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FACULTAD DE FARMACIA

EFECTOS DEL ÁCIDO LIPOICO SOBRE LA FUNCIÓN

MITOCONDRIAL Y EL ESTRÉS OXIDATIVO EN LA ENFERMEDAD

HEPÁTICA NO ALCOHÓLICA ASOCIADA A OBESIDAD

EFFECTS OF LIPOIC ACID ON MITOCHONDRIAL FUNCTION AND

OXIDATIVE STRESS IN THE NON‐ALCOHOLIC FATTY LIVER

DISEASE LINKED TO OBESITY

Mª Pilar Valdecantos Jimenez de Andrade

Pamplona, 2012

FACULTAD DE FARMACIA

Memoria presentada por Dña. MªPilar Valdecantos Jimenez de Andrade para aspirar al

grado de Doctor en Farmacia

Fdo. Mª Pilar Valdecantos Jimenez de Andrade

El presente trabajo ha sido realizado bajo nuestra dirección en el Departamento de

Ciencias de la Alimentación, Fisiología y Toxicología y autorizamos su presentación

ante el Tribunal que lo ha de juzgar.

Vo Bo Director Vo Bo Co‐directora

Dr. J. Alfredo Martínez Hernández Dra. Carmen Patricia Pérez Matute

Este trabajo ha sido posible gracias a la financiación de diversas entidades: Asociación de

Amigos de la Universidad de Navarra (beca predoctoral 2007‐2008), Instituto de Salud Carlos III

(Beca predoctoral de investigación en salud 2008‐2012), RETICs y CIBERobn. Proyecto

Nutrición, Obesidad y Salud “Línea Especial” Universidad de Navarra LE/97, Ministerio de

Educación y Ciencia (AGL2006‐04716/ALI) y Ministerio de Ciencia e Innovación (AGL 2009‐

10873/ALI).

"La ciencia es un magnífico mobiliario para el piso

superior de un hombre, siempre y cuando su

sentido común esté en la planta baja"

Oliver W. Holmes

“Para los científicos Dios está el final de todas sus

reflexiones"

Max Planck

"El trabajo endulza siempre la vida, pero los

dulces no le gustan a todo el mundo”

Victor Hugo

A mis padres

Agradecimientos

Decía Goethe que “es muy común recordar que alguien nos debe agradecimiento, pero es

más común no pensar en quienes les debemos nuestra propia gratitud", espero no caer en

este error y conseguir acordarme de todos aquellos a los que debo agradecimiento. Si, por

despiste o inconsciencia, alguno no se encuentra en estas líneas no dude que en algún

momento durante estos años pensé en que esos quería consignar su contribución en estas

breves palabras.

En primer lugar, me gustaría agradecer a la Universidad de Navarra y a la Facultad de

Farmacia el haberme formado tanto profesional como personalmente. También quisiera

agradecer al Departamento de Ciencias de la Alimentación, Fisiología y Toxicología la

oportunidad de desarrollar el presente trabajo de investigación e iniciar mi camino en la

carrera investigadora y docente.

Además, quisiera reconocer especialmente a la Asociación de Amigos de la Universidad de

Navarra no sólo la beca recibida en el inicio de esta andadura sino todos los sacrificios que

realizan para que muchos desarrollemos nuestra investigación. Quizás, en el día a día no

seamos conscientes de la magnanimidad y el sacrificio con que muchas personas sacan

adelante cada euro para hacer posibles estos proyectos, pero no quiero pasar un día tan

señalado sin tener presentes a tantas personas anonimas. Gracias también al Instituto de

Salud Carlos III por la beca concedida durante estos años y por darme la posibilidad de

colaborar con otros grupos de investigación.

Especial gratitud le debo al Dr. Alfredo Martínez por todos sus consejos y orientaciones

científicas y personales y ser tan genial como para definir un esbozo de esta tesis en

nuestras conversaciones en el Metro de Madrid y por ayudarme a enfrentarme a los

diferentes “Sanchos” por los que he pasado a lo largo de estos años. No querría dejar de

reconocer su esfuerzo por mantener recto el timón de este barco que es la Línea Especial y

lo que no es menos importante conseguir las “provisiones” necesarias para la navegación

de todos nosotros por estos mares de la Ciencia. Decía Cicerón que “una cosa es saber y

otra saber enseñar” quería ahora agradecerle a la Dra. Patricia Pérez‐Matute no sólo el

haber contribuido con sus conocimientos y consejos a este trabajo, sino el haber sabido

enseñarme con su dedicación y ejemplo cómo enseñar a otros. En resumen, gracias a

ambos por vuestros consejos, vuestra dedicación y esfuerzo. Gracias por la confianza

depositada en mí y por haberme transmitido ese gran interés no sólo por la investigación

sino también por la docencia.

Agradecimientos

During my staying in the Department of Human Biology, in Maastricht, I will never forget

Professor Patrick Schrauwen, thank you very much for the opportunity to stay in your

laboratory and for all your interest in my research. Thank you very much to Sabina

Paglialunga; thanks for your interest and expert supervision. “Heel erg bedankt” to all the

people in the lab for being so friendly and patient and thanks as well for all your help in

many ways.

Querría agradecer también a la Dra. Martínez Valverde la posibilidad de trabajar en su

laboratorio durante los últimos meses de este trabajo de investigación. Como no recordar

en este punto a Agueda, Beatriz, Virginia, Maysa, Lucia y Ana, ellas han hecho que desde el

primer día me sintiera como en casa, estando siempre dispuestas a enseñarme y guiarme.

Espero que este sea sólo el comienzo de una colaboración agradable y productiva.

También agradezco a la Dra. López Zabalza su inestimable apoyo científico, sobre todo en el

inicio de esté trabajo y su interés por mis progresos a lo largo de estos años. Como no

nombrar aquí al Dr. Aguirre que desde que estuvo en mi tribunal del DEA ha estado siempre

disponible para solucionar mis dudas y aconsejarme con su amplia experiencia, espero

sinceramente que su nuevo trabajo este tan lleno de éxitos como el anterior. Reconocer al

Dr. Rial su paciencia y consejos durante el primer año de mi tesis así como su dedicación

para explicarme lo necesario acerca del consumo de oxígeno y sus misterios. Especial

agradecimiento merece la Dra. Iciar Velaz, he dudado si incluirte entre los profesores o los

amigos, porque durante los últimos años para mi has sido una auténtica maestra y amiga,

gracias por tus consejos y tu escucha desinteresada y por poner siempre un punto de

humor en nuestras conversaciones.

Gracias a todo el vecindario del edificio de Investigación. En el fondo con quien más y quien

menos nos hemos cruzado alguna vez en el torno o en las escaleras y hemos compartido

muchas mañanas de lunes. Especialmente en deuda me encuentro con mi “departamento

adoptivo”, nuestras vecinas de Bioquímica a pesar de que cada año nos “humilléis” con

vuestros “superbelenes” en el fondo no os lo tenemos en cuenta y esperamos vuestra

creatividad. Silvia y Mª José, gracias por invitarme a café de vuestra maravillosa cafetera y

sobre todo por escucharme tantas veces; Marina, Antonia y María ¡que hubiera hecho yo

sin vosotras ante mis crisis con el Western!. Cómo no nombrar en este punto a los “vecinos

de abajo”, gracias a todo el departamento de Farmacología especialmente a Elena y Maite

por encontrarme su sonrisa y comprensión los viernes a las 9, especialmente gracias a Elena

Agradecimientos

por ayudarme con su sabiduría “Starkov”. También recordar especialmente a Lourdes y

Lucia por acompañarme en el cuarto oscuro y ver bandas donde no las hay. Gracias a mis

“compañeros de inglés” Iosu, Javier y Marina, por hacer más fáciles las clases a las 2.30 y

ayudarme con consejos varios. Por último, un especial recuerdo a Elisa mi maestra con las

LDAs, gracias por tu ayuda y por alegrarme las mañanas con tu amplía sonrisa.

No quiero avanzar más sin reconocer el trabajo de tantas “personas invisibles” que han

hecho posible esta y otras muchas tesis. En primer lugar, gracias a Reyes Saénz y a Gonzalo

Flandes por recibirnos con una sonrisa y estar siempre dispuestos a contestar mis dudas

aunque este claramente explicado en las instrucciones. Gracias al personal de limpieza y

mantenimiento ‐ los auténticos invisibles‐ y perdón por cuantas veces haya podido

dificultar su trabajo. Como no recordar aquí a los bedeles, los “hombres de gris” siempre

dispuestos a darte una llave o abrirte el torno cuando por enésima vez se te ha olvidado el

carné esa semana. Especialmente, quiero agradecer la sonrisa diaria y las bromas al final del

día a Gonzalo, Jesús y Enrique. Por último, un recuerdo especial a la gente de la biblioteca

por facilitarnos nuestro trabajo especialmente a Arantxa, Lucia y Rocío por explicarme

hasta la saciedad y resolver todas mis dudas acerca de sabio, refworks, dadun etc.

Si algo he aprendido durante estos años es que la investigación es fundamentalmente

colaboración, dicho con palabras de la Madre Teresa de Calcuta he experimentado en

numerosas ocasiones que “yo hago lo que usted no puede, y usted hace lo que yo no

puedo. Juntos podemos hacer grandes cosas”. Por eso quería agradecer a todos esos

“ustedes” que han hecho posibles grandes cosas durante estos años. En especial al Dr.

Fermín Milagro y al Dr. Javier Campión sus sabios consejos y, sobre todo, su comprensión y

su alegría para escucharme y responderme siempre todas las dudas, gracias por ese primer

año en el 215 en el que con vuestro ejemplo aprendí más que con muchas lecciones.

A todos quienes forman el departamento de Ciencias de la Alimentación, Fisiología y

Toxicología el haberse preocupado por mí durante todos estos años; a la Dra. Mª Jesús

Moreno‐Aliaga quiero agradecerle sus continuas muestras de interés en la evolución de mis

investigaciones. A la Dra. Ana Barber, gracias por su confianza y sobre todo, su alegría. A la

Dra. Marian Zulet muchas gracias por tu apoyo en nuestra labor docente y por ser siempre

nuestra “fan” número uno, por apoyarnos en nuestro problemas y darnos ánimo cuando lo

necesitabamos. A las Dras. Pilar Lostao, Amelia Martí, Iciar Astiasarán, Diana Ansorena,

Agradecimientos

Conchita Cid y Mª Paz de Peña les transmito mi gratitud por sus continuas muestras de

ánimo e interés. Gracias a todos por vuestra cercanía.

Especialmente quiero agradecer a la Dra. Adela López de Ceraín su dedicación y consejos,

gracias por escucharme siempre que ha sido necesario y por tener en cuenta mis puntos de

vista, por no decir nunca un “no tienes razón”, aunque supongo que lo merecería en algún

momento. Y sobre todo, por interesarse siempre por la evolución de esta tesis y por su

apoyo incondicional en todo momento.

A Pedro González Muniesa, sinceramente no sé qué poner en estas líneas porque todo

parece poco y se queda pobre. Gracias por estar siempre ahí. Primero como una “presencia

invisible”, la de “mi predecesor mitocondrial”, no sé si lo sabes pero me sé de memoria el

material y métodos de tu tesis. Después, a tu regreso de Liverpool, has sabido escuchar,

aconsejar y aportar desde la sombra y sin buscar nada a cambio, has estado siempre

disponible incluso quitándote horas de sueño y creándome por ello cierto cargo de

conciencia. Sólo decirte que esta tesis no hubiera sido posible sin tu apoyo, aunque espero

que ya lo sepas, MUCHAS GRACIAS.

A Ana Lorente, qué decirle a mi mayor maestra del laboratorio, gracias por tu enorme

paciencia, en ocasiones rayana al infinito, por enseñarme a trabajar, por estar siempre ahí

para pedidos, partes y dudas, pero sobre todo por haber aguantado estoicamente al

consumo de oxígeno con su “carácter temperamental”. A Vero, por haber estado dispuesta

siempre a todo lo que he necesitado y por tu pericia con el Cobas al que conoces mejor que

nadie. A Asun gracias por tu buen humor en todo momento y por descubrirme las

maravillas de Navarra.

A Paula y Beatriz, muchísimas gracias por vuestra disponibilidad siempre que he necesitado

algo, desde un dato para una de mis innumerables solicitudes de becas o un cuaderno

nuevo, en definitiva, por brindarme vuestra sonrisa cuando bajaba a visitaros y saber que

cuando os decía que erais lo mejor del departamento no iba, ni mucho menos, en broma.

Llega el momento de agradecer a todos los que pasaron por el departamento y ahora están

dispersos por tierras españolas y extranjeras, todos ellos me indicaron con su ejemplo el

camino a seguir, han sido como las luces en un camino de montaña mostrando el siguiente

paso pero sin iluminarlo todo para no asustarme de los peligros venideros. Quería recordar

especialmente a Silvia, por desgracia no estás aquí para ver este momento pero sé que

Agradecimientos

desde Estocolmo sigues todos mis avances y retrocesos, gracias por tu amistad y tu ejemplo

me has enseñado más de lo que crees. Gracias especiales a Diego, nuestro asesor

informático número uno siempre dispuesto a limpiar el ordenador, instalar la wifi etc y,

sobre todo, gracias por enseñarme con tu ejemplo a sacar una tesis sin perder de vista que

es lo realmente importante en la vida. A Cristina, por su ejemplo. Gracias a mi “Fairy”

(Nerea) por ser siempre tan alegre y saber “desengrasar” tantos momentos difíciles con tu

sonrisa. A mis maestras de prácticas, Esti, Blanca e Itzi por vuestra paciencia y entrega en la

labor docente no solo con los alumnos sino con los novatos. Itzi, gracias por tu compañía en

esos meses holandeses en especial por vivir conmigo la victoria del Mundial en “territorio

comanche” y evitar que me lincharan. Gracias también a AnaBe por su tranquilidad y

buenos consejos, su sonrisa permanente y por la acogida que nos disteis en Santiago. Almu,

gracias por estar ahí y ahora por continuar desde secretaria apoyando a tus compañeras.

Helen, mi media naranja en prácticas, muchísimas gracias por haberme enseñado tanto y

por haber sabido aprovechar mis ideas peregrinas y ponerlas juntas en prácticas, gracias

por haberme enseñado tanto de ese “querido pueblo brasileño”. Y como no a André gracias

por tu buen humor constante y que San Isidro cultivador te proteja.

A los nuevos agradeceros vuestra ilusión porque a veces cuando llevas tiempo en el camino

se nos olvida lo maravilloso de esta profesión y con vuestro entusiasmo diario nos lo

trasmitís. Uxune, te dije que con tu interés en estos meses de biblioteca te habías ganado

una frase en estos agradecimiento, ahora fuera de broma muchísimas gracias porque

durante estas semanas cada mañana te encontraba al “otro lado del muro” sonriendo y

dispuesta a escuchar. A Miki “el vikingo” por todo lo que me has enseñado con tu serenidad

y tesón durante el máster, sigue así y llegarás muy lejos. A Idoia, ánimo con las prácticas

seguro que te ganas a todos los alumnos.

Bueno ahora les llega el momento a todos con los que durante estos años he compartido

este viaje en el que todos y cada uno habéis estado a mi lado. A Laura y Adri, juntas

empezamos en este camino, ¿Quien nos iba a decir que este día llegaría? Pero aquí

estamos y ahora se nos abre una nueva etapa. Estoy segura que será difícil encontrar tan

buenas compañeras de camino. A Beich, gracias por tu bondad y constancia en el trabajo,

por superarte en cada momento y sobre todo por tu cariño y amistad. A Noe y a Pablo,

gracias por enseñarme con vuestro ejemplo el sentido de la lealtad y el compañerismo

verdadero. A Tara por trasmitirme cada lunes el espíritu rojillo de ahora en adelante

Agradecimientos

siempre que vea la tabla de clasificación miraré si ese año le toca sufrir a Osasuna. A Ceci,

gracias por tu sonrisa perenne en el café y por haberme enseñado lo que se puede hacer

con cariño y maña. Rocío, gracias por compartir tantas idas y venidas a Madrid y sus

conversaciones correspondientes. A Aurora y Patricia por ser las mejores compañeras de

prácticas y a Ana Laura por dulcificarnos con su suavidad y por hacer el mejor guacamole

del mundo. A Pedro, muchas gracias por tu apoyo durante estos años en los que con sus

más y sus menos hemos surcado este camino. Marta, gracias por el “lipoic team”. A ambos,

gracias por todo los momentos compartidos durante estos años y por haber formado parte

de vuestro equipo. Casi se me olvidan mis compañeros del piso de abajo, a Carmen por tu

alegría constante, a Carlos porque aunque nos quejemos de lo que hablas en el fondo sin

tus conversaciones los cafés no serian lo mismo, a Jonai ánimo espero que todo te vaya

bien porque te lo mereces.

Me toca ahora afrontar la ardua tarea de responder a todo el cariño recibido por mis

amigos durante estos años, ardua porque lo que está en mi corazón no puede recogerse en

estas líneas, ni en libros enteros que escribiera. No sé qué deciros y todo lo que callo es lo

auténticamente importante, en algún sitio leí que un amigo es alguien con quien se puede

estar en silencio y, aunque os parezca increíble, me he quedado sin palabras, aprovechar

que no volverá a pasar. Sólo agradeceros el haber formado parte de mi vida y sobre todo el

haberme dejado formar parte de las vuestras y espero que de ahora en adelante siempre

sigamos unidos a pesar de los vaivenes de la vida. Lo que a continuación escribo sólo

espero que haga aflorar a vuestros labios una sonrisa como la que está en los míos mientras

escribo. A Anica, mi fiel compañera de prácticas, compras, mesa… gracias por aguantar mis

invasiones de territorio, escuchar mis bromas y anécdotas en prácticas mil veces como si

fuera la primera, por ser la mejor co‐responsable que cualquiera pueda soñar y por

supuesto por haberme descubierto el maravilloso mundo de Sephora y demás trucos de

maquillaje. Gracias por tu amistad y por ser como eres, un espíritu único que rompe

moldes. A Paúl, el mejor guía turístico de la noble villa de Portugalete, eres la mejor agenda

electrónica humana que existe y el corrector infalible, como amigo no tienes precio,

aunque espero que con tus futuros doctorandos no seas tan exigente. A Barrankas (¿o eras

Trankas?) vamos a María gracias por haberme sorprendido día tras día con tu categoría

humana, tu gran corazón y tu sonrisa permanente, nunca sabrás todo lo que me has

enseñado y espero que me sigas enseñando a lo largo de los años. A David, muchísimas

gracias por ponernos los pies en el suelo a este grupo de científicos frikis fuiste el último en

Agradecimientos

entrar en el grupo pero por una adquisición así vale la pena esperar. A Teresa mi

“bioquímica favorita” gracias por tus sabios consejos pero sobre todo gracias por haber

podido formar parte de tantos acontecimientos importantes en tu vida y por no tener

nunca necesidad de “explicarme”. Al artista de nuestro grupo, Toni, por poner el punto de

belleza en nuestras cabezas científicas y por descubrirme tantos rincones de Pamplona y,

ante todo, por haberme permitido formar parte de esa nueva familia. A Marta, ya sabes

que nuestros caminos siempre se juntan, después de nuestros años madrileños vinieron los

pamplonicas, quien sabe cuál será el próximo destino que nos depare la vida pero lo que sí

que es seguro es que, nos crucemos o no, siempre serás para mí un ejemplo a seguir,

gracias por tu cariño y comprensión durante esta década.

También, me gustaría recordar a Emi, mi compañera en tierras holandesas. Al comienzo de

esos meses dijimos que al final o nos odiábamos o seríamos amigas de por vida, parece que

ha ocurrido los segundo. Gracias por estar ahí durante esos meses, por escucharme y

compartir el lunch cada día, por los kilómetros recorridos, por socorrerme con mis crisis

lingüísticas y por tantas otras cosas que las dos recordaremos el resto de nuestras vidas.

A toda la gente que fuera del ámbito de la Universidad me ha apoyado durante estos años.

A mi amiga Valle, que desde Asturias primero y en Barcelona después siempre me ha

apoyado con la voz de su experiencia, por todo el cariño brindado a lo largo de tantos años.

A mis amigas de toda la vida, Izaskun, Paloma, Elena, Dena etc por haber sabido estar a mi

lado siempre que os he necesitado desde hace tantos años que prefiero no ponerlos aquí,

siempre habéis estado ahí y sé que siempre lo estaréis.

Especialmente, quería agradecer a todas las de mi casa su apoyo incondicional en

momentos que no siempre han sido fáciles, gracias por haberme escuchado mis

conversaciones científicas con una sonrisa en los labios y por compartir mis logros y caídas,

en definitiva gracias por quererme por quién soy y no por cómo soy. No quería pasar estas

líneas sin agradecer a Marga y a Sonsoles su apoyo constante en estos años. No sé cómo

expresar lo que todas vosotras me habéis ayudado, porque es probable que ni siquiera yo

lo sepa del todo, en algún momento seré consciente pero por si entonces no os tengo al

lado no quiero perder la oportunidad de daros las gracias ahora.

A toda mi familia por su apoyo constante, gracias a mis tíos y mis primos que han seguido

mi evolución cada vez que nos encontrábamos en cualquier evento familiar. Especialmente

Agradecimientos

gracias a mi tío Javier, por haberme mostrado con su ejemplo la importancia y grandeza del

profesor universitario. A tío Pablo, porque con su trabajo incansable me ha enseñado los

valores de un buen trabajador y por sentirse orgulloso de su “sobrina la investigadora”. A

mi primo Pablo, quién nos iba a decir en aquellos trayectos de tren a las 8 de la mañana que

defenderíamos la tesis el mismo año, pues ya ves aquí estamos aunque como siempre tú

me hayas adelantado. A Pastora, por proteger siempre a tu prima favorita por tu cariño y tu

comprensión y por tus visitas anuales a Pamplona. A Las TíAS con mayúscula, gracias por

vuestros desvelos y por vuestro cariño, por estar ahí siempre, por ser el baluarte sobre el

que apoyarnos porque en medio de las tormentas sois un refugio seguro y por ser lo más

parecido a una madre para mí en los últimos diez años, nunca sabré que habría sido nuestra

vida sin vosotras.

A mis hermanos y mis cuñadas, ya veis la benjamina de la familia va defender la tesis y

todos os preguntaréis, ¿cómo se le ocurre a un Valdecantos investigar sobre la obesidad? y

sin duda Antonio pensará “y yo que pensaba que era tonta”, ya veis ironías de la vida y

Antonio que el empaque de este acto no te ciegue en el fondo sigo siendo la de siempre.

Bromas aparte, he intentado redactar estas líneas muchas veces en estos años, cada vez

que regresaba de Madrid las pensaba mentalmente y cuando el tren se adentraba en las

llanuras castellanas sólo podía dar gracias a Dios por la familia que me ha concedido porque

soy la más afortunada de las personas. Como sabéis en nuestra familia no somos dados a

los sentimentalismos, más bien a la ironía madrileña, por eso quizá me cueste expresar lo

que mi corazón desearía en estas líneas, pero ¿cómo puede expresar un brote joven su

agradecimiento a los árboles robustos que le han protegido siempre con su presencia?

Vosotros sois esos árboles y yo no encuentro más palabras para daros las gracias que esta,

GRACIAS. Quería dar las gracias a mis sobrinos, la mayoría no son conscientes de que hago

tan lejos y probablemente no se den cuenta lo reconfortantes que son sus risas infantiles y

su cariño pero durante estos años, en los momentos difíciles, mirar sus caras sonrientes y

traviesas en mi fondo de pantalla me ha arrancado más de una sonrisa y me ha devuelto las

ganas de seguir trabajando con ilusión.

Llega ahora el momento de agradecer a mis padres no esta tesis sino la vida pero, gracias a

Dios, juego con ventaja porque desde el cielo me acompañan, me guian y no necesito de

palabras para que lean en mi corazón. Ellos son lo mejor que ha ocurrido en mi vida, nunca

sabré lo que hicieron por mi y tan solo lo poco que intuyo me abruma. Durante muchos

Agradecimientos

años una obsesión a ocupado mi corazón ¡hazte digna de sus sacrificios!, pero al final me he

dado cuenta que nunca lo seré y, a la vez, que lo soy siempre porque para ellos lo

importante nunca fue que fuera la mejor en nada solamente que fuera yo y les diera el

poco amor que mi corazón de hija podía. Ellos son mi ejemplo en todo lo que hago, son los

rodrigones que han marcado mi crecimiento, han sido y siempre serán mi apoyo. Muchos

pensarán que en este día tan señalado echare en falta su presencia y, aunque en parte

tengan razón, en el fondo ellos están más presentes, hoy y siempre, desde el cielo que

todos los demás.

Por último, quería mostrar mi agradecimiento a Dios por haberme dado todo cuanto soy y

poseo, por regalarme la mejor familia del mundo y poner a mi lado a amigos que con su

cariño me han protegido y querido. Por darme las oportunidades necesarias para llegar a

este punto del camino y por cuidarme cada día y seguir haciéndolo siempre.

Abreviaturas

25

18s 18S rRNA eucariotico

Eukaryotic 18S rRNA

Acadl Acetil coenzima A deshidrogenasa, ácidos grasos de cadena larga

Acyl‐Coenzyme A dehydrogenase, long‐chain

AcCoA Acetil coenzima A

Acetyl coenzyme A

Acox1 Acil‐Coenzima A oxidasa 1, palmitoil

Acyl‐Coenzyme A oxidase 1, palmitoyl

Actb β‐Actina

β‐Actin

ADHA Ácido dehidroascórbico

Deydroascorbic acid

AESAN Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición

Spanish Agency for Food Safety and Nutrition

AL/LA Ácido α lipoico

α‐lipoic acid

ALT Alanina aminotransferasa

Alanine aminotransferase

AMP Adenosin di‐fosfato

Adenosine diphosphate

AMPK Quinasas activadas por AMP

AMP‐activated proteína kinase

ARE Elementos de respuesta a antioxidantes

Antioxidant response elements

AST Aspartato aminotransferasa

Aspartate aminotransferase

ATP Adenosin tri‐fosfato

Adenosine triphosphate

Atp5c1 Complejo ATP sintasa mitocondrial F1 γ polipept. 1

ATPsynthase, H+transporting, mitochondrial F1 complex, γ polypeptide1

BSA Albumina sérica bovina

Bovine serum albumin

Abreviaturas

26

Cat Catalasa

Catalase

CEEA Comité de ética para experimentación animal

Ethics committee for animal experimentation

CIFA Centro de Investigación en Farmacobiología Aplicada

Centre of Applied Pharmacobiology

Cit C Citocromo C

Cytochrome C

CK Ciclo de Krebs

Krebs cycle

CoQ Coenzima Q

Coenzime Q

COX I Citocromo c oxidasa, subunidad I

Cytochrome C oxidase, subunit I

COX II/Mtco2 Citocromo c oxidasa, subunidad II

Cytochrome c oxidase subunit II

COX III Citocromo c oxidasa, subunidad III

Cytochrome c oxidase subunit III

Cpt1 Carnitin palmitoil transferasa 1

Carnitine palmitoil transferase 1

Crebp Proteína de unión al elemento de respuesta a cAMP

cAMP‐response element‐binding protein

CS Citrato sintasa

Citrate synthase

CTE/ETC Cadena de transporte de electrones

Electron transport chain

DCPIP 2,6‐diclorofenolindofenol

2,6‐dichlorophenolindophenol

Dgat2 Diacilglicerol acil transferasa 2

Diacylglycerol O‐acyltransferase homolog 2

DHLA Ácido dihidrolipoico

Dihidrolipoic acid

Abreviaturas

27

DMT2 Diabetes Mellitus tipo 2

Type 2 Diabetes

DTNB Ácido 5,5’‐dithiobis‐2‐nitrobenzoico

5,5‐dithiobis (2‐nitrobenzoic acid)

ECV Enfermedad cardiovascular

Cardiovascular disease

ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas

Enzyme‐Linked ImmunoSorbent Assay

eNOS Oxido nítrico sintasa endotelial

Endothelial Nitric Oxide synthase

ERK Señal extracelular regulada por quinasas

Extracellular signal‐regulated kinases

ERN Especies reactivas de nitrógeno

Reactive Nitrogen species

ERRα Receptor relacionado con los estrógenos α

Estrogen related receptor α

FFA Ácidos grasos libres

Free Fatty Acids

Foxo1 Factor de transcripción forkhead 1

Forkhead transciption factor 1

Foxo3a Factor de transcripción forkhead 3a

Forkhead transciption factor 3a

Gpx Glutatión peroxidasa

Glutathione peroxidase

GR Glutatión reductasa

Glutathione reductase

GSH Glutatión reducido

Reduced glutathione

GSSG Glutatión oxidado

Oxidized glutathione

Abreviaturas

28

H2O2 Hidroperóxidos

Hydroperoxides

HDL Lipoproteína de alta densidad

High density lipoprotein

HFD Dieta alta en grasa

High fat diet

HNE 4‐hidroxinonenal

HNF‐4α Factor nuclear hepatocitario 4 α

Hepatocyte nuclear factor 4 α

HOMA Índice de resistencia a la insulina

Homeostasis Model Assesment

HRP Peroxidasa de rábano

Horseradish peroxidase

HTA Hipertensión arterial

Arterial Hypertension

IASO Asociacion Internacional para el estudio de la Obesidad

International Association for the Study of Obesity

IDH Isocitrato deshidrogenasa

Isocitrate dehydrogenase

IL1 Interleuquina 1

Interleukin 1

IL6 Interleuquina 6

Interleukin 6

IMC/BMI Índice de masa corporal

Body mass Index

iNOS Oxido nítrico sintasa inducida

Inducible Nitric Oxide Synthase

IRS2 Receptor de Insulina 2

Insulin receptor 2

JNK c‐Jun N‐terminal quinasas

c‐Jun N‐terminal kinases

Abreviaturas

29

LASY Ácido lipoico sintasa

Lipoic acid synthase

LD Complejo lipoamida deshidrogenasa

Lipoamide dehydrogenase complex

LDL Lipoproteína de baja densidad

Low density lipoprotein

LXR Receptor nuclear hepático X

Liver X Receptor

MAHR/IRLM Mitocondrias aisladas de hígado de rata

Isolated rat liver mitocondria

MAPK Proteina quinasa activada por mitógenos

Mitogen‐activated protein kinase

MCP‐1 Proteína quimióstatica de monocitos

Monocyte chemotactic protein‐1

MDA Malonildialdehido

Malondialdehyde

MPP Peptidasas de matriz mitocondrial

Mitochondrial matriz peptidase

mtDNA DNA mitocondrial

Mitochondrial DNA

mtGpx Glutatión peroxidasa mitocondrial

Mitochondrial glutathione peroxidase

NAFLD Enfermedad hepática no alcohólica

Non‐alcoholic fatty liver disease

NAM Nicotinamida

Nicotinamide

Napmt Nicotinamida ribosil transferasa

Nicotinamide rybosil transferase

NASH Esteatohepatitis no alcohólica

Non‐alcoholic steatohepatitis

Ndufs2 NADH deshidrogenasa (ubiquinona) Fe‐S Proteína 2

NADH dehydrogenase (ubiquinone) Fe‐S protein 2

Abreviaturas

30

NO Oxido nítrico

Nitric Oxide

Nrf1 Factor respiratorio nuclear 1

Nuclear respiratory factor 1

Nrf2 Factor respiratorio nuclear 2

Nuclear respiratory factor 2

OAA Oxalacetato

Oxalacetate

O‐AADPR 2´‐O‐acetil‐ADP‐ribosa

2´‐O‐acetyl‐ADP‐ribose

OH*‐ Radical hidroxilo

Hydroxyl Radical

OLEFT Otsuka Long‐Evans Tokushima Fatty

OMS Organización Mundial de la Salud

Worl Health Organization

ONOO‐ Peroxinitrito

Nitrite peroxide

OXPHOS Fosforilación oxidativa

Oxidative phosphorilation

PAI‐1 Inhibidor de la activación de plásminógeno 1

Plasminogen activation inhibitor 1

Parp Poli‐ADP‐ribosa polimerasa

Poly ADP ribose polymerase

PDH Complejo piruvato deshidrogenasa

Pyruvate Dehydrogenase Complex

PEP Fosfoenol piruvato

Phosphoenolpyruvate

Pgc1α Coactivador 1 α activado por proliferadores peroxisomales γ

Peroxisome proliferator‐activated receptor gamma, coactivator 1 alpha

Pgc1β Coactivador 1 β activado por proliferadores peroxisomales γ

Peroxisome proliferator‐activated receptor gamma, coactivator 1 beta

Abreviaturas

31

PI3K Fosfotidilinositol 3‐quinasa

Phosphoinositide‐3‐kinase

PK Piruvato quinasa

Pyruvate Kinase

PON‐1 Paroxenasa 1

Paroxenase 1

Pparα Receptor del activador de la proliferación peroxisomal α

Peroxisome proliferator activated receptor alpha

Pparγ Receptor del activador de la proliferación peroxisomal γ

Peroxisome proliferator activated receptor gamma

Ppia Ciclofilina

Peptidylprolyl isomerase (cyclophilin)‐like 3

QH2 Ubiquinol/ Ubiquinol

RCN Especies reactivas de cloro

Chloride Reactive Species

RCR Ratio de control respiratorio

Respiratory control ratio

RI Resistencia a la Insulina

Insulinresistance

ROS Especies reactivas de oxígeno

Reactive oxygen species

RSV Resveratrol/ Resveratrol

SAM S‐adenosil metionina

S‐Adenosyl Methionine

SDH Succinato deshidrogensa

Succinate Dehydrogenase

SEEDO Sociedad Española para el Estudio de la Obesidad

Spanish Society to Study of Obesity

Sirt1 Sirtuina 1/ Sirtuin 1

Sirt3 Sirtuina 3/ Sirtuin 3

SIRTs Familia de las Sirtuinas

Silent mating type information regulation 2 homologue family

Abreviaturas

32

SM Síndrome metabólico

Metabolic Syndrome

Sod1 Superóxido dismutasa 1, isoforma citosólica depenciente de Cu‐Zn

Superoxide dismutase 1, cytosolic isoform, Cu‐Zn Sod

Sod2 Superóxido dismutasa 2, mitocondrial dependiente de manganeso

Superoxide dismutase2, mitocondrial manganese superoxide Sod

Srebp1 Factor de transcripción de la proteína de unión al elemento regulador

de esteroles 1

Sterol regulatory element binding transcription factor 1

TAM Tejido adiposo marrón

Brown adipose tissue

TBARS Especies reactivas del ácido tiobarbitúrico

Thiobarbituric acid reactive species

Tfam Factor de transcripción mitocondrial A

Mitochondrial transcription factor A

Tfb1m Factor de transcripción mitocondria B1

Mitochondrial transcription factor B1

Tfb2m Factor de transcripción mitocondria B2

Mitochondrial transcription factor B2

TG Triglicéridos

Triglycerydes

TGFβ Factor de crecimiento β

Transforming growth factor β

TNB Ácido 5‐thio‐2‐nitrobenzoico

5‐thio (2‐nitrobenzoic acid)

TNFα Factor de necrosis tumoral α

Tumor necrosis factor α

TTFA 4,4,4‐Trifluoro‐1,2‐Trienil‐1,3‐butadienona

4,4,4‐Trifluoro‐1‐(2‐thienyl)‐1,3‐butanedione

TXR Tioredoxina reductasa

Thiredoxin reductase

Abreviaturas

33

Ucp2 Proteína desacoplante 2

Uncoupling protein 2

Uqcrq Ubiquinol‐Cit c reductasa, complejo III subunidad VII

Ubiquinol‐cytochrome c reductase, complex III subunit VII

VC Vitamina C

Vitamin C

XOD Xantino oxidasa

Xanthine Oxidase

Índice

35

ÍNDICE

CAPÍTULO 1 INTRODUCCIÓN .................................................................................... 43

1.1 La obesidad.................................................................................................................. 45

1.2 Enfermedad hepática no alcohólica ............................................................................ 56

1.3 Estrés oxidativo ........................................................................................................... 65

1.4 La mitocondria ............................................................................................................. 71

1.5 Terapia antioxidante ................................................................................................... 99

1.6 Ácido lipoico .............................................................................................................. 105

1.7 Referencias bibliográficas ......................................................................................... 119

CAPÍTULO 2 HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ...................................................................... 167

CAPÍTULO 3 MATERIAL Y MÉTODOS ....................................................................... 175

3.1 Estudio in vitro ........................................................................................................... 179

3.2 Estudios in vivo .......................................................................................................... 197


CAPITULO 4 RESULTADOS ....................................................................................... 249

6.1 Vitamin c, Resveratrol and Lipoic acid actions on isolated rat liver mitochondria. .. 253

6.2 Erythrocyte as a potential biomarker of liver mitochondrial antioxidant status ...... 279

Índice

6.3 Lipoic acid administration prevents non‐alcoholic steatosis linked to long term high‐

fat..feeding by modulating mitochondrial function …………………………….……………………..……303

6.4 Lipoic acid improves mitochondrial function in non‐alcoholic steatosis through

the..stimulation of sirtuin 1 and sirtuin 3 ………………………………………….……………………………….341

CAPÍTULO 5 DISCUSIÓN GENERAL .......................................................................... 369

7.1 Discusión general ...................................................................................................... 371


CAPÍTULO 6 CONCLUSIONES .................................................................................. 397

CAPÍTULO 7 RESUMEN ........................................................................................... 407

ANEXOS .................................................................................................................. 411

Índice de Ilustraciónes y figuras

37

ÍNDICE DE ILUSTRACIÓNES Y FIGURAS

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

Ilustración 1 Balance energético positivo y acumulación de grasa. ............................................ 45

Ilustración 2 Valores promedio de IMC de varones jóvenes en diferentes países. ...................... 50

Ilustración 3 Modelo esquemático del desarrolló del síndrome metabólico. ............................. 53

Ilustración 4 Posibles mecanismos del origen del estrés oxidativo asociado a obesidad. .......... 54

Ilustración 5 Progresión de la NAFLD y evolución histológica ..................................................... 58

Ilustración 6 Teoría del “doble impacto” para el desarrollo de la NAFLD. .................................. 60

Ilustración 7 Metabolismo de los TG en el hígado. ..................................................................... 61

Ilustración 8 Disfunción mitocondrial en la esteatosis y posibles mecanismos de protección de

las defensas antioxidantes. ......................................................................................................... 64

Ilustración 9 Esquema del daño oxidativo producido en las diferentes estructuras celulares .... 66

Ilustración 10 Reacciones de formación de radicales libres. ....................................................... 68

Ilustración 11 Esquema de las principales defensas antioxidantes celulares. ............................ 69

Ilustración 12 Esquema de la estructura mitocondrial ................................................................ 72

Ilustración 13 Etapas finales de los procesos catabólicos que se desarrollan en la matriz

mitocondrial. ............................................................................................................................... 73

Ilustración 14 Esquema de la cadena de transporte de electrones y balance de protones ........ 76

Ilustración 15 Esquema del flujo de protones en la fosforilación oxidativa ................................ 80

Ilustración 16 Consumo de oxígeno en los diferentes estados respiratorios .............................. 81

Ilustración 17 Mapa del genóma mitocondrial en vertebrados .................................................. 83

Ilustración 18 Señales de regulación de la biogénesis mitocondrial que confluyen en el promotor

de Pgc1α o en Pgc1α. .................................................................................................................. 85

Ilustración 19 Red de regulación de la función mitocondrial dirigida por Pgc1α. ....................... 87

Ilustración 20 Producción de O2*‐ en la cadena de transporte de electrones. ............................. 90

Ilustración 21 Principales defensas antioxidantes mitocondriales y vías de formación de

especies reactivas desde O2*‐. ..................................................................................................... 91

Ilustración 22 Esquema del daño oxidativo en la mitocondria. Cyt c; citocromo c, PTM; poro de

transición mitocondrial. .............................................................................................................. 92

Ilustración 23 Localización celular de las diferentes sirtuinas. .................................................... 93


38

Ilustración 24 Actividades enzimáticas de las SIRTs. Adaptado de Haigis et al (2010) ............... 94

Ilustración 25 Efectos de la Sirt1 en el metabolismo del tejido hepático en situación de ayuno.96

Ilustración 26 Esquema de los mecanismos de protección frente al estrés oxidativo mediados

por Sirt3. ..................................................................................................................................... 98

Ilustración 27 Estructura química de la Vitamina C .................................................................. 100

Ilustración 28 Metabolismo redox de la vitamina C.. ................................................................ 102

Ilustración 29 Estructura química del Resveratrol .................................................................... 104

Ilustración 30 Estructura del ácido lipoico (AL) ......................................................................... 106

Ilustración 31 Vías de transformación del ácido lipoico exógeno en modelos in vitro. ............ 107

Ilustración 32 Transformaciones químicas del AL en el hígado. ............................................... 109

Ilustración 33 Mecanismo posible de la activación de genes antioxidantes por el AL. ............. 111

Ilustración 34 Mecanismos de regeneración de antioxidantes endógenos por acción del AL. . 112

Ilustración 35 Resumen de módelos experimentales empleados .............................................. 177

Ilustración 36 Diseño experimental in vitro ............................................................................... 179

Ilustración 37 Imagen de la cavidad abdominal de rata Wistar (a) y partes del hígado (b) ..... 182

Ilustración 38 Protocolo de aislamiento de extractos mitocondriales de hígado de rata ......... 183

Ilustración 39 Esquema de la reacción para la determinación de O2*‐. ..................................... 186

Ilustración 40 Esquema del procedimiento para la determinación de la producción O2*‐ ........ 187

Ilustración 41 Esquema de la reacción para la determinación de hidroperóxidos .................... 187

Ilustración 42 Esquema del procedimiento para la determinación de la producción

hidroperóxidos ........................................................................................................................... 189

Ilustración 43 Esquema de las reacciones para la medida de la actividad superóxido dismutasa

................................................................................................................................................... 189

Ilustración 44 Esquema de las reacciones para la medida de la actividad glutatión peroxidasa

................................................................................................................................................... 191

Ilustración 45 Consumo de oxígeno en los diferentes estados respiratorios ............................ 195

Ilustración 46 Diseño experimental del estudio in vivo ............................................................. 198

Ilustración 47 Diseño experimental del estudio in vivo I ........................................................... 200

Ilustración 48 Diseño experimental in vivo II ............................................................................. 201

Ilustración 49 Reacción enzimática para la determinación de los niveles séricos de glucosa .. 202

Ilustración 50 Reacciones enzimáticas implicadas en la determinación de los niveles séricos de

AST ............................................................................................................................................. 202


39

Ilustración 51 Reacciones enzimáticas implicadas en la determinación de los niveles séricos de

ALT. ............................................................................................................................................ 203

Ilustración 52 Fundamento teórico de la detección de los niveles de insulina por el método de

ELISA .......................................................................................................................................... 204

Ilustración 53 Micrografías de hígado de rata .......................................................................... 207

Ilustración 54 Reacción de formación de aductos de MDA‐TBA ............................................... 209

Ilustración 55 Esquema de las reacciones para la medida del contenido en glutatión ............ 214

Ilustración 56 Esquema de la RT‐qPCR según la metodología TaqMan. ................................... 218

Ilustración 57 Pasos principales de la técnica de Western Blot ................................................ 221

Ilustración 58 Esquema de reacciones para la determinación de la actividad del Complejo I .. 229

Ilustración 59 Conjunto de reacciones en las que se basa la determinación de la actividad del

Complejo II+III ............................................................................................................................ 231

Ilustración 60 Reacción en la que se basa la medida de la actividad del Complejo IV .............. 233

Ilustración 61 Reacciones implicadas en la medida de la actividad ATP sintasa ...................... 235

Ilustración 62 Reacciones catalizadas por la SDH y en las que se basa la medida de su actividad

................................................................................................................................................... 236

Ilustración 63 Reacciones implicadas en la medición de la actividad citrato sintasa ............... 238

Ilustración 64 Reacción en la que se basa la medida de los niveles de ATP por bioluminiscencia

................................................................................................................................................... 240

Ilustración 65 Determinación del daño en el mtDNA mediante RT‐qPCR ................................. 243

CAPÍTULO 4: RESULTADOS

CAPÍTULO 4.1: RESULTADOS I

Figure 1 Effects of different antioxidants on mitochondrial superoxide production……………… 261

Figure 2 Effects of antioxidants on mitochondrial hydroperoxide production ……………………….262

Figure 3 Influence of VC, RSV and LA on the activity of the main mitochondrial antioxidant

enzymes ……………………………………………………………………………………………………………………………….263

Figure 4 Changes in P/O ratio after treatment with antioxidants………………….........................266

CAPÍTULO 4.2: RESULTADOS II

Figure 1 Effects of HFD and LA on erythrocyte antioxidant defences.................................... 289


40

Figure 2 Correlation between erythrocyte antioxidant defences and liver triglycerides.........290

Figure 3 Correlation between erythrocyte antioxidant defences and TBARS content............291

Figure 4 Correlation between erythrocyte antioxidant defences and mtDNA injury..............291

Figure 5 Correlation between the main antioxidant defences analyzed in erythrocytes and in

the hepatic mitochondrial compartment.................................................................................292

CAPÍTULO 4.3: RESULTADOS III

Figure 1 Changes in hepatic tryglyceryde content induced by HFD and LA..............................314

Figure 2 Effects of HFD and LA treatment in liver histopathology............................................317

Figure 3 Effects of HFD and LA on citrate synthase and succinate dehydrogenase activites....319

Figure 4 Activities of electron transport chain complexes.........................................................323

Figure 5 Changes in ATP synthase activity, mRNA levels of Atp5c1, mitochondrial ATP levels and

correlation between liver mitochondrial ATP levels and metabolic efficiency..........................324

CAPÍTULO 4.4: RESULTADOS IV

Figure 1 Effects of LA on liver damage and reactive oxygen species………………………………………352

Figure 2 Changes on mitochondrial antioxidant defenses in different experimental group……354

Figure 3 Effect of LA on mitochondrial biogenesis and mtdna damage…………………………………356

Figure 4 Effects of LA on Foxo3a and Pgc1β expresión and acetylation…………………………………358

Figure 5 Effects of LA on sirtuins pathway……………………………………………………………………………360

Índice de Tablas

41

ÍNDICE DE TABLAS

CAPÍTULO 1: INTRODUCCIÓN

Tabla 1 Criterios de la seedo para clasificar la obesidad ………………………………………………………..48

CAPÍTULO 3: MATERIAL Y MÉTODOS

Tabla 2 Composición nutricional de la dieta modelo in vitro…………………………………………………180

Tabla 3 Condiciones de utilización de los antioxidantes empleados en la incubación de

mitocondrias…………………………………………………………………………………………………………….………… 184

Tabla 4 Composición nutricional de las dietas experimentales………………………………………….… 197

Tabla 5 Descripción de los grupos experimentales modelo in vivo …………………………………….. 199

Tabla 6 Listado de genes y sondas utilizadas para el Qrt‐pcr……………………………………………… 220

Tabla 7 Anticuerpos empleados para la determinación de proteínas………………………………... 225

Tabla 8 Reactivos empleados en la medida de la actividad del complejo I………………………….230

Tabla 9 Reactivos empleados en la medida de la actividad del complejo II+III…………………. 232

Tabla 10 Reactivos empleados en la medida de la actividad del complejo II……………………….237

Tabla 11 Reactivos empleados en la medida de la actividad citrato sintasa……………………….239

CAPÍTULO 4: RESULTADOS

CAPÍTULO 4.1 RESULTADOS I

Table 1 Changes on respiratory parameters of VC, RSV and LA……………………………………………265

CAPÍTULO 4.2 RESULTADOS II

Table 1 Effects of diet and lipoic acid on obesity and oxidative markers. ……………………………..287

CAPÍTULO 4.3 RESULTADOS III

Table 1 Gene name and genbank accession number used in RT‐qPCR…………………………........ 310

Índice de Tablas

42

Table 2 Body, liver and wat weights, biochemical markers, calorie intake and feed efficiency in

lean and obese (high‐fat fed) rats…………………………………………………………………………………………313

Table 3 Effects of LA on mRNA levels of several genes involved in liver lipogenesis, β‐oxidation,

Ppars and Pgcs pathway…………………………………………………………………………………………………….. 321

CAPÍTULO 4.4 RESULTADOS IV

Table 1 Gene name and genbank accession number used in RT‐qPCR………………………………… 348

Table 2 Body weight gain, body composition, liver triglyceride content, calorie intake and

feeding efficiency in lean and obese rats……………………………………………………………………………….351

CAPÍTULO 1 / CHAPTER 1

Introducción/Introduction

Chapter 1 Introduction Capítulo 1 Introducción

45

1.1 LA OBESIDAD

1.1.1 DEFINICIÓN Y ETIOPATOGENIA

En la actualidad, la obesidad se define como una enfermedad crónica caracterizada por

un aumento de la masa grasa y, por lo tanto, del peso corporal, como consecuencia de

un balance energético positivo mantenido en el tiempo (Bray and Bouchard 2008). El

exceso de peso se asocia normalmente con un aumento de las reservas del organismo

en forma de grasa en relación con el promedio normal para la edad, sexo, talla y

complexión (Lumeng and Saltiel 2011, Redinger 2008, Sinha and Kling 2009, Bray and

Bouchard 2008).

La obesidad es una condición heterogénea y multifactorial en cuya aparición están

implicados numerosos factores etiológicos, entre los cuales la herencia y el estilo de vida

juegan un papel determinante (Valdecantos, Perez‐Matute and Martinez 2009).

Las relaciones entre la ingesta energética, el gasto energético, la composición nutricional

de la dieta y la adipogénesis determinan la cantidad de la reserva energética corporal

(Ilustración 1). Cuando la ingesta energética excede al gasto energético o la distribución

nutricional de la dieta favorece la reserva de lípidos, se produce un desequilibrio que

conlleva al desarrolló de sobrepeso y a largo plazo de obesidad (Loos and Bouchard

2003).

Ilustración 1 Balance energético positivo y acumulación de grasa. Diagrama que relaciona

el balance energético positivo con la acumulación de grasa, indicando los puntos de

actuación de la predisposición genética.

Capítulo 1 Introducción Chapter 1 Introduction

46

En la mayoría de los casos, la situación de obesidad no se debe a una única causa sino

que su origen es multifactorial, implicando diversos agentes. En muy pocas ocasiones la

causa de la obesidad es única (Apovian 2010, Egger and Dixon 2011, Musaiger 2011),

como en el caso de la deficiencia en leptina (Licinio et al 2004, Farooqi et al 2002) o la

mutación del receptor de melanocortina 4 (Yeo et al 2003, Vaisse et al 1998). A

continuación se detallan los principales factores causantes de obesidad descritos en la

literatura:

Factores genéticos: aunque se han identificado algunos casos de obesidad

monogénica en humanos, la obesidad humana es fundamentalmente de origen

poligénico (Hinney and Hebebrand 2008, Hinney, Vogel and Hebebrand 2010).

Uno de los genes relacionados con la obesidad que han sido más analizados en

los últimos años es el gen FTO (Labayen et al 2011, Moleres et al 2011, Muller

et al 2008).

Factores neuroendocrinos: en el año 1994, Zhang y colaboradores identificaron

la leptina, hormona con un importante papel en la regulación del peso corporal

(Myers et al 2010, Oswal and Yeo 2010). Posteriormente, se han identificado un

gran número de moléculas relacionadas con el control neuroendocrino de la

ingesta y del gasto energético que podrían desempeñar un papel importante en

la aparición de la obesidad como la adiponectina (Mangge et al 2010,

Matsuzawa 2010), la resistina (Lazar 2007), la grelina (Schellekens, Dinan and

Cryan 2010, Wiedmer et al 2007) o el receptor de la melanocortina 4 (MC4R)

(Scherag et al 2010, Wang et al 2010a).

Factores dietéticos y actividad física: la distribución de los substratos

energéticos de la dieta, y no solo la ingesta energética, es un importante factor

a tener en cuenta en el desarrolló de la obesidad ya que pueden tener un

impacto diferente sobre el metabolismo y el apetito, así como sobre la

respuesta del sistema nervioso simpático y por tanto en el balance energético y

en el peso corporal (Labayen and Martinez 2002, Martinez et al 2002). Por otro

lado el sedentarismo que se ha impuesto en los países occidentales provoca un

descenso en el gasto energético que ha contribuido de forma importante al


47

aumento de la obesidad principalmente en población infantil (Hills, Andersen

and Byrne 2011, Must and Parisi 2009, Steeves et al 2011).

Causas farmacológicas: como el consumo de algunos anti psicóticos, cortico

esteroides o β‐bloqueantes.

Causas psicosociales: Determinadas situaciones ambientales pueden

desencadenar respuestas emocionales que pueden llevar a ingerir una cantidad

excesiva de alimentos, produciéndose el fenómeno denominado “obesidad

reactiva”. Asimismo, en la mayoría de estudios epidemiológicos sobre la

obesidad se ha observado una relación inversa entre el nivel cultural y su

prevalencia, de modo que a menor nivel de formación se produce una mayor

incidencia de obesidad.

1.1.2 CLASIFICACIÓN

Existen diversos criterios en función de los cuales puede clasificarse la obesidad. El más

utilizado es el criterio cualitativo que se basa en el Índice de Masa Corporal (IMC) o

Índice de Quetelet. Se trata de un índice que relaciona el peso del individuo expresado

en kilogramos con la altura de dicho individuo, expresada en metros, y elevada al

cuadrado. Dicho índice es utilizado por la mayoría de estudios epidemiológicos y

recomendado por diversas sociedades médicas y organizaciones de salud

internacionales para su uso clínico, dada su reproducibilidad, facilidad de utilización y

capacidad de reflejar la adiposidad en la mayoría de la población (Salas‐Salvado et al

2007). De acuerdo con el Consenso SEEDO´2007 (Sociedad Española para el Estudio de la

Obesidad) esta clasificación queda establecida tal y como se muestra en la siguiente

tabla:


48

Tabla 1 Criterios de la SEEDO para clasificar la obesidad en función del IMC en adultos

Categoría Valores límites de IMC (Kg/m2)

Peso Insuficiente <18,5

Normopeso 18,5‐24,9

Sobrepeso grado I 25,0‐26,9

Sobrepeso grado II 27,0‐29,9

Obesidad tipo I 30,0‐34,9

Obesidad tipo II 35,0‐39,9

Obesidad tipo III (mórbida) 40,0‐49,9

Obesidad tipo IV (extrema) >50

Recientemente se ha definido un índice alternativo al IMC, el índice de adiposidad

corporal que refleja de forma más precisa el porcentaje de grasa acumulada y es

independiente del sexo y la raza (Bergman et al 2011). Este nuevo índice parece

interesante, aunque su utilidad debe ser validada por más trabajos.

Además de este criterio, la obesidad se puede clasificar en base a criterios etiológicos,

anatómicos o celulares. Para este estudio es de especial importancia la clasificación

según criterios anatómicos basada en la distribución de la grasa corporal (Serrano Rios,

Ordovas and Gutierrez Fuentes 2010). En base a esta clasificación los tipos de obesidad

serían:

Obesidad difusa o clase I: caracterizada por un exceso de grasa corporal total sin

que se produzca concentración específica de tejido adiposo en ninguna región

especial.

Obesidad central, androide o clase II: se caracteriza por un exceso de grasa

subcutánea a nivel abdominal y troncular. Esta obesidad suele asociarse a las

principales co‐morbilidades derivadas de la obesidad como la esteatosis

hepática o la DMT2.


49

Obesidad glúteo‐femoral, ginoide o clase III: caracterizada por un acumulo de

grasa principalmente en la región glúteo‐femoral. Suele asociarse a litiasis biliar,

tromboflebitis e hiperinsulinemia.

1.1.3 PREVALENCIA

La prevalencia de obesidad ha aumentado y continúa incrementándose de forma

alarmante tanto en países desarrollados como en países de economía de transición o no

desarrollados, adquiriendo proporciones epidémicas (Finucane et al 2011, Low, Chin and

Deurenberg‐Yap 2009). Según la OMS, en 2005 había en todo el mundo 1600 millones

de personas mayores de 15 años y 20 millones de menores de 5 años con sobrepeso, y

400 millones de personas con obesidad. Se estima que en el año 2015 habrá,

aproximadamente, 2300 millones de personas adultas con sobrepeso y más de 700

millones con obesidad. Los últimos análisis (2010) de la IASO (Asociación Internacional

para el Estudio de la Obesidad) estiman que aproximadamente 1000 millones de adultos

tienen sobrepeso y 475 millones son obesos. La IASO apreció que 200 millones de niños

en edad escolar sufren sobrepeso u obesidad, de los cuales entre 40 y 50 millones están

clasificados como obesos. En Europa aproximadamente el 60% de adultos y el 20% de

los niños en edad escolar tienen sobrepeso u obesidad. Traducido en números esto

implica aproximadamente 260 millones de adultos y 12 millones de niños que tienen

sobrepeso y/u obesidad en Europa.


50

Ilustración 2 Valores promedio de IMC de varones jóvenes en diferentes países. Tomada de

(Finucane et al 2011)

La prevalencia de obesidad en España, según la Encuesta Nacional de Salud 2006

publicada por el Ministerio de Sanidad Español, en población adulta es del 15,56% para

obesidad y si consideramos las situaciones de sobrepeso aumenta al 37,80%. En relación

a la prevalencia en niños y adolescentes, un estudio recientemente publicado (Febrero

2011) por la fundación THAO y llevado a cabo en 7 comunidades autónomas, muestra

que un 29,3% de los niños españoles sufre sobrepeso u obesidad. Una cifra que se

desglosa en una tasa del 21,1% de sobrepeso y del 8,2% cuando se contabiliza a

menores obesos con edades comprendidas entre los 3 y los 12 años. Un dato muy

significativo es el elevado índice de obesidad en población infantil de entre 3 y 5 años

(8,4%).

Especialmente preocupante es el aumento de la prevalencia de sobrepeso y obesidad en

niños y adolecentes (Baker et al 2010, Dehghan, Akhtar‐Danesh and Merchant 2005,

Han, Lawlor and Kimm 2010) debido a que se están teniendo que abordar algunas co‐

morbilidades asociadas a la obesidad como el síndrome metabólico (SM) (Abrams and

Levitt Katz 2011, Pacifico et al 2011a), la hipertensión (LaRosa and Meyers 2010) o la


51

esteatosis hepática (Widhalm and Ghods 2010, Weghuber et al 2011, Pacifico et al

2011b) en pacientes pediátricos lo cual acarrea una disminución importante en la

calidad de vida y un severo aumento del coste sanitario.

Este crecimiento exponencial ha convertido la obesidad en uno de los principales

problemas de salud pública en sociedades occidentales (Powers, Rehrig and Jones 2007)

estimándose que el coste económico en España derivado del tratamiento de la obesidad

y sus co‐morbilidades oscila en torno a los 5000 millones de euros anuales lo que

supone un 7% del gasto sanitario (Consenso SEEDO´2007 Sociedad Española para el

Estudio de la Obesidad) (Rubio 2007).

1.1.4 CO‐MORBILIDADES ASOCIADAS

La importancia clínica de la obesidad radica en sus complicaciones tal y como se ha

señalado previamente. La obesidad aumenta el riesgo de desórdenes metabólicos,

alteraciones cerebrovasculares, respiratorias, osteoarticulares e incluso determinados

tipos de cáncer (Hillon et al 2010, Prieto‐Hontoria et al 2011a). En este sentido, el

acúmulo de grasa corporal, principalmente en la región abdominal, está asociado a un

mayor riesgo de desarrollar DMT2 (DM2) (Das and Mukhopadhyay 2011, Eckel et al

2011), enfermedad cardiovascular (ECV) (Lavie, Milani and Ventura 2009, Artham et al

2009, Morse, Gulati and Reisin 2010) o esteatosis hepática (Cohen, Horton and Hobbs

2011, Moore 2010). Por otro lado, aumenta precozmente el desarrolló de

complicaciones metabólicas como dislipemias, hipertensión arterial, hiperinsulinemia,

hiperglucemia y resistencia a la insulina (RI), que en su conjunto caracterizan el SM

(Misra and Khurana 2008, Scaglione et al 2010, Barth 2011).

Los desórdenes clínicos asociados con la obesidad se generan bien como consecuencia

directa del aumento de la masa grasa o bien de manera secundaria, debido a que los

obesos presentan una actividad secretora del tejido adiposo alterada que puede afectar

al funcionamiento de distintos sistemas (Bray 2004, Bray and Bouchard 2008). A

continuación se resumen las alteraciones más comúnmente asociadas a la obesidad.

Enfermedad cardiovascular arterioesclerótica: cardiopatía isquémica,

enfermedad cerebrovascular etc.


52

Alteraciones cardiorrespiratorias: insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia

ventilatoria, síndrome de apneas obstructivas del sueño etc.

Alteraciones metabólicas: resistencia a la insulina y DMT2, hipertensión arterial,

dislipemia aterógena e hiperuricemia.

Alteraciones en la mujer: disfunción menstrual, síndrome de ovarios

poliquísticos, infertilidad o aumento del riesgo perinatal.

Digestivas: colelitiasis, esteatosis hepática, esteatohepatitis no alcohólica,

cirrosis, reflujo gastroesofágico y hernia de hiato.

Músculo‐esqueléticas: artrosis, lesiones articulares y deformaciones óseas.

Otras alteraciones: insuficiencia venosa periférica, enfermedad

tromboembólica, cáncer, alteraciones cutáneas, alteraciones psicológicas y

psicosociales, disminución en la calidad de vida, trastornos del comportamiento

alimentario etc.

1.1.5 PAPEL DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN EL DESARROLLÓ DE LA OBESIDAD Y ALGUNAS CO‐

MORBILIDADES ASOCIADAS

Numerosos datos publicados en los últimos años parecen indicar el papel central del

estrés oxidativo en el desarrollo de las co‐morbilidades asociadas a la obesidad

(D'Archivio et al 2011, Fernandez‐Sanchez et al 2011, Vincent, Innes and Vincent 2007).

Aunque no se conocen con exactitud los mecanismos, se ha sugerido que el aumento del

tejido adiposo blanco (TAB) conlleva una infiltración de macrófagos, que son

responsables de un aumento de la expresión de la NAD (P)H oxidasa y ésta, a su vez, es

la responsable de un aumento selectivo de la producción de ROS en el TAB (Ilustración

3). De esta manera, se genera un aumento del estrés oxidativo en el TAB que

desencadena una alteración en la secreción de adipoquinas la cual es causa del SM,

hipertensión arterial (HTA) y ateroesclerosis. En este proceso la resistencia a la insulina

en el hígado desarrolla un papel fundamental que se desarrollara más adelante en esta

tesis.


53

Ilustración 3 Modelo esquemático del desarrolló del síndrome metabólico. PAI‐1,

inhibidor del factor activador de plasminógeno tipo I; TAB, tejido adiposo blanco; TNFα,

factor de necrosis tumoral; ROS, especies reactivas de oxígeno (Valdecantos, Perez‐Matute

and Martinez 2009).

Así, en el estudio llevado a cabo por Furukawa y colaboradores se halló un aumento

selectivo en la expresión de algunas subunidades de la NAD(P)H oxidasa en el tejido

adiposo blanco en animales obesos y también se observó un aumento selectivo en la

producción de H2O2 en este tejido y en los niveles plasmáticos, estableciendo de esta

forma que el tejido adiposo es la principal fuente de ROS en situación de obesidad.

Asimismo, se analizaron diferentes indicadores de SM, como los niveles séricos de

glucosa e insulina, observando un aumento de dichos niveles en los animales con exceso

de peso que era revertido tras el tratamiento con un inhibidor de la NAD (P)H oxidasa

(apocinina) (Furukawa et al 2004). En una publicación reciente, Fortuño y colaboradores

apuntaban datos similares en pacientes obesos con SM en los que observaron tanto un

aumento en la producción de O2*‐ dependiente de NAD (P)H oxidasa como un aumento

en la expresión en algunas subunidades de esta enzima. Asimismo, estas investigaciones

establecieron una correlación positiva entre las concentraciones plasmáticas de insulina


54

y la producción de O2*‐ (Fortuno et al 2006). Por otro lado, parece que el aumento de la

expresión de NAD (P)H en el tejido adiposo puede estar relacionado con la infiltración de

macrófagos observada en dicho tejido, principalmente en el de tipo visceral (Curat et al

2006, Moreno‐Aliaga 2005).

A pesar de que estos datos contribuyan a clarificar los mecanismos de desarrolló del

estrés oxidativo asociado a obesidad, este desequilibrio no se produce por un único

mecanismo sino por la confluencia de varios factores y sus interacciones como se recoge

en la Ilustración 4.

Ilustración 4 Posibles mecanismos del origen del estrés oxidativo asociado a obesidad.

EO, estrés oxidante; FRAP, poder antioxidante del hierro; ROS, especies reactivas de

oxígeno; TA, tejido adiposo; TAS, capacidad antioxidante total del plasma (Valdecantos,

Perez‐Matute and Martinez 2009).

1.1.6 PAPEL DE LA DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL EN LA OBESIDAD Y SUS CO‐

MORBILIDADES ASOCIADAS

Investigaciones recientes han establecido una relación entre la obesidad y algunas de

sus principales co‐morbilidades asociadas con una disfunción mitocondrial. Así, Rafaella

et al (2008) describieron en modelos animales de obesidad y resistencia a la insulina

inducida por una dieta alta en grasa (HFD), diferentes alteraciones en mitocondrias


55

hepáticas, principalmente una disminución de la eficiencia mitocondrial, aumento del

estrés oxidativo así como disminución en la capacidad respiratoria (Raffaella et al 2008).

Por otro lado, en ratones con obesidad inducida por la dieta se ha observado una

disminución en la expresión del gen de la frataxina mitocondrial, cuya ausencia se

encuentra relacionada con la enfermedad de Friedereich, una de las patologías

mitocondriales de mayor importancia (Pomplun et al 2007).

Por otro lado, estudios in vitro desarrollados en la línea celular murina 3T3‐L1, han

establecido una relación directa entre la disfunción mitocondrial y la disminución en la

síntesis de adiponectina (Koh et al 2007), lo cual se considera que es uno de los

mecanismos subyacentes al desarrolló de obesidad ligado al estrés oxidante. Además,

en los últimos años se ha propuesto el papel de la sirtuina 3 (Sirt3), localizada

principalmente en la mitocondria, como reguladora de la homeostasis energética (Ahn

et al 2008). Así, en estudios de restricción calórica llevados a cabo en modelos animales

de obesidad se observó una disminución en la producción de ROS, un aumento en la

biogénesis mitocondrial junto con una mejora en la función mitocondrial (Bevilacqua et

al 2005). Estos datos han dado lugar recientemente a la hipótesis de que la disfunción

mitocondrial puede hallarse en el inicio de las principales patologías metabólicas

(Raffaella et al 2008).

Por otro lado, la mayor parte de las anomalías metabólicas identificadas en el

metabolismo energético en situaciones de obesidad tienen como nexo de unión la

participación de la mitocondria. Así, las tres principales disfunciones relacionadas con el

metabolismo energético asociadas a obesidad son; la disminución de la grasa así como

una mayor dependencia de la glucosa para la síntesis de ATP, aumento de la

acumulación de grasa en el músculo esquelético y en el hígado principalmente y una

baja concentración basal de ATP. Todas ellas parecen tener su origen en diferentes

alteraciones en la mitocondria como ha sido propuesto por Rogge et al (2009) (Rogge

2009).

Por otro lado, Raffaella et al (2008) describieron alteraciones en el compartimento

mitocondrial hepático en modelos animales de obesidad inducida por la dieta (Raffaella

et al 2008). Así, estos animales desarrollaron esteatosis hepática y resistencia a la

insulina tras la alimentación con una dieta alta en grasa. Las principales alteraciones


56

mitocondriales descritas fueron el aumento del estrés oxidativo, la disminución en las

capacidades respiratoria mitocondrial y una aumento en el tamaño de las mitocondria

que se acompaño con una disminución en la eficiencia de las mismas (Raffaella et al

2008). Estos datos sugieren que las modificaciones observadas en el compartimento

hepático mitocondrial pueden preceder y contribuir al ulterior desarrolló de resistencia

a la insulina y de otras enfermedades metabólicas.

1.2 ENFERMEDAD HEPÁTICA NO ALCOHÓLICA

La enfermedad hepática no alcohólica (NAFLD) es una enfermedad inflamatoria hepática

de carácter crónico que engloba un espectro de patologías que van desde la

acumulación simple de grasa o esteatosis hepática, hasta fases finales de la enfermedad

como la cirrosis, pasando por la esteatohepatitis no alcohólica (NASH) y la fibrosis (Vanni

et al 2010, Mark, de Alwis and Day 2010, Bellentani and Marino 2009). A pesar de que

hace cuatro décadas ya se había descrito la presencia de esteatosis, inflamación y

fibrosis en el hígado de individuos obesos así como de pacientes operados de bypass

intestinal (Bondar and Pisesky 1967, Moxley, Pozefsky and Lockwood 1974, Payne,

Dewind and Commons 1963, Zelman 1952), no es hasta 1980 cuando Ludwig et al (1980)

(Ludwig et al 1980) acuñaron el término de NAFLD, basados en dos criterios principales:

cambios grasos con hepatitis lobular y ausencia de alcoholismo.

La NAFLD constituye probablemente la tercera causa de enfermedad hepática, tras la

hepatopatía alcohólica y el virus de la hepatitis C (Francque et al 2011, Guajardo‐Salinas

and Hilmy 2010, Browning et al 2004). Por su estrecha asociación con la obesidad y la

elevada prevalencia de ésta, hay autores que consideran a la NAFLD como la causa más

frecuente de hepatopatía en las sociedades occidentales. Aunque en sus primeros

estadios la NAFLD es una condición benigna, reversible, asintomática y con pocas

complicaciones clínicas asociadas puede progresar de forma irreversible a

esteatohepatitis no‐alcohólica (NASH) y otras formas más graves de NAFLD como la

fibrosis y la cirrosis con complicaciones graves, por lo que el control de esta progresión

es un paso crítico en la prevención y tratamiento de la NAFLD (Qureshi and Abrams

2007, Day 2006, Cortez‐Pinto, de Moura and Day 2006, Clark, Brancati and Diehl 2002).


57

1.2.1 PREVALENCIA DE LA NAFLD

Actualmente no existe un índice diagnóstico rápido y preciso para la confirmación de la

presencia que NAFLD lo que hace que los estudios de prevalencia usen una gran

variabilidad de base de datos. Las estimaciones más precisas proceden de las obtenidas

en estudios que se desarrollan en pacientes que han fallecido de forma accidental así

como en estudios de muestreo llevados a cabo en la población general (Francque et al

2011, Guajardo‐Salinas and Hilmy 2010, Browning et al 2004). Así, estudios llevados a

cabo mediante ultrasonografía en la población general de Japón e Italia (Bellentani and

Marino 2009, Lonardo et al 1997, Nomura et al 1988) sitúan la prevalencia de la

enfermedad en un 23 y 16% respectivamente. Dos estudios mediante resonancia

magnética espectroscópica detectaron la presencia de esteatosis hepática en un 31% de

los adultos (Browning et al 2004) y en un 33% de los potenciales donantes vivos

sometidos a una biopsia hepática en Estados Unidos (Ryan et al 2002). Por tanto las

actuales estimaciones sitúan la prevalencia de la NAFLD en un 20‐30% y la NASH en un

2‐5% de la población general, estimándose que un 19% de estos últimos evolucionan a

cirrosis, aunque según criterios histológicos estrictos como la balonización o fibrosis la

incidencia disminuye (2‐5%) (McCullough 2002, Marchesini et al 2003, Youssef and

McCullough 2002).

1.2.2 OBESIDAD Y NAFLD

En el estudio Dyonisos (Bellentani and Marino 2009) desarrollado en el norte de Italia, se

observó que un 76% de las personas obesas tenían evidencias ecográficas de esteatosis

hepática frente a un 15 % entre las que no tenían sobrepeso u obesidad. Por otro lado,

la revisión detallada de otros estudios epidemiológicos realizados en amplias muestras

de población indican que la obesidad aumenta el riesgo de tener elevadas

concentraciones de enzimas hepáticas entre 2 y 3 veces, mientras que el riesgo de

esteatosis ecográfica aumenta 3 veces en las personas con sobrepeso y hasta 15 veces

en situaciones de obesidad (Marchesini et al 2008). Estos datos se han confirmado en

diferentes estudios en cohortes de pacientes con obesidad mórbida en los que se ha

observado que la mayoría de los pacientes padecía esteatosis (85‐98%) y que alrededor

de un tercio tenía signos histológicos de esteatohepatitis (37%) de los cuales entre un

20‐40% presentaron estadios avanzados de fibrosis (Machado, Marques‐Vidal and


58

Cortez‐Pinto 2006, Dixon, Bhathal and O'Brien 2001, Garcia‐Monzon et al 2000, Marceau

et al 1999).

Teniendo en cuenta estos datos, actualmente se considera que la esteatosis es la

principal manifestación hepática del SM (Farrell and Larter 2006, Marchesini et al 2003,

Marchesini et al 2008, Schindhelm et al 2006), definido este como la asociación de al

menos tres de las siguientes alteraciones: resistencia a la insulina, obesidad central,

hipertensión arterial y dislipemias (Kassi et al 2011). Como explicaremos más delante de

especial importancia para la progresión de la NAFLD son las dos primeras alteraciones

que constituyen el primer factor de la teoría del “doble impacto” en el desarrollo de la

enfermedad hepática (Day 2002a).

1.2.3 PROGRESIÓN DE LA NAFLD

La esteatosis hepática constituye el principal factor desencadenante del primer estadio

de la NAFLD y consiste en una acumulación ectópica de triglicéridos en el interior de los

hepatocitos en forma de vesículas, sin causar inflamación ni muerte celular. El siguiente

estadio de la enfermedad es la NASH, caracterizada por la presencia de focos

inflamatorios ricos en neutrófilos y macrófagos y muerte hepatocitaria. Posteriormente,

el paciente puede desarrollar fibrosis y en situaciones más graves cirrosis (Ilustración 5).

Ilustración 5 Progresión de la NAFLD y evolución histológica


59

El hecho de que la esteatosis hepática sea una situación reversible mientras que la

esteatohepatitis no lo sea convierte a este tránsito en un punto sin retorno para el

progreso de la enfermedad. Es, por tanto, importante conocer cuáles son los

mecanismos implicados en la instauración del hígado graso y cuáles son los procesos y

agentes defensivos que se ven afectados por la acumulación grasa y que hacen al

hepatocito vulnerable al segundo impacto responsable de la evolución de la NAFLD

(Browning and Horton 2004, Day 2006).

1.2.3.1 Teoría del doble impacto

La teoría del doble impacto es la más aceptada entre la comunidad científica para

explicar la progresión de NAFLD (Garcia‐Monzon et al 2011, Rombouts and Marra 2010,

Lewis and Mohanty 2010) (Ilustración 6). Esta teoría postula que una primera agresión

provoca la acumulación de grasa en el hígado y esta situación hace al hepatocito más

sensible a desarrollar una respuesta inflamatoria que conduce a la evolución a la NASH

(Day 2002a, Day 2002b, Day 2006). La investigación actual apunta a que una

combinación de agentes medioambientales, genéticos y metabólicos provocan el

establecimiento y el avance de la enfermedad (Krawczyk, Bonfrate and Portincasa 2010,

Garcia‐Monzon et al 2011). La resistencia a la insulina se considera el factor

fisiopatológico individual más importante en el desarrollo de la esteatosis (Browning and

Horton 2004, Vanni et al 2010, Garcia‐Monzon et al 2011). De no adaptarse a él, el

hepatocito se vuelve disfuncional pudiendo producirse muerte celular por necrosis y

apoptosis y el subsiguiente fallo hepático (James and Day 1999, Chitturi and Farrell

2001). Si se adapta, el hepatocito preserva su viabilidad funcional pero se vuelve más

vulnerable ante aquellos estímulos que desencadenan una respuesta inflamatoria. De la

intensidad y duración en el tiempo de estos estímulos va a depender el grado de la

respuesta inflamatoria y de muerte celular (Day 2002a). En este segundo impacto

pueden verse implicados factores autocrinos, paracrinos y endocrinos capaces de

desencadenar estrés oxidativo, peroxidación lipídica (Sanyal et al 2001), producción

anormal de citoquinas así como de inducir disfunción mitocondrial y desórdenes en el

metabolismo de ácidos grasos (James and Day 1999). La inflamación crónica del tejido

hepático puede provocar, además, un aumento de la concentración de mediadores pro

inflamatorios, que activan de forma paracrina la fibrogénesis en las células estrelladas


60

(Rombouts and Marra 2010, Krawczyk, Bonfrate and Portincasa 2010, Farrell and Larter

2006).

Tejido normal Esteatosis Esteatohepatitis Fibrosis Cirrosis

TEJIDO ADIPOSO

APOPTOSIS

APOPTOSIS

NECROSIS

Activación céls. Kupffer

Activación céls. estrelladas

RESISTENCIA A LA

INSULINA↑Ácidos grasos

INFLAMACIÓNESTRÉS OXIDATIVO

PRIMER IMPACTO

SEGUNDOIMPACTO

OBESIDADDIABETES

DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL

Ilustración 6 Teoría del “doble impacto” para el desarrollo de la NAFLD.

A. Primer impacto

Actualmente se considera que la resistencia a la insulina constituye el pilar básico

patogénico de la esteatosis hepática ya que puede interferir el metabolismo hepático

de los ácidos grasos a diferentes niveles. Se ha descrito que la RI produce un aumento

de flujo de ácidos grasos libres (FFA) al hígado debido al incremento de la hidrólisis de

los triglicéridos (TG) por la lipasa adipocitaria (Lewis et al 2002). Por otro lado, la

hiperinsulinemia y el aumento de la gluconeogénesis hepática inducida por la RI

estimulan la expresión de la proteína de unión al elemento regulador de esteroles 1

(Srebp1) y la de la proteína de unión al elemento de respuesta a carbohidratos (Crebp)

que son responsables de la estimulación de la lipogénesis de novo a nivel hepático


61

(Ilustración 7) (Cohen, Horton and Hobbs 2011). Además, la Srebp1 inhibe la

transcripción del substrato del receptor de insulina 2 (IRS2) lo que induce un aumento

en la RI a nivel hepático (Ide et al 2004).

Ilustración 7 Metabolismo de los TG en el hígado. Adaptada de Cohen et al (2011)

Como muestra la ilustración 7, el aumento del flujo de ácidos grasos libres además de

por la vía anterior puede provenir del tejido adiposo visceral a través de la vena porta,

siendo esta la principal fuente de FFA a nivel hepático. Esta teoría se ha visto

demostrada en estudios clínicos realizados en pacientes con NALD en los que se

demostró que la mayoría del contenido de TG hepáticos provenía del pool circulante

de FFA (60%), mientras que un 25% de la síntesis de novo de ácidos grasos y tan sólo

un 15% de la dieta (Donnelly et al 2005).

Por otro lado, se ha demostrado que la insulina (Petersen et al 2003) inhibe la β‐

oxidación mitocondrial al producir la activación, mediada por Srebp1‐1c de la isoforma

2 de la AcCoA carboxilasa que produce malonil‐CoA a nivel de la membrana interna

mitocondrial (Abu‐Elheiga et al 2000). Además, el aumento de malonil‐CoA disminuye


62

la β‐oxidación a través de la inhibición de la proteína transportadora de ácidos grasos

carnitina palmitoil transferasa (Cpt1) (Ilustración 7). Esta inhibición de la β‐oxidación

mitocondrial hace que se produzca un flujo elevado de ácidos grasos hacia su

incorporación en triglicéridos, ésteres de colesterol y fosfolípidos. El destino de los

lípidos complejos es específico del tipo celular en cuestión. En los hepatocitos, o bien

se empaquetan en las VLDL si la célula dispone de apolipoproteína B100 (apoB100)

suficiente y se secretan al torrente sanguíneo; o se almacenan en el citoplasma celular

en forma de vacuolas lipídicas.

B. Segundo impacto

Los principales responsables del “segundo impacto” en la progresión de la NAFLD son

el estrés oxidativo y la citoquinas proinflamatorias secretadas por el tejido adiposo.

Así, la peroxidación lipídica inducida por las ROS podría explicar el daño en la

membrana plasmática y mitocondrial causando la muerte celular por necrosis y

apoptosis y la aparición de megamitocondrias (Pessayre 2007, Pessayre et al 2001). El

aumento de ROS también induce la expresión del ligando de Fas a nivel hepático que

puede inducir la apoptosis de los hepatocitos que se ha descrito en pacientes con

NASH (Feldstein et al 2003). Por otro lado, algunos productos finales de la

peroxidación lipídica como el 4‐hidroxinonenal (HNE) o el malondialdehído (MDA)

pueden formar aductos proteícos que actúen como antígenos generando una

respuesta inmune intrahepática (Albano 2008), además tienen capacidad de unión a

citoqueratinas formando hialina de Mallory y pueden estimular la quimiotaxis de

neutrofilos (Cortez‐Pinto, de Moura and Day 2006). También se han encontrado

marcadores de estrés oxidativo como las proteínas nitradas en tirosina en modelos

animales y en pacientes con NAFLD que relacionan el grado de estrés con la gravedad

de la enfermedad hepática (Seki et al 2002).

En cuanto a la producción de ROS en el hígado, además de las células inflamatorias los

hepatocitos son una importante fuente de ROS en situaciones de NAFLD. Este

fenómeno se debe en primer lugar al incremento de flujo de FFA hacia los hepatocitos

inducido por la obesidad (Day 2002c). Los FFA son ligandos del activador de la

proliferación peroxisomal α ( Pparα) que, a su vez, estimula la transcripción de genes

implicados en la oxidación de los ácidos grasos contribuyendo a la formación de ROS


63

en los peroxisomas, el retículo endoplasmático y principalmente en las mitocondrias

(Reddy and Rao 2006, Laurent et al 2005).

El segundo factor a tener en cuenta en la progresión de la NAFLD son las citoquinas

pro‐inflamatorias que son capaces de inducir fenómenos de apoptosis y necrosis y la

quimiotaxis de neutrofilos, además pueden activar las células estelares hepáticas así

como la hialina de Mallory (Diehl et al 2005). Al mismo tiempo, algunas citoquinas pro‐

inflamatorias como el factor de necrosis tumoral (TNFα), y las interleuquinas 1 y 6 (IL1,

IL6) desempeñan un papel central en la patogenia de la RI sistémica y hepática

presente en los pacientes con NAFLD (Arkan et al 2005). Por otro lado, evidencias

experimentales indican que la leptina (Angulo et al 2004, Javor et al 2005) y la

adiponectina (Kaser et al 2005b, Kaser et al 2005a, Bugianesi et al 2005) podrían jugar

un papel fundamental en el desarrollo de la NAFLD.

1.2.3.2 Disfunción mitocondrial

En pacientes con NAFLD se han observado diferentes alteraciones de la funcionalidad

mitocondrial como reducción en la actividad de los complejos de la cadena de

transporte de electrones (CTE) (Browning and Horton 2004), fosforilación oxidativa

(OXPHOS) deficiente y un descenso en la concentración de ATP intracelular (Pessayre

2007), estrés oxidativo (Peng et al 2011, Dhibi et al 2011, Narasimhan et al 2010) y

anomalías ultraestructurales (Pessayre 2007, Sanyal et al 2001) y fundamentalmente

daño en el mtDNA (mtDNA) (Carabelli et al 2011, Kawahara et al 2007).

Se puede considerar que las causas de una menor capacidad de producir ATP son dos: 1)

la interrupción o el bloqueo de la cadena respiratoria en cualquier punto, lo que provoca

una reducción en el transporte de electrones en todos los complejos anteriores, que se

verán forzados a donar los electrones a la molécula de oxígeno; y 2) la disipación del

gradiente de protones a ambos lados de la membrana mitocondrial interna que impulsa

a la ATP sintasa. Al igual que otros tipos celulares, los hepatocitos pueden desarrollar

mecanismos adaptativos ante estas situaciones para mantener un flujo de electrones

similar al de un tejido normal. Para ello, principalmente, aumentan el tamaño de las

mitocondrias y de las crestas mitocondriales, lo que conlleva un aumento en la síntesis

de las proteínas de los complejos respiratorios y en la disponibilidad de la coenzima Q


64

(CoQ) (Pessayre 2007). Estas variaciones en el funcionamiento de la cadena de

transporte de electrones se pueden deber tanto a una disfunción mitocondrial como a

mecanismos de disipación de la energía a través de las proteínas desacoplantes (UCPs)

(Pecqueur et al 2001, Gonzalez‐Muniesa et al 2006).

Ilustración 8 Disfunción mitocondrial en la esteatosis y posibles mecanismos de

protección de las defensas antioxidantes. En rojo se muestran los efectos del aumento de

ROS (1) y en azul los que produciría una activación de las defensas antioxidantes (2 y 3). Las

puntas de flecha indican activación y las rayas transversales inhibición. Adaptada de Buqué

et al (2008)

La formación de ROS y el daño de las estructuras mitocondriales tiene un papel central

en la inducción de la disfunción mitocondrial (Ilustración 8). Así, en la mitocondria, las

ROS pueden interactuar tanto con fosfolípidos de la membrana como con proteínas

como el transportador de nucleótidos de adenina (ANT) y con los complejos de la

cadena respiratoria cambiando sus propiedades (Pessayre et al 2001) y

comprometiendo el transporte de electrones y el bombeo de protones al espacio


65

intermembrana (1) (Ilustración 8). La incorporación de protones a la matriz mitocondrial

promovida por los propios ácidos grasos y por el exceso de ROS puede puentear a la ATP

sintasa, decayendo la fuerza impulsora que promueve la síntesis de ATP y, por tanto,

tanto su síntesis y su posterior exportación vía ANT, se ven comprometidas. Un

transporte de electrones defectuoso exacerba la producción de ROS que va a incentivar

la peroxidación lipídica y la disfunción mitocondrial.

Sin embargo, si se consigue la activación de la proteína desacoplante 2 (Ucp2) ésta

puede disipar la sobrecarga de protones transformando la energía acumulada en el

gradiente electroquímico en forma de calor y además comportarse como un mecanismo

de defensa antioxidante (2) (Pecqueur et al 2001, Brand et al 2004, Ricquier 2005). Por

otro lado, la activación de las defensas antioxidantes mitocondriales como mecanismo

compensatorio podría neutralizar las ROS (3) y conseguirse asi una disminución de la

eficiencia energética sin daño de la función mitocondrial.

1.3 ESTRÉS OXIDATIVO

1.3.1 DEFINICIÓN

El estrés oxidativo ha generado recientemente mucho interés, debido

fundamentalmente a su papel principal en la etiología del envejecimiento y de múltiples

patologías con gran impacto en la salud pública como la hipertensión, obesidad y la

diabetes (Andreyev, Kushnareva and Starkov 2005). El término estrés oxidativo no está

claramente definido. En esencia, el estrés oxidativo está causado por un desequilibrio

entre la producción de radicales libres y las defensas antioxidantes del organismo

responsables de la detoxificación de dichos radicales (Vincent et al 2006).

Existen diferentes tipos de especies reactivas: ROS, especies reactivas del cloro (RCN) y

especies reactivas del nitrógeno (ERN). Todas estas especies reactivas contienen

radicales libres y partes no reactivas. Los radicales libres pueden definirse como

moléculas o fragmentos de moléculas que contiene uno o más electrones despareados

en los orbitales atómicos o moleculares (Halliwell 1999). Este electrón desapareado

confiere a los radicales libres una elevada reactividad (Cadenas 1989). Las ROS son


66

moléculas que contienen oxígeno y son altamente reactivas en los tejidos. Dentro de las

ROS se incluyen el anión superóxido (O2*‐), hidroperóxido (H2O2), radical hidorxilo (OH*‐),

óxido nítrico (NO), hipoclorito y el peroxinitrilo (ONOO‐) (Halliwell and Whiteman 2004).

La producción de estas especies reactivas en el organismo es necesaria para un correcto

mantenimiento de las funciones celulares, de hecho, las ROS son utilizadas en la

inducción y el mantenimiento de vías de señalización relacionadas con el crecimiento y

la diferenciación celular. Normalmente las especies reactivas se encuentran en equilibrio

con los sistemas antioxidantes del organismo, sin embargo determinadas patologías

como la enfermedad de Alzheimer (Butterfield 2002), la ateroesclerosis (Chowienczyk et

al 2000), algunos tipos de cáncer (Hagen et al 1994), las enfermedades

neurodegenerativas (Halliwell 2001) o el envejecimiento producen una ruptura de este

equilibrio, produciéndose un exceso en la producción de radicales libres, que por su

elevada reactividad, producen daños celulares a diferentes niveles de las estructuras

celulares (DNA, proteínas y lípidos) (Yu and Chung 2006) (Ilustración 9).

Ilustración 9 Esquema del daño oxidativo producido en las diferentes estructuras

celulares


67

1.3.2 PRODUCCIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO

Como se ha descrito anteriormente las principales especies reactivas en el organismo

son las ROS y las ERN, a continuación se explicaran brevemente los mecanismos de

producción de las mismas:

Especies reactivas de oxígeno: estas especies se producen a partir de una primera

desestabilización de la molécula de oxígeno, considerada birradical y de poca

reactividad. Cuando un electrón reduce la molécula de oxígeno, se produce el O2*‐, esta

especie es altamente reactiva y por tanto la vida media es muy baja, además es la más

dañina para las estructuras celulares. El O2*‐ puede transformase en H2O2 a través de una

reacción de dismutación (Fridovich 1983), o por reacciones enzimáticas de

detoxificación, la reactividad de esta molécula es la menor de todas las ROS si bien su

vida media es la más elevada. Los H2O2 en presencia de metales de transición

reductores, como el cobre o el hierro, son convertidos en OH*‐, altamente reactivo, a

través de reacciones de Fenton o Haber‐Weiss. El OH*‐ posee una elevada reactividad,

siendo muy dañino para el organismo, de hecho es el mayor oxidativo de la naturaleza y

además tiene una vida media muy corta (Pastor et al 2000). El principal sistema

biológico de producción de ROS es la mitocondria, responsable principal de la

producción de O2*‐, principalmente en el complejo I (NADH deshidrogenasa) y el

complejo III (ubiquinona citocromo bc1) de la CTE (Boveris and Cadenas 1975, Orrenius,

Gogvadze and Zhivotovsky 2007, Turrens, Alexandre and Lehninger 1985), aunque

existen otras fuentes como la oxido nítrico sintasa (Alp and Channon 2004, Vasquez‐

Vivar and Kalyanaraman 2000, Vasquez‐Vivar et al 1998), las cicloxigenasas

(Chandrasekharan and Simmons 2004), lipoxigenasas (Wittwer and Hersberger 2007),

citocromo P450 reductasa (Zangar, Davydov and Verma 2004), la xantino oxidasa

(McCord and Fridovich 1968, Pacher, Nivorozhkin and Szabo 2006) y la NADPH oxidasa

localizada en la membrana plasmática de las células polimorfonucleares, macrófagos y

células endoteliales (Babior 2000, Babior, Lambeth and Nauseef 2002, Vignais 2002).

Especies reactivas de nitrógeno: la principal de estas especies es NO que se produce

tras la reacción de un átomo de nitrógeno con uno de oxígeno, resultando una molécula

con un número impar de electrones. El NO desde el punto de vista físico es un radical

libre, pero químicamente no se comporta como tal, ya que no posee ninguna reacción


68

de propagación. Sin embargo, posee una elevada afinidad por el O2*‐ dando lugar a

ONOO‐.

Las principales reacciones de formación se recogen en la siguiente ilustración:

Ilustración 10 Reacciones de formación de radicales libres. En azul se representan las

especies no reactivas; en rojo los ROS y en verde los ERN. Las flechas rojas indican las vías

de formación de especies reactivas.

1.3.3 DEFENSAS ANTIOXIDANTES

La otra parte del equilibrio oxidativo son los antioxidantes. Los antioxidantes han sido

definidos como “compuestos químicos que hallándose presentes en baja concentración

con respecto a las de un substrato oxidable, retardan o previenen la oxidación de dicho

substrato” (Halliwell 1999). Así, los efectos dañinos resultantes de la formación de ROS

son contrarrestados por varios sistemas antioxidantes. Las defensas antioxidantes del

organismo frente a los ROS y los radicales libres han sido extensamente estudiadas y

revisadas en varias publicaciones (Kris‐Etherton et al 2004, Levy et al 2004, Schrauzer

2006, Sharoni et al 2004, Smith et al 2004). Estas defensas engloban tanto sistemas

enzimáticos como no enzimáticos.

En relación a los primeros están formados por complejos enzimáticos (Yu 1994,

Stadtman 2004), que a través de diferentes reacciones transforman las especies


69

reactivas más dañinas en formas menos perjudiciales (Ilustración 11). Las principales

enzimas antioxidantes son la superóxido dismutasa (Sod) en sus dos isoformas: la

dependiente de cobre y zinc localizada en el citosol (Sod1) y la dependiente de

manganeso que se expresa en la mitocondria (Sod2), la catalasa (Cat) y la glutation

peroxidasa (Gpx) (Yu 1994). La Sod transforma el O2*‐ producido principalmente en la

cadena respiratoria, que es altamente reactivo y muy inestable en H2O2, el cual es

menos dañino para la célula (Ilustración 11). Por otro lado la Cat y la Gpx transformaran

este metabolito en agua (Stadtman 2004). Además de estas enzimas existen otras como

la Paraoxonasa‐1 (PON‐1) que es una enzima sérica encargada de combatir la

peroxidación de las LDL (Marchegiani et al 2008).

P450 oxidasa

Citocromob5

FADH2

oxidasa

Xantinoxidasa

Cadena respiratoria

oxidasas

PEROXISOMA

CITOSOL

RE

Canal aniónico

Hipoxia

Ilustración 11 Esquema de las principales defensas antioxidantes celulares. CAT; catalasa,

Cu, Zn‐SOD; cobre zinc superóxido dismutasa, Gpx; glutatión peroxidasa, GSH; glutatión

reducido, GSSG; glutatión oxidado, GR; glutatión reductasa, Sod2; manganeso superóxido

dismutasa, RE; retículo endoplásmico. Adaptada de Cayman Chemical Company

En relación a las sustancias antioxidantes de naturaleza no enzimática, se encuentran

aquellas que por su estructura y reactividad son capaces de neutralizar los radicales


70

libres, formando compuestos químicamente estables. Cuanto más estables y mayor

afinidad por los radicales libres poseen mayor será el poder antioxidante de las mismas

(Spiteller 2003). Así, dentro de las principales sustancias antioxidantes de naturaleza no

enzimática se pueden considerar dos grupos principales. El primero de ellos son las

sustancias de naturaleza endógena, constituido principalmente por los compuestos con

grupos tioles en su composición entre los que destaca el glutatión reducido (GSH) que al

mantener el equilibrio con su forma oxidada (GSSG) mantiene el balance redox celular

(Dickinson et al 2003). En cuanto a las sustancias antioxidantes exógenas se pueden

dividir en tres grandes grupos: las vitaminas antioxidantes (vitamina E, vitamina C y

vitamina A o β‐caroteno), los minerales con capacidad antioxidante (selenio, zinc, cobre

y manganeso) y, por último, diferentes fitoquímicos (el ácido lipoico, el resveratrol, las

catequinas y los compuestos fenólicos) (Rodrigo, Guichard and Charles 2007).

La vitamina E fue una de las primeras sustancias antioxidantes a la que se le atribuyó un

papel en la prevención de la enfermedad cardiovascular (Shekelle et al 2004) y algunos

tipos de cáncer (Pham and Plakogiannis 2005). Debido a su naturaleza lipofílica posee un

importante papel en el mantenimiento de la estabilidad de las membranas celulares así

como en la prevención de la oxidación de las LDL (Upston et al 2001). La vitamina C (VC)

tiene un elevado poder para neutralizar los radicales libres protegiendo a las diferentes

estructuras del daño oxidativo, además posee la capacidad de restaurar el poder

antioxidante de la vitamina E en interacción con el selenio (May 2000). La vitamina A

posee al igual que la vitamina E naturaleza lipofílica y se ha comprobado su papel

protector sobre los daños por estrés oxidativo del DNA y la peroxidación lipídica (Kris‐

Etherton et al 2004).

Respecto a los otros dos grupos los principales minerales considerados antioxidantes

son el manganeso, el zinc y el cobre por su papel como cofactores de las dos isoformas

de la Sod. El zinc además desarrolla un papel protector frente al ataque de los radicales

a compuestos con grupos tioles como el GSH (Hao and Maret 2005). En cuanto al papel

del selenio como antioxidante se centra principalmente en actuar como cofactor de la

Gpx (Faure 2003) y en su actividad como potenciador de la vitamina E (Wintergerst,

Maggini and Hornig 2007).


71

Entre otras sustancias antioxidantes analizadas en recientes estudios cabe destacar el

papel del ácido lipoico (AL) en la reducción de los peróxidos lipídicos, la neutralización

de radicales libres así como su capacidad para regenerar el poder antioxidante de las

vitaminas C y E endogenamente (Moini, Packer and Saris 2002). El resveratrol (RSV)

posee un elevado poder antioxidante actuando sobre diferentes puntos de la CTE (de la

Lastra and Villegas 2007), principalmente como competidor del CoQ, disminuyendo la

producción de ROS, neutralizando el O2*‐ e inhibiendo la peroxidación lipídica (Zini et al

1999). Por último, resaltar el papel de diferentes compuestos fenólicos presentes en

infusiones y extractos naturales cuyo elevado poder antioxidante se ha evidenciado en

diferentes estudios, aunque no se conoce con certeza el mecanismo por el cual lo llevan

a cabo. Algunos ejemplos de estos compuestos son las catequinas presentes en el té

verde (Mandel et al 2005), las antocianinas (Zafra‐Stone et al 2007) y otros compuestos

fenólicos (Soobrattee, Bahorun and Aruoma 2006).

1.4 LA MITOCONDRIA

1.4.1 ESTRUCTURA

Las mitocondrias son los orgánulos responsables de la mayoría de los procesos

metabólicos relacionados con la obtención y transformación de la energía, su tamaño

oscila entre 0,5 y 1 µm de diámetro y hasta 7 µm de longitud y su número varía en

función de las necesidades energéticas de la célula. Estas estructuras se encuentran

rodeadas por un sistema de doble membrana, constituido por una membrana

mitocondrial interna y otra externa separadas por un espacio intermembrana. La

membrana interna se caracteriza por la presencia de una serie de invaginaciones

denominadas crestas (Alberts B. 1989, Smoly, Kuylenstierna and Ernster 1970)

(Ilustración 12), cuya ventaja principal es el aumento de la superficie total de la

membrana interna.


72

Ilustración 12 Esquema de la estructura mitocondrial (A) y micrografía electrónica

coloreada de mitocondrias de células hepáticas (9400 aumentos a 4x5 cm de tamaño)

La matriz y la membrana interna constituyen los principales compartimentos funcionales

de la mitocondria. A continuación explicaremos brevemente todos los compartimentos

mitocondriales:

Membrana externa: está constituida por una bicapa lipídica permeable a todas las

moléculas con un tamaño menor a 5000 daltons (iones, metabolitos y gran número de

polipéptidos), debido al elevado número de porinas que forman canales acuosos dentro

de la membrana externa.

Espacio intermembrana: está compuesto de un líquido similar al hialoplasma y

contiene una alta concentración de protones como resultado del bombeo de los mismos

por los complejos enzimáticos de la cadena respiratoria. En él se localizan diversos

enzimas como la adenilato quinasa o la creatina quinasa.

Membrana interna: también está constituida por una bicapa lipídica que contiene un

elevado contenido en cardiolipina que confiere a la membrana una elevada

impermeabilidad a los iones (Ott, Zhivotovsky and Orrenius 2007), lo que hace que sea

altamente selectiva siendo solamente permeable al O2, H2O y CO2. Por otro lado, posee

numerosas proteínas transportadoras para diferentes metabolitos. Este control de la


73

permeabilidad permite la generación de gradientes iónicos que produce la separación

de las funciones metabólicas entre el citosol y la mitocondria.

Asimismo, en la membrana interna mitocondrial se encuentran una serie de enzimas

como las de la cadena respiratoria que se caracterizan por la cohesión física de sus

distintos componentes y son esenciales para el proceso de fosforilación oxidativa. Por

otro lado, en la superficie interna de la membrana se localizan una serie de esferas

constituidas por la enzima F1‐ATPasa, responsable de la síntesis de ATP, proceso que en

situaciones normales se encuentra acoplado a la cadena respiratoria (Scheffler 2008c).

Matriz mitocondrial: está constituida por una sustancia tipo gel en la que existen

elevadas concentraciones de enzimas disueltas. Principalmente contiene las enzimas

solubles del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, la glutamato deshidrogenasa y las enzimas

de oxidación de ácidos grasos (Ernster 1970).

1.4.2 VÍAS METABÓLICAS EN LA MITOCONDRIA: CICLO DE KREBS Y METABOLISMO DE

ÁCIDOS GRASOS

La fuente principal de energía metabólica en las células animales es la degradación

oxidativa de la glucosa y los ácidos grasos cuyas etapas finales se desarrollan en la matriz

mitocondrial (Ilustración 13):

Ilustración 13 Etapas finales de los procesos catabólicos que se desarrollan en la matriz

mitocondrial. Adaptado de Rogge, M (2009)


74

Como se observa en la ilustración las etapas iniciales del metabolismo oxidativo de la

glucosa se desarrollan en el citoplasma donde la glucosa es convertida en piruvato a

través del proceso de glucólisis. El piruvato es transportado a la matriz mitocondrial

desde el espacio intermembrana mediante transporte activo. Posteriormente se

produce un proceso de decarboxilación oxidativa del piruvato a acetil coenzima A

(AcCoA) por la piruvato deshidrogenasa (PDH). El AcCoA es oxidado completamente a

CO2 a través del ciclo de Krebs (CK). Esta oxidación se encuentra acoplada a la reducción

de NAD+ y FAD a NADH y FADH2, respectivamente, que pasan a la CTE. Dentro del Ciclo

de Krebs existen dos enzimas de especial importancia:

Citrato sintasa (CS): la importancia de esta enzima radica en el papel que ejerce

como uno de los principales controladores de la actividad del CK ya que regula la

condensación de oxalacetato (OAA) con AcCoA proveniente de la glucólisis

siendo este uno de los pasos irreversibles del CK (Remington 1992, Wiegand and

Remington 1986). La actividad CS esta inhibida por altos ratios entre ATP:ADP o

NADH:NAD; además elevadas concentraciones de ATP y de AcCoA actúan como

moduladores alóstericos negativos (Beard, Vinnakota and Wu 2008, Chepelev et

al 2009). Por otro lado, la relación entre la actividad CS en el tejido total y en

extractos mitocondriales se ha utilizado en numerosos estudios como medida

indirecta de la masa mitocondrial de un tejido (Crescenzo et al 2006, Raffaella et

al 2008, Renner et al 2003).

Succinato Deshidrogenasa (SDH) o Complejo II: la SDH cataliza la transformación

de succinato a fumarato empleando el poder reductor generado par la

transformación de FAD a FADH2. La importancia de esta enzima radica en su

doble papel como enzima del Ciclo de Krebs y como complejo de la cadena de

transporte de electrones lo que nos permite analizarla desde ambos puntos de

vista, asimismo es la única enzima que participa en el CK que no se encuentra en

suspensión en la matriz mitocondrial sino que se encuentra anclada a la

membrana interna del orgánulo (Rustin, Munnich and Rotig 2002, Rutter, Winge

and Schiffman 2010). Por otro lado, recientemente se ha descrito que su

actividad se encuentra regulada por procesos de acetilación siendo una diana

específica de la Sirt3 (Cimen et al 2010, Finley et al 2011).


75

Por otro lado, los ácidos grasos son transformados en derivados acil CoA que son

transportados al interior de la matriz a través de la Cpt1. En la matriz sufren diferentes

ciclos de ß‐Oxidación hasta AcCoA, produciéndose en dichos ciclos moléculas de FADH2.

Así como en el caso del metabolismo oxidativo mitocondrial de la glucosa en el proceso

de transporte y ß‐Oxidación de los ácidos grasos nos gustaría recalcar la importancia de

dos enzimas implicadas en ellos:

Carnitina palmitoiltransferasa 1: el sistema enzimático carnitina

palmitoiltransferasa cataliza la activación necesaria de los acidos grasos de

cadena larga, como el ác. Palmítico, para ser transportados a la matriz

mitocondrial y allí entrar en la ß‐Oxidación, este transporte es necesario ya que

la membrana mitocondrial interna es impermeable a estos ácidos grasos

(Ramsay, Gandour and van der Leij 2001). La Cpt1 es la primera enzima

componente de este proceso y su actividad limita el funcionamiento de este

sistema y la ß‐Oxidación (Jogl and Tong 2003, Bonnefont et al 2004).

Acil‐Coenzima A deshidrogenasa, cadena larga (Acadl): esta enzima interviene

en la primera de las reacciones de la ß‐Oxidación. Se encuentra en la matriz

mitocondrial y su actividad se considera como otro de los pasos limitantes de la

oxidación de ácidos grasos (Houten and Wanders 2010, Lea et al 2000). En

cuanto a su regulación, Hirschey et al (2010) describieron que su actividad era

regulada por reacciones de desacetilación mediadas por la Sirt3 y que el control

de esta enzima regulaba la actividad de la ß‐Oxidación (Hirschey et al 2010).

Por tanto, el intermediario central del metabolismo oxidativo tanto de los azúcares

como de los ácidos grasos en las mitocondrias es el AcCoA.

Por último, la degradación de aminoácidos se desarrolla principalmente en el citosol,

aunque determinados aminoácidos pueden ser transportados a la matriz mitocondrial

por diversos transportadores activos específicos, donde son transformados en cuerpos

cetónicos por acción de diferentes transaminasas (Rogge 2009, Scheffler 2008b,

Williamson and Cooper 1980).


76

1.4.3 CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES

La misión de la cadena transportadora de electrones es aprovechar la energía

desprendida por la transferencia de electrones desde el NADH al O2 para crear un

gradiente electroquímico que se utilice en la síntesis de ATP (Kadenbach et al 2010,

Mitchell 1961). Para ello es necesario que la transferencia electrónica se realice de

forma gradual mediante el paso de los electrones entre los diferentes transportadores

que son capaces de experimentar cambios reversibles en su estado redox (Dimauro and

Rustin 2009). Estos transportadores están organizados en cuatro complejos anclados en

la membrana interna mitocondrial con un ordenamiento secuencial que facilita la

transferencia de electrones y promueve una alta eficiencia del sistema. Un quinto

complejo de proteínas sirve para acoplar las reacciones de transporte de electrones a la

síntesis de ATP (Kerr 2010, Rich and Marechal 2010).

Ilustración 14 Esquema de la cadena de transporte de electrones y balance de protones


77

1.4.3.1 Complejo I (NADH deshidrogenasa)

Es el complejo proteico más grande de la membrana mitocondrial interna, consta de 43

subunidades, siete de ellas codificadas por el propio genóma mitocondrial. Contiene

como grupo prostético una molécula de flavina mononucleótido y siete agrupamientos

hierro‐azufre (Fe‐S) (Valsecchi et al 2010). En él se inicia la trasferencia electrónica de la

cadena respiratoria mediante la oxidación del NADH, que transfiere sus electrones a la

flavina mononucleótido y ésta, a su vez, a los agrupamientos Fe‐S que acaban

donándolos al CoQ, que actúa como aceptor final (Brandt 2006, Koopman et al 2010).

Este complejo genera aproximadamente el 40% del gradiente electroquímico de la

oxidación del NADH a través del bombeo de protones al espacio intermembrana (Lenaz

et al 2006, Vinogradov 2008).

1.4.3.2 Complejo II

Este complejo contiene a la enzima SDH junto con otras tres subunidades de bajo peso

molecular. Químicamente está compuesto por una molécula de flavin adenin

mononucleótido (FAD) unida covalentemente, ocho átomos de hierro, ocho de azufre

lábiles a los ácidos y un citocromo b460. Esta estructura le permite participar en el ciclo

de los ácidos tricarboxílicos y en la cadena respiratoria (Rustin, Munnich and Rotig 2002,

Rutter, Winge and Schiffman 2010). La molécula de FAD es el aceptor de electrones de la

reacción reduciéndose a FADH2 debido a la oxidación del Succinato ya que esta reacción

de oxidación no produce suficiente poder reductor para reducir el NAD+ a NADH. El

FADH2, al estar unido covalentemente a la enzima, debe oxidarse in situ cediendo sus

dos hidrógenos al CoQ, que se reduce a ubiquinol (QH2), que es móvil y difunde por la

bicapa hasta el complejo III (Yankovskaya et al 2003).

1.4.3.3 Complejo III (Citocromo C oxidoreductasa)

El complejo III está formado por cuatro cofactores redox; un citocoromo b situado en el

espacio transmembrana y orientado hacia el espacio intermembrana, un citocromo c

(Cit c) y un agrupamiento de dos átomos de hierro y dos de azufre. Los citocromos son

proteínas encargadas de la transferencia de electrones mediante un átomo de Fe2+

situado en un grupo prostético hemo (Scheffler 2008c). El complejo III obtiene dos

electrones desde QH2 y los transfiere al Cit c, al mismo tiempo, transloca dos protones a


78

través de la membrana contribuyendo a la generación del gradiente electroquímico (Gao

et al 2003). Este complejo junto con el Complejo I es la fuente más importante de

producción de ROS (Malinska et al 2010, Viola and Hool 2010, Zhang, Zhang and Zhang

2011) y por otro lado se ha descrito su papel como un sensor de los niveles de oxígeno

intracelulares (Chandel 2010).

1.4.3.4 Complejo IV (Citocromo c oxidasa)

Es la enzima terminal de la cadena de transporte de electrones. Está formada por

aproximadamente 14 cadenas polipeptídicas, todas ellas codificadas por el mtDNA

(Mick, Fox and Rehling 2011), de las cuales la subunidad I y la II son necesarias para la

transferencia de electrones y se encuentran situadas en la membrana interna

mitocondrial en forma de dímero formando múltiples hélices que la atraviesan. Estas

dos subunidades contienen cuatro centros redox activos, dos hemo de tipo a y dos

centros cobre, el resto de las cadenas polipeptídicas parecen tener un papel regulador

sobre ambas subunidades (Brzezinski, Reimann and Adelroth 2008, Tsukihara et al

1995). Este complejo es el encargado de catalizar las oxidaciones de un electrón de las

cuatro moléculas de Cit c reducido y la reducción simultanea de cuatro electrones de

una molécula de O2 para producir H2O. Al mismo tiempo se produce una traslocación de

cuatro protones al espacio intermembrana (Yoshikawa, Muramoto and Shinzawa‐Itoh

2011a, Yoshikawa, Muramoto and Shinzawa‐Itoh 2011b) y la participación en la

formación de ROS (Yu et al 2011, Kadenbach, Ramzan and Vogt 2009).

1.4.3.5 Complejo V (ATP sintasa)

Es el quinto complejo que interviene en la fosforilación oxidativa y se halla acoplado a la

cadena de transporte electrónico, si bien, no forma parte de ella. Está constituida por

dos componentes estructuralmente diferentes, F0 y F1, que se encuentran unidos a

través de un tallo (Abrahams et al 1994, Rubinstein, Walker and Henderson 2003). El

componente F0 atraviesa la membrana interna constituyendo un canal para el paso de

los protones desde el espacio intermembrana a la matriz, este retorno es

energéticamente favorable y se encuentra acoplado a la síntesis de ATP (Dickson et al

2006, Silvester et al 2006, Walker and Dickson 2006). La porción F1 es la que cataliza la

síntesis de ATP a partir de ADP e iones fosfato (Seelert and Dencher 2011, Wittig and

Schagger 2009). Diferentes estudios han establecido que la síntesis del ATP requiere de


79

un acoplamiento mecánico entre ambas subunidades y un mecanismo de rotación

específico (Maguire, Shah and McCabe 2006, Nakamoto, Baylis Scanlon and Al‐Shawi

2008). Por otro lado, la ATP sintasa puede actuar en sentido reverso, es decir hidrolizar

el ATP a ADP y fosfato en ausencia del gradiente electroquímico de protones (Feniouk,

Suzuki and Yoshida 2007, Lotscher, deJong and Capaldi 1984).

1.4.4 LA FOSFORILACIÓN OXIDATIVA

La fosforilación oxidativa está constituida por dos procesos principalmente:

La transferencia de electrones desde NADH y FADH2 hasta el oxígeno molecular,

que se da a través de la cadena de transporte de electrones.

El acoplamiento de este proceso con la síntesis de ATP.

El mecanismo de acoplamiento de ambos procesos es también denominado

acoplamiento quimiostático y se basa en la hipótesis propuesta por Peter Mitchell en

1961 (Mitchell 1961), en la que sugirió que el ATP se genera utilizando la energía

almacenada en forma de un gradiente de protones a través de las membranas

biológicas.

Como se ha descrito anteriormente, el transporte de electrones a través de los

complejos de la CTE esta acoplado a una translocación de protones al espacio

intermembrana, estableciéndose a si un gradiente de protones a través de la membrana

interna (Nath 2010b, Nath 2010a). Este bombeo produce un aumento en la

concentración de los mismos en el espacio intermembrana, que se traduce en un

aumento de una unidad de pH en la matriz mitocondrial (pH=8), esta diferencia de pH

genera un potencial eléctrico a través de la membrana (Dimroth, Kaim and Matthey

2000, Huttemann et al 2008). Ambos fenómenos, el gradiente de protones y el potencial

eléctrico, dirigen el flujo de protones desde el espacio intermembrana a la matriz.

Debido a que la bicapalipídica es altamente impermeable a los iones por su elevado

contenido en cardiolipina, los protones solo pueden atravesar la membrana por un canal

de proteínas (Klingenberg 2009, Schlame and Ren 2009), permitiendo esta restricción el

aprovechamiento de la energía del gradiente electroquímico para la formación de ATP

por la ATP sintasa.


80

Ilustración 15 Esquema del flujo de protones en la fosforilación oxidativa

Por otro lado, las reacción de oxidación y de formación de ATP en la mitocondria

depende de la presencia de ADP y de fosforo inorgánico. En condiciones fisiológicas la

membrana mitocondrial tiene una elevada concentración de fósforo inorgánico siendo

la concentración de ADP la reguladora de la velocidad de los procesos respiratorios

mitocondriales (D'Alessandro and Melandri 2010, Jeneson et al 2009). La medida del

consumo de oxígeno por diferentes métodos, como la polarografía de oxígeno

(Gadhinglajkar, Sreedhar and Unnikrishnan 2009), permite determinar la existencia de

diferentes estados respiratorios. Así, el estado metabólico caracterizado por la presencia

de substratos oxidables, como el succinato, pero en ausencia de ADP es el denominado

estado 2 y se caracteriza por un consumo lento de oxígeno. La adición de ADP determina

un aumento en la velocidad de consumo de oxígeno hasta diez veces mayor, este estado

respiratorio es el estado 3 y corresponde a la fase de formación de ATP, y se mantiene

hasta que se produce un agotamiento del substrato estableciéndose el estado 4, que se

caracteriza por un bajo consumo de oxígeno (Chance and Williams 1955, Estabrook

1967, Gnaiger 2009, Lemieux et al 2011) (Ilustración 16).


81

Ilustración 16 Consumo de oxígeno en los diferentes estados respiratorios (gráfica

obtenida en un oxígrafo). Adaptada de Curti et al (1999)

La relación entre el consumo de oxígeno en los estados 3 y 4 (estado 3/estado 4) se

denomina ratio de control respiratorio (RCR) y se considera una medida indirecta del

acoplamiento entre los procesos de oxidación y fosforilación, así como de la integridad

mitocondrial (Voet 2006, Roussel et al 2004). Otra relación que se utiliza

frecuentemente para evaluar estos parámetros y también la eficiencia de la fosforilación

oxidativa es el ratio P/O, que corresponde a los nanomoles de oxígeno que necesita

consumir la CTE para fosforilar un nanomol de ADP (Hinkle 2005, Ferguson 2010).


82

1.4.5 BIOGÉNESIS MITOCONDRIAL

La expresión “biogénesis mitocondrial” se refiere a una serie de procesos celulares

involucrados en la formación de nuevas mitocondrias. El proceso de síntesis se

caracteriza por una serie de rápidos acontecimientos altamente coordinados entre

núcleo, el citoplasma y la mitocondria. En el fenómeno de biogénesis mitocondrial

confluyen dos procesos íntimamente ligados; la proliferación, que consiste en el

aumento del número de mitocondrias por célula; y la diferenciación, mediante la cual el

orgánulo adquiere las características estructurales y funcionales adecuadas para el

desarrollo de las funciones específicas de las distintas células del organismo (Nisoli et al

2004).

1.4.5.1 El genóma mitocondrial

La estructura, el contenido genético y la organización del genóma mitocondrial están

muy conservados en las distintas especies de mamíferos (Anderson et al 1981, Clay

Montier, Deng and Bai 2009, St John et al 2010). El mtDNA es un DNA circular de doble

cadena, de aproximadamente 16500 pares de bases y es poliploide (Hunter et al 2010,

Miller et al 2003), en concreto cada mitocondria puede contener un número variable de

copias que oscila entre 2 y 10.

Cada una de las hebras del mtDNA tiene una composición distinta de nucleótidos

guanina y timina, y son denominadas hebra pesada y hebra ligera. El mtDNA de

mamíferos codifica para 37 genes: 2 RNA ribosómicos (rRNAs), 22 RNA de transferencia

(tRNAs) y 13 polipéptidos integrantes de los complejos multienzimáticos del sistema

OXPHOS; siete (ND1, 2, 3, 4L, 4, 5 y 6) de los 46 polipéptidos del complejo I; uno (cytb)

de los 11 polipéptidos del complejo III; tres (citocromo c oxidasa I, II y III (COXI, II, III)) de

los 13 del complejo IV; y dos (ATP6 y 8) de los 16 de la ATP sintasa. Estos genes se

encuentran distribuidos de forma asimétrica entre las dos hebras, así la hebra pesada

contiene la mayoría de ellos salvo ocho tRNA y los mRNA (Legros et al 2004, Lanave et al

2002, Anderson et al 1981).


83

Ilustración 17 Mapa del genóma mitocondrial en vertebrados

1.4.5.2 Biogénesis mitocondrial: cooperación del genóma mitocondrial y nuclear

La transcripción del genóma mitocondrial está sometida a una fina regulación y su

expresión está coordinada con la de proteínas mitocondriales codificadas en el núcleo

(Hock and Kralli 2009, Ljubicic et al 2010, Scarpulla 2008b, Scarpulla 2011). Por esto la

biogénesis mitocondrial se regula coordinadamente por una serie de factores de

transcripción, codificados por genes nucleares. Estos factores de transcripción se

pueden dividir en tres grupos:

La primera clase incluye factores codificados por el núcleo que dirigen la expresión de

genes respiratorios nucleares. Entre ellos encontramos el factor respiratorio nuclear 1

(Nrf1), y el receptor relacionado con los estrógenos α (ERRα).

La segunda clase está compuesta por coactivadores, que forman complejos con los

factores de transcripción y facilitan la remodelación de la cromatina. En este grupo los

más importantes son los de la familia de los coactivadores de los Ppar: el coactivador 1 α


84

activado por proliferadores peroxisomales γ (Pgc1α) y el coactivador 1 β activado por

proliferadores peroxisomales (Pgc1β).

La tercera clase incluye diversos factores de transcripción de codificación nuclear que

promueven la expresión de genes mitocondriales. Estos incluyen el factor de

transcripción‐A mitocondrial (Tfam), el factor de transcripción mitocondrial B1 (Tfb1m) y

el factor de transcripción mitocondrial B1 (Tfb2m), la proteína de unión a DNA de hebra

única, y un factor de terminación de la transcripción. Todos los anteriores tienen la

capacidad de regular la actividad de la RNA gamma‐polimerasa.

1.4.5.3 Transcripción del mtDNA

El genóma mitocondrial, a diferencia del nuclear, se transcribe de forma completa a

partir de los promotores de transcripción de la cadena pesada y ligera, generando en el

proceso dos mRNA, uno por cada hebra (Scheffler 2008a). La iniciación de la

transcripción requiere la actividad de, al menos, una RNA polimerasa específica de

orgánulo (Ringel et al 2011), el Tfam (Fisher et al 1991, Clayton 1991, Clayton 1992) y el

Tfb1m y Tfb2m (Falkenberg et al 2002, Gleyzer, Vercauteren and Scarpulla 2005).

El Tfam forma parte de la familia de proteínas de alta movilidad y posee la capacidad de

unirse al mtDNA, de discriminar entre secuencias específicas y no específicas y de

modificar su estructura tridimensional, facilitando de esta forma la unión de la RNA

polimerasa al punto de iniciación de la transcripción (Shadel and Clayton 1997, Parisi

and Clayton 1991, Fisher et al 1991). El Tfam es capaz de iniciar la transcripción tanto in

vivo como in vitro (Falkenberg, Larsson and Gustafsson 2007) y muestra una afinidad

muy distinta por los promotores de transcripción del mtDNA situados en el D‐loop. Sin

embargo, aún existe cierta controversia acerca del papel del Tfam en la fisiología

mitocondrial y celular; ya que además de su potencial participación en la regulación de

la transcripción, también ha sido relacionado con el mantenimiento de la estructura, el

grado de empaquetamiento y el control del número de copias de mtDNA en la

mitocondria(Kanki et al 2004a, Kanki et al 2004b, Zhang et al 2011a), además de una

posible conexión con los procesos de apoptosis(Yoshida et al 2003).


85

1.4.5.4 Regulación de la biogénesis a nivel nuclear

Diferentes mecanismos de señalización promueven la activación de los factores de

transcripción involucrados en la biogénesis mitocondrial, convergiendo la mayoría de

ellos en la regulación del promotor de Pgc1α o de Pgc1α (Fernandez‐Marcos and

Auwerx 2011, Hock and Kralli 2009, Scarpulla 2011). Las principales vías son

dependiente de la ruta de las quinasas activadas por mitógenos (MAPK) (Puigserver et al

2001, Tedesco et al 2010), de ciclinas (Wang et al 2006, Sakamaki et al 2006), de las

quinasas activadas por AMP (AMPK) (Jager et al 2007, Rohas et al 2007) o la activación

de Crebp, entre otras. De especial importancia para esta tesis es la regulación de la

biogénesis mitocondrial por estrés oxidativo (Costa et al 2011), así como por las sirtuinas

1 y 3 como describiremos más adelante (Aquilano et al 2010, Kong et al 2010).

Ilustración 18 Señales de regulación de la biogénesis mitocondrial que confluyen en el

promotor de Pgc1α o en Pgc1α. La parte superior de la figura muestra los sitios de

regulación del promotor y sitios de unión al DNA. La parte inferior de la figura muestra la

regulación y activación de Pgc1α. En flechas negras se muestran las señales de activación y

en barras rojas las señales de inhibición. Adaptado de Hock et al (2009)


86

Los factores de respiración nucleares 1 y 2 (Nrf1 y Nrf2) son unos de los factores de

transcripción implicados en la regulación de la función respiratoria y de la biogénesis

mitocondrial (Scarpulla 2008a, Vercauteren, Gleyzer and Scarpulla 2008). En particular

Nrf1 fue el primer factor nuclear en describirse como regulador positivo de la

transcipción de genes que codifican para Cit c (Herzig, Andersson and Scarpulla 2000) y

Cit c oxidasa (COX) (Ongwijitwat and Wong‐Riley 2004, Wong‐Riley et al 2005). A su vez

tiene un papel en la síntesis de ATP mediante la regulación de la expresión de la

subunidad α y γ de la ATP sintasa (Shao et al 2010, Chau, Evans and Scarpulla 1992).

Además, diversos estudios de inmunoprecipitación de cromatina in vivo demuestran que

el Nrf1 actúa sobre el control de la maquinaria de transcripción y el mantenimiento del

mtDNA mediante la regulación de Tfam (Liu et al 2007, Taherzadeh‐Fard et al 2011,

Piantadosi and Suliman 2006) y de Tfb1m y Tfb2m (Gleyzer, Vercauteren and Scarpulla

2005, Vercauteren, Gleyzer and Scarpulla 2008).

En cuanto a la regulación de este factor, se ha descrito que a nivel transcripcional la

restricción calórica (Civitarese et al 2007, Civitarese, Smith and Ravussin 2007,

Spiegelman 2007) y el ejercicio físico (Vina et al 2009, Daussin et al 2011) aumentan su

expresión. Por otro lado, el Nrf1 está rápida y eficazmente regulado por translocación

nuclear y modificación post‐transduccional principalmente por el déficit energético

(Bergeron et al 2001, Nisoli et al 2005) y el estrés oxidativo (Angeloni et al 2011, Biswas

and Chan 2010) mediante la activación de las MAPK.

1.4.5.5 Co‐activadores de la biogénesis mitocondrial: Pgc1α y Pgc1β

El Pgc1α fue el primer miembro en descubrirse de una familia de co‐activadores

transcripcionales que tienen una importante función integradora en la regulación de la

biogénesis mitocondrial en variadas situaciones fisiológicas. Así, la expresión de Pgc1α

es muy elevada en tejidos con sistemas mitocondriales muy desarrollados (Puigserver

2005). Por otro lado, su expresión se induce en situaciones fisiológicas que aumentan la

demanda mitocondrial para producir energía en forma de ATP o calor, como son la

exposición al frío en el TAM (TAM) (Hao et al 2010), el ejercicio físico en el músculo

(Calvo et al 2008, Lin et al 2002) o el ayuno en el hígado (Cao et al 2004, Herzig et al

2001).


87

A nivel molecular, el Pgc1α modula la biogénesis mitocondrial a través de su interacción

con diferentes factores de transcripción. En particular, tiene la capacidad de co‐activar la

actividad transcripcional de Nrf1, e inducir a su vez la expresión del Nrf1, del Nrf2 y del

Tfam (Fernandez‐Marcos and Auwerx 2011). Además, puede interaccionar con

miembros de la superfamilia de receptores nucleares, como el Pparγ (Vercauteren,

Gleyzer and Scarpulla 2008), el receptor de glucocorticoides (Knutti, Kaul and Kralli

2000) y el receptor de estrógenos (Dufour et al 2007, Mootha et al 2004, Schreiber et al

2004). A nivel post‐transcripcional, Pgc1α se encuentra regulado por situaciones de

estrés energético que activan tanto la vía de la AMPK como la Sirt1 (Canto and Auwerx

2009, Canto et al 2009, Iwabu et al 2010, Rodgers et al 2008).

Ilustración 19 Red de regulación de la función mitocondrial dirigida por Pgc1α. Adaptado

de Scarpulla et al (Scarpulla 2011)


88

El Pgc1β es otro de los principales co‐activadores de la biogénesis mitocondrial

perteneciente a la familia de Pgc1α. Entre ambos co‐activadores existen importantes

similitudes en la secuencia de ácidos nucleicos y a nivel de proteína, tanto en el dominio

de activación amino‐terminal como en el carboxi‐terminal (Lin et al 2002, Monsalve et al

2000). Ambos co‐activadores se expresan abundantemente en tejidos con un elevado

contenido en mitocondrias como el corazón, músculo, TAM o hígado, sin embargo Pgc1β

no se induce en el TAM como respuesta termogénica (Kressler et al 2002, Meirhaeghe et

al 2003).

Aunque inicialmente se pensó que estaba implicado en la gluconeogénesis hepática (Lin

et al 2002), el Pgc1β tiene escasa capacidad de estimular la expresión de genes

gluconeogénicos en hepatocitos y en hígado (Lelliott et al 2007, Lin et al 2003,

Meirhaeghe et al 2003). Algunos autores han sugerido que estas diferencias se deben a

la falta de interacción con el factor nuclear hepatocitario 4 α (HNF‐4) y con el factor de

transcripción forkhead 1 (Foxo1) por parte de Pgc1β (Meirhaeghe et al 2003, Scarpulla

2011), responsables de la expresión de genes gluconeogénicos. Sin embargo, Pgc1β

actúa como potente coactivador de Nrf1 promoviendo la transcripción de genes

mitocondriales implicados en la regulación de la biogénesis mitocondrial (Scarpulla

2008a, Shao et al 2010, Gao et al 2011a, Gao et al 2011b).

A pesar de las similitudes funcionales entre ambos coactivadores, Pgc1β promueve un

mayor acoplamiento en la respiración mitocondrial que puede estar relacionado con

cambios en la eficiencia energética (Handschin and Spiegelman 2006, St‐Pierre et al

2003). Por otro lado, algunos estudios han descrito la capacidad de Pgc1β para

aumentar la oxidación de ácidos grasos a nivel hepático (Staiger et al 2006, Wolfrum and

Stoffel 2006). En cuanto a la regulación post‐transcripcional de Pgc1β existen pocos

datos pero algunos autores sugieren que debido a las similitudes con Pgc1α pueda ser

regulado por procesos de desacetilación mediados por sirtuinas (Kelly et al 2009).


89

1.4.6 LA MITOCONDRIA COMO FUENTE, DIANA Y PROTECCIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO

La mitocondria es la principal fuente de estrés oxidativo del organismo, ya que se estima

que es responsable de la producción del 80% de ROS del organismo (Andreyev,

Kushnareva and Starkov 2005). De hecho, se ha sugerido que el oxígeno utilizado para la

producción de ROS en la mitocondria corresponde a 1‐2% del total que está involucrado

en la respiración celular, aunque depende del estado metabólico mitocondrial y del

tejido (Alvarez 2000, Barja 2007).

El papel de la mitocondria como fuente de ROS fue descrito por primera vez en 1966 por

Jensen et al (Jensen 1966), que formularon la hipótesis de que la cadena de transporte

de electrones produjera H2O2. Posteriormente, Boveris et al describieron las

propiedades de esta producción en mitocondrias aisladas de hígado de rata (Boveris,

Oshino and Chance 1972). En relación a la producción de O2*‐ en la mitocondria se

describió con posterioridad por Loschen et al (1974) (Loschen et al 1974) que estableció

que el O2*‐ era un precursor del H2O2 (Boveris and Cadenas 1975).

Las fuentes principales de ROS mitocondriales son los complejos I, II y III (Brand 2010,

Kowaltowski et al 2009, Murphy 2009), algunas enzimas del ciclo del ácido cítrico como

la α‐cetoglutarato deshidrogenasa (Orrenius, Gogvadze and Zhivotovsky 2007), la

priuvato deshidrogenasa (Miwa and Brand 2005), la dihidrolipoamida deshidrogenasa

(Murphy 2009), las monoaminoxidasa s(Bortolato, Chen and Shih 2008) y la citocromo

b5 reductasa (Lin and Beal 2006). Si bien, las que contribuyen en mayor medida al

desarrolló de estrés oxidativo son el complejo I y III (Ilustración 20) (Murphy 2009). Así,

la producción de O2*‐ en el complejo I se produce principalmente por la reacción del O2

con el grupo prostético FMN completamente reducido (Kussmaul and Hirst 2006), otro

mecanismo de producción de O2*‐ en este complejo es durante el transporte inverso de

electrones en la cadena respiratoria (Liu, Fiskum and Schubert 2002). En relación a la

formación de O2*‐ en el complejo III, esta se produce principalmente por la reacción del

O2 con la semiubiquinona en el llamado ciclo Q (Liu, Fiskum and Schubert 2002, Adam‐

Vizi 2005, Brand 2010, Selivanov et al 2011).


90

Ilustración 20 Producción de O2*‐ en la cadena de transporte de electrones. Tomada de

Browlee et al (2001)

La mitocondria no sólo es fuente de ROS sino que también desarrolla un importante

papel en la defensa frente al estrés oxidativo. Para ello consta con importantes defensas

antioxidantes (Ilustración 21) de naturaleza enzimática y no enzimática. Las defensas no

enzimáticas están constituidas por una serie de quelantes tanto de naturaleza hidrofílica

como lipofílica, entre los que destacas el Cit c, el α‐tocoferol, la VC, el CoQ reducido y el

glutatión (Addabbo, Montagnani and Goligorsky 2009). En cuanto a las defensas

enzimáticas, están formadas principalmente por la Sod2 que cataliza la transformación

del O2*‐ a H2O2 (Macmillan‐Crow and Crow 2011) y la Gpx mitocondrial (mtGpx)

principalmente en su isoforma dependiente de selenio, que cataliza la detoxificación del

H2O2 a H2O. Otra de las enzimas antioxidantes que puede contribuir a las defensas

antioxidantes mitocondriales es la catalasa, que fundamentalmente se expresa en el

compartimento mitocondrial del músculo cardíaco (Bai and Cederbaum 2001, Neubert

and Lehninger 1962, Radi et al 1991), aunque recientemente un estudio ha observado

actividad catalasa en extractos mitocondriales de hígado de rata en situaciones de

aumento del estrés oxidativo hepático (Salvi et al 2007). Otra enzima que contribuye de

forma indirecta en las defensas antioxidantes mitocondriales es la glutatión reductasa


91

(GR), que participa en la regeneración del glutatión reducido y la thioredoxin reductasa

(TRX) dependiente de NADH.

Ilustración 21 Principales defensas antioxidantes mitocondriales y vías de formación

de especies reactivas desde O2*‐. CAT; catalasa, Gpx ; glutatión peroxidasa, GSH;

glutatión reducido, GSSG; glutatión oxidado, GR; glutatión reductasa, MnSOD;

manganeso superóxido dismutasa Tomada de Valdecantos et al (2009)

Por otro lado, la mitocondria también es diana del estrés oxidativo debido a la reacción

de las ROS con las estructuras mitocondriales (Smith and Murphy 2011, Someya and

Prolla 2010, Vendelbo and Nair 2011). Así, el O2*‐ puede reaccionar con el mtDNA

causando mutaciones que lleven a defectos en la síntesis de las proteínas de los

complejos de la CTE lo cual puede originar una disfunción en su funcionamiento que a su

vez contribuye a una mayor producción de ROS (Ma et al 2009, Wei et al 2009). Por otro

lado, estas ROS también pueden producir una oxidación de los fosfolípidos de la


92

membrana interna produciéndose un aumento de la permeabilidad y del poro de

transición mitocondrial. Especialmente dañina es la reacción con la cardiolipina, ya que

induce la reducción de la afinidad de la misma con el Cit C produciéndose su liberación al

citosol lo cual desencadena la apoptosis por dependiente de la vía mitocondrial

(Klingenberg 2009, Ott, Zhivotovsky and Orrenius 2007) (Ilustración 22).

Ilustración 22 Esquema del daño oxidativo en la mitocondria. Cyt c; citocromo c, PTM;

poro de transición mitocondrial. Adaptada de Murphy (2009)

1.4.7 LAS SIRTUINAS COMO REGULADORES DE LA FUNCIÓN MITOCONDRIAL

1.4.7.1 Definición y clasificación de las sirtuinas

El Silent Information Regulator 2 (Sir2) de S. cerevisiae (Kaeberlein, McVey and Guarente

1999, Sinclair and Guarente 1997) fue el primer miembro de la familia de las

deacetilasas dependientes de NAD+ y ADP‐ribosiltransferasas, que se han denominado

sirtuinas (SIRTs)(Frye 1999). En mamíferos se han descrito siete proteínas

pertenecientes a la familia de las SIRTs (Ilustración 23). Las Sirt1 y 6 se localizan

fundamentalmente en el núcleo(Michan and Sinclair 2007, Herranz and Serrano 2010);

la Sirt7 en el nucléolo (Ford et al 2006); la Sirt2 en el citoplasma (North and Sinclair


93

2007) y las Sirt4 y 5 en la mitocondria(Verdin et al 2010, Huang et al 2010), finalmente la

Sirt3 se expresa principalmente en la mitocondria aunque dependiendo de diferentes

situaciones fisiológicas, como bajo condiciones de estrés energético, puede cambiar su

localización al núcleo o al citoplasma(Cooper et al 2009, Hallows, Albaugh and Denu

2008).

Ilustración 23 Localización celular de las diferentes sirtuinas. Adaptado de Alhazzazi et

al (2011)

Las SIRTs requieren como co‐factor metabólico NAD+ para ejercer su actividad

enzimática. Su domino catalítico, altamente conservado, puede ejercer dos tipos de

reacciones enzimáticas: la desacetilación y la ribosilación de ADP. Durante la reacción de

desacetilación, el NAD+ se hidroliza para generar nicotinamida (NAM), 2´‐O‐acetil‐ADP‐

ribosa (O‐AADPR) y una diana desacetilada (1) (Borra et al 2004). Hay dos mecanismos

de retroalimentación que regulan la actividad catalítica de las SIRTs. En primer lugar, la

NAM es un inhibidor de la enzima, ya que compite directamente con NAD+ por la unión

al dominio catalítico (2) (Zhang et al 2009, Sauve 2009). En segundo lugar, los niveles de

NAD+ controlan la actividad de las SIRTs (Sauve 2009). Los niveles de NAD+ y NADH están

regulados por varias enzimas y sus niveles están ligados a la concentración de nutrientes

suministrados por la dieta y al estado metabólico de la célula (Yang and Sauve 2006). La

enzima nicotinamida fosforibosiltransferasa (Nampt) utiliza la nicotinamida para


94

regenerar NAD+ y así promover la actividad de las SIRTs (3) (Yang and Sauve 2006). En

cambio, la poli‐ADP‐ribosa polimerasa (Parp), una proteína nuclear implicada en la

reparación del DNA, cataliza la reacción contraria; utiliza NAD+ para generar

nicotinamida y ADP‐ribosa (4) (Ilustración 24) (Jarrett and Boulton 2007, Orsucci,

Mancuso and Siciliano 2008).

PARP(4)

PNC 1 (levaduras)

Nampt(mamiferos)

Prot. Acetilada

Prot. Acetilada

Prot. Decetilada

Limitación de nutrientes

Estrés

Ilustración 24 Actividades enzimáticas de las SIRTs. Adaptado de Haigis et al (2010)

1.4.7.2 Sirtuina 1

La Sirt1 es una proteína predominantemente nuclear perteneciente a la familia de las

desacetilasas de histonas III (HDACs), está compuesta por 747 aminoácidos y un peso

molecular de aproximadamente 80KDa. La Sirt1 cataliza la reacción de desacetilación

sobre una gran variedad de substratos histonas así como de proteínas no histónicas

(Schug and Li 2011).

En relación a su actividad fisiológica, la Sirt1 estimula la biogénesis mitocondrial en

muchos tejidos como el músculo esquelético (Suwa et al 2011, D'Antona et al 2010), el


95

TAM (Feige et al 2008, Lagouge et al 2006) o en el hígado (Buler et al 2011), entre otros.

Múltiples estudios han descrito que la Sirt1 deacetila al co‐activador Pgc1α aumentando

su actividad transcripcional (Aquilano et al 2010, Brookins Danz et al 2009, Buler et al

2011, Danz et al 2009, Gerhart‐Hines et al 2007) y cambiando los sitios de acetilación a

arginina, lo cual mimetiza un mayor estado basal de desacetilación (Rodgers et al 2005).

La estimulación de Pgc1α induce una cascada de señalización que desemboca en un

aumento de la expresión de los genes implicados en la cadena de transporte de

electrones así como en un aumento de la respiración mitocondrial y de los niveles de

ATP. De hecho, recientemente Aquilano et al (2010) han descrito la presencia de Sirt1 y

Pgc1α asociado a los nucleoides mitocondriales en purificados de mitocondrias

formando un complejo con Tfam en hígado, cerebro y músculo esquelético además de

en líneas celulares, reafirmando la teoría de que la Sirt1 y el Pgc1α son el principal nexo

de unión entre el genóma nuclear y mitocondrial (Aquilano et al 2010).

Por otro lado, numerosas investigaciones han descrito a la Sirt1 como uno de los

principales sensores energéticos y reguladores metabólicos a través de su acción sobre

Pgc1α en numerosos tejidos (Buler et al 2011, Canto et al 2010, Erion et al 2009, Feige et

al 2008, Ruderman et al 2010). El tratamiento in vivo con agonistas de la Sirt1 promueve

la desacetilación de Pgc1α en músculo esquelético y TAM, lo que se traduce en un

aumento en la actividad mitocondrial así como un aumento en la termogénesis (Lagouge

et al 2006). Además, estos agonistas previenen el aumento de peso y la resistencia a la

insulina inducida por la ingesta de una dieta alta en grasa (Milne et al 2007). Por otro

lado, numerosos estudios han descrito que un aumento en la expresión y actividad de

Sirt1 en situaciones de restricción calórica su participación en el aumento de la

longevidad en diversos tejidos asociada a situaciones de restricción calórica (Cohen et al

2009, Chen et al 2005, Rogina and Helfand 2004, Bordone et al 2007).

Por otro lado, la Sirt1 es un importante regulador del metabolismo lipídico hepático

como se ha demostrado en numerosos estudios con animales transgénicos

(Purushotham et al 2009, Rodgers and Puigserver 2007). Así, como hemos descrito en el

punto anterior el ayuno prolongado aumenta la actividad de la Sirt1 y esta activa a

Pgc1α asi como a Pparα lo que produce un aumento en la oxidación de ácidos grasos y

una mejora en la homeostasis de la glucosa (Dominy et al 2010, Purushotham et al 2009,


96

Rodgers et al 2005). Otro posible mecanismo por el cual la Sirt1 controla el metabolismo

lipídico es a través de la desacetilación del factor de transcripción Srebp1 (sterol

regulatory element binding protein 1) como se ha descrito en diversas investigaciones

(Ponugoti et al 2010, Walker et al 2010). Otras dianas importantes de la actividad de

Sirt1 en el hígado es la represión de Foxo1 (Motta et al 2004) y el TORC2 (Liu et al 2008),

factores de transcripción relacionada con el control de los procesos desencadenados por

el ayuno de corta y larga duración (ilustración 25).

Ilustración 25 Efectos de la Sirt1 en el metabolismo del tejido hepático en situación de

ayuno. Los factores de transcripción activados por desacetilación se señalan con flechas

negras, los que se inhiben por la acción de la Sirt1 se muestran con barras negras. Adaptado

de Schung et al (2011)

1.4.7.3 Sirtuina 3

La Sirt3 humana se expresa como una proteína completa de 44 kDa que se expresa en la

mitocondria por la presencia de una secuencia de localización (Schwer et al 2002). En la

mitocondria, la Sirt3 es hidrolizada por una peptidasa de matriz mitocondrial (MPP) a

una isoforma de 28 KDa que posee una mayor actividad enzimática (Cooper et al 2009,

Schwer et al 2002). Sin embargo, diversos estudios han sugerido que ambas isoformas


97

son igualmente activas (Scher, Vaquero and Reinberg 2007) y aunque la mayoría de las

investigaciones apoyan la localización mitocondrial de la Sirt3 (Cooper et al 2009,

Lombard et al 2007, Schwer et al 2002), algunos han sugerido que puede estar presente

en el núcleo (Bao et al 2010, Scher, Vaquero and Reinberg 2007). En este sentido, un

estudio de Sundaresen et al describió que aunque la isoforma de 44 KDa se expresaba

en el nucleo, en el citoplasma y en la mitocondria, la isoforma de 28 KDa estaba

localizada principalmente en la mitocondria y en situaciones de estrés oxidativo los

niveles de ambas isoformas aumentaban en el núcleo y la mitocondria de cardiomiocitos

(Sundaresan et al 2008). Teniendo en cuenta esta controversia algunos autores

proponen que la Sirt3 ejerce sus funciones principalmente a nivel mitocondrial aunque

puede tener efectos en otros compartimentos celulares (Alhazzazi et al 2011, Hallows,

Albaugh and Denu 2008).

De hecho, numerosas investigaciones en los últimos años han descrito el papel de la

Sirt3 como principal responsable de la desacetilación de las proteínas mitocondriales

(Smith et al 2011, Hirschey et al 2010, Hirschey et al 2009, Lombard et al 2007) y su

papel como regulador de la homeostasis energétic a(Ahn et al 2008, Li and Kazgan 2011,

Shi et al 2005, Verdin et al 2010), el metabolismo lipídico a nivel mitocondrial

(Choudhury, Jonscher and Friedman 2011, Hallows et al 2011, Hirschey et al 2010) y la

biogénesis mitocondrial (Kong et al 2010).

De gran importancia para esta tesis son los estudios que han descrito el papel de la Sirt3

en la estimulación de las defensas antioxidantes mitocondriales (Kong et al 2010,

Lombard et al 2007, Someya et al 2010). Esta estimulación se debe principalmente a la

acetilación de tres dianas de la Sirt3: el factor de transcripción Forkhead 3a (Foxo3a), la

Isocitrato deshidrogenasa (IDH) y Sod2 (Ilustración 26). Respecto a la acción de la Sirt3

sobre Foxo3a, la desacetilación de este factor de transcripción aumenta su actividad

transcripcional produciendo una aumento en la expresión de genes implicados en las

defensas antioxidantes mitocondriales como la Sod2 o la catalasa como ha sido descrito

en estudios previos (Jacobs et al 2008, Kops et al 2002, Sundaresan et al 2009). Por otro

lado, Jacobs et al describieron una interacción física entre la Sirt3 y Foxo3a a nivel

mitocondrial que podría explicar algunos de los efectos de la Sirt3 en la mitocondria

(Jacobs et al 2008) (Ilustración 26).


98

CITOSOL

MITOCONDRIA

NÚCLEO

Foxo3aGenes

antioxidantes

MnSODCatalasaGPx?

Foxo3a

Ac

Foxo3a

Ciclo Krebs

Isocitrato NADPH

NADP+

GSH

GSSG

αKG

Ilustración 26 Esquema de los mecanismos de protección frente al estrés oxidativo

mediados por Sirt3. Las enzimas activadas por desacetilación se señalan con flechas negras,

las que se inhiben por la acción de la Sirt3 se muestran con barras negras. Adaptado de Bell

et al (2011)

Además, otros estudios han descrito que la Sirt3 es responsable de la desacetilación de

la Sod2 presente en la matriz mitocondrial (Chen et al 2011, Ozden et al 2011, Qiu et al

2010, Tao et al 2010). La desacetilación de esta enzima induce un aumento en su

actividad específica y consecuentemente un aumento de la neutralización de las ROS.

Por otro lado, un estudio reciente de Qiu et al (Qiu et al 2010) mostró que la restricción

calórica inducía un aumento de la desacetilación y actividad de Sod2 presumiblemente

inducida por Sirt3, estos datos fueron refrendados posteriormente por Chen et al (Chen

et al 2011) (Ilustración 26).

Como hemos mencionado, otra de las dianas de Sirt3 es la IDH, enzima del Ciclo de

Krebs que produce NADPH en la mitocondria. La GR necesita altas concentraciones de

NADPH para la reducción de GSSG a GSH que actúa como co‐factor de la mtGpx para

detoxificar las ROS (Huang et al 2010, Bell and Guarente 2011, Kong et al 2010,


99

Sundaresan et al 2009). Por otro lado, la glutamato deshidrogenasa, otra de las dianas

de la Sirt3, también tiene un papel importante en el aumento de los niveles

intramitocondriales de NADPH y podría contribuir de igual manera que la IDH a la

detoxificación de ROS en la matriz mitocondrial (Lombard et al 2007, Schlicker et al

2008) (Ilustración 26).

Numerosos estudios han propuesto el papel central de la Sirt3 como modulador de la

producción de ROS en la cadena de transporte de electrones. De hecho, otras de las

dianas fundamentales de esta sirtuina son algunas de las subunidades del complejo I

(Ahn et al 2008), complejo II (Cimen et al 2010, Finley et al 2011) y complejo III (Muller,

Liu and Van Remmen 2004, Bell and Guarente 2011) de la CTE que, como hemos

descrito anteriormente, son los principales responsables de la producción de O2*‐ a nivel

celular.

1.5 TERAPIA ANTIOXIDANTE

1.5.1 ANTIOXIDANTES COMO UNA HERRAMIENTA TERAPÉUTICA PARA COMBATIR LAS

ENFERMEDADES QUE CURSAN CON ESTRÉS OXIDATIVO Y DISFUNCIÓN MITOCONDRIAL

El uso de antioxidantes en el campo clínico para el tratamiento y la prevención de

múltiples patologías que están relacionadas en su origen o desarrolló con un aumento

del estrés oxidativo ha cobrado especial relevancia en los últimos años (Ble‐Castillo et al

2007, Bleys et al 2006). De hecho, la suplementación de la dieta con vitaminas

antioxidantes en enfermedades neurodegenerativas está ampliamente respaldado por

estudios científicos (Moreira et al 2007, Liu and Ames 2005).

En este sentido, también se han llevando a cabo diferentes investigaciones sobre el

posible papel de la suplementación con diferentes antioxidantes dietéticos o mezclas de

los mismos en la mejoría y prevención de la obesidad (Menendez‐Carreno et al 2008,

Nagao, Hase and Tokimitsu 2007, Sutherland et al 2007), aunque muchos de estos

estudios se han desarrollado en diferentes modelos animales y, por tanto, es importante

señalar que los resultados obtenidos en tales ensayos no son siempre extrapolables a

cohortes humanas.


100

Por el contrario, en algunos estudios llevados a cabo en grandes poblaciones no han

observado una disminución en la incidencia de algunas patologías como el cáncer de

próstata (Gaziano et al 2009), otros tipos de cáncer (Lee et al 2005) o la enfermedad

cardiovascular no asociada a sobrepeso u obesidad (Sesso et al 2008) tras el tratamiento

con diversos antioxidantes.

1.5.2 VITAMINA C

1.5.2.1 Estructura

La vitamina C es una vitamina hidrosoluble (Senen et al 2002) que se caracteriza porque

su composición es similar a la de un monosacárido con seis átomos de carbono

(Ilustración 27). La mayoría de las especies de mamíferos sintetizan ácido ascórbico de

novo a través de un proceso de biosíntesis que involucra a la enzima glucono γ‐lactona

oxidasa, sin embargo, los cobayas, los primates y los humanos dependen absolutamente

del abastecimiento externo de VC debido a la inactivación de esta enzima por una

mutación (Ha et al 2004), por otro lado no se acumula en el organismo lo que hace que

sus necesidades sean más elevadas que las de otros micronutrientes (Levine et al 1996).

Como hemos citado, la mutación de la glucono γ‐lactona oxidasa impide la síntesis de

esta molécula en humanos por lo que es necesaria su ingestión desde fuentes externas,

principalmente las frutas cítricas (Nishikimi and Yagi 1996) siendo la dosis diaria

recomendada es de 45 mg/d y los niveles séricos normales de 80 µM.

Ilustración 27 Estructura química de la Vitamina C


101

En el organismo actúa como antioxidante y como co‐factor de sistemas enzimáticos

(Tolbert 1985), su poder antioxidante ha sido ampliamente demostrado y ha sido objeto

de algunas revisiones bibliográficas así como el papel terapéutico en múltiples

patologías (Rodrigo et al 2007).

1.5.2.2 Función

La VC posee un elevado poder antioxidante que ha sido ampliamente descrito en

numerosos estudios y revisiones bibliográficas convirtiéndola en un antioxidante de

referencia (Arrigoni and De Tullio 2002, Meister 1992). Su potencia antioxidante se debe

principalmente a su capacidad para quelar las ROS y las ERN (Arrigoni and De Tullio

2002). Además de su papel como antioxidante en el organismo actua como co‐factor de

diversos sistemas enzimáticos (Tolbert 1985). Teniendo en cuenta estas propiedades

diversos estudios han demostrado su papel terapéutico en múltiples patologías que

cursan con un aumento del estrés oxidativo (Rodrigo, Guichard and Charles 2007).

Cuando el ácido ascórbico pierde electrones en reacciones biosintéticas o antioxidantes,

se genera un radical ascorbil oxidado de corta vida media. Éste posee un potencial de

reducción bajo en comparación con todas las especies reactivas del oxígeno y nitrógeno

(Duarte and Lunec 2005). Estas propiedades hacen del ascorbato un dador de electrones

eficiente para muchas reacciones redox biológicas, y por lo tanto, es capaz de

reemplazar estos radicales libres altamente dañinos por el radical ascorbato poco

reactivo. Cabe destacar que este intermediario inestable se convierte luego en el ácido

dehidroascórbico (ADHA, la forma oxidada del ácido ascórbico) (Ilustración 28). El ADHA

y la VC se sabe que producen distintos efectos en la función celular (Wilson 2002a,

Wilson 2002b).


102

Ilustración 28 Metabolismo redox de la vitamina C. La oxidación de un electrón del

ascorbato genera el radical libre ascorbato, con un electrón deslocalizado entre tres

átomos de oxígeno, el cual en una siguiente oxidación origina el ADHA. El ADHA es una

molécula inestable que puede ser descompuesta o reducida nuevamente a ascorbato.

Diversos estudios han avalado su utilidad en el tratamiento y prevención de la obesidad.

Así, se ha demostrado que el contenido de VC esta inversamente relacionado con la

masa corporal en humanos (Johnston 2005, Johnston and Hale 2005). Además,

individuos con adecuados niveles de VC oxidan 30% más de grasa durante el ejercicio

moderado, siendo las personas con peores niveles de VC más resistentes a la pérdida de

masa grasa. Además, bajos niveles de VC en plasma se ha relacionado con un elevado

índice cintura‐cadera (Canoy et al 2005) y con un incremento del riesgo de enfermedad

cardiovascular, especialmente en personas hipertensas y con sobrepeso (Kurl et al

2002). Asimismo, distintos estudios en humanos muestran también cómo la

suplementación con VC produce beneficios tanto en la pérdida de peso (Naylor, Grant

and Smith 1985) así como en el metabolismo lipídico y glucídico en pacientes que

presentan DMT2 (Paolisso et al 1995).

Por otro lado en estudios llevados a cabo en animales, la suplementación en la dieta con

VC mejoró la sensibilidad a la insulina en ratones hiperglicémicos ob/ob sin afectar el

peso corporal (Abdel‐Wahab et al 2002). Por el contrario, otros autores han descrito una

disminución del peso corporal tanto en ratas suplementadas con esta vitamina

(Sorensen, Devine and Rivers 1974) como la disminución en el número de adipocitos y

en el tamaño de los depósitos grasos tras la inyección de VC (Senen et al 2002). De

acuerdo con estas investigaciones, un estudio llevado a cabo por Campión y


103

colaboradores (2006) en el que se suplementó una dieta alta en grasa con 750 mg/kg de

VC durante 8 semanas se observó una disminución en la ganancia de peso corporal y en

el tamaño de los diferentes depósitos grasos (visceral, subcutáneo, epididimal y

retroperitoneal) en el grupo que recibió dicha dieta alta en grasa suplementada con VC

respecto a su control alimentado solo con la dieta de cafetería (Campion et al 2006).

Trabajos más recientes de este grupo de investigación, siguiendo el mismo modelo

experimental, confirmaron estos datos y analizaron la expresión de diferentes genes en

el tejido subcutáneo. En este sentido, la disminución producida en la expresión y los

niveles de apelina generada por la dieta alta en grasa eran parcialmente revertidos por

la suplementación con VC. Asimismo, se demostró una correlación positiva entre los

bajos niveles séricos de apelina y MDA (r=0.477) (Garcia‐Diaz et al 2007). Por otro lado,

en una publicación reciente en la que utilizaban igual modelo animal y el mismo tipo de

dieta, pero con niveles de suplementación de VC inferiores (100 mg/kg peso), los

autores observaron que a pesar de no existir diferencias en el peso corporal sí que se

daba una disminución en la oxidación del colesterol total en el grupo de animales

suplementados con VC (Menendez‐Carreno et al 2008). Estos datos podrían indicar que,

a dosis bajas de suplementación hay una disminución del estrés oxidativo aunque no

llega a tener efecto significativo sobre la ganancia de peso y la grasa corporal, efectos

que si son observados a mayores concentraciones.

1.5.3 RESVERATROL

1.5.3.1 Estructura:

El resveratrol (3,5,4’‐trihidroxiestilbeno) es una fitoalexina de naturaleza fenólica del

que existen dos formas isoméricas, el trans‐resveratrol y el cis‐resveratrol, poseyendo

actividad biológica principalmente la forma trans.


104

Ilustración 29 Estructura química del Resveratrol

Esta sustancia se encuentra presente en gran cantidad de especies vegetales,

principalmente en la piel de las uvas (Pervaiz 2003) después de la infección por Botrytis

cineara (Soleas, Diamandis and Goldberg 1997), aunque también están presentes en

otros vegetales infectados por este hongo. Así, la concentración en la uva oscila entre 50

a 100 µg/g y en el vino tinto las concentraciones del isómero trans se encuentran entre

0,1 y 15 mg/L (Fremont 2000).

1.5.3.2 Función:

Los primeros indicios acerca de los potenciales efectos beneficiosos del RSV surgieron a

partir de la llamada “paradoja francesa”, en la que se describió una baja incidencia de

enfermedades cardiovasculares en una población con un consumo elevado de grasas

saturadas en su dieta, atribuyéndose este fenómeno al alto contenido de polifenoles,

principalmente de RSV presentes en el vino tinto (Kopp 1998, Sun, Simonyi and Sun

2002). Posteriormente se ha ido profundizando en los mecanismos por los que el

resveratrol ejerce su efecto beneficioso sobre diferentes patologías como el cáncer

(Aggarwal et al 2004), la enfermedad cardiovascular (Fan et al 2008), así como en

diferentes procesos inflamatorios (Udenigwe et al 2008) y enfermedades

neurodegenerativas (Rocha‐Gonzalez, Ambriz‐Tututi and Granados‐Soto 2008, Rossi et

al 2008), entre otras patologías. Por otro lado, numerosos estudios están analizando los

mecanismos por los que el resveratrol confiere resistencia frente al estrés oxidativo.

Así, entre los principales mecanismos implicados se encuentran, en primer lugar, el

elevado potencial antioxidante del resveratrol, principalmente por la capacidad de

quelar diferentes radicales libres mediante la donación de electrones desde su grupo


105

hidroxilo (Fauconneau et al 1997, Tadolini et al 2000). Por otro lado, algunos estudios

han mostrado que el tratamiento con resveratrol activa las defensas enzimáticas

antioxidantes, aumentando la expresión génica de la Gpx, la Cat y la Sod (Ungvari et al

2007). En este sentido, numerosos trabajos han descrito que el tratamiento con

resveratrol produce una inducción progresiva de la expresión génica, los niveles de

proteína y la actividad de la Sod2 (Robb et al 2008a, Robb et al 2008b). También se ha

demostrado en cultivos celulares de hepatocitos, HepG2, el efecto activador del

resveratrol sobre la oxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) e inducida (iNOS) (Notas et al

2006). Sin embargo, algunos autores postulan que el resveratrol ejerce su acción a

través de la activación de diferentes factores de transcripción. Así, Lagouge et al (2006),

describieron que el tratamiento con resveratrol mejoraba la funcionalidad mitocondrial

y prevenía de enfermedades metabólicas a través de la estimulación de la actividad de

Pgc1α facilitando su desacetilación por Sirt1 (Lagouge et al 2006). Esta misma vía fue

propuesta por Baur et al (2006) en una investigación en la que observaron un aumento

en la esperanza de vida de ratones obesos tratados con resveratrol frente a su grupo

control por la activación del Pgc1α a través de su desacetilación por acción de Sirt2

(Baur et al 2006).

1.6 ÁCIDO LIPOICO

1.6.1 ESTRUCTURA QUÍMICA Y FUENTES

El ácido lipoico es un ácido graso de cadena corta (8 átomos de carbono) con dos grupos

sulfidrilo en su estructura. Existen en dos isoformas: el R‐AL (que es la forma natural) y

el S‐AL (que es la forma sintética) (Estrada et al 1996). Es bien conocida su acción como

componente de varios sistemas multienzimáticos cuya función es la decarboxilación de

α‐cetoácidos y glicina así como la oxidación de acetoína a acetaldehido y AcCoA, para

llevar a cabo este papel como cofactor se liga covalentemente con un grupo amida a

través de un residuo de lisina (Patel and Packer 2008b). Estos cambios bioquímicos le

confieren propiedades reguladoras del estado redox celular. Por otro lado, puede

presentarse en su forma oxidada (AL) o en su forma reducida como ácido dihidrolipoico

(DHLA), poseyendo actividad antioxidante en ambas formas (Ilustración 30):


106

Ilustración 30 Estructura del ácido lipoico (AL) (a,b) y de su forma reducida, ácido

dihidrolipico (DHLA) (c)

De hecho, el AL in vitro es convertido rápidamente a su forma reducida a través de

reacciones tanto enzimáticas como son las mediadas por la GR, lipoamida

deshidrogenasa (LD) y TXR; como no enzimáticas, principalmente a través de reacciones

de Fenton con metales de transición (Pick et al 1995, Haramaki et al 1997). Por otro

lado, otros autores han descrito un efecto inverso del DHLA describiendo su elevada

reactividad del mismo con el oxígeno para formar O2*‐ (Han 2008) (Ilustración 31). Por

otro lado, el AL se regenera a partir del ciclo redox con otros antioxidantes como las

vitaminas C y E y aumenta los niveles del glutatión intracelular (Packer, Roy and Sen

1997, Scholich, Murphy and Sies 1989) y los niveles de la CoQ (Kagan et al 1992).


107

Ilustración 31 Vías de transformación del ácido lipoico exógeno en modelos in vitro. AL;

ácido lipoico, DHLA; ácido dihidrolipoico, BP.PDH; proteína ligada a la piruvato

deshidrogenasa, ETC; cadena de transporte de electrones, GR; glutatión reductasa, TXR;

thioredoxin reductasa.

El AL en un principio fue clasificado como una vitamina pero posteriormente se

encontró que podía ser sintetizado en humanos y en otros animales (Carreau 1979). Se

encuentra en numerosos alimentos de origen tanto vegetal como animal, si bien

contienen bajas cantidades de R‐AL en forma de lipolisina. Las principales fuentes

vegetales son espinacas (3,15±1,11 µg lipolisina/g peso seco), brócoli (0,94±0,25 µg

lipolisina/g peso seco) y los tomates (0,25±0,53 µg lipolisina/g peso seco). También está

presente en cereales integrales y en la levadura de cerveza. Además, el ácido lipoico

puede encontrarse en el hígado (2,64±1,23 µg lipolisina/g peso seco), corazón

(1,51±0,75 µg lipolisina/g peso seco) y riñón (0,86±0,33 µg lipolisina/g peso seco)

(Matsugo et al 1997, Moini, Packer and Saris 2002).

Como hemos citado puede ser producido endógenamente en el hígado a través de la

enzima ácido lipoico sintasa (LASY) (Padmalayam et al 2009, Cakatay 2007, Cakatay

2006), siendo los niveles endógenos en plasma de AL de 1‐25 ng/ml y de DHLA 30‐140


108

ng/ml (Ghibu et al 2009b). El AL se sintetiza a partir del ácido octanoico que se transfiere

a una amida del dominio lipoil por la acción de la octanoil transferasa (Cronan, Zhao and

Jiang 2005, Cronan, Fearnley and Walker 2005), los centros tiólicos son insertados en los

carbonos 6 y 8 del octanoato desde el polipeptido lipoil transferasa a través de la vía de

la s‐adenosil metionina (SAM), esta reacción es catalizada por la LASY (Cicchillo and

Booker 2005, Nesbitt et al 2005). De esta forma, el ácido lipoico queda unido al centro

lipoil de la LASY, para su liberación es necesaria la acción de la lipoamidasa que degrada

las proteínas que lo unen con la LASY (Hayakawa et al 2006). Por otro lado el AL libre

puede unirse al domino lipoil de la LASY por la acción de la lipoato ligasa que requiere

ATP para su acción (Hassan and Cronan 2011).

1.6.2 METABOLISMO DEL ÁCIDO LIPOICO

El AL se absorbe a nivel intestinal en un elevado porcentaje, en este sentido estudios

desarrollados en ratas Wistar han mostrado una absorción de aproximadamente el 90%

de la dosis oral administrada (Peter and Borbe 1995, Schupke et al 2001). De forma

parecida, estudios en humanos muestran que la absorción intestinal es rápida (< 1 hora)

y eficiente (Packer, Kraemer and Rimbach 2001, Amenta et al 2008). A pesar de estos

datos, el AL tiene una baja biodisponibilidad (0,2‐0,3) (Yadav et al 2010, Evans and

Goldfine 2000, Amenta et al 2008) y una vida media corta (<1 hora) que puede

explicarse, al menos en parte, por el importante metabolismo que sufre a su paso por el

hígado tanto en por la vía de la β‐oxidación como por la metilación de sus grupos tiol

(Teichert et al 2003) (Ilustración 32).


109

Ilustración 32 Transformaciones químicas del AL en el hígado. AL, ácido lipoico; DHLA,

ácido dihidrolipoico; BMOA, Ác. Octanoico 6,8‐bismetiltiol; BMHA, Ác. Hexanoico 4,6‐

bismetiltiol; BMBA, Ác. Butanoico 2,4 bismetiltiol; TNLA, tetranor lipoic acid; BNLA, bisnor

ácido lipoico. Adaptado de Teichert et al (2003)

Así se ha descrito que la administración oral de una dosis única o repetida de 600 mg de

AL produce picos plasmáticos después de una hora entre 10‐50 µM en varones sanos

(Teichert et al 2003, Amenta et al 2008), sin embargo las dosis efectivas determinadas

en estudios in vitro se mueven en rangos mucho más amplios (10‐250 µM) dependiendo

del estudio y del parámetro analizado (Foo et al 2011, Prieto‐Hontoria et al 2011b,

Guerriero et al 2011). Por otro lado, algunos estudios han demostrado que existe una

linealidad entre la dosis oral y los picos plasmáticos con dosis entre 50‐600 mg (Amenta

et al 2008, Breithaupt‐Grogler et al 1999), otras investigaciones han descrito que la

biodisponibilidad y el área bajo la curva de los picos plasmáticos disminuyen con la co‐

ingestión de comida (Gleiter et al 1996) así como con la velocidad del vaciamiento

gástrico (Hermann et al 1998). Por último, la biodisponibilidad del AL se encuentra

directamente relacionada con el flujo sanguíneo hepático (Patel and Packer 2008c).


110

1.6.3 FUNCIONES ANTIOXIDANTES

El papel antioxidante del AL radica tanto en su capacidad para neutralizar los radicales

libres y en su acción como regenerador de otros antioxidantes endógenos (Packer, Witt

and Tritschler 1995). Así, numerosos estudios han descrito la capacidad del AL y del

DHLA para neutralizar los H2O2, el OH*‐ y HOCl entre otros (Moini, Packer and Saris 2002,

Ghibu et al 2009b, De Araujo et al 2011). Asimismo, se ha descrito que el DHLA es capaz

de neutralizar el O2*‐ in vitro de manera comparable a la Sod (Ghibu et al 2009a). Por

otro lado, diversos estudios in vivo han demostrado que la suplementación con AL

disminuye el estrés oxidativo, por ejemplo Marangon et al mostraron que la

suplementación con 600 mg de AL durante dos meses a individuos sanos inducía una

disminución significativa en los niveles de diversos marcadores de estrés oxidativo como

la F2‐isoprostanonas, la peroxidación lipídica o un aumento en el tiempo de oxidación

de las LDL (Marangon et al 1999).

El papel del LA y del DHLA como quelantes de diferentes metales de transición (Mn2+,

Cu2+, Fe2+ y Zn2+) que pueden desencadenar procesos de oxidación ha sido descrito por

diversos autores. En este sentido Shu et al (2005) describieron en ratas que la

suplementación dietética con AL (0,2% p/p) durante dos semanas revertía la

acumulación de hierro y la deplección de GSH asociada a la edad en la corteza cerebral

(Suh et al 2005). Sin embargo, hay que destacar que la acción quelante del AL y DHLA

sobre el hierro y otros metales de transición es positiva en tejidos en los que se da una

alteración previa del metabolismo de estos metales (Bhatti et al 2005), mientras que en

tejidos sanos es posible que tenga un efecto negativo, si bien los potenciales efectos

pro‐oxidantes del AL son objeto de controversia (Cakatay 2006).

Aunque, como hemos descrito anteriormente, la biodisponibilidad del AL es muy baja y

su concentración en tejidos es muy inferior a la de otros antioxidantes endógenos como

el GSH o el ácido ascórbico (Petersen Shay et al 2008). Sorprendentemente, su potente

papel antioxidante ha sido descrito en numerosas investigaciones y en diferentes

situaciones fisiopatológicas como hemos ido describiendo. Esta aparente disparidad

puede ser explicada si se considera el AL como un “antioxidante de transición”, es decir,

una molécula capaz de activar otros sistemas antioxidantes endógenos lo que aumenta

exponencialmente su capacidad basal para disminuir el estrés oxidativo (Petersen Shay


111

et al 2008).

En este sentido, una de las principales acciones del AL es su acción sobre la regulación

de los niveles de GSH a través de la modulación de los genes implicados en la síntesis de

este antioxidante endógeno como es la regeneración de GSH tras su oxidación a GSSG.

Así, algunos estudios proponen el papel modulador del AL en la expresión de genes

implicado en la síntesis de GSH pueda estar mediada por el factor de transcripción Nrf2.

El Nrf2 es un factor de transcripción que estimula la expresión de genes regulados por el

elemento de respuesta antioxidante (ARE), entre los que se encuentran diversos genes

implicados en la síntesis de GSH (Jaiswal 2004, Itoh, Tong and Yamamoto 2004). En este

sentido, Suh et al (2004) observaron en ratas que la suplementación con AL (40 mg/kg

de peso) durante dos semanas revertía la disminución de los niveles de GSH y la

expresión de Nrf2. Además, la inyección intraperitoneal de AL (40 mg/kg de peso)

aumentaba los niveles de Nrf2 así como la unión con el DNA a las 24 horas (Suh et al

2004). Recientemente, Lii et al han descrito en hepatocitos de rata tratados con AL y

DHLA (50‐600 µM) durante 24 horas un aumento dosis dependiente en la expresión de

la glutatión‐S‐transferasa mediado por la activación de c‐Jun y la unión de Nrf2 a GPEI

(Lii et al 2010) (Ilustración 33).

Ilustración 33 Mecanismo posible de la activación de genes antioxidantes por el AL.

Adaptado de Shay et al (2009)


112

En cuanto a la capacidad del AL para regenerar GSH y otros antioxidantes endógenos

esta se basa principalmente en la rápida transformación del AL en DHLA a través de

mecanismos dependientes de NADH y NADPH incluida la cadena de transporte de

electrones, la TRX, la lipoamida deshidrogenasa o el GSSG (Haramaki et al 1997, Pick et

al 1995). El DHLA es un potente agente reductor (‐320 mV) y por tanto puede afectar a

otros pares redox. Principalmente, el par AL/DHLA afecta a los pares cisteína/cistina (‐

220 mV) y GSH/GSSG (‐240 mM) (Patel and Packer 2008a). De hecho, muchas de las

acciones biológicas del AL se deben en gran medida a la reducción de AL a DHLA y por

tanto a su capacidad para modificar el estado redox que a su vez es responsable de la

modulación de numerosas vías de señalización celular que regulan diferentes procesos

como la captación de glucosa (Packer and Cadenas 2011). Además de regenerar el GSH

el AL participa en el reciclamiento de las vitaminas C y E (Shay et al 2009) como se

recoge en la ilustración 34:

Ilustración 34 Mecanismos de regeneración de antioxidantes endógenos por acción del

AL. Adaptado de Ghibu et al (2009)

1.6.4 EL ÁCIDO LIPOICO COMO NUTRIENTE MITOCONDRIAL

Algunos autores han definido como nutrientes mitocondriales a aquellos que cumplen

las siguientes funciones (Liu 2008):

1. Previenen la generación de especies reactivas oxidantes

2. Neutralizan o inhiben la reactividad de las especies radicales


113

3. Reparan el daño oxidativo producido en diferentes estructuras celulares

mediante la activación de las defensas antioxidantes

4. Actúan como co‐factores de enzimas mitocondriales aumentando su actividad.

5. Regulan la funcionalidad y la biogénesis mitocondrial.

Como hemos descrito en el punto anterior de esta introducción el AL es capaz de

prevenir y reparar el estrés y el daño oxidativo, cumpliendo los tres primeros requisitos

de esta definición. A continuación, nos centraremos en su papel como co‐factor de

enzimas mitocondriales y regulador de la biogénesis mitocondrial. Asi, el AL juega un

papel fundamental en el metabolismo mitocondrial ya que biológicamente se encuentra

ligado covalentemente a proteínas mitocondriales en forma de lipoamida (Liu 2008,

Moini, Packer and Saris 2002, Packer and Cadenas 2011). En concreto, la reducción del

AL a DHLA se encuentra catalizada a nivel mitocondrial por subunidad E3 del complejo

lipoamida deshidrogenesa (Hong et al 1999, Sheline and Wei 2006), que a su vez es un

componente esencial de cuatro complejos mitocondriales: complejo piruvato

deshidrogenasa, complejo α‐cetoglutarato deshidrogenasa, complejo α‐cetoácido

deshidrogenasa y el sistema de hidrólisis de la glicina (Packer and Cadenas 2011, Patel

and Packer 2008a).

En cuanto al papel estimulador del AL sobre la biogénesis mitocondrial no existen

numerosos estudios si bien los más importantes se han desarrollado en los últimos años

(Shen et al 2011, Shen et al 2008a, Shen et al 2008b, Wang et al 2010b, Zhang et al

2010). Así, Wang et al (2010) en ratones C57BL/6 a los que se suplementó la dieta con

AL al 0,75% p/p durante un mes describieron que en el músculo esquelético se producía

un aumento de la biogénesis mitocondrial además de un aumento en el gasto

energético. En este mismo estudio analizaron en cultivos primarios de mioblastos los

posibles mecanismos implicados en los efectos del AL sugiriendo que podían estar

mediados por la activación de la AMPK que a su vez estimularía Pgc1α (Wang et al

2010b). Más recientemente Shen et al (2011) en la línea celular 3T3‐L1 tratada con AL

100 µM durante 24 horas observaron igualmente un aumento en la biogénesis

mitocondrial mediado por un incremento en la expresión y los niveles de proteína de

Pgc1α, Nrf1 y Tfam (Shen et al 2011).


114

1.6.5 PAPEL TERAPEÚTICO

Los potenciales efectos beneficiosos del AL sobre algunas patologías relacionadas con un

desequilibrio en el balance antioxidante/pro‐oxidante han sido analizados en numerosos

estudios clínicos. Así, se ha estudiado su papel en la diabetes (de Oliveira et al 2011,

Kandeil et al 2011, Poh and Goh 2009), la aterosclerosis (Yi et al 2011, Yi et al 2010, Ying

et al 2010, Zhang et al 2008), la hipertensión (Patel et al 2011, Ghibu et al 2009b,

Rahman et al 2011), las enfermedades neurodegenerativas (Jia et al 2009, De Araujo et

al 2011, Ahmed 2010) y la patología hepática (Guerriero et al 2011, Foo et al 2011) entre

otras. Además, la eficacia de este antioxidante en medicina preventiva ha sido

ampliamente descrita en sinergia con otros antioxidantes como la vitamina E (Gonzalez‐

Perez, Moy‐Lopez and Guzman‐Muniz 2008).

En esta tesis nos centraremos en describir brevemente el papel del AL en el tratamiento

de la obesidad y el SM así como en diferentes patologías hepáticas.

1.6.5.1 Efectos beneficiosos del AL sobre la obesidad y el síndrome metabólico

En relación a sus efectos sobre la acumulación de grasa, varios estudios han descrito sus

potenciales efectos anti‐obesidad. Así, Kim y colaboradores (2004) observaron que la

administración durante 14 semanas de este ácido (0,5% p/p) en la dieta de ratas

genéticamente obesas (OLEFT) redujo el peso corporal, la grasa visceral así como los

niveles plasmáticos de glucosa, insulina, ácidos grasos libres y leptina. Estos efectos se

han atribuido en parte a un incremento del gasto energético (por estimulación de la

UCP1 en grasa blanca y parda) así como a una inhibición de la ingesta, mediada por la

inhibición inducida sobre la AMPK hipotalámica (Kim et al 2004). Por otro lado,

investigaciones de nuestro grupo han descrito que sus efectos anti‐obesidad pueden ser

debidos a la disminución de la eficiencia energética debida en parte a la reducción de la

absorción intestinal de azúcares (Prieto‐Hontoria 2009). Más recientemente otros

estudios, realizados en modelos animales de obesidad inducida por una dieta alta en

grasa a los que se les administró ácido lipoico (0,1% p/p) durante 6 semanas, observaron

una disminución de la peroxidación lipídica así como una mejora en el perfil lipídico. En

el mismo estudio, el análisis por microarray de la expresión de genes implicados en la β‐

oxidación lipídica así como de enzimas antioxidantes, reveló que el AL inducía un

aumento en la expresión de todos ellos (Shen et al 2008b).


115

Uno de los mecanismos implicados en los efectos beneficiosos del AL sobre la obesidad y

el SM es la acción de este antioxidante sobre el metabolismo lipídico. En este sentido

Hamano et al (2006) describieron que la suplementación de la dieta de pollos con 400

mg/kg de peso durante cinco semanas mejoraba la lipolisis y la sensibilidad a la insulina

(Hamano 2006), sin embargo no hay estudios que hayan analizado el efecto lipolitico del

AL en profundidad. Por otro lado, algunos estudios que se analizaran más adelante han

descrito la capacidad del AL para disminuir la lipogénesis a nivel hepático (Huong and

Ide 2008). Otro de los mecanismos que podría estar involucrado en la reducción del

tamaño de los depósitos grasos inducido por el AL es una inhibición de la diferenciación

adipocitaria, tal y como ha sido descrito por Cho et al (2003), este estudio demostró que

el tratamiento con AL (250‐500 µM) inhibía la adipogenesis y la diferenciación de

preadipocitos 3T3‐L1 y disminuía la expresión de los genes aP2 y LPL, que se expresan

únicamente en adipocitos maduros. Estos efectos inhibitorios del AL sobre la

diferenciación adipocitaria parecen estar mediados por la reducción de los niveles de

Pparα y Crebp, así como por la activación de las MAPK (Cho et al 2003).

Por otro lado, algunos estudios recientes han descrito la capacidad del tratamiento con

AL para aumentar la biogénesis mitocondrial en diferentes modelos experimentales. Así,

Wang et al (2010) demostraron en ratones macho C57BL/6 de 24 meses de edad que

una administración de AL en el agua de bebida (0,75 %) durante un mes, provocaba una

menor ingesta de comida y una pérdida de peso acompañada de una menor ganancia de

tejido adiposo y de masa magra. Además, observaron que el grupo tratado con AL tenía

un mayor gasto energético en el músculo esquelético que pareció estar mediado por un

aumento en la biogénesis mitocondrial mediante una activación de la AMPK y el Pgc1α

(Wang et al 2010b). De acuerdo con esta investigación, Shen et al (2011) han descrito

que el tratamiento de preadipocitos 3T3L1, tras su diferenciación a adipocitos maduros,

con AL (10‐100 µM) durante 24 horas inducía un aumento en el número y la masa

mitocondrial así como un incremento en la expresión de genes implicados en la

regulación de la biogénesis mitocondrial como Pgc1α, Nrf1 o Tfam (Shen et al 2011).

Por último, diversas investigaciones han analizado el efecto del AL sobre la disminución

en la inflamación asociada a la obesidad y el SM. Así, Deiluiis et al en ratones

transgénicos c‐fmsYFP+, marcados con YFP en un promotor específico de monocitos, que


116

recibieron 6 mg de AL por día en el agua de bebida durante 8 semanas describieron que

el AL era capaz de disminuir los niveles de diversos marcadores de inflamación como el

TNFα, IL6 o la proteína quimiostática de monocitos (MCP1) en el tejido adiposo visceral

así como los niveles séricos, además detectaron por microscopía electrónica de

fluorescencia una menor infiltración de monocitos en el tejido adiposo visceral, siendo

este efecto mayor en los animales que recibieron suplementación con AL que en sus

respectivos grupos pair‐fed (Deiuliis et al 2011). Por otro lado, Zhang et al (2011) en un

estudio reciente llevado a cabo en pacientes con obesidad y DMT2 que recibieron por

vía intravenosa 600 mg de AL diarios durante dos semanas, observaron que el

tratamiento con AL inducía una mejora significativa en la sensibilidad a la insulina y

disminuía los niveles plasmáticos de MDA, 8‐iso‐prostaglandinas, IL6 y TNFα, además se

observó en este grupo de pacientes una disminución significativa en los niveles de

adiponectina (Zhang et al 2011b).

En relación a los estudios acerca de los efectos directos de la suplementación de AL en el

tratamiento de pacientes obesos cabe destacar dos estudios recientes. El primero de

ellos es el llevado a cabo por Carbonelli et al (2010) sobre una muestra de 1127

personas (445 hombres y 682 mujeres) de entre 18 y 60 años, que fueron divididas en

tres grupos en función de su IMC: normopeso, sobrepeso y obesidad. Estos pacientes

fueron tratados durante 4 meses con 800 mg/día de AL. Transcurrido el periodo de

tratamiento se observó un descenso del peso corporal de entre el 7% y el 9% y del

perímetro de la cintura, la presión arterial y los niveles plasmáticos de citoquinas pro‐

inflamatorias tanto en pacientes con sobrepeso como en aquellos con obesidad sin

distinción de género (Carbonelli et al 2010). Estos datos sugieren que podría tener un

papel importante en el tratamiento de la obesidad y sus co‐morbilidades asociadas. El

segundo estudio relevante es el desarrollado por Koh et al (2011) en una muestra de

360 individuos que padecían obesidad, DMT2, hipertensión arterial e

hipercolesterolemia (Koh et al 2011). En este estudio además de la suplementación con

AL (1200‐1800 mg/día) se llevó a cabo una intervención nutricional con una dieta

hipocalórica durante 20 semanas. Los resultados de esta investigación mostraron que

sólo la dosis más elevada de AL inducía una pérdida de peso significativamente más

elevada que la inducida por la dieta hipocalórica. A pesar de que los datos de estas

investigaciones proponen el papel beneficioso de la suplementación con AL para el


117

tratamiento de la obesidad aun son necesarios más estudios que demuestren el papel, la

dosis necesaria y la eficacia del tratamiento.

1.6.5.2 Efectos del AL en el tratamiento de la esteatosis y la fibrosis hepática

Existen pocos estudios que analicen directamente los efectos de la suplementación de la

dieta con AL en el tratamiento o la prevención de la esteatosis hepática, en concreto los

dos estudios principales se llevaron a cabo en 2008 y ambos describieron la capacidad

del AL para prevenir la esteatosis hepática. Así, Park et al (2008) describieron en un

modelo animal de obesidad inducida por la dieta en ratas que la suplementación de una

dieta alta en grasa con AL (0.5% p/p) durante tres semanas prevenía significativamente

la acumulación ectópica de grasa en el hígado y que este efecto no se debía a la

disminución en la ingesta por comparación con un grupo pair‐fed(Park et al 2008). En

relación a los mecanismos implicados en el efecto beneficioso del AL observaron una

inhibición significativa de Srebp1 tanto en el mRNA como en la proteína que parecía

secundaria por un lado a la activación de la vía de la AMPK así como a la disminución de

los niveles de mRNA y proteína de LXR y su actividad de unión al DNA por la disminución

en la fosforilación del factor de transcripción nuclear Sp1. Estos efectos fueron

confirmados con diferentes exprerimentos in vitro en la línea celular HepG2 en la que se

sobre expresó la AMPK tratados con AL (2 mM) así como en cultivos primarios de

hepatocitos de rata tratados con un agonista de LXR y con AL (0,5‐2 mM).

Por otro lado, Huong et al (2008) observaron en ratas alimentadas con una dieta alta en

grasa y azúcares que la suplementación de AL en diferentes concentraciones (1, 2,5 y 5

mg/Kg peso) durante 21 días prevenía la esteatosis hepática (Huong and Ide 2008). Estos

efectos parecían mediados por la inhibición de la actividad de varias enzimas hepáticas

implicadas en la síntesis de ácidos grasos y desaturación de los mismos (glucosa 6‐

fosfato deshidrogenasa, enzima málica, enzima piruvato quinasa, ATP‐ citrato liasa y

ácido graso sintetasa), dicha disminución se observó con todas las dosis empleadas,

salvo en el caso de la enzima málica cuyo descenso empezó a ser significativo a partir de

la dosis de 2,5 g/Kg. Esta reducción en las actividades enzimáticas se vio acompañada de

una disminución en los niveles de mRNA de otras proteínas hepáticas relacionadas con

la lipogénesis y la desaturación de ácidos grasos (Acetyl‐ CoA carboxilasa, spot 14,

adiponutrina, 5‐desaturasa, 6‐desaturasa, stearoyl‐ CoA desaturasa 1).


118

En cuanto a los efectos del AL en la prevención de la fibrosis hepática dos estudios

recientes han descrito su papel beneficioso y los posibles mecanismos implicados. Así,

Min et al (2010) observaron que el tratamiento con AL (100 mg/kg de peso) por vía

intraperitoneal durante una semana disminuía la fibrosis hepática inducida por la ligazón

del conducto biliar (LCB) en ratones, además se vio que revertía la acción del inhibidor

de la activación de plasminógeno (PAI‐1) que se está relacionado con en el desarrollo de

la fibrosis hepática. Para comprobar los mecanismos implicados en estas acciones del AL

se emplearon diversas líneas celulares (HepG2 y AML‐1) que se co‐trataron con TGFβ

(Transforming growth factor β), activador principal de PAI‐1, y diversas concentraciones

de AL (0,5‐2 mM) y observaron una disminución dosis dependiente en los niveles de PAI‐

1 y fibronectina que parece estar mediada por una activación de la vía de señalización

de las c‐Jun N‐terminal quinasas (JNK) y ERK así como una disminución de la fosforilación

de Sp1 (Min et al 2010).

Por último, Foo et al (2011) observaron que el co‐tratamiento con AL a diferentes dosis

(40, 60 y 80 mg/kg de peso) dos veces por semana por via intraperitoneal durante 12

semanas, disminuía el grado de fibrosis y cirrosis inducida por tioacetamida en ratas

Wistar con fibrosis hepática. También, observaron una disminución dosis dependiente

en los niveles de colágeno, TGFβ y α‐SMA respecto al control tratado con tioacetamida

que parecía ser debida a una activación de la vía de las MAPK y PI3K. Además, los

autores analizaron los efectos del tratamiento con DHLA en la activación de células

estelares hepáticas en la línea celular HSC‐T6, para ello indujeron su activación mediante

la administración de TGFβ y trataron con dosis variables de DHLA (6,25‐50 µM)

observando una disminución dosis dependiente en la activación de las células estelares

hepáticas debida, al menos en parte, a la fosforilación de ERK y JNK (Foo et al 2011).


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CAPÍTULO 2/CHAPTER 2

Hipótesis y Objetivos/Hypothesis and

aims

Chapter 2 Hypothesis and aims Capítulo 2 Hipótesis y Objetivos

169

HIPOTÉSIS Y OBJETIVOS

El hígado constituye uno de los órganos centrales en el control del metabolismo

mediante la regulación de la homeostasis energética. Además, este es órgano es el

modulador del flujo de nutrientes procedentes de la dieta hacia el resto del organismo a

través de la circulación portal. Por todo ello, el fallo hepático tiene importantes

repercusiones en el metabolismo sistémico. En este sentido, las principales causas de

patología hepática son la hepatopatía alcohólica, la hepatitis C y la enfermedad hepática

no alcohólica (NAFLD). En relación a su etiología, numerosos autores han determinado el

síndrome metabólico como la principal causa de NAFLD, considerándose como la

principal complicación de la obesidad a nivel hepático y siendo la principal causa de

hepatopatía en países occidentales (Francque et al 2011; Guajardo‐Salinas and Hilmy

2010).

Dentro de la enfermedad hepática no alcohólica, la esteatosis hepática se ha

considerado históricamente una condición benigna, reversible, asintomática y con pocas

complicaciones clínicas; sin embargo, la silente progresión a esteatohepatitis no

alcohólica (NASH) constituye un paso crítico con consecuencias graves e irreversibles

que incluyen la fibrosis, la cirrosis y el cáncer (Rombouts et al 2010; Qureshi and Abrams

2007; Day 2006; Cortez‐Pinto et al 2006), por lo que es de radical importancia controlar

los factores implicados en ésta evolución. En este sentido, la disfunción mitocondrial y

estrés oxidativo han sido descritos como dos factores claves en la evolución de la NAFLD

(Day et al 2002).

La relación de ambos factores ha sido ampliamente estudiada en los últimos años. Así, la

mitocondria ha sido descrita como la principal fuente de generación de especies

reactivas de oxígeno (ROS). En este sentido, aunque este orgánulo cuenta con potentes

sistemas de defensa frente al estrés oxidativo, también puede ser diana del aumento de

ROS cuya reacción con las estructuras mitocondriales induce daño oxidativo en las

mismas (Smith et al 2011, Someya et al 2010). Por todo ello, numerosos estudios han

analizado el papel de este orgánulo en patologías que cursan con un aumento del estrés

oxidativo y su potencial papel como diana terapéutica de estas enfermedades (Li et al

2010; Liu et al 2011; Müller et al 2010; Marra et al 2010).

Capítulo 2 Hipótesis y Objetivos Chapter 2 Hypothesis and aims

170

Por otra parte, el uso de antioxidantes en el campo clínico para el tratamiento y la

prevención de la obesidad (Savory et al 2011; Arias et al 2011; Vincent et al 2009) y la

NAFLD (McCarthy et al 2011; Samy et al 2011; Tauriaienen et al 2011) ha cobrado

especial relevancia en los últimos años. En este sentido, uno de las moléculas más

estudiadas es el ácido lipoico (AL) no sólo por sus importantes propiedades

antioxidantes sino también por su papel como regulador metabólico y nutriente

mitocondrial. Aunque su papel anti‐obesogénico ha sido descrito en algunas

investigaciones previas (Carbonelly et al 2011; Koh et al 2011; Wang et al 2011; Prieto

Hontora et al 2009); sin embargo, existen pocos estudios que analicen directamente el

papel de la suplementación con AL para el tratamiento y/o la prevención de la esteatosis

hepática (Park et al 2008; Huong et al 2008).

Por todo ello, la hipótesis de partida de la presente investigación es que que el

tratamiento con antioxidantes, en especial la suplementación de la dieta con ácido

lipoico, puede modular el estrés oxidativo y la función mitocondrial en el hígado,

previniendo el desarrolló de esteatosis hepática y su evolución a esteatohepatitis.

Así, los objetivos específicos de esta tesis doctoral fueron:

1. Analizar y comparar el papel de diferentes antioxidantes de la dieta: ácido lipoico,

vitamina C y resveratrol sobre diversos marcadores característicos de la funcionalidad

mitocondrial y el estrés oxidativo en extractos mitocondriales de hígado de rata.

2. Determinar el potencial papel de las defensas antioxidantes eritrocitarias como

marcadores del estado oxidativo del compartimento hepático mitocondrial en

diferentes situaciones de balance oxidativo, como la ingesta de una dieta alta en grasa

(balance pro‐oxidante) y la suplementación con ácido lipoico (balance anti‐oxidante).


171

3. Analizar el efecto de la suplementación con ácido lipoico de una dieta alta en grasa

en la prevención y el desarrolló de NAFLD. Además, determinar la capacidad de este

antioxidante para modular la homeostasis energética mitocondrial a nivel hepático.

4. Investigar las potenciales acciones beneficiosas del ácido lipoico sobre el estrés

oxidativo mitocondrial asociado a la NAFLD inducida por una dieta alta en grasa y el

papel de las sirtuinas en dichos efectos.


172

HYPOTHESIS AND AIMS

The liver is a central organ in the control of metabolism through the regulation of energy

homeostasis. Moreover, this organ is the main modulator of nutrients flux from the diet

to the whole body by the hepatic portal system. Consequently, hepatic failure has

important consequences in metabolism. In this sense, alcoholic steatohepatitis,

Hepatitis C and non alcoholic fatty liver disease (NAFLD) are the main causes of liver

dysfunction. Regarding to the aetiology of NAFLD, metabolic syndrome are the main

causes of this pathology. In fact, several studies have described that NAFLD is the

hepatic representation of obesity and is the major cause of liver injure in western

countries (Francque et al 2011; Guajardo‐Salinas and Hilmy 2010).

In this context, hepatic steatosis has been historically considered a benign, reversible,

asymptomatic with few clinical complications, but the silent progression to

steatohepatitis (NASH) is a critical step with serious and irreversible consequences

including fibrosis, cirrhosis and cancer (Rombouts et al 2010, Qureshi and Abrams 2007;

Day 2006, Cortez‐Pinto et al 2006). Therefore, the control of the factors involved in this

evolution is of utmost importance. In this regard, mitochondrial dysfunction and

oxidative stress have been described as two key factors in the development of NAFLD

(Day et al 2002).

The relationship between mitochondrial dysfunction and oxidative stress has been

deeply analyzed in last years. In this sense, several studies have been established that

mitochondria are the major site of reactive oxygen species production. In this sense,

although this organelle has strong antioxidant defenses against oxidative stress, it may

also be a target of ROS which, in turn, could damage mitochondrial structure (Smith et al

2011, Someya et al 2010). Therefore, the role of mitochondrial dysfunction in the

development of some diseases linked to increased oxidative stress has been deeply

analyzed. Moreover, recent investigations have established that the mitochondrion is a

potential target for the treatment of these pathologies (Li et al 2010, Liu et al 2011,

Müller et al 2010, Marra et al 2010).


173

On the other hand, the use of antioxidants in the clinical field for treatment and

prevention of obesity (Savory et al 2011, Arias et al 2011, Vincent et al 2009) and NAFLD

(McCarthy et al 2011; Samy et al 2011; Tauriaienen et al 2011) have gained special

significance in recent years. In this sense, lipoic acid has been one of the most studied

molecules. Interestingly, its potential beneficial effects are not only due to their strong

antioxidant properties, but also due to its role as a mitochondrial nutrient. Thus, the

anti‐obesogenic effect of LA has been described in numerous studies (Carbonelly et al

2011, Koh et al 2011, Wang et al 2011; Prieto Hontoria et al 2009). However, there are

few studies looking directly into LA supplementation as a treatment or prevention for

hepatic steatosis (Park et al 2008; Huong et al 2008).

Therefore the hypothesis of this investigation is that the antioxidant treatment,

especially supplementation with lipoic acid, modifies the oxidative stress and

mitochondrial function in the liver, preventing the development of hepatic steatosis and

its progression to steatohepatitis.

Thus, the specific aims of the present work were:

1. To analyze and compare the effects of different dietary antioxidants: lipoic acid,

vitamin C and resveratrol, in different markers of mitochondrial function and oxidative

stress in isolated rat liver mitochondria.

2. To determine the potential role of erythrocyte antioxidant defenses as biomarkers of

oxidative status in hepatic mitochondrial compartment under different oxidative

conditions, such as, high fat diet intake (pro‐oxidant status) and lipoic acid

supplementation (anti‐oxidant status).


174

3. To test the effect of lipoic acid supplementation of high‐fat diet in the prevention and

the development of NAFLD. Moreover, to investigate the ability of this antioxidant to

modulate mitochondrial energy homeostasis in the liver.

4. To study the potential beneficial effects of LA on mitochondrial oxidative stress

associated to NAFLD induced by a HFD and the mechanistic role of sirtuins on these

effects.


Material y Métodos/Material and

Methods

Chapter 3 Material and Methods Capitulo 3 Material y Métodos

177

Ilustración 35 Resumen de módelos

experimentales empleados y

determinaciones realizadas

Capítulo 3 Material y Métodos Chapter 3 Material and Methods

178

Ilustración 35 b Summary of

experimental dessign

Chapter 3 Material and Methods Capítulo 3 Material y Métodos

179

3.1 ESTUDIO IN VITRO

3.1.1 DISEÑO EXPERIMENTAL

El diseño del presente estudio, ha sido orientado para evaluar el efecto directo de tres

antioxidantes de la dieta sobre la producción mitocondrial de ROS, la actividad de las

principales enzimas antioxidantes mitocondriales y varios macadores respiratorios en

extractos mitocondriales de hígado de rata.

Ilustración 36 Diseño experimental in vitro


180

3.1.2 MODELO ANIMAL

Este estudio se realizó en ratas (Rattus Norvergicus) Wistar macho (n=8) de 12 semanas

de edad, suministradas por el Centro de Investigacion en Farmacobiología Aplicada

(CIFA, Universidad de Navarra, Pamplona, España). Los animales se mantuvieron en

jaulas de poli‐propileno de 19 x 43 x 26 cm provistas de una rejilla de acero inoxidable

(tres‐cuatro animales por jaula) bajo condiciones controladas de luz con ciclos de 12 h

de luz/oscuridad, una temperatura de 22 ± 2ºC y humedad relativa de 55 ± 10%. Todos

los animales fueron alimentados con una dieta estándar suministrada por Harlam Ibérica

(Barcelona, España), cuyas características nutricionales se recogen en la Tabla 2:

Tabla 2 Composición nutricional de la dieta

% VCT

Energía (Kcal) 310

Proteínas (g/100 g pellet) 12,9 16,6 %

Lípidos (g/100 g pellet) 1,6 4,6 %

Carbohidratos (g/100 g pellet) 60,9 78,6 %

%VCT: porcentaje del valor calórico total de la dieta

Los animales tuvieron acceso a la comida y la bebida ad libitum hasta el día antes del

sacrificio cuando se mantuvieron en ayuno durante un periodo aproximado de 12 h.

Antes del sacrificio fueron pesados (281,6±3,76 g). Posteriormente, cada animal fue

sacrificado por decapitación e inmediatamente se extrajo el hígado. Todos los

procedimientos realizados en este ensayo fueron realizados con la aprobación del

Comité de Ética para la Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Navarra.

3.1.3 AISLAMIENTO DE MITOCONDRIAS DE HÍGADO DE RATA POR SEDIMENTACIÓN

3.1.3.1 Fundamento básico

La base experimental del aislamiento de mitocondrias se fundamenta en la separación

por sedimentación en función del peso de los diferentes orgánulos celulares. En primer

lugar se rompe la membrana celular mediante homogeneización manteniendo la


181

estructura mitocondrial íntegra. Seguidamente la fracción mitocondrial se aísla de otros

orgánulos y restos celulares por sedimentación a diferentes velocidades en función de

su tamaño.

3.1.3.2 Reactivos

Medio 1 (pH 7,4)

Sacarosa desionizada 250 mM

NaTes (pH 7,4) 5 mM

EDTA 1 mM

Agua ultrapura

Medio 2 (pH 7,4)


NaTes (pH 7,4) 5 mM

BSA 99% 5 mg/ml

Agua ultrapura

3.1.3.3 Materiales y equipos

Homogeneizador Potter Elvhejem (BRAUN)

Tubo de vidrio y pistilo para el homogeneizador

Centrifuga RC 28 S (Sorwall)

Rotor SS‐34 (Sorwall)

Adaptadores para rotor SS‐34 (Sorwall)


182

3.1.3.4 Procedimiento

Inmediatamente después del sacrificio se extrajeron los hígados (Ilustración 37.a), se

retiraron las partes visible de tejido conectivo (Ilustración 37.b), se lavaron en medio 1

pre‐enfriado y se mantuvieron en el mismo medio (10ml/g tejido) a 4oC hasta la

inmediata obtención de los extractos mitocondriales.

Ilustración 37 Imagen de la cavidad abdominal de rata Wistar (a) y partes del hígado (b)

Primero se cortó el tejido cuidadosamente con tijeras dentro del medio 1. A

continuación se homogeneizó en un homogeneizador Potter Elvhejem (6/8 ciclos de 10

segundos). El homogeneizado resultante se centrifugó a 3000 g durante 10 minutos a

4oC (1), el sedimento constituido por núcleos y restos celulares se desechó. Con el

sobrenadante se realizó una centrifugación a 14500 g durante 10 minutos a 4oC (2), se

desechó el sobrenadante. El nuevo sedimento está formado por el extracto mitocondrial

que puede hallarse contaminado por restos de otros orgánulos. Para proceder a la

purificación del sedimento mitocondrial fue resuspendido con pipeta en medio 2 (2/5

del volumen inicial) y se repitieron los pasos 1 y 2 obteniendo un precipitado purificado

constituido por la fracción mitocondrial. Este precipitado se resuspendió con pipeta en

medio 2 (0,5 ml/g de tejido inicial). Todas las operaciones descritas en el transcurso del

aislamiento se realizaron a 4oC y con material libre de jabones (Ilustración 38)

(Gonzalez‐Muniesa et al 2006).


183

Ilustración 38 Protocolo de aislamiento de extractos mitocondriales de hígado de rata

Posteriormente, se distribuyó la muestra en alícuotas para las distintas determinaciones.

Después de ensayar diferentes condiciones de congelación y descongelación, se observó

que estos parámetros no afectaban a las determinaciones posteriores, salvo en el caso

de los parámetros respiratorios y la producción de ROS, por lo que estas

determinaciones se realizaron en extractos frescos. Para el resto de determinaciones, las

alícuotas se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se conservaron a ‐80oC.

La descongelación se llevó a cabo de forma lenta a 4oC.


184

3.1.4 TRATAMIENTO CON ANTIOXIDANTES


El método se fundamenta en la exposición de mitocondrias aisladas de hígado de rata

(MAHR) a diferentes antioxidantes para comprobar el efecto directo de los mismos

sobre la funcionalidad mitocondrial.

3.1.4.2 Reactivos

Medio respiratorio (pH 7,4) (Shen et al 2008)


Manitol 250 mM

KH2PO4 2,5 mM

MgCl2 2,5 mM

EDTA 0,5 mM

Hepes 2 mM

BSA (99 %) 0,1% (p:v)

Agua ultrapura

Antioxidantes empleados

Tabla 3 Condiciones de utilización de los antioxidantes empleados

Vitamina C Resveratrol Ác. Lipoico

Concentración stock 0,24 mM 0,4 mM 0,24 mM

Concentración MAHR 30 µM 50 µM 30 µM

Conservación Fresco ‐20ºC/oscuridad ‐20ºC/oscuridad

Diluciones seriadas 2 2 2

Diluyente inicial Agua ultrapura Etanol (99%) Etanol (99%)

Diluyente d. seriadas Agua ultrapura Agua ultrapura Agua ultrapura


185

3.1.4.3 Material y equipos

Baño húmedo termostatizado con agitación

Tubos de centelleo


Las muestras fueron descongeladas a 4oC, salvo en el caso de la medición de parámetros

respiratorios y producción de ROS que se emplearon extractos mitocondriales frescos tal

y como se ha comentado anteriormente. A continuación, se diluyeron en medio

respiratorio a 4oC hasta la concentración deseada, se distribuyeron en alícuotas en tubos

de centelleo y se les añadió el antioxidante. Inmediatamente después, los tubos se

cerraron y se sellaron. Se incubaron en un baño húmedo con control de temperatura a

25oC con agitación durante 30 y 60 minutos. Para discriminar el posible efecto del

tiempo y la temperatura sobre las MAHR, se realizó de forma paralela y bajo las mismas

condiciones experimentales la incubación de MAHR con la cantidad equivalente de

etanol a la existente en las diluciones de RSV y AL en vez de cada antioxidante. De tal

manera que cada tiempo tiene su propio control, sometido a las mismas condiciones,

respecto al cual se comparan todas las determinaciones.

3.1.5 DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO POR

QUIMIOLUMINISCENCIA


Esta técnica de medida se basa en la emisión de radiación electromagnética producida

por una reacción química. En el proceso de quimiolumuniscencia directa, dos reactivos,

un substrato y un oxidante, reaccionan para formar un producto intermedio de la

reacción que pasa a un estado electrónicamente excitado, para relajarse a continuación

hasta el estado fundamental con emisión de un fotón, responsable de la emisión de luz

(Garcia‐Campaña et al 2001). Para la detección del O2*‐ se utilizó como reactivo la

lucigenina por su especifidad y su alta sensibilidad en la detección de esta especie

reactiva (Ilustración 39) (Okajima and Ohsaka 2003).


186

Ilustración 39 Esquema de la reacción de quimioluminiscencia para la determinación de

anión superóxido.

3.1.5.2 Reactivos

Lucigenina 0,5 mM

Succinato 40 mM

Medio Respiratorio


Agitador orbital de placas

Luminoskan Ascent (Thermolab System)

Placas blancas de 96 pocillos


Para la determinación de O2*‐ antes de la incubación se diluyeron las muestras en medio

respiratorio hasta alcanzar una concentración de 0,5 mg/ml y posteriormente se

incubaron con los diferentes antioxidantes. Al final de los periodos de incubación se

determinó la cinética de producción estimulada por succinato (5 mM por pocillo)

durante 90 minutos, tras la adición de lucigenina a una concentración por pocillo de 5

µM. Estudios previos han descrito que concentraciones iguales o superiores a 50 µM

pueden introducir un sesgo en la medida de la producción de O2*‐ por activación de

ciclos redox (Li et al 1999, Li, Zhu and Trush 1999), debido a esto la concentración


187

empleada en nuestro estudio fue diez veces menor para prevenir este error de medida.

La concentración de proteína por pocillo fue de 0,1 mg/pocillo (Ilustración 40). Todas las

determinaciones se realizaron por triplicado.

Ilustración 40 Esquema del procedimiento para la determinación de la producción de

anión superóxido

3.1.6 DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE HIDROPERÓXIDOS POR

QUIMIOLUMINISCENCIA


Se basa en el mismo fundamento que la medida de O2*‐ pero con diferente reactivo: el

luminol (Ilustración 41).

Ilustración 41 Esquema de la reacción para la determinación de hidroperóxidos


188

3.1.6.2 Reactivos

Luminol 0,25 mM

Peroxidasa de rábano (HRP) 10 µg/ml

Succinato 5 mM

Medio Respiratorio




Placas de luminiscencia de 96 pocillo


Para la determinación de H2O2, antes de la incubación se diluyeron las muestras en

medio 3 hasta alcanzar una concentración de 0,05 mg/ml y posteriormente se

incubaron. Al final del periodo de incubación se determinó la cinética de producción

estimulada por succinato (5 mM por pocillo) durante 90 minutos tras la adicción de

luminol a una concentración por pocillo de 25 µM y HRP a una concentración de 10

µg/ml. La concentración de proteína por pocillo fue de 0,01 mg/pocillo. Todas las

determinaciones se realizaron por triplicado.


189

Ilustración 42 Esquema del procedimiento para la determinación de la producción

hidroperóxidos

3.1.7 MEDIDA DE LA ACTIVIDAD DE MANGANESO SUPERÓXIDO DISMUTASA


El análisis de la actividad de la Sod2 se basó en la medida de la cinética de la reacción

por colorimetría a través del siguiente conjunto de reacciones:

Ilustración 43 Esquema de las reacciones para la medida de la actividad superóxido

dismutasa


190

Como se observa en la figura 43 en este ensayo se genera O2*‐ a través de la reacción de

la xantina con el oxígeno generando agua y ácido úrico por acción de la xantino oxidasa

(XOD) (1). Dicho O2*‐ reacciona con el WST‐1 que se transforma en WST‐1 formazan que

absorbe luz a una longitud de onda de 450 nm (2). La Sod2 reduce la concentración de

O2*‐, transformándolo en H2O2, y por tanto inhibe la formación de WST‐1 formazan

(Ukeda et al 1997) (3). Así, la reducción en la aparición de WST‐1 formazan es una

medida indirecta de la actividad Sod2 presente en los extractos mitocondriales. Dichas

reacciones se midieron empleando un Kit comercial de la casa Assay Dessigns (Cat. Nº

900‐157).

3.1.7.2 Reactivos

Superóxido dismutasa actividad de 50 U/µl

Buffer Sod 10X

Succinato 5mM

Xantino oxidasa

Reactivo WST‐1

Agua ultrapura

Medio respiratorio


Multiskan spectrum (Thermo Scientific)

Placas de espectrofotometría de 96 pocillos



Primeramente se descongelaron las muestras a 4oC, se diluyeron a una concentración de

1 mg/ml y se trataron con los diferentes antioxidantes, según el procedimiento descrito

anteriormente. Al final del tratamiento se realizaron tres diluciones de cada muestra en


191

buffer Sod 1X hasta alcanzar concentraciones de 1, 25 y 75 µg proteína por pocillo.

Paralelamente se realizó una curva de Sod con el estándar suministrado por el fabricante

según las instrucciones del Kit. Para mantener las condiciones experimentales similares a

las de la medida de ROS se añadió succinato (5 mM) al medio de reacción. Se siguieron

el resto de las instrucciones del fabricante para la preparación de los diferentes

reactivos y se midió la cinética de inhibición de la formación de WST‐1 formazan a 450

nm durante 15 minutos.

3.1.8 MEDIDA DE LA ACTIVIDAD GLUTATIÓN PEROXIDASA


Al igual que en el caso de la actividad Sod el análisis de la actividad de la mtGpx se basó

en el seguimiento de la cinética de reacción por colorimetría del siguiente conjunto de

reacciones:

Ilustración 44 Esquema de las reacciones para la medida de la actividad glutatión

peroxidasa

La Gpx cataliza la reacción de oxidación del GSH (1) dando lugar a GSSG. El GSSG es de

nuevo reducido a GSH por acción de la glutatión reductasa (2). En esta reacción se

produce una disminución de NADPH, que absorbe luz a 340 nm. Así, el descenso en la

absorbancia a 340 nm es directamente proporcional a la actividad Gpx presente en la

muestra (Ozdemir et al 2005). La actividad de la Gpx fue medida a través de un Kit de la

casa Assay Dessigns (Cat. Nº 900‐158).


192

3.1.8.2 Reactivos

GSH+NADPH en viales liofilizados

Glutatión reductasa

Glutatión peroxidasa

Cumene hidroperóxido

Buffer 10X

Succinato 5 mM

Agua ultrapura






A continuación del tratamiento con antioxidantes los extractos mitocondriales se

diluyeron en buffer 1X hasta alcanzar una concentración de 75 µg proteína por pocillo.

Para mantener las condiciones experimentales similares a las de los experimentos

previos se añadió succinato (5 mM) al medio de reacción. Se siguieron el resto de las

instrucciones del fabricante para la preparación de los diferentes reactivos. Se introdujo

en cada medida un control positivo de actividad Gpx distribuido por el fabricante, y un

control negativo con buffer 1X. Se procedió al seguimiento de la disminución de NADPH,

mediante la reducción de la absorbancia a 340 nm durante 10 minutos.


193

3.1.9 MEDIDA DEL CONSUMO DE OXÍGENO Y DE ESTADOS RESPIRATORIOS


El método utilizado se basa en la capacidad de un electrodo de oxígeno tipo Clark para

detectar pequeñas y rápidas variaciones en la utilización del oxígeno de mitocondrias

aisladas. Chance y Williams (1956) fueron los primeros en adaptar los métodos

polarográficos al estudio de la respiración mitocondrial y la fosforilación de ADP (Chance

and Williams 1956).

La célula de medición de oxígeno tipo Clark consiste en un cátodo de platino que actúa

como electrodo de trabajo, y un ánodo de plata que tiene una doble función: actuar

como contraelectrodo y como electrodo de referencia. Los electrodos están en contacto

a través de una solución electrolítica de KCl. Una membrana separa los electrodos y el

electrolito permitiendo la difusión de oxígeno e impidiendo a su vez la contaminación

del electrodo. Una vez estabilizado el sistema se aplica una tensión de polarización entre

el ánodo y el cátodo, comprendida entre 700 y 800 mV. Si la célula entra en contacto

con un medio que contiene oxígeno disuelto, este difunde a través de la membrana y las

moléculas de O2 son reducidas en el cátodo. Una cantidad electroquímica equivalente de

cloruro de plata es depositada sobre el ánodo. El cátodo cede cuatro electrones por

cada molécula de oxígeno, el ánodo de plata los acepta y se genera una corriente que es

directamente proporcional a la presión parcial del oxígeno disuelto en el agua que

estamos midiendo.

3.1.9.2 Reactivos

Medio Respiratorio

Rotenona 5 µM

Succinato 5 mM

ADP 0,1 mM

CCCP 1 µM


194

Agua ultrapura saturada de oxígeno


Electro de oxígeno tipo Clark

Caja de Control (Respire 1, Hansatech)

Registrador (3021 Pen Recorder, Yokogawa)

Microjeringas (MicroliterTM Syringe, Hamilton)

Baño termostatizado a 30ºC (Tectron 3000543, Selecta)

Bomba de vacío


Previamente a la medida se diluyeron las suspensiones de mitocondrias frescas en

medio respiratorio hasta una concentración de aproximada de 10 mg/ml y se incubaron

con los antioxidantes según lo descrito anteriormente.

La unidad del electrodo de oxígeno está conectada a un dispositivo de control y éste a su

vez con un registrador gráfico. Para la calibración del electrodo se pipetean 2ml de Agua

ultrapura en la cámara del electrodo a la que se le añaden unos pocos cristales de

ditionito sódico (Na2S2O4), que provoca que la concentración de O2 descienda

rápidamente a cero. En ese momento se ajusta el valor del registrador y del dispositivo

de control a cero, correspondiente a la ausencia de corriente eléctrica. Seguidamente,

se aspira esta solución con una bomba de vacío y, tras minuciosos lavados de la cámara

con Agua ultrapura, se pipetean 2 ml de agua ultrapura saturada de oxígeno a 30oC. El

valor estable que se registra en milivoltios equivale a 256 nm O2/ml. Finalmente se

pipeteó en la cámara 1 ml de medio respiratorio. Este tipo de electrodos está provisto

de un tapón de metraquilato que impide el intercambio de gases entre la superficie de la

solución y el aire. Por otra parte, este tapón contiene una pequeña apertura por la que

se pueden añadir al medio tanto la suspensión de mitocondrias como los diferentes

substratos con la ayuda de microjeringas. Todas las medidas se realizaron a 30oC y en

constante agitación para facilitar el establecimiento de un equilibrio entre el oxígeno


195

disuelto en la solución y la difusión de gas a través de la membrana de

olitetrafluorometileno del electrodo de oxígeno.

Ilustración 45 Consumo de oxígeno en los diferentes estados respiratorios (gráfica

obtenida en un oxígrafo). Adaptada de Curti et al (1999)

Una vez estabilizado el valor registrado en el medio respiratorio, se añade a través de la

apertura un volumen de suspensión de mitocondrias, tanto las tratadas con

antioxidantes como los controles, suficiente para obtener 1 mg de proteína mitocondrial

en el medio y se mantiene durante aproximadamente 1 minuto para estabilizar el

registró y permitir que se oxiden los posibles substratos endógenos. Seguidamente, se

añade rotenona (5 µM), inhibidor del complejo I, y el succinato y se mantiene el registró

del estado 2 durante unos minutos, tras lo que se añade la cantidad necesaria de ADP

(0,1 mM) para poder registrar el estado 3 y el estado 4 en las mitocondrias analizadas.

Posteriormente se repite la adición de ADP al doble de concentración estableciendo de

nuevo el estado 3 y el estado 4. Finalmente, se procede añadir CCCP (1 µM) para

desacoplar la cadena de transporte de electrones. Como medida de la eficiencia de la


196

fosoforilación oxidativa empleamos el ratio P/O como fue descrito por Hinkle et al

(2005) (Hinkle 2005).

3.1.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO DE LOS DATOS

La normalidad de todos los datos se comprobó mediante los test de Shapiro‐Wilk y

Kolmogorof‐Smirnov, y en función de la misma se evaluaron los datos de forma

paramétrica o no paramétrica. Todos los valores son presentados como media ± error

estándar de la media. Para cada variable se realizó un Anova de dos vías de medidas

repetidas con el fin de evaluar el efecto del tiempo y el tratamiento en la variable

analizada así como la posible interacción entre ambos factores. En los casos en los que

se observó interacción, se realizó efectuó un Anova de una vía de medidas repetidas

para cada variable y cada tiempo de incubación con un test post‐hoc de Dunnett. Las

pruebas de correlaciones fueron realizadas con el coeficiente de Pearson. El nivel de

significación estadístia fue establecido para una probabilidad P<0,05. Para la realización

de todos los análisis estadísticos se utilizó el programa GraphPad Prism 5.0 (Graph Pad

Software, San Diego, CA).


197

3.2 ESTUDIOS IN VIVO

3.2.1 ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN

Los animales empleados para este estudio fueron ratas (Rattus Norvergicus) Wistar

macho con un peso medio inicial de 211,76 gramos (6 semanas de edad) suministradas

por el Centro de Investigacion en Farmacobiología Aplicada (CIFA, Universidad de

Navarra, Pamplona, España). Los animales se mantuvieron en jaulas de propileno de 19

x 43 x 26 cm provistas de una rejilla de acero inoxidable (tres‐cuatro animales por jaula)

bajo condiciones controladas de luz con ciclos de 12 h de luz/oscuridad, una

temperatura de 22 ± 2oC y humedad relativa de 55 ± 10%. Todos los procedimientos

experimentales fueron realizados de acuerdo con las Guías Nacionales e Institucionales

de Cuidado y Uso de Animales y con la aprobación del Comité de Ética para la

Experimentación Animal (CEEA) de la Universidad de Navarra. Antes de comenzar el

estudio los animales fueron sometidos a un período de adaptación a estas condiciones

de cinco días.

3.2.2 DIETAS

Para este estudio se emplearon dos dietas diferentes tanto en su composición como en

la cantidad de energía aportada por cada una de ellas. Así, se empleó una dieta alta en

grasa para inducir sobrepeso y obesidad en los animales, en comparación con la dieta

control o dieta estándar de laboratorio. La ingesta de ambas dietas fue ad libitum y los

animales tuvieron libre acceso al agua de bebida.

La dieta estándar o control fue suministrada por Harlam Teklad Global Diets y la dieta

alta en grasa por OpenSource diets Research Diets. En la siguiente Tabla se detalla la

composición en macronutrientes de ambas dietas:

Tabla 4 Composición nutricional de las dietas experimentales

Dieta control Dieta alta en grasa

Energía (Kcal/100 g) 310 524

Proteínas (%VCT) 16,7 % 20 %

Lípidos (%VCT) 4,6 % 60 %

Carbohidratos (%VCT) 78,6 % 20 %


198

3.2.3 DISEÑO EXPERIMENTAL

La presente tesís forma parte de un estudio anterior desarrollado en el departamento

de Ciencias de la Alimentación, Fisiología y Toxicología de la Universidad de Navarra en

el que se analizaron los efectos del tratamiento con ácido lipoico sobre la obesidad y sus

complicaciones asociadas en un modelo de obesidad inducida por la dieta. En particular

en esta tesis analizamos las acciones de este antioxidante en el desarrollo de la

enfermedad hepática no alcohólica seleccionándose los distintos grupos experimentales

en función de los aspectos a estudiar en cada capítulo. En el siguiente esquema se

recoge el diseño experimental general del estudio.

Ilustración 46 Diseño experimental del estudio in vivo


199

El AL (sintético; ≥ 99% pureza; Sigma Aldrich, Alemania) se administró mezclado con las

diferentes dietas en una proporción de 0,25 g/100 g de comida basándonos en estudios

previos (Kim et al 2004). Los 46 animales del estudio se distribuyeron en cinco grupos

experimentales recibiendo los diferentes tratamientos dietéticos durante 8 semanas. La

descripción del tratamiento dietético y la denominación de los grupos experimentales se

recogen en la siguiente tabla:

Tabla 5 Descripción de los grupos experimentales

Grupo Dieta Suplementación Tamaño muestral

Control Estándar No 10

CLIP Estándar Si (AL 0,25 g/100 g) 10

OB Alta en grasa No 10

OLIP Alta en grasa Si (AL 0,25 g/100 g) 10

PFO Alta en grasa No 6

Durante el tratamiento se registró el peso corporal y la ingesta energética cada 2 o 3

días. Antes del sacrificio se sometió a los animales a un periodo de ayuno de 12 horas

después del cual se sacrificaron por decapitación. Inmediatamente después del sacrificio

se extrajeron los hígados y se pesaron. Una parte del órgano se congeló en nitrógeno

líquido y se conservó a ‐80 ºC para posteriores determinaciones. Otra parte se empleó

directamente para la obtención de los extractos mitocondriales que una vez obtenidos

se conservaron a ‐80oC para la determinación de las defensas antioxidantes según el

protocolo descrito en el punto 3.1.3. Por otro lado, se tomaron biopsias de tejido para el

posterior análisis histológico. Además, se recogió la sangre de cada animal para la

obtención de suero y plasma la medida de diferentes determinación bioquímicas y de

los concentrados eritrocitarios para las diferentes medidas.

Los grupos Control, CLIP, Obeso y OLIP se tomaron como módelos de diferentes estados

antioxidantes para el estudio del segundo objetivo de esta tesis. Así en estos grupos, se

analizaron los efectos del ácido lipoico sobre las defensas antioxidantes eritrocitarias y


200

mitocondriales, el daño oxidativo hepático y el potencial papel de los eritrocitos como

biomarcadores del estado antioxidante en el compartimento hepático mitocondrial. Las

determinaciones llevadas a cabo se resumen en la siguiente figura:

Ilustración 47 Diseño experimental del estudio in vivo I

Por otro lado, para evaluar los potenciales efectos preventivos del tratamiento con ácido

lipoico sobre el desarrollo y evolución de la enfermedad hepática no‐alcohólica inducida

por una dieta alta en grasa, se eligieron los grupos control, obeso, OLIP y pair‐fed OLIP.

Los aspectos a estudiar en estos animales se dividieron en dos grandes grupos; primero,

los relacionados con los procesos bioenergéticos mitocondriales y el metabolismo

lipídico; segundo, los asociados a la regulación del balance pro‐oxidante/antioxidante. El

diseño experimental de este grupo de experimentos se recoge en la ilustración 48:


201

Ilustración 48 Diseño experimental in vivo II


202

3.2.4 DETERMINACIONES BIOQUÍMICAS EN SANGRE

Las determinaciones bioquímicas se realizaron en el suero que se obtuvo tras la recogida

de la sangre total en tubos Vacutainer heparinizados (Becton Dickinson, Gran Bretaña) y

tras su centrifugación a 2200 g durante 15 minutos a 4oC.

3.2.4.1 Determinación de los niveles de glucosa

Los niveles séricos de glucosa se cuantificaron en un autoanalizador COBAS‐Mira

empleando un método enzimático colorimétrico (Glucose HK CP, ABX Pentra) basado en

la siguiente reacción:

HNADHGluconatoDNADFosfatoaGlu

ADPfosfatoaGluATPaGluDPDHaGlu

aHexoquinas

6cos6cos

6coscos

Ilustración 49 Reacción enzimática para la determinación de los niveles séricos de glucosa

3.2.4.2 Medida de los niveles séricos de transaminasas hepáticas: ALT y AST

Uno de los parámetros bioquímicos empleados para la valoración de la función hepática

son los niveles séricos de transaminasas, principalmente la alanina aminotransferasa

(ALT) y la aspartato aminotransferasa (AST), así como la relación entre ambas para

determinar el origen hepático de las alteraciones enzimáticas observadas así como para

discernir si se trata de un proceso agudo o crónico.

Los niveles séricos de ambas enzimas se determinan a través de un método enzimático

colorimétrico en un autoanalizador COBAS‐Mira. La medida de la actividad AST se basa

en la medida de la oxidación de NADH asociado al siguiente conjunto de reacciones,

mediante el cambio en la absorbancia a 340 nm:

NADMalatoLHNADHoOxalacetat

glutamatoLoOxalacetattooxoglutaraAspartatoLMDH

AST2

Ilustración 50 Reacciones enzimáticas implicadas en la determinación de los niveles

séricos de AST


203

Al igual que en el caso de la determinación de la actividad de la AST, los niveles séricos

de ALT se fundamentan en la medida de la oxidación de NADH, pero basándose en el

papel catalizador de la ALT en otro conjunto de reacciones a partir de la L‐Alanina para

producir piruvato que, a su vez, reacciona con el NADH produciendo lactato como se

recoge en la siguiente figura:

NADLactatoLHNADHPiruvato

glutamatoLPiruvatotooxoglutaraAlaninaLLDH

ALT2

Ilustración 51 Reacciones enzimáticas implicadas en la determinación de los niveles

séricos de ALT.

3.2.5 DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE INSULINA POR ELISA


La técnica de ELISA se basa en el siguiente conjunto de reacciones (Ilustración 54):

1. Inmunocaptura: en este paso se produce la unión de la molécula diana a un

anticuerpo policlonal primario inmovilizado en un soporte rígido.

2. En la segunda reacción un anticuerpo secundario biotinilado se une al

anticuerpo primario formando un complejo con el mismo.

3. Detección: en esta última fase se añade un conjugado de HRP y estreptavidina

(Strp) que reconoce el anticuerpo biotinilado. A continuación se añade un

substrato de la HRP que se puede detectar por colorimetría directa.


204

Ilustración 52 Fundamento teórico de la detección de los niveles de insulina por el

método de ELISA


Kit de ELISA para la determinación de insulina de rata (Linco Research Inc). Cat nº.

EZRMI‐13K.

Vórtex




Antes de empezar el análisis de las muestras se prepararon todos los reactivos y se

llevaron a temperatura ambiente durante al menos media hora, además se procedió a

realizar tres lavados previos de los pocillos que se iban a emplear con buffer de lavado.

A continuación se añadieron las muestras, los estándares y controles a los pocillos según


205

la plantilla establecida y posteriormente el anticuerpo biotinilado. Se incubó la placa

durante 2 horas a temperatura ambiente en agitador orbital de placas Posteriormente

se lavó tres veces y se añadió la enzima HRP, se selló la placa y se incubó de nuevo

durante 30 minutos con agitación suave. Tras la incubación se lavó seis veces y se añadió

el substrato de la enzima y tras 20 minutos de incubación se leyó la placa en un

espectrofotómetro a una longitud de onda de 370 nm. Para calcular la concentración de

de insulina se tomó como referencia la curva interna de cada experimento y se empleó

el control negativo como blanco. Tras la interpolación de los datos a la curva se aplicó el

factor de dilución correspondiente. Todas las muestras, estándares y controles se

midieron por duplicado.

3.2.6 MEDIDA DEL ÍNDICE HOMA

El índice de resistencia a la insulina homeostasis model assesment (HOMA), permite

realizar estimaciones de resistencia insuliníca y función de las células beta mediante las

concentraciones de la glucosa y la insulina plasmáticas en ayunas. El índice se calculó

según la fórmula propuesta por Matthews y colaboradores (1985) que se recoge a

continuación:

5,22

)/()(cos.

mlUIInsulinammolesaGluHOMAIndice

3.2.7 OBTENCIÓN DE ERITROCITOS

En el momento del sacrificio se recogió la sangre en tubos Vacutainer Gel SST II

(Vacutainer, Becton Dickinson, Gran Bretaña). Seguidamente fue centrifugada a 2200 g a

4oC durante 15 minutos. El pellet, que contenía los eritrocitos, fue resuspendido en

PBS1X y congelado a ‐80oC para las posteriores determinaciones


206

3.2.8 ANÁLISIS HISTOLÓGICO


Para el análisis de tejidos por microscopia óptica es necesario previamente llevar a cabo

diferentes procesos, que se pueden resumir en cuatro grupos:

Fijación química del tejido

Infiltración en parafina

Cortado

Tinción: en nuestro estudio se utilizaron dos tipos de tinción. Con el colorante

Hematoxilina‐eosina para el análisis de las estructuras generales y la presencia de

gotas lipídicas y la tinción con Rojo Sirio con el fin de estudiar el contenido y

distribución del colágeno en el tejido hepático. En las siguientes Ilustraciónes se

muestran varias de las micrografías obtenidas en las que se han señalado las

diferentes estructuras observadas.

Análisis microscópico y fotografía


207

Ilustración 53 Micrografías de hígado de rata teñidas con hematoxilina‐eosina (HE) y rojo

sirio (RS). Panel 1 se observa la vena central del lobulillo (VC), los sinusoides hepáticos (S) y

el espacio interlobulillar (IL). Panel 2 se pueden diferenciar los diferentes tipos celulares

hepáticos: hepatocitos (H), células estelares (CE) y células de Kupfer (CK). Panel 3 se

diferencia la presencia de macro (MV) y micro (µV) vesículas lipídicas. Panel 4 se ofrece una

visión general de la estructura hepática donde se han resaltado las diferentes VC de los

lobulillos rodeadas de colágeno. Panel 5 se observan las fibras de colágeno (FC) infiltradas

dentro del parénquima hepático. Panel 6 se puede observar el aumento de colágeno en

torno a la pared de la VC así como los sinusoides.


En el momento del sacrificio se recogió una biopsia hepática que se fijó en para‐

formaldehido (4%) durante 48 horas. Posteriormente se continuó la fijación en etanol al

70% durante dos semanas. La inclusión en parafina líquida, los cortes en micrótomo (20

µm) y las tinciones se realizaron en el Servicio de Imagen del Centro de Investigación

Médica Aplicada (CIMA) bajo la supervisión de la Dra. Guembe. Los cambios histológicos

fueron analizados y fotografiados empleando el microscopio óptico de luz polarizada

Nikon eclipse E800 (Nikon Corporation, Japan) y el software de obtención de imágenes

ACT‐1 (Nikon Corporation, Japan).


208

3.2.9 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN TRIGLICÉRIDOS HEPÁTICOS

3.2.9.1 Reactivos

Buffer de homogeneización (pH 8)

NaCl 150 mM

Tritón 0,1%

Tris‐HCl 10 mM (pH 8)

Kit enzimático Pentrax (Horiba ABX, USA)



Sonicador Branson 250

Autoanalizador rápido COBAS‐Mira (Roche Diagnostics, Switzerland)

Microcentrífuga de mesa Eppendorf 5415 R


Para la determinación de triglicéridos hepáticos se utilizaron aproximadamente 150 mg

de hígado congelado que fueron introducidos en buffer de homogeneización

previamente calentado a 50ºC en una proporción 1:10. A continuación se sonicaron las

muestras durante 40 segundos en un sonicador Branson 250 a 4oC, con pulsos de 1

segundo y una amplitud del 40%. Inmediatamente se centrifugaron a 12000 g durante

10 minutos a 4oC, se recogió el sobrenadante en el que se determinó el contenido en

triglicéridos en un autoanalizador COBAS‐Mira empleando el kit comercial Pentrax

(Horiba ABX) como se ha descrito previamente (Perez‐Echarri et al 2009). Los resultados

se corrigieron por el peso de tejido empleado y se presentaron en porcentaje de

triglicéridos por 100 g de tejido.


209

3.2.10 MEDIDA DE LOS NIVELES DE MALONILALDEHÍDO EN HÍGADO


El método empleado para la medida de la concentración de MDA se basa en el

seguimiento por colorimetría de la reacción del MDA con el ácido tiobarbitúrico (TBA)

formando aductos de MDA+TBA como se recoge en la siguiente ilustración:

Ilustración 54 Reacción de formación de aductos de MDA‐TBA

Dicha reacción se produce a altas temperaturas y se puede monitorizar por colorimetría

mediante la medida de la absorbancia a 540 nm.

3.2.10.2 Reactivos

Ácido tiobarbitúrico

Ácido acético

NaOH

Estándar de MDA

Solución de SDS

Buffer RIPA (pH 7,2)

NaH2PO4 1M

Na2HPO4 200 mM


210

SDS 10%

NaCl 5M

NP40 1%

Inhibidores de proteasas

104 mM 4‐ (2‐aminoetil)benzenesulfonil fluorhídrico (AEBSF)

80 µM aprotinina

4 mM Bestatina

1,4 mM E‐64

2 mM leupeptina

1,5 mM pepstatina

1 mM PMSF

Agente colorante

Ác. Tiobarbiturico

Ác. Acético

NaOH


Balanza de precisión





211



Se emplearon aproximadamente 25 mg de tejido a los que se añadió 250 µl buffer RIPA

con inhibidores de proteasas. Se sonicaron las muestras durante 15 segundos en hielo.

Posteriormente se centrifugó el homogeneizado a 1600 g durante 10 minutos a 4oC y se

recogió el sobrenadante. Para la inducción de la formación de aductos de MDA‐TBA2 se

mezclaron 100 µl de muestra, 100 µl de solución de SDS y 4 ml de solución colorante y

se hirvieron en baño húmedo durante 1 hora. A continuación se paró la reacción

introduciendo los viales en hielo durante 10 minutos. Posteriormente se centrifugaron

las muestras a 1600 g durante 10 minutos a 4oC y 150 µl del sobrenadante se añadieron

a la placa de espectrofotometría para su lectura a 530 nm, dentro de cada placa se

introdujo una curva de calibración de MDA.

3.2.11 MEDIDA DE LA ACTIVIDAD SUPERÓXIDO DISMUTASA EN MITOCONDRIAS AISLADAS

Y ERITROCITOS


La determinación de la actividad Sod en mitocondrias aisladas de hígado se llevó a cabo

siguiendo el protocolo descrito en el punto 3.1.7. Sin embargo, en el caso de los

concentrados de eritrocitos aunque se empleó el mismo protocolo, la preparación de la

muestra varió. Asi, antes de determinar la actividad enzimática es necesario lisar los

eritrocitos y purificar la muestra del contenido en hemoglobina que puede interfierir en

la medida colorimétrica. Así, en este punto describiremos exclusivamente la preparación

de la muestra.

3.2.11.2 Reactivos

Etanol (<99% de pureza)

Cloroformo

Fosfato potásico 50 mM (pH 7,8)

Agua ultrapura


212


Tripa de diálisis

Agitadores magnéticos

Vórtex






Para lisar los eritrocitos se les añadieron 10 volúmenes de Agua ultrapura a 4oC, se

mezclaron con Vórtex y se incubaron en hielo durante 15 minutos. Se utilizó como

control de lisis el cambio de color de la solución a rojo claro brillante. Para precipitar la

hemoglobina se trataron las muestras con 0,25 volúmenes de etanol y 0,15 volúmenes

de cloroformo y se agitaron suavemente durante 1 minuto. Inmediatamente se

centrifugaron a 10000 g durante 10 minutos a 4oC. Tras la centrifugación se recogió la

capa superior formada por una solución transparente y se dializó en membranas de

diálisis frente a fosfato potásico 50 mM durante toda la noche en refrigeración.

Posteriormente, el dializado se centrifugó a 10000 g durante 10 minutos a 4oC y en el

sobrenadante se determinó la actividad Sod conforme al protocolo descrito

previamente.

3.2.12 MEDIDA DE LA ACTIVIDAD GLUTATIÓN PEROXIDASA EN MITOCONDRIAS AISLADAS

Y ERITROCITOS


De igual manera que en el caso de la actividad Sod para la determinación de la actividad

Gpx en mitocondrias aisladas se siguió el protocolo descrito en el punto 3.1.8. Para la

determinación en eritrocitos fue necesaria una preparación de muestra que está

fundamentada en el lisado de los eritrocitos.


213

3.2.12.2 Reactivos

PBS

Agua ultrapura


Vórtex






Para el lisado de eritrocitos primero se lavaron las muestras dos veces con PBS 1X a 4oC

y entre lavados se centrifugaron a 1500 g durante 10 minutos a 4oC. A continuación de

descarto cuidadosamente el sobrenadante y se añadieron 5 volúmenes de Agua

ultrapura a 4oC y se incubaron en hielo durante 10 minutos vorteándo las muestras

frecuentemente. Inmediatamente se centrifugaron a 10000 g durante 15 minutos a 4oC.

Se recogió el sobrenadante en el que se determinó la concentración de proteína

mediante Bradford y se congeló a ‐80oC para la posterior determinación de la actividad.

3.2.13 MEDIDA DEL RATIO GSH:GSSG EN MITOCONDRIAS AISLADAS Y ERITROCITOS


La determinación del contenido en glutatión total, reducido y oxidado se basó en el

seguimiento por colorimetría de la cinética del conjunto de reacciones recogidas en la

ilustración 50.


214

Ilustración 55 Esquema de las reacciones para la medida del contenido en glutatión

La GR reduce el GSSG a GSH a expensas de la oxidación de NADPH2 (1). Posteriormente

el grupo sulfihidrilo del GSH reacciona con el DTNB (ácido 5,5’‐dithiobis‐2‐nitrobenzoico)

para producir TNB (ácido 5‐thio‐2‐nitrobenzoico) que absorbe luz a 405 nm. (2)

(Mytilineou, Kramer and Yabut 2002, Onyango and Khan 2006). Así el ratio de

producción de TNB es directamente proporcional a la concentración de glutatión en la

muestra. Para la determinación de la concentración de GSH en la muestra se trató la

misma con 4‐vynilpyridin y por diferencia se obtuvo el ratio entre GSH y GSSG. El

contenido en glutatión fue medido a través de un Kit de la casa Assay Dessigns (Cat. No

900‐160).

Previamente a las determinaciones explicadas se procedió a la extracción del glutatión

de la matriz proteica mediante el tratamiento con ácido metafosfórico.

3.2.13.2 Reactivos

25X Assay Buffer

GSSG (4 μM)

Glutatión reductasa

Ácido metafosfórico 5% (p/v)


215

4‐vynilpyridin

PBS

Agua ultrapura


Vórtex


Campana de extracción





Tras la descongelación de las muestras, los concentrados eritrocitarios y los extractos

mitocondriales se trataron con cuatro volúmenes de ác. Metafosfórico al 5% (p/v) y se

incubaron en hielo durante 15 minutos vorteando periódicamente. Posteriormente, se

centrifugaron a 14000 g durante 15 minutos a 4oC y se recogió el sobrenadante para la

determinación. Se realizaron tres diluciones de cada una de la muestras para los cálculos

posteriores. En cada placa de lectura se introdujo una curva de calibración de GSSG con

el estándar suministrado por el fabricante. Paralelamente, se trató la primera dilución

de las muestras y la curva de calibración con 4‐vynilpiridin 2M durante 1 hora a

temperatura ambiente para la posterior determinación del contenido en GSH. Se

siguieron el resto de las instrucciones del fabricante para la preparación de los

diferentes reactivos y se midió la formación de TNB a 405 nm durante 10 minutos. Todas

las muestras se midieron por triplicado.


216

3.2.14 ANÁLISIS DE LA EXPRESIÓN GÉNICA POR RT‐qPCR

3.2.14.1 Extracción de RNA

La extracción de RNA total del hígado se llevó a cabo mediante el método del TRIZOL©

(Invitrogen), que consiste en una solución monofásica de fenol e isotiocianato de

guanidina. Se trata de una modificación de Chomczynski y Sacchi (1987). Durante esta

homogenización, el Trizol mantiene la integridad del RNA, mientras que rompe las

células y disuelve los componentes celulares. Con este método, se puede partir de

pequeñas cantidades de tejido, obteniéndose un RNA total libre de contaminación por

proteínas y DNA.

Para la realización de la extracción del RNA total se adicionaron a 0,1 g de hígado 1 ml

de Trizol® en tubos de polipropileno previamente autoclavados, y con ayuda de un

ultraturrax se homogeneizó el tejido. Posteriormente, se agitaron vigorosamente

durante 1 minuto (para permitir la completa disociación de los complejos

nucleoproteína), y tras un periodo de incubación de 5 minutos a temperatura ambiente

se centrifugaron a 12.000 x g durante 10 minutos a 4 ºC, para eliminar los principales

restos celulares.

A continuación, se añadieron 200 μL de cloroformo por mL de Trizol® añadido y se agitó

vigorosamente para conseguir una completa distribución del cloroformo (Sigma‐Aldrich)

sobre la fase del Trizol®. Tras esperar 2‐3 min, se volvió a centrifugar a 12000 g durante

20 minutos a 4oC y se logró separar la solución en tres fases: una fase superior acuosa

transparente (donde se encuentra el RNA), una interfase donde se encuentran las

proteínas y una fase inferior orgánica donde se encuentra el DNA. Se recogió la fase

superior acuosa a la que se añadió isopropanol (Sigma‐Aldrich) (500 μL por mL de Trizol

utilizado) y Glycoblue (Ambion) (3 μL por muestra) y se agitó ligeramente. El Glycoblue

permite identificar mejor el pellet de RNA al teñirlo ligeramente de azul. Tras 10 minutos

de incubación a temperatura ambiente, se centrifugó a 12000 x g durante 20 minutos y

a 4oC.

Una vez obtenido el pellet, se realizaron dos lavados con 75% Etanol‐DEPC

(dietilpirocarbonato sódico, Sigma‐Aldrich) (0,01%) y se volvió a centrifugar de nuevo a

12000g durante 5 minutos. Se retiró todo el etanol y se dejó secar el pellet a


217

temperatura ambiente durante 2 minutos. El DEPC inhibe las posibles RNAsas presentes

en la solución de 75% etanol y que podrían degradar la calidad del RNA obtenido. El RNA

fue resuspendido en la solución RNA secure (Ambión, Austin, USA) utilizando un

volumen de 20 μl por muestra, y se incubó durante 10 minutos en baño seco a 55‐65oC

para disolver el pellet e inactivar las RNAsas. Se enfrió en hielo y se procedió a la

cuantificación del RNA total presente en cada muestra así como su grado de pureza

respecto a proteínas y sales minerales utilizando el espectrofotómetro Nanodrop

ND1000 (Thermo Scientific, Wilminton, DE, USA). Para determinar la pureza de la

muestra nos fijamos en el ratio de las absorbancias a 260, 280 y 230 nm. A continuación

se congeló a ‐80oC hasta su posterior utilización.

3.2.14.2 Tratamiento con DNAasa y retrotranscripción

De forma previa a la retrotranscripción se realizó un tratamiento con DNAasas (Ambion,

Austin, USA) con la finalidad de obtener un RNA más puro y libre de contaminaciones

con DNA genómico. Para ello, se tomaron 2 μg de RNA, que se incubaron durante 30

minutos a 37 ºC en presencia de la enzima DNAsa, la cual degrada los restos de DNA

genómico presentes en la muestra.

Seguidamente se realizó la retrotranscripcion de cada una de las muestras, que consiste

en la obtención de DNA complementario (cDNA) a partir del RNA total obtenido, para el

posterior analisis de la expresión génica mediante PCR cuantitativa a tiempo real (RT‐

qPCR). Para cada muestra se realizó la retrotranscripcion de 4 µg de RNA utilizando la

enzima retrotranscriptasa inversa (M‐MLV, Invitrogen) en presencia de la enzima

inhibidora de ribonucleasas (RNasin., Promega) en la siguiente proporción: 4 µl Buffer

5x, 2 µl DTT, 1 µl RNasin y 1 µl M‐MLV.

Se incubaron las muestras durante 10 minutos a 25oC, 60 minutos a 37oC y finalmente

15 minutos a 70oC (inactivación de la enzima). Las muestras de DNA complementario

obtenido (cDNA) se alicuotaron y se guardaron a – 80oC hasta su utilización.

3.2.14.3 Análisis de expresión génica

La determinación de los niveles de expresión génica se llevó a cabo mediante PCR

cuantitativa a tiempo real, que se basa en la actividad 5´exonucleasa de la Taq


218

polimerasa en el que se utiliza una sonda específica del gen marcada con fluorescencia y

dos cebadores oligonucleotídicos. Mediante esta técnica, se puede determinar en

tiempo real la amplificación del gen en estudio, utilizándose otro fragmento de DNA

(sonda) complementario a una parte intermedia del DNA que se quiere amplificar. Dicha

sonda lleva acoplada una molécula fluorescente (reporter) y otra molécula que inhibe la

fluorescencia (quencher). De esta forma, cuando la molecula fluorescente es desplazada

por la enzima Taq polimerasa, dicha molécula se libera y emite fluorescencia al ser

iluminada con un laser.

Ilustración 56 Esquema de la RT‐qPCR según la metodología TaqMan (Modificado de

TaqMan Gene expresión Assays Protocol).

La cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de PCR será proporcional

a la cantidad de DNA que se está amplificando. El detector fotométrico junto con un

programa especial, monitoriza el incremento en la emisión del fluorocromo. El algoritmo

normaliza la señal a un patrón interno (Δ Rn) y automáticamente calcula la línea de corte

del ciclo (Threshold‐CT), cuando el Δ Rn alcanza diez veces la desviación estándar de la

línea base.


219

Inicialmente, se realizó una curva estándar de validación para cada cebador‐sonda con

diluciones seriadas de varias muestras para asegurar que el final de la reacción (tanto

para muestras control, como para los distintos tratamientos) se encontraba en la parte

media de la curva exponencial de amplificación. Se utilizaron 5,5 μl de cDNA, 4 μl de

Taqman Universal PCR Master Mix (Applied biosystems) y 0,5 μl de cada cebador‐sonda

por cada muestra. También se ensayaron diversos genes de referencia (house keeping

genes) para normalizar los datos (18s, ciclofilina, β‐actina y Gliceraldehido 3‐fosfato

deshidrogenasa), siendo elegidos aquellos que presentaron una menor variación entre

las distintas muestras y tratamientos. En este trabajo, los genes en estudio se refirieron

a los genes 18S, β‐actina y ciclofilina.

Los reactivos para el análisis de expresión génica de los distintos genes en estudio, así

como los genes de referencia son prediseñados y obtenidos de Applied Biosystems

(Foster City, EEUU), y las condiciones experimentales se ajustaron a las indicaciones del

fabricante. La detección y amplificación de los genes específicos se llevó a cabo con el

sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7000HT y ABI PRISM 7900HT (Secuence

Detection System, Applied Biosystems).


220

Tabla 6 Listado de genes y sondas utilizadas para el análisis de expresión génica

Nombre Símbolo gen Ref sonda TaqMan©

Proteína desacoplante 2 Ucp2 Rn01754856_m1

Receptor activado por el proliferador de peroxisomas γ Pparγ Rn00440945_m1

NADH deshidrogenasa (ubiquinona) Fe‐S proteína 2 Ndufs2Rn01411711_m1

Succinato deshidrogenasa, subunidad C SdhcRn01412110_g1

Ubiquinol‐Cit c reductasa, complejo III (VII) UqcrqRn01467641_g1

Complejo ATP sintasa mitocondrial F1 γ polipept. 1 Atp5c1 Rn01487290_g1

Superóxido dismutasa 2, mitocondrialSod2 Rn00566942_g1

Glutatión peroxidasa GpxRn00577994_g1

Receptor activado por el proliferador de peroxisomas

γ, coactivador 1 alpha Pgc1α Rn00580241_m1

Receptor activado por el proliferador de peroxisomas

γ, coactivador 1 beta Pgc1ß Rn00598552_m1

Factor de respiración nuclear 1 Nrf1 Rn01455958_m1

Sirtuina 1 Sirt1 Rn01428093_m1

Sirtuina 3 Sirt3 Rn01501408_m1

Carnitina palmitoil transferasa 1a, hígado Cpt1 Rn00580702_m1

Receptor activado por el proliferador de peroxisomas α Pparα Rn00566193_m1

Acyl‐Coenzima A deshidrogenasa, cadena larga Acadl Rn00563121_m1

Factor de transcripción regulado por esteroles 1 Srebp Rn01495772_g1

Diacilglicerol O‐aciltransferasa homolog 2 Dgat2 Rn01506785_g1

Acil‐Coenzima A oxidasa 1, palmitoil Acox1 Rn00569216_m1

Β‐Actina Actb Rn00667869_m1

Cytochrome c oxidase II codificación mitocondrial CoxII/Mtco2 Rn03296734_s1

Forkhead box O3 Foxo3a Rn01441087_m1

18S rRNA eucariótico 18s Hs99999901_s1

Ciclofilina Ppia Rn00690933_m1


221

Los datos se obtuvieron como valores CT, que es el ciclo en el cual la señal de

fluorescencia emitida se encuentra considerablemente por encima de los niveles de

amplificación inespecífica y es inversamente proporcional al número de copias iniciales

de la muestra. Después, se determinaron los valores de ΔCT (ΔCT=CT del gen en estudio‐

CT del gen de referencia) para cada muestra. Los cambios en la expresión del gen se

calcularon por el método de 2‐ΔΔCT (Perez‐Matute et al 2009).

3.2.15 MEDIDA DE LOS NIVELES DE DIVERSAS PROTEÍNAS Y DE LA ACETILACIÓN DE

Foxo3a y Pgc1β POR INMUNOPRECIPITACIÓN Y WESTERN BLOT


Para el análisis de los niveles de las proteínas se empleó la técnica de Western blot. Los

nivéles de Sirt1 y Sirt3 se determinaron en extractos protéicos totales, y los de Parp total

y procesada, en extractos de proteícos mitocondriales. Esta técnica se basa en la

separación de proteínas por electroforésis en función de su peso molecular, su posterior

transferencia a membranas y la detección de las proteínas mediante inmunoblot. Los

pasos principales de la técnica se resumen en la Ilustración 65:

Ilustración 57 Pasos principales de la técnica de Western Blot


222

3.2.15.2 Reactivos

Buffer de lisis para extracción de proteínas mitocondriales

Tris-HCl 20 mM. pH 8

NaCl 137 mM

Glicerol 10%

Triton 1%

Ortovanadato sódico 1 mM

EDTA 2 mM

PMSF 1 mM

NaF 1 mM

Inhibidores de proteasas 1%

Buffer RIPA

NaH2PO4 8 mM

Na2HPO4 42 mM

SDS 1%

NP40 1%

NaF 1mM

PMSF 1 mM

Ortovanadato sódico 1mM

Deoxioctilglicina 1 mg/ml

Inhibidores de proteasas 1%


223

Buffer de carga 2X (tejido)

TrisHCl 1 M (pH 6,7)

MOPS 100 mM

EDTA 10 mM

Glicerol 15 %

SDS 1,5 %

Tritón 0,3%

β‐Mercaptoetanol 10 %

Azul de bromofenol 0,1 %

Buffer de carga 2X (Extractos mitocondriales)

TrisHCl 125 mM (pH 6,7)

Glicerol 20 %

SDS 4 %

β‐Mercaptoetanol 10 %

Azul de bromofenol 0,1 %

Tampón de electroforésis

Tris 25 mM (pH 8,3)

Glicina 192 mM

SDS 0,1%

Tampón de transferencia

Tris 25 mM (pH 8,3)

Glicina 192 mM


224

Metanol 20 %

TBS y TBS‐Tween

TrisHCl 20 mM (pH 7,5)

NaCl 150 mM

Tween 20 0,1 % (TBS‐Tween)

Tinción de Coomasie

Azul de Bromofenol 0,15%

Metanol 50 %

Ác. Acético 10%


225

Anticuerpos empleados

Tabla 7 Anticuerpos empleados para la determinación de proteinas

Anticuerpo Fabricante Ref Dilución Especificidad

Anticuerpos primarios

Sirtuina 1 Santa Cruz sc15404 1:200 Goat Anti‐rabbit

Sirtuina 3 Santa Cruz sc99143 1:200 Goat Anti‐rabbit

Foxo3a Santa Cruz sc11351 1:100 Goat Anti‐rabbit

Parp (total y

procesada)

Cell Signalling 9542S 1:200 Goat Anti‐rabbit

Acetylated‐Lys Cell Signalling 9441 1:500 Goat Anti‐rabbit

Pgc1β Santa Cruz sc‐13067 1:200 Goat Anti‐rabbit

β‐Actina Sigma‐Aldrich A5316 1:1000 Anti‐mouse

COX I MitoScience MS404 1:1000 Anti‐mouse

Anticuerpos secundarios

Goat antirabbit BioRad 170/6515 1:10000

Goat antimouse Santa Cruz sc‐2031 1:5000

Otros reactivos

Super signal revelation solution (Pierce, Rock‐ ford, Ill., USA)

Inhibidor de proteasas (Sigma‐Aldrich): 104 mM 4‐ (2‐aminoetil)benzenesulfonil

fluorhídrico (AEBSF); 80 µM aprotinina; 4 mM Bestatina; 1,4 mM E‐64; 2 mM leupeptina;

1.5 mM pepstatina

Marcador de peso molecular All Blue y Kaleidoscope (BioRad)

Leche desnatada en polvo


226





Equipo de electroforésis Mini‐Protean tetra system (BioRad)

Equipo de transferencia Mini‐Trans Blot Cell (BioRad)

Fuente PowerPac Basic (BioRad)

Películas de revelado Hyperfilm (Amersham)


Densitómetro GS‐800 (Bio Rad Laboratories)


Extracción de proteínas tisulares: para la obtención del extracto de proteínas totales se

pesaron 100 mg de hígado a los que se les añadió 500 µl de Buffer RIPA y se sonicó el

tejido en hielo a una amplitud del 50% y 30 pulsos de 1 segundo. Posteriormente se

incubaron los homogeneizados en hielo durante 30 minutos y se centrifugaron a 13000

g durante 1 hora a 4oC. Posteriormente se recogió el sobrenadante con cuidado de no

arrastrar la capa superior de grasa y se determinó la concentración de proteínas en los

extractos por el sistema de BCA.

Extracción de proteínas mitocondriales: se trataron 200 µl de extracto mitocondrial

con igual volumen de buffer de lisis. Se incubaron en hielo durante 30 minutos y

posteriormente se centrifugaron a 13000 g durante 5 minutos a 5ºC. Se recogió el

sobrenadante en el que se determinó la concentración de proteínas por el método de

Bradford.

Inmunoprecipitación: para determinar los niveles de acetilación de diferentes

proteínas (Foxo3a y Pgc1β) se inmunoprecipitaron las muestras. Para ello, se tomaron


227

100 µl de extractos diluidos en solución de lisis. Se añadieron 2 µg de anticuerpo

policlonal anti‐acetylated‐lysine (Cell Signaling), y se dejó incubando dos horas a 4oC, en

agitación. Posteriormente se añadieron a las muestras 20 µl de suspensión de proteína

A/G PLUS‐Agarose (Santa Cruz Biotechnology). Tras incubar la mezcla durante toda la

noche a 4oC y en agitación moderada, se centrifugaron los tubos 2 minutos a 12000g y a

4oC. Se retiró el sobrenadante y se hicieron 4 lavados de la agarosa y los

inmunocomplejos, mediante centrifugación, con 300 µl de solución de lisis, retirando el

sobrenadante cada vez. A continuación, se añadieron sobre la agarosa 20 µl de buffer de

carga 2X (estándar) y se hirvieron las muestras durante 7 minutos, separando así los

inmunocomplejos de la agarosa. Se centrifugó una vez más, durante dos minutos a

12000g a 4oC y se recogió el sobrenadante. Finalmente, hervimos 5 minutos para

desnaturalizar las proteínas y poder cargar en los geles de poliacrilamida. Se cargaron

volúmenes iguales de todas ellas en paralelo para la posterior determinación de

proteína total y acetilada.

Electroforésis: la separación de las proteínas según su peso molecular se realizó

mediante la técnica descrita por Laemmli (Laemmli 1970). Se emplearon geles de

poliacrilamida discontinuos, de 0,75mm de espesor (Acrilamida: N, N’‐

metilenbisacrilamida 37,5:1), constituídos por un gel inferior de separación, al 8%, 10% ó

12% (V/V) de poliacrilamida, según el tamaño de la proteína a estudiar. El porcentaje de

acrilamida del gel superior o gel de apilamiento fue del 5%. Esta menos concentración

de acrilamida permite obtener bandas finas que se resolverán en el gel inferior. Para

cargar las muestras en el gel se mezclaron con solución de carga 2X (tejidos) y se

hirvieron durante 10 minutos a 95oC. De este modo se desnaturalizaron las proteínas y

se favoreció su unión al SDS, detergente aniónico que da forma homogénea y carga

negativamente a las proteínas. Tras enfriar las muestras en hielo y con un breve pulso de

centrifugación, se cargaron entre 50 µg de proteína en cada calle. La electroforésis se

realizó en cubetas (Mini‐Protean tetra system, Bio‐Rad Laboratories), a un voltaje

constante de 80 mV en el superior y de 120 mV en el gel inferior, hasta que el frente de

azul de bromofenol alcanzara el extremo del gel o los marcadores de peso molecular

específicos se separaran suficiente.


228

Transferencia: las proteínas separadas electroforéticamente en los geles de

poliacrilamida se inmovilizaron en membranas de PVDF previamente activadas en

metanol en una membrana de nitrocelulosa (HybondTM‐P extra, 0,45 micras, Amersham

International). Esta inmovilización se realizó mediante un sistema de transferencia

electroforética húmeda. La transferencia se realizó a 300 mA, durante 3 horas a

temperatura ambiente. Finalizada la transferencia, las membranas se incubaron 2 horas

a temperatura ambiente y en agitación, en solución de bloqueo, para evitar que se

pudiera producir posteriormente adsorción inespecífica de los anticuerpos a la

superficie de nitrocelulosa. Se utilizó como agente bloqueante una solución de leche

desnatada al 5% en TBS‐Tween.

Incubación con anticuerpos: después de bloquear las membranas, se incubaron toda la

noche con los anticuerpos primarios correspondientes a 4º C (Tabla 7), empleando la

dilución recomendada en cada caso por el fabricante. Tras la incubación, se lavaron las

membranas tres veces con TBS‐T y se incubaron durante 60 minutos a temperatura

ambiente con un anticuerpo anti‐IgG conjugado con peroxidada (Tabla 7) y dirigido

contra distintas especies, en función del anticuerpo primario al que debían reconocer.

Por último, las membranas, se sometieron a tres lavados con TBS‐T y un último lavado

con TBS antes de revelar.

Revelado: las bandas de proteína inmunoreactivas se visualizaron mediante

quimioluminiscencia (Super Signal ULTRA kit, Pierce). Para ello se incubó la membrana

con una solución de peróxido de hidrógeno y un substrato (luminol) que emite luz de

longitud de onda de 428 nm al ser oxidado por la peroxidada en presencia de fenoles

que potencian la reacción. Seguidamente se expusieron las membranas a películas

fotográficas sensibles a esta luz (High performance chemiluminescence film, Amersham

HyperfilmTM ECL, GE Healthcare, Reino Unido) durante el tiempo necesario para registrar

la señal. La intensidad de las bandas detectadas se cuantificó utilizando un sistema de

análisis de imagen, que integra la densidad óptica de todos los puntos en el área de la

banda (Densitometer GS‐800, Bio‐Rad Laboratories).

Para realizar la inmunodetección de un segundo epítopo/proteína en una membrana en

la que previamente se hubiera realizado una primera inmunodetección, se retiraron los

anticuerpos unidos a la membrana, para evitar interferencias entre las señales. Para ello


229

se añadió a la membrana la solución de stripping (Re‐Blot Plus Mild Solution 10x,

Millipore) y se incubó 15 minutos a temperatura ambiente y en vigorosa agitación.

Seguidamente se hicieron 2 lavados de 15 minutos cada uno con TBS‐T, procediendo a

bloquear la membrana durante 2 horas. Antes de utilizar las membranas se confirmó la

eliminación de los anticuerpos adsorbidos por reincubación con el anticuerpo

secundario y posterior revelado.

3.2.16 ANÁLISIS DE LA PRODUCCIÓN DE ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO EN

MITOCONDRIAL AISLADAS

La producción de O2*‐ e H2O2 se midió por quimioluminiscencia siguiendo el

procedimiento detallado en los puntos 3.1.5 y 3.1.6 de esta memoria. Los análisis se

realizaron por triplicado en extractos mitocondriales frescos.

3.2.17 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA CTE: COMPLEJO I


La medida de la actividad del Complejo I de la CTE se basó en el seguimiento por

colorimetría de las reacciones de redox que cataliza dicho complejo. Este método está

basado en procedimientos previamente descritos en la literatura (Aleardi et al 2005).

Como se resume en la ilustración 56, en este complejo se inicia la transferencia

electrónica mediante la oxidación de NADH a NAD+ (1) transfiriéndose ambos protones a

la CoQ (2) que actúa como aceptor final de la reacción de oxido‐reducción (Tocilescu et

al 2010).

Ilustración 58 Esquema de reacciones para la determinación de la actividad del Complejo I


230

3.2.17.2 Reactivos

Tabla 8 Reactivos y concentraciones empleados en la medida de la actividad del Complejo I

Reactivo Stock/Disolvente Buffer

Hepes pH 7,8 20 mM/H2O2 20 mM

KCN 1 M/ Etanol 99% 1 mM

NADH 50 mM/ Hepes 100 µM

Coenzima Q 40 mM/ Etanol 99% 40 µM

Rotenona 0,5 mM/Etanol 99% NO


Vórtex




Se diluyeron los extractos mitocondriales, previamente descongelados a 4oC, en buffer

Hepes hasta llevarlos a una concentración de 1 µg/µl y se dividieron en dos alícuotas.

A una de las alícuotas, que se empleó como control de oxidación, se le añadió

Rotenona a una concentración final de 10 µM y se incubó durante 5 minutos en hielo.

Se preparó el buffer de reacción y se añadió a las placas de lectura (150 µl/pocillo).

Se añadió con pipeta multicanal 50 µl de muestra (con y sin rotenona) por pocillo,

alcanzando así una concentración de 50 µg de proteína por pocillo. Todas las muestras

se determinaron por triplicado.

Inmediatamente después se agitó la placa protegiéndola de la luz y se procedió a la

lectura.


231

Parámetros de lectura: longitud de onda 340 nm; tiempo de lectura 10 minutos;

intervalo de medida 10 segundos; temperatura de medida 37oC.

Una vez obtenidos los datos se analizó la parte lineal de la cinética en cada curva y se

calculó la actividad restándole previamente la oxidación debida a factores ambientales

que se expresó en µmoles de NADH/min/mg de proteína. El coeficiente de extinción

molar de NADH a 340 nm y 37oC empleado fue de 6,22 mM‐1*cm‐1.

3.2.18 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA CTE: COMPLEJO II+III


La actividad de esto complejos se mide unida debido a las dificultades metodológicas

que implica la medida aislada del complejo III ya que para ello es necesario el empleó de

CoQ reducida altamente reactiva. Por esto se mide la actividad de ambos complejos

juntos y posteriormente la del Complejo II (Succinato deshidrogenasa). Se basa en el

seguimiento por colorimetría del aumento de Cit c reducido (absorbe luz a 551 nm)

asociado a las reacciones catalizadas por el complejo II y III de la CTE.

Ilustración 59 Conjunto de reacciones en las que se basa la determinación de la actividad del

Complejo II+III


232

Como se observa en la ilustración 57, el complejo II transforma el succinato en fumarato

cediendo dos protones al FAD (1), acoplada a esta reacción el CoQ pasa a CoQ‐H2 (2). Por

otro lado en el complejo III el CoQ reducido se oxida cediendo sus protones al Cit c que

se reduce, esta última reacción es la que se mide por este método basado en el

procedimiento descrito por Benard et al (2006) (Benard et al 2006) con ligeras

modificaciones.

3.2.18.2 Reactivos

Tabla 9 Reactivos y concentraciones empleados en la medida de la actividad del

Complejo II+III

Reactivo Stock/Disolvente Buffer A Buffer B

Hepes pH 7,8 20 mM/H2O2 20 mM 20 mM

Cit c 1 mM/ Hepes 50 µM 50 µM

KCN 1 M/ Etanol 99∙% 1 mM 1 mM

Succinato 0,5 M/ H2O2 5 mM


Vórtex





Hepes hasta llevarlos a una concentración de 1 µg/µl.

Se prepararon los bufferes de reacción y se añadió a las placas de lectura (150

µl/pocillo), se realizaron en paralelo las medidas con buffer A y B para cada muestra. El

buffer B se utilizó como control de reducción ambiental del Cit c.


233

Se añadió con pipeta multicanal 50 µl de muestra por pocillo, alcanzando así una

concentración de 50 µg de proteína por pocillo. Todas las muestras se determinaron por

triplicado.


lectura.





que se expresó en µmoles de Cit C reducido/min/mg de proteína. El coeficiente de

extinción molar de Cit C reducido a 551 nm y 37oC empleado fue de 21,5 mM‐1*cm‐1.

3.2.19 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA CTE: COMPLEJO IV


La actividad del Complejo IV de la CTE se determinó empleando un kit comercial

(MS444; MitoScience, Eugene, Oregon, USA). El kit se basa en la inmunocaptura del

Complejo IV con un anticuerpo específico, posteriormente se determina la actividad

mediante la monitorización de la oxidación del Cit c catalizada por la enzima, como se

detalla en la ilustración 58:

Ilustración 60 Reacción en la que se basa la medida de la actividad del Complejo IV


Preparación de muestra: tras la descongelación de los extractos mitocondriales a

4oC se centrifugaron a 13000 g durante 10 minutos a 4oC y se descartó el

sobrenadante. El pellet se resuspendió en cinco volúmenes de solución 1 del kit y se


234

midió la concentración de proteína ajustándose las muestras a una concentración de

5 mg/ml. Posteriormente, se trató con diez volúmenes de detergente durante 30

minutos en hielo. Pasada la incubación se centrifugaron las muestras a 15000 g

durante 20 minutos a 4oC y se recogió el sobrenadante. Se determinó la

concentración en el sobrenadante y se ajustó con solución 1 a 0,15 µg/µl.

Inmunocaptura: se añadieron 200 µl de muestra y controles positivo y negativo en

los pocillos y se incubó durante 3 horas a temperatura ambiente. Posteriormente se

lavaron los pocillos tres veces.

Medida de la actividad: se añadió el buffer de reacción con Cit c reducido y se

midió la absorbancia a 550 nm durante 2 horas a 30oC cada 2 minutos. Todas las

medidas se realizaron por duplicado.

3.2.20 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA CTE: COMPLEJO V


La actividad del Complejo V de la CTE se determinó empleando un kit comercial (MS543;

MitoScience, Eugene, Oregon, USA). Este kit comercial se basa en la capacidad de la ATP

sintasa para actuar en sentido reverso, es decir, en su habilidad para hidrolizar el ATP a

ADP y fosfato (1), en ausencia del gradiente de protones (Feniouk, Suzuki and Yoshida

2007, Lotscher, de Jong and Capaldi 1984). Como se muestra en la ilustración 59, dicha

reacción esta acoplada a la desfosforilación de fosfoenolpiruvato (PEP) a piruvato,

catalizada por la piruvato quinasa (PK) (2). A su vez, el piruvato es responsable de la

oxidación de NADH a NAD+ catalizada por la lactato deshidrogenasa (LDH) (3) que puede

ser monitorizada mediante la disminución en la absorbancia a 340 nm.


235

Ilustración 61 Reacciones implicadas en la medida de la actividad ATP sintasa por el

método de Lotscher

Para un correcto desarrolló de este método son necesarias diferentes modificaciones

descritas previamente (Terni et al 2010). Así se añadió al medio oligomicina para evitar

la síntesis de ATP desde el ADP hidrolizado, se inmunocapturó la subunidad F1 de la ATP

sintasa principal responsable de la hidrólisis (Itoh et al 2004), y por último, se empleó en

el medio determinados lípidos para conseguir la reestructuración funcional del complejo

(Cao et al 2001).


Preparación de muestra: tras la descongelación de los extractos mitocondriales a

4oC se centrifugaron a 13000 g durante 10 minutos a 4oC y se descartó el

sobrenadante. El pellet se resuspendió en dos volúmenes de solución 1 del kit y se

midió la concentración de proteína ajustándose las muestras a una concentración de

5 mg/ml. Posteriormente se trató con diez volúmenes de detergente durante 30

minutos en hielo. Pasada la incubación se centrifugaron las muestras a 15000 g

durante 20 minutos a 4oC y se recogió el sobrenadante. Se determinó la

concentración en el sobrenadante y se ajustó con solución 1 a 1 µg/µl.


236

Inmunocaptura y reestructuración funcional: se añadieron 50 µl de muestra y

controles positivo y negativo en los pocillos y se incubaron durante 3 horas a

temperatura ambiente. Posteriormente se lavaron los pocillos dos veces. Se

añadieron 40 µl de mix lipídico y se incubó durante 45 minutos a temperatura

ambiente.

Medida de la actividad: se añadió el buffer de reacción que contenía la PK y la

LDH, así como el piruvato y el NADH, y se midió la absorbancia a 340 nm durante 2

horas a 30oC cada 2 minutos. Todas las medidas se realizaron por duplicado.

3.2.21 ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS DEL CK: SUCCINATO DESHIDROGENASA


La importancia de la valoración de la actividad de la succinato deshidrogenasa es doble

ya que además de indicarnos el funcionamiento de la CTE nos proporciona información

acerca de la actividad del Ciclo de Krebs. Al igual que en los casos anteriores el método

se basó en el seguimiento por colorimetría de las reacciones redox que cataliza dicho

complejo.

Ilustración 62 Reacciones catalizadas por la SDH y en las que se basa la medida de su

actividad


237

Este método está basado en procedimientos previamente descritos en la literatura

(Cimen et al 2010, Finley et al 2011) con ligeras modificaciones. Como se resume en la

ilustración 60, la SDH cataliza las reacciones redox que se dan para la transformación de

succinato a fumarato en el CK, en este paso el poder reductor se concentra en el FADH2

(1). Posteriormente el FADH2 transfiere ambos protones a la CoQ (2) que los cede al 2,6‐

diclorofenolindofenol (DCPIP) oxidado reduciéndolo (3).

3.2.21.2 Reactivos

Tabla 10 Reactivos empleados en la determinación de la actividad del Complejo II


Vórtex





Hepes hasta llevarlos a una concentración de 1 µg/µl y se dividieron en dos alícuotas.

A una de las alícuotas, que se empleó como control de oxidación, se le añadió 4,4,4‐

Trifluoro‐1,2‐Trienil‐1,3‐butadienona (TTFA), inhibidor de la SDH, a una concentración

final de 100 µM y se incubó durante 5 minutos en hielo.

Reactivo Stock/Disolvente Buffer

Hepes pH 7,8 20 mM/H2O2 20 mM

KCN 1 M/ Etanol 99% 1 mM

Succinato 1 M/ H2O2 5 mM

Coenzima Q 40 mM/ Etanol 99% 40 µM

Rotenona 1 mM/Etanol 99% 1 µM

DCPIP 16 mM/ H2O2 16 µM

TTFA 10 mM/ Etanol 99% NO


238

Se preparó el buffer de reacción y se añadió a las placas de lectura (150 µl/pocillo).

Se añadió con pipeta multicanal 50 µl de muestra (con y sin TTFA) por pocillo,

alcanzando así una concentración de 50 µg de proteína por pocillo. Todas las muestras

se determinaron por triplicado.


lectura.



Una vez obtenidos los datos, se analizó la parte lineal de la cinética en cada curva y se


que se expresó en µmoles de DCPIP/min/mg de proteína. El coeficiente de extinción

molar de DCPIP a 600 nm y 37oC empleado fue de 21 mM‐1*cm‐1.

3.2.22 ANÁLISIS DE LA ACTIVIDAD DE ENZIMAS DEL CK: CITRATO SINTASA


La CS es la primera enzima que participa en el ciclo de Krebs, su actividad se emplea

para valorar tanto el funcionamiento del CK como para estimar la masa mitocondrial de

un tejido mediante el ratio entre la actividad CS total, medida en todo el tejido, y CS

específica, medida en extractos mitocondriales (Raffaella et al 2008). La actividad se

midió por la monitorización colorimétrica de las siguientes reacciones:

Ilustración 63 Reacciones implicadas en la medición de la actividad citrato sintasa


239

Como se aprecia en la ilustración 61, la CS cataliza la reacción del OAA con el AcCoA

transformándose en citrato y CoA SH. Este último es capaz de reaccionar con el DTNB

produciendo TNB que absorbe luz a una longitud de onda de 412 nm, de tal manera que

la monitorización de la absorbancia a 412 nm es una medida indirecta de la actividad de

la enzima.

3.2.22.2 Reactivos

Tabla 11 Concentración de los reactivos empleados en la medida de la actividad citrato

sintasa

Reactivo Stock/Disolvente Buffer A Buffer B

Hepes pH 7,8 20 mM/H2O2 20 mM 20 mM

DTNB 1 mM/ TrisHCl pH 8 0,1 mM 0,1 mM

Acetil CoA 20 mM/ H2O2 0,4 mM 0,4 mM

Oxalacetato 10 mM/ H2O2 0,5 mM NO


Vórtex



Calibrador de pH



Hepes hasta llevarlos a una concentración de 1 µg/µl.

Se pesaron los tejidos congelados y se homogeneizaron en buffer Hepes, después se

diluyeron a una concentración de 1 µg/µl.


240

Se prepararon los bufferes de reacción y se añadió a las placas de lectura (150

µl/pocillo), se realizaron en paralelo las medidas con buffer A y B para cada muestra. El

buffer B se utilizó como control de reducción ambiental del DTNB.

Se añadió con pipeta multicanal 50 µl de muestra por pocillo, alcanzando así una

concentración de 50 µg de proteína por pocillo. Todas las muestras se determinaron por

triplicado.


lectura.





que se expresó en µmoles de TNB /min/mg de proteína. El coeficiente de extinción

molar del TNB reducido a 412 nm y 37oC empleado fue de 14,17 mM‐1*cm‐1.

Una vez obtenidas las actividades de CS total y CS específica para cada muestra se

valoró la masa mitocondrial mediante el ratio entre ambas.

3.2.23 ESTUDIO DE LA PRODUCCIÓN DE ATP POR BIOLUMINISCENCIA


Se determinaron los niveles de ATP pre existente en las muestras empleando un kit

comercial (ATP Determination (sensitive assay), Proteinkinase) basado en la reacción de

la lucigenina con el ATP catalizada por la luciferasa que fue descrito por primera vez por

Lemasters et al (1976) (Lemasters and Hackenbrock 1976), como se detalla en la

siguiente figura:

LuzCOoPirofosfatAMPinaOxyluciferOATPLucigenina MgLuciferasa

22

2

Ilustración 64 Reacción en la que se basa la medida de los niveles de ATP por

bioluminiscencia


241

Para la correcta determinación de los niveles de ATP fue necesario extraer el ATP de la

matriz mitocondrial.

3.2.23.2 Reactivos

Buffer Hepes 20 mM, pH 7,8

Ácido perclórico 1M

KOH 2M

Tris HCl 100 mM, pH 7,8

Adenosine 5´‐trifosfato sal disódica

DTT

Luciferasa de luciérnaga

D‐Luciferina

Buffer de reacción


Vórtex


Calibrador de pH




Extracción del ATP de la matriz mitocondrial de acuerdo al protocolo de Dorta et

al (2005) (Dorta et al 2005): tras la descongelación de las muestras a 4oC se llevaron a

una concentración de 1 mg/ml con Buffer Hepes y se centrifugaron a 9000 g durante


242

5 minutos a 4oC, se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendio en ác.

perclórico. Se volvieron a centrifugar las muestras a 14000 g durante 5 minutos a 4oC,

se recogieron 100 µl de sobrenadante y se neutralizaron añadiendo 70 µl de KOH 2M,

se llevaron a un volumen final de 1 ml con Tris HCl y se centrifugaron las muestras de

nuevo a 14000 g durante 5 minutos a 4oC. En el sobrenadante se determinó la

concentración de ATP.

Medida del contenido en ATP: se preparó una curva de calibración de ATP en cada

una de las placas con concentraciones entre 10‐14 y 10‐7 M. Se añadieron a la placa 25

µl de las muestras o del patrón y 25 µl de un buffer que contenía la D‐lucigenina,

luciferasa y DTT. Se agitó la placa protegida de la luz durante 10 segundos y se incubó

a temperatura ambiente durante 10 minutos, después de la incubación se realizó una

lectura de la placa en un luminometro Luminoskan Ascent. Para el calculó de los

datos se realizó una transformación logarítmica tanto de la curva como de los valores

de la muestra y se calcularon las concentraciones extrapolando a la curva de

calibración y llevando a cabo las transformaciones matemáticas necesarias. Todas las

muestras se midieron por triplicado.

3.2.24 VALORACIÓN DEL DAÑO OXIDATIVO DEL DNA MITOCONDRIAL POR RT‐QPCR

Para determinar el daño inducido por ROS en el mtDNA se procedió a la amplificación

mediante RT‐qPCR de dos fragmentos, uno corto de 79 pb (posiciones 260 a 339) y otro

largo de 161 pb (posiciones 260 a 421) de la misma región del mtDNA, conforme a lo

descrito por Martinéz‐Redondo et al (2010) (Martinez‐Redondo et al 2010) con ligeras

modificaciones.

Este método se basa en que cuando hay un daño en el mtDNA hay un menor número de

copias viables para la amplificación del fragmento largo que del corto, por lo que el valor

de CT del fragmento largo es mayor que el del fragmento corto.


243

Ilustración 65 Determinación del daño en el mtDNA mediante RT‐qPCR

El kit utilizado para ello fue el SYBR Green qPCR SuperMix‐UDG+ROX (Invitrogen). La

reacción fue seguida por la detección de fluorescencia emitida por fluoróforo SYBR

Green que posee una excelente sensibilidad en la cuantificación de las secuencia diana.

Los oligonucleótidos empleados se obtuvieron en Sigma Aldrich (Sigma Aldrich) y las

secuencias fueron:

HVII‐FOR260: 5´‐GCCACTTTCCACACAGACATCATA‐3´

HVII‐L421: 5´‐AGTGCATACCGCCAAAA GATAAA‐3´

HVII‐C339: 5´‐TGTTTAAGTGCTGTGGCCAGA‐3´

La reacción de amplificación del fragmento largo se llevó a cabo en un volumen final de

10 µl, con 15 ng de cDNA, 5 µl de SYBR Green Mix y una concentración 10 µM de HVII‐

FOR260 y de HVII‐L421. EL programa de amplificación empleado fue 2 minutos a 50oC,

10 minutos a 95oC y 40 ciclos (15 segundos a 95oC, 1 minuto a 60oC).

La reacción de amplificación del fragmento corto se llevó a cabo en un volumen final de

10 µl, con 15 ng de cDNA, 5 µl de SYBR Green Mix y una concentración 2,5 µM de HVII‐

FOR260 y de HVII‐L421. EL programa de amplificación empleado fue 2 minutos a 50oC,

10 minutos a 95oC y 40 ciclos (15 segundos a 95oC, 1 minuto a 60oC).


244

Todas las amplificaciones se llevaron a cabo con los sistemas de detección de secuencias

ABI PRISM 7000HT y ABI PRISM 7900HT (Secuence Detection System, Applied

Biosystems) y se realizaron por triplicado.

El calculó absoluto del daño oxidativo del mtDNA se calculó como el ratio entre las

copias del fragmento largo y las del fragmento corto.

3.2.25 ESTUDIO DE LA BIOGÉNESIS MITOCONDRIAL

El estudio de la biogénesis mitocondrial se basó en el análisis de la expresión génica por

RTqPCR descrito anteriormente, de un gen codificado por el mtDNA y dependiente de la

maquinaria genética mitocondrial para su transcripción y traducción, en este estudio el

gen elegido fue el Mtco2 que codifica para la subunidad II del Complejo IV de la CTE. La

expresión de este gen se corrigió por los niveles de mRNA de un gen nuclear endógeno,

en nuestro caso el 18s, empleándose este ratio como el número de copias de mtDNA y

una aproximación fiable de la población mitocondrial del tejido (Guo et al 2011, Pagel‐

Langenickel et al 2007).

3.2.26 ANÁLISIS ESTADÍSTICO

La normalidad de todos los datos se comprobó mediante los test de Shapiro‐Wilk y

Kolmogorof‐Smirnov, y en función de la misma se evaluaron los datos de forma

paramétrica o no paramétrica. Por otro lado se analizaron los posibles outlayers (simples

y extremos) con el programa de análisis estadístico SPSS para Windows versión 15.0

(SPSS Inc. Chicago, Estados Unidos).Para valorar los efectos del tipo de dieta y del

tratamiento con AL así como el efecto independiente de la disminución en la ingesta se

realizó un Anova de una vía seguido de un test post‐hoc de comparaciones múltiples de

Bonferroini o su equivalente no paramétrico el test de Kruskall Wallis con un test post‐

hoc de Dunns. Para el análisis de correlaciones entre parámetros funcionalmente

relacionados se determinaron los coeficientes de correlación de Pearson o Spearman en

función de las pruebas de normalidad respectivas. El nivel de significación estadística fue

establecido para una probabilidad P<0,05. Para la realización de todos los análisis

estadísticos se utilizó el programa GraphPad Prism 5.0 (Graph Pad Software, San Diego,

CA).


245

3.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Aleardi AM, Benard G, Augereau O, Malgat M, Talbot JC, Mazat JP, Letellier T, Dachary‐

Prigent J, Solaini GC and Rossignol R. (2005). Gradual alteration of mitochondrial

structure and function by beta‐amyloids: importance of membrane viscosity changes,

energy deprivation, reactive oxygen species production, and cytochrome c release. J

Bioenerg Biomembr. 37, 207‐25.

Benard G, Faustin B, Passerieux E, Galinier A, Rocher C, Bellance N, Delage JP, Casteilla L,

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CAPITULO 4 / CHAPTER 4

Resultados/ Results

CAPÍTULO 4.1 /CHAPTER 4.1

Vitamin C, Resveratrol and Lipoic acid actions on

isolated rat liver mitochondria: all antioxidants but

different.

Published in Redox Report. 2010;15 (5):207‐16.

Chapter 4 Results I Capítulo 4 Resultados I

253

4.1 VITAMIN C, RESVERATROL AND LIPOIC ACID ACTIONS ON ISOLATED RAT LIVER

MITOCHONDRIA.

Capítulo 4 Resultados I Chapter 4 Results I

254

4.1.1 SUMMARY

Modulating mitochondrial antioxidant status is a nutritional issue of great interes in the

treatment or prevention of several oxidative stress related diseases such us obesity. Thus,

the aim of the present study was to analyze the effects of three antioxidants on hepatic

mitochondrial function and antioxidant status. Isolated rat liver mitochondria were

incubated with Vitamin C, Resveratrol and Lipoic Acid. The activity of antioxidant enzymes

(manganese superoxide dismutase and glutathione peroxidase), ROS generation and

respiratory parameters (RCR, P/O ratio and respiratory states) were measured. Vitamin C

influenced mitochondrial function by decreasing of ROS generation (P<0.0001), by

stimulating the activity of the manganese superoxide dismutase (197.60±35.99%; P<0.001)

as well as glutathione peroxidase (15.70±5.76%, P<0.05) and by altering the activity of the

electron transport chain, mainly by decreasing the P/O ratio (P<0.05). Resveratrol induced a

significant increase in manganese superoxide dismutase activity (160±11.78%, P<0.0001)

and a decrease in ROS generation (P<0.05‐P<0.0001). By contrast, lipoic acid inhibited the

glutathione peroxidase activity (16.48±3.27%, P<0.05) and induced the uncoupling of the

electron transport chain (P<0.01). Moreover, this antioxidant induced a strong decrease on

P/O ratio (P<0.05‐P<0.0001). In conclusion, our results suggest that the three tested

antioxidants produced direct effects on mitochondrial function, although the magnitude

and intensity of these actions were significantly different, which may have implications

when administrated as antioxidants.

Keywords: antioxidant; mitochondria; oxidative stress; reactive oxygen species

Abreviations: DHLA, dihydrolipoic acid; DIO, diet induced obesity; ETC, electron transport

chain; Gpx, glutathione peroxidase; GR, glutathione reductase; GSH, reduced glutathione;

GSSG, oxidized glutathione; H2O2, hydroperoxide; IRLM, isolated rat liver mitochondria; LA,

lipoic acid; Sod2, manganese superoxide dismutase; O2●, superoxide anion; OXPHOS,

oxidative phosphorylation; RCR, respiratory control ratio; ROS, reactive oxygen species;

RSV, resveratrol; VC; vitamin C.


255

RESUMEN

La modulación del estado antioxidante mitocondrial para el tratamiento o la prevención de

enfermedades relacionadas con un incremento del estrés oxidativo como la obesidad, es un

campo de creciente interés desde el punto de vista nutricional. Así, el objetivo del presente

estudio es analizar en el hígado los efectos de tres antioxidantes sobre la función

mitocondrial y el estado antioxidante. Para ello, mitocondrias aisladas de hígado de rata se

incubaron con Vitamina C, Resveratrol y Ácido Lipoico. Se midieron las actividades de las

enzimas antioxidantes (manganeso superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa), la

producción de ROS y diversos parámetros respiratorios (RCR, ratio P/O y el consumo de

oxígeno en los estados respiratorios). La VC produjo una disminución en la producción de

ROS (P<0.0001), mediante la estimulación de la actividad de la Sod2 (197.60±35.99%;

P<0.001) así como de la Gpx (15.70±5.76%, P<0.05) y por la variación de la actividad de la

cadena de transporte de electrones, principalmente por la disminución del ratio P/O

(P<0.05). El Resveratrol produjo un aumento significativo de la actividad Sod2 (160±11.78%,

P<0.0001) y un descenso en la producción de ROS (P<0.05‐P<0.0001). Por el contrario, el

ácido lipoico inhibió la Gpx (16.48±3.27%, P<0.05) e indujo el desacoplamiento de la cadena

de transporte de electrones (P<0.01). Además, este antioxidante indujo un fuerte descenso

en el ratio P/O (P<0.05‐P<0.0001). Nuestros resultados sugieren que los tres antioxidantes

testados ejercen efectos directos en la función mitocondrial, aunque la magnitud y la

intensidad de estas acciones es significativamente diferente para cada uno, lo cual debe

tenerse en cuenta cuando se administran como antioxidantes.


256

4.1.2 INTRODUCTION

Oxidative stress has been generating much recent interest mainly because of its accepted

role as a major contributor to the aetiology of several pathologies with serious public health

implications such as obesity (Valdecantos, Perez‐Matute and Martinez 2009), diabetes

(Rahangdale et al 2009) or metabolic syndrome (Roberts and Sindhu 2009). Oxidative

stress can result from imbalance between reactive species production and antioxidant

defenses (Vincent et al 2006). Mitochondrion is a major cellular site involved in energy

metabolism, and it is also the main source of reactive oxygen species (ROS). In order to

counterbalance the negative effects of ROS, mitochondria also contain enzymatic

antioxidant defenses, such as manganese superoxide dismutase (Sod2) and glutathione

peroxidase (Gpx) (Yu 1994).

The attenuation or complete suppression of oxidative stress as a way to improve several

diseases has flourished as one of the main challenges of research in the last years. Several

approaches have been carried out in order to either decrease the high levels of ROS

generated or boost the endogenous levels of antioxidants. Thus, numerous trials have

examined the effects of supplementation with different antioxidants on oxidative stress

(Ratnam et al 2006, Flora 2007). In this context, multiple lines of evidence suggest that

vitamin C (VC), a hydrophilic vitamin, resveratrol (RSV), a natural poliphenol, and α‐lipoic

acid (LA), a short chain fatty acid, have beneficial effects on several pathologies related to

oxidative stress.

Particularly, a recent study showed a reduction on body weight gain and fat depots after

supplementation with VC (Garcia‐Diaz et al 2007). On the other hand, Baur et al (2006)

described the beneficial effects of RSV on lifespan in obese mouse (Baur et al 2006).

Finally, Prieto‐Hontoria et al (2009) demonstrated significant anti‐obesity effects of LA in a

diet induced obesity rat model (DIO) (Prieto‐Hontoria 2009).

More specifically, these antioxidants showed direct effects on mitochondria. Thus, a recent

study by Lowes et al (2010) demonstrated the key role of vitamin C on mitochondrial

function (Lowes, Webster and Galley).The beneficial effects of RSV on mitochondrial

function have been recently discussed in different research articles (Brookins Danz et al

2009, Robb et al 2008a, Rubiolo and Vega 2008) and LA has also been known as an essential


257

cofactor for mitochondrial bioenergetics enzymes (Smith et al 2004) corroborating its role

in mitochondria.

Thus, this research attempted to address, apparently for the first time, the in vitro effects

of VC, RSV and LA on mitochondrial function by measuring the electron transport status,

the efficiency of oxidative phosphorylation (OXPHOS), ROS production and the activity of

the main mitochondrial antioxidant enzymes.

4.1.3 MATERIALS AND METHODS

4.1.3.1 Animals

Thirteen male Wistar rats (12 weeks old) weighting between 270 to 290 g (281.6±3.76 g)

were supplied by the Applied Pharmacobiology Research Center (CIFA, Pamplona, Spain).

The animals were housed in cages in a temperature controlled room (22 ± 2ºC) with a 12:12

h light:dark cycle. Food and water were given ad libitum. All procedures were performed

according to national and institutional guidelines of the Animal Care and Use Committee at

the University of Navarra. Different animals were used to provide liver mitochondria for the

measurements of respiratory parameters (n=6) than those used for measurements of ROS

production and enzymatic activities (n=7).

4.1.3.2 Materials

ADP, succinate, rotenone, carbonyl cyanide p‐trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP),

lucigenin, luminol, ascorbic acid, RSV and α‐LA were obtained from Sigma‐Aldrich Chemical

Co (Saint Louis, MO).

The concentrations used for the different antioxidants were calculated based on previous in

vitro studies (Qu et al 2001, Sagun, Carcamo and Golde 2005, Zhang, Fu and Zhou 2004,

Rubiolo and Vega 2008, Robb et al 2008a, Morkunaite‐Haimi et al 2003, Lee et al 2009).

Thus, 30 μM for vitamin C and lipoic acid and 50 μM for resveratrol were used. In particular,

the concentration of RSV is slightly higher than the other two antioxidants since previous

studies developed in primary rat hepatocytes have shown that the main effects of RSV were

observed when using concentrations equal or higher to 50 μM (Rubiolo, Mithieux and Vega

2008). RSV and LA have been diluted in ethanol and an equal concentration of ethanol was

added to the control. On the other hand, VC was diluted in water and an equal

concentration of water was also added to its correponding control.


258

4.1.3.3 Mitochondrial preparations

Mitochondria were isolated by differential centrifugation as previoulsy described Rickwood

et al. (Rickwood, Darley‐Usmar and Wilson 1987), with minor modifications (Gonzalez‐

Muniesa et al 2006). After sacrificing the animals by decapitation, livers were carefully

minced with scissors and rinsed thoroughly in an isolation buffer (10 ml/g tissue) containing

250 mM sucrose, 1 mM EDTA and 5 mM NaTES, pH=7.4. The tissue was further

homogenized in a Potter Elvehjem homogenizer. The homogenate was centrifuged for 10

minutes at 3000 g. The pellet was discarded and the supernatant was recollected and

centrifuged for 10 minutes at 14500 g. The mitochondrial pellet was resuspended in buffer

2 which contained 250 mM sucrose, 5 mg/ml BSA free fatty acids and 5 mM NaTES, pH=7.4.

The homogenate was again centrifuged for 10 minutes at 3000 g and the supernatant was

also centrifuged for 10 minutes at 14500 g. The mitochondrial pellet was carefully

resuspended in a minimal volume (0.5 ml) of buffer 2 and mitochondrial protein content

was assaed by pyrogallol red method. All steps of mitochondrial isolation were performed

at 4oC.

4.1.3.4 Incubation of isolated mitochondria with antioxidants

Rat liver mitochondria (IRLM) isolated by the procedure described before, were incubated

with incubation medium (70 mM sucrose, 250 mM manitol, 2.5 mM KH2PO4, 2.5 mM MgCl2,

0.5 mM EDTA, 2 mM Hepes and BSA 0,1%, pH 7), in the absence (control group) or in the

presence of the antioxidants: VC, RSV and LA.

The incubation periods were determined after testing different times (0 to 360 minutes)

and 30 and 60 minutes were selected. The maximum incubation time was established at 60

minutes because at higher incubation periods the electron transport chain (ETC) was

uncoupled. All measurements were performed in triplicate.

4.1.3.5 Chemiluminescent measurement of superoxide and hidroperoxide production

by IRLM

Superoxide production was quantified by measuring the lucigenine‐derived

chemiluminiscence by a Luminoskan Ascent (Thermo Electron Corporation) at room

temperature (RT). The reaction mixture contained 0.5 mg of mitochondrial protein, 250 μl

of chemiluminiscence buffer and an exogenous substrate (5 mM of succinate). The

lucigenin‐derived chemiluminiscence was initiated by adding a final concentration of 5 μM


259

lucigenin and was continuously monitored up to 60 minutes. Several investigations have

described that a lucigenin concentration lower than 50 μM do not stimulate the redox

cycling (Li et al 1999, Li, Zhu and Trush 1999), that is the reason for which a concentration

of 5 µM (ten times lower) has been used in this study (Li et al 1999).

For hydroperoxide production measurement, the luminol‐derived chemiluminiscence was

quantified by a Luminoskan Ascent (Thermo Electron Corporation) at RT. 0.1 mg of

mitochondrial protein was mixed with a buffer, succinate (5 mM) and horseradish

peroxidase (10 μg/ml). The reaction of chemiluminiscence was initiated by adding of 5μM

luminol and was continuously monitored for 60 minutes.

In order to discriminate a possible error caused by the potential reactivity of the buffers

with lucigenin and luminol, we determined a background by measuring the

chemiluminiscence produced in mixtures with no mitochondria. The values obtained were

subtracted to the values obtained when mitochondria were added to these mixtures.

4.1.3.6 Activity of Sod2 and Gpx in IRLM

Sod2 activity in IRLM was measured with a colorimetric activity kit (Superoxide Dismutase

Activity Kit. Cat. nº 900‐157, Assay Designs Inc, Michigan, USA). This colorimetric assay was

based in the following reactions: firstly, O2*‐ was generated from the conversion of xanthine

and oxygen to uric acid and hydrogen peroxide catalized by xanthine oxidase. The O2*‐ then

converts WST‐1 to WST‐1 formazan, a coloured product that absorbs light at 450 nm.

Finally, Sod reduces the O2*‐ concentration and thereby lowers the rate of WST‐1‐formazan

formation. Reduction in the appearance of WST‐1‐formazan is a measure of Sod activity

present in our mitochondria (Ukeda et al 1997). In other words, relative Sod activity of the

experimental sample is determined from percent inhibition of the rate of formation of

WST‐1 formazan.

Gpx activity in IRLM was measured using a colorimetric activity kit assay (Glutathione

Peroxidase Activity Kit. Cat nº 900‐158, Assay Inc, Michigan, USA). This method is based on

the reaction of reduced glutathione (GSH) with H2O2, which produces oxidized glutathione

(GSSG). This reaction is catalyzed by Gpx. GSH are regenerated by the reaction of GSSG with

NADPH which in turn leads to the production of NADP+. The oxidation of NADPH to NADP+

is accompanied by a decrease in absorbance at 340 nm (A340). The rate of decrease in the

A340 is directly proportional to the Glutathione Peroxidase activity in the mitochondria.


260

4.1.3.7 Oxygen Consumption

Mitochondrial oxygen consumption was polarographically measured with a Hansatech (UK)

Clark‐type oxygen electrode (Respire1), whose incubation chamber was thermostatically

set at 30ºC and magnetically stirred. Freshly IRLM (1 mg/ml) were incubated in a respiration

medium containing 75 Mm NaCl, 1 mM EGTA, 10 mM NaTES, 2 mM NaH2PO4 and 1mg/ml

BSA FFA (Gonzalez‐Muniesa et al 2006). Succinate (2.5 mM) was added in order to mimic

the formation of intermediates of the citric acid cycle as occurs in vivo. Addition of ADP (0.1

mM) initiates state 3 respiration whereas state 4 is established when ADP is

phosphorylated and converted into ATP. Finally, maximal oxygen flux (state uncoupled) was

obtained by titration of the chemical uncoupler FCCP.

The mitochondrial function and coupling of the ETC was evaluated by the respiratory

control ratio (RCR) calculated according to Estabrook (Estabrook 1967). The P/O ratio was

also determined. This ratio has been defined as the amount of oxygen consumed during the

respiratory state 3, which it is the amount of oxygen used to drive ATP synthesis and proton

leakage across the mitochondrial membrane. In this context, the P/O ratio represents an

indirect measure of the efficiency of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS)

(Hinkle 2005, Roussel et al 2004).

4.1.3.8 Statistical analysis

Data are reported as mean ± S.E. Normal distribution was confirmed by two different

methods, Shapiro‐Wilk and Kolmogorov‐Smirnov. In order to determine the effects of

different treatments, repeated measures Anova followed by post‐hoc comparisons by

Dunnet´s test were carried out. The interactions between incubation periods and

treatments were analyzed by two ways ANOVA. Relationships between variables were

analyzed by calculating Pearson correlation coefficients. All statistical analysis was

performed using GraphPad Prism 5.0 software. Differences were considered as statistically

significant at P<0.05.


261

4.1.4 RESULTS

4.1.4.1 Effects of Vitamin C, Resveratrol and Lipoic Acid on ROS production in IRLM

All the antioxidants tested (VC, RSV and LA) significantly decreased superoxide (O2*‐)

production as observed in Fig.1 (P<0.05‐P<0.0001) after both 30 and 60 minutes of

incubation. However, the magnitude of these inhibitory effects was different. Thus, the

decrease induced by VC was more potent than those observed after treatment with RSV or

LA.

Interestingly, hydroperoxide (H2O2) production was affected in a different way depending

on the antioxidant analyzed (Fig. 2). Thus, our data showed that VC and RSV induced a

significant inhibition (P<0.05‐P<0.0001) in the production of this reactive specie at both

incubation periods. However, treatment with LA showed a tendency to increase H2O2

generation after both incubation periods, although this increase did not reach statistical

significance.

Figure 1 Effects of different antioxidants on mitochondrial superoxide production in isolated rat liver

mitochondria after 30 and 60 minutes of incubation. Values shown are mean ± SE of integrated areas

under curve of lucigenin‐derived chemiluminiscence per mg of protein (n=7). *P<0.05; **P<0.01;

***P<0.0001 vs control group at each time according to repeated measure Anova with Dunnet´s post‐

hoc analysis.


262

Figure 2 Effects of different antioxidants on mitochondrial hydroperoxide production in isolated rat

liver mitochondria after 30 and 60 minutes of incubation. Values shown are mean ± SE of integrated

areas under curves of luminol‐derived chemiluminiscence per mg of protein (n=7). *P<0.05; **P<0.01;


hoc analysis.

4.1.4.2 Effects of Vitamin C, Resveratrol and Lipoic Acid on mitochondrial antioxidant

enzymes

VC strongly stimulated Sod2 activity after all periods of incubation tested, being the highest

stimulatory effect after 30 minutos of treatment (197.60±35.99%; P<0.0001). RSV

significantly increased the activity of Sod2 after 30 and 60 minutes of treatment

(160±11.78%, P<0.0001 and 47.15±15.33%, P<0.01 respectively) and a significant

interaction between incubation time and treatment was observed (P<0.0001). In contrast,

LA treatment did not affect the activity of this antioxidant enzyme (Fig. 3A).


263

Figure 3 Influence of VC, RSV and LA on the activity of the main mitochondrial antioxidant enzymes:

Sod2 (A) and Gpx (B) in isolated rat liver mitochondria (n=7) after 30 and 60 minutos of incubation.

Values shown are mean ± SE. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.0001 vs control group at each time according

to repeated measure Anova with Dunnet´s post‐hoc analysis

.

Regarding the effects of these antioxidant on Gpx activity, VC treatment induced an

increase after 30 minutes (26.18±17.72%) and 60 minutes of treatment (15.70±5.76%) but

statistical differences were only observed after 60 minutes of incubation (P<0.05).

Moreover a positive correlation between H2O2 production and the activity of this enzyme

was observed (P=0.0008, r=0.8313). On the other hand, the effects of RSV on Gpx activity

were affected by the incubation time. In fact, RSV induced a significant decrease in Gpx

activity after 30 minutes of incubation (19.80±7.60%; P<0.01), although these effects


264

disappeared after 60 minutes. Finally, the treatment with LA has an inhibitory effect on the

activity of this enzyme after short incubation periods in comparison to the control

(16.48±3.27%, P<0.05) (Fig. 3B).

4.1.4.3 Effects of Vitamin C, Resveratrol and Lipoic Acid on respiratory parameters

The direct effects of these antioxidants on different parameters of mitochondrial electron

transport chain and OXPHOS were also investigated. Thus, the treatment with VC showed a

tendency to induce an increase the RCR after 60 minutes (Table 1). This increase seems to

be a consequence, at least in part, to the significant reduction observed in oxygen

consumption on respiratory state 4 (P<0.05) (Table 1).


265

Table 1 Changes on respiratory parameters after incubation of IRLM with VC, RSV and LA.

Incubation

time (min)

Control VC

30 µM

RSV

50 µM

LA

30 µM

ANOVA

30 min RCR 3.63±0.35 3.29±0.71 3.26±0.64 2.71±0.76 0.0048

n.s n.s **

State 2 28.17±4.40 23.59±9.22 23.03±8.87 29.78±10.4 0.0323

nmolO2/min/mg n.s n.s n.s

State 3 81.34±7.97 75.06±18.7 73.73±9.79 72.66±9.50 0.2787


State 4 31.37±6.24 25.02±10.6 23.88±6.55 28.89±11.1 0.0117

nmolO2/min/mg * * n.s

60 min RCR 3.11±0.39 3.41±0.33 3.16±0.38 2.16±0.64 0,0003

n.s n.s **

State 2 19.93±8.20 20.12±3.37 21.51±4.12 20.48±4.46 0.9354


State 3 71.23±7.92 70.63±10.2 69.76±8.30 55.31±4.57 0.0071

nmolO2/min/mg n.s n.s **

State 4 27.36±3.85 23.32±3.98 24.08±4.38 23.74±3.88 0.0501

nmolO2/min/mg * n.s n.s

Values shown are mean ± SE (n=6). *P<0.05; **P<0.01 vs control group at each time, according

to repeated measure Anova with Dunnet´s post‐hoc analysis. Respiratory state 2 was

established in presence of oxidazable substrates (succinate 2.5 mM plus rotenone 5µg/µl).

Respiratory state 3 was measure in presence of ADP 0.1 mM. Respiratory state 4 was

established after ADP was phosphorylated on ATP.


266

In addition, the P/O ratio was significantly reduced by VC after 30 and 60 minutes of

incubation (P<0.05) (Fig. 4A). A significant reduction in respiratory state 4 after 30 minutes

of incubation was also observed after RSV treatment (P<0.05) as well as a significant

decrease in the P/O ratio, but only at longer incubation periods (P<0.05) (Fig. 4B). Finally,

treatment of IRLM with LA induced the strongest effects on respiratory parameters in

comparison with the other two antioxidants analyzed. Thus, LA induced a significant

decreased in RCR after 30 and 60 minutes (P<0.01), which seems to be secondary to the

decrease observed on oxygen consumption in respiratory state 3 (Table 1). Furthermore, a

significant reduction in the P/O ratio was also found after treatment with this antioxidant

(P<0.05‐P<0.0001) (Fig. 4C).

Figure 4 Changes in P/O ratio after treatment with Vitamin C (A), Resveratrol (B) and Lipoic acid (LA)

at different incubation periods (n=6). Values shown are mean ± SE (n=6). *P<0.05; **P<0.01;


hoc analysis.

Chapter 4.1 Results I Capítulo 4.1 Resultados I

267

4.1.5 DISCUSSION

Antioxidants are defined as “any substance that when present at low concentrations

compared with those of an oxidizable substrate significantly delays or prevents oxidation of

that substrate” (Halliwell 1999). However, herein we have demonstrated for the first time

that not all antioxidants behave on the same way or with the same intensity, at least when

their direct actions on mitochondria are analyzed.

Vitamin C is one of the most widely used dietary supplementation due to its antioxidant

properties. The ability of VC to reduce and neutralize ROS has been widely described

(Wilson 2009). Our data showed that treatment of IRLM with VC (30 µM) induced a

significant decrease in the levels of O2*–, which was corroborated by Oliveira et al (2003)

(Oliveira et al 2003). These beneficial effects could be explained by the stimulation exerted

by this vitamin on Sod2 activity, suggesting that O2*– is rapidly converted into H2O2. In this

sense, previous studies have shown that the protective role of VC against oxidative stress is

mediated by the stimulation of major mitochondrial antioxidant enzymes (Lowes, Webster

and Galley, Devi et al 2007).

The beneficial effects of VC on oxidative damage can also be justified by its capacity to

modulate the H2O2 production, as demonstrated in several studies (Ahn, Yun and Oh 2006)

as in ours. H2O2 generation has been associated with oxygen consumption in respiratory

state 4 (Boveris and Chance 1973). In this sense, we observed a significant reduction in

H2O2 production and in oxygen consumption in state 4, suggesting that the decrease

detected in H2O2 after treatment with VC may be secondary to the reduction in oxygen

consumption in this respiratory state. Another mechanism that could explain the reduction

found in H2O2 generation after VC treatment is the increased activity of Gpx, which catalyze

the detoxification of H2O2 to H2O.

We have also investigated the effects of VC on the functionality and efficiency of the ETC.

Our data showed an increase in the RCR after 60 minutes of treatment with VC, which could

be due, at least in part, to the reduction observed in oxygen consumption in state 4.

Moreover, VC induced a significant decrease in the P/O ratio, which has been established as

a marker of the OXPHOS efficiency (Hinkle 2005). These results might suggest that VC may

have a potential positive role in the treatment of obesity by decreasing metabolic

Capítulo 4.1 Resultados I Chapter 4.1 Results I

268

efficiency. Indeed, recent investigations showed a decrease in metabolic efficiency in an

animal model of DIO supplemented with this vitamin (Campion et al 2008).

This data evidenced, that VC exerts these positive effects on mitochondrial redox state by

inducing the activity of the electron transport chain, which is supported by the increase

observed in the RCR, as found by Mandl et al (2009) (Mandl, Szarka and Banhegyi 2009).

This increase in the ETC activity gives support to findings concerning to the decrease in O2*–

levels observed in isolated mitochondria treated with VC. Furthermore, this increase in ETC

activity provides electrons to ascorbic acid in order to be transformed into dihydroascorbic

acic, as previously proposed by Madl et al (2009). In addition, several studies have reported

that VC is a natural scavenger of ROS (Arrigoni and De Tullio 2002), being able to increase

the Sod2 and Gpx expression and activity (Devi et al 2007, Yogeeta et al 2006), which, in

turn, leads to a decrease in superoxide and hydrogen peroxide production, respectively.

RSV has been reported to improve the mitochondrial function (Brookins Danz et al 2009,

Lagouge et al 2006). The capacity of this antioxidant to reduce ROS levels has been

proposed as a mechanism that could explain its protective role against situations with an

imbalance in the oxidative status (Lu et al 2008). In this sense, a reduction on O2*–

generation was observed in our study. This reduction seems to be secondary to the

increase observed in Sod2 activity, as previously reported with VC. Furthermore, different

studies have proposed that the beneficial effects of RSV against oxidative stress damage are

mediated by a specific and progressive stimulation of Sod2 (Robb et al 2008b).

Furthermore, RSV showed a very potent inhibitory action on H2O2 production. Our findings

were corroborate by Brookins Danz et al (2009) (Brookins Danz et al 2009), who observed a

decrease in basal production of H2O2 after treatment with RSV in neonatal rat ventricular

myocytes. This decrease could be explained by the reduction on respiratory state 4, in fact,

and similarly as VC, a significant decrease in H2O2 generation and in state 4 were observed.

Conversely, changes in H2O2 production could not be explained by variations in Gpx activity

in our study. In fact, our results showed a decrease in the activity of this enzyme after 30

minutos of exposure to the antioxidant; however, this effect disappeared in longer

incubation periods. Previous studies showed conflicting results regarding the action of RSV

on the activity of Gpx, suggesting that its effects depends on the tissue, dose and period of

treatment (Bujanda et al 2008, Robb et al 2008a).


269

Concerning the actions of RSV on the functionality and efficiency of the ETC, this

polyphenol did not show any effects in RCR, although a significant decrease in a P/O ratio

was found. Thus, our results suggest that main effects of RSV in IRLM are the direct and

progressive activation of Sod2 which is supported by data from Robb et al (2008) (Robb et

al 2008b, Robb et al 2008a). In addition, several investigations have proven the potent

effect of RSV to scavenger ROS, which corroborates the decreased production of both

superoxide and hydrogen peroxide species observed in our study.

LA has been defined as the "antioxidant of antioxidants" (Packer, Witt and Tritschler 1995)

because of its ability to decrease ROS production (Shen et al 2008) and to stimulate the

activity of antioxidant enzymes (Long et al 2009). Thus, investigations carried out in

mitochondria isolated from rat cardiomyocytes found a decline in the levels of O2●– after

treatment with different doses of DHLA, which is the reduced form of LA (Schonheit, Gille

and Nohl 1995). Accordingly, our data showed a decrease in the levels of O2●– after

treatment with LA, although this decrease cannot be explained by variations in Sod2

activity. On the other hand, these results could be explained by different mechanisms

associated with REDOX reactions that maintain the balance between the LA and DHLA

(Haramaki et al 1997). In fact, some research described the capacity of DHLA to neutralized

O2●–, therefore our investigation could suggest that the decrease observed in O2

●– could be

due, at least in part, by the transformation of LA into DHLA.

Despite these findings, it has also been established that LA may have pro‐oxidant effects

depending on its concentration, incubation time and the experimental model used

(Cakatay 2006). In fact, our results showed a stimulatory action of LA on H2O2 generation, at

all incubation periods tested, similarly to the data provided by Dicter et al (2002) (Dicter,

Madar and Tirosh 2002). The increased levels of H2O2 could be explained by the reduction

observed in the activity of Gpx, which, in turn, could be due to a displacement of the

GSH:GSSG balance to the oxidized form, as described by Morkunaite et al (2000)

(Morkunaite, Teplova and Saris 2000). However, we have not addressed this hypothesis.

Regarding the effects of LA on the ETC, our data revealed a significant decrease in RCR,

suggesting that this acid could uncouple the ETC. In fact, similar data were observed by

Schönheit et al (1995) (Schonheit, Gille and Nohl 1995). We consider that the uncoupling

effect of lipoic acid in electron transport chain is the strongest effect of this molecule in


270

IRLM. The data are consequently in agreement with other researches that have described

this effect of LA (Dicter, Madar and Tirosh 2002). Our data also showed a decrease in the

ratio P/O after treatment with LA corroborating previous studies (Schonheit, Gille and Nohl

1995). These findings could suggest a potential therapeutic role of LA in the treatment of

obesity. However, these results should be interpreted with caution since LA might have

pro‐oxidant and antioxidant properties in different circumstances.

In summary, VC improved mitochondrial function by decreasing ROS levels and by

increasing the activity of antioxidant enzymes and the activity of the ETC. The magnitude of

the beneficial effects of RSV was lower than those observed for VC, probably because other

factors such as sirtuins could also be involved. By contrast, treatment with LA induced an

apparently pro‐oxidant effect on IRLM. The main mechanisms involved in this pro‐oxidant

effect could be summarized as the induction of an uncoupling the ETC and the stimulation

observed in H2O2 generation, which seems to be due to the inhibition of Gpx activity.

Finally, this study demonstrated that VC, RSV and LA exerted direct effects on

mitochondrial function, although the magnitude and intensity of these effects were

significantly different. Furthermore, LA appears to exert some pro‐oxidant actions,

suggesting that not all antioxidants are equal or their effects are mediated by the same

pathways. In fact, the outcomes after incubation of mitochondria with the three

antioxidants should be carefully examined since the physical properties of the assayed

molecules are different and could affect their ability to enter the mitochondria and

therefore to affect their functionality. However, it is important to state that LA showed

quite different actions in comparison with VC and RSV even though both LA and RSV are

lipophylic molecules, suggesting that other mechanisms different from pure physical

characteristics of the compounds are involved in their effects on mitochondria. In fact, this

is not the first time that compounds with similar chemical function demonstrate differential

actions. Thus, Perez‐Matute et al (2007) demonstrated different actions on basal leptin

production between linoleic acid and its isomer conjugated linoleic acid (Perez‐Matute et

al 2007). Taking into account these findings, more in vivo studies are needed in order to


271

elucidate the beneficial effects of VC, RSV and LA on mitochondrial function and oxidative

stress associated diseases such as obesity.

ACKNOWLEDGEMENTS

The authors thank Dr. Eduardo Rial and Dra. MJ López‐Zabalza their very helpful scientific

support. We would like to acknowledge Ana Lorente for her technical assistance. This work

has been supported by Línea especial “Nutrición, Obesidad y Salud” (University of Navarra

LE/97). MP. Valdecantos has been granted a scholarship from “Instituto de Salud Carlos III”

(ISCIII) (Spanish Ministry of Health).


272

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CAPÍTULO 4.2 /CHAPTER 4.2

Erythrocyte antioxidant defenses as a potential

biomarker of liver mitochondrial status in different

oxidative conditions

Published in Biomarkers Dec;16(8):670‐8

Chapter 4.2 Results II Capítulo 4.2 Resultados II

279

4.2 ERYTHROCYTE AS A POTENTIAL BIOMARKER OF LIVER MITOCHONDRIAL

ANTIOXIDANT STATUS

Capítulo 4.2 Resultados II Chapter 4.2 Results II

280

4.2.1 ABSTRACT

The need for minimally invasive biomarkers to predict the progression of non‐alcoholic

fatty‐liver disease to non‐alcoholic steatohepatitis is a priority. Oxidative stress and

mitochondrial dysfunction contribute in this physiopathological process. The aim of this

study was to analyze the potential role of erythrocytes as surrogate biomarkers of hepatic

mitochondrial oxidative status in an animal model under different dietary oxidative

conditions. Interestingly, we found that erythrocyte antioxidant status correlated with

triglyceride content (P<0.05‐P<0.001), TBARS levels (P<0.001) and with liver mitochondrial

antioxidant levels (P<0.001). These data suggest that erythrocyte antioxidant defenses

could be used as sensitive and minimally invasive biomarkers of mitochondrial status in

diverse oxidative conditions.

Keywords: high fat diet; obesity; NASH; oxidative stress; steatosis

Abbreviations: NASH, non‐alcoholic steatohepatitis; NAFLD, non‐alcoholic fatty liver

disease; Sod2, manganese superoxide dismutase; mtGpx, mitochondrial glutathione

peroxidase; SOD, superoxide dismutase; Gpx, glutathione peroxidase; HFD, high‐fat diet;

LA, α‐lipoic acid; TG, triglyceride; TBARS; thiobarbituric acid reactive species; MDA,

malondialdehyde; mtDNA, mitochondrial DNA; GSH, reduced glutathione; GSSG, oxidized

glutathione; WAT, visceral white adipose tissue.


281

RESUMEN

Es prioritario encontrar biomarcadores mínimamente invasivos para predecir la progresión

de la enfermedad hepática no alcohólica a esteatohepatitis. El estrés oxidativo y la

disfunción mitocondrial contribuyen a este proceso fisiopatológico. El objetivo de este

estudio es valorar el papel potencial de las defensas antioxidantes eritrocitarias como

biomarcadores del estado oxidativo del compartimento hepático mitocondrial en un

modelo animal alimentado con dietas que promueven diferentes estados antioxidantes.

Por otro lado, observamos que las defensas antioxidantes eritrocitarias estaban

estrechamente correlacionadas con el contenido hepático de triglicéridos (P<0.05‐P<0.001),

los niveles de TBARS (P<0.001), así como con las defensas antioxidantes en el

compartimento hepático mitocondrial (P<0.001). Estos datos sugieren que las defensas

antioxidantes eritrocitarias podrían emplearse como biomarcadores sensibles y

mínimamente invasivos del estado antioxidante mitocondrial en el hígado bajo diferentes

situaciones del balance antioxidante/pro‐oxidante.


282

4.2.2 INTRODUCTION

Currently, the diagnosis of non alcoholic steatohepatitis (NASH) requires liver biopsy with

corresponding drawbacks of sampling and interpretation errors (Adams and Feldstein

2011). Hence, the need for minimally invasive methods to cover the whole spectrum of non

alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a priority. In fact, several investigations have focused

on diagnostic methods such as breath markers (Millonig et al 2010, Solga et al 2006), but

the results are inconclusive and further studies are needed. It is also necessary for future

research to develop less invasive biomarkers to identify patients at risk of liver disease

progression.

NAFLD is generally considered as one of the main causes of hepatic dysfunction linked to

obesity and an important manifestation of metabolic syndrome (Rector et al 2010, Cohen,

Horton and Hobbs 2011). In obese individuals, the increased supply of free fatty acids from

diet, from adipose tissue and through increased “de novo” lipogenesis all serve to promote

hepatic steatosis (Donnelly et al 2005). Moreover, visceral adipose tissue seems to play a

major role by secreting hormones and adypokines that contribure to the progression of

NAFLD to NASH (Wree et al 2011).

The role of oxidative stress as a key contributor to the transition from non‐alcoholic fatty

liver disease, usually asymptomatic, to non‐alcoholic steatohepatitis has been widely

accepted (Pessayre 2007). On the other hand, another major factor involved in the

pathophysiological evolution of NAFLD to NASH is the impairment in mitochondrial

function, which is linked with an increase of oxidative stress. (Perez‐Carreras et al 2003,

Rector et al 2010). In this sense, the mitochondrion is a major cellular site involved in

energy metabolism (Brand 2010), but it is also the main source of reactive oxygen species

(ROS). Furthermore, and in order to counterbalance the negative effects of ROS,

mitochondria also contain enzymatic antioxidant defenses, such as manganese superoxide

dismutase (Sod2) (Brunet et al 2004), mitochondrial glutathione peroxidase (mtGpx)

(Lowes and Galley 2011) and mitochondrial glutathione (Canto et al 2009). When the

balance between mitochondrial ROS generation and the antioxidants occurs, an increase in

mitochondrial oxidative stress is observed, which leads to impaired mitochondrial function

(Ozden et al 2011, Simula and De Re 2010).


283

Erythrocyte antioxidant status has been described as a biomarker of general oxidative

stress (Kalahasthi, Hirehal Raghavendra Rao and Bagalur Krishna Murthy 2006, Pavao et al

2006). In fact, several studies have used antioxidant defenses for example, superoxide

dismutase (SOD) and glutathione peroxidase (Gpx) activities as predictors in the

development of oxidative stress linked to disorders such as cancer (Monari et al 2006) or

neurodegenerative diseases (Torsdottir et al 2010). Thus, we investigated if erythrocytes

could also be potential biomarkers of antioxidant status using an animal model under

different oxidative conditions: obesity and obesity‐treated with alimentary antioxidant, α‐

lipoic acid (LA).

4.2.3 METHODS

4.2.3.1 Animals and diets

Male Wistar rats (n=40) aged six weeks were supplied from the Applied Pharmacology

Research Center (CIFA, Pamplona, Spain). Animals were housed in cages in a temperature‐

controlled room (22 ±2˚C) with a 12‐hour light‐dark cycle, fed a pelleted chow diet and

given deionised water ad libitum for an adaptation period of 5 days. After this period, rats

were assigned to four experimental groups for 8 weeks. Control (C) and CLIP (control + LA)

groups were fed a standard diet (Harlam Tekland Global Diets, USA) containing 4.6 % of

energy as a lipids per dry weight. The Obese (OB) and OLIP (obese + LA) were fed a high‐fat

diet (HFD) containing 60 % of energy as a lipids per dry weight. The diet of the CLIP and

OLIP subgroups was supplemented with α‐LA (Sigma Aldrich, USA) in a proportion of 0.25

g/100 g of diet as previously described (Prieto‐Hontoria 2009).

Body weight and food intake were recorded every 2‐3 days. At the end of the experimental

period, rats were euthanized by decapitation and blood and tissue samples were

immediately collected, frozen in liquid nitrogen and kept at ‐80 ˚C. Until analysis, all

experimental procedures were performed according to National and Institutional

Guidelines for Animal Care and Use at the University of Navarra.

4.2.3.2 Tissue homogenization procedure and mitochondrial isolation

Livers were quickly excised after sacrificing the animals and either frozen in liquid nitrogen

or placed in ice‐cold buffer (250 mM sucrose, 1 mM EDTA and 5 mM NaTES, pH=7.4). Fresh

tissue placed in buffer was used to prepare mitochondrial suspensions according to the


284

method of Rickwood et al (1987) (Rickwood, Darley‐Usmar and Wilson 1987) with slight

modifications as described elsewhere (Valdecantos et al 2010).

4.2.3.3 Erythrocyte concentrates

Erythrocyte concentrates were obtained after centrifugation in Vacutainer tubes containing

gel without additives (Vacutainer Gel SST II) and pellets were resuspended in PBS and kept

at ‐80 ºC.

4.2.3.4 Hepatic triglyceride content

To determine the hepatic triglyceride (TG) content, 150 mg of these tissues were sonicated

in a Branson 250 Sonifier (Duty cycle 40%; Output control 4; Hold Continuous) for 40

seconds in 1.5 ml of buffer (150 mM NaCl, 0,1% Triton and 10 mM Tris (pH8)) at 50ºC. After

centrifugation at 12000g for 10 min, the obtained supernatants were used to measure the

TG levels with a COBAS‐Mira analyzer (Roche Diagnostics, Switzerland) using an enzymatic

kit (Horiba ABX, USA) and a COBAS‐Mira analyzer (Roche Diagnostics, Switzerland) as

described elsewhere (Perez‐Echarri et al 2009).

4.2.3.5 Lipid peroxidation

The formation of thiobarbituric acid reactive species (TBARS) derived from the reaction

with reactive aldehydes, such as malonyldialdehyde (MDA), from the decomposition of the

unstable peroxides was spectrophotometricallyq uantified following their controlled

reaction with thiobarbituric acid. Changes in absorbance were measured in liver

homogenate with a commercial kit (Cayman Chemical, Michigan, USA) according to the

manufacturer’s instructions with slightly modifications and using a Luminoskan Ascent

spectrophotometer (Thermo Electron Corporation, USA). Results were corrected by the

amount of tissue in milligrams (mg).

4.2.3.6 Real‐time quantitative PCR

Total RNA was isolated from liver using Trizol® reagent (Invitrogen, Carlsbad, California,

USA) according to the manufacturer’s instructions. RNA concentrations were determined by

Nanodrop 1000 (Thermo Electron Corporation, Foster City, California, USA). To avoid

contamination with genomic DNA, DNA digestion and inactivation was assessed using the


285

DNAse kit (Ambion Inc, St. Austin, Texas, USA). Four micrograms of RNA were transcribed to

cDNA using the M‐MLV kit (Invitrogen) following instructions from the suppliers.

4.2.3.7 Mitochondrial oxidative damage estimation

Mitochondrial DNA (mtDNA) oxidative damage was estimated as the ratio of 80‐bp

fragment (260–339 position), compared to a 162‐bp fragment (260–421 position) of the

same sample. For real‐time PCR reactions of both fragments, we used SYBR Green qPCR

Master Mix with ROX as reference dye (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) in an ABI

PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California,

USA). The primers used were HVII‐FOR260 (5´‐GCCACTTTCCACACAGACATCATA‐3´), HVII‐

L421 (5´‐AGTGCATACCGCCAAAA GATAAA‐3´) and HVII‐C339 (5´‐

TGTTTAAGTGCTGTGGCCAGA‐3´) from Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri,

USA). Both fragments were amplified in a total volume of 10 μl with 15 ng of total DNA, 5 μl

SYBR Green Mix and 10 μM of HVII‐FOR260 and HVII‐L421 for large fragments and 2.5 μM

HVII‐FOR260 and HVII‐C339 for short fragments. The PCR conditions were 2 min at 50°C,

95°C for 10 min, 40 cycles at 95°C for 15 s and 60°C for 1 min.

4.2.3.8 Measurement of antioxidant defences

Total Sod and Gpx activities were measured in erythrocyte concentrates. Manganese

superoxide dismutase and mitochondrial Gpx activities were assessed in isolated rat liver

mitochondria. Enzymatic colorimetric activity kits (Assay Designs Inc, Michigan, USA) were

used in these determination following the manufacturer´s instruction with slight

modifications as described previously (Valdecantos et al 2010). Total, reduced (GSH) and

oxidized (GSSG) glutathione levels were measured in the same samples using a colorimetric

assay (Assay Designs Inc, Michigan, USA). The ratio between GSH and GSSG was also

calculated as a marker of antioxidant status in both erythrocytes and the hepatic

mitochondrial compartment.


The effects of diet, LA treatment or interaction were evaluated using a two way Anova test.

When interactions were significant, the effects were evaluated using one way Anova

followed by the Bonferroni post‐hoc test. Relationships between variables were analyzed

by calculating Pearson correlation coefficients as all variables followed a normal


286

distribution as verified by two different methods (Kolmogorov‐Smirnov and Shapiro‐Wilk

tests). All statistical analysis was performed using the GraphPad Prism 5.0 software

(GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Differences were considered as statistically

significant at P<0.05. Variables analyzed and presented in figures are unique and did not

require a multiple comparison correction.

4.2.4 RESULTS

4.2.4.1 Effects of high fat diet and lipoic acid on the liveR

As expected, significant increases in body weight gain, and ectopic fat accumulation in the

liver were observed. Increase in hepatic oxidative damage was also observed in obese rats

after ingestion of a high‐fat diet. These effects were significantly prevented by LA

supplementation (Table 1). Thus, LA supplementation of standard di et also diminished

body weight gain, hepatic triglyceride content and TBARS levels as compared with the

control group. Interestingly, a strong interaction between diet and treatment was observed

in the actions of LA on ectopic fat storage in the liver and in hepatic oxidative damage

(Table 1).


287

Table 1: Effects of diet and lipoic acid on obesity and oxidative injury markers.

CONTROL CLIP OBESE OLIP ANOVA 2x2 ANOVA

DIET LA D*LA

Initial body weight (g) 215±20.3 215±22.3 218±17.8 211±21.6 n.s n.s n.s 0.9206

Body weight gain (g) 177±26.3 106±20.7 264±36.9 167±38.9 <0.001 <0.001 n.s <0.001

Liver triglycerides (%) 3.6±1.05 2.5±0.65* 9.2±0.78*** 2.5±0.63*,### <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

TBARS (µmoles/mg tissue) 4.6±0.50 3.3±0.50*** 6.9±7.74*** 2.9±0.47***,### <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

mtDNA oxidative injury 0.76±0.05 0.66±0.05 0.84±0.06 0.75±0.04 <0.01 <0.001 n.s <0.001

Values are means ± SE. *P<0.05, ***P<0.001 vs control group; ###P<0.001 vs obese group according to one way Anova followed by post‐hoc multiple

comparisons correction with Bonferroni test.


288

4.2.4.2 Effects of high fat diet and lipoic acid on oxidative generated mtDNA damage

We analyzed oxidative generated mtDNA damage by q‐RT‐qPCR and observed that, as

expected, high fat intake induced an increase in oxidative injury to mtDNA (Table 1) which

was completely reversed by LA treatment. This protective effect was independent of type

of diet, as statistically significant differences between the C and CLIP group were found

(P<0.001).

4.2.4.3 Erythrocyte antioxidant defences in obesity and LA‐treated animals

The analysis of antioxidant defences in erythrocytes revealed that the consumption of a

high‐fat diet induced a significant inhibitory effect (‐51.32%) in Sod dismutase activity

(Figure 1.A), although no significant effects were observed in Gpx activity (Figure 1.B) or in

the GSH:GSSG ratio (Figure 1.C). In contrast, LA supplementation is able to reverse the

effects of obesity in Sod activity (+122.44% vs OB group) as well to induce an increase in the

activity of this enzyme when supplemented in a standard diet (+78.78%). Moreover, LA

induced an important increase in Gpx activity and also in the GSH:GSSG ratio when it was

added to the standard diet and also in the HFD regimen. Interestingly, a important

interaction (P<0.001) between diet and treatment was observed in the GSH:GSSG ratio

values (Figure 1.C). Thus, the stimulatory effects of this molecule are stronger when it is

administered with a HFD (29.93% in CLIP vs 126.63% in OLIP).


289

Figure 1: Effects of HFD and LA on erythrocyte antioxidant defences. (A) Superoxide activity (SOD), (B)

Glutathione peroxidise (Gpx) activity and (C) GSH:GSSG ratio. Values are mean±SE. *P<0.05, ***P<0.001

vs control group; ###P<0.001 vs obese group according to one way Anova followed by post‐hoc multiple

comparisons correction with Bonferroni test.

4.2.4.4 Effects on liver mitochondrial antioxidant defences in obesity and LA‐treated

animals

A statistical effect of HFD on Sod2 activity (P<0.01) was found. In fact, the activity of this

enzyme was inhibited (‐26.29%) in obese animals. Moreover, the effect of LA on this

enzyme was higher than the HFD (P<0.001) and was able to activate Sod2 when given with

a standard diet (34.35%) and also with a high‐fat diet (50.50%). As for the effect of HFD and

LA on mtGpx activity and the GSH:GSSG ratio, our data showed an important interaction

between HFD and LA (P<0.05; P<0.001 respectively). Therefore, HFD induced a strong

reduction in mtGpx (30.91%) and also in the GSH:GSSG ratio (56.19%). Moreover, LA was

able to reverse these effects on mtGpx and the GSH:GSSG ratio and increase these values to

higher levels (42.82% ; 139.88 % respectively OLIP vs C). Although, LA was also able to


290

stimulate significantly mtGpx activity (36.75%; P<0.05) and the GSH:GSSG ratio (114.32%;

P<0.001) when included in a standard diet, our data showed that these effects were

stronger with HFD suggesting that LA actions could be modulated by the fat content of the

diet.

4.2.4.5 Correlations between erythrocytes and liver mitochondrial antioxidant

defences

Erythrocyte antioxidant defences significantly correlated with the hepatic triglyceride

content (Figure 2). Additionally, and more importantly, hepatic TBARS levels (Figure 3) and

mtDNA damage (Figure 4), a robust markers of oxidative damage, were highly associated

with Sod and Gpx activities and also with the GSH:GSSG ratio in erythrocytes, which could

suggest the potential role of erythrocyte antioxidant defences as biomarkers of liver

oxidative damage. Interestingly, all antioxidant defences assessed in erythrocytes and in the

hepatic mitochondrial compartment were positively correlated (Figure 5).

Figure 2: Correlation between erythrocyte antioxidant defences and liver triglyceride content

(A) Sod activity, (B) Gpx activity, (C) GSH:GSSG ratio. r=Pearson correlation coefficient;

r2=goodness of fit.


291

Figure 3: Correlation between erythrocyte antioxidant defences and TBARS content in liver (A) Sod

activity, (B) Gpx activity, (C) GSH:GSSG ratio. r=Pearson correlation coefficient; r2=goodness of fit.

Figure 4: Correlation between erythrocyte antioxidant defences and mtDNA oxidative injury (A) Sod

activity, (B) Gpx activity, (C) GSH:GSSG ratio. r=Pearson correlation coefficient; r2=goodness of fit.


292

Figure 5: Correlation between the main antioxidant defences analyzed in erythrocytes and in

the hepatic mitochondrial compartment. (A) Superoxide activity, (B) Glutathione peroxidase

activity and (C) GSH:GSSG ratio. r=Pearson correlation coefficient; r2= goodness of fit.

4.2.5 DISCUSSION

The spectrum of NAFLD features ranges from asymptomatic steatosis to NASH and cirrhosis

(Krawczyk, Bonfrate and Portincasa 2010). In general, the prognosis for simple steatosis is

very good; however, NASH can progress to cirrhosis and hepatocellular carcinoma in 10% to

15% of patients (Rombouts and Marra 2010). Moreover, non invasive methods (e.g.,

abdominal ultrasonography) are safe ways to support a diagnosis of hepatic steatosis, but

advanced liver histopathologic findings including NASH and fibrosis cannot be identified

without performing liver biopsies (Cortez‐Pinto and Camilo 2004, Adams and Feldstein

2011). Given the positive prognosis of steatosis and the difficulty in treating NASH, it is

important to find non invasive methods to predict the progression of NAFLD to NASH based

on the pathogenesis of NAFLD/NASH. From this point of view, our study reports, for the

first time, that erythrocyte antioxidant defences are highly correlated with antioxidant

status in the hepatic mitochondrial compartment and liver oxidative damage under

different antioxidant conditions. These data highlight the possibility of evaluating the


293

oxidative balance in the hepatic mitochondrial compartment just through blood samples

instead of using liver biopsies.

NAFLD is now considered the main hepatic manifestation of obesity and metabolic

syndrome (Carmiel‐Haggai, Cederbaum and Nieto 2005, Lewis and Mohanty 2010). In fact,

our data demosnstrate that high fat feeding increased body weight gain and subsequently

induced liver steatosis. Further events in the liver include oxidative stress and the decrease

in antioxidant defenses induced by early mitochondrial dysfunction (Abdel‐Wahab et al

2002, Gambino, Musso and Cassader 2011). Thus, oxidative stress represents an imbalance

between the production and manifestation of ROS and the antioxidant defenses that are

able to readily detoxify the reactive intermediates or to repair the resulting damage

(Furukawa et al 2004, Valdecantos, Perez‐Matute and Martinez 2009, Vincent and Taylor

2006).

Disturbances in the normal redox state can cause injury in other cell components, including

lipids. Indeed, several studies have described an increase in TBARS content, a good marker

of lipid oxidative damage, in steatotic livers (Park et al 2011, Caito et al 2010). Accordingly,

in this study obese animals presented an increase in TBARS levels that was prevented by LA

treatment, suggesting that the HFD produced an increase in hepatic oxidative stress,

inducing oxidative damage in lipids.

Furthermore, oxidative damage of mitochondrial DNA has been correlated with several

diseases such as neurodegenerative disease (Cortopassi et al 1992, Michikawa et al 1999),

cancer (Brunet et al 2004, Rohan et al 2010) or diabetes (Madsen‐Bouterse et al 2010).

Moreover, mtDNA is more susceptible to oxidative injury than nuclear DNA due to its

localization near to the site of free radical generation (Ballinger et al 1999). Accordingly,

our data showed that a decrease in antioxidant defenses in the hepatic mitochondrial

compartment of obese animals was associated with enhanced mtDNA oxidative generated

damage and LA treatment is able to reverse the deleterious effect in mtDNA, corroborating

its beneficial effects on oxidative stress in liver mitochondria after the ingestion of a high‐

fat diet.

There is no established treatment for NAFLD except for weight loss and treatments that

prevent obesity and metabolic syndrome. In this context, LA exerts beneficial physiological


294

effects such as: attenuation of oxidative stress (Maritim, Sanders and Watkins 2003),

modulation of glucose metabolism (Sadi, Yilmaz and Guray 2008), prevention of body

weight gain induced by HFD (Wollin et al 2004) as well as a reduction of energy efficiency

(Prieto‐Hontoria 2009). Our results confirm that LA treatment is able to prevent body

weight gain and attenuate oxidative stress through the stimulation of antioxidant defences,

both systemic and in the hepatic mitochondrial compartment, specially the GSH:GSSG ratio,

whose role as a regulator of antioxidant status in mitochondria has been described

(Kimura, Goto and Kimura 2010, Muyderman et al 2007).

Furthermore, previous experiments have revealed that liver oxidative stress plays a central

role in several hepatic disorders (Copple, Jaeschke and Klaassen 2010). In addition, other

studies have demonstrated an association between liver disease and systemic oxidative

stress (Ljubuncic, Tanne and Bomzon 2000, Powell, Jonsson and Clouston 2010). Moreover,

the central role of mitochondrial changes and oxidative stress in the evolution of fatty‐liver

linked to obesity (Perez‐Carreras et al 2003, Rector et al 2010) suggest that mitochondrial

antioxidant status is a fine predictor of the pathological development of an important liver

complication of obesity. However, liver biopsy is necessary to assess mitochondrial

antioxidant status and consequently to predict progression of NAFLD to NASH.

Interestingly, our data showed a strong correlation between antioxidant biomarkers in

erythrocytes and the liver mitochondrial compartment under different antioxidant status

conditions and highlight the possibility of using erythrocytes as non‐invasive biomarker of

the progression of NAFL to NASH instead of liver biopsy.

4.2.6 CONCLUSIONS

In conclusion, our results show that the assessment of the activity of antioxidant defences

(such as Sod and Gpx) and the GSH:GSSG ratio in erythrocytes could be used as good

markers of the antioxidant status of the hepatic mitochondrial compartment and,

consequently, they could be good predictors of the development of non‐alcoholic fatty‐liver

disease after a high fat diet. In addition, LA treatment is able to prevent the impairment of

systemic and hepatic mitochondrial antioxidant defences induced by a high‐fat diet intake.


295

Acknowledgments

We would like to thank acknowledge Ana Lorente and Veronica Ciaurriz for their technical

assistance. We also thank Paul Miller from the Department of Modern Languages

(University of Navarra) for the English scientific revision. This work has been supported by

Línea especial “Nutrición, Obesidad y Salud” (University of Navarra LE/97) and Ministry of

Science and Innovation (AGL2006‐04716/ALI and AGL2009‐10873/ALI). MP. Valdecantos

holds a scholarship from “Instituto de Salud Carlos III” (ISCIII) (Spanish Ministry of Health).

Also CIBER and RETICS networks are gratefully credited.


296

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CAPÍTULO 4.3/CHAPTER 4.3

Lipoic acid administration prevents non‐alcoholic steatosis

linked to long term high‐fat feeding by modulating

mitochondrial function

Published in Journal of Nutritional Biochemistry (In press)

Chapter 4.3 Results III Capítulo 4.3 Resultados III

4.3 LIPOIC ACID PREVENTS NON‐ALCOHOLIC STEATOSIS

Capítulo 4.3 Resultados III Chapter 4.3 Results III

304

4.3.1 ABSTRACT

Non‐alcoholic steatosis is an important hepatic complication of obesity linked to

mitochondrial dysfunction and insulin resistance. Furthermore, lipoic acid has been

reported to have beneficial effects on mitochondrial function. In this study, we analyzed the

potential protective effect of lipoic acid supplementation against the development of non‐

alcoholic steatosis associated with a long‐term high‐fat diet feeding and the potential

mechanism of this effect. Wistar rats were fed on a standard diet (n=10), a high‐fat diet

(n=10) and a high‐fat diet supplemented with lipoic acid (n=10). A group pair‐fed to the

latter group (n=6) was also included. Lipoic acid prevented hepatic triglyceride

accumulation and liver damage in rats fed on a high‐fat diet (‐68±11.3% vs obese group),

through the modulation of genes involved in lipogenesis and mitochondrial β‐oxidation,

and be improving insulin sensitivity. Moreover, this molecule showed an inhibitory action

on electron transport chain complexes activities (P<0.01‐P<0.001) and ATP synthesis

(P<0.05), and reduced significantly energy efficiency. By contrast, lipoic acid induced an

increase in mitochondrial copy number and in Ucp2 gene expression (P<0.001 vs obese). In

summary, this investigation demonstrated the ability of lipoic acid to prevent non‐alcoholic

steatosis induced by a high‐fat intake. Finally, the novelty and importance of this study is

the finding of how lipoic acid modulates some of the mitochondrial processes involved in

energy homeostasis. The reduction in mitochondrial energy efficiency could also explain, at

least in part, the beneficial effects of lipoic acid not only in fatty liver but also in preventing

excessive body weight gain.

Keywords: mitochondrial dysfunction; high‐fat diet; oxidative‐phosphorylation; energy

efficiency; obesity; energy homeostasis; steatosis; triglyceride synthesis; insulin resistance.

Abbreviations: NASH; non alcoholic steatohepatitis; HFD, high‐fat diet; LA, α‐Lipoic acid;

ATP, adenosine triphosphate; LASY, lipoic acid synthase; AMPK, adenosine

monophosphate‐activated protein kinase; mtDNA, mitochondrial DNA; ETC, electron

transport chain; OXPHOS, oxidative‐phosphorylation.


RESUMEN

La esteatosis no alcohólica es una importante complicación de la obesidad ligada a una

disfunción mitocondrial y a la resistencia a la insulina. Por otro lado, se ha descrito que el

ácido lipoico posee efectos beneficiosos sobre la funcionalidad mitocondrial. En este

estudio se analizó el potencial papel protector de la suplementación con ácido lipoico

frente al desarrolló de esteatosis no alcohólica asociada a la ingesta de una dieta alta en

grasa y los mecanismos implicados. Para ello ratas Wistar macho fueron alimentadas con

una dieta estándar (n=10), una dieta alta en grasa (n=10) y una dieta alta en grasa

suplementada con ácido lipoico (n=10). Además, se introdujo un grupo pair‐fed respecto al

grupo suplementado con ácido lipoico (n=6). El ácido lipoico previno la acumulación de

triglicéridos en el hígado y el daño oxidativo en las dietas respecto a los animales

alimentados con una dieta alta en grasa (‐68±11.3% vs grupo obeso), a través de la

modulación de la expresión de genes implicados en la lipogénesis y la β‐oxidación

mitocondrial, y por una mejora en la sensibilidad a la insulina. Además, esta molécula

mostró un efecto inhibitorio en la actividad de los complejos de la cadena de transporte de

electrones (P<0.01‐P<0.001) y en la síntesis de ATP (P<0.05), y redujo significativamente la

eficiencia energética. Por el contrario, el ácido lipoico indujo un incremento en el número

de copias de mtDNA y en la expresión de Ucp2 (P<0.001 vs grupo obeso). En resumen, esta

investigación demuestra la capacidad del ácido lipoico para prevenir la esteatosis hepática

no alcohólica inducida por una dieta alta en grasa. Finalmente, la aportación más novedosa

e importante del presente estudio es como el ácido lipoico modula varios procesos de la

homeostasis energética mitocondrial. La disminución observada en la eficiencia energética

también puede explicar, al menos en parte, los efectos beneficiosos del ácido lipoico no

sólo en el hígado graso sino también en la prevención de una excesiva ganancia de peso.


306

4.3.2 INTRODUCTION

Fatty liver or steatosis refers to a histopathological condition in which an excessive

accumulation of lipids, primarily triglycerides, within hepatocytes occurs (Burt, Mutton and

Day 1998). This disease is generally considered as one of the main causes of hepatic

dysfunction and an important manifestation of the metabolic syndrome and obesity

(Carmiel‐Haggai, Cederbaum and Nieto 2005). Because of the crucial importance of this

organ in metabolism and homeostasis, alterations in hepatic function have an impact on

the whole organism and could be responsible for several complications derived from the

consumption of rich fat diets, including obesity.

Accumulating evidence indicates that insulin resistance (Sanyal et al 2001) and an impaired

mitochondrial function (Perez‐Carreras et al 2003, Rector et al 2010) plays a central role in

the development of non‐alcoholic steatosis. In fact, a constellation of mitochondrial

abnormalities such as: impaired mitochondrial oxidation capacity, significant mitochondrial

structural abnormalities, hypertrophy of the microsomal oxidative function, increased

activity of the cytochrome P‐450 system and generation of free oxygen radicals were

described in non‐alcoholic steatohepatitis (NASH) livers (Pessayre et al 2001, Robertson,

Leclercq and Farrell 2001). In this sense, it is well known that a high‐fat diet (HFD) cause

alterations in hepatic mitochondrial compartment (Raffaella et al 2008, Mollica et al 2009).

α‐Lipoic acid (LA) is a natural compound derived from octanoic acid. It is present in a wide

variety of plants and animals and synthesized through a reaction catalyzed by lipoic acid

synthase (LASY) within the mitochondria (Padmalayam et al 2009). Also, LA acts as a

cofactor of several mitochondrial bioenergetic enzymes (Reed 1998) and in several

processes of aerobic metabolism. Apart from its role in the mitochondria, when

supplemented in diets, LA exerts beneficial physiological effects such as: attenuation of

oxidative stress (Maritim, Sanders and Watkins 2003), overcoming of ageing decay

(McCarty, Barroso‐Aranda and Contreras 2009), modulation of glucose metabolism (Sadi,

Yilmaz and Guray 2008), prevention of body weight gain induce by HFD (Wollin et al 2004),

as well as, a reduction of energy efficiency (Prieto‐Hontoria 2009). In addition, the ability of

LA to reduce serum and tissue lipid levels has been reported by other investigators

(Timmers et al 2010, Chiu, Tsao and Yang 2009). Moreover, it has been demonstrated that

LA decreases hepatic lipogenesis, although the underlying mechanisms are not completely

understood (Bortolato, Chen and Shih 2008).


In the light of the above considerations, we suggest that LA treatment may have a

protective effect against the development of fatty liver associated with a long‐term

high‐fat diet feeding through the modulation of mitochondrial function and lipid

metabolism pathways. To test this hypothesis, we evaluated several parameters of

ectopic lipid storage in the liver, mitochondrial function and lipid metabolism in rats fed

with HFD supplemented with LA.

4.3.3 METHODS AND MATERIALS


Male Wistar rats (n=36) aged six weeks were supplied from the Applied Pharmacology

Research Center (CIFA, Pamplona, Spain). Animals were housed in cages in temperature‐


given deionised water ad libitum for an adaptation period of 5 days. After this period,

rats were assigned into 4 experimental groups for 8 weeks. The Control group (n=10),

was fed on a standard diet (4.6% w/w of lipids), commercially available (Harlam Tekland

Global Diets, USA). The obese group (OB) (n=10) was fed with ad libitum high‐fat diet

(60% w/w of lipids); the OLIP (Obese + Lipoic acid) group (n=10) was fed with ad libitum

HFD (same as Obese Group) supplemented with LA in a proportion of 0.25 g LA/100 g of

diet, as previously described (Prieto‐Hontoria 2009); the pair‐fed OLIP group (PFO) (n=6)

was fed with the same amount of HFD eaten by OLIP group but without adding LA. Body

weight and food intake were recorded every 2‐3 days. At the end of the experimental

period, rats were euthanized and blood and tissue samples were immediately collected,

frozen in liquid nitrogen and kept at ‐80˚C. All experimental procedures were performed

according to National and Institutional Guidelines for Animal Care and Use at the

University of Navarra.


Livers were quickly excised after sacrificing the animals and either frozen in liquid

nitrogen or placed in ice‐cold buffer (250 mM sucrose, 1 mM EDTA and 5 mM NaTES,

pH=7.4). Fresh tissue placed in buffer was used to prepare mitochondrial suspension

according to modified method of Rickwood et al (1987) (Rickwood, Darley‐Usmar and

Wilson 1987) with slight modifications as previously described by Valdecantos et al

(2010) (Valdecantos et al 2010).


308

4.3.3.3 Blood samples and biochemical parameters

Blood was drawn into Vacutainer tubes containing gel without additives (Vacutainer Gel

SST II). Serum samples were prepared after centrifugation for 15 min at 2200 g at 4˚C,

supernatant was collected, immediately frozen and kept at ‐80˚C. Transaminases serum

levels were determined using a COBAS‐Mira analyzer (Roche Diagnostics, Switzerland).

Serum insulin levels were measured by ELISA for rat/ mouse Insulin ELISA kit (Linco, St.

Charles,MI, USA). Serum glucose levels were assayed using a Cobas Mira Autoanalyzer

(Roche Diagnostic, Basel, Swiss), as previously described (Perez‐Matute et al 2007).


To determine the hepatic triglyceride (TG) content, 150 mg of these tissues were

sonicated in a Branson Sonifier 250 equipment (Duty cycle 40%; Output control 4; Hold

Continuous) for 40 seconds in 1.5 ml of buffer (150 mM NaCl, 0,1% Triton and 10 mM

Tris (pH 8)) at 50˚C. After centrifugation at 12000g for 10 min, the obtained supernatant

was used to measure the TG levels using a COBAS‐Mira analyzer (Roche Diagnostics,

Switzerland) as described elsewhere (Perez‐Echarri et al 2009).

4.3.3.5 Morphological evaluation

For histopathological analysis, liver specimens fixed in 4% of paraformaldehyde

were embedded in paraffin, sliced 10 µm thicknesses, and stained with hematoxylin

and eosin staining for detection of hepatic steatosis, inflammation and

morphological changes following routine procedures. Moreover, liver slices were

stained with Sirius Red staining to determine collagen fibers. The pathological

changes were assessed and photographed under a Nikon eclipse E800 microscope

(Nikon Corporation, Japan).

4.3.3.6 Real‐time quantitative PCR

Total RNA was isolated from liver using Trizol® reagent (Invitrogen, USA) and according

to the manufacturer’s instructions. RNA concentrations were determined by Nanodrop

1000 (Nanodrop, USA). To avoid contamination with genomic DNA, DNA digestion and

inactivation were assessed using the DNAse kit (Ambion Inc, USA). Four micrograms of

RNA were reverse transcribed to cDNA using the M‐MLV kit (Invitrogen, USA) following

instructions from the suppliers.


Fourteen genes were analyzed (Table 1) using predesigned TaqMan® Assays‐on‐ demand

fixed on a low density array microplates (Applied Byosistems, USA). The reaction

conditions were set up according to the manufacturer's instructions. Amplification and

detection of specific products were performed using the ABI PRISM 7900HT Sequence

Detection System (Applied Biosystems, USA). All the samples were analyzed in duplicate.

CT values were generated by the ABI software. Finally, the relative expression levels of

each gene were calculated with 2‐∆∆CT method, previously reported (Perez‐Matute et al

2009). Hepatic expression levels of each gene were normalized by β‐Actin. The ratio

between mitochondrial encoded gen (Mtco2) and nuclear endogenous gene (18s) was

used to calculate the mitochondrial copy number.


310

Table 1: Gene name and GenBank accession number used in RT‐qPCR

Gen symbol

GenBank number

Gene name Gene function

Atp5c1 NM_053825.1 ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, gamma polypeptide 1

ATP synthesis

Ucp2 NM_019354.2 Uncoupling protein 2 Energy expenditure

Srebp1 XM_213329.5 Sterol regulatory element binding transcription factor 1

Lipogenesis (regulation)

Dgat2 NM_001012345.1 Diacylglycerol O‐acyltransferase homolog 2

Triglyceride synthesis

Acadl NM_012819.1 Acyl‐Coenzyme A dehydrogenase, long‐chain

Mitochondrial β‐oxidation

Acox1 NM_017340.2 Acyl‐Coenzyme A oxidase 1, palmitoyl Peroxisomal β‐oxidation

Cpt1 NM_031559.2 Carnitine palmitoyltransferase 1a Mitochondrial β‐oxidation

Ppara NM_013196.1 Peroxisome proliferator activated receptor alpha ( Pparα)

Lipid metabolism (regulation)

Pparg NM_013124.3 Peroxisome proliferator‐activated receptor gamma (Pparγ)

Lipid metabolism (regulation)

Ppargc1a NM_031347.1 Peroxisome proliferator‐activated receptor gamma, coactivator 1 alpha (Pgc‐1α)

Mitochondrial function (regulation)

Ppargc1b NM_176075.2 Peroxisome proliferator‐activated receptor gamma, coactivator 1 beta (Pgc‐1β)

Mitochondrial function (regulation)

Mtco2 MIM_516040 Cytochrome c oxidase subunit 2 Mitochondrial encoded gen

4.3.3.7 Complex I, Complex II+III, succinate dehydrogenase activities

Assays of the activities of these enzymes were carried out in frozen isolated

mitochondria using a kinetic method in a Multiskan Spectrum spectrophotometer

(Thermo Electron Corporation, USA), through standardized reproducible methods as

described elsewhere (Aleardi et al 2005, Benard et al 2006). All activities were

expressed in nmoles per minute and per milligram. Activity measurements were

performed for both complexes using 50 µg of mitochondrial protein.


4.3.3.8 Complex IV activity and ATP synthase activity

Complex IV and ATP synthase activities were measured in frozen isolated rat liver

mitochondria (25 µg and 75 µg of mitochondrial protein respectively) with a

MitoProfile®Rapid Microplate assay kits according to the manufacturer´s instructions

(Cat. nº MS447 and MS541, respectively. MitoScience, USA). Complex IV and ATP

synthase were immunocaptured within the wells of microplates, and the enzyme activity

was measured by a kinetic colorimetric assay and activities were determined as

previously described (Terni et al 2008, Liu et al 2009).

4.3.3.9 Citrate synthase activity

Citrate synthase activity were measured in frozen isolated mitochondria and in whole

liver homogenate through the monitoring of the reduction of 5,5‐dithiobis (2‐

nitrobenzoic acid) (DTNB) by citrate synthase at 412 nm was followed in coupled

reaction with coenzyme A and oxaloacetate. A reaction mixture of 20 mM HEPES, 0.4

mM of acetyl‐coenzime A, 0.5 mM of oxaloacetate and 0.1 mM of DTNB, the reaction

was initiated by the addition of isolated mitochondria (50 µg). At once, the natural

oxidation of DTNB was measured in the same experimental conditions without

oxaloacetate as a substrate of citrate synthase. This ratio of oxidation was subtracted to

all samples (Benard et al 2006). The ratio between citrate synthase activity in whole

tissue and in isolated mitochondria was used to evaluate mitochondrial protein mass as

described previously by Raffaella et al (2008) (Raffaella et al 2008).

4.3.3.10 Liver mitochondrial ATP content

ATP was determined by the firefly luciferin‐luciferase assay system accordingly to the

method of Lemasters et al (1976) (Lemasters and Hackenbrock 1976). Firstly, we extract

the ATP from mitochondrial matrix according with a protocol (Dorta et al 2005),

previously described by Dorta et al (2005) with minor modifications. Bioluminiscence

was measured in the supernatant with a Proteinkinase sensitive assay kit (Proteinkinase,

Biaffin GmbH & Co KG, Germany), according to the manufacturer´s instructions with

slight modifications and using a Luminoskan Ascent (Thermo Electron Corporation, USA).


Data are reported as mean ± S.E. Normal distribution was assessed by two different test,

Shapiro‐Wilk and Kolmogorov‐Smirnov. In order to determine the effects of LA


312

treatment, one way Anova or Kruskal‐Wallis followed by a Bonferroni or Dunns test

respectively were carried out. The P values represented in figures and tables

corresponded to pos‐hoc test. The P values of Anova or Kruskal‐Wallis test appear in

separate column in table and also in the right‐up corner of the figures. Relationships

between variables were analyzed by calculating Pearson correlation coefficients. All

statistical analyses were performed using the GraphPad Prism 5.0 software (GraphPad

Software Inc., San Diego, USA) and SPSS 15.0 software (SPSS Inc, Chicago, USA).

Differences were considered as statistically significant at P<0.05. Variables analyzed and

presented in figures are unique and not required a multiple comparison correction.

4.3.4 RESULTS

4.3.4.1 Effects of LA on body and liver weights and energy efficiency

As expected, an increase in body weight (P<0.001) was observed in rats fed a HFD.

Interestingly, this increase was significantly prevented by LA treatment (P<0.001).

Although no differences between experimental groups were observed in livers weight,

expressed as a percentage of total body weight (Table 2). Energy intake was measured in

order to find out if the differences in body weight gain could be related to differences in

food intake. In this sense, HFD fed rats showed an increase in their calorie intake

(+43±6% vs control group; P<0.001), which was also reduced by LA treatment (‐17±4% vs

obese group; P<0.001). Changes in energy efficiency, calculated as a ratio between body

weight gain and calorie intake, was not observed in the obese group. Furthermore, LA

induced a significant decrease in energy efficiency in the OLIP group in contrast with the

obese group as well as with the PFO group, suggesting that the prevention in body

weight gain could be due, at least in part, to a reduction in energy efficiency and it is not

secondary to calorie restriction (P<0.01 OLIP vs PFO) (Table 2).


Table 2: Body, liver and WAT weights, biochemical markers, calorie intake and feed

efficiency in lean and obese (high‐fat fed) rats.

CONTROL OBESE OLIP PFO ANOVA

n=10 n=10 n=10 n=6

Final body weight (g) 391.8±12.21 482.0±13.73*** 363.7±14.32###, a 423.2±4.50* <0.001

Liver/body weight (%) 2.48±0.162 2.13±0.101 2.59±0.167 2.13±0.105 0.0386

WAT/body weight (%) 7.2±0.39 13.3±0.58*** 7.2±0.38###,b 9.4±0.39##,* <0.001

Calorie intake (Kcal/day) 69.9±0.68 99.8±1.41*** 83.4±0.99### 81.8±1.19### <0.001

Energy efficiency (g/Kcal*100) 4.2±0.19 4.9±0.11 3.2±0.22##,**, b 4.3±0.19 <0.001

Insulin (ng/ml) 1.1±0.13 2.1±0.16*** 1.0±0.10###,a 1.5±0.04# <0.001

HOMA index 5.9±0.67 13.2±1.37*** 6.5±0.74###,a 10.3±0.75# <0.001

ALT (U/l) 45.1±2.63 60.4±5.37** 36.4±2.82### 39.1±1.84### <0.001

AST (U/l) 136.5±7.42 164.8±4.92** 110.6±4.95##,a 155.8±7.968 0.0022

Values are means ± SE. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01,

###P<0.001 vs obese group; aP<0.05, bP<0.01 vs PFO group according to post‐hoc multiple

comparisons by Bonferroni or Dunns test. The P value of one way Anova or Kruskal‐Wallis

appear in right column.

4.3.4.2 Effects of HFD and LA on glucose and insulin serum levels

Non‐significant changes were observed in serum glucose levels (data not shown) after

LA treatment in comparison with the obese group. In contrast, LA was able to reverse

the effects of HFD in insulin plasma levels (P<0.001). However, caloric restriction

induced also a significant reduction (P<0.05) of insulin plasma levels in comparison with

obese animals but not completely reverse the effects of HFD (Table 2). Insulin sensitivity

was analyzed by measuring the homeostatic model assessment (HOMA) index. As found

in table 2, our data revealed that HOMA index was significantly increase in obese rats

(P<0.001) and LA treatment was able to reduce this index to control values. Moreover,


314

caloric restriction partially reverses the effects if HFD on insulin sensitivity, but the effect

was significantly lower (P<0.01) than under LA supplementation.

4.3.4.3 Effects of LA on hepatic triglyceride content and liver transaminases serum

levels

HFD produced a very significant increase (P<0.001) on hepatic triglyceride content in

liver compared with control rats (Fig.1). Calorie restriction alone was able to reduced

this increase (‐38±16.3% vs obese group), but LA treatment induced a strongest effect (‐

68±11.3% vs obese group, P<0.001), reversing completely the effects of HFD on the

trygliceride content of the liver (Fig.1.). These data suggested that LA could induced

other mechanism to prevent ectopic fat accumulation. Furthermore, HFD induced a

significant increase (P<0.01) in serum levels of ALT and AST, and this increase was

completely reversed by LA treatment and only partially by calorie restriction, ALT serum

levels were reduced but AST serum levels did not change significantly (Table 2).

Figure 1 Changes in hepatic tryglyceryde content induced by HFD and LA treatment.

Values are mean ± SE. ***P<0.001 vs control group; ###P<0.001 vs obese group; cP<0.001 vs

PFO group according to post‐hoc multiple comparisons by Bonferroni or Dunns test. The P

value of one way Anova or Kruskal‐Wallis appear in up corner.


4.3.4.4 Effects of LA in liver morphology

As revealed by a histological study, rats fed with a HFD developed macro‐ and

microvesicular steatosis with nuclear displacement, which appears to be reversed by LA

treatment. A micro‐steatosis without nuclear displacement was observed in the PFO

group. On the other hand, inflammatory infiltrates and higher macrophage presence

were observed in obese rats, but not in OLIP and PFO rats (Fig.1A). On the other hand,

an increase in activate stellate and Kupfer cells in livers from obese animals were

detected. Moreover, Sirius Red staining revealed a thickening of vascular walls in obese

and PFO animals, which was completely overturned by LA treatment (Fig.1B).Moreover,

in obese animals an increase of collagen fibers within the hepatocytes was also observed

(Fig.1B).


B

20X

40X

2

3

4

5

6

7

8

9

10

12

10X

1

CVCV

CV

CV CV

CV

CV

CV CV

CV

CVCV

C

CV

CV

C

CV

C

SDCV

C

CV

CV SD

11

CONTROL OBESE PFOOLIP


321

Figure 2 Effects of HFD and LA treatment in liver histopathology. (A) Representative

images of H&E‐stained liver sections from different experimental groups; high‐fat‐fed rats

displayed macro (MV) and microvesicular (µV) steatosis with nuclear displacement (Picture

6) and inflammatory infiltrate extended pericellularly in obese rats (Picture 5 lower right

inset). Moreover, increase the presence of active Kupfer (KC) and stellate cells (SC) and

focal hepatocyte necrosis, which were engulfed by macrophages (Picture 6 lower right

inset) increased of diploid hepatocytes (DPC) (Picture 6). PFO rat displayed microvesicular

(µV) steatosis without disturbance of nucleus (Picture 12). (B) Red Sirius staining for

collagen shows a thickening of vascular walls of central veins (CV) and in the space of Disse

(SD) in obese animals (Picture4 and 6). Moreover, an increase in collagen fibers (C) in

hepatic section was also observed in obese group (Picture 11).Thickening of vascular walls

was also observed in PFO rats (Picture 10 and 12).

4.3.4.5 Effects of LA on mRNA levels of several genes involved in lipogenesis, β‐

oxidation, PPARs and PGCs signaling pathways

In order to explore the potential mechanisms involved in the aforementioned effects of

LA on hepatic triglyceride content, the expression of several key enzymes and nuclear

factors involved in lipogenesis and β‐oxidation were evaluated.

A significant increase in Srebp1 (P<0.001) and Dgat2 (P<0.01) mRNA levels were

observed in the obese group in comparison with the control animals. LA was able to

overturn this effect partially (Table 3). Moreover, calorie restriction induced the same

reduction in Srebp1 as LA treatment, although, the reduction induced on the expression

of Dgat2 was smaller than the induced by LA (P<0.05) suggesting that LA is able to

stimulate the expression of this gene by a different mechanism other than calorie

restriction. Interestingly this value was strongly correlated with hepatic triglyceride

content (P<0.001; r=0.6961) (data not shown).


322

Table 3: Effects of LA on mRNA levels of several genes involved in liver lipogenesis, β‐

oxidation, Ppars and PGCs pathway


n=10 n=10 n=10 n=6

LIPOGENESIS

Srebp 1.00±0.107 2.50±0.274*** 1.65±0.138#,* 1.72±0.194 0.0002

Dgat2 1.00±0.088 1.51±0.152** 0.89±0.067###, a 1.31±0.0866 0.0008

Β‐OXIDATION

Cpt1 1.00±0.083 0.423±0.075*** 0.992±0.090### 0.843±0.080# 0.0003

Acadl 1.00±0.071 0.69±0.091* 1.28±0.047###, a 0.78±0.029 0.001

Acox1 1.00±0.015 0.36±0.067*** 0.93±0.065###,b 0.62±0.048#,* <0.001

Ppars PATHWAY

Ppar‐α 1.00±0.028 0.62±0.076* 1.85±0.186###,**, a 1.18±0.117# <0.001

Pparγ 1.00±0.044 1.16±0.063 1.95±0.204##,b 1.22±0.075 <0.001

PGCs PATHWAY

Pgc‐1α 1.00±0.029 0.22±0.0.49*** 0.56±0.027##,** 0.47±0.07** 0.0004

Pgc‐1β 1.00±0.038 0.47±0.063*** 1.42±0.111###,c,** 0.82±0.059 <0.001

UNCOUPLING PROTEINS

Ucp2 1.00±0.038 0.66±0.073** 1.13±0.052###,c 0.83±0.035 0.0064

Values are means±SE. *P<0.05, ***P<0.01, ***P<0.001 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01,

###P<0.001 vs obese group; aP<0.05 vs PFO group according to post‐hoc multiple


appear in right column. Gene expression is expressed as fold changes (2‐∆∆CT) compared to

the control group, which was considered as 1.


323

As expected, rats fed with a HFD showed a marked decrease in Cpt1 (P<0.001), Acadl

(P<0.001) and Acox1 (P<0.05) gene expression, all of them involved in mitochondrial and

peroxisomal β‐oxidation. Similarly as what was observed with lipogenic genes, LA was

able to reverse these effects. Moreover, the effects of LA on Acadl and Acox1 expression

seem to be direct (P<0.05 vs PFO) (Table 3). This values were negatively correlated with

the hepatic triglyceride content (Acadl P=0.0003; r=‐0.6278 and Acox1 P<0.001; r=‐

0.6988) (data not shown).

Furthermore, feeding a HFD induced a significant decrease (P<0.01) in the expression of

Pparα, however, it did not modify the pattern of expression of Pparγ. Nevertheless, LA

treatment induced a significant increase in the expression of Pparα (+86.5%, P<0.001)

and Pparγ (+125.6%, P<0.01), independently of calorie restriction. On the other hand,

HFD produced a significant reduction of Pgc1α (‐76.2%, P<0.001) and Pgc1β (‐45.6%,

P<0.05) gene expression, while LA was able to significantly increase (P<0.01‐P<0.05 vs

OB) the expression of these genes (Table 3). Interestingly, LA treatment induced a

stronger increase (+140.3% vs obese group) than calorie restriction (+46.4% vs obese

group) in Pgc1β expression, this data suggested that LA would be stimulating an

alternative mechanism to regulate the expression of this transcription factor.

4.3.4.6 Effects of LA on several key enzymes of citric acid cycle

The ingestion of a HFD induced a significant impairment (P<0.001) in the activity of

citrate synthase and succinate dehydrogenase in hepatic isolated mitochondria.

Nevertheless, rats fed with a HFD supplemented with LA increased the activity of both

enzymes (P<0.01 and P<0.001 respectively) and these stimulatory effects were

independent of the calorie restriction, suggesting a direct role of LA on citric acid cycle

(Fig.3).


324

Figure 3: Effects of HFD and LA on activities of citrate synthase (A) and succinate

dehydrogenase (B). Values are mean±SE. ***P<0.001 vs control group; ##P<0.01 vs obese

group; aP<0.05 vs PFO group according to post‐hoc multiple comparisons by Bonferroni or

Dunns test. The P value of one way Anova or Kruskal‐Wallis appear in up corner.

4.3.4.7 Effects of LA on OXPHOS activity on liver mitochondria

LA treatment induced a strong inhibitory effect in the activity (‐54.2%, P<0.001 vs

control) of Complex I (Fig.4A) despite consuming a high fat diet. Moreover, the statistical

differences between OLIP and PFO group (P<0.001) could suggest that this inhibitory

effect was independent of the reduction in food intake. On the other hand, HFD induced

a stimulatory effect in the activity of Complex II+III (Fig.4B) (+92.2%, P<0.001) and

Complex IV (Fig.4C) (+103.2 %, P<0.01) of electron transport chain, being these effects

reversed by LA treatment. Moreover, the reduction observed after LA treatment seems

to be direct and not secondary to calorie restriction as suggested from the statistical

differences observed between OLIP and PFO group in Complex II+III (P<0.01) and also in

Complex IV (P<0.05) activities.


325

Figure 4 Activities of electron transport chain complexes. (A) Complex I; (B) Complex II+III;

(C) Complex IV. Values are mean±SE. *P<0.05, **P<0.01, vs control group; ###P<0.001 vs

obese group; aP<0.05, bP<0.01 vs PFO group according to post‐hoc multiple comparisons by

Bonferroni or Dunns test. The P value of one way Anova or Kruskal‐Wallis appear in up

corner.

4.3.4.8 Actions of LA on ATP production and mitochondrial bioenergetics

Supplementation with LA induced a significant decrease in the activity (‐68.1%, P<0.001

vs obese group) and expression of ATP synthase (P<0.01) (Fig.5A and 5B). Furthermore,

LA treatment was able to directly reduce ATP production (‐31.7%, P<0.05) (Fig.5C). In

fact, this outcome was a direct effect of LA and not secondary to caloric restriction

(P<0.05 vs PFO). Interestingly, ATP production was positively correlated to energy

efficiency (Fig.5D). Finally, HFD induced a significant decrease in mRNA expression of

Ucp2 (‐39.3%;P<0.05) that was significantly reversed by LA treatment (+189.5%;

P<0.001). This finding appears as a direct effect of LA and not secondary to energy

restriction (P<0.05 vs PFO) (Table 3).


326

Figure 5 Changes in ATP synthase activity (A), mRNA levels of ATP5c1 (B), mitochondrial

ATP levels (C) and correlation between liver mitochondrial ATP levels and metabolic

efficiency (D). Values are mean±SE. ***P<0.001, vs control group; #P<0.05, ##P<0.01,



appear in up corner. r=Pearson correlation coefficient. mRNA level are expressed as fold

changes (2‐∆∆CT) compared to control group considered as 1.

4.3.4.9 Changes in mitochondrial copy number and in mitochondrial mass

The ingestion of HFD induced a reduction in mitochondrial copy number (0.39±0.21 vs

1.0±0.45 in control group; P<0.05), although it stimulated a highly significant increase in

mitochondrial mass (50.4±5.51 vs 35.1±5.52 mg mitochondria protein/g of tissue;

P<0.001). Furthermore, LA treatment was able to reverse the effects of HFD in

mitochondrial copy number (1.57±0.68) and reduced the mitochondrial protein mass as

compared to obese group (40.6±3.99 vs 50.4±5.51 mg mitochondria protein/g of tissue;

P<0.05). The statistical differences (P<0.01) observed between mtDNA levels in OLIP

(1.57±0.68) and PFO group (0.69±0.31) and also in values of mitochondrial mass (P<0.05;


327

52.6±14.06 mg/g of tissue), suggesting that these effects of lipoic acid are not secondary

to a variation in energy intake.

4.3.5 DISCUSSION

In the present study, we have found that LA prevents ectopic fat storage in the liver when

induced by a long term high‐fat feeding through the modulation of mitochondrial

bioenergetics and lipid metabolism. In addition, LA treatment improved systemic insulin

sensitivity and partially reversed the enhancement of insulin resistance induced by a high

fat diet.

In this context, Park et al (2008) described that LA is able to prevent ectopic fat storage in

the liver of rats fed with a HFD and attributed this effect to a decrease in Srebp1 expression

through the regulation of AMPK (Park et al 2008). In agreement with this study, the

histological and biochemical analysis of our samples showed the same effects of LA in

triglyceride content, although in the genetic analysis, we observed that the effect of lipoic

acid treatment in Srebp1 mRNA levels could be secondary to calorie restriction. In order to

shed some light into the mechanisms of these physiological impairments, the expression

levels of several genes involved in lipogenesis and β‐oxidation were measured, such as:

Dgat2, an enzyme responsible for the final step in triacylglycerol synthesis (Yu et al 2005)

and involved in the development of hepatic steatosis (Millar et al 2006). Interestingly,

lipoic acid inhibited, independently from calorie restriction, the expression of this gene,

which could contribute to explain, at least in part, the lower triglyceride accumulation in

the liver of these animals as indicated by the correlation found between Dgat2 mRNA levels

and hepatic triglyceride content. These data suggested that Dgat2, rather than Srebp1, is a

potential target of LA in the liver under our experimental conditions.

Other mechanisms that could explain the development of fatty liver is the impairment of

mitochondrial β‐oxidation (Browning and Horton 2004). Indeed, in the present study and

according to previous investigations (Perez‐Echarri et al 2009), genes involved in

mitochondrial β‐oxidation were down‐regulated in high‐fat fed rats. Our data showed, for

the first time, that LA treatment reversed completely this inhibition of HFD on Acox1 and

Acadl. Furthermore, lipoic acid induced an overexpression of Acadl gene, an enzyme with a

key role in the regulation of mitochondrial β‐oxidation (Hirschey et al 2010) and in the

development of hepatic steatosis (Zhang et al 2007). Thus, we proposed that another


328

potential mechanism that could explain the beneficial effects of LA on hepatic triglyceride

content is the genetic modulation of β‐oxidation, mainly through the regulation of Acadl

gene expression. Indeed, Acadl is a specific target of Pparα (Mandard, Muller and Kersten

2004), a key transcriptional factor involved in fatty acid metabolism that is able to decrease

fat accumulation by increasing fatty acid degradation (Reddy and Rao 2006). Supporting

this theory, our results and those from other groups (Butler, Hagen and Moreau 2009,

McCarty, Barroso‐Aranda and Contreras 2009) demonstrate that LA treatment is able to

increase the expression of Pparα. In addition, it is important to note the emerging and

pivotal role of Pgc1β in the prevention of hepatic steatosis (Sonoda et al 2007), as well as

its ability to regulate transcriptional activity of Pparα (Meirhaeghe et al 2003). Thus, and

based on the direct and stimulatory effects on Pgc1β mRNA levels observed after LA

treatment, we suggest that there might be an association between the effects of LA on Pgc‐

1β, Pparα and Acadl in liver.

Besides the accumulation of triglyceride within hepatocytes, other mechanisms are

involved in the development of steatosis. In fact, Day et al (2002) proposed the “two hits”

hypothesis which suggested the central role of insulin resistance and mitochondrial

dysfunction in the evolution of simple steatosis to non alcoholic steatohepatitis (NASH)

(Day 2002a). In fact, the beneficial effects of LA treatment in type II diabetes have been

widely described in several studies (de Oliveira et al 2011, Henriksen, Diamond‐Stanic and

Marchionne 2010, Poh and Goh 2009). Taking into account this information, we measured

the effects of HFD and LA treatment on insulin sensitivity and mitochondrial function,

showing an important improvement of insulin sensitivity after LA treatment, measured by

HOMA index. Following this line, our data showed that LA is able to reverse the effect of

long term high‐fat feeding on Pgc1β gene expression and, even, to stimulate further this

gene, without influence of calorie restriction. Some studies highlight the ability of Pgc1β to

modulate similar pathways to Pgc1α, such as mitochondrial energy homeostasis with the

exception of hepatic gluconeogenesis (Lin et al 2003). Furthermore, Hernández et al (2008)

suggested that Pgc1β have the ability to modulate the insulin resistance through lipolysis,

lipogenesis and mitochondrial biogenesis in the liver (Hernandez and Lin 2009). Therefore,

our data suggested that the effects of LA on Pgc1β could modulate, at least in part, the

preventive effects of this antioxidant on insulin resistance and fatty liver observed in our

study.


329

The second “hit” proposed by Day et al in the progress of NASH is the development of

mitochondrial dysfunction in the liver (Day 2002b). In order to analyze the effects of HFD

and LA in this hit, we studied different parameters of mitochondrial function. Firstly, we

analyzed the effects of HFD and LA supplementation on the activity of the electron

transport chain (ETC). Indeed, our results demonstrated for the first time that LA reduced

the activity of the main complexes of the electron transport chain in the liver, which, in

turn, leads to a lower efficiency of oxidative phosphorylation (OXPHOS) and therefore,

lowers ATP production. These results contrast with the increase observed in the activity of

Krebs cycle, because this enhancement should increase the electron flow within the

respiratory chain. In fact, the stimulatory effects of LA in the activity of citric acid cycle were

also described in other studies (Sudheesh et al 2009, Sudheesh et al 2010). However, we

suggest that the reduction in energy efficiency could be a compensatory mechanism to

combat the excess of energy provided by the high‐fat diet through the Krebs cycle. In fact,

our data evidence that this reduction in ATP synthesis after LA treatment was strongly

correlated with a decrease in body weight gain and total energy efficiency despite a high‐fat

diet. These associations confirm previous studies where a reduction in energy efficiency

after LA treatment was also demonstrated (Prieto‐Hontoria 2009, Luz, Zemdegs and Amaral

2009). Interestingly, these changes in mitochondrial function were accompanied with an

increase in mitochondrial copy number and a decrease in mitochondrial protein mass.

Several authors associated these parameters with morphological and functional changes in

mitochondrial compartment, mainly characterized by more number and more functional

mitochondrion (Mollica et al 2009, Raffaella et al 2008). Furthermore, the decrease in the

activity of electron transport chain could produce an increase in mitochondrial membrane

potential and an up‐regulation of the expression levels of uncoupling proteins genes, such

as Ucp2 gene, mainly expressed in liver and this could, therefore, contributing to dissipate

this membrane potential and impairing energy production (Dlaskova, Clarke and Porter

2010, Ricquier 2005, Margareto et al 2001). In fact, an increase of Ucp2 gene expression

after lipoic acid supplementation was found. This incresase could be related with the

stimulation of Ppar‐α showed in this study, in accordance with Pecqueur et al (Pecqueur et

al 2001). Consequently, it can be hypothesized that this increase in Ucp2 mRNA levels could

also contribute to the reduction observed in energy efficiency as well as in body weight in

rats fed a high fat diet supplemented with LA. Furthermore, recent data have shown the


330

ability of LA to induce an uncoupling effect between electron transport chain and ATP

synthesis in isolated rat liver mitochondria (Valdecantos et al 2010).

Following the study of the mitochondrial function and energy homeostasis, Pgc1α (Rodgers

et al 2008, Gerhart‐Hines et al 2007) and Pgc1β (Finck and Kelly 2006, Sonoda et al 2007)

were analyzed in this study. Regarding to the first gene, some studies described that LA is

able to stimulate the expression of Pgc1α in different tissues, such as skeletal muscle

(Wang et al 2010) or hepatocytes (McCarty, Barroso‐Aranda and Contreras 2009). A

stimulatory effect of LA on Pgc1α in the liver of rats fed with a high‐fat diet was observed,

although this effect seems to be secondary to caloric restriction, since no significant

differences were found between the OLIP and PFO groups. On the other hand, the

stimulatory effect of LA on Pgc1β gene expression, independently of food restriction

suggests that this transcription factor, instead of Pgc‐1α, is a direct target of LA in the liver.

In fact, different investigations established the key role of Pgc1β in the transcriptional

control of mitochondrial metabolism and energy homeostasis (Shao et al 2010, Vianna et al

2006). Moreover, a higher ability of Pgc1β in comparison with Pgc1α to regulate

mitochondrial function has been proposed in several studies (Shao et al 2010, Vianna et al

2006), suggesting that LA actions on Pgc1β and not on Pgc1α could contribute, to some

extent, to the energy dissipation observed in liver mitochondria after LA treatment. In fact,

the current results demonstrate that LA was able to prevent the effects of high‐fat diet

ingestion in other metabolic parameters such as body weight gain and fat accumulation,

explained partially by a reduction in calorie intake. Kim et al (2004) (Kim et al 2004)

described the ability of LA to diminish food intake by suppression of hypothalamic AMPK

cascade. Furthermore, it was confirmed that LA treatment is able to reduce energy

efficiency to lower levels than control group as described previously by us and other

authors (Kim and Lee 2005, Prieto‐Hontoria 2009).

Other important component of liver injury is the occurrence of inflammation and

fibrogenesis processes in the liver. Recently, Min et al (2010) described the beneficial

effects of LA treatment (100 mg/kg) on liver fibrosis in an animal model of bile duct ligation

through the activation of plasminogen activation inhibitor (PAI‐1) that could be mediated

by JNK and ERK pathway (Min et al 2010). Moreover, Foo et al (2011) observed that

treatment of cell cultures of hepatic stellate cells (HSC‐T6) with DHLA (6, 25 and 50 µM)

induced an inhibition of activation of these cells, which could be also induced through the

stimulation of JNK and ERK (Foo et al 2011). According to these studies our histological


331

analysis showed that LA treatment could be prevent inflammation in the liver by the

inactivation of inflammatory cells. Furthermore, LA also prevents the increase of liver

fibrosis induced by high fat feeding.

In summary, this investigation demonstrated the ability of lipoic acid to prevent non‐

alcoholic steatosis induced by a HFD; in three different areas. LA regulated the ectopic fat

storage in the liver through lipogenic and β‐oxidation genes and improved insulin

sensitivity. Finally, the novelty and importance of this study is the finding of how lipoic acid

modulates mitochondrial processes involved in energy homeostasis. Thus, LA induced a

significant decrease in the electron transport chain activity as well as in ATP production,

while, this antioxidant increased the expression of Ucp2. This reduction in mitochondrial

energy efficiency could also explain, at least in part, the beneficial effects of LA not only in

fatty liver but also in preventing excessive body weight gain.

Acknowledgements

This work has been supported by Línea especial “Nutrición, Obesidad y Salud” (University of

Navarra LE/97) and Ministry of Science and Innovation (AGL2006‐04716/ALI and AGL2009‐

10873/ALI). M.P. Valdecantos holds a scholarship from “Instituto de Salud Carlos III” (ISCIII)

(Spanish Ministry of Health). Also CIBER and RETICS networks are gratefully credited.


332

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CAPÍTULO 4.4/CHAPTER 4.4

Lipoic acid improves mitochondrial function in non‐

alcoholic steatosis through the stimulation of sirtuin 1

and sirtuin 3

Published in Obesity (Silver Spring) (In press)

Chapter 4.4 Results IV Capítulo 4.4 Resultados IV

341

4.4 LIPOIC ACID STIMULATES SIRTUIN 1 AND SIRTUIN 3.

Capítulo 4.4 Resultados IV Chapter 4.4 Results IV

342

4.4.1 ABSTRACT

Non‐alcoholic steatosis is an important hepatic complication of obesity linked to

mitochondrial dysfunction and oxidative stress. Lipoic acid (LA) has been reported to have

beneficial effects on mitochondrial function and to attenuate oxidative stress. The sirtuin

family has been demonstrated to play an important role in the regulation of mitochondrial

function and in the activation of antioxidant defenses. In this study, we analyzed the

potential protective effect of LA supplementation, via the modulation of mitochondrial

defenses through the sirtuin pathway, against oxidative stress associated with high‐fat

feeding. Wistar rats were fed a standard diet (C, n=10), a high‐fat diet (OB, n=10) and a

high‐fat diet supplemented with LA (OLIP, n=10). A group pair‐fed to the latter group (PFO,

n=6) was also included. LA prevented hepatic triglyceride accumulation (‐68.2%) and liver

oxidative damage (P<0.01) through the inhibition of hydroperoxide production (P<0.001)

and the stimulation of mitochondrial antioxidant defenses. LA treatment up‐regulated

manganese superoxide dismutase (60.6%) and glutathione peroxidase (100.2%) activities,

and increased the GSH:GSSG ratio and Ucp2 mRNA levels (P<0.001‐ P<0.01). Moreover, this

molecule reduced oxidative damage in mitochondrial DNA and increased mitochondrial

copy number (P<0.001‐ P<0.01). LA treatment decreased the acetylation levels of Foxo3a

and Pgc1β (P<0.001‐ P<0.01) through the stimulation of Sirt3 and Sirt1 (P<0.001). In

summary, our results demonstrate that the beneficial effects of LA supplementation on

hepatic steatosis could be mediated by its ability to restore the oxidative balance by

increasing antioxidant defenses through the deacetylation of Foxo3a and Pgc1β by Sirt1

and Sirt3.

Keywords: antioxidant defenses; high‐fat diet; mitochondrial biogenesis; obesity; Foxo3a;

Pgc1β.

Abbreviations: NAFLD, non‐alcoholic fatty liver disease; SS, simple steatosis; NASH, non‐

alcoholic steatohepatitis; ROS, reactive oxygen species; Sod2, manganese superoxide

dismutase; Gpx, glutathione peroxidase; LA, α‐lipoic acid; HFD, high‐fat diet; SIRTs, sirtuins;

Sirt1, sirtuin 1; Sirt3, sirtuin 3; Foxo3a, Forkhead transcription factor ; Parp, poly ADP ribose

polymerase; TG, trygliceryde; MDA, malondialdehyde; GSSG, oxidized glutathione; GSH,

reduced glutathione; mtDNA, mitochondrial DNA; O2*‐, superoxide anion; ETC, electron

transport chain; H2O2, hydroperoxide.


343

RESUMEN

La esteatosis no alcohólica es una importante complicación hepática de la obesidad ligada a

la disfunción mitocondrial y al estrés oxidativo. Se han descrito numerosos efectos

beneficiosos del ácido lipoico (AL) sobre la funcionalidad mitocondrial y su capacidad para

atenuar el estrés oxidativo. Se ha demostrado el importante papel de la familia de las

sirtuinas en la regulación de la funcionalidad mitocondrial y la activación de las defensas

antioxidantes. En este estudio se analiza el potencial papel protector de la suplementación

con AL frente al estrés oxidativo en el compartimento hepático mitocondrial inducido por la

ingesta de una dieta alta en grasa, a través de la modulación de las defensas antioxidantes

reguladas por las sirtuinas. Para ello, se alimentaron ratas Wistar con una dieta estándar (C,

n=10), una dieta alta en grasa (OB, n=10) y una dieta alta en grasa suplementada con AL

(OLIP, n=10). Además, se introdujo un grupo pair‐fed respecto al grupo suplementado con

AL (PFO, n=6). El AL previno la acumulación de triglicéridos en el hígado (‐68.2%) y el daño

oxidativo (P<0.01) mediante la inhibición de la producción de H2O2 (P<0.001) y la

estimulación de las defensas antioxidantes mitocondriales. Así, el AL estimuló la actividad

de la Sod2 (60.6%) y de la Gpx (100.2%), además incremento el ratio GSH:GSSG y los niveles

de mRNA de la Ucp2 (P<0.001‐ P<0.01). Además, esta molécula disminuyó el daño oxidativo

en el mtDNA e incremento el número de copias de mtDNA (P<0.001‐ P<0.01). El

tratamiento con AL disminuyó los niveles de acetilación de Foxo3a y de Pgc1β (P<0.001‐

P<0.01), mediante la estimulación de Sirt3 y Sirt1 (P<0.001). En resumen, nuestros

resultados demuestran que los efectos beneficiosos de la suplementación con AL en la

esteatosis hepática no‐alcohólica pueden estar mediados por su capacidad para

restablecen el balance oxidativo mediante un incremento de las defensas antioxidantes a

través de la activación de Foxo3a y de Pgc1β por su desacetilación mediada por la Sirt3 y la

Sirt1.


344

4.4.2 INTRODUCTION

Non‐alcoholic fatty liver disease (NAFLD) which is also considered the major hepatic

representation of metabolic syndrome is a critical complication of obesity (Sorrentino et al

2010, Milagro, Campion and Martinez 2006). Oxidative stress together with insulin

resistance contributes to the transition from simple steatosis (SS) to non alcoholic

steatohepatitis (NASH) (Pessayre 2007). In this regard, not only is the mitochondrion a

major cellular site involved in energy metabolism, but it is also the main source of reactive

oxygen species (ROS). Furthermore and in order to counterbalance the negative effects of

ROS, mitochondria also contain enzymatic antioxidant defenses, such as manganese

superoxide dismutase (Sod2), glutathione peroxidase (Gpx) and mitochondrial glutathione.

When the balance between mitochondrial ROS generation and the antioxidants defenses

was displace to the pro oxidant side an increase in mitochondrial oxidative stress is

observed, leading to impaired mitochondrial function. Moreover, several studies have

described that impaired mitochondrial function plays a central role in the development of

NASH (Rector et al 2010, Bonda et al 2011, Raffaella et al 2008).

Research into the attenuation or complete suppression of oxidative stress as a means of

combating several diseases has flourished and has become a major challenge in recent

years. Several approaches have been carried out in order to either decrease the high levels

of ROS generated or boost the endogenous levels of antioxidants. α‐Lipoic acid (LA) is a

natural antioxidant synthesized through a reaction catalyzed by lipoic acid synthase within

the mitochondria (Padmalayam et al 2009). Furthermore, LA acts as a cofactor of several

mitochondrial bioenergetic enzymes (Reed 1998) and in several processes of aerobic

metabolism. Apart from its role in the mitochondria, when supplemented in diets LA exerts

beneficial physiological effects such as: attenuation of oxidative stress, prevention of body

weight gain induced by HFD, as well as reduction of energy efficiency (Prieto‐Hontoria

2009, Wollin et al 2004).

The sirtuins (SIRTs) are a conserved family of proteins with NAD+‐dependent deacetylase

activity, distinct form class I and II histone deacetylases (Michan and Sinclair 2007). SIRTs

have been demonstrated to play important roles in many physiological and

pathophysiological situations, including metabolic syndrome, cell survival, aging and calorie

restriction‐mediated longevity through deacetylation of numerous substrates (Haigis and


345

Sinclair 2010). Furthermore, the role of sirtuin 1 (Sirt1) in the regulation of mitochondrial

biogenesis and energy homeostasis through the activation of peroxisome proliferator‐

activated receptor gamma coactivator 1‐alpha (Pgc1α) has been widely studied (Caito et al

2010a, Canto et al 2010). Sirtuin 3 (Sirt3), another member of the sirtuin family, which is

expressed in mitochondria, plays a role in regulating in vivo energy homeostasis (Ahn et al

2008). Forkhead transcription factor 3a (Foxo3a) is a substrate of Sirt3 (Jacobs et al 2008,

Sundaresan et al 2009) and in its deacetylated form has been demonstrated to stimulate

several antioxidant defenses (Sundaresan et al 2009, Choi et al 2007).

In the light of the above considerations, we suggest that LA treatment may have protective

effects against the oxidative stress associated with a high‐fat feeding via the modulation of

mitochondrial defenses through the sirtuin pathway. To test this hypothesis,several

parameters of oxidative stress and antioxidant defenses in the mitochondrial hepatic

compartment as well as mitochondrial function and sirtuin pathway in rats fed with high‐fat

diet supplemented with LA were assessed.

4.4.3 MATERIALS AND METHODS


Six‐weeks‐old male Wistar rats (n=36) were obtained from the Centre of Applied

Pharmacology (CIFA, Pamplona, Spain). Animals were housed in cages in a temperature‐


given deionizer water ad libitum for an adaptation period of 5 days. After this period, rats

were assigned to 4 experimental groups for 8 weeks. The Control (C) group (n=10), was fed

a standard commercially available (Harlan Tekland Iberica, Barcelona, Spain) diet (4.6% w/w

of energy as lipids),. The obese group (OB) (n=10) was fed ad libitum a high‐fat

commercially available (OpenSource Diets, Research Diets, New Jersey, USA) diet (60% w/w

of energy as lipids); the OLIP (Obese + Lipoic acid) group (n=10) was fed ad libitum a HFD

supplemented with racemic α‐lipoic acid (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA) in a

proportion of 0.25 g LA/100 g of diet, as previously described (Prieto‐Hontoria 2009); the

pair‐fed OLIP group (PFO) (n=6) was fed the same amount of HFD provided to the OLIP

group but without the addition of LA. This group will be used to determine if LA actions are

independent of the LA effect on food intake. Body weight and food intake were recorded

every 2‐3 days. At the end of the experimental period, rats were euthanized and blood and


346

tissue samples were immediately collected, frozen in liquid nitrogen and kept at ‐80˚C. All

experimental procedures were performed according to National and Institutional

Guidelines for Animal Care and Use at the University of Navarra.


Livers were quickly excised after the animals had been sacrificed and either frozen in liquid

nitrogen or placed in ice‐cold buffer (250 mM sucrose, 1 mM EDTA and 5 mM NaTES,

pH=7.4). Fresh tissue placed in buffer was used to prepare mitochondrial suspensions

according to the modified method of Rickwood et al with minor modifications (Valdecantos

et al 2010). Antioxidant defenses, total and cleaved poly ADP ribose polymerase (Parp)

protein levels and mitochondrial DNA damage were measured in isolated rat liver

mitochondria. Triglyceride content, lipid peroxidation and protein levels were assayed in

total liver homogenates.


To determine the hepatic triglyceride (TG) content, 150 mg of frozen liver were sonicated in

a Branson Sonifier 250 for 40 seconds in 1.5 ml of buffer (150 mM NaCl, 0,1% Triton and 10

mM Tris (pH 8)) at 50˚C. After centrifugation at 12000g for 10 min, the supernatant

obtained was used to measure the TG levels using a COBAS‐Mira analyzer (Roche

Diagnostics, Barcelona, Spain).

4.4.3.4 Lipid peroxidation

Malondialdehyde (MDA) levels were quantified following the controlled reaction with

thiobarbituric acid (TBA). Colorimetric changes were measured in liver homogenates with a

commercial kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, Michigan, USA) following the manufacturer’s

instructions with minor modifications and using a Luminoskan Ascent (Thermo Electron

Corporation, Foster City, California, USA). Results were corrected by the amount of tissue in

milligrams.

4.4.3.5 Chemiluminescent measurement of superoxide and hydroperoxide production

Superoxide (O2*‐) and hydroperoxide (H2O2) production was quantified in isolated

mitochondria by measuring the lucigenine‐derived and luminol‐derived chemiluminescence

as described previously (Valdecantos et al 2010).


347

4.4.3.6 Measurement of antioxidant defenses

Manganese superoxide dismutase and glutathione peroxidase activities were measured in

isolated rat liver mitochondria using enzymatic colorimetric activity kits (Assay Designs Inc,

Ann Arbor, Michigan, USA) with slight modifications as previously described (Valdecantos et

al 2010). Total reduced (GSH) and oxidized (GSSG) glutathione levels were measured in the

same samples using a colorimetric assay (Assay Designs Inc, Ann Arbor, Michigan, USA). The

ratio between GSH and GSSG was also calculated as a marker of antioxidant status in both

erythrocytes and the hepatic mitochondrial compartment.

4.4.3.7 Mitochondrial oxidative damage estimation

Mitochondrial DNA (mtDNA) oxidative damage was estimated as the ratio of 80‐bp

fragment (260–339 position), compared to a 162‐bp fragment (260–421 position) of the

same sample. For real‐time PCR reactions of both fragments, we used SYBR Green qPCR

Master Mix with ROX as reference dye (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) in an ABI

PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, California,

USA). The primers used were HVII‐FOR260 (5´‐GCCACTTTCCACACAGACATCATA‐3´), HVII‐

L421 (5´‐AGTGCATACCGCCAAAAGATAAA‐3´) and HVII‐C339 (5´‐

TGTTTAAGTGCTGTGGCCAGA‐3´) from Sigma Aldrich (Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri,

USA). Both fragments were amplified in a total volume of 10 μl with 15 ng of total DNA, 5 μl

SYBR Green Mix and 10 μM of HVII‐FOR260 and HVII‐L421 for large fragments and 2.5 μM

HVII‐FOR260 and HVII‐C339 for short fragments. The PCR conditions were 2 min at 50°C,

95°C for 10 min, 40 cycles at 95°C for 15 s and 60°C for 1 min.

4.4.3.8 Real‐time quantitative PCR and mitochondrial copy number

Total RNA was isolated from liver using Trizol® reagent (Invitrogen, Carlsbad, California,

USA) and according to the manufacturer’s instructions. RNA concentrations were

determined by Nanodrop 1000 (Thermo Electron Corporation, Foster City, California, USA).

To avoid contamination with genomic DNA, DNA digestion and inactivation was assessed

using the DNAse kit (Ambion Inc, St. Austin, Texas, USA). Four micrograms of RNA were

transcribed to cDNA using the M‐MLV kit (Invitrogen) following instructions from the

suppliers.


348

Twelve genes were analyzed (Table 1) using predesigned TaqMan® Assays‐on‐demand

(Applied Biosystems). The reaction conditions were set up according to the manufacturer's

instructions. Amplification and detection of specific products were performed using the ABI

PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems). All the samples were

analyzed in duplicate. CT values were generated by the ABI software. Finally, the relative

expression levels of each gene were calculated as foldchange (2‐∆∆CT). Hepatic expression

levels of each gene were normalized by β‐Actin or cyclophilin. The ratio between

mitochondrial encoded gen (Mtco2) and nuclear endogenous gen (18s) was used to

calculate the mitochondrial copy number.

Table 1: Gene name and GenBank accession number used in RT‐qPCR

Gen symbol

GenBank number

Gene name Gene function

Sod2 NM_017051.2 Superoxide Dismutase 2, mitochondrial Antioxidant defenses

Gpx NM_ 030826.3 Glutathione peroxidase 1, hepatic Antioxidant defenses

Ucp2 NM_019354.2 Uncoupling protein 2 Antioxidant defenses

Sirt3 NM_001106313.2 Sirtuin (silent mating type information regulation 2 homologue) 3

NAD+ dependentdeacetylase, mitochondrial

Foxo3a NM_001106395.1 Forkhead box O3a Transcription factor

Ppargc1a NM_031347.1 Peroxisome proliferator‐activated receptor gamma, coactivator 1 alpha ( Pgc1α )

Mitochondrial biogenesis

Ppargc1b NM_176075.2 Peroxisome proliferator‐activated receptor gamma, coactivator 1 beta (Pgc1β)

Mitochondrial biogenesis

Nrf1 NM_001100708.1 Nuclear respiratory factor 1 Mitochondrial biogenesis

Mtco2 MIM_516040 Cytochrome c oxidase subunit 2 Mitochondrial encoded gene

18s X03205.1 Eukaryotic 18S rRNA House Keeping

Actb NM_031144.2 β Actin House Keeping

Ppia NM_175707.3 Peptidylprolyl isomerase (cyclophilin)‐like 3

House Keeping


349

4.4.3.9 Western blotting

Total proteins were extracted by treating 100 mg of frozen liver with 500 µl of RIPA buffer

containing proteases inhibitor (Sigma Aldrich) and phosphatase inhibitors (2 mM NaVO3, 1

mM NaF). Samples were sonicated in Branson Sonifier 250 equipment, then were incubated

at 4°C for 30 min and then centrifuged at 12,000 g for 1 hour at 4°C, and the supernatant

was collected for analysis. Mitochondrial proteins were extracted by treating isolated rat

liver mitochondria with lysis buffer (1:1) (20 mM TrisHCl pH 8, 137 mM NaCl, 10% glycerol

and 1% Triton) with proteases and phosphatases inhibitors in same proportion than in RIPA

buffer. Samples were incubated at 4oC for 30 min and then centrifuged at 13,000 g for 15

min, and the supernatant was collected for analysis. Proteins were quantified with the BCA

method (Bio Rad laboratories, Madrid, Spain) according to the supplier´s instructions. Total

proteins were resolved in SDS‐PAGE minigels and electroblotted onto PVDF membranes (GE

Healthcare Europe GmbH, Barcelona, Spain). The membranes were blocked and incubated

with specific antibodies against Parp (Cell Signalling Technology, Boston, Massachusetts,

USA), Sirt1, Sirt3 and Actin (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Germany). Secondary

antibody was horseradish peroxidase goat anti‐rabbit IgG‐HRP (Bio Rad Laboratories). The

immunoreactive proteins were detected with enhanced chemiluminescence (Pierce

Biotechnology, Rockford, Illinois, USA). Band intensities were quantified using a GS‐800

calibrated densitometer (Bio Rad Laboratories).

4.4.3.10 Immunoprecipitation

For acetylation analysis, 2 µg of anti‐Foxo3a (Santa Cruz Biotechnology) or anti‐Pgc1β

(Santa Cruz Biotechnology) antibody was added to protein extracts and incubated for 2 h at

4°C. After the addition of 30 μg of protein A/G PLUS‐Agarose (Santa Cruz Biotechnology),

incubation at 4°C with shaking was carried out overnight. The A/G PLUS‐Agarose‐beads

were pelleted by centrifugation at 12,000 g for 2 min at 4°C and washed four times with

RIPA buffer at 4°C to remove non‐adsorbed proteins. After the final wash, protein was

released from the beads by treatment at 95°C for 7 min in sample buffer and

electrophoresed on 10% SDS‐PAGE gels and transfer to PVDF membranes. The membranes

were blocked and incubated with specific antibodies against Foxo3a or Pgc1β (Santa Cruz

Biotechnology) to determine total Foxo3a or Pgc1β and anti‐acetylated Lys (Cell Signalling)

to analyze acetylation of Foxo3a and Pgc1β.


350


Data are reported as mean ± S.E. Normal distribution was confirmed by two different

methods, Shapiro‐Wilk and Kolmogorov‐Smirnov. In order to determine the effects of LA

treatment, one way Anova followed by Bonferroni post‐hoc analysis or Kruskal‐Wallis

followed by followed by Dunns post‐hoc analysis were carried out depending on the

distribution of the data. Relationship between variables was analyzed by calculating

Pearson correlation coefficients. All statistical analyses were performed using the GraphPad

Prism 5.0 software (GraphPad Software Inc., San Diego, California, USA). Differences were

considered as statistically significant at P<0.05. Variables analyzed and presented in figures

are unique and will not require a multiple comparison correction.

4.4.4 RESULTS

4.4.4.1 Effects of LA on body and liver weights and hepatic triglyceride content

As expected, an increase in body weight (P<0.001) was observed in rats fed a HFD.

Interestingly, this increase was significantly prevented by LA treatment (P<0.001 vs OB).

Furthermore, HFD increases white adipose tissue accumulation (P<0.001) which was

completely reversed by LA treatment (P<0.001 vs OB) (Table 2). Moreover, HFD produced a

very significant increase (P<0.001) on hepatic triglyceride content in liver compared with

control rats (Table 2). Calorie restriction was also able to reduce this increase (P<0.001 vs

OB), but LA lowering effects were of major magnitude and statistically significance between

the OLIP and the PFO group (P<0.001), suggesting a direct lowering effect of LA on liver

triglyceride content. Furthermore, histological analysis previously reported by our group

demonstrated that LA treatment in these animals was able to prevent the development of

SS induced by a HFD.


351

Table 2: Body weight gain, body composition, liver triglyceride content, calorie intake and

feeding efficiency in lean and obese rats.


n=10 n=10 n=10 n=6

Initial body weight (g) 215.1±20.33 218.1±17.75 214.7±20.80 209.8±9.83 n.s

Body weight gain (g) 166.7±27.04 275.9±18.24***,b 153.7±35.45###,b 200.1±16.81 <0.001

WAT (%) 7.2±1.25 13.3±1.83*** 7.2±1.26###,b 9.4±0.95##,* <0.001

Liver weight (%) 2.48±0.457 2.13±0.284 2.59±0.386 2.13±0.258 0.0386

Liver triglyceride content (%) 3.6±1.19 9.2±0.89***,c 2.5±0.72###,c 5.0±1.3* <0.001

Plasma triglyceride (mg/dl) 69.9±20.26 63.7±12.24a 47.2±6.39# 45.9±8.86 0.0024

Plasma cholesterol (mg/dl) 68.8±7.90 68.4±10.20 66.94±12.58 58.7±6.88 0.2182

HDL cholesterol (mg/dl) 23.7±2.89 19.6±3.09* 26.0±3.28###,c 19.9±1.99* <0.001

LDL cholesterol (mg/dl) 52.7±15.03 51.4±11.28 59.9±12.62 46.1±7.08 n.s.

Values are means ± SE. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01,



appear in up corner.

4.4.4.2 Effects of LA on lipid peroxidation

As shown in figure 1, HFD induced an important increase in lipid peroxidation in the liver

(P<0.001). This effect was reversed by LA treatment, which induces a lower MDA content in

liver in comparison with the obese group (P<0.01) but also in comparison with control

group (P<0.01). Furthermore, this effect can be directly attributed to LA, because a

significant difference was observed between OLIP and PFO groups (P<0.001).


352

Figure 1 Effects of LA on liver oxidative damage and reactive oxygen species. (A)

Malondialdehyde levels; (B) Superoxide production, (C) Hydroperoxyde production. Values

are mean±SE. (n=10‐6). **P<0.01, ***P<0.001 vs control group; ##P<0.01, ###P<0.001 vs

obese group; aP<0.05, bP<0.01, cP<0.001 vs PFO group according to one way Anova followed

by post‐hoc multiple comparisons by Bonferroni test. Abbreviations: MDA,

malondialdehyde; O2‐●, superoxide anion; H2O2, hydroperoxide.


353

4.4.4.3 Effects of HFD and LA treatment on reactive oxygen species production in IRLM

Oxidative stress has been described as an imbalance between ROS production and

antioxidant defenses. Taking into account that mitochondria are the main source of ROS

production in cells, we checked the role of mitochondrial oxidative stress in the

development of obesity. We measured the production of superoxide anion (O2*‐) the firstly

reactive oxygen species produced in the mitochondrial electron transport chain (ETC). LA

treatment induced a significant increase in O2*‐ production (P<0.001), with no effects

observed by dietary treatment (Figure 1B). Preliminary results of our group showed that

lipoic acid treatment induced a strong inhibition on Complex I and Complex II+III.

Interestingly, a higher correlation between superoxide production and the activity of

Complex I (r=‐0.6226; P=0.0012) and Complex II+III (r=‐0.5687; P=0.0058) was found

(Valdecantos et al 2009). Surprisingly, the opposite effect was observed on H2O2 production

(Figure 1C). Thus, HFD induced a strong increase in the production of H2O2 that was

completely reversed by LA treatment (P<0.001). The differences observed between OLIP

and PFO group (P<0.001) in H2O2 production suggested that LA may activate other

mechanisms independent of calorie restriction to counteract the increase observed in the

levels of this ROS.

4.4.4.4 LA treatment increased antioxidant defenses on rat liver mitochondria

To gain a better insight into the mechanisms that could explain the effects of LA against

mitochondrial oxidative damage, gene expression and activity of several antioxidant

enzymes were investigated. The analysis of gene expression showed that HFD induced a

reduction in mRNA level of Sod2 (0.6±0.13 fold changes; P<0.01 vs C) that overturned to

control levels after LA treatment (1.2±0.53 fold changes; P<0.001 vs OB). However pair‐fed

rats present the same expression levels as obese animals (0.7±0.11 fold changes; P<0.05 vs

OLIP). Conversely, Gpx gene expression was stimulated by HFD (1.8±0.50 fold changes;

P<0.001 vs C) and this effect was reversed by lipoic acid treatment (1.1±0.34 fold changes;

P<0.01 vs OB) and calorie restriction (1.2±0.22 fold changes). As expected, animals with

liver steatosis exhibited an important decrease in Sod2 (P<0.01) and Gpx (P<0.05) activities

in liver mitochondria (Figure 2A and 2B). Interestingly, LA treatment stimulated the activity

of both enzymes and these effects were not secondary to a reduction of food intake, which


354

highlights that LA was able to improve mitochondrial antioxidant defenses by different

mechanisms than calorie restriction.

As for the effects of HFD and LA treatment on non enzymatic antioxidant defenses, HFD

induced a significant decrease in GSH:GSSG ratio in rat liver mitochondria (P<0.05), a robust

marker of antioxidant status. LA treatment (Figure 2C) was able to counteract the decrease

and to increase this ratio to levels even higher than in the control group (P<0.001 vs C, OB

and PFO groups). Moreover, the analysis of mRNA levels of Ucp2, which has an important

role in the regulation of mitochondrial redox status, revealed that animals with liver

steatosis showed lower gene expression levels than the control animals (P<0.05) whereas

LA treatment was able to overturn this effect (Figure 2D). Similarly, as in other antioxidant

defenses this effect did not seem secondary to calorie restriction as statistical differences

between OLIP and PFO groups were found (P<0.05).

Figure 2 Changes on mitochondrial antioxidant defenses in different experimental group.

(n=10‐6). (A) Manganese superoxide dismutase activity, (B) Glutathione peroxidase mRNA

activity, (C) Mitochondrial GSH:GSSG ratio (D) Ucp2 mRNA levels. Values are mean±SE.

*P<0.05, ***P<0.001 vs control group; ##P<0.01, ###P<0.001 vs obese group; aP<0.05,

bP<0.01, cP<0.001 vs PFO group according to one way Anova followed by post‐hoc multiple

comparisons by Bonferroni test.


355

4.4.4.5 Changes on mitochondrial biogenesis induced by LA treatment

Regarding mitochondrial copy number, HFD produced an important reduction (49.6%;

P<0.001) as compared to control animals. Interestingly, lipoic acid reversed the effect of

high fat feeding on mitochondrial biogenesis and also induced a significant increase in the

mitochondrial copy number to levels higher than those observed in the control group

(151.1%; P<0.05) (Figure. 3A). Moreover, a negative correlation between mitochondrial

copy number and mtDNA oxidative damage (r= 0.6052; P<0.001) was found. HFD also down

regulated Pgc1α mRNA levels (P<0.01) and this effect was partially reversed by lipoic acid

although no differences were observed in comparison with the PFO group (Figure 3B). HFD

also induced a reduction in NRF1 gene expression (P<0.05) and lipoic acid was able to

counteract these effect (P<0.01) and, as deduced from statistical differences between

groups, this stimulatory effect was not secondary to changes in food intake.


356

Figure 3 Effect of LA on mitochondrial biogenesis and mitochondrial DNA damage. (n=10‐6). (A) Mitochondrial copy number, (B) mRNA levels of genes involved in

transcriptional control, (C) mt DNA oxidative damage, (D) Quantification of Parp Western Blot, (E) Wester blot analysis of Parp cleavage. Values are mean±SE. *P<0.05,

**P<0.01, ***P<0.001 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs obese group; aP<0.05, bP<0.01, cP<0.001 vs PFO group according to one way Anova followed by

post‐hoc multiple comparisons by Bonferroni test. Abbreviations: mtDNA, mitochondrial DNA; Parp, poly ADP ribose polymerase.


357

4.4.4.6 Effects of LA on mitochondrial DNA oxidative damage and Parp

The aforementioned data suggested that liver steatosis induced a pro‐oxidant state in the

mitochondrial liver compartment. This state may lead to oxidative injury in different

mitochondrial structures such as membrane, proteins of ETC or mtDNA. Taking into account

this hypothesis, we analyzed mtDNA oxidative damage by q‐RTPCR and observed that, as

expected, high fat intake induced oxidative damage in mtDNA (Figure 3C) which was

completely reversed by LA treatment. This protective effect was independent of a

reduction in energy intake, as significant differences between OLIP and PFO group were

found (P<0.001). Moreover, mitochondrial DNA oxidative injury were highly correlated with

H2O2 production (r=0.7523; P<0.001).

Next, we investigated the role of LA on mtDNA repair by the measurement of Parp cleavage

in our experimental animal groups. Obese animals showed highest levels of Parp cleavage

(Figure 3D and 3E). This effect of HFD was reversed in part by calorie restriction and

completely overturned by lipoic acid treatment. These data could suggest that LA

stimulates mtDNA repair by the regulation of Parp cleavage. In fact, a highly significant

correlation between mtDNA damage and Parp cleavage was observed (r=0.6315; P<0.001).

4.4.4.7 Changes on Foxo3a mRNA levels and protein acetylation levels

To determine the potential role of Foxo3a in the stimulating actions of LA on antioxidant

defenses previously described, protein levels and acetylation of Foxo3a were measured. As

observed in figure 4A. HFD induced a significant decrease in gene expression of this

transcription factor. Calorie restriction was able to partially reverse the effect of HFD on

Foxo3a gene expression although it did not reach statistical significance. However, lipoic

acid up regulated the mRNA levels of this gene to levels even higher than those observed in

the control group (Figure 4A). Taking into account that protein acetylation of Foxo3a

inhibits the activity of this transcription factor on stimulation of antioxidant defenses; we

measured the acetylation levels by immunoprecipitation. We found that high fat feeding

animals had higher Foxo3a acetylation levels than the control group (Figure 4B).

Interestingly, lipoic acid treatment return acetylation levels to control values. Moreover,

the Foxo3a acetylation percentage of OLIP animals (51.2±11.63%) was lower than PFO

animals (88.5±14.05%). These data suggest that the regulation of Foxo3a gene expression

and its deacetylation could be mediated by the effects of LA on antioxidant defenses.

Chapter 7 Results IV Capítulo 7 Resultados IV

358

Figure 4 Effects of LA on Foxo3a and Pgc1β mRNA levels and protein acetylation. (n=10‐6). (A) mRNA levels of Foxo3a, (B) Lysine acetylation of Foxo3a expressed in fold

changes vs control group, (C) Inmunoprecipitation and western blot analysis of total and acetylated Foxo3a, (D) mRNA levels of Pgc1β, (B) Lysine acetylation of Pgc1β

expressed in fold changes vs control group, (C) Inmunoprecipitation and western blot analysis of total and acetylated Pgc1β. Values are mean±SE. *P<0.05, **P<0.01,

***P<0.001 vs control group; #P<0.05, ##P<0.01, ###P<0.001 vs obese group; aP<0.05, bP<0.01, cP<0.001 vs PFO group according to one way Anova followed by post‐hoc

multiple comparisons by Bonferroni test. Abbreviations: Foxo3a, Forkhead transcription factor; Pgc1β, Peroxisome proliferator‐activated receptor gamma, coactivator 1 beta.


359

4.4.4.8 Changes on Pgc1β gene expression and acetylation levels

To determine the potential role of Pgc1β in the previously described stimulating actions of

LA on mitochondrial biogenesis, gene expression and protein acetylation of this co‐activator

were measured. HFD induced a significant decrease in the mRNA levels of this transcription

factor (Figure 4D). LA up regulated the expression of this gene in comparison to both obese

and PFO groups (P<0.001). Some studies propose that protein acetylation of Pgc1β could

modulate its activity. Thus, we measured the acetylation levels by immunoprecipitation. As

was the case with Foxo3a, HFD induced an intensification of acetylation of Pgc1β (Figure

4E) and LA was able to decrease these acetylation levels (P<0.001 vs OB). Furthermore, the

acetylation levels of Pgc1β were negatively associated with protein level of Sirt1 (r=‐0.7559;

P<0.001) as well as mitochondrial copy number (r=‐0.7168; P<0.001).

4.4.4.9 Effects of LA on SIRTs

To determine the role of sirtuins in LA actions on hepatic mitochondrial oxidative status, we

analyzed the mRNA and protein levels of Sirt1 and Sirt3 in our experimental groups.

Regarding to Sirt1, HFD down regulated the mRNA levels of this gene (P<0.01) whereas LA

was able to up regulate the mRNA levels up to control values (Figure 5A). However, this

effect may be due to calorie restriction as deduced from the same values observed in the

PFO group. By contrast, LA induced a strong stimulatory effect on protein level of Sirt1 (6.5

fold; P<0.001 vs C and OB group) whereas dietary patterns (obesity and calorie restriction)

had no effect (Figure 5B and 5C). In addition, a highly significant correlation between

protein levels of Sirt1 and mitochondrial copy number was found (r=0.7800; P<0.001). On

the other hand, and similarly to what was observed with Sirt1, HFD induced a reduction in

Sirt3 gene expression and this effect was completely reversed by LA treatment (P<0.001).

This up regulation was not secondary to calorie restriction as inferred from differences with

PFO group (P<0.05) (Figure. 5D). Furthermore, LA also increases Sirt3 protein levels

(P<0.001) and independently of reduction in food intake (Figure. 5E and 5F). Additionally,

the protein levels of Sirt3 were negatively associated with acetylation of Foxo3a (r=‐0.6108;

P=0.002) suggesting that Sirt3 could stimulate the activity of Foxo3a by deacetylation and,

therefore, could mediate the effects of LA.


360

Figure 5 Effects of LA on sirtuins pathway. (n=10‐6). (A) Sirt1 mRNA levels, (B) Wester blot

analysis of SIRT 1, (C) Quantification of Sirt1 western blot, (D) Sirt3 mRNA levels, (E) Wester

blot analysis of SIRT 3, (F) Quantification of Sirt3 western blot. Values are mean±SE.

**P<0.01 vs control group; ###P<0.001 vs obese group; aP<0.05, cP<0.001 vs PFO group

according to one way Anova followed by post‐hoc multiple comparisons by Bonferroni test.

Abbreviations: Sirt1, sirtuin 1; Sirt3, sirtuin 3.


361

4.4.5 DISCUSSION

To our knowledge, this is the first study where the effects of LA on sirtuins have been

studied. We have found that the beneficial effects of LA on fatty liver could be mediated

through its actions on mitochondria and more specifically due to its ability to increase the

antioxidant defenses in this compartment which seems to be due to the increase observed

in Sirt1 and Sirt3 proteins.

NAFLD is now considered the main hepatic manifestation of obesity and metabolic

syndrome (Sorrentino et al 2010, Carmiel‐Haggai, Cederbaum and Nieto 2005, Lewis and

Mohanty 2010). In fact, our data have shown that high fat feeding increased body weight

gain and subsequently induced liver steatosis. Further events in the liver include oxidative

stress and the decrease in antioxidant defenses induced by early mitochondrial dysfunction

(Abdel‐Wahab et al 2002, Gambino, Musso and Cassader 2011). Moreover, some

researchers described the ability of LA, a compound with antioxidant properties, to reverse

the effects of HFD on liver steatosis (Park et al 2011, Huong and Ide 2008). In this context,

our data confirm these protective effects of LA on hepatic triglyceride accumulation in an

animal model of diet induced obesity.

The central role of mammalian sirtuins in the regulation of mitochondrial function and

oxidative stress has been reviewed in detail over recent years (Canto and Auwerx 2009,

Haigis and Sinclair 2010, Bell and Guarente 2011, Caito et al 2010b). In fact, several studies

have proposed that SIRTs are important targets to prevent several disorders involving

mitochondrial dysfunction and an increase in oxidative stress (Bonda et al 2011, Tang

2011). Accordingly, in the present study we observed that the increase in sirtuins 1 and 3

induced after LA treatment was accompanied by an enhancement in mitochondrial copy

number which could be associated with the improvement observed in the antioxidant

status of hepatic mitochondrial compartment and could contribute to the beneficial effects

of LA on fatty liver after the ingestion of a HFD.

Several lines of evidence described that Sirt3 stimulates antioxidant defenses by different

ways (Bao et al 2010, Bell and Guarente 2011). One of the most important mechanisms is

the deacetylation of mammalian Foxo factors that control various biological functions,

including detoxification of reactive oxygen species and repair of DNA damage. Particularly,


362

the ability of Foxo3a to stimulate mitochondrial antioxidant defenses such as Sod2 has been

described in different studies (Kops et al 2002, Sundaresan et al 2009). Moreover, Jacobs et

al (2008) suggested that Foxo3a is a mitochondrial protein, whose function could be

regulated through the interaction with Sirt3 in the mitochondria (Jacobs et al 2008). In

agreement with this hypothesis, other research described that activation of Foxo3a through

deacetylation is specifically stimulated in response to oxidative stress stimuli (Brunet 2004).

In this context, our results demonstrate for the first time that acetylation levels of Foxo3a

are strongly increased in steatotic livers whereas LA treatment completely reversed this

effect.

In this sense, some studies have indicated that the full‐length form of Sirt3 is located in the

nucleus whereas a shorter form, that is more active, was found in mitochondria (Cooper et

al 2009). Our data suggest that the increase in Foxo3a acetylation in the obese group could

be mediated by a strong reduction in the shorter‐active form of Sirt3 in these animals.

Moreover, our study demonstrated for the first time that LA treatment is able to induce a

strong stimulation of Sirt3 protein and this stimulatory effect could mediate the increase in

antioxidant defenses through the deacetylation of Foxo3a. In fact, some studies have

described that Sirt3 stimulates mitochondrial antioxidant defenses by the activation of Sod2

through acetylation (Chen et al 2011, Someya and Prolla 2010).

In this context, our data revealed an important decrease in antioxidant defenses in obese

animals in agreement with previous studies (Raffaella et al 2008, Park et al 2011). In such a

situation, LA is highly effective in reducing ROS levels as observed with H2O2 but also in

stimulating other antioxidant systems. Manganese dependent superoxide dismutase, acts

as the first line of defense against ROS production in ETC by catalyzing the dismutation of

superoxide anion to hydroperoxide which is further remove by Gpx (Cheng et al 2002).

Moreover, several studies suggest that one of the main mechanisms by which LA modulates

redox balance is its ability to participate in thiol /disulfide exchange (Choi et al 2007).

Accordingly, our data revealed that LA treatment increases GSH:GSSG ratio. These findings

suggest that deacetylation of Foxo3a could mediate the stimulatory effects of LA on

mitochondrial antioxidant defenses.

Moreover, our data showed that LA treatment is able to reverse the deleterious effect of

HFD in mtDNA oxidative damage, corroborating its beneficial effects on oxidative stress of

hepatic mitochondrion after the ingestion of a high‐fat diet. In this sense, Parp is a nuclear


363

and mitochondrial enzyme that exerts numerous functions in the maintenance of DNA

stability to transcriptional regulation (Orsucci, Mancuso and Siciliano 2008). Increase of

oxidative stress activates caspase 3, which inhibits Parp by cleavage into two fragments and

produces damage accumulation in mtDNA (Jarrett and Boulton 2007). Consistently, we

observed that in obese animals, Parp is completely cleaved. However, we found a balance

between cleaved‐inactive and total‐active Parp forms in control and LA treated groups.

Interestingly, levels of mtDNA damage and cleaved ratio of Parp are strongly associated and

support the hypothesis that this enzyme contributes to mtDNA repair.

On the other hand, the stimulatory role of mammalian Sirt1 in mitochondrial biogenesis has

been reviewed in detail over recent years (Canto and Auwerx 2009, Haigis and Sinclair

2010). Accordingly, in the present study we observed a strong activation of Sirt1 protein

levels as a response to LA treatment, which are correlated with an increase of

mitochondrial copy number. Regarding the transcriptional control of mitochondrial

biogenesis, several studies have highlighted the central role of Pgc1α and its activation by

Sirt1 (Canto and Auwerx 2009, Fernandez‐Marcos and Auwerx 2011). Interestingly, we

observed that LA treatment is able to up‐regulate Pgc1α gene expression but this increase

seems to be secondary to calorie restriction, as stated in previous studies (Civitarese et al

2007). However, the stimulatory effect of LA on Pgc1βgene expression, independently of

food restriction, suggests that this transcription factor, instead of Pgc1α, is a direct target of

LA in the liver. In fact, different studies have established the key role of Pgc1βin the

transcriptional control of mitochondrial metabolism and energy homeostasis (Vianna et al

2006). Moreover, a higher ability of PGC1‐β in comparison with PGC1‐α to regulate

mitochondrial function has been proposed in several studies (Shao et al 2010), suggesting

that LA actions on PGC1‐β and not on Pgc1α could contribute, to some extent, to the

increase in mitochondrial biogenesis. Moreover, Kelly et al (2009) reported the ability of

Sirt1 to regulate Pgc1β activity by acetylation (Kelly et al 2009). Confirming this finding, our

data showed a marked correlation between Sirt1 protein levels and Pgc1β acetylation.

Interestingly, Pgc1β acetylation levels were also correlated with mitochondrial copy

number suggesting that the deacetylation of Pgc1β could mediate the increase observed in

mitochondrial biogenesis. Moreover, based on the aforementioned stimulatory effects of

LA, which seem not to be mediated by calorie restriction, we propose that this molecule

exerts its actions on mitochondrial biogenesis through the stimulation of Sirt1 and


364

consequently of deacetylation of Pgc1β. Regarding the effects of HFD and/or LA treatment

in NRF1 expression levels, another transcriptional regulator of mitochondrial biogenesis

(Scarpulla 2006), the pattern of effects was similar to those observed with Pgc1β according

to previous investigations.

In summary, our results demonstrate for the first time that the beneficial effects of LA

supplementation on fatty liver resulting from the ingestion of a high‐fat diet and associated

with an obese state, could be mediated, at least in part, by its effects on oxidative status of

hepatic mitochondria. Thus, LA seems to restore the oxidative balance by increasing

antioxidant defenses through the activation of Sirt1 and Sirt3 proteins. More specifically,

Sirt1 seems to induce an increase in the mitochondrial copy number through the

deacetylation of Pgc1β, whereas Sirt3 seems to exert a direct effect on antioxidant

defenses such as Sod2 through Foxo3a deacetylation.

Acknowledgments

We would like to thank Ana Lorente and Veronica Ciaurriz for their technical assistance. We

also thank Paul Miller from the Department of Modern Languages (University of Navarra)

for the English scientific revision of the last revision. This work has been supported by Línea

especial “Nutrición, Obesidad y Salud” (University of Navarra LE/97) and Ministry of Science

and Innovation (AGL2006‐04716/ALI and AGL2009‐10873/ALI). MP. Valdecantos holds a

scholarship from “Instituto de Salud Carlos III” (ISCIII) (Spanish Ministry of Health). Also

CIBER and RETICS networks are gratefully credited.


365

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Discusión General /General Discussion

Capítulo 5 Discusión General Chapter 5 General Discussion

371

5.1 DISCUSIÓN GENERAL

La primera parte de este trabajo se interesó en el análisis de los efectos del ácido lipoico, la

vitamina C y el resveratrol en mitocondrias aisladas de hígado de rata con el objetivo de

comprobar su capacidad para modular el estado oxidativo mitocondrial (ROS y defensas

antioxidantes) y su papel en la regulación de otros parámetros de funcionalidad

mitocondrial.

La vitamina C es uno de los antioxidantes más utilizados como suplemento dietético debido

a su capacidad para disminuir y neutralizar ROS tal y como ha sido ampliamente descrito en

la bibliografía (Wilson 2009, Frank et al 2006, Ratnam et al 2006). En este sentido, los datos

obtenidos en nuestro trabajo muestran que el tratamiento de extractos mitocondriales con

vitamina C (30 µM) indujo una disminución significativa en los niveles de O2*‐, lo cual

corrobora estudios previos desarrollados tanto in vitro (Kc, Carcamo and Golde 2005) como

en ratas Wistar con NAFLD inducida por una dieta deficiente en colina suplementada con

este antioxidante (Oliveira et al 2003). Esta disminución puede deberse, al menos en parte,

a la estimulación de la actividad de la Sod2 inducida por el tratamiento con vitamina C, que

induciría una rápida transformación del O2*‐ a H2O2. De acuerdo con estos hallazgos,

investigaciones previas desarrolladas en diferentes modelos animales con un incremento

del estrés oxidativo bien por la presencia de diabetes (Sadi, Yilmaz and Guray 2008) o por la

exposición a cloruro de manganeso (Zhang et al 2010), han mostrado el papel protector de

la vitamina C a través de la regulación de Sod2 (Ahmed et al 2011, Marcil et al 2011,

Yogeeta et al 2006, Devi et al 2007). Otro mecanismo que puede justificar los efectos

beneficiosos observados tras el tratamiento con vitamina C es su capacidad para modular la

producción de H2O2 como han descrito varios autores en modelos in vitro (Ahn, Yun and Oh

2006, Kc, Carcamo and Golde 2005) e in vivo (Ahn et al 2008) y que se confirman en el

presente estudio. Por otro lado, la disminución en la producción de H2O2 puede estar

provocada por la estimulación de la mtGpx observada en los extractos mitocondriales

tratados con este antioxidante.

En relación a las acciones de la vitamina C sobre la respiración mitocondrial los resultados

obtenidos mostraron que el tratamiento con este antioxidante indujo pequeños cambios,


372

principalmente un descenso del ratio P/O y por tanto de la fosforilación oxidativa (Hinkle

2005), lo cual sugiere que la acción de la vitamina C a nivel mitocondrial contribuya a

disminuir la eficiencia metabólica como ha sido descrito en modelos animales de obesidad

inducida por la dieta (Campion et al 2008). Por otro lado, el aumento en el RCR observado

puede deberse, al menos en parte a la transformación del ácido ascórbico en

dehidroascórbico aprovechando el mayor flujo electrónico proveniente de la cadena de

transporte, como ya ha sido descrito previamente (Mandl, Szarka and Banhegyi 2009).

En relación al tratamiento con resveratrol, distintas investigaciones han descrito la

capacidad del este antioxidante para prevenir el daño oxidativo en el compartimento

mitocondrial en diferentes modelos animales (Lagouge et al 2006, Robb et al 2008b) así

como en estudios in vitro (Brookins Danz et al 2009, Robb et al 2008a, Rubiolo, Mithieux

and Vega 2008). Uno de los caminos que se han propuesto para explicar el efecto protector

de este antioxidante es su capacidad de disminuir los niveles de ROS (Lu et al 2008, Park

and Lee 2008). Por otro lado, algunos autores han demostrado que el resveratrol confiere

resistencia al estrés oxidativo a través de la una inducción progresiva y especifica en la

expresión génica y actividad de la Sod2 (Robb et al 2008a, Robb et al 2008b). Nuestros

datos mostraron resultados similares a los presentados en estas y otras investigaciones a

tiempos cortos de incubación en los que se observó una disminución en los niveles de O2*‐ y

de H2O2 (Brookins Danz et al 2009, Notas et al 2006). En el caso de la producción de O2*‐, la

disminución puede deberse, al menos en parte, al importante aumento en la actividad Sod2

a ambos tiempos de tratamiento. Estos resultados son similares a los apuntados en

múltiples estudios desarrollados in vivo (Bujanda et al 2008, Kasdallah‐Grissa et al 2007,

Robb et al 2008b) e in vitro (Brookins Danz et al 2009, Cao and Li 2004, Robb et al 2008a,

Rubiolo and Vega 2008).

Por el contrario, no se observó un aumento en la actividad mtGpx por lo que la disminución

de los niveles H2O2 no puede ser explicada por las acciones del antioxidante en esta enzima.

De hecho, nuestros datos revelaron una inhibición de la mtGpx después de 30 minutos de

tratamiento con RSV que no se observó después de 60 minutos de tratamiento con el

antioxidante. De acuerdo con estos resultados publicaciones previas han descrito que el

tratamiento con resveratrol puede tener efectos contrapuestos sobre la actividad de esta

enzima (Bujanda et al 2008, Kasdallah‐Grissa et al 2007, Cao and Li 2004), sugiriendo que


373

sus acciones dependen del tejido analizado, la dosis y el periodo de tratamiento. De hecho,

Rubiolo et al (2008), en un estudio llevado a cabo en cultivos primarios de hepatocitos de

rata, observaron cambios en la actividad Gpx únicamente empleando dosis elevadas (75

µM) y tras tiempos largos de tratamiento (48 horas). Sin embargo, este estudio estableció

un incremento de la actividad de la catalasa de forma independiente a la dosis y periodo de

tratamiento (Rubiolo, Mithieux and Vega 2008), lo cual podría explicar la reducción

observada en los niveles de H2O2 tras el tratamiento con RSV.

A pesar de que el papel del resveratrol sobre la función mitocondrial ha sido ampliamente

descrito en la literatura (Gutierrez‐Perez et al 2011, Gogada et al 2011, Zhu et al 2011, Chen

et al 2011), en nuestro modelo experimental el tratamiento con resveratrol indujo menores

cambios sobre los parámetros respiratorios que el resto de los antioxidantes empleados.

Estos resultados pueden deberse a que los estudios previos han sido desarrollados en

animales de experimentación o en cultivos celulares en los que, a diferencia de nuestro

estudio, esta molécula puede modular la expresión y los niveles de proteína así como la

acción de factores de regulación y transcripción. De hecho, muchos de estos estudios

atribuyen las acciones del resveratrol sobre la función mitocondrial a su acción sobre la

Sirt1 y Pgc1α (Beeson, Beeson and Schnellmann 2010, Chen et al 2011). No obstante, el

tratamiento provoco una caída en el consumo de oxígeno en el estado 4 que puede

deberse a su capacidad para insertarse en la membrana la interna mitocondrial

protegiéndola del daño inducido por las ROS como ha sido descrito previamente (Megli and

Sabatini 2003).

El ácido lipoico ha sido definido como el “antioxidante de los antioxidantes” (Packer, Witt

and Tritschler 1995) y su capacidad para disminuir la producción de ROS se ha comprobado

en numerosas investigaciones en modelos in vitro (Jia et al 2007) e in vivo (Shen et al 2008).

En este sentido, nuestros datos mostraron una disminución en la producción de O2*‐, lo

cual se corrobora con estudios llevados a cabo con ácido dihidrolipoico, la forma reducida

del ácido lipoico (Schonheit, Gille and Nohl 1995). A diferencia de lo observado con la

vitamina C y el resveratrol, en el caso del ácido lipoico esta disminución no puede ser

explicada por el aumento de la actividad de la Sod2. Sin embargo, esta inhibición podría

justificarse por diferentes mecanismos asociados a procesos redox implicados en el

mantenimiento del balance del ácido lipoico y el dihidrolipoico, el cual posee una elevada


374

capacidad para la neutralización de O2*‐ (Haramaki et al 1997). Por otro lado, diversos

trabajos han descrito la capacidad del ácido lipoico para estimular la actividad de las

principales enzimas antioxidantes (Jia et al 2007, Long et al 2009, Padmalayam et al 2009).

A pesar de estos hallazgos, actualmente se ha establecido que esta molécula puede tener

efectos pro‐oxidantes en función de la concentración, el tiempo de incubación así como el

modelo experimental empleado (Cakatay 2006, Moini, Packer and Saris 2002). De hecho, en

este estudio se muestra que el tratamiento con AL induce un aumento en la producción de

H2O2 comparado con su control, dicho incremento podría deberse a la inhibición de la

mtGpx inducida por el antioxidante. Datos similares han sido descritos anteriormente por

Dicter et al (2002) en similares condiciones experimentales a las empleadas en este trabajo

(Dicter, Madar and Tirosh 2002).

En relación a los efectos del ácido lipoico sobre el funcionamiento de la cadena de

transporte de electrones observamos que de entre los tres antioxidantes empleados era el

que ejercía una acción más intensa en los parámetros respiratorios. Así, nuestros datos

revelaron que el ácido lipoico induce un fuerte desacoplamiento de la cadena de electrones

debido principalmente al aumento en el consumo de oxígeno durante la fase fosforilativa

de la OXPHOS. En efecto, datos similares fueron observados por Schönheit et al (1995) en

mitocondria aisladas de cardiomiocitos de rata tratados con ácido lipoico (Schonheit, Gille

and Nohl 1995). Por otro lado, Morkunaite et al (2003) en condiciones experimentales

similares a las del presente estudio observaron una disminución en el potencial de

membrana inducida por el antioxidante que se asoció al desacoplamiento de la CTE

(Morkunaite‐Haimi et al 2003). Además, al igual que la vitamina C, disminuyó el ratio P/O lo

cual puede estar relacionado con la disminución de la eficiencia metabólica observada en el

estudio in vivo y que se explicara más adelante.

Estos datos muestran que bajo nuestras condiciones experimentales y en mitocondrias

aisladas de hígado la vitamina C y el resveratrol actúan según su naturaleza antioxidante

pero cada uno con diferente magnitud y sin afectar de forma significativa a la respiración

mitocondrial. Sin embargo el ácido lipoico, en las mismas condiciones, se comportó como

una sustancia pro‐oxidante y además mostró su capacidad para modular la actividad de la

cadena de transporte de electrones, incluso a tiempos cortos de tratamiento.

Debido a estos resultados, decidimos comprobar cuál era el comportamiento de esta

molécula sobre el estado antioxidante sistémico y en el compartimento mitocondrial


375

hepático en un modelo in vivo en el que se indujeron diferentes variaciones en el balance

antioxidante/pro‐oxidante a través de modificaciones dietéticas.

La capacidad del ácido lipoico como potenciador de las defensas antioxidantes endógenas

ha sido ampliamente descrita en la bibliografía (Long et al 2009, Padmalayam et al 2009).

En este sentido, nuestros resultados confirman el papel estimulador de esta molécula sobre

las defensas antioxidantes a nivel eritrocitario. Así, nuestros datos mostraron como la

suplementación con ácido lipoico inducía un aumento en la actividad de la Sod y la Gpx así

como en el ratio GSH:GSSG en animales sin un aumento del estrés oxidativo como ha sido

previamente descrito en otros modelos animales (Marsh, Laursen and Coombes 2006,

Caylak, Aytekin and Halifeoglu 2008).

Paradójicamente nuestros resultados muestran que los efectos del ácido lipoico sobre las

defensas antioxidantes son mayores cuando se da una situación aumento del estrés

oxidativo previa como puede ser la obesidad inducida por la ingesta de una dieta alta en

grasa (Dhibi et al 2011, Koek, Liedorp and Bast 2011). Estos datos sugieren, que este

antioxidante promueva mecanismos compensatorios frente a un aumento del estrés

oxidativo, lo cual concuerda con la falta de efectos antioxidantes del ácido lipoico

observados en el ensayo in vitro anteriormente descrito en el cual no se generó

previamente un estado pro‐oxidante. De hecho, efectos similares se han descrito para otros

tratamientos dietéticos, como en el caso de la suplementación de la dieta con EPA (Perez‐

Matute et al 2007).

Por otro lado, nuestros datos muestran un aumento importante de los niveles de TBARS y

del daño oxidativo en el mtDNA hepático así como una disminución en las defensas

antioxidantes mitocondriales en los animales obesos. En este sentido, múltiples estudios

han descrito el papel del estrés oxidativo y la disfunción mitocondrial como factores

centrales en la evolución de la NAFLD asociada a obesidad (Perez‐Carreras et al 2003,

Rector et al 2010). Teniendo en cuenta, la silente progresión de la esteatosis a formas

compleja de la NAFLD como la NASH, que además requieren para su diagnóstico de técnicas

invasivas como la biopsia hepática (Cortez‐Pinto and Camilo 2004, Adams and Feldstein

2011) quisimos analizar la relación entre la defensas antioxidantes eritrocitarias y los

diferentes marcadores de daño oxidativo a nivel hepático, especialmente en el

compartimento mitocondrial. Así, nuestros datos revelan la existencia de una estrecha

correlación entre las defensas antioxidantes a nivel eritrocitario y los valores en el

compartimento hepático mitocondrial así como con el daño oxidativo tanto en situaciones


376

pro‐oxidantes, como la obesidad, como en situaciones en la que se da un aumento de las

defensas antioxidantes, como en el caso de los animales alimentados con una dieta control

suplementada con AL. En consecuencia, los resultados del presente estudio sugieren la

posibilidad de que el estado antioxidante a nivel eritrocitario sea un buen marcador

mínimamente invasivo para valorar la evolución de la NAFLD.

Tras confirmar que el tratamiento con ácido lipoico aumenta las defensas antioxidantes a

nivel sistémico y que es un buen marcador del estado oxidativo en el hígado, nos

planteamos analizar los efectos de este antioxidante sobre el desarrollo de NAFLD inducida

por una dieta alta en grasa, así como los mecanismos implicados en estos efectos a nivel

mitocondrial.

Para ello en esta parte del estudio empleamos un modelo animal de obesidad inducida por

una dieta alta en grasa. La administración de la dieta hipercalórica indujo un aumento

significativo en la ganancia de peso de las ratas, tal y como había sido descrito

anteriormente (Lira et al 2011, Prieto‐Hontoria 2009). La dosis de ácido lipoico utilizada es

similar a la de otros ensayos en los que también se ha observado la capacidad de este

antioxidante para prevenir o revertir la obesidad y la acumulación de grasa en el hígado en

modelos animales de obesidad (Huong and Ide 2008, Kim et al 2004, Prieto‐Hontoria 2009).

Por otro lado, estudios previos han evidenciado las propiedades anorexígenas del ácido

lipoico a dosis similares a las empleadas en esta investigación (Kim et al 2004, Shen et al

2008, Song et al 2005). Nuestros datos confirmaron que los animales tratados con ácido

lipoico disminuían significativamente su ingesta de alimento, por lo que para poder analizar

si los efectos observados eran secundarios exclusivamente a la restricción calórica se

incluyo en el estudio un grupo pair‐fed con el que fueron comparadas todas las variables

analizadas.

La teoría del “doble impacto” postula que en la evolución de la NAFLD se da un primer

estadio provocado por la acumulación de grasa en el hígado (Day 2002, Day 2006). En este

sentido, algunos estudios han demostrado la capacidad del ácido lipoico para prevenir la

acumulación ectópica de triglicéridos a nivel hepático a través de la activación de diversos

mecanismos (Huong and Ide 2008, Park et al 2008). En el presente estudio se confirma la

capacidad del ácido lipoico para prevenir esta primera fase de la instauración de la NAFLD,

siendo este efecto claramente inducido por el antioxidante y no por la disminución en la


377

ingesta. En cuanto a los mecanismos implicados, Park et al (2008) describieron que el

tratamiento con ácido lipoico era capaz de prevenir la acumulación de grasa en el hígado de

ratas alimentadas con una dieta alta en grasa por la disminución en la expresión de Srebp1

modulada a través de la AMPK (Park et al 2008). La disminución de los niveles de mRNA de

Srebp1 también fue observada en nuestro estudio, sin embargo estos niveles eran similares

en el grupo pair‐fed lo que sugiere que esté asociada a la disminución de la ingesta. Sin

embargo, el ácido lipoico fue capaz de disminuir la expresión del gen Dgat2, que está

implicado en la síntesis de triglicéridos (Yu et al 2005) y en el desarrollo de esteatosis

hepática (Millar et al 2006), mientras que en el grupo pair‐fed no se observaron variaciones

significativas en la expresión de este gen.

Por otro lado, la disminución en la expresión de distintos genes implicado en la β‐oxidación

mitocondrial y peroxisomal se ha asociada con el desarrollo de NAFLD (Browning and

Horton 2004, Perez‐Echarri et al 2009). En efecto, nuestros datos muestran que la ingesta

de la dieta alta en grasa induce una disminución en genes implicados en estos procesos

como el Cpt1, Acadl y Acox1. Además, el tratamiento con este antioxidante fue capaz de

revertir estos efectos sobre los tres genes analizados. Especialmente interesantes son los

efectos observados sobre la expresión de Acadl cuyo papel central en la regulación de la β‐

oxidación mitocondrial y el desarrollo de la NAFLD ha sido descrito en diversos estudios

(Hirschey et al 2010, Zhang et al 2007). De hecho, Hirschey et al (2010) describieron en

ratones Sirt3 ‐/‐ que la desacetilación de Acadl por Sirt3 jugaba un papel fundamental en la

regulación de la oxidación de ácidos grasos durante el ayuno (Hirschey et al 2010). En el

presente trabajo describimos que el ácido lipoico estimula tanto la expresión génica como

los niveles de proteína de la Sirt3 en el hígado y que dicha estimulación no es secundaria a

la disminución en la ingesta. Por otro lado, aunque no se han analizado los niveles de

acetilación de Acadl el aumento en la desacetilación de otras dianas de la Sirt3 como el

factor de transcripción Foxo3a parecen indicar que esta proteína se encuentre desacetilada

y por tanto su actividad esté también aumentada en los animales tratados con ácido

lipoico.

Numerosos estudios han descrito el papel central del Pgc1β en la prevención de la

esteatosis hepática y una disminución en la expresión génica de este factor de transcripción

en animales alimentados con una dieta alta en grasa (Sonoda et al 2007, Meirhaeghe et al


378

2003, Hernandez and Lin 2009). De acuerdo con esas investigaciones, nuestros datos

muestran que la ingesta de una dieta alta en grasa redujo los niveles de mRNA del Pgc1β y

que este efecto es revertido por el tratamiento con ácido lipoico. Algunos autores han

propuesto que Pgc1β ejerce su acción mediante la regulación de la actividad transcripcional

de Pparα (Song et al 2010, Sonoda et al 2007), cuyo papel estimulador de la β‐oxidación

mitocondrial está ampliamente descrito en la literatura (Haemmerle et al 2011, Song et al

2010). En este sentido, observamos que el tratamiento con ácido lipoico estimulaba la

expresión de Pparα hasta niveles superiores a los observados en los animales control, en

concordancia con datos recientemente publicados por El Midaouis et al (2011) (El Midaoui

et al 2011).

En cuanto a la regulación de Pgc‐1β, Kelly et al (2009) describieron que su actividad estaba

regulada mediante procesos de desacetilación mediados por Sirt1 (Kelly et al 2009). Por

otra parte, numerosos estudios han descrito en los últimos años el papel central de esta

sirtuina en el control del metabolismo lipídico, fundamentalmente en situaciones de ayuno

(Schug and Li 2011, Buler et al 2011, Ponugoti et al 2010). Nuestros datos muestran que el

efecto del ácido lipoico sobre la expresión de Sirt1 parece deberse a la disminución en la

ingesta. Sin embargo, nuestro estudio describe por primera vez el importante papel

estimulador de este antioxidante sobre los niveles de proteína de Sirt1.

Todos estos datos sugieren que el tratamiento con ácido lipoico es capaz de prevenir la

acumulación ectópica de triglicéridos en el hígado, al menos en parte, mediante la

modulación del metabolismo lipídico hepático a través de la estimulación de la Sirt1 y la

Sirt3.

Por otro lado, la resistencia a la insulina se considera como el factor fisiopatológico

individual más importante en el desarrollo de la esteatosis (Browning and Horton 2004,

Garcia‐Monzon et al 2011, Vanni et al 2010). En este sentido, numerosos estudios

desarrollados en animales (Cummings et al 2010, El Midaoui et al 2011, Kandeil et al 2011)

y en humanos (Lee and Dugoua 2011, de Oliveira et al 2011, Poh and Goh 2009), han

descrito la capacidad de esta molécula de aumentar la sensibilidad a la insulina y disminuir

los niveles plasmáticos de glucosa. De acuerdo con estas investigaciones, nuestros

resultados muestran que la suplementación con ácido lipoico revirtió los efectos de la dieta

alta en grasa sobre la sensibilidad a la insulina, disminuyendo los niveles plasmáticos de


379

insulina y el índice HOMA hasta valores control. Sin embargo, la disminución en la ingesta

aunque también mejoró la sensibilidad a la insulina lo hizo con una intensidad menor a lo

observada con el tratamiento con el ácido lipoico.

Una vez determinado que el tratamiento con ácido lipoico era capaz de prevenir la

esteatosis hepática, el siguiente objetivo fue evaluar los efectos de este antioxidante sobre

los principales factores implicados en el “segundo impacto”. Uno de los principales

componentes del daño hepático es el desarrolló de inflamación y fibrosis. En este sentido,

investigaciones recientes han descrito que el tratamiento con ácido lipoico es capaz de

disminuir la fibrosis mediante la activación de PAI‐1 (Min et al 2010). Por otro lado, Foo et

al (2011) observaron que este antioxidante inhibía la activación de células estelares

hepática in vitro (Foo et al 2011). Aunque en el presente estudio no hemos analizado

molecularmente estos fenómenos el análisis histológico mostró, en concordancia con estos

estudios, que el tratamiento con AL disminuía la presencia de células inflamatorias, células

estelares hepáticas y células de Kupfer activas en el tejido hepático. De igual manera,

observamos que prevenía el aumento de fibras de colágeno en torno a las paredes

vasculares y en el parénquima hepático inducido por la dieta alta en grasa.

La evidencia de que la disfunción mitocondrial hepática juega un papel fundamental en la

evolución de la NAFLD está ampliamente descrita en la literatura (Krawczyk, Bonfrate and

Portincasa 2010, Rector et al 2010, Serviddio et al 2011, Sookoian et al 2010), por lo que el

análisis de la función mitocondrial fue el siguiente objetivo de esta investigación. Así,

nuestros datos mostraron por primera vez que el ácido lipoico reduce la actividad de la

mayoría de los complejos de la cadena de transporte de electrones, lo que desembocaba en

una disminución en la eficiencia de la fosforilación oxidativa y en una menor síntesis de

ATP. Estos resultados contrastaron con el efecto estimulador del antioxidante sobre

enzimas fundamentales del Ciclo de Krebs (Succinato deshidrogenasa y citrato sintasa), si

bien esta acción ha sido descrita previamente en diversas investigaciones (Sudheesh et al

2009, Sudheesh et al 2010) y concuerda con el papel de esta molécula como co‐factor de

enzimas esenciales del Ciclo de Krebs (Packer and Cadenas 2011, Patel and Packer 2008).

Estos datos sugieren, que el ácido lipoico induzca una disminución en la eficiencia de la

fosforilación oxidativa, mediante el desacoplamiento en la cadena de transporte de

electrones o un funcionamiento reverso de la ATP sintasa en ausencia del gradiente


380

electroquímico, como un mecanismo compensatorio al aumento de grasa y energía

proporcionados por la dieta. De hecho, esta hipótesis esta en concordancia con los datos

aportados en el estudio in vitro, en el que se observó que el ácido lipoico provocó un

desacoplamiento de la cadena de transporte, debido fundamentalmente a la disminución

en el consumo de oxígeno en el estado 3. Además, se observó una disminución en la

eficiencia energética en los animales tratados con ácido lipoico, confirmado datos previos

descritos por Luz et al (2009) (Luz, Zemdegs and Amaral 2009). Por otro lado, se observó un

aumento en los niveles de mRNA de la Ucp2 tras el tratamiento con esta molécula que

están de acuerdo con los datos obtenidos en el estudio in vitro anteriormente descritos.

A continuación nos centramos en el estudio de los efectos de este antioxidante sobre la

biogénesis mitocondrial. Así, nuestros datos muestran que el tratamiento con AL indujo un

aumento en el número de copias de mtDNA y una disminución en la masa mitocondrial. Sin

embargo, la dieta alta en grasa indujo los efectos contrarios, lo que sugiere la aparición de

mega‐mitocondrias menos funcionales en los animales obesos de acuerdo a lo descrito por

numerosos autores (Raffaella et al 2008, Mollica et al 2009).

En relación a la regulación de la biogénesis mitocondrial, es necesario que se dé la

interacción entre el genóma mitocondrial y el nuclear, de hecho, está regulada por

numerosos factores de transcripción y co‐activadores nucleares. En los últimos años,

númerosos autores han resaltado el papel central del Pgc1α y de su activación por Sirt1 en

la regulación de este proceso (Canto and Auwerx 2009, Fernandez‐Marcos and Auwerx

2011). Algunos estudios han descrito que el tratamiento con ácido lipoico es capaz de

estimular la expresión de Pgc1α en diferentes tejidos (Wang et al 2010, McCarty, Barroso‐

Aranda and Contreras 2009). De acuerdo con estas investigaciones observamos que este

antioxidane era capaz de aumentar los niveles de expresión de Pgc1α. Sin embargo, los

datos observados en el grupo OLIP y PFO eran muy similares sugiriendo que los cambios en

los niveles de mRNA de este co‐activador son secundarios a la disminución en la ingesta

como ha sido descrito en estudios previos desarrollados en animales sometidos a

restricción calórica (Civitarese et al 2007).

No obstante y como hemos mencionado anteriormente, en este estudio observamos que el

AL inducía un aumento en la expresión y la desacetilación de Pgc1β que podía estar

mediado por Sirt1. En relación al papel de este co‐activador en la regulación de la


381

funcionalidad mitocondrial y la homeostasis energética, este ha sido analizado

profundamente en los últimos años (Gao et al 2011a, Gao et al 2011b, Kelly et al 2009,

Liesa et al 2008, Shao et al 2010, Srivastava et al 2009). De hecho, Shao et al (2010)

propusieron que Pgc1β poseía una mayor capacidad para la estimulación de la biogénesis

mitocondrial que su homólogo el Pgc1α a través de la estimulación de Nrf1 (Shao et al

2010). De acuerdo con este estudio, nuestros datos mostraron que el antioxidante ejercía

sobre la expresión de Nrf1 efectos similares a los observados para Pgc‐1β. Por otro lado, se

estableció una fuerte correlación entre los niveles de mRNA de Pgc1β y el número de

copias de mtDNA. Otro de los factores que ha sido extensamente revisado como

activadores de la biogénesis mitocondrial son las desacetilasas dependientes de NAD+ de la

familia de las sirtuinas, especialmente la Sirt1 (Canto and Auwerx 2009, Haigis and Sinclair

2010). Como se ha descrito previamente en este estudio, nuestros datos mostraron una

activación de la Sirt1 en los animales tratados con ácido lipoico. Todos estos resultados

parecen sugerir que el ácido lipoico estimula la biogénesis mitocondrial a través de la

acetilación de Pgc1β por Sirt1, promoviendo así un aumento en el número de mitocondrias,

lo cual contribuye a corroborar la hipótesis formulada anteriormente acerca de la

estimulación de mecanismos compensatorios al exceso de energía para prevenir la

acumulación de grasa a nivel hepático.

El principal factor responsable del “segundo impacto” en la evolución de la NAFLD es el

estrés oxidativo que desencadena una serie de daños en diferentes componentes celulares

(Koek, Liedorp and Bast 2011, Gambino, Musso and Cassader 2011). En este sentido,

algunos autores han descrito elevados niveles de MDA en animales con NAFLD (Park et al

2011, Caito et al 2010), resultados similares a los observados en nuestros animales

alimentados con una dieta alta en grasa. Asimismo, hemos podido describir que el

tratamiento con AL prevenía el aumento de la peroxidación lipídica asociada al hígado

graso.

Teniendo cuenta que el estrés oxidativo esta caracterizado por un desequilibrio entre la

producción de ROS y las defensas antioxidantes, en primer lugar analizamos la producción

de ROS. Sorprendentemente, observamos que el AL inducía un aumento en la producción

de O2‐● que se debe, al menos en parte, a la disminución en la actividad de los complejos I y

III de la cadena de transporte de electrones como ha sido descrito anteriormente (Brand


382

2010, Brand et al 2004). Sin embargo, los efectos de la dieta alta en grasa en la producción

de H2O2 se revirtieron hasta los niveles control en los animales tratados con AL mientras

que el grupo pair‐fed mostró niveles elevados similares a los de los animales obesos. Estos

datos coinciden con los observados en relación a la peroxidación lipídica, encontrándose de

hecho una fuerte correlación entre ambos parámetros.

Teniendo en cuenta estos datos y dado el hecho de que en los animales alimentados con

una dieta alta en grasa existe un aumento del estrés oxidativo, y por tanto, del daño en el

mtDNA quisimos analizar el efecto del ácido lipoico sobre dicho daño oxidativo en el

mtDNA. Así observamos que, como en el caso de la peroxidación lipídica, el ácido lipoico

fue capaz de revertir los efectos del la dieta alta en grasa sobre el daño oxidativo del

mtDNA. Además, encontramos una elevada correlación entre el daño en el mtDNA y la

producción mitocondrial de H2O2, lo cual sugiere que el aumento de esta ROS sea la

responsable del incremento del daño en el mtDNA.

En relación al daño en el mtDNA quisimos estudiar los efectos de la dieta alta en grasa y del

ácido lipoico sobre los mecanismos de reparación del DNA. En este sentido, la enzima Parp

es la principal responsable de la reparación del daño del DNA (Orsucci, Mancuso and

Siciliano 2008). Si bien tradicionalmente se ha descrito su expresión únicamente en el

núcleo, Jarret et al (2007) describieron la presencia de esta enzima a nivel mitocondrial. Al

mismo tiempo, propusieron que el aumento del estrés oxidativo mitocondrial inducía la

activación de la caspasa 3 responsable del procesamiento de Parp en dos fragmentos

inactivos provocando la acumulación del daño oxidativo en el mtDNA (Jarrett and Boulton

2007). Nuestros datos mostraron que en los animales obesos había un predominio de la

forma procesada de Parp mientras que en los animales tratados con ácido lipoico

aumentaban los niveles de la forma sin procesar. Estos datos sugieren, que el ácido lipoico

además de prevenir el daño oxidativo en el mtDNA es capaz de estimular la reparación del

mismo a través de Parp.

Varios estudios han descrito que la dieta alta en grasa induce una disminución en las

defensas antioxidantes hepáticas (Raffaella et al 2008, Park et al 2011), de hecho, los datos

analizados en esta tesis corroboran estos estudios. Es más, nuestros datos demuestran la

capacidad del ácido lipoico para estimular las defensas antioxidantes mitocondriales de

forma independiente a la disminución en la ingesta inducida por el antioxidante.


383

En cuanto a los posibles mecanismos por los que el AL ejerce sus acciones estimuladoras

sobre las defensas antioxidantes mitocondriales, se analizó el papel de la familia de los

factores de transcripción Foxo. Este conjunto de factores de transcripción ejercen

numerosas funciones entre las que se incluye la detoxificación de ROS y la reparación del

DNA. En particular, la capacidad del Foxo3a para estimular las defensas antioxidantes

mitocondriales ha sido descrita en varias investigaciones (Kops et al 2002, Sundaresan et al

2009). Además, Jacobs et al (2008) describieron la presencia de este factor de transcripción

en la mitocondria y sugirieron que su actividad estaba regulada por la interacción con la

Sirt3 en la mitocondria (Jacobs et al 2008). De acuerdo con esta hipótesis otras

investigaciones observaron que Foxo3a se activaba especificamente a través de su

desacetilación en respuesta a situaciones de estrés oxidativo (Brunet 2004). En este

contexto, nuestros resultados demuestran que la dieta alta en grasa aumenta los niveles de

acetilación de Foxo3a mientras que el ácido lipoico revierte estos efectos hasta niveles

control.

Por otro lado, nuestros datos muestran por primera vez que el AL es capaz de inducir un

aumento significativo en la expresión y en los niveles de proteína de la Sirt3, mientras que

la dieta alta en grasa disminuía la expresión y aunque no ejercía efectos significativos sobre

los niveles totales de Sirt3, sí que se observó una importante reducción en la isoforma de

27 KDa. En este sentido, varias investigaciones han definido que la Sirt3 posee diferentes

isoformas con varias localizaciones celulares y niveles de actividad (Alhazzazi et al 2011,

Hallows, Albaugh and Denu 2008). Así, la isoforma corta se encuentra principalmente en la

mitocondria y es más activa que la larga (44 KDa) que está presente en el núcleo y es

inactiva (Schwer et al 2002, Cooper et al 2009). Teniendo en cuenta estos datos, nuestros

resultados parecen sugerir que el AL estimula las defensas antioxidantes mitocondriales

mediante la estimulación de la Sirt3 que, a su vez, es responsable de la activación del factor

de transcripción Foxo3a, regulador último de estas defensas.

En resumen, los datos del presente trabajo muestran la capacidad del ácido lipoico para

prevenir la instauración y el desarrollo de la enfermedad hepática no alcohólica asociada a

la ingesta de una dieta alta en grasa modulando la función mitocondrial y el estrés

oxidativo. Así, en un primer estadio de la enfermedad hepática no alcohólica el ácido


384

lipoico mejora la sensibilidad a la insulina y previene la acumulación ectópica de grasa

mediante la regulación de genes implicados en el metabolismo lipídico en el higado,

fundamentalmente, aumentando la expresión de genes implicados en la β‐oxidación (Cpt1,

Acadl y Acox1) y disminuyendo los relacionados con la lipogénesis (Srebp1 y Dgat2). Por

otro parte, el ácido lipoico modula la homeostasis energética mitocondrial en el hígado,

induciendo mecanismos compensatorios al exceso de energía y lípidos suministrado en la

dieta. Fundamentalmente, la disminución de la actividad de la cadena de transporte de

electrones y la síntesis de ATP, el aumento en la actividad del Ciclo de Krebs y el incremento

de la biogénesis mitocondrial. Además, este antioxidante disminuyó el estrés y el daño

oxidativo en el compartimento mitocondrial hepático a través de la estimulación de las

defensas antioxidantes mitocondriales.

En este estudio también se ha descrito por primera vez que el ácido lipoico es un potente

activador de la Sirt1 y la Sirt3. Así, nuestros datos sugieren que las acciones preventivas de

este antioxidantes sobre la disfunción mitocondrial y el estrés oxidativo en el

compartimento hepático mitocondrial asociadas a la NAFLD, estén mediadas por la

estimulación de las sirtuinas y la consecuente desacetilación de dos de sus principales

dianas, el Pgc1β y el Foxo3a. En este sentido, serian necesarios experimentos in vitro para

la profundización acerca de los mecanismos implicados en la estimulación de las sirtuinas

por este antioxidante, siendo este uno de los puntos más interesantes de este estudio. En la

misma línea de investigación, se deberían analizar los efectos del ácido lipoico sobre la

desacetilación de otras dianas de las sirtuinas como la Sod2 o el complejo I de la cadena de

transporte de electrones y sus repercusiones en la enfermedad hepática no alcohólica y

otras patologías asociadas a la obesidad.


385

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Conclusiones/Conclusions

Chapter 6 Conclusions Capítulo 6 Conclusiones

399

CONCLUSIONES

1. La incubación de mitocondrias aisladas de hígado de rata con vitamina C y resveratrol

indujo una disminución en la producción de ROS (O2*‐ y H2O2). En el caso de la

vitamina C, dicha disminución parece mediada por el aumento en la actividad de las

principales defensas antioxidantes enzimáticas (Sod2 y mtGpx). Sin embargo, el

resveratrol no indujo cambios importantes en la actividad de dichas defensas

antioxidantes. Por otro lado, estos antioxidantes no indujeron cambios significativos

en la cadena de transporte de electrones, si bien ambas moléculas disminuyeron el

ratio P/O, indicador de la eficiencia de la cadena transportadora de electrones.

2. El tratamiento con ácido lipoico de mitocondrias aisladas de hígado de rata presentó

efectos pro‐oxidantes al inducir un aumento en la producción de H2O2 y una

inhibición de la actividad de la glutatión peroxidasa. Además, el ácido lipoico provocó

un desacoplamiento de la cadena de transporte electrónico asociado a una

disminución del consumo de oxígeno en el estado 3 y una bajada del ratio P/O.

3. El ácido lipoico, en contraposición con lo observado in vitro, revirtió el aumento del

estrés oxidativo y el daño oxidativo en el compartimento mitocondrial hepático

asociado a la evolución de la NAFLD a NASH inducida por una dieta alta en grasa.

Principalmente, mediante la estimulación de las defensas antioxidantes

mitocondriales (Sod2, mtGpx y ratio GSH:GSSG).

4. La medida de las defensas antioxidantes eritrocitarias podría ser un adecuado

biomarcador, mínimamente invasivo, del estado antioxidante en el compartimento

hepático mitocondrial. En consecuencia, también de la evolución de la enfermedad

hepática no alcohólica inducida por la ingesta de una dieta alta en grasa. De hecho,

se encontró una estrecha asociación entre las defensas antioxidantes en ambos

tejidos, eritrocitos e hígado, así como una relación inversa con la acumulación de

grasa en el hígado y el daño en el mtDNA.

5. La suplementación de un dieta control y alta en grasa con ácido lipoico aumentó las

principales defensas antioxidantes en eritrocitos y en el compartimento hepático

Capítulo 6 Conclusiones Chapter 6 Conclusions

400

mitocondrial. Los efectos estimulantes del ácido lipoico sobre el ratio GSH:GSSG y la

actividad glutatión peroxidasa fueron de intensidad mayor en los animales

alimentados con una dieta alta en grasa en comparación con los alimentados con

dieta control.

6. La suplementación de una dieta alta en grasa con ácido lipoico fue capaz de prevenir

la esteatosis hepática en un modelo animal de obesidad inducida por la dieta. Esta

acción puede atribuirse a la disminución en la expresión de genes lipogénicos,

especialmente Dgat2, así como al aumento de genes implicados en la β‐oxidación de

ácidos grasos (Acox1 y Acdl). Además, el ácido lipoico redujo el índice HOMA,

marcador de resistencia a la insulina.

7. El ácido lipoico disminuyó la eficiencia metabólica al reducir la actividad de la cadena

de transporte de electrones, la producción de ATP y la expresión génica de Ucp2, a

pesar de aumentar la actividad de las principales enzimas del ciclo de Krebs. Estos

resultados parecen sugerir que la inhibición de la actividad de la cadena de

transporte de electrones inducida por este antioxidante sea un mecanismo

compensatorio frente al exceso de la ingesta energética.

8. El ácido lipoico estimuló la biogénesis mitocondrial en el hígado asociada a una

disminución en la masa mitocondrial, lo que sugiere que este antioxidante produce

un aumento en el número y la eficiencia de las mitocondrias. Consecuentemente, los

animales del grupo suplementado con ácido lipoico mostraron niveles elevados en la

expresión de los principales genes implicados en la biogénesis mitocondrial (Pgc‐1α,

Pgc1β y Nrf1), siendo especialmente relevante el aumento observado en Pgc‐1β.

9. La suplementación de una dieta alta en grasa con ácido lipoico indujo un aumento en

los niveles de proteína de Sirt1 y Sirt3 en hígado. Además, dichos niveles se

correlacionaron con un aumento en la desacetilación de Pgc1β y Foxo3a,

respectivamente. Estos datos sugieren que los efectos beneficiosos del ácido lipoico

sobre las defensas antioxidantes, la biogénesis y función mitocondrial así como sobre

la homeostasis energética esten mediados por la acción del antioxidante sobre las

sirtuinas.


401

CONCLUSION GENERAL

La vitamina C, el resveratrol y el ácido lipoico son capaces de modular la función

mitocondrial y el balance oxidativo en mitocondrias hepáticas a través de diferentes

mecanismos. En particular, el tratamiento de animales de experimentación con ácido

lipoico fue capaz de prevenir el desarrollo de la esteatosis hepática inducida por una

dieta alta en grasa. Este efecto se debió, fundamentalmente, a su acción beneficiosa

sobre algunos de los principales factores implicados en la evolución de la enfermedad

hepática no alcohólica, como son, la resistencia a la insulina, el estrés oxidativo y la

disfunción mitocondrial.


CONCLUSIONS

1. Vitamin C and resveratrol treatment of isolated rat liver mitochondria reduces ROS

production (O2*‐ and H2O2). The effects of vitamin C on ROS production could be

mediated by an increase in mitochondrial antioxidant defenses (Sod2 y mtGpx).

However, resveratrol did not induce important changes on antioxidant enzymes.

Moreover, both antioxidants did not produced significant changes in the activity of

electron transport chain, while both decreased P/O ratio.

2. The treatment of rat liver mitochondria with lipoic acid presents pro‐oxidant effects

by stimulating H2O2 production and reducing mtGpx activity. Moreover, lipoic acid

induced an uncoupling of electron transport chain linked to a decrease in oxygen

consumption in respiratory state 3 and a fall in the P/O ratio.

3. Dietary supplementation with lipoic acid, in contrast to the in in vitro findings,

reversed the increase of oxidative stress and oxidative damage linked to the

evolution of NAFLD to NASH in mitochondrial liver compartment. This condition may

be associated to the increase of some mitochondrial antioxidant defenses (Sod2,

mtGpx y GSH:GSSG ratio).

4. The assessment of antioxidant defences in erythrocytes could be used as good

surrogate marker, minimally invasive, of the mitochondrial antioxidant status in the

liver, and consequently, it could be good predictor of the development of NAFLD

after a high fat diet. This outcome could be attributed to an association between

antioxidant defences in erythrocytes and liver. Furthermore, an inverse relationship

of erythrocyte antioxidant defences and lipid accumulation in the liver and oxidative

damage in mtDNA was also observed.

5. LA supplementation of a standard and high fat diet induced an increase of main

antioxidant defenses in erythrocytes and also in the liver mitochondria. The

stimulatory effects of lipoic acid in GSH:GSSG ratio and mtGpx activity were higher in

animals fed with a high fat diet than in rats fed with standard diet.

Capítulo 6 Conclusiones Chapter 6Conclusions

404

6. Lipoic acid supplementation of high‐fat diet was able to prevent liver steatosis in an

animal model of diet induced obesity. This beneficial effect may be due to a

reduction in mRNA levels of lipogenic genes, especially Dgat2, as well as an increase

in the expression of β‐oxidation related genes (Acox1 y Acdl) induced by lipoic acid in

the liver. Moreover, lipoic acid supplementation reduced HOMA index, a marker of

insulin resistance.

7. Lipoic acid diminished energy efficiency by the decrease of electron transport chain

activity, ATP production and gene expression of Ucp2, despite increasing the activity

of the main enzymes of Krebs cycle. These results suggest that the inhibition of

electron transport chain activity induced by this antioxidant is a compensatory

mechanism against increase in energy intake.

8. Lipoic acid stimulates mitochondrial biogenesis in the liver associated with a

reduction of mitochondrial mass, which suggest that this antioxidant induced an

increase in mitochondrial number and efficiency. Consequently, animals fed with a

lipoic acid supplemented diet showed higher mRNA levels of genes involved in

transcriptional control of mitochondrial biogenesis (Pgc‐1α, Pgc1β y Nrf1),

particularly of Pgc‐1β.

9. Lipoic acid supplementation of HFD stimulates Sirt1 and Sirt3 protein content in the

liver, which was correlated with an increase of Pgc1β and Foxo3a deacetylation

levels, respectively. These results may suggest that the beneficial effects of lipoic acid

on antioxidant defenses, mitochondrial function and biogenesis and also in energy

homeostasis could be mediated through the stimulation of sirtuinas induced by this

antioxidant.


GENERAL CONCLUSION

Vitamin C, resveratrol and lipoic acid is able to regulate mitochondrial function and

oxidative balance in the liver by different mechanisms. Particularly, lipoic acid treatment

is able to prevent the onset of hepatic steatosis induced by a high fat diet intake. These

effects could be explained by beneficial actions on main factors involved in the evolution

of non‐alcoholic fatty liver disease such as insulin resistance, oxidative stress and

mitochondrial dysfunction.


Resumen /Summary

Chapter 7 Summary Capítulo7 Resumen

Non‐alcoholic steatosis is an important hepatic complication of obesity linked to mitochondrial

dysfunction and oxidative stress. Lipoic acid has been reported to have beneficial effects on

mitochondrial function and to attenuate oxidative stress. In this PhD project, I was analyzed

the potential protective effect of lipoic acid supplementation against the development of non‐

alcoholic steatosis associated with a long‐term high‐fat diet feeding and the potential

mechanisms involved in these effects. Particularly, I researched the effects of LA on the

modulation of mitochondrial defenses through the sirtuin pathway. To achieve these

objectives, male Wistar rats were fed a standard diet (C, n=10), a high‐fat diet (OB, n=10) and a

high‐fat diet supplemented with LA (OLIP, n=10). A group pair‐fed to the latter group (PFO,

n=6) was also included.

Lipoic acid prevented hepatic triglyceride accumulation and liver damage in rats fed on a high‐

fat diet (‐68±11.3% vs obese group), through the modulation of genes involved in lipogenesis

and mitochondrial β‐oxidation, and by improving insulin sensitivity. Moreover, this molecule

showed an inhibitory action on electron transport chain complexes activities (P<0.01‐P<0.001)

and ATP synthesis (P<0.05), and reduced significantly energy efficiency. By contrast, lipoic acid

induced an increase in mitochondrial copy number and in Ucp2 gene expression (P<0.001 vs

obese). Moreover, LA prevented liver oxidative damage (P<0.01) through the inhibition of

hydroperoxide production (P<0.001) and the stimulation of mitochondrial antioxidant

defenses. LA treatment up‐regulated manganese superoxide dismutase (60.6%) and

glutathione peroxidase (100.2%) activities, and increased the GSH:GSSG ratio and Ucp2 mRNA

levels (P<0.001‐ P<0.01). Moreover, this molecule reduced oxidative damage in mitochondrial

DNA and increased mitochondrial copy number (P<0.001‐ P<0.01). LA treatment decreased the

acetylation levels of Foxo3a and Pgc1β (P<0.001‐ P<0.01) through the stimulation of Sirt3 and

Sirt1 (P<0.001).

Summary up, our results demonstrate that the beneficial effects of LA supplementation on

hepatic steatosis could be mediated by its ability to restore the oxidative balance by increasing

antioxidant defenses through the deacetylation of Foxo3a and Pgc1β by Sirt1 and Sirt3. Finally,

the novelty and importance of this study is the finding of the role of lipoic acid modulating

some of the mitochondrial processes involved in energy homeostasis. The reduction in

mitochondrial energy efficiency could also explain, at least in part, the beneficial effects of

lipoic acid not only in fatty liver, but also in preventing excessive body weight gain.

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facultad de farmacia - dadun: página de...

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