explicacion tp iv fosfatasa
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Trabajo Práctico Nº IV:
ENZIMAS: ENSAYO CUANTITATIVO
OBJETIVOS
Analizar la variación de la actividad enzimática de lafosfatasa alcalina de suero sanguíneo en función de laconcentración de sustrato.
Establecer las condiciones adecuadas para que ladeterminación de la velocidad de reacción seaproporcional a la concentración de enzima.
Determinar la actividad enzimática específica.
Afianzar los conceptos sobre condiciones óptimas demedida de la actividad enzimática en fluidos biológicos otejidos como herramienta para el diagnóstico de muchasenfermedades.
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v = - [S] = [P] ; unidades: moles [S] o [P]
t t min
Ensayo cualitativo: Indica presencia o no de Ez. Se verifica la
aparición de P ó desaparición de S.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Ensayo cuantitativo: Generalmente imposible determinar cantidad
absoluta de Ez (mg o moles). Depende del grado de pureza. Se mide la
velocidad de reacción que será proporcional a [Ez], si [S] saturante.
Unidad Internacional Enzima: cantidad de enzima capaz de
transformar 1 mmol S / min
Actividad Específica: Actividad enzimática (medida en condiciones
de Vmax) en relación al contenido de proteínas. Depende del grado de
purificación de una enzima.
Se expresa en: Unidades Enzimáticas / mg proteína
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Cuando la enzima actúa a su máxima velocidad.
Optimizando condiciones del medio
pH, temperatura, cofactores y …
[S] saturantes
La medida de la actividad enzimática se refiere a la capacidad de la catálisis en condiciones óptimas…?
Cuando la [S] no es saturante …?
la velocidad de la reacción enzimática V0 depende de la [S] cinética de saturación
Para enzimas Michaelianas: ecuación de Michaelis-Menten:
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Vmax[S]
Km + [S]V0 =
Constantes cinéticasKm (constante para cada enzima): Es la [S] en la que la V0 = ½ Vmax. Medida inversa de la afinidad del enzima por S. Vmax (constante para cada concentración de enzima): Se alcanza cuando todos los centros activos están ocupados con sustrato.
Los valores de Km y Vmax
se pueden estimar a partir
del gráfico de V0 vs. [S],
aunque calcularlos a partir
de este gráfico no es fácil.
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Una forma más exacta para calcular las constantes cinéticas es utilizar la transformación lineal de Lineweaver-Burk: 1/V0 vs. 1/[S]
Se obtiene una recta en la cual:
La pendiente es Km/Vmax
La abscisa al origen es - 1/Km
La ordenada al origen es1/Vmax
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Determinación cuantitativa de la actividad fosfatasa alcalina
La fosfatasa alcalina tiene una baja especificidad de sustrato porlo que es capaz de hidrolizar una amplia variedad de fosfoésteresorgánicos.
El aceptor del fosfato liberado por acción de la enzima puede sercualquier solvente que contenga un grupo –OH, habitualmente unamolécula de agua:
R-O-PO32- + H-O-H R-O-H + H-O-PO3
2-
Fosfatasa alcalina:
pH óptimo altamente básico.
Múltiples isoformas
Presente en muchos tejidos
Valores sanguíneos se alteran fundamentalmente en procesos que afectan el sistema hepatobiliar o el tejido óseo
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FUNDAMENTOS DEL MÉTODO
La fosfatasa alcalina desdobla al fenilfosfato de sodio en medio alcalino tamponado con aminometil propanol (AMP).
El fenol liberado se determina por reacción con 4-amino-antipirina y ferricianuro como agente oxidante.
El color desarrollado es directamente proporcional a la actividad enzimática y se mide a 520 nm.
H
+ PO4HNa2
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H2O
4-amino-antipirina ferricianuro
520 nm
Procedimiento Experimental
a) Curva de calibración
Standard solución de fenol: 50 ml equivalente a 200 UI/L.
1UI = Cantidad de enzima que cataliza la formación de
1 mmol de Producto/min
TuboEstandar,
mL
Buffer,
mL
Reactivo
color, mL
Absorbancia
520 nm
Abs.
corregida
UI/L
1 0 500 2,5 0,004 0 0
2 10 490 2,5 0,149 0,145 40
3 25 475 2,5 0,187 0,183 100
4 50 450 2,5 0,265 0,261 200
5 75 425 2,5 0,342 0,338 300
6 100 400 2,5 0,411 0,407 400
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Calcular el factor como la inversa de la pendiente de la recta de calibración
Curva de calibrado
y = 0,0007x + 0,1131
R2 = 0,9993
y = 0,0009x + 0,0662
R2 = 0,929
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 50 100 150 200 250 300 350 400
U I / L
Ab
s c
orr
eg
ida
sin 0 con 0 Lineal (sin 0) Lineal (con 0)
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b) Variación de la actividad enzimática en función de la [S]
Tubo Sustrato Buffer Suero Absorbancia
mM ml ml
Preincubar
en baño de
agua a 37°C
unos
minutos.
Luego
agregar:
ml
1A 0 0 0,5 0
2B 0 0 0,5 50
3 2.8 0,5 0 50
4 5.6 0,5 0 50
5 11.2 0,5 0 50
6 16.8 0,5 0 50
7 22.4 0,5 0 50
8 25.2 0,5 0 50
9 28 0,5 0 50
10C 5.6 0,5 0 0
11C 28 0,5 0 0
- Iniciar la reacción con el agregado de enzima en forma secuencial.
- Incubar a 37ºC durante 10 minutos exactos (usar cronómetro).
- Agregar 2,5 ml reactivo de color, retirar del baño termostatizado y agitar.
- Leer Absorbancia 520 nm frente a blanco de agua destilada (color de la
reacción estable 30 minutos).Explicación TP IV Química Biológica Pag. 12
TuboSustrato,
mM
Absorbancia
520 nm
Absorbancia
corregida
Formación de
producto total, UI/l
Activ. fosfatasa
alcalina, UI/l
1A 0
2B 0
3 2.8
4 5.6
5 11.2
6 16.8
7 22.4
8 25.2
9 28
10C 5.6
11C 28
1 Abs. corregida = Abs. muestra – (Abs. blanco reactivos + Abs. blanco muestra)
2 Formación Producto total = P formado por hidrólisis química + P formado por
hidrólisis enzimática)
3 Activ. Fosfatasa = Formación Producto total - P formado por hidrólisis química (para
cada concentración de sustrato)
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Blanco de reactivos
Blanco de muestra
Blancos de reacción, para descontar hidrólisis
química (no enzimática) del sustrato
Formación de producto (UI/L) = factor x Abs. corregida
10C y 11C Para descontar la hidrólisis química (no enzimática,
blanco de reacción) del sustrato.
Como la [S] varía entre tubos, se procede a realizar una curva
de velocidad de hidrólisis química con ambos valores más el
cero y se interpola el valor para cada concentración de sustrato
S
P
P
+ EES
Velocidad de
hidrólisis química
Hidrólisis total
Actividad fosfatasa alcalina
0
40
80
120
160
200
240
280
0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30
[FFNa], mM
Acti
v.
UI/
l
Representar en un mismo gráfico:
- hidrólisis química
- hidrólisis total: hidrólisis química + hidrólisis enzimática
En función de la [S], especificar unidades
Explicación TP IV Química Biológica Pag. 15
Transformación lineal
y = 0,0105x + 0,003
R2 = 0,9935
0,000
0,002
0,004
0,006
0,008
0,010
0,012
0,014
0,016
-0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
1/[S] mM-1
1/V
(U
I/l)
-1
con S 28 mM sin S 28 mM Lineal (sin S 28 mM)
Calcular a partir del gráfico: Km y Vmax
Con valor de [proteínas]/ml suero calcular Actividad específica….?
Explicación TP VI Química Biológica Pag. 16