EVALUACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE TEMPERATURA, PRESIÓ N Y

COSOLVENTE EN LA EXTRACCIÓN DE CERAMIDAS CON CO 2 SUPERCRITICO,

A PARTIR DE LANA DE OVEJA

ARMANDO REYES NAJAR

Cod: 1836031

Director: FABIÁN PARADA ALFONSO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE FARMACIA

ESPECIALIZACIÓN EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA COSMÉTICA

BOGOTÁ D.C.

NOVIEMBRE/2010

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EVALUACIÓN DE LOS PARÁMETROS DE TEMPERATURA, PRESIÓ N Y

COSOLVENTE EN LA EXTRACCIÓN DE CERAMIDAS CON CO 2 SUPERCRÍTICO,

A PARTIR DE LANA DE OVEJA

Armando Reyes Najar, areyesn@unal.edu.co

Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia

Resumen

Las ceramidas son un tipo de lípidos presentes en el estrato corneo de la piel humana que ayuda a mantener el

equilibrio de la hidratación necesaria para la buena conservación de la misma. El presente trabajo indagó el

contenido de ceramidas contenidas en extractos obtenidos a partir de lana de oveja Dorper x criollo, empleando

extracción Soxhlet (cloroformo:metanol, 2:1 v/v) y extracción con fluidos supercríticos (EFS), usando CO2

supercrítico con cosolvente (metanol ó etanol). Con EFS se obtuvieron extractos a 50 y 60 ºC de temperatura y

15,9 y 20,7 MPa de presión, para cada uno de los cosolventes. El extracto obtenido por el método Soxhlet mostró

el mayor rendimiento (23,25 %) y el menor contenido en ceramidas (1,0 %). Los resultados de EFS permitieron

observar que los extractos obtenidos con metanol, presentaron el mayor rendimiento, dándose el mejor

rendimiento de extracción a 60 ºC - 20,7 MPa (4,49 %), con un contenido en ceramidas de 3,4 %. Sin embargo, al

emplear etanol como cosolvente se obtuvieron extractos con contenidos mayores en ceramidas, destacándose el

obtenido a 50 ºC - 15,9 MPa (24,5 % en ceramidas).

Palabras clave: Ceramidas – lanolina – cosméticos – lana de oveja – fluidos supercríticos

Abstract

The ceramides are lipidic compounds. These are in the corneum stratum of human skin. The ceramides help

maintain moisture balance necessary for the skin preservation. This study investigated the ceramides content in

extracts obtained from wool Dorper x criollo sheep, using the Soxhlet extraction (chloroform: methanol, 2:1 v /

v) and the supercritical fluid extraction (EFS) (CO2 as solvent and methanol or etanol as cosolvent). The EFS

extracts were obtained at 50 and 60 º C and 15.9 and 20.7 MPa pressure for each of the cosolvents. The extract

obtained by Soxhlet method showed the highest yield (23.25%) and lower content of ceramides (1.0%). The EFS

results revealed that the extracts obtained with methanol showed the best performance, giving the best yield of

extraction at 60 ° C - 20.7 MPa (4.49%), with 3.4% ceramide. However, when ethanol was using as co-solvent,

the extracts were obtained with higher ceramide content, the best extraction conditions were at 50 º C - 15.9 MPa,

obtaining a extract with 24.5% of ceramides.

Keywords: Ceramides - cosmetics - wool – supercritical fluid extraction

2

1. Introducción

La lana es una fibra natural, suave y ondulada que se extrae principalmente de los ovinos. La

lana de oveja se presenta bajo la forma de una fibra ondulada de un diámetro aproximado de

16 a 40 micrómetros y de un largo de 35 a 350 milímetros (figura 1a). Microscópicamente esta

fibra presenta escamas o pseudoescamas, y un canal central de anchura media (figura 1b). La

grasa forma manchas marrones repartidas de forma irregular sobre el filamento (1).

(a) (b)

Figura 1. Lana de Oveja

1.1. Constitución y composición de la fibra de lana

La fibra de lana presenta tres capas, a saber:

Corteza cuticular: Es la capa mas externa, la cual se compone de células planas poligonales o

escamas superpuestas unas con otras. Consta de tres capas (epicuticular, exocuticular y

endocuticular) y constituye aproximadamente el 10 % de la fibra (2).

Cortical o Córtex: Constituye aproximadamente el 90 % de la fibra. Está formada por células

alargadas paralelas al eje de la fibra que contienen queratina. Estructuralmente esta capa está

integrada por macrofibrillas y éstas a su vez por microfibrillas (2).

3

Médula: Esta capa aparece en lanas gruesas, generalmente no se presenta en lanas finas (2).

Figura 2. Constitución de la fibra de lana

La lana de ovinos está constituida por una fracción proteica (queratina) y una grasa, esta

última compuesta por lanolina (contenido lipídico externo) y un contenido lipídico interno,

rico en ceramidas (3).

Queratina: Es una proteína de naturaleza polimérica que presenta una composición química

elemental de: 51 % de carbono, 17 % de nitrógeno, 22 % de oxígeno, 7 % de hidrógeno y de 3

% de azufre. Dicho polímero es insoluble en agua y sirve para proteger el cuerpo del medio

externo de la lana. Este compuesto químico tiene numerosos enlaces disulfuro que le confieren

gran estabilidad y le permiten resistir la acción de las enzimas proteolíticas. La estructura de

esta proteína le da elasticidad, resistencia y concibe que la lana sea esponjosa (1,3).

Lanolina: Es una sustancia de aspecto y consistencia grasa que se extrae de la lana de oveja y

que tiene como tarea envolver cada fibra con una película impermeable, confiriéndole una

coloración amarillenta. Esta grasa es insoluble en agua, pero forma una mezcla homogénea

con ella. Se funde entre 36 - 41,5 º C. La lana de ovino contiene entre 5 y 20 % de esta grasa,

la cual es secretada por la piel del animal y se deposita sobre las fibras por simple contacto. Se

utiliza como base para ungüentos, cosméticos e ingredientes de jabones (1,3).

Lípidos internos de la lana: Son los lípidos de la estructura interna de la fibra lanar en donde

se pueden encontrar ceramidas naturales, junto con colesterol, ácidos grasos y otros

componentes lipídicos menores (2).

4

Ceramidas: Son compuestos grasos, que hacen parte de un grupo de lípidos complejos

(esfingolípidos), constituidos por una molécula base llamada esfingosina (amino-alcohol de

cadena larga), un ácido graso y un grupo polar que puede llegar a ser muy complejo. La

esfingosina se encuentra conectada por un grupo amino, por medio de una enlace amida, a un

ácido graso saturado o monoinsaturado de 18 a 26 átomos de carbono (4). La figura 3 muestra

ocho tipos diferentes de ceramidas, las cuales se encuentran en forma natural en la piel

humana y constituyen un factor crítico para mantener una buena salud de la piel, así como una

apariencia luminosa y fresca. Las ceramidas intervienen en la estabilidad y en la capacidad

funcional como una barrera de permeabilidad (regulación del balance hidrolipídico cutáneo),

que a su vez depende de un suficiente abastecimiento de ácidos grasos esenciales a la piel.

Figura 3. Estructura de las ceramidas

A partir de lana de oveja se pueden obtener extractos de lípidos internos, los cuales contienen

ceramidas muy semejantes en su composición a las del estrato córneo de la piel humana. Éstas

son una materia prima de la industria cosmética, empleada en la elaboración de productos para

la piel y el cabello, dado que ayudan a prevenir o retardar el envejecimiento prematuro (2).

Algunas investigaciones anteriores muestran que las ceramidas se obtenían por extracción y

aislamiento de tejidos epidérmicos animales, aunque este procedimiento resulta inseguro y de

elevado costo a nivel industrial. En la actualidad en la industria farmacéutica y cosmética se

preparan ceramidas utilizando métodos sintéticos, biotecnológicos o se obtienen por procesos

5

de extracción tradicionales (con solventes). Los métodos sintéticos o biotecnológicos de

producción de ceramidas son de alto costo y el producto obtenido presenta fuertes diferencias

en cuanto a su composición química, respecto a las existentes en la piel humana. Los procesos

de extracción con solventes, aunque no son costosos, pueden inducir degradaciones térmicas u

oxidativas. Mediante la extracción con fluidos supercríticos (EFS) es posible obtener extractos

libres de transgresiones, conservando las características de funcionalidad de éstos (5).

1.2. Extracción con Fluidos Supercríticos (EFS)

Un fluido supercrítico es un estado de la materia en el que ésta es comprensible, tal como los

gases, no obstante tiene la densidad de un líquido (0,1 a 1,0 g/mL) y por lo tanto su poder

disolvente. También puede definirse como un gas denso con poder disolvente controlable, o

bien como una forma de materia en la que los estados líquido y gaseoso son indistinguibles

entre sí. Para lograr esto es necesario que un fluido se encuentre bajo condiciones de presión y

temperatura superiores a las del punto crítico (6).

Los fluidos supercríticos no poseen interfase gas-líquido y poseen propiedades de alta

difusividad respecto a disolventes convencionales, total miscibilidad con otros gases,

viscosidad más baja que la de los líquidos, baja tensión superficial y su densidad depende de la

presión y la temperatura. El principal fluido utilizado en EFS es el dióxido de carbono (CO2)

ya que su temperatura y presión son accesibles (31 ºC-7,38 MPa), su calor de vaporización es

bajo, no es tóxico ni inflamable y además es abundante, económico y reciclable (6).

En el diagrama de fases se indican los procesos a los es sometido el CO2 cuando se emplea en

EFS, en azul se resalta la región supercrítica, ver figura 4. Inicialmente, el CO2 (L) se comprime

y calienta hasta llevarlo a condiciones supercríticas. Bajo estas condiciones, el CO2 actúa

sobre la muestra como solvente; posteriormente la mezcla CO2-extracto se descomprime, con

lo cual el CO2 pasa a fase vapor, perdiendo la capacidad solvatante y liberando el extracto.

Finalmente, se obtiene el extracto libre de solvente y el CO2 (V) se condensa al refrigerarlo, con

lo cual puede reiniciarse el proceso de extracción.

6

Figura 4. Diagrama básico del proceso de EFS

Debido a la dificultad de extracción de las ceramidas, la EFS ha sido empleada en la obtención

de fracciones grasas ricas en ceramidas, a partir de lana de oveja merino de España y

Australia. En dicho trabajo se encontró que en condiciones de temperatura y presión similares,

cuando se usó 20 % de metanol como cosolvente, se obtuvo una alta cantidad de ceramidas. El

hecho más relevante de este trabajo fue la reducción de 20 % a 10 % de cosolvente cuando se

usó etanol, para lograr cantidades equivalentes a las obtenidas con metanol (7). Otro trabajo en

el que se empleó EFS para obtener extractos con altos contenidos de ceramidas, desde fibras

de lana de oveja merino procedentes de España, Neozelanda, Sudafrica, y Australia, concluyó

que el método de extracción Soxhlet presentó rendimientos de extracción muy superiores a los

obtenidos mediante EFS, pero a su vez la EFS fue menos afín por el colesterol y más afín por

la extracción de ceramidas, mejorando el proceso de obtención de extractos enriquecidos en

ceramidas con un menor impacto ambiental (3).

Teniendo en cuenta lo anterior, mediante el presente trabajo, se plantea la posibilidad de

emplear la EFS para obtener fracciones grasas enriquecidas en ceramidas, a partir de lana de

oveja Dorper x criollo, la cual es un residuo de este tipo de animales. Por otra parte, vale la

pena señalar que no se conoce reportes de literatura sobre el contenido de ceramidas en ovinos

Dorper x criollo.

7

2. Metodología

2.1. Materiales y Reactivos

Para el presente estudio se empleó el producto del esquilado de ovinos hembras de Dorper x

criollo del criadero Las Alicias, ubicado en Puente Nacional-Santander. La materia prima

inicialmente se sometió a un proceso de limpieza con un detergente no iónico, posteriormente

se enjuagó con agua para eliminar la materia vegetal y el polvo. Por último, la lana se secó a

40 ºC durante 2 h (8). El CO2 se adquirió a la empresa INGEGAS-Bogotá. Los solventes

orgánicos utilizados fueron marca MERCK calidad HPLC. La muestra de ceramida comercial

C3, fue proporcionada por LIPO CHEMICAL INC. Las extracciones fueron realizadas en el

Laboratorio de Alta Presión del Departamento de Química-Facultad de Ciencias de la

Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá. Se emplearon los equipos de rotavapor y

HPLC de la empresa farmacéutica LABORATORIOS LA SANTÉ.

2.2. Métodos de extracción y análisis

Para obtener los extractos se empleó extracción con solvente orgánico (extracción Soxhlet) y

EFS con cosolvente, cada uno de los extractos se obtuvo por triplicado. Para cada una de las

extracciones se definió el rendimiento y los extractos obtenidos fueron analizados por HPLC.

Extracción con solvente (Soxhlet): La muestra de lana (6,5 g) fue introducida en un dedal de

papel de filtro e insertada en un extractor Soxhlet con una capacidad de 10 mL. La extracción

fue realizada con 100 mL de una mezcla de solventes de cloroformo-metanol (80:20 v/v) por

un tiempo de 1 h. El extracto obtenido fue llevado a sequedad y pesado. Luego fue disuelto en

5 mL de una mezcla cloroformo-metanol (2:1 v/v) para ser almacenado bajo refrigeración.

Extracción con CO2 supercrítico: Se empleó el equipo mostrado en la figura 5, diseñado y

construido en el laboratorio de Alta Presión de la Universidad Nacional, el cual consta de una

entrada de CO2 (A), una entrada para el co-solvente (B), una celda de extracción (C) con una

8

capacidad de 58,4 mL, celda de despresurización (D), un sistema de recolección de muestra

(E), medidores de presión (F), válvulas de control de flujo (G), un regulador de temperatura

(H), una resistencia de calentamiento (I) y una salida de CO2 (J).

Figura 5. Equipo de EFS

En el extractor (C) se depositó la muestra (15,2 g aprox.) y el cosolvente empleado. Armado el

equipo, se inyectó CO2 con ayuda de una bomba neumática HASKEL, hasta alcanzar la

presión deseada. La celda de extracción fue calentada hasta la temperatura requerida ±1 ºC.

Luego de mantener el equilibrio por 1 hora, se permitió el flujo del extracto hacia la celda D,

permitiendo la liberación del CO2 y la recolección del extracto. Como cosolventes se empleó

metanol y etanol, en un 10 % respecto al peso de la muestra. Las presiones y temperaturas de

trabajo fueron 50 y 60 ºC y 15,9 y 20,7 MPa. Los extractos fueron llevados a sequedad y se

pesaron. Posteriormente se disolvieron en 5 mL de cloroformo-metanol (2:1 v/v), se

almacenaron y refrigeraron.

AB

C

D

E

F

G

H

I

J

F

9

En la siguiente tabla se relacionan las condiciones de extracción.

Tabla 1. Condiciones de EFS.

EXTRACCIÓN TEMPERATURA (ºC)

PRESION (MPa) COSOLVENTE

EFS 1 50 15,9 Etanol 10%

EFS 2 60 15,9 Etanol 10%

EFS 3 60 20,7 Etanol 10%

EFS 4 50 15,9 Metanol 10%

EFS 5 50 20,7 Metanol 10%

EFS 6 60 20,7 Metanol 10%

HPLC: El análisis de los extractos fue realizado en un equipo Shimadzu LC 10AVP de bomba

binaria LC 10ATVP, muestreador automático SIL-10AF, horno de columna CTO 10AVP,

detector de arreglo de diodos SPD M10AVP, columna Select-B RP 18 (250 x 4,6 x 5,0), la

cual se mantuvo a 60 ºC. La fase móvil estaba compuesta por una solución (A) de formiato de

amonio 5 mM (pH 4,0)/metanol/tetrahidrofurano (5:2:3, v/v/v) y una solución (B) de formiato

de amonio 5 mM (pH 4,0)/metanol/tetrahidrofurano (1:2:7, v/v/v) (9). A partir de cada

extracto diluido en la mezcla cloroformo-metanol (2:1 v/v) se tomo 1 mL y se llevó a 5 mL de

la misma mezcla de solventes cloroformo-metanol. Para la separación por HPLC, se inyectó

20 µl de cada muestra y se usó un programa de gradiente con un flujo de 0,7 ml/min.

Inicialmente se hizo pasar 100% de la composición del buffer (A), posteriormente se cambió

de forma lineal hasta el 80% del buffer (B) en 19,0 min y se mantuvo durante 11,0 min, a

continuación se vuelve a la condición de equilibrio inicial en 2,0 minutos, el tiempo de análisis

fue de 32,0 min). Para cuantificar el contenido de ceramidas en los extractos obtenidos, se

preparó una solución patrón de 1 mg/mL de ceramida C3 (CC3) en cloroformo-metanol (2:1

v/v) (λmax 219 nm).

10

3. Resultados y Discusión

Los extractos obtenidos por Soxhlet presentaron un color levemente amarillo, alcanzando un

rendimiento promedio de 23,25 %. La totalidad de extractos obtenidos por EFS fueron

incoloros. Al emplear como cosolvente etanol, el rendimiento osciló entre 0,62 y 1,40 %,

mientras que con metanol como cosolvente, el rendimiento fue superior (2,03 a 4,49 %), ver

tabla 2. En EFS se observó un aumento en el rendimiento al aumentar la temperatura o la

presión de extracción. La totalidad de datos correspondientes a las pesadas se encuentran en el

anexo 1.

Tabla 2. Rendimientos obtenidos para cada extracto.

EXTRACTO TEMPERATURA (ºC)

PRESION (MPa) COSOLVENTE

% RENDIMIENTO

PROMEDIO EFS 1 50 15,9 Etanol 10% 0,62

EFS 2 60 15,9 Etanol 10% 0,80

EFS 3 60 20,7 Etanol 10% 1,40

EFS 4 50 15,9 Metanol 10% 2,03

EFS 5 50 20,7 Metanol 10% 2,40

EFS 6 60 20,7 Metanol 10% 4,49

Soxhlet -- -- Cloroformo : Metanol (75:25)

23,25

Respecto a los resultados obtenidos por HPLC, la totalidad de extractos presentaron perfiles

similares, destacándose la señal de 27 min, aprox., la cual corresponde con la presentada por la

CC3 (27,201 min). Con base en lo anterior, se puede afirmar que, posiblemente, en los

extractos obtenidos predomina la CC3, ver tabla 3. La información relacionada con el análisis

de HPLC (cromatogramas, tiempos de retención y áreas) se encuentra en los anexos 2 y 3.

En cuanto al contenido de CC3 en el conjunto de extractos, se encontró que el extracto Soxhlet

presentó el menor contenido de ésta. Por su parte, los extractos obtenidos por EFS presentaron

un mayor contenido de CC3, entre 3,4-7,8 y 11,1-24,5 % empleando como cosolvente metanol

y etanol, respectivamente. Independiente de la naturaleza del cosolvente utilizado, la pureza en

CC3 disminuyó al aumentar las condiciones de temperatura y presión de extracción. Este

11

comportamiento contrastó con el dado para el rendimiento en extracto, el cual aumentó al

aumentar las condiciones de extracción.

La extracción con CO2 supercrítico, con etanol como cosolvente, permitió alcanzar un

contenido en CC3 hasta de un 24,5 %, a 50 ºC-15,9 MPa. Se resalta este resultado, dado que al

emplear CO2 como solvente, sustancia tipo GRAS (generally recognized as safe), y etanol

como cosolvente, sustancia no tóxica, y bajo las condiciones de extracción mas suaves, es

posible obtener extractos con alto contenido de CC3.

Tabla 3. Contenido de ceramida C3 (CC3) en los extractos obtenidos.

EFS 1 EFS 2 EFS 3 EFS 4 EFS 5 EFS 6 Soxhlet

CC3 en la solución (mg/mL) 0,956 0,980 0,974 0,994 0,988 0,963 0,611

% CC3 en los extractos 24,5 19,6 11,1 7,8 6,6 3,4 1,0

% CC3 en la lana 0,158 0,161 0,160 0,164 0,163 0,159 0,232

Dado que en la industria cosmética se emplean extractos de lanolina con un mínimo del 3 %

en ceramidas (10), de acuerdo con los resultados obtenidos, los extractos por EFS con etanol

como cosolvente, son susceptibles de ser aplicados en formulaciones cosméticas.

12

4. Conclusiones

El mayor rendimiento en extracto graso, obtenido a partir de lana de oveja Dorper x criollo, se

logró mediante extracción Soxhlet (23,25 %), seguido de EFS, usando metanol como

cosolvente a 60 ºC-20,7 MPa (4,49 %).

Los extractos resultantes de emplear EFS, con etanol como cosolvente, presentaron la mayor

pureza en CC3 (11,1 % a 60 ºC-20,7 MPa; 19,6 % a 60 ºC-15,9 MPa; 24,5 % a 50 ºC-15,9

MPa). Por ende, el contenido de ceramidas en lana de oveja Dorper x criollo supera el 0,16 %.

Es posible obtener un producto de interés para la industria cosmética, extractos grasos

enriquecidos en ceramidas, a partir de lana de oveja Dorper x criollo, material no

aprovechable, empleando la técnica de EFS.

13

5. Recomendaciones

Dados los alcances y fines de un trabajo propio de un programa de especialización, con el

propósito de lograr resultados con una mayor profundidad, se hace necesario dedicar futuros

trabajos a ampliar el rango de estudio de las variables propuestas (valores de temperatura y

presión, naturaleza y % de cosolvente) así como a evaluar otras variables (p.e. el tipo de

muestra, lana de ovinos Dorper, lana de ovinos criollo, lana oscura).

Para avanzar en el estudio cualitativo de los extractos obtenidos, es necesario disponer de

otros patrones de ceramidas, y en el mejor de los casos realizar análisis HPLC-MS.

Agradecimientos

A los departamentos de Farmacia y de Química de la Facultad de Ciencias de la Universidad

Nacional de Colombia. A laboratorios La Santé por su colaboración en el análisis de HPLC. A

la Dra. Alicia Lucia Morales quien suministro el material de estudio. Además el autor

agradece el apoyo incondicional de su familia.

14

Bibliografía

1) http://www.cdrtcampos.es/lanatural/info_lana.htm, en línea, (consultado noviembre

13/2010)

2) D. Marín y A. Del Pozo, materias primas y activos cosméticos, ceramidas. Unidad de

Tecnología Farmacéutica. Facultad de Farmacia. Universidad de Barcelona, vol 23 núm 4

abril 2004.

3) Patente; C. Negra, Mª L. Fonollosa Argemi, J. Pera López, M. Maza Ribera, A. Parra Juez,

J. L. Martí, G. Meritxell, “Composiciones y uso extracto de lípidos internos de la lana en la

preparación de productos para el tratamiento y cuidado de la piel”, Consejo Superior de

Investigaciones Científicas, Madrid, 2002.

4) Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M., “Principios de Bioquímica”, Ed Omega, 3ª

Edición, (2001), Pp 297-298

5) I. Garai, “La Tecnología de los Fluidos supercríticos y sus aplicaciones más relevantes en

productos textiles”, AITEX Instituto Tecnologico Textil Review, Nº 31, Pag 8-10, (Enero

2009).

6) M. D. Luque de Castro, M. Varcárcel, M. T. Tena, “extracción con fluidos supercríticos en

el proceso analítico”, Ed. Reverté S. A., Barcelona, España, (1993). Pag 47 – 56

7) R. Ramírez, I. Garay, J. Álvarez, M. Martí, J.L. Parra, L. Coderch, “Supercritical fluid

extraction to obtain ceramides from wool fibers”, Separation and Purification Technology,

63:552–557(2008).

15

8) R. Alzaga, E. Pascual, P. Erra, J. M. Bayona, “Development of a novel supercritical Fluid

extraction procedure for lanolin extraction from raw wool”, Analytica Chimica Acta 381:39

48 (1999).

9) Y. Hye Hyun, S. Junghyun, K. Dong-Hyun, “Liquid chromatography–tandem mass

spectrometric determination of ceramides and related lipid species in cellular extracts”,

Journal of Chromatography B, 843 (2006) 327–333

10) Patente; C. Negra, Mª L. Fonollosa Argemi, J. Pera López, M. Maza Ribera, A. Parra Juez,

J. L. Martí, G. Meritxell, “utilización de fracciones de lanolina ricas en ceramidas para el

tratamiento de la piel, y composiciones que la contienen”, Consejo Superior de

Investigaciones Científicas, Madrid, 2002.

16

Anexo 1

Resumen de datos de cada una de las extracciones realizadas

PESOS DE MUESTRAS Y EXTRACTOS OBTENIDOS EN CADA EXTRACCIÓN

Extracto Peso M1

(mg) Peso E1

(mg) R* % Peso M2

(mg) Peso E2

(mg) R* % Peso M3

(mg) Peso E3

(mg) R* % Promedio

R* % EFS 1 15218,7 92,3 0,61 15174,8 96,7 0,64 15138,7 94,5 0,62 0,62 EFS 2 15168,7 118,2 0,78 15163,6 132,8 0,88 15190,3 112,0 0,74 0,80 EFS 3 15226,4 201,8 1,33 15184,9 201,8 1,33 15134,7 232,7 1,54 1,40 EFS 4 15163,5 310,5 2,05 15186,8 301,2 1,98 15168,7 312,6 2,06 2,03 EFS 5 15172,9 362,2 2,39 15188,1 360,1 2,37 15152,9 371,2 2,45 2,40 EFS 6 15175,3 694,1 4,57 15167,2 678,4 4,47 15172,3 671,4 4,43 4,49

SOXHLET 6565,3 1531,9 23,33 6572,9 1529,8 23,27 6589,2 1524,7 23,14 23,25

R* = % Rendimiento de extracto

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Anexo 2

Condiciones HPLC:

Equipo Shimadzu LC 10AVP de bomba binaria LC 10ATVP, muestreador automático SIL-

10AF, horno de columna CTO 10AVP, detector de arreglo de diodos SPD M10AVP,

columna Select-B RP 18 (250 x 4,6 x 5,0), la cual se mantuvo a 60 ºC. La fase móvil estaba

compuesta por una solución (A) de formiato de amonio 5 mM (pH

4,0)/metanol/tetrahidrofurano (5:2:3, v/v/v) y una solución (B) de formiato de amonio 5

mM (pH 4,0)/metanol/tetrahidrofurano (1:2:7, v/v/v) (9). A partir de cada extracto diluido

en la mezcla cloroformo-metanol (2:1 v/v) se tomo 1 mL y se llevó a 5 mL de la misma

mezcla de solventes cloroformo-metanol. Para la separación por HPLC, se inyectó 20 µl de

cada muestra y se usó un programa de gradiente con un flujo de 0,7 ml/min. Inicialmente se

hizo pasar 100% de la composición del buffer (A), posteriormente se cambió de forma

lineal hasta el 80% del buffer (B) en 19,0 min y se mantuvo durante 11,0 min, a

continuación se vuelve a la condición de equilibrio inicial en 2,0 minutos, el tiempo de

análisis fue de 32,0 min). Para cuantificar el contenido de ceramidas en los extractos

obtenidos, se preparó una solución patrón de 1 mg/mL de ceramida C3 (CC3) en

cloroformo-metanol (2:1 v/v) (λmax 219 nm).

Cromatogramas:

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Anexo 3

Datos usados para la cuantificación de contenido de CC3 en cada extracto obtenido

CONTENIDO DE CERAMIDAS CERAMIDA C 3

DATOS VARIABLES EFS 1 EFS 2 EFS 3 EFS 4 EFS 5 EFS 6 Soxhlet

PESO MTA (mg) 94,5 121,0 212,1 308,1 364,5 681,3 1528,8 PESO STD (mg) 25,53 25,53 25,53 25,53 25,53 25,53 25,53 POTENCIA STD 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 94,9 AREA STANDARD 63391784 63391784 63391784 63391784 63391784 63391784 63391784 AREA MUESTRA 60616707 62125380 61755384 63016538 62659174 61036573 38738539 VOL. 1 DILUCION STD 25 25 25 25 25 25 25 VOL. 1 DILUCION MTA 5 5 5 5 5 5 5 mL TOMADOS DLICION 1 STD 1 1 1 1 1 1 1 mL TOMADOS DLICION 1 MTA 1 1 1 1 1 1 1 VOL. 2 DILUCION STD (mL) 1 1 1 1 1 1 1 VOL. 2 DILUCION MTA (mL) 5 5 5 5 5 5 5 DILUCION 2 STD 1 1 1 1 1 1 1 DILUCION 2 MTA 5 5 5 5 5 5 5

PROMEDIO DE AREAS

Estándar EFS 1 EFS 2 EFS 3 EFS 4 EFS 5 EFS 6 Soxhle t

63391784 60616707 62125380 61755384 63016538 62659174 61036573 38738539

CONTENIDO CERAMIDA C3 EN LOS EXTRACTOS CANTIDAD EFS 1 EFS 2 EFS 3 EFS 4 EFS 5 EFS 6 Soxhlet

Concentración en la solución (mg/mL) 0,956 0,980 0,974 0,994 0,988 0,963 0,611

% ceramida C3 en los extractos 24,5 19,6 11,1 7,8 6,6 3,4 1,0

% ceramida C3 en la lana 0,158 0,161 0,160 0,164 0,163 0,159 0,232