Kim, H. W., Wyatt, R. G., Rodriguez, W. J., Ross, S., Cline, W. L., Parrott, R.

H., Chanock, R. M. (1974). Reoviruslike agent in stools: association with infantile diarrhea and

development of serologic tests. Science 185 (156): 1049-53.

443. Kapikian, A. Z., Wyatt, R. G., Dolin, R., Thornhill, T. S., Kalica, A. R., Chanock, R. M. (1972).

Visualization by immune electron microscopy of a 27-nm particle associated with acute

infectious nonbacterial gastroenteritis. J Virol 10 (5): 1075-81.

444. Kaplan, J. E., Feldman, R., Campbell, D. S., Lookabaugh, C., Gary, G. W. (1982a). The

frequency of a Norwalk-like pattern of illness in outbreaks of acute gastroenteritis. Am J Public

Health 72 (12): 1329-32.

445. Kaplan, J. E., Gary, G. W., Baron, R. C., Singh, N., Schonberger, L. B., Feldman, R.,

Greenberg, H. B. (1982b). Epidemiology of Norwalk gastroenteritis and the role of Norwalk

virus in outbreaks of acute nonbacterial gastroenteritis. Ann Intern Med 96 (6-1): 756-61.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Natori%20K%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shirato-Horikoshi%20H%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tanaka%20T%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Taniguchi%20K%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

225

446. Kappus, K. D., Marks, J. S., Holman, R. C., Bryant, J. K., Baker, C., Gary, G. W., Greenberg,

H. B. (1982). An outbreak of Norwalk gastroenteritis associated with swimming in a pool and

secondary person-to-person transmission. Am J Epidemiol 116 (5): 834-9.

447. Karlsson, K. A. (1995). Microbial recognition of target-cell glycoconjugates. Curr Opin Struct

Biol 5 (5): 622-35.

448. Karst, S. M., Wobus, C. E., Lay, M., Davidson, J., Virgin, H. W. (2003). STAT-1 dependent

innate immunity to a Norwalk-like virus. Science 299 (5612): 1575-8.

449. Katayama, K., Hansman, G. S., Oka, T., Ogawa, S., Takeda, N. (2006). Investigation of

Norovirus replication in human cell line. Arch Virol 151 (7): 1291-308.

450. Kauffman, C. A., Linnenman, C. C., Schiff, G. M., Phair, J. P. (1976). Effect of viral bacterial

pneumonias on cell-mediated immunity in humans. Infect Immun 13 (1): 78-83.

451. Kauffman, S. S., Chatterjee, N. K., Fuschino, M. E., Magid, M. S., Gordon, R. E., Morse, D.

L., Herold, B. C., LeLeiko, N. S., Tschernia, A., Florman, S. S.,Gondolesi, G. E., Fishbein, T.

M. (2003). Calicivirus enteritis in an intestinal transplant recipient. Am J Transplant 3 (6): 764-

8.

452. Keeney, S. E., Schmalstieg, F. C., Palkowetz, K. H., Rudloff, H.E., Le, B. M., Goldman, A. S.

(1993). Activated neutrophils and neutrophil activators in human milk. Increased expression of

CD11b and decreased expression of L-selectin. J Leukoc Biol 54 (2) 97-104.

453. Keller, M. A. (1987). Transfer of tuberculin immunity from mother to infant. En “Human

Lactation 3: The effects of human milk on the recipient infant”. 1ª ed. (Goldman, A. S.,

Atkinson, S. A., Hanson, L. A. eds.). New York London: Plenum Press; 261-7.

454. Keller, M. A., Heiner, D. C., Kidd, R. M., Myers, A. S. (1983). Local production of Ig G4 in

human colostrum. J Immunol 130 (4): 1654-7.

455. Keller, M. A., Henner, D. C., Myers, A. S., Reisinger, D. M. (1984). IgD a mucosal

immunoglobulin? Pediatr Res 18 (4): 258.

456. Keller, M. A., Kidd, R. M., Bryson, Y. J., Turner, J. L., Carter, J. (1981). Lymphokine

production by human milk lymphocytes. Infect Immun 32 (2): 632-6.

457. Kemp, A. S., Cripps, A. W., Brown, S. (1980). Suppression of leukocyte chemokinesis and

chemotaxis by human IgA. Clin Exp Immunol 40 (2): 388-95.

458. Kenney, S. E., Schmalstieg, F. C., Palkowetz, K. H., Rudloff, H. E., Le, B. M., Goldman, A. S.

(1993). Activated neutrophils and neutrophil activation in human milk. Increased expression of

CD11b and decreased expression of L-selectin. J Leokoc Biol 54 (2): 97.

459. Khamrin, P., Maneekarn, N., Peerakome, S., Tonusin, S., Malasao, R., Mizuguchi, M., Okitsu,

S., Ushijima, H. (2007). Genetic diversity of noroviruses and sapoviruses in children

hospitalized with acute gastroenteritis in Chiang Mai, Thailand. J Med Virol 79 (12): 1921-6.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Magid%20MS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gordon%20RE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Morse%20DL%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Herold%20BC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22LeLeiko%20NS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tschernia%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Florman%20SS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gondolesi%20GE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fishbein%20TM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fishbein%20TM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schmalstieg%20FC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Palkowetz%20KH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rudloff%20HE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Le%20BM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Goldman%20AS%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rudloff%20HE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Le%20BM%22%5BAuthor%5D


_____________________________________________________________________________

226

460. Khamrin, P., Takanashi, S., Chan-It, W., Kobayashi, M.,Nishimura, S., Katsumata, N., Okitsu,

S., Maneekarn, N., Nishio, O., Ushijima, H. (2009). Immunochromatography test for rapid

detection of norovirus in fecal specimens. J Virol Methods 157 (2): 219-22.

461. Khan, A. S., Moe, C. L., Glass, R. I., Monroe, S. S., Estes, M. K., Chapman, L. E., Jiang, X.,

Humphrey, C., Pon, E., Iskander, J. K., Schonberger, L. B. (1994). Norwalk Virus-associated

gastroenteritis traced to ice consumption aboard a cruise ship in Hawaii: comparison and

application of molecular method-based assays. J of Clin Microbiol 32 (2): 318-22.

462. Khan, R. R., Lawson, A. D., Minnich, L. L., Martin, K., Nasir, A., Emmett, M. K., Welch, C.

A., Udall, J. N. Jr. (2009). Gastrointestinal norovirus infection associated with exacerbation of

inflammatory bowel disease. J of Pediatr Gastroenterol Nutr 48 (3): 328-33.

463. Kijlstra, A., Jeurissen, S. H. M. (1982). Modulation of classical C3 convertase of complement

by tear lactoferrin. Immunology 47: 263-70.

464. Kilgore, P. E., Belay, E. D., Hamlin, D. M., Noel, J. S., Humphrey, C. D., Gary, H. E. Jr, Ando,

T., Monroe, S. S., Kludt, P. E., Rosenthal, D. S., Freeman, J., Glass, R. I. (1996). A university

outbreak of gastroenteritis due to a small round-structured virus. Application of molecular

diagnostics to identify the etiologic agent patterns of transmission. J Infect Dis 173 (4): 787-93.

465. Kindberg, E., Akerlind, B., Johnsen, C., Knudsen, J. D., Heltberg, O., Larsson, G., Böttiger, B.,

Svensson, L. (2007). Host Genetic Resistance to Symptomatic Norovirus (GGII.4) Infections in

Denmark. J Clin Microbiol 45 (8): 2720–2722.

466. Kitamoto, N., Tanaka, T., Natori, K., Takeda, N., Nakata, S., iang, X., Estes, M. K. (2002).

Cross-reactivity among several recombinant calicivirus virus-like particles (VLPs) with

monoclonal antibodies obtained form mice immunized orally with one type of VLP. J Clin

Microbiol 40 (7): 2459-65.

467. Koda, Y., Soejima, M., Kimura, H. (2001) The polymorphisms of fucosyltransferases. Legal

Med 3: 2-14.

468. Kogawa, K., Nakata, S., Ukae, S., Adachi, N., Numata, K., Matson, D. O., Estes, M. K., Chiba,

S. (1996). Dot blot hybridization with a cDNA probe derived from the human calicivirus

Sapporo 1982 strain. Arch Virol 141 (10): 1949-59.

469. Kohl, S., Pickering, L. K., Cleary, T. G., Steinmetz, K. D., Loo, L. S. (1980). Human colostral

cytotoxicity. II. Relative defects in colostral leukocyte cytotoxicity and inhibition of peripheral

blood leukocyte cytotoxicity by colostrum. J Infect Dis 142 (6): 884-91.

470. Kojima, S., Fukumi, H., Kusama, H. (1948). Studies on the causative agent of the infectious

diarrea: records of the experiments on human volunteers. Jpn Med J 1: 467-76.

471. Koldovsky, O. (1985). Digestion and absorption of carbohydrates, protein, and fat in infants and

children. En “Nutrition in Pediatrics, Basic Science and Clinical Application”. 1ª ed. (Walker,

W. A., Watkins, J. B., eds.). Boston Toronto, Little, Brown and Company; 253-77.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Okitsu%20S%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maneekarn%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nishio%20O%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ushijima%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rosenthal%20DS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Freeman%20J%22%5BAuthor%5D


_____________________________________________________________________________

227

472. Koletzko, S., Sherman, P., Corey, M., Griffiths, A., Smith, C. (1989). Role of infant feeding

practices in development of Crohn´s disease in childhood. BMJ 298 (6688): 1617-8.

473. Konig, M., Thiel, H. J., Meyers, G. (1998). Detection of viral proteins after infection of cultured

hepatocytes with rabbit hemorrhagic disease virus capsid. J Virol 72 (5): 4492-7.

474. Kono, Y. L., Beagley, K. W., Fujihashi, K., McGhee, J. R., Taga, T., Hirano, T., Kishimoto, T.,

Kiyono, H. (1991). Cytokine regulation of localized inflammation. Induction of activated B

cells and IL-6 mediated polyclonal IgG and IgA synthesis in inflamed human gingival. J

Immunol 146 (6): 1812-21.

475. Koopmans, J. S., Eckert, E. A., Greenberg, H. B., Strohm, B. C., Isaacson, R. E., Monto, A. S.

(1982). Norwalk virus enteric illness acquired by swimming exposure. Am J Epidemiol 115 (2):

173-7.

476. Koopmans, M., Duizer, E. (2004). Foodborne viruses: an emerging problem. Int J Food

Microbiol 90 (1): 23-41.

477. Koopmans, M., Harris, J., Verhoef, H., Depoortere, E., Takkinen, J., Coulumbier, D. (2006).

European investigation into recent norovirus outbreaks on cruise ships: update. Euro Surveill 11

(7): E060706.5

478. Koppel, R., Han, R. N., Cox, D., Tanswell, A. K., Rabinovitch, M. (1994). Alpha-1-antitrypsin

protects neonatal rats from pulmonary vascular and parenchimal effects of oxygen toxicity.

Pediatr Res 36 (6): 763-70.

479. Kosek, M., Bern, C., Guerrant, R. L. (2003). The global burden of diarrhoeal disease, as

estimated from studies published between 1992 and 2000. Bull World Health Organ 81 (3):

197-204.

480. Kotloff, K. L., Losonky, G. A., Morris, J. G. Jr, Wasserman, S. S., Singh-Naz, N., Levin, M. M.

(1989). Enteric adenovirus infection in chidhood diarrea: epidemic study in three clinical

settings. Pediatrics 84 (2): 219-25.

481. Kramer, M. S. (1988). Infant feeding, infection and public health. Pediatrics 81 (1): 164-6.

482. Kramer, M. S., Chalmers, B., Hodnett, E. D., Sevkovskaya, Z., Dzikovich, I., Shapiro,

S., Collet, J. P., Vanilovich, I., Mezen, I., Ducruet, T., Shishko, G., Zubovich, V., Mknuik,

D., Gluchanina, E., Dombrovskiy, V., Ustinovitch, A., Kot, T., Bogdanovich,N., Ovchinikova,

L., Helsing, E. (2001). Promotion of Breastfeeding Intervention Trial (PROBITT): a

randomized trial in the Republic of Belarus. JAMA 285 (4): 413-20.

483. Kramer, M. S., Guo, T., Platt, R. W., Shapiro, S., Collet, J. P., Chalmers, B., Hodnett, E.,

Sevkovskaya, Z., Dzikovich, I., Vanilovich, I. (2002). Breastfeeding and infant growth: biology

or bias? Pediatrics 110 (2-1): 343-7.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sherman%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Corey%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Griffiths%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Smith%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shapiro%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shapiro%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Collet%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Vanilovich%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mezen%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ducruet%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shishko%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zubovich%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mknuik%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mknuik%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gluchanina%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dombrovskiy%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ustinovitch%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kot%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bogdanovich%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ovchinikova%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ovchinikova%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Helsing%20E%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

228

484. Kreutz, L. C., Seal, B. S., Mengeling, W. L. (1994). Early interaction of feline calicivirus with

cells in culture. Arch Virol 136 (1-2): 19-34.

485. Kroneman, A., Vennema, H., Harris, J., Reuter, G., von Bonsdorff, C. H., Hedlund, K. O.,

Vainio, K., Jackson, V., Pothier, P., Koch, J., Schreier, E.,Böttiger, B. E., Koopmans, M.

(2006). Increase in norovirus activity reported in Europe. Euro Surveill 11 (12): 612-14.

486. Kroneman, A., Verhoef, L., Harris, J., Vennema, H., Duizer, E., van Duynhoven, Y., Gray, J.,

Iturriza, M., Böttiger, B., Falkenhorst, G., Johnsen, C., von Bonsdorff, C. H., Maunula, L.,

Kuusi, M., Pothier, P., Gallay, A., Schreier, E., Höhne, M., Koch, J., Szücs, G., Reuter, G.,

Krisztalovics, K., Lynch, M., McKeown, P., Foley, B., Coughlan, S., Ruggeri, F. M., Di Bartolo,

I., Vainio, K., Isakbaeva, E., Poljsak-Prijatelj, M., Grom, A. H., Mijovski, J. Z., Bosch, A.,

Buesa, J., Fauquier, A. S., Hernandéz-Pezzi, G., Hedlund, K. O., Koopmans, M. (2008).

Analysis of integrated virological and epidemiological reports of norovirus outbreaks collected

within the foodborne viruses in Europe Network from 1 July 2001 to 30 June 2006. J Clin

Microbiol 46 (9): 2959-65.

487. Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. (1993). Interleukin-10-deficient

mice develop chronic enterocolitis. Cell 75 (2): 263-74.

488. Kukurozovic, R. H., Brewster, D. R. (2002). Small bowel intestinal permeability in Australian

aboriginal children. J Pediatr Gastroenterol Nutr 35 (2): 206-12.

489. Kulkarni, A. B., Ward, J. M., Yaswen, L., Mackall, C. L., Bauer, S. R., Huh, C. G., Gress, R.

E., Karlsson, S. (1993). Transforming growth factor beta-1 null mutation in mice causes

excessive inflammatory response and early death. Proc Natl Acad Sci USA 90 (2): 770-4.

490. Kulski, J. K., Hartmann, P. E. (1981). Changes in the concentration of cortisol in milk during

different stages of human lactation. Aust J Exp Biol Med Sci 59 (6): 769-78.

491. Kumar, S., McKerlie, M. L., Albrecht, T. B., Goldman, A. S., Baron, S. (1984). A broadly

active viral inhibitor in human and animal organ extracts and body fluids. Proc Soc Exp Biol

Med 177 (1): 104-11.

492. Kunz, C., Rudloff, S., Baie, W., Klein, N., Strobel, S. (2000). Oligosaccharides in human milk:

structural, functional, and metabolic aspecsts. Annu Rev Nutr 20: 699-722.

493. Kunzelmann, K., Mall, M. (2002). Electrolytic transport in the mammalian colon: mechanisms

and implication for disease. Physiol Rev 1 (82): 245-89.

494. Lacroix, C., Berthier, M., Agius, G., Bonneau, D., Pallu, B., Jacquemin, J. L. (1987).

Cryptosporidium oocysts in immunocompetent children: epidemiologic investigations in the

day-care centers of Poitiers, France. Eur J Epidemiol 3 (4): 381-5.

495. Laegreid, A., Kolsto Otnaess, A. B. (1987). Trace amounts of ganglioside GM1 in human milk

inhibit enterotoxins from Vibrio cholera and Escherichia coli. Life Sci 40 (1): 55-62.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jackson%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pothier%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Koch%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schreier%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22B%C3%B6ttiger%20BE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Koopmans%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bonneau%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pallu%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jacquemin%20JL%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

229

496. Laegreid, A., Kolsto Otnaess, A. B., Bryn, K. (1986a). Purification of human milk gangliosides

by silica gel chromatography and analysis of trifluoroacetate derivatives by gas

chromatography. J Chromatogr 377: 59-67.

497. Laegreid, A., Kolsto Otnaess, A. B., Fuglesang, J. (1986b). Human and bovine milk:

comparison of ganglioside composition and enterotoxin-inhibitory activity. Pediatr Res 20 (5):

416-21.

498. Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of

bacterophage T4. Nature 227 (5259): 680-685.

499. Laurent, S., Vautherot, J. F., Madelaine, M. F., Le Gall, G., Rasschaert, D. (1994). Recombinant

rabbit hemorragic disease virus capsid protein expressed in baculovirus self-assembles into

virus-like particles and induces protection. J Virol 68 (10): 6794-98.

500. Lazzerini, M. Ronfani, L. (2008). Oral zinc for treating diarrhoea in children. Int J of Epidemiol

37 (3): 938-40.

501. Le Guyader, F. S, Loisy, F., Atmar, R. L., Hutson, A. N., Estes, M. K., Ruvoën-Clouet, N.,

Pommepuy, M., Le Pendu, J. (2006). Norwalk virus-specific binding to oyster digestive tissues.

Em Infect Dis 12 (6): 931-6.

502. Le Guyader, F. S., Parnaudeau, S., Schaeffer, J., Bosch, A., Loisy, F., Pommepuy, M., Atmar,

R. L. (2009). Detection and quantification of noroviruses in shellfish. Appl Environm Microbiol

75 (3): 618-24.

503. Le Guyader, F., Estes, M. K., Hardy, M. E., Neill, F. H., Green, J., Brown, D., Atmar, R. L.

(1996). Evaluation of a degenerate primer for the PCR detection of human caliciviruses. Arch

Virol 141 (11): 2225-35.

504. Le Pendu, J. (2004). Histo-blood group antigen and human milk oligosaccharides: genetic

polymorphism and risk for infectious diseases. Adv Exp Med Biol 554: 135-43.

505. Leffler, H., Svanborg Edén, C. (1986). Glycolipids as receptors for Escherichia coli lectins or

adhesions. En “Microbial lectins and agglutinins: properties and biological activities”. 1ª ed.

(Mirelman, D., ed.). New York, Wiley; 83.

506. Leite, J. P., Ando, T., Noel, J. S., Jiang, B., Humphrey, C. D., Lew, J. F., Green, K. Y., Glass,

R. I,. Monroe, S. S. (1996). Characterization of Toronto virus capsid protein expressed in

baculovirus. Arch Virol 141 (5): 865-75.

507. Leo, F., Asakuma, S, Fukuda, K., Senda, A., Urashima, T. (2010). Determination of syalil and

neutral oligosaccharide levels in transition and mature milks of Samoan women, using

anthranilic derivatization followed by reverse phase high performance liquid chromatography.

Biosci Biotechnol Biochem 74 (2): 298-303.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kolst%C3%B8%20Otnaess%20AB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bryn%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Otnaess%20AB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fuglesang%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jiang%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Humphrey%20CD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lew%20JF%22%5BAuthor%5D





_____________________________________________________________________________

230

508. Letterio, J. J., Geiser, A. G., Kulkarni, A. B., Roche, N. S., Sporn, M. B., Roberts, A. B. (1994).

Maternal rescue of transforming growth factor-β1 null mice. Science 264 (5167): 1936-8.

509. Levy, A. G., Widerlite, L., Schwartz, C. J., Dolin, R., Blacklow, N. R., Gardner, J. D., Kimberg,

D. V., Trier, J. S. (1976). Jejunal adenylate ciclase activity in human subjects during viral

gastroenteritis. Gastroenterology 70 (3): 321-5.

510. Lew, J. F., Kapikian, A. Z., Jiang, X., Estes, M. K., Green, K. Y. (1994a). Molecular

characterization and expression of the capsid protein of a Norwalk-like virus recovered from a

Desert Shield troop with gastroenteritis. Virology 200: 319-325.

511. Lew, J. F., Kapikian, A. Z., Valdeuso, J., Green, K. Y. (1994b). Molecular characterization of

Hawaii virus and other Norwalk-like viruses: evidence for genetic polymorphism among human

caliciviruses. J Infect Dis 170 (3): 535-42.

512. Lew, J. F., Petric, M., Kapikian, A. Z., Jiang, X., Estes, M. K., Green, K. Y. (1994c).

Identification of minireovirus as Norwalk-like virus in pediatric patients with gastroenteritis. J

Virol 68 (5): 3391-6.

513. Lewis, D. B., Yu, C. C., Meyer, J., English, B. K., Kahn, S. J., Wilson, C. B. (1991). Cellullar

and molecular mechanisms for reduced interleukin 4 and interferon-gamma production by

neonatal T cells. J Clin Invest 87 (1): 194-202.

514. Ley, K. (2003). The role of selectins in inflammation and disease. Trends Mol Med 9 (6): 263-8.

515. Lindberg, T., Ohlsson, K., Weström, B. (1982). Protease inhibitors and their relation to protease

activity in human milk. Pediatr Res 16 (6): 479-83.

516. Lindesmith, L. C., Donaldson, E. F., Baric, R. S. (2011). Norovirus GII.4 strain antigenic

variation. J of Virol 85 (1): 231-42.

517. Lindesmith, L. C., Donaldson, E. F., Lobue, A. D., Cannon, J. L., Zheng, D. P., Vinje, J., Baric,

R. S. (2008). Mechanisms of GII.4 norovirus persistence in human populations. PLoS Med 5

(2): e31.

518. Lindesmith, L. C., Donaldson, E., Leon, L., Moe, C. L., Frelinger, J. A., Johnston, R. E., Ewber,

D. J., Baric, R. S. (2010). Heterotypic humoral and cellular immune responses following

Norwalk virus infection. J of Virol 84 (4): 1800-15.

519. Lindesmith, L., Moe, C., Lependu, J., Frelinger, J. A., Treanor, J., Baric, R. S. (2005). Cellular

and humoral immunity following Snow Mountain virus challenge. J Virol 79 (5): 2900-09.

520. Lindesmith, L., Moe, C., Marionneau, S., Ruvoen, N., Jiang, X., Lindblad, L., Stewart, P.,

LePendu, J., Baric, R. (2003). Human susceptibility and resistance to Norwalk virus infection.

Nat Med 9 (5): 548-53.

521. Lindh, E. (1985). Increased resistance of immunoglobulin dimers to proteolytic degradation

after binding of secretory component. J Immunol 114 (1-2): 284-6.

http://pubget.com/search?q=authors%3A%22Andrew%20G%20Geiser%22

http://pubget.com/search?q=authors%3A%22Ashok%20B%20Kulkarni%22

http://pubget.com/search?q=authors%3A%22Nanette%20S%20Roche%22

http://pubget.com/search?q=authors%3A%22Michael%20B%20Sporn%22

http://pubget.com/search?q=authors%3A%22Anita%20B%20Roberts%22




_____________________________________________________________________________

231

522. Liu, B. L., Lambden, P. R., Gunther, H., Otto, P., Elschner, M., Clarke, I. N. (1999a). Molecular

characterization of a bovine enteric calicivirus: relationship to the Norwalk-like viruses. J Virol

73 (1): 819-25.

523. Liu, B. L., Viljoen, G. J., Clarke, I. N., Lambden, P. R. (1999b). Identification of further

proteolytic cleavage sites in the Southampton calicivirus polyprotein by expression of the viral

protease in E. coli. J Gen Virol 80 (2): 291-96.

524. Liu, B., Clarke, I. N., Lambden, P. R. (1996). Polyprotein processing in Southampton virus:

identification of 3C-like protease cleavage sites by in vitro mutagenesis. J Virol 70 (4): 2605-

10.

525. LoBue, A. D., Lindesmith, L., Yount, B., Harrington, P. R., Thompson, J. M., Johnston, R. E.,

Moe, C. L., Baric, R. S. (2006). Multivalent norovirus vaccines induce strong mucosal and

systemic blocking antibodies against multiple strains. Vaccine 24 (24): 5220-34.

526. Lochridge, V. P., Jutila, K. L., Graff, J. W., Hardy, M. E. (2005). Epitopes in the P2 domain of

norovirus VP1 recognized by monoclonal antibodies that block cell interactions. J Gen Virol 86

(10): 2799-06.

527. Lönerdal, B. (2003). Nutritional and physiological significance of human milk proteins. Am J

Clin Nutr 77 (6): 1537-43.

528. Lopman, B. A., Adak, G. K., Reacher, M. H., Brown, D. W. (2003a). Two epidemiological

patterns of norovirus outbreaks: surveillance in England and Wales, 1992-2000. Emerg Infect

Dis 9 (1): 71-7.

529. Lopman, B. A., Reacher, M. H., Van Duynhoven, Y., Hanon, F. X., Brown, D., Koopmans, M.

(2003b). Viral gastroenteritis outbreaks in Europe, 1995-2000. Emerg Infect Dis 9 (1): 90-6.

530. Lopman, B. A., Reacher, M. H., Vipond, I. B., Hill, D., Perry, C., Halladay, T., Brown, D. W.,

Edmunds, W. J., Sarangi, J. (2004a). Epidemiology and cost of nosocomial gastroenteritis. Avon

England, 2002-2003. Emerg Infect Dis 10 (10): 1827-34.

531. Lopman, B., Vennema, H., Kohli, E., Pothier, P., Sanchez, A., Negredo, A., Buesa, J., Schreier,

E., Reacher, M., Brown, D., Gray, J., Iturriza, M.,Gallimore, C., Bottiger, B., Hedlund, K.

O., Torvén, M., von Bonsdorff, C. H., Maunula, L., Poljsak-Prijatelj, M., Zimsek, J., Reuter,

G., Szücs, G.,Melegh, B., Svennson, L., van Duijnhoven, Y., Koopmans, M. (2004b). Increase

in viral gastroenteritis outbreaks in Europe and epidemic spread of new norovirus variant.

Lancet 363 (9410): 682-8.

532. Lucas, A., Cole, T. J. (1990a). Breast milk and neonatal necrotizing enterocolitis. Lancet 336

(8730): 1519-23.

533. Lucas, A., Morley, R. (1990b). Early diet of preterm infants and the development of allergic or

atopic disease: randomized prospective study. Br Med J 300 (6728): 837-40.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Otto%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Elschner%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Clarke%20IN%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pothier%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sanchez%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Negredo%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Buesa%20J%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reacher%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brown%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gray%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Iturriza%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gallimore%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bottiger%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hedlund%20KO%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hedlund%20KO%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Torv%C3%A9n%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22von%20Bonsdorff%20CH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Maunula%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Poljsak-Prijatelj%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zimsek%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reuter%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Reuter%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sz%C3%BCcs%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Melegh%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Svennson%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22van%20Duijnhoven%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Koopmans%20M%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

232

534. Lukacik, M., Thomas, R. L., Aranda, J. V. (2008). A meta-analysis of the effects of oral zinc in

the treatment of acute and persistent diarrhea. Pediatrics 121 (2): 326-36.

535. Lund, J. M., Alexopoulou, L., Sato, A., Karow, M., Adams, N. C., Gale, N. W., Iwasaki, A.,

Flavell, R. A. (2004). Recognition of single-stranded RNA viruses by Toll-like receptors 7.

Procl Natl Acad Sci USA 101 (15): 5598-603.

536. Lynch, M., Painter, J., Woodruff, R., Braden, C. (2006). Surveillance for foodborne disease

outbreaks. United States, 1998-2002. Morb Mort Weekley Rep 55 (10): 1-42.

537. Lynch, M., Sieh, W. J., Tatti, K., Gentsch, J. R., Ferebee-Harris, T., Jiang, B., Guarner,

J., Bresee, J. S., Greenwald, M., Cullen, S., Davies, H. D.,Trevenen, C., Zaki, S. R., Glass, R. I.

(2003). The pathology of rotavirus-associated deaths, using new molecular diagnostics. Clin

Infect Dis 37 (10): 1327-33.

538. Maccario, R., Chirico, G., Mingrat, G., Aricò, M., Lanfranchi, A., Montagna, D., Moretta, A.,

Rondini, G. (1993). Expression of CD45RO antigen on the surface of resting and activated

neonatal T lymphocite subsets. Biol Neonate 64 (6): 346-53.

539. Macfarlane, G. T., Macfarlane, S. (1997). Human colonic microbiota: Ecology, physiology and

metabolic potential of intestinal bacteria. Scand J Gastroenterol 222: 3-9.

540. Madeley, C. R. (1979). Comparison of the features of astroviruses and caliciviruses seen in

samples of feces by electron microscopy. J Infect Dis 139 (5): 519-23.

541. Madeley, C. R., Cosgrove, B. P. (1975). 28 nm particles in faeces in infantile gastroenteritis.

Lancet 2 (7932): 451-2.

542. Madeley, C. R., Cosgrove, B. P. (1976). Caliciviruses in man. Lancet 307 (7952): 199-200.

543. Madore, H. P., Treanor, J. J., Buja, R., Dolin, R. (1990). Antigenic relatedness among the

Norwalk-like agents by serum antibody rises. J Med Virol 32 (2): 96-101.

544. Maeda, Y., Tohya, Y., Matsuura, Y., Mochizuki, M., Sugimura, T. (2002). Early interactions of

canine calicivirus in cells is the major determinant for its cells tropism in vitro. Vet Microbiol

87 (4): 291-300.

545. Mahalanabis D. (1996). Current status of oral rehydration as a strategy for the control of

diarrhoeal diseases. Indian J Med Res 104: 115-24.

546. Malathi, K., Dong, B., Gale, M. Jr., Silverman, R. H. (2007). Small self-RNA generated by

RNase L amplifies antiviral innate immunity. Nature 448 (7155): 816-819.

547. Malloy, M. H., Graubard, B. (1994). Predictors of rehospitalization among very low birth

weight infants. Clin Res 41 (4): 791.

548. Maltezou, H. C., Zatiropoulu, A., Mavrikou,. N., Bozavoutoglou, E., Liapi, G., Foustoukou, M.,

Kafetzis, D. A. (2001). Acute diarrhea in children treated in an outpatient setting in Athens,

Greece. J Infect Dis 43 (2): 122-7.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gale%20NW%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Iwasaki%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Flavell%20RA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gentsch%20JR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ferebee-Harris%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jiang%20B%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guarner%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guarner%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bresee%20JS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Greenwald%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cullen%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Davies%20HD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Trevenen%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Zaki%20SR%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chirico%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mingrat%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Aric%C3%B2%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lanfranchi%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Montagna%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Moretta%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rondini%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bozavoutoglou%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Liapi%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Foustoukou%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kafetzis%20DA%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

233

549. Marie-Cardine, A., Gourlain, K., Mouterde, O., Castignolles, N., Hellot, M., Mallet, E., Buffet-

Janvresse, B. (2002). Epidemiology of acute viral gastroenteritis in children hospitalized in

Rouen, France. Clin Infect Dis 34 (9): 1170-8.

550. Marionneau, S., Airaud, F., Bovin, N.V., Le Pendu, J., Ruvoën-Clouet, N. (2005b). Influence of

the combined ABO, FUT2, and FUT3 polymorphism on susceptibility to Norwalk virus

attachment. J Infect Dis 192 (6):1071-7.

551. Marionneau, S., Airaud, F., Bovin, N. V., Le Pendu, J., Ruvoën-Clouet, N. (2005). Influence of

the combined ABO, FUT2 and FUT3 polymorphism on susceptibility to Norwalk virus

attachment. J Infect Dis 192 (6): 1071-7.

552. Marionneau, S., Cailleau-Thomas, A., Rocher, J., Le Moullac-Vaidye, B., Ruvouen, N,

Clément, M., Le Pendu, J. (2001). ABH and Lewis histo-blood group antigens, a model for the

meaning of oligosaccharide diversity in the face of a changing world. Biochemistry 83 (7): 565-

73.

553. Marionneau, S., Ruvoen, N., Le Moullac-Vaidye, B., Clement, M., Cailleau-Thomas, A., Ruiz-

Palacios, G., Huang, P., Jiang, X., Le Pendu, J. (2002). Norwalk virus binds to histo-blood

group antigens present on gastroduodenal epithellial cells of secretor individuals.

Gastroenterology 122 (7): 1967-77.

554. Marks, P. J., Vipond, I. B., Carlisle, D., Deakin, D., Fey, R. E., Caul, E. O. (2000). Evidence for

airborne transmission of Norwalk-like virus (NLV) in a hotel restaurant. Epidemiol Infect 124

(3): 481-7.

555. Marks, P. J., Vipond, I. B., Regan, F. M., Wegwood, K., Fey, R. E., Caul, E. O. (2003). A school

outbreak of Norwalk-like virus: evidence for airborne transmission. Epidemiol Infect 131(1):

727-36.

556. Marshall, J. A., Dimitriadis, A., Wright, P. J. (2005). Molecular and epidemiological features of

norovirus-associated gastroenteritis outbreaks in Victoria, Australia in 2001. J Med Virol 75 (2):

321-31.

557. Martín-Sosa, S., Martín, M. J., García-Pardo, L. A., Hueso, P. (2004). Distribution of sialic

acids in the milk of Spanish mothers of full term infants during lactation. J of Pediatr

Gastroenterol Nutr 39 (5): 499-503.

558. Mata, L. J., Jiménez, F., Cordón, M., Rosales, R. (1972). Gastrointestinal flora of children with

protein-calorie malnutrition. Am J Clin Nutr 25: 1118-26.

559. Mata, L. J., Urrutia, J. J., García, B., Fernández, R., Béhar, M. (1969a). Shigella infection in

breast-fed Guatemalan Indian neonates. Am J Dis Child 117 (2): 142-6.

560. Mata, L. J., Urrutia, J. J., Gordon, J. E. (1969b). Diarrhoeal disease in a cohort of Guatemalan

village children observed from birth to age of two years. Trop Geogr Med 19: 247-57.

561. Mata, L. J., Wyatt, R. G. (1971). Host resistance to infections. Am J Clin Nutr 24 (8): 976-86.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Airaud%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bovin%20NV%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Le%20Pendu%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ruvo%C3%ABn-Clouet%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Clement%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cailleau-Thomas%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ruiz-Palacois%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ruiz-Palacois%20G%22%5BAuthor%5D




_____________________________________________________________________________

234

562. Matheson, A. J., Noble, S. (2000). Racecadotril. Drugs 14 (1): 75-9.

563. Matson, D. O., Estes, M. K., Tanaka, T., Bartlett, A. V., Pickering, L. K. (1990). Asymptomatic

human calicivirus infection in a day care center. Pediatr Infect Dis J 9 (3): 190-6.

564. Matson, D. O., Zhong, W. M., Nakata, S., Numata, K., Jiang, X., Pickering, L. K., Chiba, S.,

Estes, M. K. (1995). Molecular characterization of a human calicivirus with closer sequence

relatedness to animal caliciviruses than other known human caliciviruses. J Med Virol 45 (2):

215-222.

565. Matsui, S. M., Greenberg, H. B. (2000). Immunity to calicivirus infection. J Infect Dis 181 (2):

331-5.

566. Matsui, S. M., Kim, J. P., Greenberg, H. B., Su, W., Sun, Q., Johnson, P. C., DuPont, H. L.,

Oshiro, L. S., Reyes, G. R. (1991). The isolation and characterization of a Norwalk virus-

specific cDNA. J Clin Investig 87 (4): 1456-61.

567. Mattner, F., Sohr, D., Heim, A., Gastmeier, P., Vennema, H., Koopmans, M. (2006). Risk groups

for clinical complications of norovirus infections: an outbreak investigation. Clin Microbiol

Infect 12 (1): 69-74.

568. Maunula, L., Piparinen, H., von Bonsdorff, C. H. (1999). Confirmation of Norwalk-like virus

amplicons after RT-PCR by microplate hybridization and direct sequencing. J Virol Methods 83

(1-2): 125-34.

569. Maunula, L., von Bonsdorff, C. H. (2005). Norovirus genotypes causing gastroenteritis

outbreaks in Finland 1998-2002. J Clin Virol 34 (3): 186-94.

570. Mc Cartney, S. A., Thackray, L. B., Gitlin, L., Gilfillan, S., Virgin, H. W., Colonna, M. (2008).

MDA-5 recognition of a murine norovirus. PLoS Pathog 4 (7): e1000108.

571. Mc Clelland, D. B. L., Mc Grath, J., Samson, R. R. (1978). Antimicrobial factors in human

milk. Studies of concentration and transfer to the infant during the early stages of lactation. Acta

Paediatr Scand 67 (271): 1.

572. Mc Evoy, M., Blake, W., Brown, D., Green, J., Cartwright, R (1996). An outbreak of viral

gastroenteritis on a cruise ship. Commun Dis Rep 6 (13): 188-92.

573. Mcfarland, L. V., Brandmarker, S. A., Guandalini, S. (2000). Pediatric Clostridium difficile: a

phantom menace or clinical reality? J Pediatr Gastroenterol Nutr 31 (3): 220-31.

574. McLean, B. S., Holmes, I. H. (1981). Effects of antibodies, trypsin and trypsin inhibitors on

susceptibility of neonates to rotavirus infections. J Clin Microbiol 13 (1): 22-9.

575. Mead, P. S., Slutker, L., Dietz, V., McCaig, L. F., Bresee, J. S., Shapiro, C., Griffin, P. M.,

Tauxe, R. V. (1999). Food-related illness and death in the United States. Emerg Infect Dis 5 (5):

607-25.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McCaig%20LF%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Shapiro%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Griffin%20PM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tauxe%20RV%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

235

576. Meeroff, J. C., Schreiber, D. S., Trier, J. S., Blacklow, N. R. (1980). Abnormal gastric motor

function in viral gastroenteritis. Ann Intern Med 92 (3): 370-73.

577. Mendez, M., Arias, C. F. (2007). Astroviruses. En “Fields Virology”. 5ª ed. (Kinippe, D. M.,

Howley, P. M., eds.). Philapdelphia, Walter Kluwer&Lippincott William&Wilkins; 982-99.

578. Meyer, E. J., Hamman, R. F., Gay, E. C., Lezotte, D. Z., Savitz, D. A., Klingesmith, G. J.

(1988). Reduced risk of IDDM among breast fed children. The Colorado IDDM Registry.

Diabetes 37 (12): 1625-32.

579. Meyer, E., Ebner, W., Scholz, R., Dettenkoffer, M., Daschner, F. D. (2004). Nosocomial

outbreak of norovirus gastroenteritis and investigation of ABO histo-blood group type in

infected staff and patients. J Infect Dis 56 (1): 64-6.

580. Meyers, G., Wirblich, C., Thiel, H. J. (1991). Genomic and subgenomic RNA of rabbit

hemorrhagic disease virus are both protein-linked and packaged into particles. Virology 184 (2):

677-86.

581. Millard, J., Appleton, H., Parry, J. V. (1987). Studies on heat inactivation of hepatitis A virus

with special reference to shellfish. Part 1. Procedures for infection and recovery of virus from

laboratory-mantained cockles. Epidemiol Infect 98 (3): 397-414.

582. Miller, L. C., Isa, S., LoPreste, G., Schaller, J. G., Dinarello, C. A. (1990). Neonatal interleukin-

1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor: cord blood levels and cellullar production. J

Pediatr 117 (6): 961-5.

583. Mirelaman, D. (1986). “Microbial lectins and agglutinins: properties and biological activities”.

1ª ed. (Mirelaman, D., ed.). New York, Wiley; 123-7.

584. Mishu, B., Blaser, M. J. (1993). Role of infection due to Campylobacter jejuni in the initiation

of Guillain-Barré syndrome. Clin Infect Dis 17 (1): 104-8.

585. Miyoshi, M., Yoshizumi, S., Kanda, N., Karino, T., Nagano, H., Kudo, S., Okano, M., Ishida, S.

(2010). Different genotypic sapoviruses detected in two simultaneous outbreaks of

gastroenteritis among schoolchildren in the same school district in Hokkaido, Japan. Jpn J

Infect Dis 63 (1): 75-8.

586. Moe, C. L., Gentsch, J., Ando, T., Grohman, G., Monroe, S. S., Jiang, X., Wang, J., Estes, M.

K., Seto, Y., Humphrey, C., Stine, S., Glass, R. I. (1994). Application of PCR to detect Norwalk

virus in fecal specimens from outbreaks of gastroenteritis. J Clin Microbiol 32 (3): 642-8.

587. Monroe, S. S., Stine, E., Jiang, X., Estes, M. K., Glass, R. I. (1993). Detection of antibody to

recombinant Norwalk virus antigen in specimens from outbreaks of gastroenteritis. J Clin

Microbiol 31 (11): 2866-72.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Isa%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22LoPreste%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schaller%20JG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dinarello%20CA%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

236

588. Morales, M., Barcena, J., Ramirez, M. A., Boga, J. A., Parra, F., Torres, J. M. (2004). Synthesis

in vitro of rabbit hemorrhagic disease virus subgenomic RNA by internal initiation on (-) sense

genomic RNA: mapping of a subgenomic promoter. J Biol Chem 279 (17): 17013-8.

589. Moreno-Espinosa, S., Farkas, T., Jiang, X. (2004). Human calicivirus and pediatric

gastroenteritis. Semin Pediatr Infect Dis 15 (4): 237-45.

590. Morgan, O. S., Bankay, J., Quash, G. A. (1975). The effect of lactoferrin, an iron-binding

protein or complement activity. West Indian Med J 24 (1): 46-54.

591. Morgan, W. T., Watkins, W. M. (2000). Unravelling the biochemical basis of blood group ABO

and Lewis antigenic specificity. Glycoconj J 17 (7-9): 501-30.

592. Morotti, R. A., Kauffman, S. S., Fishbein, T. M., Chatterjee, N. K., Fuschino, M. E., Morse, D.

L., Magid, M. S. (2004). Calicivirus infection in pediatric small intestine transplant recipients:

pathological considerations. Human Pathol 35 (10): 1236-40.

593. Morris, C. A., Flewett, T. H., Byrden, A. S., Davies, H. (1975). Epidemic viral enteritis in a

long-stay children´s ward. Lancet 1 (7897): 4-5.

594. Morrow, A. L., Guerrero, M. L., Shults, J., Calva, J. J., Lutter, C., Bravo, J., Ruiz-Palacios,

G., Morrow, R. C., Butterfoss, F. D. (1999). Efficacy of home-based peer counseling to

promote exclusive breastfeeding: a randomized controlled trial. Lancet 353 (9160): 1226-31.

595. Morrow, A. L., Ruiz-Palacios, G. M., Jiang, X., Newburg, D. S. (2005). Human milk glycans

that inhibit pathogens binding protect breastfeeding infants against infectious diarrhea. J Nutr

135 (5): 1304-7.

596. Morrow, A. L., Ruiz-Palacios, G. M., Altaye, M., Jiang, X., Guerrero, M. L., Meinzen-Derr, J.

K., Farkas, T., Chaturvedi, P., Pickering, L. K., Newburg, D. S. (2004). Human milk

oligosaccharides are associated with protection against diarrea in breast-fed infants. J Pediatr

145 (3): 297-303.

597. Mortari, F., Wang, J. Y., Schroeder, H. W. Jr. (1993). Human cord blood antibody repertoire.

Mixed population of VIH gene segments and CDR3 distribution in the expression of C alpha

and C gamma repertoires. J Immunol 150 (4): 1348-57.

598. Morton, V., Jean, J., Farber, J., Mattison, K. (2009). Detection of noroviruses in ready-to-eat

foods by using carbohydrate-coated magnetic beads. Appl Environ Microbiol 75 (13): 4641-3.

599. Mostov, K. E., Blobel, G. A. (1982). A transmembrane precursor of secretory component. The

receptor of transcellullar transport of polymeric immunoglobulins. J Biol Chem 257 (19):

11816-21.

600. Mounts, A. W., Ando, T., Koopmans, M., Breese, J. S., Noel, J., Glass, R. I. (2000). Cold

weather seasonality of gastroenteritis associated with Norwalk-like viruses. J Infect Dis 181 (2):

284-7.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chatterjee%20NK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fuschino%20ME%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Magid%20MS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bravo%20J%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Morrow%20RC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Butterfoss%20FD%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Altaye%20M%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guerrero%20ML%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Meinzen-Derr%20JK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Meinzen-Derr%20JK%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chaturvedi%20P%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Newburg%20DS%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

237

601. Mumphrey, S. M., Changotra, H., Moore, T. N., Heimann-Nichols, E. R., Wobus, C. E.,

Michael, J. (2007). Murine norovirus 1 infection is associated with histopathological changes in

immunocompetent hosts, but clinical disease is prevented by STAT1-dependent interferon

responses. J Virol 81 (7): 3251-63.

602. Munoz, C., Endres, S., van der Meer, J., Schlesinger, L., Arevalo, M., Dinarello, C. (1990).

Interleukin-1beta in human colostrum. Res Immunol 141: 501-13.

603. Murakami, K., Suzuki, S., Aoki, N., Okajima, T., Nadano, D., Uchida, K., Yamashita, K., Oka,

T., Katayama, K., Takeda, N., Matsuda, T. (2010). Binding of Norovirus virus-like particles

(VLPs) to human intestinal Caco-2 cells and the suppressive effect of pasteurized bovine

colostrum on this VLP binding. Biosci Biotechnol Biochem 74 (3):541-7.

604. Murata, T., Katsushima, N., Mizuta, K., Muraki, Y., Hongo, S., Matsuzaki, Y., (2007).

Prolonged norovirus shedding in infants < or = 6 months of age with gastroenteritis. Pediatr

Infect Dis J 26 (1): 46-9.

605. Murphy, C., Hahn, S. Volmink, J. (2004). Reduced osmolarity oral rehydration solution for

treating cholera. Cochrane Database Syst Rev CD003754.

606. Mushtaha, A. A., Schmalstieg, F. C., Hughes, T. K. Jr., Rajaraman, S., Rudloff, H. E.,

Goldman, A. S. (1989). Chemokinetic agents for monocytes in human milk: posible role of

tumor necrosis factor-α. Pediatr Res 25 (6): 629-33.

607. Musumeci, M., Simpore, J., D’Agata, A., Sotgiu, S., Musumeci, S. (2006). Oligosaccharides in

colostrum of Italian and Burkinabe women. J of Pediatr Gastroenterol Nutr 43 (3): 372-8.

608. Myers, K. E. C., Schulman, S., Kaplan, B. S. (1997). Principles of the treatment of Shiga toxin-

associated hemolytic-uremic syndrome: pay meticulous attention to detail, and do not harm. En

“Escherichia coli O157:H7 and other Shiga toxin producing E. coli starins”. 1ª ed. (Kaper, J. B.,

O’Brian, A. D.., eds.). Washington D. C.: ASM Press; 364-73.

609. Myrmel, M., Rimstad, E., Estes, M., Skjerve, E., Wasteson, Y. (1996). Prevalence of serum

antibodies to Norwalk virus among Norwegian military recruits. Int J Food Microbiol 29 (2-3):

233-40.

610. Naarding, M. A., Ludwig, I. S., Groot, F., Bekhout, B., Geijtenbeek, T. B., Pollakis, G., Paxton,

W. A. (2005). Lewis X component in human milk binds DC-SIGN and inhibits HIV-1 transfer

to CD 4 + T lymphocytes. J Clin Invest 115 (11): 3256-64.

611. Nachamkin, I., Allos, B. M., Ho, T. (1998). Campylobacter species and Guillain-Barré

syndrome. Clin Microbiol Rev 11 (3): 555-67.

612. Nakajima, S., Baba, A. S., Tamura, N. (1977). Complement system in human colostrum:

presence of nine complement components and factors of alternative pathway in human

colostrums. Int Arch Allergy Immunol 54 (5): 428-33.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Murakami%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Suzuki%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Aoki%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Okajima%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nadano%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Uchida%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yamashita%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oka%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oka%20T%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Matsuda%20T%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Allos%20BM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ho%20T%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

238

613. Nakata, S., Chiba, S., Terashima, H., Sakuma, Y., Kogasaka, R., Nakao, T. (1983). Microtiter

solid-phase radioimmunoassay for detection of human calicivirus in stools. J Clin Microbiol 17

(2): 198-201.

614. Nakata, S., Chiba, S., Terashima, H., Yokoyama, T., Nakao, T. (1985). Humoral Immunity in

infants with gastroenteritis caused by human calicivirus. J Infect Dis 152 (2): 274-9.

615. Nakata, S., Kogawa, K., Numata, K., Ukae, S., Adachi, N., Matson, D. O., Estes, M. K.,

Chiba S. (1996). The epidemiology of human calicivirus/Sapporo/82/Japan. Arch Virol 12: 263-

70.

616. Nakhla, T., Fu, D., Zopf, D., Brosky, N. L., Hurt, H. (1999). Neutral oligosaccharides content of

preterm human milk. Br J Nutr 82 (5): 361-7.

617. Nanulescu, M., Condor, M., Popa, M., Muresan, M., Panta, P., Ionac, S., Popescu, L., Sarb,

S., Suciu, D., Corduneanu, D. (1995). Early re-feeding in the management of acute diarrea in

infants 0-1 year of age. Acta Paediatr 84 (9): 1002-1006.

618. Narayanam, I., Prakash, K., Bala, S., Verma, R. K., Gujral, V. V. (1980). Partial

supplementation with expressed breast-milk for prevention of infection in low-birth-weight

infants. Lancet 316 (8194): 561-3.

619. Neil, J. D. (1990). Nucleotide sequence of a región of the feline calicivirus genome which

encodes picornavirus-like RNA-dependent RNA polymerase, cysteine protease and 2C

polypeptides. Virus Res 17 (3): 145-160.

620. Neil, J. D., Sosnovtsev, S. V., Green, K. Y. (2000). Recovery and altered neutralization

especificities of chimeric viruses containing capsid protein domain exchanges from

antigenically distinct strains of feline calicivirus. J Virol 74 (3): 1079-84.

621. Neill, J. D. (2002). The subgenomic RNA of feline calicivirus is packaged into viral particles

during infection. Virus Res 87 (1): 89-93.

622. Neill, J. D., Mengeling, W. L. (1998). Further characterization of the virus-specific RNAs in

feline calicivirus infected cells. Virus Res 11 (1): 59-72.

623. Neu, J., Wu-Wang, C. Y., Measel, C. P., Gimotty, P. (1988). Prostaglandin concentrations in

human milk. Am J Clin Nutr 47 (4): 649-52.

624. Newburg, D. S. (1997). Do the binding properties of oligosaccharides in milk protect human

infants from gastrointestinal bacteria? J Nutr 127 (5): 980-4.

625. Newburg, D. S. (1999). Human milk glycoconjugates that inhibit pathogens. Curr Med Chem 6

(2): 117-27.

626. Newburg, D. S. (2005a). Innate immunity and human milk. J Nutr 135 (5): 1308-12.

627. Newburg, D. S. (2009). Neonatal protection by an innate immune system of human milk

consisting of oligosaccharides and glycans. J Anim Sci 87 (13): 26-34.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mure%C5%9Fan%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Pan%C5%A3a%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ionac%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Popescu%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%A2rb%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22S%C3%A2rb%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Suciu%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Corduneanu%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Prakash%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bala%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Verma%20RK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gujral%20VV%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

239

628. Newburg, D. S., Chaturvedi, P. (1992a). Neutral glycolipids of human and bovine milk. Lipids

27 (11): 923-7.

629. Newburg, D. S., Daniel, P. F., O’Niel, N. E., Mc Cluer, R. H. (1986). High performance liquid

chromatography of oligosaccharides from human milk and colostrum. En “Human Lactation 2:

Material and environmental factors”. 1ª ed. (Hamosh, M., Goldman, A. S., eds.). New York:

Plenum; 581-8.

630. Newburg, D. S., Linhardt, R. J., Ampofo, S. A., Yolken, R. H. (1995a). Human milk

glycosaminoglycans inhibit HIV glycoprotein gp120 binding to its host cell CD4 receptor. J

Nutr 125 (3): 419-24.

631. Newburg, D. S., Neubauer, S. H. (1995b). Carbohydrates in milk. En “Handbook of milk

composition”. 1ª ed. (Jensen, R. G., ed.). San Diego, Academic Press; 273-9.

632. Newburg, D. S., Peterson, J. A., Ruiz-Palacios, G. M., Matson, D. O., Morrow, A. L., Shults, J.,

Guerrero, M. L., Chaturvedi, P., Newburg, S. O., Scallan, C. D., Taylor, M. R., Ceriani, R. L.,

Pickering, L. K. (1998). Role of human milk lactadherin in protection against symptomatic

rotavirus infection. Lancet 351 (9110): 1160-4.

633. Newburg, D. S., Pickering, L. K., McCluer, R. H., Cleary, T. G. (1990). Fucosylated

oligosaccharides of human milk protect suckling mice from heat-stable enterotoxin of

Escherichia coli. J Infect Dis 162 (5): 1075-80.

634. Newburg, D. S., Ruiz-Palacios, G. M., Altaye, M., Chaturvedi, P., Meinzen-Derr, J, Guerrero,

M., L., Morrow, A. L. (2004). Innate protection conferred by fucosilated oligosaccharides of

human milk against diarrea in breastfed infants. Glycobiology J 14 (3): 253-63.

635. Newburg, D. S., Ruiz-Palacios, G. M., Morrow, A. L. (2005b). Human milk glycans protect

infants against enteric pathogens. Annu Rev Nutr 25: 37-58.

636. Newburg, D. S., Viscidi, R. P., Ruff, A., Yolken, R. H. (1992b). A human milk factor inhibits

binding of human immunodeficiency virus to the CD4 receptor. Pediatr Res 31 (1): 22-8.

637. Nguyen, T. A., Khamrin, P., Takanashi, S., Le Hoang, P., Pham Ie, D., Hoang, K. T., Satou,

K., Masuoka, Y., Okitsu, S., Ushijima, H. (2007a). Evaluation of immunochromatography tests

for detection of rotavirus and norovirus among Vietnamese children with acute gastroenteritis

and the emergence of a novel norovirus GII.4 variant. J Trop Pediatr 53 (4): 264-9.

638. Nguyen, T. A., Yagyu, F., Okame, M., Phan, T. G., Trinh, Q. D., Yan, H., Hoang, K. T., Cao,

A. T., Le Hoang, P., Okitsu, S., Ushijima, H. (2007b). Diversity of viruses associated with acute

gastroenteritis in children hospitalized with diarrhea in Ho Mihn City, Vietnam. J Med Virol 79

(5): 582-90.

639. Nichols, B. L., McKee, K. S., Henry, J. F., Putman, M. (1987). Human lactoferrin stimulates

thymidine incorporation into DNA of rat crypt cells. Pediatr Res 21 (6): 563-7.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Viscidi%20RP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ruff%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yolken%20RH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Satou%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Satou%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Masuoka%20Y%22%5BAuthor%5D



_____________________________________________________________________________

240

640. Nichols, J. H., Bezkorovainy, A., Paque, R. (1975). Isolation and characterization of several

glycoproteins from human colostrum whey. Biochem Biophys Acta 412 (1): 99-108.

641. Nilsson, M., Hedlund, K. O., Thorhagen, M., Larson, G., Johansen, K., Ekspong, A., Svensson,

L. (2003). Evolution of human calicivirus RNA in vivo: accumulation of mutations in the

protruding P2 domain of the capsid leads to structural changes and possibly a new phenotype. J

Virol 77 (24): 13117-24.

642. No authors listed. (1987). What has happened to carbohydrate intolerance following

gastroenteritis? Lancet 1 (8523): 23-4.

643. No authors listed. (1992). Recommendations for composition of oral rehydration solutions for

the children of Europe of an ESPGHAN Working Group. J Pediatr Gastroenterol Nutr 14 (1):

113-5.

644. Noda, K., Umeda, M., Ono, T. (1984). Transforming growth factor activity in human colostrum.

Gann 75 (2): 109-12.

645. Noel, J. S., Ando, T., Leite, J. P., Green, K. Y., Dingle, K. E., Estes, M. K., Seto, Y, Monroe, S.

S., Glass, R. I. (1997). The correlation of patient immune responses with genetically

characyerized small round-structured viruses involved in outbreaks of nonbacterial acute

gastroenteritis in the United States, 1990 to 1995. J Med Virol 53 (4): 372-83.

646. Noel, J. S., Fankhauser, R. L., Ando, T., Monroe, S. S., Glass, R. I. (1999). Identification of a

distinct common strain of “Norwalk-like viruses” having a global distribution. J Infect Dis 179

(6): 1334-44.

647. Oatness, A. B., Laegreid, A., Ertresvag, K. (1983). Inhibition of enterotoxin from Escherichia

coli and Vibrio cholerae by gangliosides from human milk. Infect Immun 40 (2): 563-69.

648. Oatness, A. B., Svennerholm, A. M. (1982). Non-immunoglobulin fraction of human milk

protects against enterotoxin-induced intestinal fluid secretion. Infect Immun 35 (2): 738-40.

649. Oberhelman, R. A., Javier de la Cabada, F., Vasquez-Garibay, E., Bitsura, J. A., DuPont, H. L.

(1987). Efficacy of thrimetropim-sulfamethoxazole in treatment of acute diarrea in a Mexican

pediatric population. J Pediatr 110 (6): 960-5.

650. Obermeier, S., Rudloff, S., Pohlentz, G., Lentze, M. J. Kunz, C. (1999). Secretion of 13-labelled

oligosaccharides into human milk and infant´s urine after an oral [13C] galactose load. Isotopes

Environ Health Stud 35 (1-2): 119-25.

651. Ofek, I., Sharon, N. (1990). Adhesins as lectins: specificity and role in infection. Curr Top

Microbiol Immunol 151: 91-113.

652. Ohyama, T., Yoshizumi, S., Sawada, H., Uchiyama, Y., Katoh, Y., Hamakoa, N., Utagawa, E.

(1999). Detection and nucleotide sequence analysis of human caliciviruses (HuCVs) from

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bitsura%20JA%22%5BAuthor%5D


_____________________________________________________________________________

241

samples in non-bacterial gastroenteritis outbreaks in Hokkaido, Japan. Microbiol Immunol 43

(6): 543-50.

653. Oka, T., Katayama, K., Ogawa, S., Hansman, G. S., Kageyama, T., Ushijima, H., Miyamura, T.,

Takeda, N. (2005). Proteolytic processing of sapovirus ORF1 polyprotein. J Virol 79 (12):

7283-90.

654. Okada, M., Tanaka, T., Oseto, M., Takeda, N., Shinozaki, K. (2006). Genetic analysis of

noroviruses associated with fatalities in healthcare facilities. Arch Virol 151 (8):1635-41.

655. Okhuysen, P. C., Jiang, X., Ye, L., Johnson, P. C., Estes, M. K. (1995). Viral shedding and fecal

IgA response after Norwalk virus infection. J Infect Dis 171 (3): 566-69.

656. Oksenberg, J. R., Persitz, E., Brautbar, C. (1985). Cellular immunity in human milk. Am J

Reprod Immunol Microbiol 8 (4): 125-9.

657. Olesen, B., Neimann, J., Bottinger, B., Ethelberg, S., Schiellerup, P., Jensen, C., Helms,

M., Scheutz, F., Olsen, K. E., Krogfelt, K., Petersen, E.,Molbak, K., Gerner-Smidt, P. (2005).

Etiology of diarrea in young children in Denmark: a case-control study. J Clin Microbiol 43 (8):

3636-41.

658. Oliver, S. L., Brown, D. W., Green, J., Bridger, J. C. (2004). A chimeric bovine enteric

calicivirus: evidence for genomic recombination in genogroup III of the norovirus genus of the

Caliciviridae. Virology 326 (2): 231-9.

659. Olsen, S. J., MacKinnon, L. C., Goulding, J. S., Bean, N. H., Slutsker, L. (2000). Surveillance

for foodborne disease outbreaks. United States, 1993-1997. Morb Mort Weekley Rep 49 (1): 1-

62.

660. Ostrea, E. M. Jr., Balun, J. E., Winkler, R., Porter, T. (1986). Influence of breast-feeding on the

restoration of the low serum concentration of vitamin E and beta-carotene in the newborn

infant. Am J Obstet Gynecol 154 (5): 1014-7.

661. Otnaess, A. B., Svennerholm, A. M. (1986). Non-immunoglobulin fraction of human milk

protects against enterotoxin-induced intestinal fluid secretion. Infect Immun 35 (2): 738-40.

662. OzFoodNet Network. (2004). Foodborne Disease investigation across Australia. Annual report

2003. Commun Dis Intell 28 (3): 359-89.

663. Özkaragoz, F., Rudloff, H. B., Rajaraman, S., Mushtaha, A. A., Schmalstieg, F. C., Goldman,

A. S. (1988). The motility of human milk macrophages in collagen gels. Pediatr Res 23 (5):

449-52.

664. Pabst, H. F., Grace, M., Godel, J., Cho, H., Spady, D. (1989). Effect of breast-feeding on

immune response to BCG vaccination. Lancet 1 (8663): 295-7.

665. Pabst, H. F., Spady, D. W. (1990). Effect of breast-feeding on antibody response to conjugate

vaccine. Lancet 336 (8710): 269-70.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hansman%20GS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kageyama%20T%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miyamura%20T%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ethelberg%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schiellerup%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jensen%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Helms%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Helms%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Scheutz%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Olsen%20KE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Krogfelt%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Petersen%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22M%C3%B8lbak%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gerner-Smidt%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Balun%20JE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Winkler%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Porter%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rudloff%20HB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rajaraman%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mushtaha%20AA%22%5BAuthor%5D




_____________________________________________________________________________

242

666. Palkowetz, K. H., Royer, C. L., Garofalo, R., Rudloff, H. E., Schmalstieg, F. C. Jr., Goldman,

A. S. (1994). Production of interleukin-6 and interleukin-8 by human mammary gland epitelial

cells. J Reprod Immunol 26 (1): 57-64.

667. Pang, K., Bresson, J. L., Walker, W. A. (1983). Development of the gastrointestinal mucosal

barrier. III. Evidence for structural differences in microvillus membranes from newborn and

adult rabbits. Biochem Biophys Acta 727 (1): 201-8.

668. Pang, X. L., Honma, S., Nakata, S., Vesikari, T. (2000). Human caliciviruses in acute enteritis

of young children in the community. J Infect Dis 181 (2): 288-94.

669. Pang, X. L., Joensuu, J., Vesikari, T. (1999). Human calicivirus-associated sporadic enteritis in

Finnish children less than two years of age followed prospectively during a rotavirus vaccine

trial. Pediatr Infect Dis J 18: 420-6.

670. Parashar U. D., Breese J. S., Glass, R. I. (2003a). The global burden of diarrhoeal disease in

children. Bull of the World Health Organ 81 (4): 236.

671. Parashar, U. D., Dow, L., Fankhauser, R. L., Humphrey, C. D., Miller, J., Ando, T., Williams,

K. S., Eddy, C. R., Noel, J. S., Ingram, T., Bresee, J. S., Monroe, S. S., Glass, R. I. (1998). An

outbreak of viral gastroenteritis associated with consumption of sandwiches: implications for

the control of transmission by food handlers. Epidemiol Infect 121 (3): 615-21.

672. Parashar, U. D., Hummelman, E. G., Breese J. S., Miller, M. A., Glass, R. I. (2003b). Global

illness and deaths caused by rotavirus disease in children. Emerg Infect Dis 9 (5): 565-72.

673. Parashar, U., Quiroz, E. S., Mounts, A. W., Monroe, S. S., Fankhauser, R. L., Ando, T. (2001).

“Norwalk-like viruses”. Public Health consequences and outbreak management. Morb Mort

Weekley Rep 50 (9): 1-17.

674. Park, K.U., Song, J., Han, K.S., Kim, J.Q. (2005). The fusion allele of the FUT2 (secretor type

alpha(1,2)-fucosyltransferase) gene at a high frequency and a new se385 allele in a Korean

population. Ann Hematol 84 (10): 656-60.

675. Parker, T. D., Kitamoto, N., Tanaka, T., Hutson, A. M., Estes, M. K. (2005). Identification of

Genogroup I Genogroup II broadly reactive epitopes on the norovirus capsid. J Virol 79: 7402-

09.

676. Parkkinen, J., Finne, J., Achtman, M., Vaisanen, V., Korhonen, T. K. (1983). Escherichia coli

strains binding neuramil α 2,3 galactosides. Biochem Biophys Res Commun 111: 456-61.

677. Parrino, T. A., Schreiber, D. S., Trier, J. S., Kapikian, A. Z., Blacklow, N. R. (1977). Clinical

immunity in acute gastroenteritis caused by Norwalk agent. N Engl J Med 297 (2): 86-89.

678. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Fout, G. S. (2004). Development of homologous internal

controls for use in RT-PCR assays of waterbone enteric viruses. J Virol Methods 121 (1): 39-48.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Humphrey%20CD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miller%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ando%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Williams%20KS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Williams%20KS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Eddy%20CR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Noel%20JS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ingram%20T%22%5BAuthor%5D




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hutson%20AM%22%5BAuthor%5D


_____________________________________________________________________________

243

679. Patel, M. M., Hall, A. J., Vinje, J., Parashar, U. D. (2009). Noroviruses: a comprehensive

review. J Clin Virol 44 (1): 1-8.

680. Patel, M. M., Widdowson, M. A., Glass, R. I., Akazawa, K., Vinje, J., Parashar, U. D. (2008).

Systematic review of role of noroviruses in sporadic gastroenteritis. Emerg Infect Dis 14 (8):

1224-31.

681. Paterson, W., Haswell, P., Fryers, P. T., Green, J. (1997). Outbreak of small round structured

virus gastroenteritis arose after kitchen assistant vomited. Commun Dis Rep 7: 101-3.

682. Peeters, B. P., de Leeuw, O. S., Koch, G., Gielkens, A. L. (1999). Rescue of Newcastle disease

virus from cloned cDNA: evidence that cleavability of the fusion protein is a major determinant

for virulence. J Virol 73 (6): 5001-9.

683. Peiper, A. (1992). Chronik der Kinderheilkunde. Ed. Thieme.

684. Peitersen, B., Bohn, L., Andersen, H. (1975). Quantitative determination of immunoglobulins,

lysozyme, and certain electrolytes during a 24-hour period, and in milk from the individual

mammary gland. Acta Paediatr Scand 64 (5): 709-17.

685. Pelligrini, A., Thomas, U., Bramaz, N., Hunziker, P., von Fellenberg, R. (1999). Isolation and

identification of three bactericidal domains in the bovine α-lactalbumin molecule. Biochim

Biophys Acta 1426 (3): 439-48.

686. Peltola, H., Käyhty, H., Virtanen, M., Mäkelä, P. H. (1994). Prevention of Haemophillus

influenzae type b bacterial infections with the capsular polysaccharide vaccine. N Engl J Med

310: 1561-6.

687. Perillo, N. L., Marcus, M. E., Baum, L. G. (1998). Galectins: versatile modulators of cell

adhesión, cell proliferation, and cell death. J Mol Med 76 (6): 402-12.

688. Peters, M. J., Dixon, G., Kotowicz, K. T., Hatxch, D. J., Heyderman, R. S., Klein, N. J. (1999).

Circulating platelet-neutrophil complexes represent a subpopulation of activated neutrophils

primed for adhesion, phagocytosis and intracellular killing. Br J Haematol 106 (2): 391-9.

689. Phadke, S. M., Deslouches, B., Hileman, S. E., Montelaro, R. C., Wiesenfeld, H. C., Mietzner,

T. A. (2005). Antimicrobial peptides in mucosal secretions: the importance of local secretions

in mitigating infection. J Nutr 135 (5): 1289-93.

690. Philipson, J. Peterson, U. Lindberg, U., eds. (1975). Molecular Biology of Adenoviruses. En

“Virology Monographs”. 1ª ed. New York, Springer Publishing; 14.

691. Pichlmair, A. Schulz, O., Tan, C. P., Naslund, T. I., Liljestrom, P., Weber, F., Reis e Sousa, C.

(2006). RIG-I mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5´-phosphates.

Science 314 (5801): 997-1001.

692. Pichlmair, A., Reis e Sousa, C. (2007). Innate recognition of viruses. Immunity 27 (3): 370-83.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22K%C3%A4yhty%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Virtanen%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22M%C3%A4kel%C3%A4%20PH%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

244

693. Pickering, L. K., Woodward, W. E., Du Pont, H. L., Sullivan, P. (1984). Occurrence of Giardia

lamblia in children in day care centers. J Pediatr 104 (4): 522-6.

694. Powers, G. F. (1926). A comprehensive plan of treatment for the so-called intestinal

intoxification of infants. J Dis Child 32 (2): 232-57.

695. Prasad, B. V., Crawford, S., Lawton, J. A., Pesavento, J., Hardy, M., Estes, M. K. (2001).

Structural studies on gastroenteritis viruses. Novartis Found Symp 238: 26-37.

696. Prasad, B. V., Hardy, M. E., Dokland, T., Bella, J., Rossmann, M. G., Estes, M. K. (1999). X-

ray crystallographic structure of the Norwalk virus capsid. Science 286 (5438): 287-90.

697. Prasad, B. V., Hardy, M. E., Jiang, X., Estes, M. K. (1996). Structure of Norwalk virus. Arch

Virol Suppl 12: 237-42.

698. Prasad, B. V., Matson, D. O, Smith, A. W. (1994a). Three dimensional structure of calicivirus. J

Mol Biol 240 (3): 256-64.

699. Prasad, B. V., Rothnagel, R., Jiang, X., Estes, M. K. (1994b). Three-dimensional structure of

baculovirus-expressed Norwalk-virus capsids. J Virol 68 (8): 5117-25.

700. Prentice, A. (1987). Breast feeding increases concentrations of IgA in infant´s urine. Arch Dis

Child 62 (8): 792-5.

701. Provisional Comité on Quality Improvement Subcomité of Acute gastroenteritis. (1996). The

management of acute gastroenteritis in young children. Pediatrics 97: 423-36.

702. Ptempio, V. F. (1658). Avicenna Canon Medicus 1 (3):1-4.

703. Pullan, C. R., Toms, G. L., Martin, A. J., Gardner, P. S., Webb, J. K. G., Appleton, D. R.

(1990). Breast-feeding and respiratory syncitial virus infection. Br Med J 281: 1034-6.

704. Racial and ethnic distribution of ABO blood types. Disponible en URL

<http://www.bloodbook.com /world-abo.html>. [Acceso 28 de marzo, 2012].

705. Ravn, V., Dabelsteen, E. (2000). Tissue distribution of histo-blood group antigens. APMIS 108

(1): 1-28.

706. Red Book. Report of the Comitee on Infectious Diseases 2000. American Academy of

Pediatrics. Pickering, L. K., Peter, G., Baker, C. J., Gerber, M. A., Mc Donald, N. E., (eds).

American Academy of Pediatrics. III: 202-3, 500-4, 516-7, 653-8.

707. Rees, L., Brook, C. G. D. (1979). Gradual reintroduction of full strength milk after acute

gastroenteritis in children. Lancet 7: 770-1.

708. Reid, B., Smith, H., Friedman, Z. (1980). Prostaglandins in human milk: relationships to milk

fatty acid content. Pediatrics 66: 870-2.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rothnagel%20R%22%5BAuthor%5D



_____________________________________________________________________________

245

709. Reid, J. A., Caul, E. O., White, D. G., Palmer, S. R. (1988). Role of infected food handler in

hotel outbreak of Norwalk-like viral gastroenteritis: implications for control. Lancet 2 (8606):

321-3.

710. Reinman, H. A., Price, A. H., Hodges, J. H. (1945). The cause of epidemic diarrea, nausea and

vomiting. Viral dysentery? Proc Soc Experiment Biol Med 59: 8-9.

711. Reinmann, H. A., Hodges, J. H., Price, A. H. (1945). Epidemic diarrea, nausea and vomiting of

unknown cause. JAMA 127 (1): 1-6.

712. Reiter, B. (1978). The lactoperoxidase-thiocyanate-hydrogen peroxide antibacterium system.

Ciba Found Symp 65 (6-8): 285-94.

713. Resta, S., Luby, J.P., Rosenfeld, C. R., Siegel, J. D. (1985). Isolation and propagation of a

human enteric coronavirus. Science 229 (4714): 978-81.

714. Ribes, J. M., Montava, R., Téllez-Castillo, C. J., Fernández-Jiménez, M., Buesa, J. (2010).

Seroprevalence of Aichi Virus in a Spanish Population from 2007 to 2008. Clin Vacc Immun 17

(4): 545-9.

715. Rockx, B. H., Bogers, W. M., Heeney, J. L., van Amerongen, G., Koopmans, M. P. (2005a).

Experimental norovirus infections in non-human primates. J Med Virol 75 (2): 313-20.

716. Rockx, B. H., Vennema, H., Hoebe, C. J., Duizer, E., Koopmans, M. P. (2005b). Association of

histo-blood group antigens and susceptibility to norovirus infections. J Infect Dis 191 (5): 749-

54.

717. Rockx, B., Baric, R. S., de Grijs, I., Duizer, E., Koopmans, M. P. (2005c). Characterization of

the homo-and heterotypic immune responses after natural norovirus infection. J Med Virol 77

(3): 439-46.

718. Rockx, B., De Wit, M., Vennema, H., Vinjé J, De Bruin, E., Van Duynhoven, Y., Koopmans,

M. (2002). Natural history of human calicivirus infection a prospective cohort study. Clin Infect

Dis 35 (3): 246-53.

719. Rognum, T. O., Thrane, S., Stoltenberg, L., Vege, A., Brandtzaeg, P. (1992). Development of

intestinal mucosal immunity in fetal life and the first postnatal months. Pediatr Res 32 (2): 145-

9.

720. Romain, N., Dandrifosse, G., Jeusette, F., Forget, P. (1992). Polyamine concentration in rat

milk and food, human milk, and infant formula. Pediatr Res 32 (1): 58-63.

721. Román, E., Negredo, A., Dalton, R. M., Wilhelmi, I., Sánchez-Fauquier, A. (2002). Molecular

detection of human calicivirus among Spanish children with acute gastroenteritis in Spain. J

Clin Microbiol 40 (10): 3857-9.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Luby%20JP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rosenfeld%20CR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Siegel%20JD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dandrifosse%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Jeusette%20F%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Forget%20P%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

246

722. Román, E., Wilhelmi, I., Cilleruelo, M. I., Calvo, C., García García, M. L., Sánchez-Fauquier,

A. (2004). Nosocomial acute gastroenteritis and asymptomatic infection by rotavirus and

astrovirus in hospitalized children. Anal Pediat (Barc) 60 (4): 337-43.

723. Rooney, R. M., Cramer, E. H., Mantha, S., Nichols, G., Bartram, J. K., Farber, J. M.,

Benembarek, P. K. (2004). A review of outbreaks of foodborne disease associated with

passenger ships: evidence for risk management. Public Health Rep 119 (4): 427-34.

724. Roux, M. E., McWilliams, M., Philips-Quagliata, J. M., Weisz-Carrington, P., Lamm, M. E.

(1978). Origin of IgA secretory plasma cells in the mammary gland. Proc Natl Acad Sci USA 75

(6): 2928.

725. Roy, S., Tomkins, A., Akramuzzaman, S., Behrens, R. H., Haider, R., Mahalanabis, D., Fuchs,

G. (1997). Randomised controlled trial of zinc supplementation in malnourished Bangladeshi

children with acute diarrhoea. Arch Dis Child 77 (3): 196-200.

726. Rudloff, H. E. (1993). Interleukin-6 in human milk. J Reprod Immunol 23 (1): 13-20.

727. Rudloff, H. E., Schmalstieg, F. C. Jr., Mushtaha, A. A., Palkowetz, K. H., Liu, S. K., Goldman,

A. S. (1992). Tumor necrosis factor-alfa in human milk. Pediatr Res 31 (1): 29-33.

728. Rudloff, S., Pohlentz, G., Diekmann, L., Egge, H., Kunz, C. (1996). Urinary excretion of

lactose and oligosaccharides in preterm infants fed human milk or infant formula. Acta Paediatr

85 (5): 598-603.

729. Ruuska, T., Vesikari, T. (1990). Rotavirus disease in Finnish children: Use of numerical scores

for clinical severity of diarrhoeal episodes. Scand J Infect Dis 22 (3): 259 -67.

730. Ruvoen-Clouet, N., Ganiere, J. P., Andre-Fontaine, G., Blanchard, D., Le Pendu, J. (2000).

Binding of rabbit hemorrhagic disease virus to antigens of the ABH histo-blood group family. J

Virol 74 (24): 11950-54.

731. Ruvoen-Clouet, N., Mas, E., Marionneau, S., Guillon, P., Lombardo, D., Le Pendu, J. (2006).

Bile-salt stimulated lipase and mucins from milk of “secretor” mothers inhibit the binding of

Norwalk virus capsids to their carbohydrate ligands. Biochem J 393 (3): 627-34.

732. Sabharwal, H., Sjöblad, S., Lundblad, A. (1991). Affinity chromatographic identification and

quantitation of blood group A-active oligosaccharides in human milk and feces of breast-fed

infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr 12 (4): 474-9.

733. Sachdev, H. P. S., Mittal, N. K., Mittal, S. K., Yadav, H. S. (1988). A controlled trial on utility of

oral zinc supplementation in acute dehydrating diarrea in infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr 7

(6): 877-81.

734. Saito, S. (1991). Detection of IL-6 in human milk and its involvement in IgA production. J

Reprod Immunol 20 (3): 267-76.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schmalstieg%20FC%20Jr%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mushtaha%20AA%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Liu%20SK%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Blanchard%20D%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mas%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Marionneau%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Guillon%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lombardo%20D%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sabharwal%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sj%C3%B6blad%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lundblad%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=affinity%20chromatographic%20identification%20and%20quantitation%20of%20blood%20group%20A-active%20

_____________________________________________________________________________

247

735. Saito, S., Maruyama, M., Kato, Y., Moriyama, I., Ichijo, M. (1993). Tarnsforming growth

factor-beta (TGF-β) in human milk. Clin Exp Immunol 94 (1): 220-4.

736. Sakai, Y., Nakata, S., Honma, S., Tatsumi, M., Numata-Kinoshita, K., Chiba, S. (2001).

Clinical severity of Norwalk virus Sapporo virus gastroenteritis in children in Hokkaido, Japan.

Pediatr Infect Dis J 20 (9): 849-53.

737. Sakamoto, J., Yin, B.W.T., Lloyd, K. O. (1984). Analysis of the expression of H, Lewis, X, Y

and precursor blood group determinants in saliva and red cells using a panel of mouse

monoclonal antibodies. Mol Immunol 21: 1093-8.

738. Sala, M. R., Cardeñosa, N., Arias, C., Llovet, T., Recasens, A., Dominguez, A., Buesa, J.,

Salleras, L. (2005). An outbreak of food poisoning due to a genogroup I norovirus. Epidemiol

Infect 133 (1): 187-91.

739. Salazar-Lindo, E., Sack, R. B., Chea-Woo, E., Kay, B. A., Piscoya, Z. A., Leon-Barua, R., Yi, A.

(1986). Early treatment with erythromycin of Campylobacter jejuni associated dysentery in

children. J Pediatr 109 (2): 355-60.

740. Salazar-Lindo, E., Santisteban-Ponce, J., Chea-Woo, E., Gutierrez, M. (2000). Racecadotril in

the treatment of acute watery diarrea in children. N Engl J Med 343 (7): 463-467.

741. Salminen, S. J., Gueimonde, M., Isolauri, E. (2005). Probiotics that modify disease risk. J Nutr

135 (5): 1296-8.

742. Samson, R. R., Mirtle, C., McClelland, D. B. L. (1980). The effect of dygestive enzymes upon

the binding and bacteriostatic properties of lactoferrin and vitamin B12 binder in human milk.

Acta Paediatr Scand 69: 517.

743. Sandhu, B. K. European Society of Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition

Working Group on Acute Diarrhoea. (2001). Rationale for early feeding in childhood

gastroenteritis. J Pediatr Gastroenterol Nutr 33 (2): 13-6.

744. Sandhu, B. K., Cristobal, F. I., Brueton, M. J. (1989). Optimising oral rehydration solution

composition in model systems: studies in normal mammalian small intestine. Acta Paediatr

Scand 364: 17-22.

745. Sanguansermsi, J., György, P., Zilliken, F. (1974). Polyamines in human and cow´s milk. Am J

Clin Nutr 27: 859-65.

746. Sazawal, S., Black, R. E., Bhan, M. K., Bhandari, N., Sinha, A., Jalla, S. (1995). Zinc

supplementation in young children with acute diarrea in India. N Engl J Med 333 (13): 839-44.

747. Scahnler, R. J., Goldblum, R. M., Garza, C., Goldman, A. S. (1986). Enhanced fecal excretion

of selected immune factors in very low birth weight infants fed fortified human milk. Pediatr

Res 20 (8): 711-5.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kay%20BA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Piscoya%20ZA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Leon-Barua%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yi%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22European%20Society%20of%20Paediatric%20Gastroenterology%2C%20Hepatology%20and%20Nutrition%20Working%20Group%20on%20Acute%20Diarrhoea%22%5BCorporate%20Author%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22European%20Society%20of%20Paediatric%20Gastroenterology%2C%20Hepatology%20and%20Nutrition%20Working%20Group%20on%20Acute%20Diarrhoea%22%5BCorporate%20Author%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Goldblum%20RM%22%5BAuthor%5D



_____________________________________________________________________________

248

748. Schaffer, F. L., Soeregel, M. E., Black, J. W., Skilling, D. E., Smith, A. W., Cubbitt, W. D.

(1985). Characterization of a new Calicivirus isolated from feces of a dog. Arch Virol 84 (3-4):

181-95.

749. Schaffer, F. L., Zeresmann, D. W., Fretz, M. K., Soergel, M. I. (1980). A protein VPg

covalently linked to 36S calicivirus RNA. J Gen Virol 47: 215-20.

750. Schanler, R. J., Goldblum, R. M., Garza, C., Goldman, A. S. (1986). Enhanced fecal excretion

of selected immune factors in very low birth weight infants fed fortified human milk. Pediatr

Res 20 (8): 711-5.

751. Schierer, S. H. (2003). Clinical aspects of gastrointestinal food allergy in childhood. Pediatrics

111 (6): 1609-16.

752. Schnorr, K. L., Pearson, L. D. (1984). Intestinal absorption of maternal leukocytes by newborn

lambs. J Reprod Immunol 6 (5): 329-37.

753. Schreiber, D. S., Blacklow, N. R., Trier, J. S. (1973). The mucosal lesion of the proximal small

intestine in acute infectious nonbacterial gastroenteritis. N Engl J Med 288 (25): 1318-23.

754. Schreiber, D. S., Blaclow, N. R., Trier, J. S. (1974). The small intestinal lesion induced by

Hawaii agent acute infectious nonbacterial gastroenteritis. J Infect Dis 129 (6): 705-8.

755. Schultz, C. L., Coffman, R. L. (1991). Control of isotype switching by T cells and cytokines.

Curr Opin Immunol 3 (3): 350-4.

756. Schwab, K. J., Estes, M. K., Atmar, R. L. (2000). Norwalk and other human caliciviruses:

molecular characterization, epidemiology and pathogenesis. En “Microbial foodborne diseases:

mechanisms of pathogenecity and toxin synthesis”. 1ª ed. (Cary, J. W., Linz, J. E., Bhatnagar,

D. eds.). Lancaster, Pa: Technomic Publishing Company, Inc; 469-93.

757. Schwab, K. J., Estes, M. K., Neil, F. H., Atmar, R. L. (1997). Use of heat release and internal

RNA standard control in reverse transcription-PCR detection of Norwalk virus from stool

samples. J Clin Microbiol 35 (2): 511-4.

758. Scott, K. J., Salter, D. N., Finglass, P. (1990). A possible physiologic role for the milk folate

binding protein in the nutrition of the neonate. Colloque INSERM 197: 483-7.

759. Scroten, H., Hanisch, F. G., Plogmann, R., Hacker, J., Uhlenbruck, G., Nobis-Bosch, R, Wahn,

V. (1992). Inhibition of adhesión of S-fimbriated Escherichia coli to buccal epitelial cells by

human milk fat globule membrane components: a novel aspect of the protective function of

mucins in the nonimmunoglobulin fraction. Pediatr Res 60 (7): 2893-9.

760. Sder, Q. W., Lewis, D., Price, E. H. (1986). Norwalk-like viruses: study of an outbreak. Arch

Dis Child 61: 142-7.

761. Seah, E. L., Gunesekere, I. C., Marshall, J. A., Wright, P. J. (1999). Variation in ORF3 of

genogroup 2 Norwalk-viruses. Arch Virol 144 (5): 1007-14.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Goldblum%20RM%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hanisch%20FG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Plogmann%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hacker%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Uhlenbruck%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nobis-Bosch%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wahn%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wahn%20V%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

249

762. Seas, C., DuPont, H., Valdez, L., Gotuzzo E. (1996). WHO position paper on Oral Rehydration

Salts to reduce mortality on cholera. Practical guidelines for the treatment of cholera. Drugs 51:

966-73.

763. Serpa, J., Lunet, N., Mendes, N., Barros, H., David, L. (2004). Lewis and secretor status and

Helicobacter pylori infection. Epidemiol Infect 132 (5): 997-8.

764. Serpa, J., Mendes, N., Reis, C.A., Santos-Silva, L.F., Almeida, R., Le Pendu, J., David, L.

(2004). Two new FUT2 (fucosyltransferase 2 gene) missense polymorphisms, 739G-->A and

839T-->C, are partly responsible for non-secretor status in a Caucasian population from

Northern Portugal. Biochem J. 383 (3): 469-74.

765. Sfadar, N., Said, A., Gangnon, R. E., Maki, D. G. (2002). Risk of hemolytic uremic syndrome

after antibiotic treatment of Escherichia coli O157:H7 enteritis: a meta-analysis. JAMA 288 (8):

996-1001.

766. Shanker, S., Choi, J. M., Sankaran, B., Atmar, R.L., Estes, M.K., Prasad, B.V. (2011).

Structural analysis of histo-blood group antigen binding specificity in a norovirus GII.4

epidemic variant: implications for epochal evolution. J Virol 85 (17): 8635-45.

767. Shastri, S., Doane, A. M., Gonzales, J., Upadhyayula, U., Bass, D. M. (1998). Prevalence of

astroviruses in a children´s hospital. J Clin Microbiol 36 (9): 2571-4.

768. Sherman, P. M., Cabana, M., Gibson, G. R., Koletzko, B. V., Neu, J., Veereman-Wauters, G.,

Ziegler, E. E., Walker, W. A. (2009). Potential roles and clinical utility of prebiotics in

newborns, infants, and children: proceedings from a global prebiotic Summit meeting, New

York City, June 27-28, 2008. J Pediatr 155 (5): 61-70.

769. Shimizu, T., Yamashiro, Y., Yabuta, K. (1992). Prostaglandin E1, E2 and F2a in human milk

and plasma. Biol Neonate 61 (4): 222-5.

770. Shull, M. M., Ormsby, I., Kier, A. B., Pawlowski, S., Diebold, R. J., Yin, M., Allen, R.,

Sidman, C., Proetzel, G., Calvin, D., Annunziata, N., Doetschman, T. (1992). Targeted

disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory

disease. Nature 359 (6397): 693-9.

771. Siebenga, J. J., Vennema, H., Duizer, E., Koopmans, M. P. (2007). Gastroenteritis caused by

norovirus GGII.4. The Netherlands, 1994-2005. Emerg Infect Dis 13 (1): 144-6.

772. Simmonds, P., Karakasiliotis, I., Bailey, D., Chaudry, Y., Evans, D. J., Goodfellow, I. G.

(2008). Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among

different genera of human and animal caliciviruses. Nucleic Acids Res 36 (8): 2530-46.

773. Simmons, G., Greening, G., Gao, W., Campbell, D. (2001). Raw oyster consumption and

outbreaks of viral gastroenteritis in New Zealand: evidence for risk to the public´s health. Aust

N Z Public Health 25 (3): 234-40.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yamashiro%20Y%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yabuta%20K%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

250

774. Simon, A., Schildgen, O., Eis-Habinger, M., Hasan, C., Bode, U., Buderus, S., Engelhart, S.,

Fleischack, G. (2006). Norovirus outbreak in a Pediatric Oncology Unit. Scand J Gastroenterol

41 (6): 693-9.

775. Sirinavin, S. Garner, P. (2000). Antibiotics for treating salmonella gut infections. Cochrane

Database Syst Rev 1: CD001167.

776. Sjazewska, H., Hoekstra, J. H., Shandu, B. The Working Group on Acute Diarrhoea of the

European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition. (2000).

Management of acute gastroenteritis in Europe and the impact of the new reccomendations: a

multicenter study. J Pediatr Gastroenterol Nutr 30 (5): 522-7.

777. Sjazewska, H., Murkovicz, J. Z. (2001). Probiotics in the treatment and prevention of acute

infectious diarrea in infants and children: a systematic review of published randomized, double-

blind, placebo-controlled trials. J Pediatr Gastroenterol Nutr 33 (2): 17-25.

778. Skansén-Saphir, U., Lindfors, A., Andersson, U. (1993). Cytokine production in mononuclear

cells of human milk studied at the single-cell level. Pediatr Res 34 (2): 213-6.

779. Slade, H. B., Schwartz, S. A. (1987). Mucosal immunity: the immunology of breast milk. J

Allergy Clin Immunol 80 (3-1): 348-58.

780. Smiley, J. R., Chang, K. O., Hayes, J., Vinjé, J, Saif, L. J. (2002). Characterization of an

enteropathogenic bovine calicivirus representing a potentially new calicivirus genus. J Virol 76

(20): 10089-98.

781. Smith, A. W., Skilling, D. E., Cherry, N., Mead, J. H., Matson, D. O. (1998). Calicivirus

emergence from ocean reservoirs: zoonotic and interspecies movements. Emerg Infect Dis 4 (1):

13-20.

782. Smith, C. W., Goldman, A. S. (1968). The cells of human colostrum. I. In vitro studies of

morphology and functions. Pediatr Res 2 (2): 103-9.

783. Smolinski, M. S., Hamburg, M. A., Lederberg, J., eds. (2003). “Microbial threats to health:

Emergence, detection and response”. 1ª ed. Washington: National Academic Press; 281-312.

784. Soejima, M., Fujimoto, R., Agusa, T., Iwata, H., Fujihara, J., Takeshita, H., Minh, T. B., Trang,

P. T., Viet, P. H., Nakajima, T., Yoshimoto, J., Tanabe, S., Koda, Y. (2011). Genetic variation

of FUT2 in a Vietnamese population: identification of two novel Se enzyme-inactivating

mutations. Transfusion 21.

785. Soejima, M., Nakajima, T., Fujihara, J., Takeshita, H., Koda, Y. (2008). Genetic variation of

FUT2 in Ovambos, Turks, and Mongolians. Transfusion 48 (7):1423-31.

786. Soejima, M., Pang, H., Koda, Y. (2007). Genetic variation of FUT2 in a Ghanaian population:

identification of four novel mutations and inference of balancing selection. Ann Hematol 86

(3):199-204.

_____________________________________________________________________________

251

787. Sommer, C., Mueller, W., Resch, B. (2009). Two norovirus noscomial outbreaks in the neonatal

intensive and intermediate care unit. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 28 (9): 1133-6.

788. Sorea, S., Dabadie, A., Bridoux-Henno, L., Balançon-Morival, M., Jouan, H., Le Gall, E.

(2003). Colite hémorragique chez le nourrissons an allaitement maternel exclusif. Arch Pediatr

3003 (10): 772-5.

789. Sosnovtsev, S. V., Belliot, G., Chang, K. O., Onwudiwe, O., Green, K. Y. (2005). Feline

calicivirus VP2 is essential for the production of infectious virions. J Virol 79 (7): 4012-24.

790. Sosnovtsev, S. V., Belliot, G., Chang, K. O., Prikhodko, V. G., Thackray, L. B., Wobus, C.

E., Karst, S. M., Virgin, H. W., Green, K. Y. (2006). Cleavage map and proteolytic processing of

the murine norovirus nonstructural polyprotein in infected cells. J Virol 80 (16): 7816-31.

791. Sosnovtsev, S. V., Garfield, M., Green K. (2002). Processing map and essential cleavage sites

of nonestructural polyprotein encoded by ORF1 of the feline calicivirus genome. J Virol 76

(14): 7060-72.

792. Sosnovtsev, S. V., Green, K. Y. (2000). Identification and genomic mapping of the ORF3 and

VPg proteins in feline calicivirus virions. Virology 277 (1): 193-203.

793. Sosnovtsev, S. V., Sosnovtseva, S. A., Green, K. Y. (1998). Cleavage of the feline calicivirus

capsid precursor is mediated by a virus-encoded proteinase. J Virol 72 (4): 3051-59.

794. Sosnovtsev, S., Green, K. Y. (1995). RNA transcripts derived from a cloned full-length copy of

the feline calicivirus genome do not require VPg for infectivity. Virology 210 (2): 383-90.

795. Sosnovtseva, S. A, Sosnovtsev, S. V, Green, K. Y. (1999). Mapping of the feline calicivirus

proteinase responsable for autocatalytic processing of the nonestructural polyprotein and

identification of a stable proteinase-polymerase precursor protein. J Virol 73 (8): 6626-33.

796. Spik, G., Brunet, B., Mazurier-Dehaine, C., Fontaine, G., Montreuil, J. (1982). Characterization

and properties of the human and bovine lactotransferrins extracted from the feces of newborn

infants. Acta Paediatr Scand 71 (6): 979-85.

797. Spik, G., Cheron, A., Monteul, J., Dolby, J. M. (1978). Bacterostasis of a milk.sensitive strain

of Escherichia coli by immunoglobulins and iron-binding proteins in association. Immunology

35 (4): 663-71.

798. Spik, G., Montreuil, J. (1966). Etudes comparatives de la structure de la transferrine de la

lactotransferrine humaines. Fingerprinting des hydolites proteasiques des deux glycoproteides.

CR Seances Soc Biol Paris 160: 94.

799. Springer, T. A. (1994). Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration:

the multistep paradigm. Cell 76 (2): 301-14.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Prikhodko%20VG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Thackray%20LB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wobus%20CE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wobus%20CE%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Karst%20SM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Virgin%20HW%22%5BAuthor%5D


_____________________________________________________________________________

252

800. Stahl, B., Thurl, S., Zeng, J., Karas, M., Hillenkamp, F., Steup, M, Sawatzki, G. (1994).

Oligosaccharides from human milk as revealed by matrix-assisted laser desorption/ionization

mass spectrometry. Anal Biochem 223 (2): 218-26.

801. Stanley, P., Cummings, R. D. Structures common in glycans. (2008). En “Essentials of

Glycobiology”. 2ª ed. (Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P.,

Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E., eds.). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold

Spring Harbors. New York: 179-86.

802. Steinhoff, M. C., Douglas Jr., R. G., Greenberg, H. B., Callahan, D. R. (1980). Bismuth

subsalicylate therapy of viral gastroenteritis. Gastroenterology 78 (6): 1495-99.

803. Stenberg, K., Johns, B., Scherpbier, R. W., Tan-Torres Edejer, T. (2007). A financial road map to

scaling up essential child health interventions in 75 countries. Bull of the World Health Organ

85 (4): 305-314.

804. Stephens, S. (1986a). Development of secretory immunity in breast fed and bottle fed infants.

Arch Dis Child 61 (3): 263-9.

805. Stephens, S., Dolby, J. M., Monteruil, J., Spik, G. (1980). Differences in inhibition of the

growth of commensal and enteropathogenic strains of Escherichia coli by lactoferrin and

secretory immunoglobulin A isolated from human milk. Immunology 41: 597.

806. Stephens, S., Kennedy, C. R., Lakhani, P. K., Brenner, M. K. (1986b). In-vivo immune

responses of breast- and bottle-fed infants to tetanus toxoid antigen and to normal gut flora.

Acta Paediatr Scand 73 (4): 426-32.

807. Stigbrand, T. (1976). Biochemistry and properties of the immunosuppressive pregnancy zone

protein (PZ). Prot Biol Fluids 24: 181-8.

808. Storry, J.R., Johannesson, J.S., Poole, J., Strindberg, J., Rodrigues, M.J., Yahalom, V.,

Levene,C., Fujita, C., Castilho, L., Hustinx, H., Olsson, M.L. (2006). Identification of six new

alleles at the FUT1 and FUT2 loci in ethnically diverse individuals with Bombay and Para-

Bombay phenotypes. Transfusion 46 (12): 2149-55.

809. Straub, T. M., Honer zu, B. K., Orosz-Coghlan, P., Dohnalkova, A., Mayer, B.

K., Bartholomew, R. A., Valdez, C. O., Bruckner-Lea, C. J.,Gerba, C. P., Abbaszadegan, M.,

Nickerson, C. A. (2007). In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg

Infect Dis 13 (3): 396-403.

810. Streeter, P. R., Berg, E. L., Rouse, B. T., Bargatze, R. F., Butcher, E. C. (1988). A tissue

specific endothelial cell molecule involved in lymphocyte homing. Nature 331 (6151): 41-6.

811. Strömquist, M., Falk, P., Bergström, S., Hansson, L., Lonnerdal, B., Normark, S., Hernell, O.

(1995). Human milk κ-casein and inhibition of Helicobacter pylori adhesion to human gastric

mucosa. J Pediatr Gastroenterol Nutr 21 (3): 288-96.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kennedy%20CR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lakhani%20PK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brenner%20MK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Dohnalkova%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mayer%20BK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mayer%20BK%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bartholomew%20RA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Valdez%20CO%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bruckner-Lea%20CJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gerba%20CP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Abbaszadegan%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Nickerson%20CA%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

253

812. Stuart, J., Norrell, S., Harrington, J. P. (1984). Kinetic effect of human lactoferrin on the growth

of Escherichia coli. J Biochem 16 (10): 1043-7.

813. Stuart, R. L., Tan, K., Mahar, J. E., Kirkwood, C. D., Ramsden, A. C., Andranopoulos, N.,

Jolley, D., Bawden K., Doherty, R., Kotsanas, D., Bradford, J., Buttery, J. P. (2010). An

outbreak of necrotizing enterocolitis associated with norovirus genotype GII.3. Pediatr Infect

Dis 29 (7): 644-7.

814. Subekti, D. S., Tjaniadi, P., Lesmana, M., McArdle, J., Iskandriati, D., Budiarsa, I. N., Walujo,

P., Suparto, I. H., Winoto, I., Campbell, J. R., Porter, K. R., Sajuthi, D., Ansari, A. A., Oyofo,

B. A. (2002). Experimental infection of Macaca nemestrina with a Toronto Norwalk-like virus

of epidemic viral gastroenteritis. J Med Virol 66 (3): 400-6.

815. Sugieda, M., Nagaoka, H., Kakishima, Y., Ohshita, T., Nakamura, S., Nakajima, S. (1998).

Detection of Norwalk-like virus genes in the caecum content of pigs. Arch Virol 143 (6): 1215-

21.

816. Sugieda, M., Nakajima, K., Nakajima, S. (1996). Outbreaks of Norwalk-like viruses associated

gastroenteritis traced to shellfish: coexistence of two genotypes in one specimen. Epidemiol

Infect 116 (3): 339-46.

817. Sumpter, R. Jr., Loo, Y. M., Foy, E., Li, K., Yoneyama, M., Fujita, T., Lemon, S. M., Gale, M.

Jr. (2005). Regulating intracellular antiviral defense and permissiveness to hepatitis C virus

RNA replication through a cellular RNA helicase, RIG-I. J Virol 79 (5): 2689-99.

818. Svraka, S., Vennema, H., van der Veer, B., Hedlund, K., Thorhagen, M., Siebenga, J., Duizer,

E., Koopmans, M. (2010). Epidemiology and genotype analysis of emerging sapovirus-

associated infections across Europe. J of Clin Microbiol 41 (8): 2191-98.

819. Szajewska, H., Setty, M., Mrukowicz, J., Guandalini, S. (2006). Probiotics in Gastrointestinal

Diseases in Children: Hard and Not-So-Hard Evidence of efficacy. J of Pediatr Gastroenterol

Nutr 42 (5): 454-75.

820. Szajewska, H., Skorka, A., Ruszczynski, M., Gieruszczak-Bialek, D., Dylag, M. (2007). Meta-

analysis: Lactobacillus GG for treating acute diarrhoea in children. Aliment Pharmacology

Therapeutics 25 (3): 257-64.

821. Tacket, C. O., Mason, H. S., Losonsky, G., Estes, M. K., Levine, M. M., Arntzen, C. J. (2000).

Human immune responses to a novel Norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes. J

of Infect Dis 182 (1): 302-5.

822. Tacket, C. O., Sztein, M. B., Losonky, G. A., Wasserman, S. S., Estes, M. K. (2003). Humoral,

mucosal, and cellullar immune responses to oral Norwalk virus-like particles in volunteers. Clin

Immunol 108 (3): 241-7.

823. Takeuchi, O., Akira, S. (2007). Recognition of viruses by innate immunity. Immunol Rev 220:

214-224.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McArdle%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Iskandriati%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Budiarsa%20IN%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Walujo%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Walujo%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Suparto%20IH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Winoto%20I%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Campbell%20JR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Porter%20KR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sajuthi%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ansari%20AA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oyofo%20BA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oyofo%20BA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wasserman%20SS%22%5BAuthor%5D


_____________________________________________________________________________

254

824. Takkinen, J. (2006). Recent norovirus outbreaks on river and seagoing cruise ships in Europe.

Euro Surveill 11 (7): E060706.5.

825. Tamura, M., Natori, K., Kobayashi, M., Miyamura, T., Takeda, N. (2004). Genogroup II

noroviruses efficiently bind to heparan sulfate proteoglycan associated with the celular

membrane. J Virol 78 (8): 3817-26.

826. Tamura, M., Natori, K., Kobayashi, M., Miyamura, T., Takeda, N. (2000). Interaction of

recombinant Norwalk virus particles with the 105-kilodalton celular binding protein, a

candidate receptor molecule for virus attachment. J Virol 74 (24): 11589-97.

827. Tan, M., Huang, P., Meller, J., Zhong, W., Farkas, T., Jiang, X. (2003). Mutations within the P2

domain of norovirus capsid affect binding to human histo-blood group antigens: evidence for a

binding pocket. J Virol 77 (23): 12562-71.

828. Tan, M., Jiang, X. (2005a). Association of histo-blood group antigens and susceptibility to

norovirus infections. J Infect Dis 191 (5): 749-54.

829. Tan, M., Jiang, X. (2005b). Norovirus and histo-blood group antigen receptors: an answer to a

historical puzzle. Trends Microbiol 13 (6): 285-93.

830. Tan, M., Jiang, X. (2005c). The P domain of norovirus capsid protein forms a subviral particle

that binds to histo-blood group antigen receptors. J Virol 79 (22): 14017-30.

831. Tan, M., Meller, J., Jiang, X. (2006). C-terminal arginine cluster is essential for receptor

binding of norovirus capsid protein. J Virol 80 (15): 7322-31.

832. Tan, M., Xia, M., Chen, Y., Bu, W., Hedge, R. S., Meller, J., Li, X. (2009). Conservation of

carbohydrate binding interfaces evidence of human HBGA selection in norovirus. PLos ONE 4

(4): e5058.

833. Tan, M., Zhong, W., Song, D., Thornton, S., Jiang, X. (2004). E. coli-expressed recombinat

norovirus capsid proteins mantain authentic antigenicity and receptor binding capability. J Med

Virol 74 (4): 641-9.

834. Teichberg, S., Wapnir, R. A., Moyse, J., Lifshitz, F. (1992). Development of the neonatal rat

small intestine barrier to nonspecific macromolecular absorption. II. Role of dietary

corticosterone. Pediatr Res 32 (1): 50-7.

835. Ternhag, A., Asikainen, T., Giesecke, J., Ekdahl, K. (2007). A meta-analysis on the effects of

antibiotic treatment on duration of symptoms caused by infection with Campylobacter species.

Clin Infect Dis 44 (5): 696-700.

836. Thillainayagam, A., Hunt, J., Farthing, M. (1998). Enhancing clinical efficacy of oral

rehydration therapy: is low osmolality the key? Gastroenterol 114 (1): 197-210.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kobayashi%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miyamura%20T%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wapnir%20RA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Moyse%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lifshitz%20F%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

255

837. Thoren, A., Wolde-Mariam, T., Stintzing, G., Wadström, T., Habte, D. (1980). Antibiotics in the

treatment of gastroenteritis caused by enteropathogenic Escherichia coli. J Infect Dis 141 (1):

27-31.

838. Thormar, H., Isaacs, C. E., Brown, H. R., Barshatzky, M. R., Pessolano, T. (1987). Inactivation

of enveloped viruses and killing of cells by fatty acids and monoglycerides. Antimicrobial

Agents and Chemotherapy. Am Soc Microbiol 31 (1): 27-31.

839. Thornhill, T. S., Kalica, A. R., Wyatt, R. G., Kapikian, A. Z., Chanock, R. M. (1975). Pattern of

shedding of the Norwalk particle in stools during experimentally induced gastroenteritis in

volunteers as determined by immune electron microscopy. J Infect Dis 132 (1): 28-34.

840. Thornhill, T. S., Wyatt, R. G., Kalica, A. R., Dolin, R., Chanock, R. M., Kapikian, A. Z. (1977).

Detection by immune electron microscopy of 26 to 27-nm virus-like particles associated with

two family outbreaks of gatroenteritis. J Infect Dis 135 (1): 20-7.

841. Thorpe, L. W., Rudloff, H. E., Powell, L. C., Goldman, A. S. (1986). Decreased response of

human milk leukocytes to chemoattractant peptides. Pediatr Res 20 (4): 373-7.

842. Thorven, M., Grahn, A., Hedlund, K.O., Johansson, H., Wahlfrid, C., Larson, G., Svensson, L.

(2005). A homozygous nonsense mutation (428G-A) in the human secretor (FUT 2) gene

provides resistance to symptomatic norovirus (GGII) infections. J of Virol 79 (24): 15351-5.

843. Thumfart, J. O., Meyers, G. (2002). Feline Calicivirus: recovery of wild-type and recombinant

viruses after transfection of cRNA or cDNA constructs. J Virol 76 (12): 6398-407.

844. Thurl, S., Henker, J., Siegel, M., Tovar, K., Sawatzki, G. (1997). Detection of four human milk

groups with respect to Lewis-blood-group-dependent oligosaccharides. Glycoconj J 14 (7): 795-

99.

845. Thurl, S., Werner, B. M., Sawatzki, G. (1996). Quantification of individual oligosaccharides

compounds from human milk using high-pH anion exchange chromatography. Ann Biochem

235 (2): 202-6.

846. Tian, X.F., Li, Z.J., Wang, B.J., Ding, M., Xuan, J.F., Xing, J.X., Li, C.M., Pang, H.Fa. (2009).

Polymorphic distribution of FUT2/01 in northern Han Chinese population. Yi Xue Za Zhi 25

(5):345-7.

847. Tissier, H. (1905). Repartition des microbes dans l´intestin du nourisson. Ann Inst Pasteur

(Paris) 19 (15-17): 109-23.

848. Toivanen, P., Rossi, T., Hirvonen, T. (1969). Immunoglobulins in human fetal sera at different

stages of gestation. Experimentia 25 (5): 527-28.

849. Tompkins, D. S., Hudson, M. J., Smith, H. R., Eglin, R. P., Wheeler, J. G., Brett, M. M., Owen,

R. J., Brazier, J. S., Cumberland, P., King, V., Cook, P. E. (1992). A study of infectious intestinal

http://www.springerlink.com/content/?Author=T.+Rossi

http://www.springerlink.com/content/?Author=T.+Hirvonen

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Eglin%20RP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wheeler%20JG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brett%20MM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Owen%20RJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Owen%20RJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brazier%20JS%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cumberland%20P%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22King%20V%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Cook%20PE%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

256

disease in England: microbiological findings in cases and controls. Commun Dis Public Health

2: 108-13.

850. Tong, M. J., Martin, D. G., Cunningham, J. J., Gunning, J. J. (1970). Clinical and

bacteriological evaluation of antibiotic in Shigellosis. JAMA 214 (10): 1841-4.

851. Totterdell, B. M., Chrystie, I. L., Banatvala, J. E. (1976). Rotavirus infection in a maternity unit.

Arch Dis Child 51: 924.

852. Treanor, J. J., Dolin, R. (2005). Noroviruses and other Caliciviruses. En “Principles and Practice

of Infectious Diseases”. 6a ed. (Mandell, G. L., Benett, J. E., Dolin, R., eds.). Philadelphia:

Churchill Livingstones; 2194-9.

853. Treanor, J. J., Jiang, X., Madore, H. P., Estes, M. K. (1993). Subclass specific serum antibody

responses to recombinant Norwalk virus capsid antigen (rNV) in adults infected with Norwalk,

Snow Mountain, or Hawaii virus. J Clin Microbiol 31 (6): 1630-4.

854. Treanor, J. J., Madore, H. P., Dolin, R. (1986). Development of a monoclonal antibody to the

Snow Mountain agent of gastroenteritis (abstract 109). En “Program and Abstracts of the 26th

Interscience Conference of Antimicrobial Agents and Chemotherapy”. Washington, DC:

American Society for Microbiology.

855. Treviño, M., Prieto, E., Peñalver, M. D., Aguilera, A., García-Zabarte, A., García-Riestra, C.,

Regueiro, B. J. (2001). Diarrea por adenovirus y astrovirus en pacientes inmunodeficientes

hospitalizados. Enferm Infecc Microbiol Clin 19 (1): 7-10.

856. Tsuda, H., Dickey, W. D., Goldman, A. S. (1984a). Separation of human colostral macrophages

and neutrophils on gelatin and collagen-serum substrata. Cell Struct Funct 8 (4): 367-71.

857. Tsuda, H., Takeshige, K., Shibata, Y., Minakami, S. (1984b). Oxygen metabolism of human

colostral macrophages. J Biochem 95: 1237.

858. Tsugawa, T., Numata-Kinoshita, K., Honma, S., Nakata, S., Tatsumi, M., Sakai, Y., Natori, K.,

Takeda, N., Kobayashi, S., Tstsumi, H., Sakai, Y., Natori, K., Takeda, N., Kobayashi, S.,

Tsutsumi, H. (2006). Virological, serological, and clinical features of an outbreak of acute

gastroenteritis due to recombinant genogroup II norovirus in an infant home. J of Clin

Microbiol 44 (1): 177-182.

859. Tu, E. T., Nguyen, T., Lee, P. Bull, R. A., Musto, J., Hansman, G., White, P. A., Rawlinson, W.

D., McIver, C. J. (2007). Norovirus GII.4 strains and outbreaks, Australia. Emerg Infect Dis 13

(7): 1128-30.

860. Tucker, A. W., Haddix, A. C., Breese, J. S., Holman, R. C., Parashar, U. D., Glass, R. I. (1998).

Cost effectiveness analysis of rotavirus immunization program in the United States. JAMA 279:

1371-76.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sakai%20Y%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kobayashi%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tsutsumi%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Bull%20RA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Musto%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hansman%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22White%20PA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rawlinson%20WD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Rawlinson%20WD%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22McIver%20CJ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Holman%20RC%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Parashar%20UD%22%5BAuthor%5D


_____________________________________________________________________________

257

861. Turcios, R. M., Widdowson, M. A., Sulka, A. C., Mead, P. S., Glass, R. I. (2006). Reevaluation

of epidemiological criteria for identifying outbreaks of acute gastroenteritis due to norovirus:

United States, 1998-2000. Clin Infect Dis 42 (7): 964-9.

862. Turcios-Ruiz, R. M., Axelrod, P., St John, K., Bullitt, E., Donahue, J., Robinson, N., Friis, H. E.

(2008). Outbreak of necrotizing enterocolitis caused by norovirus in a neonatal intensive care

unit. J Pediatr 153 (3): 339-44.

863. Underdown, B. J., Knight, A., Papsin, F. R. (1976). The relative paucity of IgE in human milk.

J Immunol 116 (5): 1435-8.

864. Van der Poel, W. H., Vinje, J., van der Heide, R., Herrera, M. I.,Vivo, A., Koopmans, M. P.

(2000). Norwalk-like calicivirus genes in farm animals. Emerg Infect Dis 6 (1): 36-41.

865. Van Kooyk, Y., Geijtenbeek, T. B. (2003). DC-SIGN: escape mechanism for pathogens. Nat Rev

Immunol 3 (9): 697-709.

866. Van Leeuwenhoek, A. (1965). In “Arcana naturae detecta delphis batavorum. Apud Henricum

a Krooneveld“. Epistola 106.

867. Van Niel, C. W., Feudtner, C., Garrison, M. M., Christakis, D. A. (2002). Lactobacillus therapy

for acute infectious diarrea in children: a meta-analysis. Pediatrics 109 (4): 678-84.

868. Vanderhoof, J., Young, R. (2002). Probiotics in Pediatrics. Pediatrics 109 (1): 956-8.

869. Varki, A. (1997). Selectin ligands: will the real ones please stand up? J Clin Invest 99 (2): 158-

62.

870. Veereman-Wauters, G., Taminiau, J. (2006). Diarrhea. En “Pediatric Gastroenterology and Liver

Disease. Patophisiology, Diagnosis and Management”. 3a ed. (Willie, R., Hyams, J. S., Kay, M.,

eds.).The Netherlands; 151-168.

871. Veerhuis, R., Kijlstra, A. (1982). Inhibition of hemolytic complement activity by lactoferrin in

tears. Exp Eye Res 34 (2): 257-65.

872. Venkataram Prasad, B. V., Hardy, M. E., Estes, M. K. (2000). Structural studies of recombinant

Norwalk capsids. J Infect Dis 181 (2): 317-21.

873. Venkataram Prasad, B. V., Rothnagel, R., Jiang, X., Estes, M. K. (1994). Three-dimensional

estructure of baculovirus-expressed Norwalk virus capsids. J Virol 68 (8): 5117-25.

874. Vicente, D., Cilla, G., Montes, M., Pérez-Yarza, E. G., Pérez-Trallero, E. (2007). Human

bocavirus, a respiratory and enteric virus. Emerg Infect Dis 13 (4): 636-7.

875. Victoria, C., Bryce, J., Fontaine, O., Monasch, R. (2000). Reducing deaths from diarrea trough

oral rehydration therapy. Bull World Health Organ 78 (10): 1246-55.

876. Victoria, C., Util, S., Fuchs, S., Nobre, L. C., Barros, F. C. (1992). Deaths due to dysentery,

acute and persistent diarrea among Brazilian infants. Acta Paediatr 381: 7-11.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Knight%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Papsin%20FR%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

258

877. Victoria, M., Carvalho-Costa, F. A., Heinemann, M. B., Leite, J. P., Miagostovich, M. P.

(2007). Genotypes and molecular epidemiology of human astroviruses in hospitalized children

with acute gastroenteritis in Rio de Janeiro, Brazil. J Med Virol 79 (7): 939-44.

878. Vidal, R., Solari, V., Mamani, N., Jiang, X., Vollaire, J., Roessler, P., Prado, V., Matson, D. O.,

O'Ryan, M. L. (2005). Caliciviruses and foodborne gastroenteritis, Chile. Emerg Infect Dis 11

(7): 1134-7.

879. Vinje, J., Altena, S. A., Koopmans, M. P. (1997). The incidence and genetic variability of small

round-structured viruses in outbreaks of gastroenteritis in The Netherlands. J Infect Dis 176 (5):

1374-8.

880. Vinjé, J., Green, J., Lewis, D. C., Gallimore, C. I., Brown, D. W., Koopmnas, M. P. (2000a).

Genetic polymorphism across regions of the three open reading frames of “Norwalk-like

viruses”. Arch Virol 145 (2): 223-41.

881. Vinjé, J., Koopmans, M. P. (1996). Molecular detection and epidemiology of small-round

structured viruses in outbreaks of gastroenteritis in the Netherlands. J Infect Dis 174 (3): 610-5.

882. Vinjé, J., Koopmans, M. P. G. (2000b). Simultaneous detection and genotyping of “Norwalk-

like viruses” by oligonucleotide array in a reverse line blot hybridization format. J of Clin

Microbiol 38 (7): 2595-601.

883. Vinje, J., Vennema, H., Maunula, L., von Bonsdorff, C. H., Hoehne, M., Schreier, E., Richards,

A., Green, J., Brown, D., Beard, S. S., Monroe, S. S.,de Bruin, E., Svensson, L., Koopmans, M.

P. (2003). International collaborative study to compare reverse transcriptase PCR assays for

detection and genotyping of noroviruses. J Clin Microbiol 41 (4): 1423-33.

884. Viverge, D., Grimmonprez, L., Cassanas, G., Bardet, L., Solere, M. (1990). Discriminant

carbohydrate components of human milk according to donor secretor types. J Pediatr

Gastroenterol Nutr 11 (3): 365-70.

885. Von Ehrlich, P. (1891). Experimentelle untersuchungen über Inmunität.I Üeber ricin. Deutschen

Medicinischen Wochenschrift 32: 1.

886. Von Liebig, J. (1865). Suppe für Säuglinge. Braunschweig. Ed. Friedrich Boewig und Sohn.

887. Walker, C. L., Bhutta, Z. A., Bhandari, N., Teka, T., Shahid, F., Taneja, S., Black, R. E. (2007).

Zinc during and in convalescence from diarrhea has no demonstrable effect on subsequent

morbidity and anthropometric status among infants < 6 mo of age. Am J Clin Nutr 85 (3): 887-

94.

888. Walker-Smith, J. A. (1990). Management of infantile gastroenteritis. Arch Dis Child 65: 917-

918.

889. Walker-Smith, J. A. (1994). Intractable diarrhoea in infancy: a continuing challenge for the

Paediatric Gastroenterologist. Acta Pediatr 83 (395): 6-9.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22von%20Bonsdorff%20CH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Hoehne%20M%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Richards%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Richards%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Green%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Brown%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Beard%20SS%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22de%20Bruin%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Svensson%20L%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Koopmans%20MP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Koopmans%20MP%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

259

890. Walker-Smith, J. A., Sandhu, B. K., Isolauri, E. (1997). Guidelines prepared by the ESPHGAN

Working Group on Acute Diarrhoea. Recommendations for feeding in childhood gastroenteritis.

Medical position paper on behalf of European Society of Pediatric Gastroenterology and

Nutrition. J Pediatr Gastroenterol Nutr 24 (1-2): 619-20.

891. Walker-Smith, J., Murch, S., eds. (1999). Gastroenteritis and its sequelae. En “Diseases of the

Small intestine in Childhood”. 4a ed. Oxford: Isis medical Media; 119-94.

892. Wang, J., Jiang, X., Madore, H. P., Gray, J., Desselberger, U., Ando, T, Seto, Y., Oishi, I., Lew,

J. F., Green, K. Y., Estes, M. K. (1994). Sequence diversity of small round structured viruses. J

Virol 68: 5982-90.

893. Wapnir, R. A., Lifshitz, F. (1985). Osmolality and solute concentration, their relationship with

oral rehydration solution effectiveness: an experimental assessment. Ped Res 19 (9): 894-8.

894. Ward, R. L., Knowlton, D. R., Greenberg, H. B., Schiff, G. M., Bernstein, D. I. (1990). Serum

neutralizing antibody to VP4 and VP7 proteins in infants following vaccination with WC3

bovine rotavirus. J of Virol 64(6): 2687-91.

895. Weaver, E. A., Goldblum, R. M., Davis, C. P., Goldman, A. S. (1981). Enhanced

immunoglobulin A release from human colostral cells during phagocytosis. Infect Immun 34 (2):

498-502.

896. Weiler, I. L., Hickler, W., Sprenger, R. (1983). Demonstartion that milk cells invade the

neonatal mouse. Am J Reprod Immunol 4 (2): 95-8.

897. Weisz-Carrington, P., Roux, M. E., McWilliams, M., Phillips-Quagliata, J. M., Lamm, M. E.

(1978). Hormonal induction of the secretory immune system in the mammary gland. Proc Natl

Acad Sci USA 75 (6): 2928-32.

898. Welsh, J. K., Arsenakis, M., Coelen, R. J., May, J. T. (1979). Effect of antiviral lipids, heat and

freezing on the activity of viruses in human milk. J Infect Dis 140 (3): 332-8.

899. White, K. E., Osterholm, M. T., Mariotti, J. A., Korlath, J. A., Lawrence, D. H., Ristinen, T.

L., Greenberg, H. B. (1986). A foodborne outbreak of Norwalk virus gastroenteritis. Evidence

for post-recovery transmission. Am J Epidemiol 124 (1): 120-6.

900. White, L. J., Ball, J. M., Hardy, M. E., Tanaka, T. N., Kitamoto, N., Estes, M. K. (1996).

Attachment and entry of recombinant Norwalk virus capsids to cultured human and animal cell

lines. J Virol 70 (10): 6589-97.

901. Whitmore, A. C., Prowse, D. M., Haughton, G., Arnold, L. W. (1991). Ig isotype switching in B

lymphocites. The effect of T-cell derived interleukins, cytokins, cholera toxin, and antigen on

isotype switch frequency of a cloned B cell lymphoma. Int Immunol 3 (1): 95-103.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Korlath%20JA%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Lawrence%20DH%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ristinen%20TL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Ristinen%20TL%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Greenberg%20HB%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Prowse%20DM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Haughton%20G%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Arnold%20LW%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

260

902. Widdowson, E. M., Colombo, V., Artavanis, C. (1976). Changes in the organs of pigs in

response to feeding for the first 24 hours after birth. II. The digestive tract. Biol Neonate 28 (5-

6): 272-82.

903. Widdowson, M. A., Breese, J. R., Genstch, J. R., Glass, R. I. (2005a). Rotavirus disease and its

prevention. Curr Opin Gastroenterol 21 (1): 26-31.

904. Widdowson, M. A., Cramer, E. H., Hadley, L., Bresee, J. S., Beard, R. S., Bulens, S.

N., Charles, M., Chege, W., Isakbaeva, E., Wright, J. G., Mintz, E., Forney, D., Massey,

J., Glass, R. I., Monroe, S. S. (2004). Outbreaks of acute gastroenteritis on cruise ships and on

land: identification of a predominant circulating strain of norovirus. United States, 2002. Infect

Dis 190 (1): 27-36.

905. Widdowson, M. A., Sulka, A., Bulens, S. N., Beard, R. S., Chaves, S. S., Hammond, R., Salehi,

E. D., Swanson, E., Totaro, J., Woron, R., Mead, P. S.,Bresee, J. S., Monroe, S. S., Glass, R. I.

(2005b). Norovirus and foodborne disease, United States, 1991-2000. Emerg Infect Dis 11 (1):

95-102.

906. Widerlite, L., Trier, J. S., Blacklow, N. R., Schreiber, D. S. (1975). Structure of the gastric

mucosa in acute infectious nonbacterial gastroenteritis. Gastroenterology 68 (3): 425-30.

907. Wiechers, C., Bissinger, A. L., Hamprecht, K., Kimmig, P., Jahn, G., Poets, C. F. (2008).

Apparently non-specific results found using a norovirus antigen immunoassay for fecal

specimens from neonates. J Perinatol 28 (1): 79-81.

908. Wilhelmi, J., Román, E., Sánchez-Fauquier, A. (2003). Viruses causing gastroenteritis. Clin

Microbiol Infect 9 (2): 247-62.

909. Wilson, C. B., Westall, J., Johnston, L., Lewis, D. B., Dower, S. K., Alpert, A. R. (1986).

Decreased production of interferon-gamma by human neonatal cells. Intrinsic and regulatory

deficiencies. J Clin Invest 77 (3): 860-7.

910. Wilson, E. O., ed. (1980). En “Sociobiology: The New Synthesis”. Cambridge, M. A: Harvard

University Press.

911. Winberg, J., Wessner, G. (1971). Does breast milk protect against septicaemia in the newborn?

Lancet 2 (7709): 1091-4.

912. Wirblich, C., Thiel, H. J., Meyers, G. (1996). Genetic map of the calicivirus rabbit hemorrhagic

disease virus as deduced from in vitro translation studies. J Virol 70 (11): 7974-83.

913. Wirt, D., Adkins, L. T., Palkowetz, K. H., Schmalstieg, F. C., Goldman, A. S. (1992).

Activated-memory T lymphocites in human milk. Cytometry 13 (3): 282-90.

914. Wobus, C. E., Karst, S. M., Thackray, L. B., Chang, K. O., Sosnovtsev, S., Belliot, G., Krug,

A., Mackenzie, J. M., Green, K. Y., Virgin, IV, H. W. (2004). Replication of Norovirus in cell

culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages. PLoS Biol 2 (12): e432.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Beard%20RS%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Charles%20M%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chege%20W%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Isakbaeva%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Wright%20JG%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mintz%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Forney%20D%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Massey%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Massey%20J%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Salehi%20ED%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Salehi%20ED%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Swanson%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Totaro%20J%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Woron%20R%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Mead%20PS%22%5BAuthor%5D




http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Adkins%20LT%22%5BAuthor%5D




_____________________________________________________________________________

261

915. Wold, W., Horwitz, M. S. (2007). Adenoviruses. En “Fields Virology”. 5a ed. (Knippe, D. M., y

Howley, P. M., eds.). Philadelphia: Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins; 2395-436.

916. Woodbury, R. M. (1922). The relation between breast and artificial feeding in infant mortality.

Am J Hyg 2 (6): 668-7.

917. World Health Organisation. (1985). Persistent diarrea in children. Geneva: WHO-Diarrheal

disease control. Bull World Health Organ 85 (1): 1-9.

918. World Health Organisation. (2004). Clinical Management of acute diarrhea. Disponible en

URL: <http://www.emro.who.int/cah/pdf/who_unicef_statement.pdf>. [Acceso 14 junio, 2010].

919. World Health Organisation. (2008a). Global burden of protein-energy malnutrition in the year

2000. Global Burden of Disease 2000. Bull World Health Organ 8: 1-12.

920. World Health Organisation. (2008b). The Global Burden of Disease: 2004 update. Geneva

(Switzerland): WHO Press. ISBN 9789241563710. Disponible en URL:

http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/GBD_report_2004update_full.pdf.

[Acceso 28 de mayo, 2010].

921. World Health Organisation. (2009). Progress on health-related Millennium Development Goals

(MDGs). Disponible en URL: <http://www.who.int/ mediacentre/factsheets /fs290/ en/ index

.html>. [Acceso 31 de mayo, 2010].

922. World Health Organisation. Department of Child and Adolescent Health and Development.

(2006). Reduced osmolarity oral rehydration salts (ORS) formulation. Report from a meeting of

experts jointly organized by UNICEF and WHO. WHO/FCH/CAH/01.22. Disponible en URL:

<http://rehydrate.org/ors/low-osmolarity-ors.htm>. [Acceso 9 junio, 2010].

923. Wu, H. M., Fornek, M., Schwab, K. J., Chapin, A. R., Gibson, K., Schwab, E., Spencer,

C., Henning, K. (2005). A norovirus outbreak at a long term-care facility: the role of

environmental surface contamination. Infect Control Hosp Epidemiol 26 (1): 802-10.

924. Wyatt, R. G., Dolin, R., Blacklow, N. R., DuPont, H. L., Buscho, R. F., Thornhill, T.

S., Kapikian, A. Z., Chanock, R. M. (1974). Comparison of three agents of acute infectious

nonbacterial gastroenteritis by cross-challenge in volunteers. J Infect Dis 129 (6): 709-14.

925. Wyatt, R. G., Greenberg, H. B., Dalgard, D. W., Allen, W. P., Sly, D. L., Thornhill, T.

S., Chanock, R. M., Kapikian, A. Z. (1978). Experimental infection of chimpanzees with the

Norwalk agent of epidemic viral gastroenteritis. J Med Virol 2 (2): 89-96.

926. Wyatt, R. G., Kapikian, A. Z. (1977). Viral agents associated with acute gastroenteritis in

humans. Am J Clin Nutr 30: 1857-70.

927. Wyatt, R. G., Mata, L. J. (1969). Bacteria in colostrum and milk in Guatemalan Indian women.

J Trop Pediatr 15 (4): 159-62.

http://www.emro.who.int/cah/pdf/who_unicef_statement.pdf

http://www.who.int/healthinfo/global_burden_disease/GBD_report_2004update_full.pdf

http://www.who.int/%20mediacentre/factsheets%20/fs290/%20en/%20index%20.html

http://www.who.int/%20mediacentre/factsheets%20/fs290/%20en/%20index%20.html

http://rehydrate.org/ors/low-osmolarity-ors.htm

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chapin%20AR%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gibson%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Schwab%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spencer%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Spencer%20C%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Henning%20K%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Buscho%20RF%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Thornhill%20TS%22%5BAuthor%5D


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kapikian%20AZ%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chanock%20RM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Allen%20WP%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sly%20DL%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Chanock%20RM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kapikian%20AZ%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

262

928. Yachie, A., Takano, N., Ohta, K., Uehara, T., Fujita, S., Miyawaki, T., Taniguchi, N. (1992).

Defective production of interleukin-6 in very small premature infants in response to bacterial

pathogens. Infact Immun 60 (3): 749-53.

929. Yamashita, T., Sugiyama, M., Tsuzuki, H., Sakae, Y., Suzuki, Y., Miyazaki, Y. (2000).

Applications of reverse transcription-PCR for identification and differentiation of Aichi virus, a

new member of the Picornavirus family associated with gastroenteritis in humans. J Clin

Microbiol 38 (8): 2955-61.

930. Yamauchi, K., Tomita, M., Giehl, T. J., Ellison, R. T. (1993). Antibacterial activity of

lactoferrin a pepsin-derived peptide fragment. Infect Immun 61 (2): 719-28.

931. Yan, L., Zhu, F., Xu, X., Hong, X., Lv, Q. (2005). Molecular basis for para-Bombay

phenotypes in Chinese persons, including a novel nonfunctional FUT1 allele. Transfusion 45

(5): 725-30.

932. Yoda, T., Suzuki, Y., Terano, Y., Yamazaki, K., Sakon, N., Kuzuguchi, T., Oda,

H., Tsukamoto, T. (2003). Precise characterization of norovirus (Norwalk-like virus)-specific

monoclonal antibodies with broad reactivity. J Clin Microbiol 41 (6): 2367-71.

933. Yolken, R. H., Peterson, J. A., Vonderfecht, S. L., Fouts, E. T., Midthun, K.,Newburg, D. S.

(1992). Human milk mucin inhibits rotavirus replication prevents experimental gastroenteritis. J

Clin Invest 90 (5): 1984-91.

934. Yoneyama, M., Kikuchi, M., Matsumoto, K., Imaizumi, T., Miyagishi, M., Taira, K., Foy,

E., Loo, Y. M., Gale, M. Jr., Akira, S., Yonehara, S., Kato, A.,Fujita, T. (2005). Shared and

unique functions of the DExD/H-box helicases RIG-I, MDA5, and LGP2 in antiviral innate

immunity. J Immunol 175 (5): 2851-8.

935. Yoneyama, M., Kikuchi, M., Natsukawa, T., Shinobu, N., Imaizumi, T., Miyagishi, M., Taira,

K., Akira, S., Fujita, T. (2004). The RNA helicase RIG-I has an essential function in double-

stranded RNA-induced innate antiviral responses. Nat Immunol 5 (7): 730-737.

936. Yu, V. Y., Jamieson, J., Bajuk, B. (1981). Breast milk feeding in very low birth weight infants.

Aust Pediatr J 17 (3): 186-90.

937. Yunus, M. A., Chung, L. M. W., Chaudry, Y., Bailey, D., Goodfellow, I. (2010). Development

of an optimized RNA-based murine norovirus reverse genetics system. J Virol Meth 169 (1):

112-8.

938. Zheng, D. P., Ando, T., Fankhauser, R. L., Beard, R. S., Glass, R. I., Monroe, S. S. (2006).

Norovirus classification and proposed strain nomenclature. Virology 346 (2): 312-23.

939. Zimbabwe, Bangladesh, South Africa (Zimbasa). Dysentery Study Group. (2002). Multicenter

randomised, double blind clinical trial of short courses versus standard course oral ciprofloxacin

for Shigella dysenteriae in children. Pediatr Infect Dis J 21 (12): 1136-41.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yamazaki%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sakon%20N%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kuzuguchi%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oda%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Oda%20H%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Tsukamoto%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Taira%20K%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Foy%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Foy%20E%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Loo%20YM%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Gale%20M%20Jr%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Akira%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Yonehara%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kato%20A%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fujita%20T%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Miyagishi%20M%22%5BAuthor%5D



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Akira%20S%22%5BAuthor%5D

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Fujita%20T%22%5BAuthor%5D

_____________________________________________________________________________

263

940. Zingg, W., Colombo, C., Jucker, T., Bossart, W., Ruef, C. (2005). Impact of an outbreak of

norovirus infection on hospital resources. Infect Control Hosp Epidemiol 26 (3): 263-7.

941. Zintz, C., Bok, K., Parada, E., Barnes-Eley, M., Berke, T., Staat, M. A., Azimi, P., Jiang, X.,

Matson, D. O. (2005). Prevalence and genetic characterization of caliciviruses among children

hospitalized for acute gastroenteritis in the United States. Infect Gent Evol 5 (3): 281-90.

facultad de medicina y odontología - core.ac.uk · el amor por los niños, que son la base de mi...

Documents