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133EXPOSICIÓN DE PROTEÍNAS FORÁNEAS EN PLLL

EXPOSICIÓN DE PROTEÍNASFORÁNEAS EN PIII.NELSON SANTIAGO VISPO1, ARIANA GARCÍA OJALVO1, GIANNI CESARENI2

INTRODUCCIÓNEn los últimos años se han expuesto proteínas y dominios proteicos en la cápsidade los fagos filamentosos. La siguiente tabla relaciona algunas proteínas quehan sido presentadas en fago correctamente plegadas.

TABLA 8.1. Proteínas que han sido expuestas en la cápsida de los fagos filamentososy mantienen su actividad biológica.

CAPÍTULO 8

1 Centro de Ingienería Genética y Biotecnología. Ave. 31 e/ 158 y 190, Playa. AP 6162,CP 10600, Ciudad de La Habana, Cuba.

2 Departamento de Biología “Enrico Calef”, Universidad de Roma Tor Vergata, Via della RicercaScientifica, 00133 Roma, Italia.

134 CAPÍTULO 8

Tabla 8.1 (continuación).

e α

β


En la biología molecular actual existen tres aplicaciones fundamentales de lametodología para la exposición de proteínas en fagos, la primera logra unaevolución directa de la molécula para obtener mutantes con un marcadoincremento de la actividad biológica; la segunda consiste en la selección deanticuerpos de gran afinidad y la tercera corresponde a la expresión y tamizajede bibliotecas de ADNc [36].

Los trabajos que se describen a continuación, a modo de ejemplo, utilizan pIIIcomo molécula de fusión y están encaminados a buscar aumentos de afinidad enlas interacciones de estas moléculas, explotando las bondades de este sistema

Tabla 8.1 (continuación).

β

136 CAPÍTULO 8

para seleccionar a partir de una biblioteca de mutantes el fenotipo deseado yjunto con él, su genotipo.

La hormona del crecimiento humano (hGH) fue el primer candidato para laobtención de mutantes de mayor afinidad por su receptor. La hGH fue ex-puesta en la cápsida de los bacteriófagos [5]. Esta hormona había sido am-pliamente estudiada y se contaba con una gran cantidad de mutantes puntualesy los datos de las zonas de interacción con el receptor. Además, la estructuracristalina del complejo hormona-receptor había sido resuelta [37]. La hormo-na interactúa con su receptor con una alta afinidad (Ka = 3 x 109 M-1) a travésde una interfase que implica dos hélices, dos mini-hélices y regiones lazo(sitio 1). Después de la unión al sitio 1 otra zona de la hormona (sitio 2) se unea otro receptor para el envío de la señal.

Para aumentar la afinidad del sitio 1 se construyeron cinco bibliotecas de estesitio, donde se aleatorizaron cuatro residuos aminoacídicos. Después de dife-rentes rondas de selección contra el dominio extracelular del receptor fueronanalizados los mutantes seleccionados. Se encontraron mutantes que aumenta-ron su afinidad entre tres y seis veces. En algunos casos se mantuvieron losresiduos críticos para la unión. Se seleccionaron, además, mutantes más con-servados (Arg a Ala) o más radicales (Phe a Ala) fundamentalmente en laperiferia del sitio de unión. Los mutantes co-seleccionados permitieron obteneruna mayor afinidad en una forma cooperativa. Todas estas mutaciones se com-binaron en un “supermutante” con 15 cambios respecto a la molécula salvaje yque se unió al receptor con una afinidad 400 veces superior (Ka = 1012 M-1).Con la incorporación de un mutante que destruía la unión al sitio 2 se obtuvo unpotente antagonista de la hGH. La estructura del “supermutante” con el receptor[38], mostró que muchos de los cambios son sutiles, por ejemplo la sustituciónde la Phe 10 por Ala produce una suave re-orientación de una hélice que incluyevarios sitios de contacto.

En otros estudios [39, 40] se analizó la importancia energética de los 31 resi-duos ocupados en la interfase entre la hGH y el dominio extracelular de sureceptor, y se han mostrado evidencias de que el epítopo del sitio de uniónfuncional es mucho menor que el epítopo estructural (determinado porcristalografía). Además, el cálculo teórico de los residuos que participan en laantigenicidad de una proteína de forma activa indica que están formados porpocos aminoácidos energéticos rodeados de una superficie que contribuye a lacomplementariedad [41].

La metodología de exposición de proteínas en fagos también ha sido utilizadapara modificar la especificidad. El Inhibidor de la Tripsina Pancreática Bovina


(BPTI) inhibe diferentes proteasas de serina, pero presenta una afinidad débil(Ka = 4 x 106 M-1) por la Elastasa Humana de Neutrófilos (HNE).

Con la introducción de cuatro mutaciones directas y la construcción de una pe-queña biblioteca (900 clones) de cinco residuos presentes en un lazo que se une alsitio activo, se seleccionó una variante de BPTI que se une a la HNE con unaafinidad de Ka = 1012 M-1. Esta es 50 veces más fuerte que el mejor de losinhibidores de HNE que se conocía [19]. En este caso no se utilizó una bibliotecaaleatorizada, sólo se necesitaron codones específicos para residuos hidrofóbicos.

El mismo diseño se ha utilizado para lograr un aumento de la afinidad de otrasproteínas por su ligando (Tabla 9.1).

Un factor común en estos estudios es tener una base de datos extensa de lasestructuras de las moléculas para identificar específicamente los residuos quedeben ser aleatorizados. Otra variante es la de aleatorizar la molécula comple-ta, pero en este caso se necesita la construcción de bibliotecas mayores.

Por los métodos tradicionales sólo es posible examinar un número limitado deresiduos, de ahí que sea necesario conocer los residuos de la molécula blancoque intervienen en la unión a su ligando. La metodología para la exposición deproteínas en fagos contempla otros procedimientos que la hacen extremada-mente poderosa en comparación con estos estudios tradicionales de análisisestructural y funcional en una interfase de unión. Una vertiente importante enel uso de esta metodología ha sido expresar en la superficie de los fagoscolecciones de fragmentos de anticuerpos para su selección específica con-tra diferentes antígenos.

Los genes de las regiones variables de algunos anticuerpos han sido clonadosen vectores fagomídicos fusionados al gen III de los fagos filamentosos. Laproteína híbrida creada tiene los dominios de anticuerpo en el extremo N-termi-nal, seguidos por pIII. La misma, correctamente plegada, se incorpora en elfago y retiene las propiedades de unión del anticuerpo soluble original.

Cada genoma recombinante de fago contiene el ADN que codifica para elanticuerpo específico expuesto en su superficie, lo que permite que la partículade fago que porta el gen de anticuerpo se seleccione directamente a través delas propiedades de unión de la proteína expresada [42].

El objetivo de este trabajo es explicar las etapas de la metodología para laexposición de proteínas foráneas en pIII, correctamente plegadas; detallar losprocedimientos técnicos que se realizan en cada etapa y exponer los resultadosde la aplicación de esta metodología en dos modelos específicos.

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PREPARACIÓN DEL VECTOR LINEAL

El fagómido pHEN1 [27] es un vector diseñado para clonar y expresar proteínasforáneas fusionadas al extremo NH2 de la proteína pIII del bacteriófago M13(Figura 8.1). Tiene una talla de 4522 pb y contiene la secuencia nucleotídica delgen III precedida por la señal de secreción pelB de Erwinia carotovora, bajo elcontrol transcripcional del promotor lacZ. El péptido señal pelB y el gen III estánseparados por un oligonucleótido que codifica para un péptido reconocido por elanticuerpo monoclonal anti-c-myc 9E10 [43]. Este péptido c-myc permite la de-tección de la proteína clonada por ELISA o “western blot”, así como su purifica-ción en columnas de afinidad. Entre pelB y el péptido c-myc existe un sitio derestricción múltiple para la clonación del inserto.

El vector pHEN1 contiene los orígenes de replicación de bacteria y debacteriófago M13. El fagómido se propaga como plasmidio en Escherichiacoli. Cuando las células transformadas son superinfectadas con el fagoauxiliador M13KO7, se activa el origen viral de replicación yempaquetamiento y se propaga como bacteriófago. Este vector contieneademás, un gen de resistencia a ampicillina.

Figura 8.1. Esquema del vector fagómido pHEN1. Se destacan el promotor lacZ, la señal desecreción pelB, el sitio de restricción múltiple, la secuencia que codifica para elpéptido c-myc, el codón de parada Ámbar (TAG), el gen III de los fagos filamentosos,el gen de resistencia a ampicillina (ApR) y los orígenes de replicación de bacteria(colE1 ori) y de fago (M13 ori).

Sitio de restricción múltiple C-myc

TAG

Gen IIIPel BPlac Z

pHEN1 4,52 kb

Ap R

M13 ori E1 oricol


Otra característica importante de pHEN1 es la presencia de un codón de para-da Ambar (TAG) entre el péptido c-myc y el gen III, de modo que el insertoclonado en el sitio de restricción múltiple también queda separado del gen IIIpor este codón de parada. Cuando el fagómido recombinante es transformadoen una cepa no supresora (su-), se expresa solamente el producto génico delinserto, porque la traducción se detiene en el codón de parada. Sin embargo,cuando se transforma en una cepa supresora (su+), el codón Ambar es leídocomo glutamina (Gln) y la traducción continúa, por lo que se expresa el produc-to del inserto fusionado a pIII.

La preparación del vector lineal para su posterior ligamiento con el inserto serealiza mediante digestión con la enzima de restricción XhoI, seguida de untratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I para generarextremos romos. Finalmente, se digiere con la endonucleasa de restricción NcoI,que produce un extremo cohesivo.

PROCEDIMIENTO

1. Mezclar en un tubo de microcentrífuga los componentes de la reacción dedigestión con XhoI:

X µL pHEN1 (10 µg)

10 µL Tampón 10X de XhoI (1X)

10 µL BSA 1 µg/µL (0,1 µg/µL)

X µLH2Od (hasta 100 µL de volumen total)

Añadir 100 U de XhoI. Incubar durante 2 h a 37 ºC.

2. Extraer el ADN digerido con igual volumen de fenol:cloroformo (50:50) pararemover la actividad enzimática residual. Precipitar el ADN por adición de 0,1volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 2,5 volúmenes de etanol 100 %frío. Recuperar el ADN por centrifugación a 12 000 rpm en una microcentrífugadurante 15 min. Decantar el sobrenadante y lavar el precipitado de ADN con200 µL de etanol 70 %. Centrifugar nuevamente y remover el etanol. Secar elprecipitado al aire y resuspenderlo en 50 µL de H2Od.

3. Mezclar en un tubo de microcentrífuga los componentes de la reacción conKlenow:

50 µL pHEN1 / XhoI (10 µg)

20 µL Tampón 10X de Klenow (1X)

130 µL H2Od (hasta 200 µL de volumen total)

140 CAPÍTULO 8

Añadir 10 U de Klenow. Incubar durante 3 min a 37 ºC. Añadir:

2 µL dGTP 10 mM (0,1 mM)

2 µL dATP 10 mM (0,1 mM)

2 µL dTTP 10 mM (0,1 mM)

2 µL dCTP 10 mM (0,1 mM)

Incubar durante 10 min a 37 ºC y durante 15 min más a temperatura ambien-te. Inactivar la enzima por calentamiento a 70 ºC durante 10 min para dete-ner la reacción.

4. Extraer el ADN con igual volumen de fenol:cloroformo (50:50). Precipitar elADN por adición de 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 2,5volúmenes de etanol 100 % frío. Recuperar el ADN por centrifugación a12 000 rpm durante 15 min. Decantar el sobrenadante y lavar el precipitadode ADN con 200 µL de etanol 70 %. Centrifugar nuevamente y remover eletanol. Secar el precipitado al aire y resuspenderlo en 50 µL de H2Od.

5. Mezclar en un tubo de microcentrífuga los componentes de la reacción dedigestión con NcoI:

50 µL pHEN1 / XhoI / Klenow (10 µg)

10 µL Tampón 10X de NcoI (1X)

10 µL BSA 1 µg/µL (0,1 µg/µL)

30 µL H2Od (hasta 100 µL de volumen total)

Añadir 100 U de NcoI e incubar durante 2 h a 37 ºC.

6. Extraer el ADN digerido con igual volumen de fenol:cloroformo (50:50). Pre-cipitar el ADN por adición de 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 2,5volúmenes de etanol 100 % frío. Recuperar el ADN por centrifugación a 12 000rpm durante 15 min. Decantar el sobrenadante y lavar el precipitado de ADNcon 200 µL de etanol 70 %. Centrifugar nuevamente y remover el etanol.Secar el precipitado al aire y resuspenderlo en 50 µL de H2Od.

7. Comprobar la ocurrencia de digestión por electroforesis en gel de agarosa0,8 %. Utilizar como controles un marcador de peso molecular y una mues-tra del ADN nativo. Determinar la concentración del ADN por medición dela absorbancia a 260 nm.


PREPARACIÓN DEL INSERTO

El gen de la proteína de interés puede obtenerse por digestión del ADN fuentecon enzimas de restricción que generen extremos compatibles con los del vector.También se puede utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) conoligonucleótidos que incorporen los sitios de restricción adecuados para creardichos extremos. Otra variante es la síntesis química, que igualmente debe te-ner en cuenta estos sitios de restricción. La calidad del ADN del inserto debeser controlada por electroforesis en gel de agarosa 1 %.

LIGAMIENTO DEL VECTOR Y EL INSERTO

En esta reacción el ADN lineal del vector y el gen de interés se ligan paraformar la población de ADN que será transformada en E. coli. La proporciónvector:inserto 1:5 es óptima para un ligamiento eficiente.

PROCEDIMIENTO

1. Mezclar en un tubo de microcentrífuga los componentes de la reacción deligamiento:

X µL vector lineal (500 ng = 0,17 pmol)

X µL inserto (0,85 pmol)

1 µL Tampón 10X de T4 ADN ligasa (1X)

1 µL T4 ADN ligasa 2000 U/µL (2 000 U)

X µL H2Od (hasta 10 µL de volumen total)

Incubar a 16 ºC durante toda la noche. Utilizar como controles las siguientesmezclas de reacción:

vector + T4 ADN ligasa

vector - T4 ADN ligasa

inserto + T4 ADN ligasa

inserto - T4 ADN ligasa

2. Inactivar la enzima por calentamiento a 70 ºC durante 10 min.

TRANSFORMACIÓN EN E. COLI DEL ADN LIGADO

Se utiliza el principio del choque térmico para producir poros en la membranacitoplasmática, a través de los cuales se introduce el ADN ligado. Las células

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deben encontrarse en estado de competencia, lo cual se logra mediante trata-miento con CaCl2.

PREPARACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES

Este método se basa en el tratamiento de las células con CaCl2. El estado decompetencia de las células puede mantenerse durante meses.

1. Inocular 300 mL de medio LB con la cepa apropiada de E coli. Incubar elcultivo a 37 ºC, con agitación hasta alcanzar una DO620 de 0,5.

2. Transferir el cultivo a tubos de centrífuga estériles. Es importante mantenerlas células a 4 ºC durante todo el proceso. Centrifugar a 3 600 rpm a 4 ºCdurante 25 min. Decantar el sobrenadante.

3. Resuspender suavemente las células en 150 mL de CaCl2 50 mM estéril, frío.Incubar en hielo durante 1 h.

4. Centrifugar a 3 600 rpm durante 15 min a 4 ºC. Desechar el sobrenadante.

5. Resuspender cuidadosamente las células en 10 mL de CaCl2 50 mM / glice-rol 20 % estéril y frío. Preparar alícuotas de 500 µL en tubos estériles yconservarlas a –70 ºC.

TRANSFORMACIÓN DE CÉLULAS COMPETENTES

6. Descongelar las células competentes en hielo. Mezclar en un tubo demicrocentrífuga 100 µL de células competentes con los 10 µL de la reacciónde ligamiento. Utilizar un control negativo sin ADN. Incubar en hielo durante15 min.

7. Incubar durante 2 min a 42 ºC para provocar el choque térmico que propiciala apertura de poros en la membrana citoplasmática y la entrada del ADN.Seguidamente, incubar en hielo durante 10 min para estabilizar a las célulasen su nuevo estado.

8. Añadir 1 mL de medio LB e incubar a 37 ºC durante 1 h. En este período sesintetizan las primeras moléculas de β-lactamasa, que garantizarán la supervi-vencia de las células transformadas en un medio de cultivo con ampicillina.

9. Sembrar las células transformadas en medio sólido LB + ampicillina 100 µg/mL.Incubar a 37 ºC durante toda la noche. Como resultado se obtiene una poblaciónde colonias bacterianas transformantes.

SELECCIÓN DE LOS TRANSFORMANTES RECOMBINANTES

Para seleccionar los transformantes recombinantes se realiza un análisis delADN plasmídico por digestión con endonucleasas de restricción. Se parte de


colonias bacterianas aisladas obtenidas como resultado de la transformaciónpara inocular precultivos de 3 mL de medio LB + ampicillina 100 µg/mL. ElADN plasmídico de los transformantes se purifica a escala minipreparativa yse digiere con las enzimas de restricción adecuadas para diferenciar según elpatrón de restricción, a los transformantes recombinantes de los que no lo son.

ANÁLISIS DE EXPRESIÓN Y SECRECIÓN DE LA PROTEÍNA

HETERÓLOGA AL PERIPLASMA DE E. COLI

Durante el ciclo infectivo de los bacteriófagos filamentosos el ensamblaje de lanueva progenie de fagos ocurre en la membrana interna de la célula hospedera,donde se almacenan las proteínas estructurales de nueva síntesis. A medida quela partícula viral atraviesa la membrana hacia el espacio periplasmático, se vaensamblando la cápsida alrededor del ADN. Para lograr la exposición de unaproteína heteróloga en la superficie de los bacteriófagos filamentosos es nece-sario que la fusión de esta proteína con pIII (codificada por el fagómido) seasecretada al periplasma bacteriano. Sólo en este compartimento la proteínahíbrida podrá competir con las copias de tipo salvaje de pIII por incorporarse a

la cápsida del nuevo virión. Los transformantes recombinantes seleccionadospor análisis de restricción deben ser evaluados en cuanto a su capacidad deexpresar y secretar la proteína de interés al periplasma de E. coli.

INDUCCIÓN DEL PROMOTOR LACZEl sistema LacZ es inducible por IPTG, previa represión con glucosa.

PROCEDIMIENTO

1. Para reprimir inicialmente el promotor lacZ, inocular precultivos de 3 mL demedio LB + ampicillina 100 µg/mL + glucosa 1 % con los clones recombinantespreviamente seleccionados. Incluir controles positivo y negativo de la expre-sión. Incubar a 37 ºC con agitación durante toda la noche.

2. A partir de los precultivos, inocular cultivos de 50 mL de medio LB + ampicillina100 µg/mL + IPTG 1 mM a una DO620 inicial de 0,1. Incubar a 37 ºC conagitación por 6-8 h.

EXTRACCIÓN DE LAS FRACCIONES CELULAR Y PERIPLASMÁTICA DE E. COLI

3. Colectar las células por centrifugación a 4 000 rpm durante 15 min a 4 ºC.Desechar el sobrenadante.

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4. Lavar el precipitado celular con 50 mL de solución A fría (Tris 0,5 M pH 8,0/ NaCl 0,8 %) . Centrifugar a 4 000 rpm durante 30 min a 4 ºC. Desechar elsobrenadante.

5. Resuspender el precipitado en 2,5 mL de solución B (Tris 10 mM pH 8,0 /EDTA 1 mM / sacarosa 25 %). Incubar a temperatura ambiente durante 10min. Debido a este tratamiento las células quedan en un medio hipertónico.Centrifugar a 4 000 rpm durante 15 min a 4 ºC. Desechar el sobrenadante.

6. Resuspender el precipitado en 2,5 mL de solución C fría (Tris 10 mM pH 8,0/ MgCl2 0,5 mM). Incubar en hielo durante 5 min. El cambio brusco de unmedio hipertónico a uno hipotónico provoca la entrada de agua a las célulascon el consiguiente hinchamiento y la ruptura de la pared celular. Centrifugara 4 000 rpm durante 15 min a 4 ºC. Separar el sobrenadante (fracciónperiplasmática) del precipitado (fracción celular).

ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA-SDS Y “WESTERN BLOT”7. Concentrar al vacío 1 mL de la fracción periplasmática extraída hasta 50 µL.

Añadir igual volumen de tampón de aplicación 2X (Tris-HCl 120 mM / β-mercaptoetanol 10 % / glicerol 20 % / SDS 4 %) y 10 µL de bromofenol

azul. Calentar a 95 ºC durante 10 min y aplicar a un gel de poliacrilamida-SDSal 15 %. Realizar la corrida electroforética a una corriente de 30 mA. Utilizartampón de corrida (Tris-HCl 25 mM / glicina 0,192 M / SDS 0,1 %). Incluir uncontrol positivo de reconocimiento.

8. Sumergir el gel junto con un filtro de nitrocelulosa y varias piezas de papelabsorbente en el tampón de transferencia semiseca (Tris 48 mM / glicina39 mM / metanol 20 % / SDS 1,3 mM) durante 10 min. Colocar el gel unidoal filtro entre las piezas de papel absorbente, en el equipo de transferenciasemiseca (BIO-RAD) y realizar la transferencia a una corriente de 400 mAdurante 30 min. Comprobar la transferencia por tinción del filtro con rojoPonceau y desteñir con agua corriente.

9. Incubar el filtro con leche descremada 5 % / TBS a 37 ºC durante 2 h parabloquear los sitios donde no ocurrió transferencia de proteínas.

10. Incubar el filtro con un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigidocontra la proteína de interés. Diluir el anticuerpo en leche descremada5 % / TBS, incubar a temperatura ambiente con agitación durante 1 h.Lavar el filtro 4 veces con TBS / Tween 20 0,05 % por 5 min y una vezmás con TBS durante 5 min.


11. Incubar el filtro con un anticuerpo anti-especie (según el utilizado en el pasoanterior) conjugado a peroxidasa de rábano picante. Diluir en leche descremada5% / TBS, incubar a temperatura ambiente con agitación durante 1 h. Lavarel filtro 4 veces con TBS / Tween 20 0,05% durante 5 min y una vez máscon TBS por 5 min.

12. Incubar el filtro con el sustrato de la peroxidasa según el sistema ECL(Amersham, Suecia) durante 1 min, exponerlo ante una placa fotográficadurante 1 min. Revelar y fijar la placa.

Nota: En el análisis del resultado del “western blot” se debe considerar no sólola presencia de la proteína de interés en la fracción periplasmática, sino tambiénla ocurrencia o no de procesamiento del péptido señal. Si la peptidasa señalprocesó el péptido pelB, la señal debe aparecer a la talla esperada para laproteína. En caso contrario, la señal aparece a una talla superior.

INDUCCIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA HETERÓLOGA

EN LA CÁPSIDA DEL BACTERIÓFAGO M13En esa etapa las células de E. coli transformadas con los clones seleccionadosse superinfectan con el fago auxiliador M13KO7, que proporciona los genes delas proteínas estructurales y funcionales necesarias para la síntesis del ADN

circular de simple cadena y para el ensamblaje de los fagos híbridos. Esta in-fección no conduce a la lisis o muerte de las células hospederas, sino a unproceso más lento de crecimiento y división celular, acompañado por la libera-ción de partículas fágicas sin un límite aparente.

PROCEDIMIENTO

1. Inocular precultivos de 3 mL de medio 2xYT + ampicillina 100 µg/mL + gluco-sa 1 % con una cepa supresora de E. coli transformada con los fagómidosseleccionados. Incubar a 37 ºC con agitación durante toda la noche.

2. A partir de los precultivos, inocular cultivos de 150 mL de medio LB +ampicillina 100 µg/mL + glucosa 1 % a una DO620 inicial de 0,05. Incubar a37 ºC con agitación durante 2 h hasta alcanzar una DO620 de 0,3.

3. Añadir a cada cultivo 109 ufc-KanR/mL (unidades formadoras de coloniasresistentes a kanamicina por mL) del fago auxiliador M13KO7. Incubar a 37 ºCsin agitación durante 45 min para permitir la adsorción de las partículas defago a las células. A continuación, agitar a 300 rpm durante 1 h.

4. Centrifugar a 3 000 rpm por 10 min y desechar el sobrenadante para eliminarlas partículas libres de fago. Resuspender el precipitado celular en 150 mL de

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medio 2xYT + ampicillina 100 µg/mL + kanamicina 70 µg/mL. Incubar a 37ºC con agitación durante 20 h. La kanamicina garantiza la selección de lascélulas infectadas con el fago auxiliador.

PURIFICACIÓN DE LAS PARTÍCULAS DE FAGO QUE EXPONEN

LA PROTEÍNA HETERÓLOGA EN SU SUPERFICIE

Este método se basa en la precipitación de las partículas virales con polietilenglicol(PEG). Es una técnica rápida y sencilla. Las preparaciones de fago resultantespresentan títulos del orden de 1010 ufc-AmpR/mL y tienen un nivel de purezaaceptable para realizar experimentos de reconocimiento inmunoquímico.

PROCEDIMIENTO

1. Remover las células del cultivo por centrifugación a 9 000 rpm durante 10min a 4 ºC, dos veces. Recuperar el sobrenadante donde se encuentran laspartículas de fago liberadas por las células.

2. Precipitar los fagos por adición de 0,25 volúmenes de polietilenglicol (PEG)8000 16,7 % / NaCl 3,3 M e incubar en hielo durante 2 h.

3. Centrifugar a 10 000 rpm durante 15 min a 4 ºC. Desechar el sobrenadante.

4. Resuspender el precipitado en 1 mL de solución SM (NaCl 5,8 mg/mL /MgSO4.7H2O 2 mg/mL / Tris 6,057 mg/mL pH 7,5 / gelatina 0,1 mg/mL)y añadir 250 µL de PEG 8000 16,7 % / NaCl 3,3 M. Incubar en hielodurante 1 h.

5. Centrifugar a 12 000 rpm durante 15 min en microcentrífuga. Desechar elsobrenadante.

6. Resuspender el precipitado en 500 µL de solución SM. Calentar la suspen-sión de fago a 70 ºC durante 10 min para eliminar las células remanentes.Centrifugar a 12 000 rpm durante 3 min y recuperar las partículas de fago enel sobrenadante.

7. Conservar la preparación a 4 ºC por tiempo indefinido. Alternativamente sepuede añadir glicerol 15 % y conservarla a –70 ºC.

Nota: Se debe tener en cuenta que junto con las partículas de fago precipitandiversos productos extracelulares. En la preparación final pueden quedar tra-zas de PEG que pudieran interferir con la unión del fago a varios blancos. Enalgunos casos es conveniente purificar los fagos previamente precipitados conPEG por centrifugación en gradiente de CsCl [44].


TITULACIÓN DE PREPARACIONES DE BACTERIÓF AGOS

Un método conveniente para cuantificar el número de partículas de fago de unapreparación consiste en infectar células de E. coli y contar el número de colo-nias que crecen en medio sólido. La eficiencia de formación de colonias esmayor que el 50 % del número real de partículas de fago, lo que asegura lasensibilidad de este método.

PROCEDIMIENTO

1. Preparar diluciones seriadas de la preparación de fago (10-1 - 10-10, con un factorde dilución de 10) en medio LB, en una placa de microtitulación. Añadir 10 µL decada dilución a 20 µL de un cultivo de una cepa supresora de E. coli. Incubar a37 ºC durante 10 min para permitir la adsorción de los fagos a las células.

2. Añadir 100 µL de medio LB a cada pocillo e incubar a 37ºC durante 30 min.En este tiempo se sintetizan las primeras moléculas de β-lactamasa, quepermitirán la supervivencia de las células infectadas en un medio con antibiótico.

3. Sembrar 3 µL de cada pocillo en medio sólido LB + ampicillina 100 µg/mL.Incubar a 37 ºC durante toda la noche.

4. A partir de la menor dilución a la cual se obtienen colonias aisladas, calcularel título en términos de unidades formadoras de colonias resistentes aampicillina por mL (ufc-AmpR/mL) mediante la siguiente fórmula:

ufc-AmpR/mL = (13 000 x No colonias) / (3 x dilución)

Nota: Si se titula una preparación de fago auxiliador M13KO7, en el paso 3 sedebe sembrar en medio sólido LB + kanamicina 70 µg/mL. Calcular el título entérminos de ufc-KanR/mL.

“B IOPANNING”En esta etapa las partículas de fago que exponen la proteína heterólogainteractúan con una molécula blanco (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal)inmovilizada en una fase sólida. Los fagos que se unen a la molécula blanco seeluyen y se amplifican por infección de E. coli y superinfección con el fagoauxiliador M13KO7. Al repetir dos o más veces este proceso de selección-amplificación se logra un enriquecimiento de la preparación en los fagos queexponen la proteína de interés.

Esta técnica permite comprobar que la proteína heteróloga expuesta en lacápsida de los bacteriófagos se encuentra adecuadamente plegada para unirsea la molécula blanco inmovilizada en la fase sólida.

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PROCEDIMIENTO

1. Recubrir la fase sólida (perla o placa de poliestireno) con un 1 mL de unasolución de la molécula blanco a una concentración adecuada (10 µg/mLen el caso de un anticuerpo monoclonal) en tampón de recubrimiento(Na2CO3 0,1 M / NaHCO3 0,1 M pH 9,6). Incubar a 4 ºC con agitacióndurante toda la noche.

2. Lavar tres veces con PBS a temperatura ambiente durante 10 min, y una vezcon H2O destilada por otros 10 min.

3. Bloquear la fase sólida recubierta con 1 mL de una solución de BSA10 mg/mL / TBS / Tween 20 0,05 %. Incubar a 4 ºC con agitacióndurante 4 h. Este tratamiento evita la adsorción inespecífica de losfagos a la fase sólida.

4. Lavar dos veces con TBS / Tween 20 0,05 % durante 10 min.

5. Añadir 1012 ufc-KanR/mL de M13KO7, previamente inactivado por radiacio-nes ultravioletas, en 1 mL de BSA 1 mg/mL / TBS / Tween 20 0,05 % parabloquear con el fago auxiliador. Incubar a 4 ºC con agitación durante 4 h.

Este paso tiene como objetivo evitar posibles uniones inespecíficas de losfagos por otros sitios distintos de la proteína heteróloga expuesta.

6. Añadir 1011 ufc-AmpR/mL de la preparación de fago que expone la proteínaheteróloga. Incubar a 4 ºC con agitación durante toda la noche.

7. Recuperar las partículas de fago no adsorbidas después de la incubaciónfrente a la molécula blanco.

8. Lavar diez veces con TBS / Tween 20 0,05 % a temperatura ambientedurante 10 min, para eliminar los fagos unidos inespecíficamente.

9. Añadir 600 µL de tampón de elución (HCl 0,1 N pH 2,2). Incubar a tempera-tura ambiente con agitación durante 10 min.

10. Neutralizar por adición de 400 µL de tampón neutralizante (Tris-HCl 2 MpH 9,0). Recuperar las partículas de fago adsorbidas después de laincubación frente a la molécula blanco.

11. Titular las fracciones no adsorbida (N) y adsorbida (A) según el procedimien-to descrito en la etapa anterior y calcular la relación N/A. Si N/A <= 102, sepuede estimar que la preparación está enriquecida en las partículas fágicasde interés.


Nota: La molécula blanco puede ser inmovilizada en diversos tipos de fasesólida tales como placas de ELISA, perlas paramagnéticas, placas Petri depoliestireno (35 mm de diámetro), Sefarosa. La variante óptima varía de unaaplicación a otra.

Si no se obtiene enriquecimiento en la primera ronda de “biopanning” (N/A >102), se pueden realizar rondas sucesivas mediante los siguientes pasos:

AMPLIFICACIÓN DE LA FRACCIÓN ADSORBIDA PARA REALIZAR RONDAS SUCESIVAS

DE “BIOPANNING”12. Adicionar todo el volumen de la fracción adsorbida (~ 1 mL) a un tubo de

centrífuga que contenga 5 mL de un cultivo de la cepa supresora de E. coli,para infectar las células con los fagos de interés. Incubar a 37 ºC durante30 min con agitación lenta. Sembrar en una placa (9 x 9’) de medio sólidoLB + ampicillina 100 µg/mL. Incubar a 37 ºC durante toda la noche.

13. Colectar las células en un volumen de 5 mL de medio LB + ampicillina 100µg/mL. Añadir 5 mL de glicerol 60 %. Conservar a –20 ºC.

14. Superinfectar 50 µL de la mezcla de células con 1012 ufc-KanR/mL delfago auxiliador M13KO7. Incubar a 37 ºC durante 10 min para permitir laadsorción del fago auxiliador a las células. Inocular un cultivo de 50 mL

de medio LB + ampicillina 100 µg/mL + kanamicina 70 µg/mL. Incubar a37 ºC durante 6 h.

15. Purificar las partículas fágicas de interés según el procedimiento descrito enla etapa de purificación de las partículas de fago. Utilizar 100 µL del mate-rial purificado para una nueva ronda de “biopanning” (paso 6).

RESULTADOS DE LA APLICACIÓN DE LA TECNOLOGÍA

DE EXPOSICIÓN DE PROTEÍNAS EN FAGO

Se utilizaron como modelos la proteína Rop de E. coli y la Interleucina-2 (IL-2) humana. La proteína Rop de E. coli participa en la regulación de lareplicación de la familia de los plásmidos ColE1. Rop es una proteína biencaracterizada cuya estructura es relativamente insensible a sustituciones, porlo que puede ser utilizada como andamiaje para la presentación de péptidosconstreñidos en el marco de una estructura más rígida [30]. La IL-2 humanaes una citocina de bajo peso molecular que juega un importante papel en laregulación del crecimiento y la diferenciación celular linfocitaria, la respuestainmune y la hematopoyesis [45]. Debido a sus propiedades esta glicoproteína

150 CAPÍTULO 8

es especialmente atractiva para la terapéutica inmunomoduladora, y se ha uti-lizado con buenos resultados en el tratamiento de numerosas enfermedadesmicrobianas y varios tipos de cáncer.

CLONACIÓN DEL GEN DE LA PROTEÍNA ROP EN EL VECTOR

FAGÓMIDO PHEN1El gen que codifica para la proteína Rop se aisló a partir de pex58 mediante unPCR. La banda resultante se digirió con las enzimas de restricción NcoI y NotI yse insertó en el vector fagómido pHEN1 (Figura 9.1) previamente digerido conlas mismas enzimas. El gen de la proteína Rop quedó ubicado entre el péptido desecreción pelB y la secuencia del gen III. El clon resultante, denominado Rop-pIII, se sometió a análisis por restricción y por secuenciación de ADN.

EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA ROP EN EL PERIPLASMA DE E. COLI

El plásmido Rop-pIII se transformó en la cepa de E. coli HB2151. Se realizóuna inducción en presencia de 1 mmol/L de IPTG y se procedió a la extrac-ción de las fracciones citoplasmática y periplasmática. Ambas muestras seaplicaron en un gel de poliacrilamida-SDS al 15 %, se transfirió a un filtro denitrocelulosa, se realizó una inmunodetección con un anticuerpo policlonal anti-Rop desarrollado en conejo y se reveló con un anticuerpo anti- IgG de conejoconjugado a peroxidasa. El resultado alcanzado fue el reconocimiento de laproteína Rop en ambas fracciones (Figura 8.2).

Figura 8.2. “Western blot” de las fracciones celular (línea 1) y periplasmática (línea 3) delclon Rop-pIII. Control negativo: células totales de la cepa transformada con elvector pHEN1 (línea 2).


PRESENTACIÓN DE LA PROTEÍNA ROP EN LA CÁPSIDA

DE LOS FAGOS FILAMENTOSOS

El plásmido Rop-pIII se transformó en la cepa supresora de E. coli TG1. Lascélulas transformadas se cultivaron y posteriormente se coinfectaron con elfago auxiliador M13KO7. Los fagos presentes en el sobrenadante del cultivo seprecipitaron con polietilenglicol y se purificaron por un gradiente de CsCl. Lapresencia de la proteína Rop se evaluó mediante un ELISA con un anticuerpopoliclonal anti-Rop desarrollado en conejo y se reveló con un anticuerpo anti-IgG de conejo conjugado a peroxidasa. El resultado alcanzado fue la exposiciónde la proteína Rop en el fago correctamente plegada (Figura 8.3).

CLONACIÓN DEL GEN DE LA IL-2 EN EL VECTOR FAGÓMIDO PHEN1El primer paso para la fusión de la IL-2 con la proteína III de los fagosfilamentosos fue la clonación del gen de la IL-2 en el vector fagómido pHEN1,que presenta el promotor LacZ, además de la señal de secreción pelB y el genque codifica para la proteína III de los fagos filamentosos (Figura 8.1). La

Figura 8.3. ELISA del sobrenadante de infección que contiene los fagos que exponen la proteínaRop. Control negativo: l sobrenadante correspondiente al pHEN1.

Abs 492 nm

0,5

0,6

0,4

0,3

0,2

0,1

pHEN

1

Rop-

p III

152 CAPÍTULO 8

proteína III puede ser suprimida de la preparación resultante de proteína con laintroducción de un codón de parada ámbar entre las dos secuencias y la utiliza-ción de una cepa supresora como hospedero.

El gen de la IL-2 se extrajo del M13mp18 con la enzima BamHI que produceun extremo protuberante, el cual se rellenó con el fragmento Klenow de laADN polimerasa de E. coli y se volvió a digerir con la enzima NcoI. De estaforma es posible insertar esta banda en el sitio múltiple de clonación del pHEN1digerido con las enzimas XhoI-Klenow-NcoI. El plásmido resultante, deno-minado pAS-6, se sometió a análisis por endonucleasas de restricción y porsecuenciación de ADN.

EXPRESIÓN DE LA IL-2 EN EL PERIPLASMA DE E. COLI.INCREMENTO EN LA HIDROFOBICIDAD DEL PÉPTIDO SEÑAL PELBPara estudiar la expresión de la IL-2 en el periplasma de la bacteria con elpéptido de secreción pelB (Figura 8.4), se utilizó el plásmido pAS-6 para trans-formar la cepa de E. coli HB2151. Las células transformadas se cultivaron enpresencia de diferentes concentraciones del inductor (desde 1 mmol/L hastaausencia de IPTG) y a varias temperaturas de crecimiento (37, 30 y 23 ºC). Seobtuvieron muestras de las fracciones citoplasmática y periplasmática y se ana-lizaron por electroforesis en un gel de poliacrilamida-SDS al 15 %. Se realizóuna detección inmunoquímica con el anticuerpo monoclonal CB-IL-2.1. En lainmunotransferencia (Figura 8.5a) se observó expresión de la IL-2 y su secre-ción al periplasma por parte de la secuencia señal pelB. En todos los casos labanda de IL-2 presenta una masa molecular superior a la esperada en 2 kDa,que corresponde a la proteína no procesada por la peptidasa señal.

Figura 8.4. Esquema de la estrategia de mutación empleada para incrementar la hidrofobicidad delpéptido de secreción pelB.


El proceso de infección de los fagos filamentosos a la bacteria ocurre a 37 ºC,por lo que el trabajo estuvo encaminado a lograr la secreción de la IL-2 alperiplasma bacteriano y el correcto procesamiento del péptido señal a dichatemperatura. Con este objetivo se procedió al incremento de la hidrofobicidaddel centro hidrofóbico del péptido de secreción. Se realizó un PCR inversopara modificar la secuencia de interés. Los oligonucleótidos empleados intro-dujeron diez residuos de valina en esta zona y eliminaron el centro hidrofóbicode la señal de secreción pelB (Figura 8.4). Este PCR se realizó sobre el pAS-6.Los clones positivos se seleccionaron por análisis de restricción mediante unsitio Sma I introducido por los oligonucleótidos, y posteriormente sesecuenciaron. A partir de estos experimentos se seleccionó el clon pVM-51para los estudios de expresión.

El plásmido pVM-51 se transformó en la cepa de E. coli HB2151. Se realizóuna inducción a 37 ºC en presencia de 1 mmol/L de IPTG, se aislaron las frac-ciones citoplasmática y periplasmática y se inmunoidentificó con el anticuerpomonoclonal CB-IL-2.1. Los resultados (Figura 8.5b) muestran la secreción dela IL-2 con una masa molecular de 15 kDa, correspondiente a la moléculacorrectamente procesada por la peptidasa señal durante su paso al periplasma.

Figura 8.5. “Western blot” de las fracciones celular (FC) y periplasmática (FP) de las induccionesrealizadas a los clones pAS-6 y pVM-51. Control positivo: la Interleucina-2 (IL-2)recombinante . La electroforesis se realizó en un gel de poliacrilamida-SDS al 15 %. Seutilizó el anticuerpo monoclonal CB-IL-2.1 conjugado a peroxidasa.

154 CAPÍTULO 8

PRESENTACIÓN DE LA IL-2 EN LA CÁPSIDA DE LOS FAGOS

FILAMENTOSOS

Con el fagómido pVM-51 se llevó a cabo un estudio de expresión en la cápsidamediante “western blot” de muestras de los fagos purificados por un gradiente deCsCl (Figura 8.6). Se incluyeron también aquí las muestras de fracciónperiplasmática de las cepas HB2151 y TG1 transformadas con el fagómido pVM-51. En este caso, para el fago que porta el pVM-51 se obtuvo una banda al mismonivel que la de la cepa supresora (TG1), lo que confirmó que la proteína híbridaIL-2-pIII es capaz de incorporarse eficientemente en la cápsida del bacteriófago.

Estos resultados demostraron que el sistema empleado es efectivo tanto en laexpresión de IL-2-pIII, regulada por el promotor lacZ, como en su secreción,dirigida por la secuencia señal pelB. Una vez en el periplasma, esta proteínahíbrida es capaz de competir con las moléculas de pIII de tipo salvaje por laincorporación a la cápsida del fago.

ENSAYOS DE “BIOPANNING” CON EL ANTICUERPO CB-IL-2.1La cepa TG1 transformada con el plásmido pVM-51 se infectó con el fagoauxiliador M13KO7. Las partículas virales se aislaron del cultivo infectado y se

*La fracción periplasmática del pVM-51 transformado en la cepa TG1 se utilizó como control de latalla que debe tener la proteína híbrida expuesta en el fago pVM-51.

Figura 8.6. ¨Western blot¨ de muestras de fago purificados por un gradiente de CsCl.* Comocontroles negativos se utilizaron el pHEN1 transformado en la cepa TG1 y el fagocorrespondiente a este vector. La electroforesis se realizó en un gel de poliacrilami-da-SDS al 12,5 %. Se utilizó el anticuerpo monoclonal CB-IL-2.1 conjugado aperoxidasa.


purificaron por un gradiente de CsCl. El M13KO7 y el pHEN1 se purificaronmediante el mismo método.

La presencia de la IL-2 expuesta en el fago se determinó por dos ensayos de“Biopanning”. En ambos se utilizó el anticuerpo monoclonal CB-IL-2.1 comoelemento de captura sobre perlas de poliestireno.En el primer ensayo (Tabla 8.2) se comparó la relación entre la cantidad deunidades formadoras de colonias resistentes a ampicillina, infectadas por el pVM-51 ylas obtenidas por la infección con el vector pHEN1, después de una ronda deselección. En este caso la relación fue de 80 veces del primero con respecto alsegundo.

En el segundo ensayo (Tabla 8.3) el problema se abordó con la utilización de laperla de poliestireno recubierta con el anticuerpo monoclonal CB-IL-2.1 comoelemento de captura y otra perla control sin el anticuerpo. Ambas se hicieronreaccionar con una mezcla del fago auxiliador M13KO7, que confiere resisten-cia a la kanamicina, y el pVM-51 en una relación de 100 a 1. El enriquecimientoque se obtuvo fue de 76,9 veces por parte de la perla recubierta con el anticuer-po, lo que demostró que aún dentro de esta mezcla del fago auxiliador con elfago que porta la IL-2, el anticuerpo fue capaz de seleccionar a su antígenocorrespondiente.

TABLA 8.2. Enriquecimiento específico del fago que expone la IL-2 (pVM-51) compara-do con el control negativo (pHEN1). Se utilizó el anticuerpo monoclonalCB-IL-2.1 como elemento de captura.

TABLA 8.3. Enriquecimiento específico del fago que expone la IL-2 (pVM-51) compara-do con el fago auxiliador M13KO7. Se utilizó el anticuerpo monoclonalCB-IL-2.1 como elemento de captura.

156 CAPÍTULO 8

Estos dos experimentos reafirmaron el criterio inmunoquímico que se expusoparcialmente en el “western blot” de la Figura 8.6, en el cual el fago se lepresentó al anticuerpo en forma desnaturalizada en un gel de poliacrilamida. Enlos experimentos de “Biopanning” el antígeno (IL-2) se enfrentó al anticuerpoCB-IL-2.1 en el contexto del fago, presentándose en la reacción de reconoci-miento en forma soluble. Este resultado ratificó la selección de la IL-2 por partedel AcM dentro de toda la estructura formada por las restantes proteínas de lacápsida del bacteriófago y validó su posible utilización para generar bibliotecasde mutantes de esta molécula.

Para confirmar que la IL-2 expuesta en el fago se encuentra correctamenteplegada se realizó un ensayo de actividad biológica con la línea murina CTLL-2,dependiente de IL-2 para su proliferación. El resultado alcanzado fue que elfago pVM-51 (1,62 x 1012 ufc-AmpR/mL), que expone la IL-2, tiene una activi-dad proliferativa de 528 ± 160 U/mL. En la Figura 8.7 se muestra el resultadocorrespondiente.

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Figura 8.7. Inducción de la proliferación celular de la línea murina CTLL-2 en presencia de IL-2.


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