EXPRESIÓN DE

PROTEÍNAS EN

LEVADURAS

Saccharomyces cerevisiae

Vectores de Saccharomyces cerevisiae

Vector Secuencias de Frecuencia. de Nº copias/cel. Inestabilidad

Levaduras transformacióna mitótica

b

Integrativo

Yip ADN homólogo 102

> 1 0,1%

Reemplazo ADN homólogo 10 1 Estable

rADN rADN nd 100-200 Estable

Episomal

Replicación ARS 104 1-20 20%

(YRp)

Centromérico ARS/CEN 104

1-2 1%

(YCp)

Basados en 2µ ORI, STB, en 104

25 2-8%

(YEp) huésped 2µ (Yep13)

ORI, STB,REP1, REP2 104

50-100 0,6-1,8%

FLP huésped 2µ0 (pJDB248)

ORI, STB,REP1, REP2 nd 200 0,26%

en huésped 2µ0 (pJDB219

ORI, STB,REP1, REP2 nd 50-100 0,20%

D,FLP en huésped 2µ0

(pJB205)

a Transformantes por µg de ADN usando esferoplastos b Células sin plásmido generadas por generación en medio no selectivo

PLÁSMIDO 2 MICRONES

Vectores de Saccharomyces cerevisiae

Vector Secuencias de Frecuencia. de Nº copias/cel. Inestabilidad

Levaduras transformacióna mitótica

b

Integrativo

Yip ADN homólogo 102

> 1 0,1%

Reemplazo ADN homólogo 10 1 Estable

rADN rADN nd 100-200 Estable

Episomal

Replicación ARS 104 1-20 20%

(YRp)

Centromérico ARS/CEN 104

1-2 1%

(YCp)

Basados en 2µ ORI, STB, en 104

25 2-8%

(YEp) huésped 2µ (Yep13)

ORI, STB,REP1, REP2 104

50-100 0,6-1,8%

FLP huésped 2µ0 (pJDB248)

ORI, STB,REP1, REP2 nd 200 0,26%

en huésped 2µ0 (pJDB219

ORI, STB,REP1, REP2 nd 50-100 0,20%

D,FLP en huésped 2µ0

(pJB205)

a Transformantes por µg de ADN usando esferoplastos b Células sin plásmido generadas por generación en medio no selectivo

Integración cromosómica de ADN por

recombinación homóloga

Marcadores de selección

1-Auxotróficos. Alelos que complementan mutaciones en

cepas auxotróficas.

Ej.: LEU2, TRP1, URA3, HIS3, usados en cepas auxotróficas

para leucina, triptofano, uracilo e histidina

2-Dominantes. Se pueden usar en una mayor variedad de

cepas.

Ej: Tn903kanr: selección con G418

DHFR: selección con metotrexate /sulfanilamida

Cmr: selección con cloranfenicol en medio con glicerol

Promotores y terminadores transcripcionales

Promotores de enzimas glicolíticas: son los más poderosos pero poco regulables

Ej: PGK: fosfoglicerato quinasa

GAP: gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa

ADH: alcohol deshidrogenasa

Son inducidos varias veces por glucosa

Promotores del metabolismo de galactosa: Son los promotores regulables más usados.

Ej: GAL1, GAL7 y GAL10: Se inducen hasta 1000 veces por galactosa y se reprimen por glucosa

Promotores híbridos: Ej: PGK/GAL, tiene la fuerza del promotor PGK y la regulación de GAL

Terminadores: sólo de levaduras. En general se usa el terminador de 2

Secreción de proteínas en Saccharomyces

cerevisiae¿Para qué?

Plegamiento correcto

Evitar efectos tóxicos

Facilita la purificación

Péptido señal péptido N-terminal hidrofóbico

propio de levaduras

MF1: feromona

SUC2: invertasa

PHO5: fosfatasa ácida

MF1

Proteína de 165 aa: prepro factor

Procesamiento: clivaje del péptido señal

corte de Lys-Arg por KEX2

remoción de pares Glu-Ala por diaminopeptidasa STE1

remoción de Lys-Arg terminal por KEX1

Construcción del gen para expresar en levaduras

• 1- Eliminar todas las secuencias no codificantes en la región 5’no codificante (5’UTR) ya que secuencias ricas en G y estructuras 2as son inhibitorias de la iniciación de la traducción

• 2- El ATG debe estar precedido por ADN rico en AT, preferentemente AAAAAATG ya que esto favorece la iniciación de la traducción

• 3- Uso de codones propios del sistema

• 4- Usar ADNc

• 5- Analizar secuencia del gen por posibles sitios de poliadenilación, estructuras 2as cerca del ATG, sitios de glicosilación, etc.

• 6- Incluir sitios de restricción para el clonado

Expression of tetanus toxin fragment C in yeast: gene

synthesis is required to eliminate fortuitous polyadenylation

sites in AT-rich DNAMichael A.Romanos*, Andrew J.Makoff, Neil F.Fairweather, Katrina M.Beesley, Debbie E.Slater,

Fred B.Rayment, Mike M.Paynel and Jeffrey J.Clare

Departments of Molecular Biology and 'Protein Chemistry, Wellcome Biotech, Langley Court,

Beckenham, Kent BR3 3BS, UK. Nucleic Acids Research, Vol. 19, No. 7 1461, 1991

Northern blotting

Glicosilación de proteínas

• Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgi

donde los hidratos de carbono sufren modificacines

• N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la

misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También

ocurre O-Glicosilación.

• Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150

manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones

terminales 1-3 glicano

Transformación de levaduras

• Esferoplastos: remoción de la pared

• Litio, PEG

• Electroporación

•La mayoría son promotores constitutivos.

•Falta de promotores fuertes. El producto representa

1-5% del total de las proteínas producidas.

•Los promotores inducibles no producen grandes

cantidades de mRNA cuando se desregulan.

•Inestabilidad plasmídica.

•Hiperglicosilación de glicoproteínas secretadas.

Problemas asociados a la producción en S. c.

Casi todos los productos derivados de levaduras

que están en el mercado son producidos en

Saccharomyces cereviciae

2009: la FDA apueba la 1era proteína

biofarmaceútica producida en una levadura

distinta de S.c. : Inhibidor de kallicreína

producida en Pichia pastoris por Dynax Inc.

LEVADURAS METILOTRÓFICAS

• Son capaces de utilizar metanol como única fuente de C

• Poseen capacidad de crecer a altas densidades, proceso fácilmente

escalable a grandes volúmenes de producción

• La producción de proteínas heterólogas en cepas transformadas

con promotores fuertemente inducibles pueden alcanzar

rendimientos de hasta el 30 - 40% de las proteínas solubles

celulares.

• Sistema actualmente muy difundido

Hansenula polymorpha (Pichia angusta)

Candida boidinii

Pichia methanolica

Pichia pastoris

Pichia pastoris

•Son las primeras enzimas del camino metabólico de

metanol y están codificadas por dos genes AOX1 y AOX2.

•A nivel proteico AOX1 y AOX2 presentan un 97% de

homología

•AOX esta constituída por un octámero de subunidades

idénticas a las que se le unen moléculas de FAD.

ALCOHOL OXIDASA

PEROXISOMA CITOSOL

CH3OH

O2 AOX GSH FDH

H2O2 HCHO HCHO GS-CH2OH HCOOH CO2

CATALASA FLDH NAD NAD

1/2O2 + H2O DHAS NADH2 NADH2

Xu5P

GAP DHA

1/3 GAP constituyentes

DHA DHAP celulares

ATP

ADP FBP F6P

GAP P2

CH3OH

•AOX tiene baja afinidad por el oxígeno. La células

compensan esta baja actividad catalítica sintetizando

grandes cantidades de la enzima. Cuando las levaduras

metilotróficas crecen en glucosa, AOX no es detectable,

mientras que en metanol llega a representar el 30-35% de

las proteínas celulares solubles.

•La síntesis de AOX está regulada a nivel transcripcional.

Promotor AOX1: fuerte, AOX2: débil

Inductor: Metanol

Represor: glucosa, glicerol, etanol

Peroxisomas

Vectores de expresión para Pichia pastoris

Inducción

con

metanol

Promotor AOX1

Desventajas del uso del promotor AOX1

Monitoreo complejo de metanol durante el

proceso fermentativo

El metanol es inflamable

El uso de metanol no es deseable para

industria alimentaria

Uso de dos fuentes de carbono distintas

Inducción

con glucosa o

glicerol

Promotor GAP

Inducción con

metil amina o

metanol

Promotor FLD1

Reemplazo génico

Integración del ADN en genoma

Inserción génica

Recombinación homóloga

Inserción génica en AOX

Inserciones múltiples

Inserción génica en his4

Reemplazo génico

Medio MD Medio MM

Muts

Muts

Mut +

Selección de cepas recombinantes

fenotipo His+Mut+ e His+Muts

Confirmación por PCR y Southern blot

Selección de cepas recombinantes

His+Mut+ e His+Muts

MD MM

Cepa Muts KM71: his4arg4 aox1Δ::ARG4

Métodos de transformación de Pichia pastoris

Método Frecuencia de Conveniencia Integración

transformación (por µg) múltiple

Esferoplastos 105 Baja Sí

Electroporación 105 Alta Sí

PEG1000 103 Alta No

LiCl 102 Alta No

Selección de los clones recombinantes

MD

MD

MM

Caracterización del producto de expresión

SDS PAGE +/- DTT Western blot

Caracterización de la cepa productora

PCR: presencia y estabilidad del gen

Southern blot: Mut+/Muts

Dot Blot: Nº de copias del gen

PCR cuantitativa: Nº de copias del gen

GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS

EN LEVADURAS

El patrón de glicosilación en levaduras

es distinto del de mamíferos

GLICOSILACIÓN DE PROTEÍNAS

1- N- GLICOSILACIÓN

2- O- GLICOSILACIÓN

Glicosilación de proteínas

• Las proteínas son transportadas en vesículas al Golgi

donde los hidratos de carbono sufren modificacines

• N- glicosilación: la señal para la adición de azúcares es la

misma que para mamíferos (Asn-X-Ser/Thr). También

ocurre O-Glicosilación.

• Adicionan muchas manosas: S. Cerevisiae, 50-150

manosas. Además los oligosacáridos poseen uniones

terminales 1-3 glicano

N- GLICOSILACIÓN

“Sequon”: Asn-X-Thr/Ser X: cualquier

aa menos Prolina

Asn

Se cortan las glucosas y una manosa α-1,2 y se transporta a

Golgi en donde se adicionan otros azúcares y fosfato

Pichia: 3-13 manosas. S.c. > 50 manosas

La disposición del “sequon” en la estructura terciaria de la

proteína es importante para la glicosilación:

“Competencia”: plegamiento vs. Glicosilación

Formación de puentes de H2

Cercanía a S-S (crecimiento de células con DTT)

Cercanía a COOH terminal (menos tiempo para glicosilarse)

Estabilidad de la estructura secundaria (pro péptido)

Disposición tridimencional de los sequones en la proteína, sobre

todo cuando están cerca (glicosilación del 1º puede alterar al 2º)

Disponibilidad de precursores: oligosacárido dolicol, transferasa

La velocidad de síntesis de la proteína

influencia el grado de glicosilación

Glicosilación y estabilidad de la

proteína

En algunos casos la glicosilación confiere termoestabilidad:

calor o frío

Puede conferir estabilidad estructural:

Evitando proteólisis

Ayudando con el plegamiento correcto

Ser/Treo

α - manosa

α – 1,2 manosa

O-GLICOSILACIÓN EN LEVADURAS

Sequon? Abundancia inusual de ser/treo

Prolinas cerca de ser/thr

aa cargados cerca de ser/treo

GLICOSILACIÓN DE PROTEINAS EN

LEVADURAS

El patrón de glicosilación en levaduras es distinto del

de mamíferos

Las proteínas humanas, glicosiladas en levaduras,

pueden tener efectos inmunogénicos en humanos

Alternativas para prevenir la glicosilación en levaduras

Tunicamicina

Cepas mutantes

Enzimas para desglicosilar

No usar la vía de secreción

Mutagénesis dirigida

La productividad de un sistema recombinante está

determinada por muchos factores genéticos y fisiológicos.

Posibles cuellos de botella:

Uso de codones

Número de copias del gen

Transcripción eficiente usando promotores fuertes

Señales de traducción

Translocación determinada por el péptido señal

Procesamiento y plegamiento en RE y Golgi

Secreción

Proteólisis…..cepas SMD1168 (his4pep4), pH, casa aminoácidos, etc.

A Single Mutation in the Activation Site of Bovine Trypsinogen

Enhances Its Accumulation in the Fermentation Broth of the

Yeast Pichia pastorisJosé Hanquier,1 Yannick Sorlet,2 Dominique Desplancq,2 Laurence Baroche,2 Marc Ebtinger,3 Jean-François Lefèvre,2 Franc

Pattus,2 Charles L. Hershberger,1 and Alain A. Vertès3* Lilly Research Laboratories,

Applied and Environmental Microbiology, February 2003, p. 1108-1113, Vol. 69, No. 2

Engineering of Pichia pastoris for Improved Production of

Antibody FragmentsBrigitte Gasser,1 Michael Maurer,1 Johannes Gach,1 Renate Kunert,1 Diethard Mattanovich1,2

Biotechnology and Bioengineering, Vol. 94, No. 2, June 5, 2006

Retención de la cadena pesada, pero no de la liviana, del Fab a lo

largo de la fermentación el plegamiento de la proteína y el

ensamblado del dímero en el RE son pasos limitantes en la

secreción del Fab

1- Uso de AOX1 vs GAP

2-

Efecto de la sobre expresión de HAC1 y PDI en la secreción del Fab

Conversion of an inactive xylose isomerase into a

functional enzyme by co-expression of GroEL-

GroES chaperonins in Saccharomyces cerevisiaeBeatriz Temer1 , Leandro Vieira dos Santos1,2, Victor Augusti Negri1 , Juliana Pimentel

Galhardo1 , Pedro Henrique Mello Magalhães1 , Juliana José1 , Cidnei Marschalk1 , Thamy

Lívia Ribeiro Corrêa1 , Marcelo Falsarella Carazzolle1 and Gonçalo Amarante Guimarães

Pereira

BMC Biotechnology (2017) 17:71

This study demonstrated that XI from the bacterium Propionibacterium

acidipropionici becomes functional in S. cerevisiae when co-expressed

with GroEL-GroES chaperonin complex from Escherichia coli. The

developed strain BTY34, harboring the chaperonin complex, is able to

efficiently convert xylose to ethanol.

Cambio de escala

2.5 l Fermenters, with 1.5 l working

volume

50 mlShake-flask

cultures20 l Fermenters, with 15 l working

volume

400 l Fermenters, with 300 l working

volume

COSECHA CENTRIFUGACIÓN