Evaluación del efecto de la sobreexpresión de los genes groES y groEL en la tolerancia de Clostridium sp. IBUN 158B a 1,3-propanodiol

Daniel Marín Torres

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias

Bogotá, Colombia 2016

Evaluación del efecto de la sobreexpresión de los genes groES y groEL en la tolerancia de Clostridium sp. IBUN 158B a 1,3-propanodiol

Daniel Marín Torres

Tesis de grado presentada como requisito parcial para optar por el título de:

Magíster en Ciencias – Microbiología

Directora: Ph.D. Dolly Montoya Castaño

Línea de investigación: Microorganismos Solventogénicos

Grupo de Investigación: Grupo de Bioprocesos y Bioprospección

Universidad Nacional de Colombia Facultad de Ciencias

Bogotá, Colombia 2016

I

Agradecimientos

A la doctora Dolly Montoya por darme la oportunidad de trabajar en su grupo de investigación y por su apoyo incondicional durante el desarrollo de esta tesis. A Ximena Carolina Pérez por toda su ayuda e infinita paciencia. A los integrantes de la línea de microorganismos solventogénicos del IBUN por sus aportes y consejos. A la doctora Martha Fontanilla por su colaboración durante la maestría.

II

Resumen La tolerancia microbiana a los solventes es uno de los factores limitantes en los procesos de producción por vía biológica de dichos compuestos. En el presente trabajo, se evaluó el efecto de la expresión autóloga de las chaperonas codificadas por el operón groESL en la tolerancia al 1,3-propanodiol de la cepa nativa Clostridium sp. IBUN 158B. Para esto, se construyó un plásmido con los genes de interés (pMTL(groESL)), el cual fue transferido por conjugación a IBUN 158B. Los ensayos de inhibición realizados demostraron que la cepa recombinante obtenida presentó un aumento de 29,83% en la tolerancia al 1,3-propanodiol con respecto a la cepa control, lo cual puede atribuirse a la actividad de renaturación de las chaperonas expresadas y a su consecuente efecto protector sobre las proteínas afectadas por el solvente. Por otra parte, los experimentos de PCR cuantitativa con retrotranscripción revelaron que la expresión de los genes de interés en la cepa recombinante era 43 veces mayor en presencia del solvente con respecto a la cepa control. Palabras clave: Chaperonas, 1,3-propanodiol, Clostridium, RT-qPCR, Sobreexpresión, Tolerancia a solventes.

III

Abstract Microbial tolerance to solvents is one of the limiting factors in the biological production of said compounds. In this work, the effect of the overexpression of the chaperones codified by the groESL operon on the tolerance of the native strain Clostridium sp. IBUN 158B to 1,3-propanediol was evaluated. To do this, a plasmid with the sequence of interest was constructed (pMTL(groESL)) and transferred to IBUN 158B by conjugation. The inhibition assays revealed that the recombinant strain exhibited a 29,83% increase in tolerance to 1,3-propanediol relative to the control strain, which can be attributed to the renaturation activity of the expressed chaperones, and the consequent protector effect that they confer to the proteins affected by the solvent. Moreover, Quantitative Reverse Transcription PCR experiments revealed that the expression of the genes of interest was increased 43-fold relative to the control strain.

Keywords: Chaperones, 1,3-propanediol, Clostridium, RT-qPCR, Overexpression, Solvent tolerance.

IV

Contenido

Pág.

Introducción.................................................................................................................... 1

Justificación.................................................................................................................... 2

1. Marco Teórico.......................................................................................................... 3

1.1 Biodiesel y glicerol.......................................................................................... 3

1.2 Generalidades del 1,3-propanodiol................................................................. 4

1.2.1 Producción de 1,3-propanodiol............................................................. 5

1.3 Toxicidad de solventes orgánicos y Mecanismos de tolerancia..................... 7

1.3.1 Proteínas de choque térmico y su efecto en la tolerancia a

solventes............................................................................................... 8

1.4 Avances del grupo de Bioprocesos y Bioprospección en el estudio de cepas

nativas de Clostridium sp. productoras de 1,3-propanodiol........................... 9

2. Objetivos................................................................................................................. 10

2.1 Objetivo General.......................................................................................... 10

2.2 Objetivos Específicos................................................................................... 10

3. Metodología............................................................................................................ 11

3.1 Microorganismos y condiciones de cultivo.................................................. 11

3.2 Diseño de cebadores................................................................................... 11

3.3 Extracción de ADN....................................................................................... 12

3.4 Clonación del operón groESL en Clostridium sp. IBUN 158B...................... 12

3.5 Ensayos de inhibición................................................................................... 15

3.6 Extracción y cuantificación de ARNm.......................................................... 16

3.7 Secuenciación y análisis bioinformático del operón groESL........................ 18

4. Resultados y Discusión........................................................................................ 19

4.1 Construcción y transferencia de pMTL(groESL) a Clostridium sp. IBUN

158B.................................................................................................................. 19

4.2 Análisis de la tolerancia al 1,3-propanodiol de la cepa Clostridium sp. IBUN

158B pMTL(groESL).......................................................................................... 21

4.3 PCR cuantitativa: Validación de los genes de referencia y análisis de la

eficiencia............................................................................................................ 23

4.4 Análisis de la expresión diferencial del operón groESL.............................. 25

V

4.5 Perspectivas: Aplicación de la cepa Clostridium sp. IBUN 158B-

pMTL(groESL)................................................................................................... 27

5. Conclusiones........................................................................................................ 28

6. Recomendaciones................................................................................................ 29

Bibliografía.................................................................................................................... 30

Anexos........................................................................................................................... 37

VI

Lista de Figuras

Pág.

Figura 1: Reacción de transesterificación para producción de biodiesel..................... 3

Figura 2: Reacción de síntesis del politrimetilentereftalato.......................................... 4

Figura 3: Rutas de degradación del glicerol por parte de Clostridium butyricum........ 5

Figura 4: Estructura del vector pMTL007C-E2............................................................ 14

Figura 5: Análisis del constructo pMTL(groESL)......................................................... 20

Figura 6: Ensayos de inhibición................................................................................... 21

Figura 7: Curvas estándar - Eficiencia......................................................................... 24

Figura 8: Expresión diferencial de los genes groESL de la cepa IBUN pMTL(groESL) vs

la cepa IBUN pMTL en ausencia y en presencia de 1,3-propanodiol........................... 26

VII

Lista de Tablas

Pág.

Tabla 1: Microorganismos y plásmidos.................................................................. 11

Tabla 2: Cebadores................................................................................................ 12

Tabla 3: Reacción de amplificación del operón groESL......................................... 13

Tabla 4: Reacción de digestión del operón groESL............................................... 13

Tabla 5: Reacción de amplificación para qPCR..................................................... 17

Tabla 6: Estadísticas descriptivas de los genes de referencia............................... 23

Tabla 7: Eficiencia de las reacciones de amplificación (qPCR).............................. 25

Tabla 8: Comparación de la región promotora de los operones groESL................ 26

Tabla 9: Comparación de la secuencia CIRCE de los operones groESL............... 27

VIII

Lista de Anexos

Pág.

Anexo A: Medios de cultivo........................................................................................ 36

Anexo B: Protocolos de Extracción de Ácidos Nucleicos........................................... 38

Anexo C: Preparación de células quimiocompetentes............................................... 41

Anexo D: Datos de densidad óptica – Ensayos de inhibición..................................... 42

Anexo E: Curvas de disociación de los productos de qPCR...................................... 43

1

Introducción La gran diversidad enzimática y metabólica que presentan las bacterias del género Clostridium ha incentivado a diferentes investigadores a aprovechar este potencial para la producción de compuestos de interés industrial [1]. Dicho potencial se traduce en la capacidad de estos microorganismos de fermentar diferentes carbohidratos para dar lugar a ácidos orgánicos como son el ácido butírico [2] y el ácido acético [3]; hidrógeno [4, 5]; y solventes como el butanol [6-9] y la acetona [7-9]. Uno de los metabolitos producido por Clostridium spp. de mayor interés industrial en los últimos años es el 1,3-propanodiol (1,3-PD), un diol de cadena corta empleado en la producción de lubricantes, alimento animal, cosméticos, biocidas y plásticos biodegradables [10, 11]. No obstante, la producción biotecnológica a gran escala del 1,3-propanodiol se ve limitada por factores como el costo del sustrato, bajos rendimientos, la formación de subproductos y la inhibición por sustrato y/o producto [10-14]. Con respecto al primer factor mencionado, una de las soluciones más llamativas la ofrece la industria del biodiesel, cuyo crecimiento alrededor del mundo ha generado un aumento en la oferta del subproducto obtenido de la formación de este biocombustible, el glicerol, del cual se producen 10 toneladas por cada 100 toneladas de biodiesel [15, 16]. Debido a esto, y al glicerol generado por otras industrias en procesos como la producción de jabones y de bebidas alcohólicas, se ha originado un exceso de este compuesto en el mercado internacional [17], fomentándose de esta manera la búsqueda de usos y aplicaciones para este subproducto. Entre las posibilidades existentes, se encuentra su utilización como sustrato para la producción biotecnológica de 1,3-propanodiol, la cual a su vez puede realizarse a partir del glicerol industrial (i.e. glicerol no purificado) por bacterias del género Clostridium (específicamente Clostridium butyricum) con rendimientos y productividades similares a las obtenidas con glicerol puro [14, 18, 19]. Este fenómeno es de gran importancia ya que no sólo disminuye los costos de producción del solvente, sino que también le da valor agregado al proceso de producción del biodiesel y disminuye su precio. En lo referente a la inhibición por producto, se ha propuesto que el efecto adverso del 1,3-propanodiol, al igual que el de otros solventes, ocurre a medida que se acumula en el medio y consiste fundamentalmente en la alteración de la membrana celular del microorganismo, lo cual no sólo afecta su fluidez, y consecuentemente su habilidad de funcionar como una barrera semipermeable frente a las moléculas encontradas en el ambiente, sino que también inhibe la actividad de las proteínas intermembranales y destruye el gradiente de pH [20-22]. Sin embargo, pese a que diferentes investigadores han evaluado el efecto del 1,3-propanodiol en el crecimiento y la producción de metabolitos tanto en cepas silvestres [12-14, 23] como cepas mutantes de Clostridium [24, 25], hasta la fecha no se conocen los genes involucrados en los mecanismos de tolerancia al solvente, los cuales podrían ser empleados en estrategias de mejoramiento genético con el objetivo de optimizar el proceso de producción. El objetivo principal de esta tesis de maestría fue evaluar el efecto de la sobreexpresión de los genes groES y groEL sobre la tolerancia a 1,3-propanodiol de la cepa Clostridium sp. IBUN 158B. Para esto, se clonaron y expresaron dichos genes en Clostridium sp. IBUN 158B y se realizó una comparación de la tolerancia al solvente presentada por la cepa recombinante y una cepa control.

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Justificación En los últimos años, la producción de biodiesel en Colombia ha ido en aumento gracias al interés de diferentes organizaciones nacionales de obtener fuentes alternativas de energía a los combustibles fósiles; entre ellas el Estado, el cual mediante la ley 939 de 2004, fomenta el uso de biocombustibles de origen vegetal o animal para uso en motores diesel [26]. En la actualidad, existen 9 plantas en funcionamiento para la producción de este biocombustible en el país, reportándose aproximadamente 470.000 toneladas producidas en 2015 [27]. Esta producción indica que estas plantas están generando unas 49.000 toneladas de glicerol industrial, producto que constituye una potencial fuente de ingreso para esta industria debido a su utilidad en diferentes aplicaciones como son la producción de alimento animal (en la cual se utiliza como aditivo), biopolímeros, surfactantes, productos farmacéuticos y cosméticos, entre otros [28]. No obstante, para muchas de estas aplicaciones es necesario remover las impurezas derivadas del proceso de producción del biocombustible, como metanol, ácidos grasos saturados e insaturados, metales pesados, sales, entre otros [14, 19, 28-30], lo cual aumenta los costos de las plantas de producción y consecuentemente aumenta el precio del biodiesel. Una de las soluciones a este problema es utilizar el glicerol crudo como materia prima para la producción por vía biológica de 1,3-propanodiol [10, 18, 28-30], producto cuya demanda en 2014 alcanzó los 310,5 millones de dólares, y se proyecta que para 2021 alcance un valor de 621,2 millones de dólares [31]. La obtención por vía biológica de este solvente a partir de glicerol se ha realizado empleando microorganismos de los géneros Klebsiella [32-35], Lactobacillus [36-38], Citrobacter [39, 40], Halanaerobium [41] y Clostridium [14, 18, 19, 23-25, 29, 30, 42]. Este último grupo de microorganismos ha atraído la atención de diferentes investigadores debido a que la enzima glicerol deshidratasa de estos microorganismos (específicamente de C. butyricum), que participa en la reducción del glicerol a 1,3-PD, no necesita vitamina B12 como cofactor [29, 43], lo cual disminuye el precio del proceso de fermentación. Sin embargo, la producción mundial de 1,3-propanodiol en la actualidad a nivel industrial se ve limitada por la baja rentabilidad del proceso, razón por la cual es necesario diseñar estrategias que optimicen tanto las condiciones de la fermentación (i.e sustratos, pH, temperatura y tipo de fermentación, entre otros), como las capacidades propias microorganismo utilizado [10, 11]. Uno de los problemas que limitan la rentabilidad de la producción de 1,3-propanodiol por vía biológica es la inhibición generada por el solvente, la cual limita el crecimiento del microorganismo durante la fermentación, y consecuentemente disminuye los rendimientos y productividades obtenidos al final del proceso. Entre las posibles alternativas para solucionar este problema, se encuentra la sobreexpresión de proteínas de choque térmico, las cuales contribuyen al replegamiento de enzimas y proteínas estructurales denaturadas, generando así un efecto protector frente al daño causado por el solvente. Esta estrategia ha permitido obtener microorganismos más tolerantes a los efectos inhibitorios de solventes como n-butanol [44, 45] y etanol [46]; sin embargo, hasta la fecha no hay estudios relacionados con el 1,3-propanodiol. Dicho esto, el objetivo de este proyecto es evaluar el efecto de la sobreexpresión de las proteínas de choque térmico del sistema groESL sobre la tolerancia de Clostridium sp. IBUN 158B al 1,3-propanodiol.

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1. Marco teórico

1.1 Biodiesel y glicerol

El desarrollo de fuentes alternativas de energía ha sido uno de los objetivos de mayor interés para la comunidad científica y diferentes sectores de la industria en los últimos años debido al agotamiento de los combustibles fósiles y al impacto negativo que tiene la utilización de estos sobre el ambiente [47]. Entre las fuentes alternativas de energía más atractivas se encuentran los biocombustibles, los cuales ofrecen ventajas como menor impacto ambiental, mayor seguridad energética, desarrollo agrícola y, en el caso de países sin reservas de petróleo, la oportunidad de entrar en el mercado mundial de energía [48]. El biodiesel, definido como monoalquil ésteres de ácidos grasos derivados de aceites vegetales o grasas animales, es obtenido a partir de distintos procedimientos, siendo el más común la transesterificación de grasas y metil- o etil- alcoholes, lo cual da lugar a metil- o etil- ésteres y glicerol (Figura 1) [15]. El biodiesel es uno de los biocombustibles más prometedores debido a su alta susceptibilidad de ser biodegradado, su baja toxicidad, su baja cantidad de compuestos azufrados y compuestos aromáticos y, a diferencia de otras alternativas, su producción es económicamente viable tanto en países desarrollados como en países en vía de desarrollo [15, 16].

Figura 1. Reacción de transesterificación para producción de biodiesel (Tomado y adaptado de [15])

El único subproducto generado durante la producción del biodiesel, el glicerol, es una sustancia de gran interés económico gracias a su utilidad como solvente y agente modificador de la viscosidad de cosméticos y productos farmacéuticos, como aditivo y conservante en la industria de alimentos [28], y en la producción biotecnológica de compuestos orgánicos como ácido cítrico [49, 50], ácido propiónico [51], polihidroxialcanoatos [52, 53], y 1,3-propanodiol [10-14, 17-19, 23-25, 28-30, 33-41, 54-62].

1.2 Generalidades del 1,3-propanodiol

El 1,3-propanodiol (1,3-PD), también conocido como trimetilenglicol, es un compuesto orgánico líquido a temperatura ambiente, que se caracteriza por ser incoloro, viscoso e incombustible [10]. Este compuesto es empleado en diversas aplicaciones como la producción de polímeros de uso en balística, la producción de biocidas (ej. 2-nitro-1,3-propanodiol), como aditivo en detergentes y cosméticos, solvente de tintas y anticongelantes, como intermediario en la producción de compuestos heterocíclicos (e.g. índoles), e incluso como tranquilizante [10, 11]. No obstante, la aplicación más llamativa de este diol de cadena corta se da en la producción de plásticos como poliuretanos, poliéteres y poliésteres [63], entre los cuales se encuentra el politrimetilentereftalato (PTT). El PTT, sintetizado a partir de la condensación del 1,3-propanodiol y del ácido tereftálico (Figura 2), es un polímero aromático biodegradable cuyas propiedades como alta flexibilidad; suavidad; baja absorción de agua; resistencia a manchas, al lavado (washfastness), y a la luz UV [64];

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lo hacen de especial interés en la producción de fibras para ropa y alfombras; y en la fabricación de empaques y películas de tipo fotográfico [11, 64].

Figura 2. Reacción de síntesis del politrimetilentereftalato [11].

1.2.1 Producción de 1,3-propanodiol

La producción por vía química del 1,3-propanodiol, llevada a cabo por las empresas DuPont y Shell [11], consiste en la hidratación del aldehído acroleína y posterior hidrogenación del 3-hidroxipropionaldehído producido, o por la hidroformilación y posterior hidrogenación del etileno [65]. Esta vía ha sido relegada a favor de la producción biotecnológica a partir de materias primas como el glicerol debido a problemas como la formación de subproductos tóxicos, el precio de los catalizadores, el uso de materias primas no renovables como la acroleína y el óxido de etileno, la necesidad de altas presiones y temperaturas para obtener el producto, entre otros [10]. Por otra parte, la producción por vía biotecnología del 1,3-propanodiol se puede realizar a temperaturas y presiones más bajas, lo cual disminuye los costos energéticos hasta en un 40% [64]; no hay producción de intermediarios tóxicos; y su obtención puede darse a partir de recursos biológicos renovables [10, 54]. La formación de 1,3-PD por vía biológica se da en la naturaleza únicamente a partir de la fermentación del glicerol [66, 67]. La degradación del glicerol se da por medio de dos vías metabólicas: una vía oxidativa en la cual se produce energía en forma de ATP, potencial reductor en forma de NADH+H, y diferentes metabolitos; y una vía reductiva en la que se regenera el NAD+ y se forma 1,3-propanodiol [10, 11, 29, 58, 63]. La composición y cantidad de los metabolitos producidos en la ruta oxidativa varían dependiendo del microorganismo. En el caso de Clostridium butyricum, la degradación por vía oxidativa da lugar a hidrógeno y a compuestos orgánicos como ácido acético, etanol, ácido butírico y ácido láctico (Figura 3) [14, 18, 24, 30, 55, 56, 58]; en las fermentaciones realizadas con Clostridium pasteurianum, se producen ácido acético, butanol, ácido butírico y etanol [29, 42]; y, en el caso de Klebsiella pneumoniae, se produce etanol, ácido láctico y 2,3-butanodiol [32, 33, 35].

5

Figura 3. Rutas de degradación del glicerol por parte de Clostridium butyricum (Tomado y modificado

de [10])

En la vía reductiva, el glicerol es transformado en 3-hidroxipropionaldehído por la acción de la glicerol deshidratasa, el cual es posteriormente reducido a 1,3-propanodiol por la acción de la 1,3-propanodiol deshidrogenasa, proceso en el que se consumen 2 moléculas de NADH2. Las enzimas de este proceso pertenecientes a Clostridium butyricum fueron caracterizadas molecularmente por Raynaud y colaboradores en 2003, cuya investigación reveló que los genes responsables de codificar tanto la glicerol deshidratasa (dhaB1), como la 1,3-propanodiol deshidrogenasa (dhaT), eran transcritos en tándem junto con el gen dhaB2, el cual codifica una proteína activadora de la deshidratasa [43]. Por otra parte, se encontró que existían dos genes (dhaS y dhaA) cercanos al operón dhaB1/dhaB2/dhaT que codifican para una histidin-quinasa y un regulador de respuesta respectivamente, y que probablemente están involucrados en la regulación transcripcional de dicho operón [43]. Pese a los adelantos realizados sobre la biología del proceso de producción de 1,3-PD, el escalamiento a nivel industrial y el desarrollo de un proceso económicamente viable con Clostridium spp. se han visto limitados por diferentes problemas, como son los bajos rendimientos y productividades de las fermentaciones, el costo y la eficiencia de los

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procesos de separación y purificación, la inhibición por sustrato, y la inhibición por productos [10, 11]. Los bajos rendimientos y productividades de 1,3-propanodiol obtenidos por vía biotecnológica se atribuyen principalmente a la generación de otros metabolitos (e.g. ácidos orgánicos, alcoholes, hidrógeno) durante la fermentación, los cuales desvían el flujo de carbono y electrones de la formación del solvente de interés [29]. Para la obtención de cepas con un mayor potencial de producción de 1,3-PD, se han empleado estrategias de modificación genética que buscan bloquear las rutas encargadas de la producción de dichos metabolitos y/o aumentar la producción del solvente por sobreexpresión de los genes involucrados en su formación. El bloqueo de las rutas responsables de la producción de metabolitos no deseados se ha realizado empleando dos metodologías en las que se inactivan los genes de dichas rutas: la mutagénesis al azar, que se puede realizar sin tener conocimiento previo del genoma del microorganismo a utilizar; y la mutagénesis dirigida, la cual es más eficaz y menos laboriosa a la hora de obtener mutantes con el genotipo deseado [29, 68]. Entre los estudios que han empleado mutagénesis al azar, se encuentra el realizado por Abbad-Andaloussi y colaboradores, en el que se utilizó N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) para obtener mutantes de C. butyricum tolerantes a mayores concentraciones de glicerol y 1,3-PD. Las mejores mutantes (2/2, 2/6 y 5/6) no solo podían crecer bajo concentraciones de 1955 mM de glicerol y 525 mM de 1,3-propanodiol (condiciones que inhibían completamente el crecimiento de la cepa silvestre), sino que también las concentraciones finales y rendimientos obtenidos eran superiores [24]. Una variación al método tradicional de mutagénesis al azar, conocido como genome shuffling, fue realizado para mejorar la producción de una cepa silvestre de Clostridium diolis DSM 15140 [69]. Esta modificación consiste en la generación y fusión de protoplastos de células previamente mutadas que presenten el fenotipo deseado, de manera tal que, por fenómenos de recombinación, se obtenga un microorganismo con las características de las células parentales. En el estudio en cuestión, se lograron obtener 3 mutantes que presentaron rendimientos de 1,3-PD entre 0.61-0.64 mol/mol y productividades entre 2.09-2.82 gL-1h-1 en cultivos por lote alimentado [69]. Hasta la fecha, el único estudio que ha empleado mutagénesis dirigida para mejorar la producción de 1,3-propanodiol fue realizado por Montoya en 2012, estudio en el cual se empleó el sistema de mutagénesis Clostron en Clostridium sp. IBUN 158B para inactivar los genes responsables de la producción de hidrogenasa (hdyA), lactato deshidrogenasa (ldhA) y 3-hidroxibutiril-CoA deshidrogenasa (hbd), de manera tal que se desviara el flujo de electrones y carbono hacia la producción de 1,3-PD. Además de esto, se generaron cepas recombinantes con un vector de expresión que contenía los genes dhaB1, dhaB2 y dhaT de Clostridium sp. IBUN 13A. Los mejores resultados en cultivo por lotes en términos de rendimiento, productividad y concentración final de 1,3-PD se obtuvieron con la cepa silvestre con el plásmido recombinante (0.56 mol/mol; 0.8 mM/h; 57.79 mM) y con la cepa mutante de ldhA con el plásmido recombinante (0.58 mol/mol; 0.78 mM/h; 56.21 mM) [56]. Entre los estudios dirigidos a sobreexpresar genes involucrados en la producción de 1,3-PD, se encuentra el de González-Pajuelo y colaboradores, en el cual se realizó la clonación y sobreexpresión de los genes dhaB1, dhaB2 y dhaT (provenientes de C. butyricum VPI 3266) en C. acetobutylicum, un microorganismo modelo dentro de este género bacteriano que naturalmente no produce 1,3-propanodiol [70]. La cepa recombinante obtenida presentó una capacidad superior de producción de 1,3-PD a partir de glicerol en comparación a cepas no

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modificadas de otras especies de Clostridium, observándose un rendimiento de 0.65 mol/mol, una productividad de 1.70 gL-1h-1 y una concentración final de 1,3-PD de 84 g/L en cultivo por lote alimentado [55]. En 2009, Tang y colaboradores construyeron un vector de expresión con los genes dhaB1 y dhaB2 de C. butyricum, más el gen yghD de Escherichia coli, el cual produce una deshidrogenasa capaz de utilizar moléculas de NADPH (además de NADH) como cofactores para la reducción del 3-hidroxipropionaldehído a 1,3-PD [57]. Posterior a la clonación y sobreexpresión de los genes de dicho constructo en E. coli, se obtuvo un rendimiento de 0.46 mol/mol, una productividad de 2.61 gL-1h-1 y un título final de 104.4 g/L a partir de un cultivo con glicerol como sustrato [57]. La separación y purificación del 1,3-propanodiol del cultivo es un obstáculo importante en la comercialización de este producto ya que los costos operativos de estos procesos pueden representar hasta un 70% del costo total de producción [71]. La dificultad en la recuperación del 1,3-PD se atribuye principalmente a su alto punto de ebullición (214 °C) y a su naturaleza hidrofílica, la cual se atribuye a la presencia de los dos grupos hidroxilo en su estructura [10, 11]. Entre las metodologías empleadas, se encuentran la cromatografía, la extracción líquido-líquido, procesos de evaporación-destilación, filtración por membranas y extracción reactiva; no obstante, todos estos métodos presentan limitaciones en términos de consumo de energía y rendimientos obtenidos [10, 71]. Durante la producción de 1,3-PD, la inhibición por sustrato - específicamente por el glicerol - se da por el estrés osmótico del compuesto sobre el microorganismo y por la toxicidad de las impurezas que contiene el glicerol proveniente de la industria del biodiesel [10, 29], entre las cuales se encuentran principalmente el metanol, ácidos grasos saturados e insaturados, y sales de sodio y potasio [72]. Por otra parte, la acumulación de los productos de la fermentación del glicerol, específicamente de ácidos orgánicos y del solvente en el cultivo, limitan el crecimiento del microorganismo, lo cual influye directamente en la concentración final del producto obtenida del bioproceso [12, 73].

1.3 Toxicidad de solventes orgánicos y mecanismos de tolerancia La toxicidad de los solventes orgánicos sobre células está relacionada con la hidrofobicidad inherente de cada uno de estos compuestos, la cual les permite unirse a la membrana citoplasmática y alterar su organización, aumentando su permeabilidad y consecuentemente disminuyendo su capacidad de funcionar como barrera frente al ingreso y salida de metabolitos [74]. Otros efectos que presentan son la eliminación del potencial electroquímico de la membrana, la denaturación de proteínas y degradación de moléculas de ADN y ARN [21]. La toxicidad de estos compuestos se puede medir con base en su respectivo coeficiente de partición o LogP, que se define como la partición del solvente en una mezcla equimolar de 1-octanol y agua [21]. Se considera que cuanto menor sea el valor de LogP, mayor será la cantidad de solvente que se une a la membrana y por lo tanto mayor será la toxicidad del compuesto [75]; no obstante, la tolerancia a solventes varía dependiendo de la cepa que se esté trabajando [21, 74, 76]. La tolerancia a solventes orgánicos en bacterias está dada por varios mecanismos, entre los cuales se encuentran las bombas de eflujo, expresión de proteínas de choque térmico, modificaciones en la composición de la membrana, degradación enzimática del compuesto y esporulación [74, 76]. Las bombas de eflujo son complejos proteicos dependientes de energía encargados del transporte de sustancias hacia el exterior de la célula, como antibióticos, sales biliares, sustratos y solventes [77-79]. La contribución de las bombas de eflujo con respecto al aumento de la tolerancia ha sido demostrada para solventes como

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tolueno [80, 81], ciclohexano [82], p-xileno [78] etilbenceno [81] y propilbenceno [80, 81]. Sin embargo, algunos estudios muestran la inefectividad de estos transportadores en mejorar la tolerancia a alcoholes de cadena corta, entre los cuales se encuentra el estudio realizado por Ankarloo y colaboradores, en el cual demostraron que el sistema de eflujo AcrAB/TolC no protegía a Escherichia coli contra los efectos del etanol y el 1-propanol [83]. Por otra parte, Dunlop y colaboradores reportaron que ninguno de los 43 sistemas de eflujo evaluados por expresión heteróloga en E. coli mejoraron la tolerancia del microorganismo frente al n-butanol y el isopentanol [79]. La modificación de los lípidos que se encuentran en la membrana citoplasmática es una de las respuestas celulares a la presencia de solventes en el medio, la cual busca contrarrestar los efectos de estas moléculas mediante un cambio en la fluidez y permeabilidad de dicha membrana. En el caso de microorganismos Gram-negativos como Vibrio sp. y Pseudomonas putida, se ha encontrado que la presencia de solventes con diversos valores de LogP propician un aumento en la proporción de ácidos grasos trans presentes en los fosfolípidos, lo que produce un incremento en la densidad de la membrana y una consecuente disminución de su fluidez [84]. Por otra parte, Weber y de Bont determinaron que, en presencia de alcoholes de cadena larga, el grado de insaturación de los ácidos grasos de membrana disminuye en Escherichia coli, lo cual tiene un efecto similar al mencionado anteriormente [85]. Este fenómeno también ha sido reportado en bacterias Gram-positivas como Clostridium acetobutylicum (en presencia de butanol) [86] y Bacillus sp. (en presencia de tolueno) [87]. Es importante tener en cuenta que en procesos en los que se busque la producción biotecnológica de cualquier solvente, las modificaciones que involucren una disminución en la permeabilidad de la membrana constituyen una potencial barrera para la viabilidad del microorganismo debido a la acumulación del solvente al interior de la célula [74].

1.3.1 Proteínas de choque térmico y su efecto en la tolerancia a solventes Las proteínas de choque térmico (HSPs, por sus siglas en inglés Heat-Shock Proteins) son chaperonas moleculares cuya importancia radica en el replegamiento de proteínas denaturadas, la prevención de la formación de agregados proteicos y la translocación de proteínas a través de la membrana citoplasmática [88, 89]. Entre las chaperonas más estudiadas en bacterias, se encuentra la proteína GroEL o HSP60. Esta proteína de 58 kDa forma dos anillos de siete unidades, los cuales se unen para dar lugar a un complejo oligomérico en forma de cilindro, al cual ingresa la proteína denaturada. Posterior a esto, ocurre la asociación de un oligomero de siete subunidades conformado por la co-chaperonina GroES, la cual bloquea uno de los extremos del complejo GroEL. Finalmente, se realiza el plegamiento o replegamiento del sustrato, el cual es liberado al medio por efecto de un cambio conformacional provocado por una reacción dependiente de ATP [89, 90]. Estas proteínas, codificadas por los genes encontrados en el operón groESL, han sido estudiadas en microorganismos como Escherichia coli [91], Campylobacter jejuni [92], Bacillus subtilis [93], Clostridium acetobutylicum [94], entre otros. La expresión de HSPs bajo condiciones de estrés asociado a la presencia de solventes ha sido caracterizada tanto en microorganismos Gram-negativos como Gram-positivos. Zingaro y Papoutsakis reportaron que la sobreexpresión de las chaperonas del sistema GroESL aumentaban tanto el crecimiento como la viabilidad celular de Escherichia coli luego de someter al microorganismo a etanol, n-butanol, 2-butanol y 1,2,4-butanotriol [46]. Estudios transcriptómicos y proteómicos realizados con Pseudomonas putida revelaron que, bajo condiciones de estrés por presencia de tolueno, hay un aumento en la expresión de

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chaperonas de distintas familias, entre las cuales se encuentran GroES, Tuf-1, DnaK, DnaJ y GrpE [59, 95]. Por otra parte, Tomas y colaboradores encontraron que la sobreexpresión autóloga del operón groESL no sólo mejoraba la tolerancia de Clostridium acetobutylicum al n-butanol hasta en un 85%; también permitía la obtención de mayores concentraciones finales del solvente [44]. Estos resultados son similares a los reportados por Desmond y colaboradores para cepas de Lactoccocus lactis y Lactococcus paracasei [96]. En un estudio posterior, el grupo de Tomas encontró que existía un aumento proporcional de la expresión de los genes groES, dnaK, dnaJ, hsp18 y hsp90 con respecto a la cantidad de butanol a la que era sometido Clostridium acetobutylicum [97].

1.4 Avances del grupo de Bioprocesos y Bioprospección en el estudio de cepas nativas de Clostridium productoras de 1,3-propanodiol

La línea de microorganismos solventogénicos del grupo de Bioprocesos y Bioprospección ha dedicado los últimos 25 años al estudio y mejoramiento de la producción biotecnológica de solventes. En los últimos años, el grupo se ha centrado en la obtención de 1,3-propanodiol a partir de fermentaciones realizadas con 13 cepas pertenecientes al género Clostridium, las cuales fueron aisladas de suelos colombianos [98]. Un estudio posterior reveló el potencial enzimático de estos aislamientos, y además, permitió evidenciar la relación taxonómica de las cepas con la especie Clostridium butyricum [99]. A partir del análisis de los rendimientos y productividades obtenidos de fermentaciones con glicerol y de la comparación de los perfiles metabólicos de los aislamientos contra cepas de referencia, se determinó que el aislamiento más promisorio era Clostridium sp. IBUN 158B [100], el cual fue escogido para estudios de optimización del proceso fermentativo [101] y para estudios moleculares dirigidos a la caracterización del operón dha [102]. En 2012, Comba y colaboradores realizaron un análisis del proteoma de la cepa IBUN 158B en dos puntos de la curva de crecimiento, específicamente en el punto final de la fase de adaptación y en el punto final de la fase de crecimiento exponencial [103]. Los autores encontraron diferentes enzimas involucradas en el metabolismo, entre ellas las enzimas responsables de la producción de 1,3-PD; sin embargo, también hallaron proteínas de choque térmico o chaperonas [103], lo cual sugiere que estas proteínas son producidas por el microorganismo durante la producción de 1,3-propanodiol, el cual es un metabolito asociado al crecimiento [14, 18, 56, 101].

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2. Objetivos

2.1 Objetivo General Evaluar el efecto de la sobreexpresión de los genes groES y groEL sobre la tolerancia de Clostridium sp. IBUN 158B a 1,3-propanodiol.

2.2 Objetivos Específicos Obtener cepas recombinantes de Clostridium sp. IBUN 158B con los genes groES y groEL. Determinar el efecto inhibitorio del 1,3-propanodiol sobre las cepas recombinantes de Clostridium IBUN 158B. Evaluar los patrones de expresión de los genes seleccionados en las cepas recombinantes de Clostridium sp. IBUN 158B durante el crecimiento en presencia y ausencia de 1,3-propanodiol.

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3. Metodología

3.1 Microorganismos y condiciones de cultivo Los microorganismos y plásmidos empleados en este trabajo se presentan en la Tabla 1. La cepa silvestre Clostridium sp. IBUN 158B fue mantenida en forma esporulada en viales stock con 100 mL de medio Reinforced Clostridial Medium (RCM) (Anexo A - Tabla A1), las cepas recombinantes fueron mantenidas a -70 °C en medio Tryptone-Glucose-Yeast extract (TGY) estéril (Anexo A - Tabla A2) suplementado con glicerol al 20%; y las cepas de E. coli fueron mantenidas en viales con medio Luria-Bertani (LB) (Anexo A - Tabla A4) suplementado con glicerol al 20%, a una temperatura de -70 °C. Para la preparación de los inóculos de la cepa silvestre de Clostridium sp., las esporas del microorganismo fueron activadas por choque térmico, para lo cual se sometieron dichas esporas a una temperatura de 70°C por 10 minutos y posteriormente a un baño de agua – hielo durante 10 minutos. Este procedimiento se realizó luego de transferir, en condiciones de anaerobiosis, un volumen del cultivo stock correspondiente al 10% del volumen final del inóculo a medio. Por otra parte, para la preparación de inóculos de las cepas recombinantes de Clostridium sp., se activaron los cultivos conservados en glicerol mediante siembra en agar RCM, luego de lo cual se transfirió una colonia del microorganismo a 10 mL de medio TGY, que fue incubado a 37°C y 200 rpm. Finalmente, para los ensayos de inhibición se empleó el medio Clostridial Growth Medium (CGM) (Tabla Anexo A - A3). Tabla 1. Microorganismos y plásmidos utilizados en este trabajo.

Cepa/Plásmido Características relevantes Referencia/Origen

Clostridium sp.

IBUN158B Cepa nativa aislada de suelo de plantación de tomate [98]

IBUN 158B-pMTL IBUN 158B con el plásmido pMTL007C-E2 Este trabajo

IBUN 158B-pMTL(groESL) IBUN 158B con el constructo pMTL(groESL) Este trabajo

E. coli

DH5α Cepa de clonación Invitrogen, EUA

CA434 Cepa HB101 con el plásmido conjugativo R702 [104]

Plásmidos pMTL

pMTL007C-E2 Vector lanzadera para mutagénesis dirigida [68]

pMTL(groESL) Vector pMTL con el operón groESL Este trabajo

3.2 Diseño de cebadores Se diseñaron 2 clases de cebadores o iniciadores para los experimentos realizados: (i) los cebadores diseñados para la amplificación del operón groESL, y (ii) los iniciadores dirigidos al análisis de expresión por PCR cuantitativa con retrotranscripción (RT-qPCR por sus siglas en inglés Reverse Transcription – Quantitative PCR) (Tabla 2). El primer set de iniciadores se diseñó con base en la secuencia correspondiente al operón groESL de Clostridium sp. IBUN 13A; la cual es una cepa filogenéticamente cercana a la cepa IBUN 158B [105] y cuyo

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genoma fue secuenciado previamente por el grupo de investigación [106]. Una vez obtenidas las secuencias de los cebadores tentativos con el programa Primer3web v4.0.0 [107], se añadieron 14 nucleótidos en sus extremos 5’, dentro de los cuales se encuentran los sitios de corte para las enzimas de restricción MluI (iniciador forward) y AatII (iniciador reverse). Previamente al diseño del segundo set de cebadores, se seleccionaron los genes housekeeping rpoA (Subunidad A de la ARN polimerasa) y tpi (Triosa-fosfato isomerasa) con base en su utilidad como genes de referencia para experimentos de RT-qPCR en otros estudios con especies de Clostridium [108, 109]. Las secuencias de los genes de interés fueron nuevamente obtenidas a partir de los datos genómicos de la cepa IBUN 13A, y sus respectivos cebadores fueron diseñados con el programa Primer3web v4.0.0, empleando los parámetros por defecto a excepción del tamaño máximo del amplímero esperado, cuyo valor fue de 200 pb para todos los genes. Todas las parejas de cebadores diseñadas fueron analizadas con la herramienta en línea Multiple Primer Analyzer de Thermo Scientific [110] con los parámetros por defecto; esto con el objetivo de determinar tanto las propiedades relevantes para los experimentos posteriores (Tm, %GC), como su capacidad para formar homo- y heterodímeros.

Tabla 2. Cebadores utilizados en este trabajo.

Cebador Secuencia (5’-3’) Sitios de Restricción

GroF1 TTTAACGCGTATTCGATGAGTATTGGCGATTTATTCAG MluI

GroR1 AATAGACGTCGCACAATGCATATAAAACCTCCCTTTTT AatII

rpoAF1 TGAGCCACTTGAAAGAGGATATG

rpoAR1 TAACAGAAGTTGGTGCCACTC

tpiF1 TGGGCTATTGGAACTGGTAAG

tpiR1 CAACTTCGCTTCCGAACATTT

qGroESF1 GGCAGAAGAAAAGACTAAGAGTGGA

qGroESR1 CATCTACAACTGCGCCTGGA

Los nucleótidos subrayados representan el sitio de corte de las respectivas enzimas de restricción.

3.3 Extracción de ADN

La extracción de ADN total se realizó a partir de muestras correspondientes a la fase de crecimiento exponencial de un cultivo de Clostridium sp. IBUN 158B, siguiendo el protocolo estandarizado en el laboratorio de Microbiología de la línea de microorganismos solventogénicos del IBUN (Anexo 1B). La extracción de plásmidos de las cepas recombinantes de E. coli y Clostridium sp. se realizó empleando una versión modificada del protocolo de lisis alcalina descrito por Sambrook y colaboradores [111] (Anexo 2B).

3.4 Clonación del operón groESL en Clostridium sp. IBUN 158B

Los genes groES y groEL de Clostridium sp. IBUN 158B fueron amplificados por PCR empleando la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion High Fidelity (Thermo Scientific, EUA). Las condiciones de amplificación empleadas fueron: 1 ciclo de denaturación inicial de 98 °C durante 5 minutos; 30 ciclos con una etapa de denaturación a 98 °C por 30 segundos,

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una etapa de anillamiento/extensión a 72 °C por 40 segundos; y un ciclo de extensión final a 72 °C durante 10 minutos. El esquema de amplificación empleado (Volumen final = 50 µL) se presenta en la Tabla 3.

Tabla 3. Reacción de amplificación del operón groESL

Componente

Ci Cf

Volumen

dNTPs

2,5 mM 0,25 mM 5 μL

GroF1 10 µM 0,5 µM 2,5 μL

GroR1 10 µM 0,5 µM 2,5 μL

Phusion Buffer HF 5X 1X 10 μL

ADN polimerasa 2 U/µL 0,02 U/µL 0,5 μL

ADN 100 ng/ µL 5 ng/ µL 5 μL

H2O Milli-Q - - 24,5 μL

Ci: Concentración inicial; Cf: Concentración final.

El amplímero obtenido fue separado por electroforesis (10 V/cm, 90 minutos) en gel de agarosa al 0,8% p/v y purificado con el kit de purificación de bandas de gel GeneJet® (Thermo Scientific, EUA), según las instrucciones del fabricante. El ADN obtenido fue digerido simultáneamente con las enzimas de restricción MluI y AatII (Thermo Scientific, EUA), empleando el esquema descrito en la Tabla 4 (Volumen final = 20 µL).

Tabla 4. Reacción de digestión del operón groESL.

Componente

Ci Cf

Volumen

Amplímero

50 ng/µL 25 ng/µL 10 μL

MluI 10 U/µL 2 U/µL 4 μL

AatII 10 U/µL 0,5 U/µL 1 μL

Buffer Tango 10X 1X 2 μL

H2O Milli-Q - - 3 μL

Ci: Concentración inicial; Cf: Concentración final.

La reacción de digestión fue incubada a 37°C durante 16 horas para garantizar la digestión completa del amplímero. Una vez terminado el tiempo de incubación, el ADN fue purificado con el kit de purificación de bandas de gel GeneJet® (Thermo Scientific, EUA). Asimismo, se realizó la digestión del vector pMTL007C-E2 (Figura 4) con las mismas enzimas de restricción, y bajo las mismas condiciones anteriormente descritas. Los fragmentos obtenidos fueron separados por electroforesis (10 V/cm, 90 minutos) en gel de agarosa al 0,8 % p/v, y el fragmento de mayor tamaño (5,4 kb) fue purificado empleando el mismo kit mencionado anteriormente.

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Figura 4. Estructura del vector pMTL007C-E2 [68].

Posteriormente, se realizó la ligación del fragmento purificado del vector pMTL007C-E2 y el amplímero, para lo cual se utilizaron 3 U de ADN ligasa T4 (Thermo Scientific, EUA) por cada 100 ng de producto (vector e inserto) y se empleó una relación molar de inserto:vector de 7:1. Esta reacción fue incubada a 22°C durante 1 hora en un baño termostatado.

El constructo obtenido, denominado pMTL(groESL), fue transferido a células quimiocompetentes de E. coli DH5α (Anexo C) mediante choque térmico. Para esto, se transfirieron 10 µL de la reacción de ligación a un tubo de 1,5 mL con 100 µL de células quimiocompetentes de E. coli DH5α; esta suspensión se mantuvo en hielo durante 30 minutos. Terminado este período, el tubo fue incubado durante 60 segundos en un baño termostatado a 42°C, para posteriormente ser incubado en hielo durante 10 minutos. Luego de esto, se adicionaron 900 µL de medio SOC fresco (Anexo A - Tabla A5) al tubo, el cual fue incubado a 37°C durante 2 horas, esto para permitirle a las células con el plásmido expresar la cloranfenicol acetiltransferasa codificada por catP. Posteriormente, se realizó una centrifugación a 10000 rpm durante 1 minuto, y el pellet obtenido fue resuspendido en 100 µL de sobrenadante; esta suspensión fue sembrada en agar LB suplementado con cloranfenicol (20 µg/mL), el cual fue incubado durante 48 horas a 30°C. La verificación de la transferencia del constructo deseado fue realizada por electroforesis en gel de agarosa al 1% luego de realizar la extracción de plásmidos de las células transformadas por el método de lisis alcalina. Este mismo procedimiento se utilizó para transferir el constructo a células quimiocompetentes de E. coli CA434. Para la transferencia del vector recombinante y del plásmido control (pMTL007C-E2) a Clostridium sp. IBUN 158B, se empleó una modificación del protocolo de conjugación

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descrito por Cai y colaboradores en 2011 [112]. En primer lugar, se prepararon cultivos de 5 mL de la cepa donadora (E. coli CA434) en LB y de la cepa receptora (Clostridium sp. IBUN 158B) en medio TGY, los cuales se incubaron en un shaker orbital durante 16 horas a 37°C y 200 rpm. Una vez terminado el tiempo de incubación, se transfirió una alícuota de 1 mL del cultivo de la cepa donadora a un tubo de 1,5 mL, el cual fue centrifugado a 3000 g durante 3 minutos. Luego de descartar el sobrenadante, se llevó el tubo y el cultivo de la cepa receptora a la cámara de anaerobiosis, donde se continuó con el resto del procedimiento. Acto seguido, se resuspendió el pellet de la cepa donadora en 1 mL de buffer PBS (Anexo A - Tabla A6), se centrifugó dicha la suspensión a 3000 g durante 3 minutos. Una vez descartado el sobrenadante obtenido, las células fueron resuspendidas en 200 µL del cultivo de la cepa receptora, los cuales fueron distribuidos en spots de 20 µL sobre una caja de agar TGY. Este medio fue transferido a una jarra de anaerobiosis de 2,5 L, la cual fue posteriormente llevada a incubar durante 8 horas a 37°C para permitir la conjugación entre los microorganismos. Luego de este período, se adicionaron 500 µL de buffer PBS a la caja y se recuperaron las células con un asa de Drigalsky. La suspensión resultante fue transferida a agar TGY suplementado con colistina (10 µg/mL), para eliminar las células de la cepa donadora, y tianfenicol (15 µg/mL), para seleccionar las células de transconjugantes de Clostridium; dicho medio fue transferido a una jarra de anaerobiosis, la que fue incubada a 37°C durante 72 horas. Las colonias obtenidas fueron sembradas nuevamente en agar TGY suplementado con colistina y tianfenicol, y fueron incubadas a 37°C durante 48 horas; esto con el objetivo de permitir el crecimiento exclusivo de las células transconjugantes.

3.5 Ensayos de Inhibición Para la determinación del efecto inhibitorio del solvente sobre los microorganismos, se utilizó una versión modificada del protocolo descrito por Borden & Papoutsakis [113]. En primer lugar, se prepararon medios CGM en diferentes viales, a los cuales se les adicionó 1,3-propanodiol de manera tal que se generaran medios con concentraciones finales de 0 g/L, 20 g/L, 40 g/L, 60 g/L y 80 g/L del solvente. Estos medios fueron distribuidos en alícuotas de 9,9 mL en tubos Hungate® en condiciones de anaerobiosis, esterilizados por autoclave a 121°C durante 15 minutos, y suplementados con tianfenicol (15 µg/mL). Posteriormente, se inocularon en cada tubo 100 µL de un cultivo en fase exponencial (DO600nm 0.6); esto se realizó tanto para la cepa recombinante como para la cepa control (Clostridium sp. IBUN 158B con el vector sin inserto) por triplicado. Cada tubo fue incubado a 37°C durante 12 horas, período posterior al cual se evaluó el crecimiento celular mediante la medición de la densidad óptica del cultivo a 600 nm. A partir de los datos obtenidos, se determinó el porcentaje de tolerancia (%T) para cada concentración de 1,3-propanodiol con la siguiente fórmula:

Tn = (DO600nm)PDO(n),12h - (DO600nm)PDO(n),t0 * 100 (1) (DO600nm)PDO(0),12h - (DO600nm)PDO(0),t0 Donde T representa el porcentaje de tolerancia correspondiente a la concentración (n) de 1,3-propanodiol; (DO600nm)PDO(n),12h representa la densidad óptica del cultivo suplementado con el solvente luego del periodo de incubación; (DO600nm)PDO(n),t0 representa la densidad óptica del cultivo con 1,3-propanodiol antes de la incubación; (DO600nm)PDO(0),12h representa la densidad óptica del cultivo sin solvente luego del periodo de incubación; y (DO600nm)PDO(0),t0 representa la densidad óptica del cultivo sin solvente previamente a la incubación.

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Por otra parte, la tolerancia relativa de la cepa recombinante fue calculada con base en el área bajo la curva del porcentaje de tolerancia de cada microorganismo de la siguiente manera:

TR = (AreaT)rec – (AreaT)control * 100 (2) (AreaT)control Donde TR representa el porcentaje de tolerancia relativa; (AreaT)rec representa el área bajo la curva del porcentaje de tolerancia de la cepa IBUN 158B-pMTL(groESL); (AreaT)control representa el área bajo la curva del porcentaje de tolerancia de la cepa IBUN 158B-pMTL.

3.6 Cuantificación relativa de la expresión de groESL Previamente al análisis de expresión diferencial de los genes de interés, se evaluó la validez de los genes housekeeping previamente seleccionados como genes de referencia para los ensayos de cuantificación relativa de este estudio, y se realizó un análisis de la eficiencia de las reacciones con los cebadores de los genes de interés. Por otra parte, en todos los experimentos realizados se evaluó la especificidad de la reacción por medio de curvas de disociación. Para el procedimiento de validación, se analizó la expresión de los genes de referencia en la cepa IBUN 158B-pMTL y en la cepa IBUN 158B-pMTL(groESL) en presencia del solvente. Para esto, se prepararon cultivos de cada microorganismo en medio CGM suplementado con tianfenicol (15 µg/mL) y 1,3-propanodiol (40 g/L), los cuales fueron incubados durante 12 horas a 37°C. Posteriormente, se realizó la extracción de ARN total de cada cultivo empleando el protocolo estandarizado en el laboratorio de microbiología del grupo de microorganismos solventogénicos del IBUN (Anexo 2). El ARN obtenido fue utilizado para obtener ADN complementario (ADNc) mediante el kit First-Strand cDNA Synthesis (Fermentas, EUA), el cual a su vez fue cuantificado por PCR cuantitativa (qPCR) en el equipo LightCycler® 480 mediante la metodología de detección SYBR Green I (Roche, EUA). El programa empleado para la amplificación y la obtención de las curvas de disociación fue: 1 ciclo de preincubación a 95 °C durante 10 minutos; 45 ciclos de amplificación con una etapa de denaturación a 95°C por 15 segundos, una etapa de anillamiento a 60°C durante 20 segundos, y una etapa de extensión a 72°C por 10 segundos; 1 ciclo de disociación con una etapa de denaturación a 95°C por 5 segundos, una etapa de enfriamiento a 65 °C durante 1 minuto; y una etapa de denaturación continua a 97°C con medición de fluorescencia cada 5°C. El esquema empleado para las reacciones se presenta en la Tabla 5 (Volumen final = 10 µL). Cada una de las reacciones de qPCR fue realizada por triplicado. Los resultados correspondientes a 3 réplicas biológicas fueron analizados con la herramienta BestKeeper v1.0 [114]. Por otra parte, para el análisis de eficiencia, se realizó una curva estándar para cada gen housekeeping. Para esto, se prepararon diluciones con diferentes concentraciones de ADN genómico de la cepa nativa Clostridium sp. IBUN 158B, las cuales fueron utilizadas en reacciones de qPCR con los cebadores de los genes rpoA, tpi y groES (qGroESF1-R1), empleando el programa de amplificación descrito anteriormente y siguiendo el esquema descrito en la Tabla 5.

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Tabla 5. Reacción de amplificación para qPCR.

Componente

Ci Cf

Volumen

SYBR Green I Master

2x 1x 5 μL

Primer forward 10 μM 0,2 μM 0,2 μL

Primer reverse 10 μM 0,2 μM 0,2 μL

Muestra - - 1 μL

H2O Milli-Q - - 3,6 μL

Ci: Concentración inicial; Cf: Concentración final.

Los resultados obtenidos fueron graficados para evaluar la linealidad de los datos y obtener la pendiente de la curva correspondiente. Este dato fue utilizado para calcular la eficiencia de cada reacción con la siguiente formula:

E = (10(-1/m) – 1) * 100 (3) Donde E representa la eficiencia de la reacción y m representa la pendiente de la curva estándar. Para el análisis de expresión diferencial, se evaluaron los patrones de expresión correspondientes a dos condiciones para ambas cepas: ausencia y presencia de 1,3-propanodiol en el medio de cultivo. Para esto, se prepararon cuatro cultivos de 40 mL en medio CGM correspondientes a las cepas recombinante y control, en ausencia (0 g/L) y en presencia (40 g/L) del solvente. Luego de un período de incubación de 12 horas a 37°C, se realizó la extracción de ARN total empleando el protocolo mencionado anteriormente. Posteriormente, se utilizó el kit First-Strand cDNA Synthesis (Fermentas, EUA) para obtener el ADNc de las muestras de ARN total de cada cepa, según las instrucciones del fabricante. Los transcritos de los genes de interés fueron cuantificados por PCR cuantitativa (qPCR) en el equipo LightCycler® 480 mediante la metodología de detección SYBR Green I (Roche, EUA). El programa empleado para la amplificación y la obtención de las curvas de disociación fue: 1 ciclo de preincubación a 95°C durante 5 minutos; 40 ciclos de amplificación con una etapa de denaturación a 95°C por 10 segundos, una etapa de anillamiento a 60°C durante 15 segundos, y una etapa de extensión a 72°C por 10 segundos; 1 ciclo de disociación con una etapa de denaturación a 95°C por 5 segundos, una etapa de enfriamiento a 65°C durante 1 minuto; y una etapa de denaturación continua a 97°C con medición de fluorescencia cada 5°C. El esquema empleado para las reacciones se presenta en la Tabla 5 (Volumen final = 10 µL). Los resultados obtenidos al final de cada experimento (3 réplicas biológicas) fueron analizados con el programa LightCycler® 480 v1.5.1.62, empleando el método de segunda derivada [115] para el análisis de los datos de cuantificación absoluta, y el método de comparación de Crossing Threshold o Ct (ΔΔCt) para la cuantificación relativa [116]; cuya fórmula asociada es:

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NE = 2-((CtgroES,Rec – CtRef,Rec) – (CtgroES,Control – CtRef,Control)) (4)

Donde NE representa el cambio en los niveles de expresión; CtgroES,Rec representa el Ct del

gen blanco en la cepa de sobreexpresión IBUN 158B-pMTL(groESL); CtRef,Rec representa la

media geométrica de los valores de Ct de los genes de referencia en la cepa IBUN 158B-pMTL(groESL); CtgroES,Control

representa el Ct del gen blanco en la cepa control IBUN 158B-pMTL; y CtRef,Control

representa la media geométrica de los valores de Ct de los genes de referencia en la cepa control IBUN 158B-pMTL.

3.7 Secuenciación y Análisis bioinformático del operón groESL El inserto correspondiente al operón groESL fue secuenciado por el laboratorio de Secuenciación y Análisis Molecular del Instituto de Genética de la Universidad Nacional de Colombia. Posteriormente, se comparó la región 5’ de la secuencia del inserto con las regiones 5’ de los operones groESL de otras bacterias gram-positivas; esto con el objetivo de determinar la presencia de secuencias reguladoras en el inserto. Para esto, se recuperaron las secuencias de los operones de 6 especies de Clostridium y de Bacillus subtillis de la base de datos Genbank del NCBI, las cuales fueron sometidas a un alineamiento múltiple junto con la secuencia del inserto, para lo cual se empleó el programa en línea T-Coffee [117].

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4. Resultados y Discusión

4.1 Construcción y transferencia de pMTL(groESL) a Clostridium sp. IBUN 158B

A partir del ADN genómico aislado de Clostridium sp. IBUN 158B, se realizó la amplificación del operón groESL con los iniciadores GroF1 y GroR1. El amplímero obtenido tenía una longitud de aproximadamente 2,3 kb (Figura 5B). Luego de una digestión con las enzimas de restricción MluI y AatII, el operón fue ligado al fragmento de 5,4 kb producto de la digestión del vector pMTL007C-E2. Dicho fragmento contenía los elementos necesarios para crear un vector de expresión, como son los orígenes de replicacion tanto para las cepas de clonación y conjugación (ColE1) como para la cepa nativa de Clostridium (pCB102); un marcador de selección (catP) que permite precisamente la selección de colonias con el plásmido de interés; un origen de transferencia junto con el gen traJ, para el proceso de conjugación; y un terminador que facilita la finalización del proceso de transcripción de los genes de interés (Figura 5A). El constructo obtenido y el plásmido no modificado fueron transferidos a E. coli DH5α, y posteriormente a E. coli CA434, por medio de choque térmico. Es importante resaltar que fue necesario incubar tanto la cepa de clonación como la cepa de conjugación a una temperatura de 30°C luego del proceso de transformación antes de obtener colonias. Una posible explicación para este fenómeno es la expresión heteróloga de las proteínas codificadas por el fragmento de interés, lo cual, debido a las diferencias en el uso de codones entre los microorganismos de los géneros Escherichia y Clostridium [118], constituyó una carga metabólica muy alta para los hospederos, lo que resultó en una limitación del crecimiento a la temperatura óptima (37°C). Posterior a esto, los plásmidos pMTL007C-E2 y pMTL(groESL) fueron transferidos a Clostridium IBUN 158B mediante conjugación. El ADN plasmídico de las cepas recombinantes de Clostridium fue extraído y digerido con las enzimas MluI y AatII para confirmar la identidad de cada vector (Figura 5B). La obtención de las cepas recombinantes demuestra la efectividad de la estrategia de conjugación utilizada en este trabajo. Existen varias estrategias para transferir vectores de interés a células bacterianas, siendo una de las más utilizadas para bacterias del género Clostridium es la transformación. Para esta metodología, se generan esferoplastos de las células competentes en condiciones de anaerobiosis, las cuales son sometidas a un choque eléctrico en presencia del vector a transferir; este choque eléctrico permite la formación de poros en las células receptoras y la consecuente entrada del material genético [119]. Las primeras cepas recombinantes del género Clostridium obtenidas por el método de transformación fueron reportadas a principios de la década de 1990 [120, 121], no obstante, los autores mencionan bajas eficiencias en el proceso de transformación e inestabilidad del vector empleado. Esto lo atribuyen a la actividad de la endonucleasa Cac824I producida por el hospedero y a los numerosos sitios de corte de dicha enzima en los plásmidos utilizados [120]. Por esta razón, en un estudio posterior se describió una metodología de metilación in vivo en E. coli, la cual permitía proteger los constructos diseñados por medio de la actividad de la metiltransferasa del fago φ3TI, codificada por los plásmidos pAN1 y pAN2 [122].

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Figura 5. Análisis del constructo pMTL(groESL). A. Estructura de pMTL(groESL); B. Análisis electroforético

del amplicon y los vectores utilizados. M1: Marcador de peso molecular Hyperladder I (Bioline); Carril 1: Plásmido pMTL007C-E2 digerido con MluI y AatII; Carril 2: Constructo pMTL(groESL) digerido con MluI y AatII; Carril 3: Producto de amplificación correspondiente al operón groESL.

Pese a la reportada efectividad de esta metodología, diferentes experimentos realizados por los integrantes del grupo de investigación de la línea de microorganismos solventogénicos demostraron la dificultad de su implementación exitosa para las cepas de Clostridium nativas, por esta razón, se eligió otra de las estrategias utilizadas para este género bacteriano, la conjugación. La conjugación es un método de transferencia horizontal de genes en el cual una célula donadora entra en contacto con una célula receptora por medio de estructuras especializadas conocidas como pili, luego de lo cual se da la transferencia unidireccional del material genético a dicha célula receptora [119]. Esta estrategia de transferencia de material genético ha sido empleada exitosamente para otras especies de Clostridium, como C. beijerinckii [68], C. cellulolyticum [123], C. difficile [68, 104], C. acetobutylicum [124], C. butyricum [112], entre otros. En este trabajo, la transferencia por conjugación del constructo elaborado y del plásmido control fue posible por la presencia del origen de transferencia oriT en los vectores, y a la producción del activador transcripcional TraJ (codificada por traJ en pMTL007C-E2), el cual permite la expresión del operón tra presente en el plásmido de conjugación R702 de la cepa donadora E. coli CA434 [104]. El mecanismo de conjugación permite evitar la degradación del constructo por la acción de la endonucleasas del hospedero, lo cual se debe probablemente a la metilación del vector por parte de Clostridium a medida que éste es transferido desde la célula donadora [123].

A B

21

4.2 Análisis de la tolerancia al 1,3-propanodiol de la cepa Clostridium sp. IBUN 158B pMTL(groESL)

Para determinar el efecto de la expresión de los genes groES y groEL sobre la tolerancia al estrés generado por el 1,3-propanodiol, se evaluó el crecimiento de la cepa control (IBUN 158B-pMTL) y la cepa de sobreexpresión (IBUN 158B-pMTL(groESL)) en presencia de diferentes concentraciones del solvente (Anexo D – Tabla D1). Los resultados de estos ensayos se presentan en la figura 6.

PDO (g/L)

0 20 40 60 80

Ab

s 6

00 n

m

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

3,5

PDO (g/L)

0 20 40 60 80 100

% T

ole

ran

cia

0

20

40

60

80

100

Figura 6. Ensayos de Inhibición.

A. Densidad óptica de los microorganismos luego de crecimiento en diferentes concentraciones del solvente. Cepa Control - Barras blancas; Cepa de Sobreexpresion – Barras negras. Las barras de error representan la desviación estándar entre réplicas. B. Porcentaje de tolerancia de los microorganismos luego de crecimiento en diferentes concentraciones del solvente Cepa Control – Círculos; Cepa de Sobreexpresion – Triángulos.

A

B

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Como se puede apreciar en las gráficas, el 1,3-propanodiol tiene un efecto inhibitorio proporcional a su concentración en el medio; no obstante, el efecto sobre el crecimiento de la cepa de sobreexpresión es menor en comparación con la cepa control. Dicho fenómeno se evidencia cuando se realiza el cálculo de la tolerancia relativa al solvente, parámetro cuyo valor es de 29,83%. Este resultado sugiere que efectivamente la presencia del constructo tiene un efecto positivo sobre la tolerancia del microorganismo al solvente, lo cual probablemente se deba a la actividad de las chaperonas sobreexpresadas, las cuales facilitan la renaturación de enzimas y proteínas estructurales denaturadas por la acción del 1,3-propanodiol, lo que le permite al microorganismo mantener su metabolismo y equilibrio osmótico frente al estrés generado por el solvente [44]. Los resultados obtenidos son comparables a los reportados en otros estudios donde se sobreexpresan proteínas de choque térmico. En 2003, Tomas y colaboradores construyeron el plásmido pGROE1 mediante la ligación del operón groESL al vector de expresión pSOS95; dicho constructo fue a la cepa Clostridium acetobutylicum ATCC 824 [44]. Los ensayos de tolerancia les permitieron establecer que el microorganismo modificado era inhibido por butanol hasta en un 85% menos en comparación con la cepa control. Además de esto, los autores reportan un aumento de hasta el 40% en la concentración de solventes finales con la cepa 824(pGROE1) en una fermentación por lote con pH controlado [44]. Un estudio posterior con la misma especie de Clostridium reveló que la sobreexpresión de las proteínas de choque térmico HtpG, GrpE, GroES y GroEL aumentaba la tolerancia de la bacteria frente a butanol (2% v/v), obteniéndose aumentos entre 25-56% en el número de colonias obtenidas en comparación con la cepa control [45]. Por otra parte, Desmond y colaboradores encontraron que la sobreexpresión de los genes groES y groEL en cepas de Lactococcus lactis y Lactoccocus paracasei les permitía a dichos microorganismos crecer en presencia de concentraciones de hasta 0,5% v/v de butanol, lo que demuestra el potencial de esta aproximación en el desarrollo de cepas de Lactococcus en procesos industriales, siendo la opción más llamativa la producción de bioetanol [96]. La expresión de proteínas de choque térmico no ha sido la única estrategia utilizada para obtener cepas más tolerantes a solventes. Un ejemplo de esto fue el estudio de Borden y Papoutsakis en 2007, quienes reportaron que la expresión homóloga de los genes CAC0003 (proteína desconocida) y CAC1869 (regulador transcripcional), obtenidos a partir del tamizaje de una librería de Clostridium acetobutylicum, aumentaban la tolerancia de la cepa en un 13% y un 81% frente a estrés por butanol, respectivamente [113]. Otra aproximación exitosa fue la sobreexpresión de los genes del regulón bet – involucrados en la síntesis de glicina-betaína – en Escherichia coli frente al estrés generado por etanol [125]. Los autores de este estudio argumentan que, gracias al efecto osmoprotector de la glicina-betaína, el microorganismo es más tolerante al aumento en la fluidez de la membrana producido por el etanol, lo cual le permite crecer en concentraciones de 7% vol/vol del solvente [125]. Por otro lado, la sobreexpresión de chaperonas ha sido utilizada para mejorar la tolerancia a otros compuestos tóxicos para el crecimiento microbiano. Un ejemplo de esto es el estudio realizado por Lee y colaboradores en 2015, en el cual demostraron que la sobreexpresión de las proteínas del operón groESL aumentaba la tolerancia de Clostridium beijerinckii NCIMB 8052 al ácido ferúlico (un compuesto fenólico encontrado en hidrolizados de biomasa lignocelulósica) y permitía la obtención de mayores concentraciones de acetona al final del proceso fermentativo [126]. Por otra parte, Abdullah-Al y Sonomoto demostraron que la sobreexpresión autóloga y heteróloga del gen dnaK (HSP70) en Lactoccocus lactis NZ9000 aumenta la tolerancia del microorganismo al estrés celular generado por el antibiótico peptídico nisina; encontrándose que las cepas recombinantes alcanzaban

23

densidades ópticas más altas (4,44-7,81x) en comparación con la cepa control en presencia de 10 ng/mL del compuesto [127].

4.3 PCR cuantitativa: Validación de los genes de referencia y análisis de la eficiencia

Previamente al análisis de cuantificación relativa de la expresión del operón groESL por qPCR, se realizaron dos experimentos para garantizar la validez de los resultados: (i) se determinó la utilidad de los genes housekeeping rpoA y tpi como genes de referencia; y (ii) se evaluó la eficiencia de la reacción de qPCR tanto para los genes de referencia como para el gen groES. Para evaluar la utilidad de los genes rpoA y tpi como genes de referencia, se evaluaron los niveles de expresión de ambos genes tanto en la cepa de sobreexpresión como en la cepa control, por medio de RT-qPCR. Los resultados obtenidos fueron analizados con la herramienta BestKeeper, la cual presenta 2 parámetros importantes: (i) la desviación estándar de los valores de Ct de cada gen, la cual indica la estabilidad de la expresión de los transcritos, y (ii) los coeficientes de correlación de Pearson (r) entre el promedio de los valores Ct de los genes de referencia; lo que permite evaluar la correlación entre los niveles de expresión de los transcritos y su consecuente susceptibilidad de ser utilizados conjuntamente para la normalización de los datos [114]. Como se puede observar en la tabla 6, los valores de desviación estándar son menores a 1, lo cual indica que tanto rpoA como tpi se expresan de manera estable en las dos cepas estudiadas. Además de esto, se encontró una buena correlación entre ambos genes, lo que sugiere que los genes de referencia evaluados presentan niveles de expresión similares. La estabilidad de la expresión de los genes de referencia es un requisito fundamental en los análisis de expresión diferencial, ya que dicho fenómeno permitirá la normalización de los resultados de cuantificación de los transcritos. Es importante resaltar que, pese a que en la literatura se encuentran genes ampliamente utilizados para dicho propósito, se recomienda en cada estudio particular evaluar el efecto del tratamiento utilizado sobre la expresión de los genes seleccionados para corroborar su utilidad como genes de referencia [116].

Tabla 6. Estadísticas descriptivas de los genes de referencia.

rpoA tpi

Media aritmética 20,05 20,92

Desviación estándar 0,2 0,18

Coeficiente de correlación 0,843

Valor p 0,035

24

ADN (ng/µL)

10^-4 10^-3 10^-2 10^-1 1.0

Ct

0

10

20

30

ADN (ng/µL)

10^-4 10^-3 10^-2 10^-1 1.0

Ct

0

10

20

30

ADN (ng/µL)

10^-4 10^-3 10^-2 10^-1 1.0

Ct

0

10

20

30

A

B

C

Figura 7. Curvas estándar -

Eficiencia. A. Curva estándar para el gen groES. B. Curva estándar para el gen rpoA. C. Curva estándar para el gen tpi.

25

En lo referente a la eficiencia de las reacciones, el análisis de las curvas estándar de los 3 genes analizados (Figura 7) reveló que tanto los genes de referencia como el gen blanco (groES) exhiben pendientes similares, las cuales representan valores de eficiencia igualmente similares (Tabla 7). Dado que la diferencia entre la eficiencia de cada gen de referencia y la eficiencia del gen blanco no es superior al 5%, en los análisis de expresión diferencial - descritos en la sección 4.4 de este documento - se empleó el método de comparación de CT o ΔΔCT [116].

Tabla 7. Eficiencia de las reacciones de amplificación (qPCR).

Gen Pendiente Eficiencia (%)

groES -3,404 96,69

rpoA -3,504 93,14

tpi -3,309 98,48

Es importante resaltar que en todos los experimentos realizados se confirmó la presencia de un solo pico en las curvas de disociación (Anexo E), lo cual indica que en cada reacción se obtuvo un solo amplímero. Este experimento de confirmación es de gran importancia en los análisis por qPCR donde se emplea la metodología de cuantificación por SYBR Green, ya que este agente intercalante se une a todas las moléculas de doble cadena en la reacción, lo cual puede generar datos erróneos si en la reacción se amplifican productos diferentes a los esperados [128].

4.4 Análisis de la expresión diferencial del operón groESL

Para confirmar la sobreexpresión de los genes del operón groESL en la cepa modificada de Clostridium sp. IBUN 158B, se realizó un análisis a nivel transcripcional de la expresión del gen groES mediante RT-qPCR. Los resultados de estos experimentos mostraron que en ausencia de 1,3-propanodiol, la expresión de los genes del operón groESL en la cepa de sobreexpresión es 1,7 veces mayor con respecto a la cepa control; mientras que en presencia de 1,3-propanodiol (40 g/L), el aumento en la expresión de los genes es 43 veces mayor con respecto a la cepa control (Figura 8). Estos resultados muestran que efectivamente hay una sobreexpresión de los genes presentes en el plásmido; y además, que el 1,3-propanodiol tiene un efecto sobre la expresión del operón groESL. Los resultados obtenidos contrastan con lo reportado en otros estudios donde se han utilizado estrategias de sobreexpresión similares. Zingaro y colaboradores encontraron un aumento de 65x en el nivel de expresión de groESL en la cepa E. coli 10-β(pAC-groESL) con respecto a la cepa control luego de incubar el microorganismo durante 10 horas a 37 °C en medio LB suplementado con 6% v/v de etanol [46]. Por otra parte, en el estudio de Lee y colaboradores, se reporta una sobreexpresión de los genes groES y groEL 5 veces mayor en la cepa modificada de C. beijerinckii luego de una fermentación en presencia de ácido ferúlico (0,5 g/L) [126]. Igualmente, Tomas y colaboradores reportaron un aumento de hasta 15 veces en los niveles de expresión de los genes del operón groESL en la cepa de sobreexpresión C. acetobutylicum 824(pGROE1) [44].

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Figura 8. Expresión diferencial de los genes groESL de la cepa IBUN pMTL(groESL) vs la cepa IBUN pMTL en

ausencia y en presencia de 1,3-propanodiol. Las barras de error representan la desviación estándar de las 3 réplicas biológicas. Las diferencias encontradas en los niveles de expresión de los genes del operón groESL en ausencia y en presencia del solvente indican que el promotor constitutivo de la ferrodoxina (PFdx) del constructo (Figura 5) no regula la transcripción de dichos genes. Tomando como referencia las secuencias caracterizadas por Narberhaus y Bahl [94], se realizó un alineamiento múltiple con las regiones 5’ de operones groESL de otras bacterias, el cual permitió encontrar dos elementos reguladores corriente arriba de los genes groES y groEL de la cepa IBUN 158B, específicamente el promotor (Tabla 8) y el operador (Tabla 9).

Tabla 8. Comparación de la región promotora de los operones groESL

Cepa Secuencia Código

Genbank Región -35 Espaciador Región -10

IBUN158B TTGAAT TATATGGATATAAACGC TATTAT Este Trabajo

C. beijerinckii ATCC 35702 TTGAAT TATATGGATATAAAGGA TATTAT CP006777.1

C. acetobutylicum DSM 1731 TTGCTA ATATATTCAGGATTATT TATTAT M74572.1

C. ljungdahlii DSM 13528 TTGAAA ATATAAATACTATTCAT TATTAT CP001666.1

C. pasteurianum DSM 525 TTGCTT ATATAAATGCTATTAAT TATTAT CP009268.1

C. cellulovorans 743B TTGATA ATAATTAGAATATTAAG TATTAT CP002160.1

B. subtilis MB11 TTGAAA TTGGAAGGGAGATTCTT TATTAT M84965.1

Consenso TTGata TATTAT

Como se puede observar en la tabla 8, la secuencia del promotor del operón groESL de Clostridium sp. IBUN 158B es similar a secuencias reportadas para otras especies de Clostridium, e incluso a la secuencia del promotor de groESL de Bacillus subtilis.

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Tabla 9. Comparación de la secuencia CIRCE de los operones groESL

Cepa Secuencia

Referencia Región 5’ Espaciador Región 3’

IBUN158B TTAGCACTC GATGATGAT GAGTGCTAA Este Trabajo

C. beijerinckii ATCC 35702 TTAGCACTC GACAATGAT GAGTGCTAA CP006777.1

C. acetobutylicum DSM 1731 TTAGCACTC AAGATTAAC GAGTGCTAA M74572.1

C. ljungdahlii DSM 13528 TTAGCACTC ATAATTAAT GAGTGCTAA CP001666.1

C. pasteurianum DSM 525 TTAGCACTC AAGTGTAAT GAGTGCTAA CP009268.1

C. cellulovorans 743B TTAGCACTC TATCAAGAT GAGTGCTAA CP002160.1

B. subtilis MB11 TTAGCACTC TTTAGTGCT GAGTGCTAA M84965.1

Consenso TTAGCACTC GAGTGCTAA

Por otra parte, la secuencia del operador identificada en el inserto es idéntica a las secuencias encontradas en los otros microorganismos evaluados (Tabla 9). Este elemento regulador en particular se conoce como elemento CIRCE (por sus siglas en inglés Controlling Inverted Repeat of Chaperone Expression), el cual es un operador asociado a genes codificadores de chaperonas en bacterias gram-positivas [89, 129]. Estos resultados permiten sugerir que la expresión de los genes evaluados en la cepa de sobreexpresión es regulada por el promotor nativo. Lo encontrado en el presente trabajo es comparable a lo descrito en el estudio de Zingaro y colaboradores mencionado anteriormente, donde se reportan niveles de expresión altos del operón groESL cuando este es sobreexpresado empleando el promotor nativo [46].

4.5 Perspectivas: Aplicación de la cepa Clostridium sp. IBUN 158B-pMTL(groESL)

La cepa de sobreexpresión obtenida en este trabajo es más tolerante frente al estrés generado por el 1,3-propanodiol que la cepa control, lo cual la hace una candidata de interés para la producción del solvente. Sin embargo, es importante resaltar que se deben evaluar parámetros de producción como rendimiento, productividad y concentración final a nivel de fermentador para determinar la viabilidad de su uso a nivel industrial. Otro factor que debe ser evaluado es la estabilidad del constructo en el microorganismo, y la consecuente necesidad de utilizar antibiótico para mantener la presión de selección, dado que esto puede aumentar los costos del proceso y disminuir su rentabilidad. Por esta razón, es necesario evaluar en estudios futuros el número de generaciones en las que el plásmido permanece en las células sin que estas estén sometidas al antibiótico. Finalmente, se recomienda evaluar la producción de otros solventes (ej: butanol, acetona) con la cepa IBUN 158B-pMTL(groESL), ya que, como se ha establecido en otros estudios, la sobreexpresión de las chaperonas puede conllevar a un aumento en las concentraciones finales de dichos metabolitos.

28

5. Conclusiones

El plásmido de sobreexpresión pMTL(groESL) fue construido a partir de la ligación del operón groESL amplificado y el vector pMTL007C-E2 digerido. Dicho constructo fue transferido a Clostridium sp. IBUN 158B.

La sobreexpresión de los genes groES y groEL aumenta la tolerancia de Clostridium sp. IBUN 158B frente al 1,3-propanodiol un 29,83%.

La presencia de 1,3-propanodiol en el medio de cultivo induce la expresión de los genes groES y groEL en la cepa Clostridium sp. IBUN 158B-pMTL(groESL).

La expresión de los genes del operón groESL en la cepa de sobreexpresión IBUN 158B-pMTL(groESL) es 43 veces mayor con respecto a la cepa control IBUN 158B-pMTL en presencia de 1,3-propanodiol (40 g/L).

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6. Recomendaciones

Se recomienda realizar un análisis del perfil metabólico de la cepa recombinante obtenida con el fin de determinar el impacto de la sobreexpresión de los genes groES y groEL sobre la producción de 1,3-PD y otros metabolitos de interés.

Asimismo, se considera pertinente analizar en estudios posteriores la estabilidad del constructo pMTL(groESL) en Clostridium sp. IBUN 158B sometiendo al microorganismo a crecimiento sin presión de selección y evaluando la presencia del vector luego de varias generaciones.

Se recomienda evaluar el efecto de la sobreexpresión de groESL sobre la expresión de otros genes codificadores de proteínas de choque térmico en ausencia y en presencia del solvente.

Se recomienda analizar la tolerancia de la cepa de sobreexpresión frente al 1,3-propanodiol luego de someter al microorganismo a procesos de adaptación al solvente.

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Bibliografía [1] Tracy BP, Jones SW, Fast AG, Indurthi DC, Papoutsakis ET. Clostridia: the importance of their

exceptional substrate and metabolite diversity for biofuel and biorefinery applications. Current opinion in biotechnology 2012;23:364-381.

[2] Huang J, Cai J, Wang J, Zhu X, Huang L, Yang S-T, Xu Z. Efficient production of butyric acid from Jerusalem artichoke by immobilized Clostridium tyrobutyricum in a fibrous-bed bioreactor. Bioresource Technology 2011;102:3923-3926.

[3] Sim JH, Kamaruddin AH, Long WS, Najafpour G. Clostridium aceticum—A potential organism in catalyzing carbon monoxide to acetic acid: Application of response surface methodology. Enzyme and Microbial Technology 2007;40:1234-1243.

[4] Wang X, Monis PT, Saint CP, Jin B. Biochemical kinetics of fermentative hydrogen production by Clostridium butyricum W5. International Journal of Hydrogen Energy 2009;34:791-798.

[5] Wang X, Jin B. Process optimization of biological hydrogen production from molasses by a newly isolated Clostridium butyricum W5. Journal of bioscience and bioengineering 2009;107:138-144.

[6] Jang Y-S, Malaviya A, Cho C, Lee J, Lee SY. Butanol production from renewable biomass by clostridia. Bioresource Technology 2012;123:653-663.

[7] Abd-Alla MH, Elsadek El-Enany A. Production of acetone-butanol-ethanol from spoilage date palm (Phoenix dactylifera L.) fruits by mixed culture of Clostridium acetobutylicum and Bacillus subtilis. Biomass and Bioenergy 2012;42:172-178.

[8] Ponthein W, Cheirsilp B. Development of Acetone Butanol Ethanol (ABE) Production from Palm Pressed Fiber by Mixed Culture of Clostridium sp. and Bacillus sp. Energy Procedia 2011;9:459-467.

[9] Patakova P, Linhova M, Rychtera M, Paulova L, Melzoch K. Novel and neglected issues of acetone–butanol–ethanol (ABE) fermentation by clostridia: Clostridium metabolic diversity, tools for process mapping and continuous fermentation systems. Biotechnology Advances 2013;31:58-67.

[10] Kaur G, Srivastava AK, Chand S. Advances in biotechnological production of 1,3-propanediol. Biochemical Engineering Journal 2012;64:106-118.

[11] Saxena RK, Anand P, Saran S, Isar J. Microbial production of 1,3-propanediol: Recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances 2009;27:895-913.

[12] Colin T, Bories A, Moulin G. Inhibition of Clostridium butyricum by 1,3-propanediol and diols during glycerol fermentation. Applied Microbiology and Biotechnology 2000;54:201-205.

[13] Chatzifragkou A, Aggelis G, Gardeli C, Galiotou-Panayotou M, Komaitis M, Papanikolaou S. Adaptation dynamics of Clostridium butyricum in high 1,3-propanediol content media. Applied Microbiology and Biotechnology 2012;95:1541-1552.

[14] Papanikolaou S, Ruiz-Sanchez P, Pariset B, Blanchard F, Fick M. High production of 1,3-propanediol from industrial glycerol by a newly isolated Clostridium butyricum strain. Journal of biotechnology 2000;77:191-208.

[15] Shahid EM, Jamal Y. Production of biodiesel: A technical review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2011;15:4732-4745.

[16] Atabani AE, Silitonga AS, Badruddin IA, Mahlia TMI, Masjuki HH, Mekhilef S. A comprehensive review on biodiesel as an alternative energy resource and its characteristics. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2012;16:2070-2093.

[17] Johnson DT, Taconi KA. The glycerin glut: Options for the value-added conversion of crude glycerol resulting from biodiesel production. Environmental Progress 2007;26:338-348.

[18] Chatzifragkou A, Papanikolaou S, Dietz D, Doulgeraki A, Nychas G-J, Zeng A-P. Production of 1,3-propanediol by Clostridium butyricum growing on biodiesel-derived crude glycerol through a non-sterilized fermentation process. Applied Microbiology and Biotechnology 2011;91:101-112.

[19] Wilkens E, Ringel A, Hortig D, Willke T, Vorlop K-D. High-level production of 1,3-propanediol from crude glycerol by Clostridium butyricum AKR102a. Applied Microbiology and Biotechnology 2012;93:1057-1063.

31

[20] Jain MK, Gleeson J, Upreti A, Upreti GC. Intrinsic perturbing ability of alkanols in lipid bilayers. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes 1978;509:1-8.

[21] Nicolaou SA, Gaida SM, Papoutsakis ET. A comparative view of metabolite and substrate stress and tolerance in microbial bioprocessing: From biofuels and chemicals, to biocatalysis and bioremediation. Metabolic Engineering 2010;12:307-331.

[22] Sardessai YN, Bhosle S. Industrial potential of organic solvent tolerant bacteria. Biotechnology progress 2004;20:655-660.

[23] Ringel AK, Wilkens E, Hortig D, Willke T, Vorlop KD. An improved screening method for microorganisms able to convert crude glycerol to 1,3-propanediol and to tolerate high product concentrations. Applied Microbiology and Biotechnology 2012;93:1049-1056.

[24] Abbad-Andaloussi S, Manginot-Durr C, Amine J, Petitdemange E, Petitdemange H. Isolation and Characterization of Clostridium butyricum DSM 5431 Mutants with Increased Resistance to 1,3-Propanediol and Altered Production of Acids. Applied Environmental Microbiology 1995;61:4413-4417.

[25] Reimann A, Abbad-Andaloussi S, Biebl H, Petitdemange H. 1,3-Propanediol formation with product-tolerant mutants of Clostridium butyricum DSM 5431 in continuous culture: productivity, carbon and electron flow. Journal of applied microbiology 1998;84:1125-1130.

[26] Senado de la República de Colombia - Información Legislativa. Ley 939 de 2004. http://www.secretariasenado.gov.co/senado/basedoc/ley/2004/ley_0939_2004.html (Fecha de consulta: 15/09/2013).

[27] Federación Nacional de Biocombustibles de Colombia. Informe Estadístico del Sector de los Biocombustibles - Cifras Informativas del Sector Biocombustibles BIODIÉSEL DE ACEITE DE PALMA http://www.fedebiocombustibles.com/files/Cifras%20Informativas%20del%20Sector%20Biocombustibles%20-%20BIODIESEL%2836%29.pdf (Fecha de consulta: 18/09/2013).

[28] Tan HW, Abdul Aziz AR, Aroua MK. Glycerol production and its applications as a raw material: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2013;27:118-127.

[29] Kubiak P, Leja K, Myszka K, Celińska E, Spychała M, Szymanowska-Powałowska D, Czaczyk K, Grajek W. Physiological predisposition of various Clostridium species to synthetize 1,3-propanediol from glycerol. Process Biochemistry 2012;47:1308-1319.

[30] Gonzalez-Pajuelo M, Andrade JC, Vasconcelos I. Production of 1,3-propanediol by Clostridium butyricum VPI 3266 using a synthetic medium and raw glycerol. Journal of industrial microbiology & biotechnology 2004;31:442-446.

[31] 1,3-propanediol market estimated to reach $621.2 million by 2021. M2 Presswire (2015, Nov 05). http://search.proquest.com/docview/1729702146?accountid=13250 (Fecha de consulta: 01/01/2016).

[32] Cheng K-K, Zhang J-A, Liu D-H, Sun Y, Liu H-J, Yang M-D, Xu J-M. Pilot-scale production of 1,3-propanediol using Klebsiella pneumoniae. Process Biochemistry 2007;42:740-744.

[33] Menzel K, Zeng AP, Deckwer WD. High concentration and productivity of 1,3-propanediol from continuous fermentation of glycerol by Klebsiella pneumoniae. Enzyme and Microbial Technology 1997;20:82-86.

[34] Metsoviti M, Paraskevaidi K, Koutinas A, Zeng A-P, Papanikolaou S. Production of 1,3-propanediol, 2,3-butanediol and ethanol by a newly isolated Klebsiella oxytoca strain growing on biodiesel-derived glycerol based media. Process Biochemistry 2012;47:1872-1882.

[35] Xiu Z-L, Song B-H, Wang Z-T, Sun L-H, Feng E-M, Zeng A-P. Optimization of dissimilation of glycerol to 1,3-propanediol by Klebsiella pneumoniae in one- and two-stage anaerobic cultures. Biochemical Engineering Journal 2004;19:189-197.

[36] Amin HM, Hashem AM, Ashour MS, Hatti-Kaul R. 1,2 Propanediol utilization by Lactobacillus reuteri DSM 20016, role in bioconversion of glycerol to 1,3 propanediol, 3-hydroxypropionaldehyde and 3-hydroxypropionic acid. Journal of Genetic Engineering and Biotechnology 2013;11:53-59.

[37] Pflügl S, Marx H, Mattanovich D, Sauer M. 1,3-Propanediol production from glycerol with Lactobacillus diolivorans. Bioresource Technology 2012;119:133-140.

[38] Schütz H, Radler F. Anaerobic Reduction of Glycerol to Propanediol-1.3 by Lactobacillus brevis and Lactobacillus buchneri. Systematic and Applied Microbiology 1984;5:169-178.

32

[39] Anand P, Saxena RK. A comparative study of solvent-assisted pretreatment of biodiesel derived crude glycerol on growth and 1,3-propanediol production from Citrobacter freundii. New Biotechnology 2012;29:199-205.

[40] Metsoviti M, Zeng A-P, Koutinas AA, Papanikolaou S. Enhanced 1,3-propanediol production by a newly isolated Citrobacter freundii strain cultivated on biodiesel-derived waste glycerol through sterile and non-sterile bioprocesses. Journal of biotechnology 2013;163:408-418.

[41] Kivistö A, Santala V, Karp M. 1,3-Propanediol production and tolerance of a halophilic fermentative bacterium, Halanaerobium saccharolyticum subsp. saccharolyticum. Journal of biotechnology 2012;158:242-247.

[42] Moon C, Hwan Lee C, Sang B-I, Um Y. Optimization of medium compositions favoring butanol and 1,3-propanediol production from glycerol by Clostridium pasteurianum. Bioresource Technology 2011;102:10561-10568.

[43] Raynaud C, Sarçabal P, Meynial-Salles I, Croux C, Soucaille P. Molecular characterization of the 1,3-propanediol (1,3-PD) operon of Clostridium butyricum. Proceedings of the National Academy of Sciences 2003;100:5010-5015.

[44] Tomas CA, Welker NE, Papoutsakis ET. Overexpression of groESL in Clostridium acetobutylicum Results in Increased Solvent Production and Tolerance, Prolonged Metabolism, and Changes in the Cell's Transcriptional Program. Applied and Environmental Microbiology 2003;69:4951-4965.

[45] Mann MS, Dragovic Z, Schirrmacher G, Lütke-Eversloh T. Over-expression of stress protein-encoding genes helps Clostridium acetobutylicum to rapidly adapt to butanol stress. Biotechnology Letters 2012;34:1643-1649.

[46] Zingaro KA, Papoutsakis TE. GroESL overexpression imparts Escherichia coli tolerance to i-, n-, and 2-butanol, 1,2,4-butanetriol and ethanol with complex and unpredictable patterns. Metabolic Engineering 2013;15:196-205.

[47] Demirbas A. Political, economic and environmental impacts of biofuels: A review. Applied Energy 2009;86:S108-S117.

[48] Escobar JC, Lora ES, Venturini OJ, Yáñez EJ, Castillo EF, Almazan O. Biofuels: Environment, technology and food security. Renewable and Sustainable Energy Reviews 2009;13:1275-1287.

[49] Imandi SB, Bandaru VR, Somalanka SR, Garapati HR. Optimization of medium constituents for the production of citric acid from byproduct glycerol using Doehlert experimental design. Enzyme and Microbial Technology 2007;40:1367-1372.

[50] Papanikolaou S, Muniglia L, Chevalot I, Aggelis G, Marc I. Yarrowia lipolytica as a potential producer of citric acid from raw glycerol. Journal of applied microbiology 2002;92:737-744.

[51] Barbirato F, Chedaille D, Bories A. Propionic acid fermentation from glycerol: comparison with conventional substrates. Applied Microbiology and Biotechnology 1997;47:441-446.

[52] Ashby R, Solaiman DY, Foglia T. Bacterial Poly(Hydroxyalkanoate) Polymer Production from the Biodiesel Co-product Stream. Journal of Polymers and the Environment 2004;12:105-112.

[53] Koller M, Bona R, Braunegg G, Hermann C, Horvat P, Kroutil M, Martinz J, Neto J, Pereira L, Varila P. Production of polyhydroxyalkanoates from agricultural waste and surplus materials. Biomacromolecules 2005;6:561-565.

[54] Biebl H, Menzel K, Zeng AP, Deckwer WD. Microbial production of 1,3-propanediol. Applied Microbiology and Biotechnology 1999;52:289-297.

[55] González-Pajuelo M, Meynial-Salles I, Mendes F, Soucaille P, Vasconcelos I. Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol: physiological comparison of a natural producer, Clostridium butyricum VPI 3266, and an engineered strain, Clostridium acetobutylicum DG1(pSPD5). Applied Environmental Microbiology 2006;72:96-101.

[56] Montoya Solano JD. Metabolic engineering of the Colombian strain Clostridium sp. IBUN 158B in order to improve the bioconversion of glycerol into 1,3-propanediol.Ulm, Germany: Ulm University; Doctoral thesis; 2012.

[57] Tang X, Tan Y, Zhu H, Zhao K, Shen W. Microbial conversion of glycerol to 1,3-propanediol by an engineered strain of Escherichia coli. Applied Environmental Microbiology 2009;75:1628-1634.

[58] Zeng AP. Pathway and kinetic analysis of 1,3-propanediol production from glycerol fermentation by Clostridium butyricum. Bioprocess Engineering 1996;14:169-175.

33

[59] Domínguez-Cuevas P, González-Pastor JE, Marqués S, Ramos JL, de Lorenzo V. Transcriptional Tradeoff between Metabolic and Stress-response Programs in Pseudomonas putida KT2440 Cells Exposed to Toluene. Journal of Biological Chemistry 2006;281:11981-11991.

[60] Reimann, Abbad A, Biebl, Petitdemange. 1,3-Propanediol formation with product-tolerant mutants of Clostridium butyricum DSM 5431 in continuous culture: productivity, carbon and electron flow. Journal of Applied Microbiology 1998;84:1125-1130.

[61] Ringel AK, Wilkens E, Hortig D, Willke T, Vorlop KD. An improved screening method for microorganisms able to convert crude glycerol to 1,3-propanediol and to tolerate high product concentrations. Appl Microbiol Biotechnol 2012;93:1049-1056.

[62] Saxena RK, Anand P, Saran S, Isar J. Microbial production of 1,3-propanediol: Recent developments and emerging opportunities. 2009;27:895-913.

[63] Biebl H, Menzel K, Zeng AP, Deckwer WD. Microbial production of 1,3-propanediol. Appl Microbiol Biotechnol 1999;52:289-297.

[64] Kurian J. A New Polymer Platform for the Future — Sorona® from Corn Derived 1,3-Propanediol. Journal of Polymers and the Environment 2005;13:159-167.

[65] Matar S, Lewis H. Chemistry of Petrochemical Processes. United States: Gulf Professional Publishing; 2001. p. 356.

[66] Lin EC. Glycerol dissimilation and its regulation in bacteria. Annual Review of Microbiology 1976;30:535-578.

[67] Cameron DC, Altaras NE, Hoffman ML, Shaw AJ. Metabolic Engineering of Propanediol Pathways. Biotechnology progress 1998;14:116-125.

[68] Heap JT, Kuehne SA, Ehsaan M, Cartman ST, Cooksley CM, Scott JC, Minton NP. The ClosTron: Mutagenesis in Clostridium refined and streamlined. Journal of Microbiological Methods 2010;80:49-55.

[69] Otte B, Grunwaldt E, Mahmoud O, Jennewein S. Genome shuffling in Clostridium diolis DSM 15410 for improved 1,3-propanediol production. Applied Environmental Microbiology 2009;75:7610-7616.

[70] González-Pajuelo M, Meynial-Salles I, Mendes F, Andrade JC, Vasconcelos I, Soucaille P. Metabolic engineering of Clostridium acetobutylicum for the industrial production of 1,3-propanediol from glycerol. Metabolic Engineering 2005;7:329-336.

[71] Xiu Z-L, Zeng A-P. Present state and perspective of downstream processing of biologically produced 1,3-propanediol and 2,3-butanediol. Applied Microbiology and Biotechnology 2008;78:917-926.

[72] Samul D, Leja K, Grajek W. Impurities of crude glycerol and their effect on metabolite production. Annals of Microbiology 2013:1-8.

[73] Zeng AP, Ross A, Biebl H, Tag C, Günzel B, Deckwer WD. Multiple product inhibition and growth modeling of clostridium butyricum and klebsiella pneumoniae in glycerol fermentation. Biotechnology and Bioengineering 1994;44:902-911.

[74] Dunlop MJ. Engineering microbes for tolerance to next-generation biofuels. Biotechnology for biofuels 2011;4:32.

[75] Inoue A, Horikoshi K. Estimation of solvent-tolerance of bacteria by the solvent parameter log P. Journal of Fermentation and Bioengineering 1991;71:194-196.

[76] Torres S, Pandey A, Castro GR. Organic solvent adaptation of Gram positive bacteria: applications and biotechnological potentials. Biotechnology Advances 2011;29:442-452.

[77] Paulsen IT, Brown MH, Skurray RA. Proton-dependent multidrug efflux systems. Microbiological reviews 1996;60:575-608.

[78] Li XZ, Zhang L, Poole K. Role of the multidrug efflux systems of Pseudomonas aeruginosa in organic solvent tolerance. Journal of bacteriology 1998;180:2987-2991.

[79] Dunlop MJ, Dossani ZY, Szmidt HL, Chu HC, Lee TS, Keasling JD, Hadi MZ, Mukhopadhyay A. Engineering microbial biofuel tolerance and export using efflux pumps. Molecular systems biology 2011;7:487.

[80] Matsumoto M, de Bont JA, Isken S. Isolation and characterization of the solvent-tolerant Bacillus cereus strain R1. Journal of bioscience and bioengineering 2002;94:45-51.

[81] Rojas A, Duque E, Mosqueda G, Golden G, Hurtado A, Ramos JL, Segura A. Three efflux pumps are required to provide efficient tolerance to toluene in Pseudomonas putida DOT-T1E. Journal of bacteriology 2001;183:3967-3973.

34

[82] Aono R, Tsukagoshi N, Yamamoto M. Involvement of outer membrane protein TolC, a possible member of the mar-sox regulon, in maintenance and improvement of organic solvent tolerance of Escherichia coli K-12. Journal of bacteriology 1998;180:938-944.

[83] Ankarloo J, Wikman S, Nicholls IA. Escherichia coli mar and acrAB mutants display no tolerance to simple alcohols. International journal of molecular sciences 2010;11:1403-1412.

[84] Heipieper HJ, Meinhardt F, Segura A. The cis-trans isomerase of unsaturated fatty acids in Pseudomonas and Vibrio: biochemistry, molecular biology and physiological function of a unique stress adaptive mechanism. FEMS microbiology letters 2003;229:1-7.

[85] Weber FJ, de Bont JA. Adaptation mechanisms of microorganisms to the toxic effects of organic solvents on membranes. Biochimica et biophysica acta 1996;1286:225-245.

[86] Bowles LK, Ellefson WL. Effects of butanol on Clostridium acetobutylicum. Applied Environmental Microbiology 1985;50:1165-1170.

[87] Pepi M, Heipieper HJ, Fischer J, Ruta M, Volterrani M, Focardi SE. Membrane fatty acids adaptive profile in the simultaneous presence of arsenic and toluene in Bacillus sp. ORAs2 and Pseudomonas sp. ORAs5 strains. Extremophiles : life under extreme conditions 2008;12:343-349.

[88] Han M-J, Yun H, Lee SY. Microbial small heat shock proteins and their use in biotechnology. Biotechnology Advances 2008;26:591-609.

[89] Kumar CMS, Mande SC, Mahajan G. Multiple chaperonins in bacteria—novel functions and non-canonical behaviors. Cell Stress and Chaperones 2015;20:555-574.

[90] Kubota H. Heat Shock Proteins: HSP60 Family Genes*. In: G. Fink editor. Encyclopedia of Stress (Second Edition). New York: Academic Press; 2007. p. 288-292.

[91] Fayet O, Ziegelhoffer T, Georgopoulos C. The groES and groEL heat shock gene products of Escherichia coli are essential for bacterial growth at all temperatures. Journal of bacteriology 1989;171:1379-1385.

[92] Thies FL, Weishaupt A, Karch H, Hartung HP, Giegerich G. Cloning, sequencing and molecular analysis of the Campylobacter jejuni groESL bicistronic operon. Microbiology 1999;145 ( Pt 1):89-98.

[93] Schmidt A, Schiesswohl M, Volker U, Hecker M, Schumann W. Cloning, sequencing, mapping, and transcriptional analysis of the groESL operon from Bacillus subtilis. Journal of bacteriology 1992;174:3993-3999.

[94] Narberhaus F, Bahl H. Cloning, sequencing, and molecular analysis of the groESL operon of Clostridium acetobutylicum. Journal of bacteriology 1992;174:3282-3289.

[95] Segura A, Godoy P, van Dillewijn P, Hurtado A, Arroyo N, Santacruz S, Ramos JL. Proteomic analysis reveals the participation of energy- and stress-related proteins in the response of Pseudomonas putida DOT-T1E to toluene. Journal ofBacteriology 2005;187:5937-5945.

[96] Desmond C, Fitzgerald GF, Stanton C, Ross RP. Improved stress tolerance of GroESL-overproducing Lactococcus lactis and probiotic Lactobacillus paracasei NFBC 338. Applied Environmental Microbiology 2004;70:5929-5936.

[97] Tomas CA, Beamish J, Papoutsakis ET. Transcriptional analysis of butanol stress and tolerance in Clostridium acetobutylicum. Journal ofBacteriology 2004;186:2006-2018.

[98] Montoya D, Spitia S, Silva E, Schwarz WH. Isolation of mesophilic solvent-producing clostridia from Colombian sources: physiological characterization, solvent production and polysaccharide hydrolysis. Journal ofBiotechnology 2000;79:117-126.

[99] Montoya D, Areválo C, Gonzales S, Aristizabal F, Schwarz WH. New solvent-producing Clostridium sp. strains, hydrolyzing a wide range of polysaccharides, are closely related to Clostridium butyricum. Journal of Industrial Microbiolology and Biotechnology 2001;27:329-335.

[100] Cárdenas D, Pulido C, Aragón O, Aristizabal F, Suárez Z, Montoya D. Evaluación de la producción de 1,3-propanodiol por cepas nativas de Clostridium sp. mediante fermentación a partir de glicerol USP y glicerol industrial subproducto de la producción de biodiesel. Revista Colombiana de Ciencias Químico-Farmaceúticas 2006;35:120-137.

[101] Pérez Mancilla XC. Estandarización de la concentración de glicerol industrial y de la fuente de nitrógeno en el medio de cultivo para la producción de 1,3-propanodiol utilizando una cepa nativa de Clostridium sp.Bogotá, Colombia: Universidad Nacional de Colombia; Master Scientae en Microbiología; 2009.

35

[102] Montoya Solano JD. Determinación de la secuencia de genes putativamente involucrados en la producción de 1,3-propanodiol en la cepa nativa colombiana Clostridium sp. IBUN 158B.Bogotá, Colombia: Universidad Nacional de Colombia; Master Scientae en Microbiología; 2009.

[103] Comba Gonzalez N, Vallejo AF, Sanchez-Gomez M, Montoya D. Protein identification in two phases of 1,3-propanediol production by proteomic analysis. Journal ofProteomics 2013;89:255-264.

[104] Purdy D, O'Keeffe TAT, Elmore M, Herbert M, McLeod A, Bokori-Brown M, Ostrowski A, Minton NP. Conjugative transfer of clostridial shuttle vectors from Escherichia coli to Clostridium difficile through circumvention of the restriction barrier. Molecular Microbiology 2002;46:439-452.

[105] Jaimes CP, Fabio AAG, Bernal M M, Suárez ZR, Montoya D. AFLP fingerprinting of Colombian Clostridium spp strains, multivariate data analysis and its taxonomical implications. Journal of Microbiological Methods 2006;67:64-69.

[106] Rosas-Morales JP, Perez-Mancilla X, López-Kleine L, Montoya Castaño D, Riaño-Pachón DM. Draft Genome Sequences of Clostridium Strains Native to Colombia with the Potential To Produce Solvents. Genome Announcements 2015;3.

[107] Untergasser A, Cutcutache I, Koressaar T, Ye J, Faircloth BC, Remm M, Rozen SG. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic acids research 2012;40.

[108] Metcalf D, Sharif S, Weese JS. Evaluation of candidate reference genes in Clostridium difficile for gene expression normalization. Anaerobe 2010;16:439-443.

[109] Liu J, Tan Y, Yang X, Chen X, Li F. Evaluation of Clostridium ljungdahlii DSM 13528 reference genes in gene expression studies by qRT-PCR. Journal of bioscience and bioengineering 2013;116:460-464.

[110] Multiple Primer Analyzer - Thermo Scientific Web Tools. www.lifetechnologies.com/co/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/molecular-biology-resource-library/thermo-scientific-web-tools/multiple-primer-analyzer.html#/legacy=www.thermoscientificbio.com (Fecha de consulta: 18/01/2014).

[111] Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001. p. 2344.

[112] Cai G, Jin B, Saint C, Monis P. Genetic manipulation of butyrate formation pathways in Clostridium butyricum. Journal of biotechnology 2011;155:269-274.

[113] Borden JR, Papoutsakis ET. Dynamics of genomic-library enrichment and identification of solvent tolerance genes for Clostridium acetobutylicum. Applied Environmental Microbiology 2007;73:3061-3068.

[114] Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP. Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper - Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnology Letters 2004;26:509-515.

[115] LightCycler® 480 Instrument Operator’s Manual. Roche Diagnostics GmbH. 2008. [116] Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time

Quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method. Methods 2001;25:402-408. [117] Notredame C, Higgins DG, Heringa J. T-coffee: A novel method for fast and accurate multiple

sequence alignment. Journal of Molecular Biology 2000;302:205-217. [118] Bachvarov BI, Kirilov Kiril T, Ivanov IG. Codon and codon pairs usage in bacteria. Bacterial DNA,

DNA Polymerase and DNA Helicases; 2009. p. 1-50. [119] Glen C, Nigel PM, Ian JD, Mike Y. Gene Cloning in Clostridia. Handbook on Clostridia: CRC

Press; 2005. p. 37-52. [120] Lee SY, Mermelstein LD, Bennett GN, Papoutsakis ET. Vector Construction, Transformation,

and Gene Amplification in Clostridium acetobutylicum ATCC 824a. Annals of the New York Academy of Sciences 1992;665:39-51.

[121] Mermelstein LD, Welker NE, Bennett GN, Papoutsakis ET. Expression of cloned homologous fermentative genes in Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Bio/Technology 1992;10:190-195.

[122] Mermelstein LD, Papoutsakis ET. In vivo methylation in Escherichia coli by the Bacillus subtilis

phage φ3TI methyltransferase to protect plasmids from restriction upon transformation of

36

Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Applied and Environmental Microbiology 1993;59:1077-1081.

[123] Jennert KCB, Tardif C, Young DI, Young M. Gene transfer to Clostridium cellulolyticum ATCC 35319. Microbiology 2000;146:3071-3080.

[124] Williams DR, Young DI, Young M. Conjugative plasmid transfer from Escherichia coli to Clostridium acetobutylicum. Journal ofGeneral Microbiology 1990;136:819-826.

[125] Goodarzi H, Bennett BD, Amini S, Reaves ML, Hottes AK, Rabinowitz JD, Tavazoie S. Regulatory and metabolic rewiring during laboratory evolution of ethanol tolerance in E. coli. Molecular systems biology 2010;6.

[126] Lee S, Lee JH, Mitchell RJ. Analysis of Clostridium beijerinckii NCIMB 8052's transcriptional response to ferulic acid and its application to enhance the strain tolerance. Biotechnology for biofuels 2015;8.

[127] Abdullah Al M, Sonomoto K. Nisin Tolerance of DnaK-overexpressing Lactococcus lactis Strains at 40°C. American Journal of Biochemistry and Molecular Biology 2012;2:157-166.

[128] Real-Time PCR Handbook - Life Technologies. http://www.lifetechnologies.com/co/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/real-time-pcr-handbook.html (Fecha de consulta: 18/01/2014).

[129] Segal G, Ron EZ. Regulation and organization of the groE and dnaK operons in Eubacteria. FEMS microbiology letters 1996;138:1-10.

37

Anexo A: Medios de Cultivo y Soluciones Buffer

Tabla A1. Medio RCM

Componente Concentración (g/L)

Extracto de Carne 10

Peptona 10

Extracto de Levadura 3

D(+)-Glucosa 5

Almidón soluble 1

NaCl 1

Acetato de sodio 1

L-cisteína 0,5

Tabla A2. Medio TGY

Componente Concentración (g/L)

D(+)-Glucosa 50

Triptona 5

Extracto de Levadura 5

K2HPO4 1

Tabla A3. Medio CGM

Componente Concentración (g/L)

D(+)-Glucosa 50

Extracto de Levadura 5

CH3COONa 2.46

Asparagina 2

(NH4)2SO4 2

NaCl 1

K2HPO4 0.75

KH2PO4 0.75

MgSO4 · 7H2O 0.71

MnSO4 · H2O 0.01

FeSO4 · 7H2O 0.01

Resazurina 0.001

38

Tabla A4. Medio Luria-Bertani

Componente Concentración

(g/L)

Triptona 5

Extracto de Levadura 10

NaCl 5

Tabla A5. Medio SOC

Componente Concentración

(g/L)

Triptona 20

Extracto de Levadura 5

NaCl 0.5

Previamente a llevar a volumen con agua destilada, agregue 10 mL/L de una solución de KCl 250 mM. Ajuste el pH a 7.0 con NaOH 5 N. Ajustar a volumen final. Esterilizar a 15 psi por 20 minutos. Una vez el medio haya sido esterilizado y alcance una temperatura de 60°C o menos, agregue 20 mL/L de una solución de glucosa 1 M previamente esterilizada por filtración. Justamente antes de emplear el medio, adicione 5 mL/L de una solución ésteril de MgCl2 2 M.

Tabla A6. Buffer PBS

Componente Concentración (g/L)

NaCl 8

Na2HPO4 · 2H2O 1.4

KCl 0.2

KH2PO4 0.2

Una vez se completa el volumen con agua destilada y se mezclan los componentes, agregue un 10% más de agua destilada y caliente la solución hasta eliminar dicho exceso. Esto con el objetivo de eliminar el oxigeno disuelto en el buffer.

39

Anexo B: Protocolos de Extracción de Ácidos Nucleicos

Protocolo de Extracción de ADN total para Clostridium spp.

1. A partir de un cultivo ON del m.o., inocular un volumen entre 7-10% en viales con medio TGY (10 – 40mL). Incubar a 37 °C hasta alcanzar una DO600nm de 0,3-0,5.

2. Distribuir el volumen del cultivo en tubos de 2 mL estériles y centrifugar a 10000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Descartar el sobrenadante.

3. Resuspender el pellet obtenido en un 1 volumen de SSE (0,85 % p/v NaCl; 10 mM EDTA). Centrifugar a 10000 rpm durante 5 minutos a 4 °C. Descartar el sobrenadante.

4. Resuspender el pellet en 500 µL de TE (10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA). 5. Agregar 50 µL de lisozima (50 mg/mL) e incubar a 37 °C en baño termostatado durante

30 minutos. 6. Adicionar 17 µL de SDS al 10% y 3 µL de proteinasa K (20 mg/mL). Incubar a 37 °C

durante 1 hora. 7. Añadir 5 µL de RNAsa (10 mg/mL). Incubar a 37 °C durante 30 minutos. 8. Adicionar 100 µL de NaCl 5M e incubar a 65 °C durante 10 minutos. 9. Agregar 1 volumen de fenol:cloroformo:isoamil alcohol (25:24:1). Centrifugar a 14000

rpm durante 5 minutos a 4 °C. 10. Recuperar la mayor cantidad de sobrenadante posible y transferirla a otro tubo de 2 mL. 11. Añadir un volumen de cloroformo:isoamil alcohol (24:1). Centrifugar a 14000 rpm

durante 5 minutos a 4 °C. 12. Repetir pasos 10 y 11. 13. Una vez transferido el sobrenadante a un tubo estéril, agregar 0.8 volúmenes de

isopropanol e incubar a -20 °C por 16 horas/-70 °C durante 2 horas. 14. Centrifugar a 14000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. 15. Descartar el sobrenadante y adicionar 200 µL de etanol al 70%. Centrifugar a 10000 rpm

durante 5 minutos. 16. Descartar el sobrenadante y dejar secar los tubos boca abajo sobre una toalla de papel

a temperatura ambiente. 17. Resuspender el ADN en 30-50 µL de agua HPLC o buffer TE y almacenar a -20 °C.

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Protocolo de Extracción de ADN plásmidico

1. A partir de un vial conservado a -80 °C, aislar el microorganismo en medio sólido (LB para E. coli; TGY para Clostridium). Incubar durante 24-48 a 30-37 °C.

2. Transferir una colonia del microorganismo a 5 mL de medio liquido (LB para E. coli; TGY para Clostridium). Incubar a 37 °C, 200 rpm durante 16 horas en un shaker orbital.

3. Centrifugar a 12000 rpm por 3 minutos. Descartar el sobrenadante. 4. Resuspender el pellet en 1 mL de buffer STE (Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM; NaCl

100 mM; pH 8.0). Centrifugar a 12000 rpm por 3 minutos y descartar el sobrenadante.

5. Resuspender el pellet en 200 µL de solución de lisis I (buffer STE). 6. Adicionar 400 µL de solución de lisis II (NaOH 0.2 N; SDS 1% p/v). Mezclar por

inversión. 7. Agregar 300 µL de solución de lisis III*. Mezclar por inversión e incubar en hielo

durante 10 minutos. 8. Centrifugar a 12000 rpm durante 5 minutos. Transferir el sobrenadante a un tubo

estéril. 9. Adicionar 0.8V de isopropanol. Mezclar por inversión e incubar a -20 °C durante 1

hora. 10. Centrifugar a 14000 rpm durante 10 minutos. Descartar el sobrenadante y eliminar

completamente. 11. Resuspender el ADN en 40-50 µL de agua Milli-Q. Incubar a -20 °C. Evaluar la

calidad y cantidad del ADN obtenido por electroforesis en gel de agarosa al 1%. *Solución de lisis III: Por cada 100 mL de solución, mezclar 60 mL de acetato de potasio 5 M; 11,5 mL de ácido acético glacial y 28,5 mL de agua destilada. Nota: Para la extracción de plásmidos de Clostridium spp., se debe agregar lisozima (Cf: 0.1 mg/mL) e incubar durante 1 hora a 37 °C antes de adicionar la solución de lisis II.

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Protocolo de Extracción de ARN total para Clostridium sp.

12. Transvasar 25 mL de un cultivo en fase exponencial del microorganismo en un tubo de 50 mL.

13. Centrifugar a 12000 rpm por 30 minutos. Descartar el sobrenadante. 14. Re-suspender el pellet del cultivo en 1 mL de buffer de extracción para ARN (Tris-

HCl 0,18 M, LiCl 0,09 M, EDTA 4.5 mM, SDS 1% p/v; pH 8.2) 15. Servir la suspensión en un tubo Eppendorf de 2 mL, previamente tratado con agua

dietilpirocarbonato (DEPC). 16. Sonicar por 30 segundos a 60 hz dejando descansar 1 min y repetir 3 veces. 17. Incubar en baño termostatado a 50°C durante 20 minutos. 18. Adicionar 600 μL de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1), mezclar por

inmersión durante 3 minutos, y centrifugar a 12000 rpm por 20 minutos, tomar la fase acuosa y servirla en un tubo Eppendorf de 2 mL previamente tratado con agua DEPC (Repetir 4 veces).

19. Adicionar 600 μL de cloroformo, mezclar por inmersión durante 2 minutos, y centrifugar a 12000 rpm por 20 minutos, tomar el sobrenadante y servirlo en un tubo Eppendorf de 1.5 mL. previamente tratado con agua DEPC.

20. Adicionar 600 μL de isopropanol, mezclar bien por inmersión y dejar precipitar a -20°C durante 1 día.

21. Centrifugar a 12000 rpm por 10 minutos, descartar el sobrenadante teniendo cuidado de no perder el botón. Agregar 600 μL de etanol al 70% y centrifugar a 12000 RPM durante 10 minutos (Repetir 3 veces).

22. Dejar secar el Pellet y re-suspender con 10-30 μL de agua tratada con DEPC. Tratamiento con DNAsa

1. Tomar 1.5 μL de RNA y adicionarle 1 μL de Buffer de reacción 10X y 1 μL de DNAsa 100U/μL completar el volumen a 10 μL con agua tratada con DEPC e incubar a 65°C durante 15 minutos.

2. Adicionar 1 μL de EDTA 20 mM e incubar a 65°C. durante 10 minutos para inactivar la enzima.

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Anexo C: Protocolo de Preparación de Células Quimiocompetentes

1. Reactivar el microorganismo a partir de un vial crioconservado mediante siembra en

agar LB. Incubar durante 16-24 horas a 37°C. 2. Inocular una colonia del microorganismo en 25 mL de medio LB. Incubar a 37°C, 200

rpm hasta que el cultivo alcance una densidad óptica a 600 nm de 0,5-0,6 (Aproximadamente 4 horas).

3. Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos a 4°C. 4. Descartar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente el pellet en 5 mL de una

solución fría de CaCl2 100 mM. 5. Incubar en hielo durante 3 horas a 4°C. 6. Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos a 4°C. 7. Descartar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente el pellet en 1,5 mL de una

solución fría de CaCl2 100 mM y glicerol al 15%. 8. Distribuir la suspensión en alícuotas de 100 µL en tubos de 1,5 mL y almacenar a -80

°C. Nota: Es recomendable utilizar las células competentes lo más pronto posible y evitar varios ciclos de congelación-descongelación, esto con el objetivo de preservar la competencia de las células.

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Anexo D: Datos de Densidad Óptica - Ensayos de Inhibición

Tabla D1. Datos integrados de los ensayos de inhibición.

Concentración de PDO (g/L)

(DO600nm)Control %TControl (DO600nm)groESL %TgroESL

0 2,602 100 2,62 100

20 1,996 76,63 2,436 93,19

40 1,234 46,86 2,001 76,63

60 0,448 16,63 0,693 25,81

80 0,025 0,34 0,088 2,84

(DO600nm)Control: Densidad óptica a 600 nm de la cepa control; (DO600nm)groESL: Densidad óptica a 600 nm de la cepa de sobreexpresión; %TControl: Porcentaje de Tolerancia de la cepa control; %TgroESL: Porcentaje de Tolerancia de la cepa de sobreexpresión.

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Anexo E: Curvas de Disociación de los productos de qPCR

Figura E1. Curva de Disociación - groES

Figura E2. Curva de Disociación - rpoA

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Figura E3. Curva de Disociación - tpi