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XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
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Evaluacioacuten de la conservacioacuten de dos preparados comerciales formulados a base de micromicetos del geacutenero trichoderma Mariacuten JI Rodriacuteguez P Boix A Lupioacuten B Velasco V Tello JC Grupo de investigacioacuten AGR-200 Universidad de Almeriacutea Dpto de Agronomiacutea Cantildeada de San Urbano sn 04120 Almeriacutea jignaciomarinmailcom
RESUMEN
Son numerosos los preparados microbioloacutegicos comerciales que incluyen en su formulacioacuten hongos del geacutenero Trichoderma A las especies de este geacutenero se le atribuyen propiedades de biocontrol de patoacutegenos asiacute como cualidades bioestimulantes y biofortificantes
Las esporas son los propaacutegulos comunmente empleados en programas de biocontrol con Trichoderma y por tanto la principal forma de produccioacuten comercial Existen deficiencias en las tecnologiacuteas de conservacioacuten asiacute como en las indicaciones de las etiquetas comerciales Considerando que se trata de formulados que incluyen a un ser vivo en su composicioacuten con el objetivo de obtener preparados microbioloacutegicos de calidad que den fiabilidad de uso se hace necesario el mantenimiento y conservacioacuten de sus propiedades en el tiempo Asiacute este trabajo que surge del campo empresarial almeriense evaluacutea la concentracioacuten y conservacioacuten en el tiempo de Trichoderma sp en dos preparados comerciales 1)liacutequido y 2)soacutelido almacenados durante seis meses a diferentes temperaturas
Los resultados sugieren que los preparados estudiados se conservan mejor a 5ordmC que a temperatura ambiente Asiacute mismo el descenso en la viabilidad de las esporas fue maacutes acusado en el preparado soacutelido Debe considerarse que el descenso en ninguacuten caso afectoacute a la potencia 107 UFC∙g-1 que acompantildea a la concentracioacuten de propaacutegulos aunque las etiquetas indicaban 108 UFC∙g-1 Ademaacutes en el preparado soacutelido la coincidencia entre el coacutemputo de esporas y su viabilidad en ninguacuten momento superoacute el 40 sin embargo en el preparado liacutequido el coacutemputo de esporas fue normalmente inferior a la viabilidad de los propaacutegulos presentes
Palabras clave Bioestimulante biofortificante biocontrol
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INTRODUCCIOacuteN
La homologacioacuten en los paiacuteses industrializados es un obstaacuteculo para la
comercializacioacuten de biopesticidas teacutermino que incluye a todos aquellos
fitosanitarios no obtenidos mediante siacutentesis quiacutemica industrial (De Lintildeaacuten
2013) En este sentido la directiva de la Unioacuten Europea 91414CEE establece
un procedimiento que es muy exigente previsto fundamentalmente para
fitosanitarios de siacutentesis conformados habitualmente por una materia activa
con una composicioacuten uniforme Al respecto estos procedimientos son
considerados no oacuteptimos para la evaluacioacuten y registro de biopesticidas lo que
ha incitado la buacutesqueda de viacuteas alternativas que faciliten el proceso (Sundh y
Goettel 2013) Aparecen entonces los bioestimulantes que algunos autores
definen como sustancias que ldquomodifican el metabolismo vegetal secundario de
ciertas partes de las plantas lo que les permite resistir bien al estreacutes abioacutetico o
al parasitismo de algunos bio-agresores o bien modifican el metabolismo de
los microorganismos del suelo inducieacutendolos a producir metabolitos
particulares que favorecen la nutricioacuten mineral de las plantasrdquo Esta definicioacuten
engloba a la vez elicitores y fertilizantes (bioestimulantes y biofertilizantes)
Asiacute este enfoque particular parece dispensar a preparados microbioloacutegicos de
su homologacioacuten como productos fitosanitarios (Tello et al 2011)
El mercado de biopesticidas ha crecido desde finales del siglo XX y se
estima un crecimiento anual comprendido entre el 10-16 en contraste con el
decrecimiento del mercado de pesticidas de siacutentesis estimado en -15 anual
(Marrone 2007 Bailey et al 2010) Igualmente se conoce que a principios del
siglo XXI aproximadamente el 90 de los micoplaguicidas empleados en el
control de microorganismos fitopatoacutegenos incluiacutean en su formulacioacuten hongos
del geacutenero Trichoderma (Lorito 2006) Trichoderma es un habitante natural del
suelo y sus especies forman parte de un grupo complejo de hongos
filamentosos clasificados como Ascomicetos pertenecientes al orden
Hipocreales Al respecto son numerosas las especies empleadas para el
biocontrol de patoacutegenos del suelo y a las que se le atribuyen tambieacuten
cualidades bioestimulantes y biofertilizantes (Papavizas 1985 Windham et al
1986 Ousley et al 1994 Beniacutetez et al 2004 Harman et al 2004 Infante et
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al 2009 Schuster y Schmoll 2010) Se reproduce clonalmente mediante un
ciclo de vida asexual en el que se alterna micelio y esporas principalmente y
en determinadas condiciones produce clamidosporas que son estructuras de
resistencia que le permite perdurar a traveacutes del tiempo (Lewis y Papavizas
1984) Las esporas son los propaacutegulos maacutes viables empleados en programas
de biocontrol con Trichoderma y por tanto la principal forma de produccioacuten
comercial La biomasa de esporas puede ser obtenida por medio de cultivos
sumergidos y cultivos en sustratos soacutelidos (Lewis y Papavizas 1983 Elad et
al 1993 Elad y Kirshner 1993)
En la actualidad de acuerdo con los datos del Ministerio de Agricultura
Alimentacioacuten y Medio Ambiente (MAGRAMA 2013) los formulados de
Trichoderma registrados como productos fitosanitarios son comercializados
como polvo mojable y granulado dispersable en agua Otros productos
comerciales que tambieacuten incluyen Trichoderma sp en su composicioacuten no
registrados como fitosanitarios se presentan en forma de polvo seco
formulaciones liacutequidas en aceite asiacute como encapsulados que contienen el
hongo
Las deficiencias en las tecnologiacuteas de formulacioacuten conservacioacuten y
aplicacioacuten suponen una limitacioacuten Es por ello que con el objetivo de obtener
preparados fuacutengicos de alta calidad que den fiabilidad de uso se hace
necesario el mantenimiento y conservacioacuten de sus propiedades en el tiempo
Esto tiene primordial importancia para garantizar la densidad de poblacioacuten
presente en los preparados comerciales asiacute como las caracteriacutesticas originales
de las cepas de produccioacuten de forma que pueda disponerse de un clon del
microorganismo con su estabilidad geneacutetica y fenotiacutepica establecida Por ello
para obtener el producto final con una prolongada vida en estante es necesario
conocer la formulacioacuten asiacute como establecer las condiciones adecuadas de
almacenamiento donde la humedad y la temperatura son los principales
paraacutemetros que afectan a la estabilidad de biopesticidas de origen microbiano
(Jenkins y Grzywacz 2003) Al respecto hay en general deficiencias de
bibliografiacutea que se cifran en aspectos como la preparacioacuten del antagonista
(medios de cultivo etc) y sobre su conservacioacuten (tiempo condiciones etc) En
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consecuencia este trabajo que surge del campo empresarial almeriense trata
de evaluar parte de estos aspectos y asiacute continuar indagando en lo que se
discute en el trabajo de Tello et al (2011) titulado ldquoReflexiones sobre algunos
preparados microbianos comerciales utilizados para el control de insectos y
hongos paraacutesitos de los cultivosrdquo
OBJETIVOS
El objetivo de este trabajo consiste en evaluar la densidad de poblacioacuten
y conservacioacuten en el tiempo de Trichoderma sp en dos preparados
comerciales uno soacutelido y otro liacutequido almacenados durante un periodo de seis
meses a diferentes temperaturas Asiacute mismo se evaluacutea el porcentaje de
germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su coacutemputo directo al microscopio
MATERIAL Y MEacuteTODOS
Preparados microbianos
Las evaluaciones se realizaron en dos preparados comerciales
Soacutelido preparado comercial en forma de graacutenulos dispersables
Compuesto seguacuten etiqueta comercial por las cepas Trichoderma sp
(A) (1 x 108 ufcg) y Trichoderma sp (B) (1 x 108 ufcg)
Liacutequido preparado comercial liacutequido Compuesto seguacuten etiqueta
comercial por una cepa de Trichoderma sp (1 x 108 ufcml)
Temperaturas y periodo de conservacioacuten
Los preparados comerciales se conservaron en recipientes opacos de 1
L de volumen a dos temperaturas diferentes Temperatura ambiente y 5ordmC El
periodo de conservacioacuten contemplado fue de 6 meses
Evaluacioacuten de la densidad de poblacioacuten
Durante los 6 meses que abarcoacute el trabajo se realizaron anaacutelisis
quincenales para evaluar la densidad de poblacioacuten de Trichoderma sp en los
dos productos comerciales conservados a las diferentes temperaturas Esta
evaluacioacuten estaacute referida al nuacutemero de esporas viables Para ello se empleoacute la
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teacutecnica de las diluciones sucesivas (Tello et al 1991) El medio de cultivo
empleado fue Agar-Malta acidificado (aacutecido ciacutetrico al 025) Se realizaron 10
repeticiones (placas de Petri) por cada dilucioacuten Las diluciones estudiadas en
cada anaacutelisis fueron aquellas que en el anaacutelisis anterior mostraban la maacutexima
concentracioacuten asiacute como las dos diluciones inmediatamente maacutes concentradas
La incubacioacuten se realizoacute en el laboratorio a temperatura ambiente durante 2-5
diacuteas Transcurrido el tiempo indicado se procedioacute al conteo de las Unidades
Formadoras de Colonias (UFC) totales presentes en cada repeticioacuten
Recuento de conidias al microscopio
En todos los anaacutelisis realizados se procedioacute al recuento de conidias
presentes en las diluciones evaluadas Este procedimiento fue realizado
utilizando las diluciones preparadas para determinar la densidad de poblacioacuten
(contempladas en el apartado anterior) Los recuentos se llevaron a cabo con
caacutemara Neubauer (Brand Germany) Para ello se realizaron 3 recuentos de
cada muestra evaluada Para los recuentos del preparado soacutelido se empleoacute la
dilucioacuten 10-3 puesto que esa concentracioacuten permitiacutea un recuento de conidias
maacutes certero mientras que para el recuento en el preparado liacutequido se utilizoacute la
dilucioacuten 10-2 Finalmente el total de conidias se obtiene a partir de la siguiente
foacutermula
dilucioacutenmmcaacutemaradprofundidammcontadaSuperficie
contadasPartiacuteculasvoluacutemenlporPartiacuteculas
)()( 2
Evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su
coacutemputo directo al microscopio
Esta evaluacioacuten permitioacute establecer la viabilidad del hongo Se realizoacute
durante el periodo de conservacioacuten de 6 meses Los resultados se presentan
como el porcentaje de UFC en relacioacuten con el coacutemputo total de conidias al
microscopio
Anaacutelisis estadiacutestico de los datos
Los anaacutelisis realizados para las comparaciones entre diacuteas de
conservacioacuten consistieron en anaacutelisis de la varianza (ANOVA) simple Los
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meacutetodos empleados para la comparacioacuten de las medias fueron el
procedimiento de las diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD) y
el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD)
ambas al 95 de confianza Para la comparacioacuten de las dos temperaturas de
conservacioacuten (Tordf ambiente y 5ordmC) se realizoacute la prueba t-Student Asiacute mismo los
anaacutelisis estadiacutesticos realizados en la evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten
se han llevado a cabo con los datos obtenidos de la transformacioacuten del
arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1 En
todos los casos contemplados al tratarse de anaacutelisis parameacutetricos se
comprobaron previamente las asunciones de Normalidad y Homocedasticidad
El paquete estadiacutestico usado fue Statgraphic Plus 51 (Manugistic
Incorporated Rockville MD USA) para Windows
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Densidad de poblacioacuten en funcioacuten del tiempo y de la temperatura de
conservacioacuten
El estudio de la densidad de poblacioacuten de Trichoderma sp en los dos
preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a las
diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 1 y 2)
En el caso del preparado soacutelido cuando fue conservado a 5ordmC las diferencias
significativas aparecen entre anaacutelisis intermedios realizados durante el periodo
de conservacioacuten En cambio los resultados finales tras los 6 meses de
conservacioacuten no difieren de los resultados iniciales Sin embargo el preparado
soacutelido conservado a temperatura ambiente muestra un descenso en el nuacutemero
de UFC maacutes acusado mostrando mayores diferencias que son crecientes en
funcioacuten del tiempo Una vez comprobado que la conservacioacuten a temperatura
ambiente provocaba un mayor descenso en el nuacutemero de UFC a lo largo del
tiempo se procedioacute a evaluar a partir de queacute momento estas diferencias eran
significativas (ple005) entre las ambas temperaturas de conservacioacuten Los
resultados reflejan diferencias significativas y continuadas en el tiempo a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 1)
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En el caso del preparado liacutequido cuando fue conservado a 5ordmC auacuten
habiendo diferencias estadiacutesticamente significativas el test de diferencias
honestamente significativas de Tukey (HSD) no mostroacute diferencias en funcioacuten
del tiempo de conservacioacuten Sin embargo el preparado liacutequido conservado a
temperatura ambiente muestra un mayor descenso de UFC siendo en
comparacioacuten con el valor inicial significativo y continuado a partir de los 168
diacuteas de conservacioacuten Es a partir de la misma fecha cuando al comparar
ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias fueron significativas
(ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 2)
Llama la atencioacuten que en general los resultados de las evaluaciones
realizadas del preparado liacutequido muestran gran variabilidad en los resultados
Esto podriacutea ser debido a que las esporas tienden a depositarse en el fondo y
aunque el recipiente era bien agitado posiblemente no se lograba una total
homogeneidad
Respecto a los resultados obtenidos debe considerarse que auacuten siendo
descensos significativos (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten en
ninguacuten caso el descenso afectoacute a la potencia (107) que representa la densidad
de UFC de los preparados microbianos evaluados Asiacute mismo es importante
resentildear que en su evaluacioacuten inicial los preparados no mostraron valores del
orden de 108 UFCml-1 o g-1 como indicaban las etiquetas comerciales tan solo
el preparado soacutelido presentoacute valores bastante cercanos a los indicados
Porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su coacutemputo directo al
microscopio
Es comuacuten que las etiquetas indiquen una concentracioacuten de inoacuteculo pero
no se especifica si ese inoacuteculo se ha valorado como viable o simplemente por
conteo de esporas El siguiente ensayo trataba de conocer si hay una
correlacioacuten entre el nuacutemero de esporas en el formulado y el nuacutemero de esporas
viables (UFC) Al respecto el estudio del porcentaje de germinacioacuten de esporas
de Trichoderma sp en relacioacuten con su coacutemputo directo al microscopio en los
dos preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a
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las diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 3 y 4)
En el caso del preparado soacutelido el descenso de viabilidad de las
esporas es progresivo en el tiempo para ambas temperaturas de conservacioacuten
siendo este maacutes acusado cuando el preparado es conservado a temperatura
ambiente En este caso los resultados reflejan diferencias significativas y
continuadas en el tiempo entre las dos temperaturas de conservacioacuten a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 3) Es especialmente llamativo que en
ninguacuten caso se produce una germinacioacuten de esporas superior al 40 este
resultado muestra que en los anaacutelisis realizados durante el periodo de
conservacioacuten maacutes del 60 de las esporas presentes en el preparado soacutelido no
fueron viables
Asiacute mismo en el preparado liacutequido tambieacuten se aprecioacute un descenso
progresivo en la viabilidad de las esporas en funcioacuten del tiempo para ambas
temperaturas de conservacioacuten y al igual que el preparado soacutelido el descenso
fue maacutes acusado durante la conservacioacuten a temperatura ambiente En este
caso en general los resultados de las evaluaciones realizadas del preparado
liacutequido muestran gran variabilidad y es a partir de los 168 diacuteas de conservacioacuten
cuando al comparar ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias
fueron significativas (ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 4) Hay que
destacar que en estas evaluaciones el preparado liacutequido mostroacute valores
superiores al 100 lo que indica mayor nuacutemero de UFC que esporas contadas
en el hematociacutemetro Una explicacioacuten posible seriacutea que el preparado liacutequido no
soacutelo presenta esporas de Trichoderma sp como estructuras de germinacioacuten o
propaacutegulos sino que tambieacuten presenta otras estructuras capaces de germinar
en el medio de cultivo empleado en el ensayo tales como clamidosporas yo
fracciones de micelio o hifas del hongo Probablemente en la elaboracioacuten del
preparado liacutequido se emplean mecanismos no selectivos de esporas y se
produce el desprendimiento de otros tipos de estructuras yo propaacutegulos
Siguiendo la dinaacutemica de nuestros resultados Cejas et al (2000)
concluyen que los formulados a base de Trichoderma sp se conservan mejor a
bajas temperaturas y recomiendan almacenar los cultivos liacutequidos de
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Tharzianum con 1 de aacutecido soacuterbico y 1 de alumbre a temperaturas de
12ordmC Esto es debido a que despueacutes de cuatro meses de conservacioacuten el
porcentaje de germinacioacuten fue muy bajo cuando se almacenoacute a 26ordmC (inferior al
3) obteniendo mejores resultados cuando el producto fue almacenado a
12ordmC Asiacute mismo Lewis et al (1987) obtuvieron resultados anaacutelogos para la
conservacioacuten en caacutepsulas de alginato Este estudio evaluoacute la conservacioacuten de
tres cepas diferentes de Trichoderma tras 24 semanas almacenadas a 5 y
25ordmC Estos se conservaron mejor a bajas temperaturas (5ordmC) ya que a 25ordmC el
nuacutemero de UFC representaba menos del 5 sobre el nuacutemero de esporas
totales Otro estudio (Kuumlccediluumlk y Kıvanccedil 2005) muestra resultados en los que el
descenso en la viabilidad de las esporas parece ser maacutes acusado en
preparados soacutelidos mostrando que cuando T harzianum se almacenoacute en
graacutenulos a 30degC durante 24 semanas mostroacute menos del 1 de viabilidad Del
mismo modo Roussos et al (1989) en el estudio de diferentes teacutecnicas de
conservacioacuten (secado congelacioacuten y refrigeracioacuten) de Tharzianum concluyen
que la teacutecnica de refrigeracioacuten a 4ordmC mantiene las conidiosporas con un
porcentaje de viabilidad del 85-95 por un periodo de dos meses
CONCLUSIONES
Las conclusiones se han elaborado de manera concisa tratando de
mostrar las dificultades que entrantildea la ldquotipificacioacutenrdquo de preparados microbianos
para su comercializacioacuten
1- Los preparados comerciales estudiados se conservan mejor a bajas
temperaturas (5ordmC) independientemente de tratarse de un preparado soacutelido o
liacutequido
2- El descenso en la viabilidad de las esporas es maacutes acusado en el
preparado soacutelido que en el preparado liacutequido Debe considerarse que en
ninguacuten caso el descenso afecta a la potencia (107) que representa la densidad
de propaacutegulos iniciales aunque las etiquetas indicaban 108 UFC∙g-1 o ml-1
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ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
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Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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INTRODUCCIOacuteN
La homologacioacuten en los paiacuteses industrializados es un obstaacuteculo para la
comercializacioacuten de biopesticidas teacutermino que incluye a todos aquellos
fitosanitarios no obtenidos mediante siacutentesis quiacutemica industrial (De Lintildeaacuten
2013) En este sentido la directiva de la Unioacuten Europea 91414CEE establece
un procedimiento que es muy exigente previsto fundamentalmente para
fitosanitarios de siacutentesis conformados habitualmente por una materia activa
con una composicioacuten uniforme Al respecto estos procedimientos son
considerados no oacuteptimos para la evaluacioacuten y registro de biopesticidas lo que
ha incitado la buacutesqueda de viacuteas alternativas que faciliten el proceso (Sundh y
Goettel 2013) Aparecen entonces los bioestimulantes que algunos autores
definen como sustancias que ldquomodifican el metabolismo vegetal secundario de
ciertas partes de las plantas lo que les permite resistir bien al estreacutes abioacutetico o
al parasitismo de algunos bio-agresores o bien modifican el metabolismo de
los microorganismos del suelo inducieacutendolos a producir metabolitos
particulares que favorecen la nutricioacuten mineral de las plantasrdquo Esta definicioacuten
engloba a la vez elicitores y fertilizantes (bioestimulantes y biofertilizantes)
Asiacute este enfoque particular parece dispensar a preparados microbioloacutegicos de
su homologacioacuten como productos fitosanitarios (Tello et al 2011)
El mercado de biopesticidas ha crecido desde finales del siglo XX y se
estima un crecimiento anual comprendido entre el 10-16 en contraste con el
decrecimiento del mercado de pesticidas de siacutentesis estimado en -15 anual
(Marrone 2007 Bailey et al 2010) Igualmente se conoce que a principios del
siglo XXI aproximadamente el 90 de los micoplaguicidas empleados en el
control de microorganismos fitopatoacutegenos incluiacutean en su formulacioacuten hongos
del geacutenero Trichoderma (Lorito 2006) Trichoderma es un habitante natural del
suelo y sus especies forman parte de un grupo complejo de hongos
filamentosos clasificados como Ascomicetos pertenecientes al orden
Hipocreales Al respecto son numerosas las especies empleadas para el
biocontrol de patoacutegenos del suelo y a las que se le atribuyen tambieacuten
cualidades bioestimulantes y biofertilizantes (Papavizas 1985 Windham et al
1986 Ousley et al 1994 Beniacutetez et al 2004 Harman et al 2004 Infante et
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al 2009 Schuster y Schmoll 2010) Se reproduce clonalmente mediante un
ciclo de vida asexual en el que se alterna micelio y esporas principalmente y
en determinadas condiciones produce clamidosporas que son estructuras de
resistencia que le permite perdurar a traveacutes del tiempo (Lewis y Papavizas
1984) Las esporas son los propaacutegulos maacutes viables empleados en programas
de biocontrol con Trichoderma y por tanto la principal forma de produccioacuten
comercial La biomasa de esporas puede ser obtenida por medio de cultivos
sumergidos y cultivos en sustratos soacutelidos (Lewis y Papavizas 1983 Elad et
al 1993 Elad y Kirshner 1993)
En la actualidad de acuerdo con los datos del Ministerio de Agricultura
Alimentacioacuten y Medio Ambiente (MAGRAMA 2013) los formulados de
Trichoderma registrados como productos fitosanitarios son comercializados
como polvo mojable y granulado dispersable en agua Otros productos
comerciales que tambieacuten incluyen Trichoderma sp en su composicioacuten no
registrados como fitosanitarios se presentan en forma de polvo seco
formulaciones liacutequidas en aceite asiacute como encapsulados que contienen el
hongo
Las deficiencias en las tecnologiacuteas de formulacioacuten conservacioacuten y
aplicacioacuten suponen una limitacioacuten Es por ello que con el objetivo de obtener
preparados fuacutengicos de alta calidad que den fiabilidad de uso se hace
necesario el mantenimiento y conservacioacuten de sus propiedades en el tiempo
Esto tiene primordial importancia para garantizar la densidad de poblacioacuten
presente en los preparados comerciales asiacute como las caracteriacutesticas originales
de las cepas de produccioacuten de forma que pueda disponerse de un clon del
microorganismo con su estabilidad geneacutetica y fenotiacutepica establecida Por ello
para obtener el producto final con una prolongada vida en estante es necesario
conocer la formulacioacuten asiacute como establecer las condiciones adecuadas de
almacenamiento donde la humedad y la temperatura son los principales
paraacutemetros que afectan a la estabilidad de biopesticidas de origen microbiano
(Jenkins y Grzywacz 2003) Al respecto hay en general deficiencias de
bibliografiacutea que se cifran en aspectos como la preparacioacuten del antagonista
(medios de cultivo etc) y sobre su conservacioacuten (tiempo condiciones etc) En
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consecuencia este trabajo que surge del campo empresarial almeriense trata
de evaluar parte de estos aspectos y asiacute continuar indagando en lo que se
discute en el trabajo de Tello et al (2011) titulado ldquoReflexiones sobre algunos
preparados microbianos comerciales utilizados para el control de insectos y
hongos paraacutesitos de los cultivosrdquo
OBJETIVOS
El objetivo de este trabajo consiste en evaluar la densidad de poblacioacuten
y conservacioacuten en el tiempo de Trichoderma sp en dos preparados
comerciales uno soacutelido y otro liacutequido almacenados durante un periodo de seis
meses a diferentes temperaturas Asiacute mismo se evaluacutea el porcentaje de
germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su coacutemputo directo al microscopio
MATERIAL Y MEacuteTODOS
Preparados microbianos
Las evaluaciones se realizaron en dos preparados comerciales
Soacutelido preparado comercial en forma de graacutenulos dispersables
Compuesto seguacuten etiqueta comercial por las cepas Trichoderma sp
(A) (1 x 108 ufcg) y Trichoderma sp (B) (1 x 108 ufcg)
Liacutequido preparado comercial liacutequido Compuesto seguacuten etiqueta
comercial por una cepa de Trichoderma sp (1 x 108 ufcml)
Temperaturas y periodo de conservacioacuten
Los preparados comerciales se conservaron en recipientes opacos de 1
L de volumen a dos temperaturas diferentes Temperatura ambiente y 5ordmC El
periodo de conservacioacuten contemplado fue de 6 meses
Evaluacioacuten de la densidad de poblacioacuten
Durante los 6 meses que abarcoacute el trabajo se realizaron anaacutelisis
quincenales para evaluar la densidad de poblacioacuten de Trichoderma sp en los
dos productos comerciales conservados a las diferentes temperaturas Esta
evaluacioacuten estaacute referida al nuacutemero de esporas viables Para ello se empleoacute la
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teacutecnica de las diluciones sucesivas (Tello et al 1991) El medio de cultivo
empleado fue Agar-Malta acidificado (aacutecido ciacutetrico al 025) Se realizaron 10
repeticiones (placas de Petri) por cada dilucioacuten Las diluciones estudiadas en
cada anaacutelisis fueron aquellas que en el anaacutelisis anterior mostraban la maacutexima
concentracioacuten asiacute como las dos diluciones inmediatamente maacutes concentradas
La incubacioacuten se realizoacute en el laboratorio a temperatura ambiente durante 2-5
diacuteas Transcurrido el tiempo indicado se procedioacute al conteo de las Unidades
Formadoras de Colonias (UFC) totales presentes en cada repeticioacuten
Recuento de conidias al microscopio
En todos los anaacutelisis realizados se procedioacute al recuento de conidias
presentes en las diluciones evaluadas Este procedimiento fue realizado
utilizando las diluciones preparadas para determinar la densidad de poblacioacuten
(contempladas en el apartado anterior) Los recuentos se llevaron a cabo con
caacutemara Neubauer (Brand Germany) Para ello se realizaron 3 recuentos de
cada muestra evaluada Para los recuentos del preparado soacutelido se empleoacute la
dilucioacuten 10-3 puesto que esa concentracioacuten permitiacutea un recuento de conidias
maacutes certero mientras que para el recuento en el preparado liacutequido se utilizoacute la
dilucioacuten 10-2 Finalmente el total de conidias se obtiene a partir de la siguiente
foacutermula
dilucioacutenmmcaacutemaradprofundidammcontadaSuperficie
contadasPartiacuteculasvoluacutemenlporPartiacuteculas
)()( 2
Evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su
coacutemputo directo al microscopio
Esta evaluacioacuten permitioacute establecer la viabilidad del hongo Se realizoacute
durante el periodo de conservacioacuten de 6 meses Los resultados se presentan
como el porcentaje de UFC en relacioacuten con el coacutemputo total de conidias al
microscopio
Anaacutelisis estadiacutestico de los datos
Los anaacutelisis realizados para las comparaciones entre diacuteas de
conservacioacuten consistieron en anaacutelisis de la varianza (ANOVA) simple Los
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meacutetodos empleados para la comparacioacuten de las medias fueron el
procedimiento de las diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD) y
el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD)
ambas al 95 de confianza Para la comparacioacuten de las dos temperaturas de
conservacioacuten (Tordf ambiente y 5ordmC) se realizoacute la prueba t-Student Asiacute mismo los
anaacutelisis estadiacutesticos realizados en la evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten
se han llevado a cabo con los datos obtenidos de la transformacioacuten del
arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1 En
todos los casos contemplados al tratarse de anaacutelisis parameacutetricos se
comprobaron previamente las asunciones de Normalidad y Homocedasticidad
El paquete estadiacutestico usado fue Statgraphic Plus 51 (Manugistic
Incorporated Rockville MD USA) para Windows
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Densidad de poblacioacuten en funcioacuten del tiempo y de la temperatura de
conservacioacuten
El estudio de la densidad de poblacioacuten de Trichoderma sp en los dos
preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a las
diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 1 y 2)
En el caso del preparado soacutelido cuando fue conservado a 5ordmC las diferencias
significativas aparecen entre anaacutelisis intermedios realizados durante el periodo
de conservacioacuten En cambio los resultados finales tras los 6 meses de
conservacioacuten no difieren de los resultados iniciales Sin embargo el preparado
soacutelido conservado a temperatura ambiente muestra un descenso en el nuacutemero
de UFC maacutes acusado mostrando mayores diferencias que son crecientes en
funcioacuten del tiempo Una vez comprobado que la conservacioacuten a temperatura
ambiente provocaba un mayor descenso en el nuacutemero de UFC a lo largo del
tiempo se procedioacute a evaluar a partir de queacute momento estas diferencias eran
significativas (ple005) entre las ambas temperaturas de conservacioacuten Los
resultados reflejan diferencias significativas y continuadas en el tiempo a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 1)
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En el caso del preparado liacutequido cuando fue conservado a 5ordmC auacuten
habiendo diferencias estadiacutesticamente significativas el test de diferencias
honestamente significativas de Tukey (HSD) no mostroacute diferencias en funcioacuten
del tiempo de conservacioacuten Sin embargo el preparado liacutequido conservado a
temperatura ambiente muestra un mayor descenso de UFC siendo en
comparacioacuten con el valor inicial significativo y continuado a partir de los 168
diacuteas de conservacioacuten Es a partir de la misma fecha cuando al comparar
ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias fueron significativas
(ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 2)
Llama la atencioacuten que en general los resultados de las evaluaciones
realizadas del preparado liacutequido muestran gran variabilidad en los resultados
Esto podriacutea ser debido a que las esporas tienden a depositarse en el fondo y
aunque el recipiente era bien agitado posiblemente no se lograba una total
homogeneidad
Respecto a los resultados obtenidos debe considerarse que auacuten siendo
descensos significativos (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten en
ninguacuten caso el descenso afectoacute a la potencia (107) que representa la densidad
de UFC de los preparados microbianos evaluados Asiacute mismo es importante
resentildear que en su evaluacioacuten inicial los preparados no mostraron valores del
orden de 108 UFCml-1 o g-1 como indicaban las etiquetas comerciales tan solo
el preparado soacutelido presentoacute valores bastante cercanos a los indicados
Porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su coacutemputo directo al
microscopio
Es comuacuten que las etiquetas indiquen una concentracioacuten de inoacuteculo pero
no se especifica si ese inoacuteculo se ha valorado como viable o simplemente por
conteo de esporas El siguiente ensayo trataba de conocer si hay una
correlacioacuten entre el nuacutemero de esporas en el formulado y el nuacutemero de esporas
viables (UFC) Al respecto el estudio del porcentaje de germinacioacuten de esporas
de Trichoderma sp en relacioacuten con su coacutemputo directo al microscopio en los
dos preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a
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las diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 3 y 4)
En el caso del preparado soacutelido el descenso de viabilidad de las
esporas es progresivo en el tiempo para ambas temperaturas de conservacioacuten
siendo este maacutes acusado cuando el preparado es conservado a temperatura
ambiente En este caso los resultados reflejan diferencias significativas y
continuadas en el tiempo entre las dos temperaturas de conservacioacuten a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 3) Es especialmente llamativo que en
ninguacuten caso se produce una germinacioacuten de esporas superior al 40 este
resultado muestra que en los anaacutelisis realizados durante el periodo de
conservacioacuten maacutes del 60 de las esporas presentes en el preparado soacutelido no
fueron viables
Asiacute mismo en el preparado liacutequido tambieacuten se aprecioacute un descenso
progresivo en la viabilidad de las esporas en funcioacuten del tiempo para ambas
temperaturas de conservacioacuten y al igual que el preparado soacutelido el descenso
fue maacutes acusado durante la conservacioacuten a temperatura ambiente En este
caso en general los resultados de las evaluaciones realizadas del preparado
liacutequido muestran gran variabilidad y es a partir de los 168 diacuteas de conservacioacuten
cuando al comparar ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias
fueron significativas (ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 4) Hay que
destacar que en estas evaluaciones el preparado liacutequido mostroacute valores
superiores al 100 lo que indica mayor nuacutemero de UFC que esporas contadas
en el hematociacutemetro Una explicacioacuten posible seriacutea que el preparado liacutequido no
soacutelo presenta esporas de Trichoderma sp como estructuras de germinacioacuten o
propaacutegulos sino que tambieacuten presenta otras estructuras capaces de germinar
en el medio de cultivo empleado en el ensayo tales como clamidosporas yo
fracciones de micelio o hifas del hongo Probablemente en la elaboracioacuten del
preparado liacutequido se emplean mecanismos no selectivos de esporas y se
produce el desprendimiento de otros tipos de estructuras yo propaacutegulos
Siguiendo la dinaacutemica de nuestros resultados Cejas et al (2000)
concluyen que los formulados a base de Trichoderma sp se conservan mejor a
bajas temperaturas y recomiendan almacenar los cultivos liacutequidos de
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Tharzianum con 1 de aacutecido soacuterbico y 1 de alumbre a temperaturas de
12ordmC Esto es debido a que despueacutes de cuatro meses de conservacioacuten el
porcentaje de germinacioacuten fue muy bajo cuando se almacenoacute a 26ordmC (inferior al
3) obteniendo mejores resultados cuando el producto fue almacenado a
12ordmC Asiacute mismo Lewis et al (1987) obtuvieron resultados anaacutelogos para la
conservacioacuten en caacutepsulas de alginato Este estudio evaluoacute la conservacioacuten de
tres cepas diferentes de Trichoderma tras 24 semanas almacenadas a 5 y
25ordmC Estos se conservaron mejor a bajas temperaturas (5ordmC) ya que a 25ordmC el
nuacutemero de UFC representaba menos del 5 sobre el nuacutemero de esporas
totales Otro estudio (Kuumlccediluumlk y Kıvanccedil 2005) muestra resultados en los que el
descenso en la viabilidad de las esporas parece ser maacutes acusado en
preparados soacutelidos mostrando que cuando T harzianum se almacenoacute en
graacutenulos a 30degC durante 24 semanas mostroacute menos del 1 de viabilidad Del
mismo modo Roussos et al (1989) en el estudio de diferentes teacutecnicas de
conservacioacuten (secado congelacioacuten y refrigeracioacuten) de Tharzianum concluyen
que la teacutecnica de refrigeracioacuten a 4ordmC mantiene las conidiosporas con un
porcentaje de viabilidad del 85-95 por un periodo de dos meses
CONCLUSIONES
Las conclusiones se han elaborado de manera concisa tratando de
mostrar las dificultades que entrantildea la ldquotipificacioacutenrdquo de preparados microbianos
para su comercializacioacuten
1- Los preparados comerciales estudiados se conservan mejor a bajas
temperaturas (5ordmC) independientemente de tratarse de un preparado soacutelido o
liacutequido
2- El descenso en la viabilidad de las esporas es maacutes acusado en el
preparado soacutelido que en el preparado liacutequido Debe considerarse que en
ninguacuten caso el descenso afecta a la potencia (107) que representa la densidad
de propaacutegulos iniciales aunque las etiquetas indicaban 108 UFC∙g-1 o ml-1
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Tello JC Palmero D de Cara M Moreno A Ruiacutez C Boix A Garciacutea C Lacasa C Camacho F 2011 Reflexiones sobre algunos preparados microbianos comerciales utilizados para el control de insectos y hongos paraacutesitos de los cultivos Terralia 83 26-37
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ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
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Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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al 2009 Schuster y Schmoll 2010) Se reproduce clonalmente mediante un
ciclo de vida asexual en el que se alterna micelio y esporas principalmente y
en determinadas condiciones produce clamidosporas que son estructuras de
resistencia que le permite perdurar a traveacutes del tiempo (Lewis y Papavizas
1984) Las esporas son los propaacutegulos maacutes viables empleados en programas
de biocontrol con Trichoderma y por tanto la principal forma de produccioacuten
comercial La biomasa de esporas puede ser obtenida por medio de cultivos
sumergidos y cultivos en sustratos soacutelidos (Lewis y Papavizas 1983 Elad et
al 1993 Elad y Kirshner 1993)
En la actualidad de acuerdo con los datos del Ministerio de Agricultura
Alimentacioacuten y Medio Ambiente (MAGRAMA 2013) los formulados de
Trichoderma registrados como productos fitosanitarios son comercializados
como polvo mojable y granulado dispersable en agua Otros productos
comerciales que tambieacuten incluyen Trichoderma sp en su composicioacuten no
registrados como fitosanitarios se presentan en forma de polvo seco
formulaciones liacutequidas en aceite asiacute como encapsulados que contienen el
hongo
Las deficiencias en las tecnologiacuteas de formulacioacuten conservacioacuten y
aplicacioacuten suponen una limitacioacuten Es por ello que con el objetivo de obtener
preparados fuacutengicos de alta calidad que den fiabilidad de uso se hace
necesario el mantenimiento y conservacioacuten de sus propiedades en el tiempo
Esto tiene primordial importancia para garantizar la densidad de poblacioacuten
presente en los preparados comerciales asiacute como las caracteriacutesticas originales
de las cepas de produccioacuten de forma que pueda disponerse de un clon del
microorganismo con su estabilidad geneacutetica y fenotiacutepica establecida Por ello
para obtener el producto final con una prolongada vida en estante es necesario
conocer la formulacioacuten asiacute como establecer las condiciones adecuadas de
almacenamiento donde la humedad y la temperatura son los principales
paraacutemetros que afectan a la estabilidad de biopesticidas de origen microbiano
(Jenkins y Grzywacz 2003) Al respecto hay en general deficiencias de
bibliografiacutea que se cifran en aspectos como la preparacioacuten del antagonista
(medios de cultivo etc) y sobre su conservacioacuten (tiempo condiciones etc) En
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consecuencia este trabajo que surge del campo empresarial almeriense trata
de evaluar parte de estos aspectos y asiacute continuar indagando en lo que se
discute en el trabajo de Tello et al (2011) titulado ldquoReflexiones sobre algunos
preparados microbianos comerciales utilizados para el control de insectos y
hongos paraacutesitos de los cultivosrdquo
OBJETIVOS
El objetivo de este trabajo consiste en evaluar la densidad de poblacioacuten
y conservacioacuten en el tiempo de Trichoderma sp en dos preparados
comerciales uno soacutelido y otro liacutequido almacenados durante un periodo de seis
meses a diferentes temperaturas Asiacute mismo se evaluacutea el porcentaje de
germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su coacutemputo directo al microscopio
MATERIAL Y MEacuteTODOS
Preparados microbianos
Las evaluaciones se realizaron en dos preparados comerciales
Soacutelido preparado comercial en forma de graacutenulos dispersables
Compuesto seguacuten etiqueta comercial por las cepas Trichoderma sp
(A) (1 x 108 ufcg) y Trichoderma sp (B) (1 x 108 ufcg)
Liacutequido preparado comercial liacutequido Compuesto seguacuten etiqueta
comercial por una cepa de Trichoderma sp (1 x 108 ufcml)
Temperaturas y periodo de conservacioacuten
Los preparados comerciales se conservaron en recipientes opacos de 1
L de volumen a dos temperaturas diferentes Temperatura ambiente y 5ordmC El
periodo de conservacioacuten contemplado fue de 6 meses
Evaluacioacuten de la densidad de poblacioacuten
Durante los 6 meses que abarcoacute el trabajo se realizaron anaacutelisis
quincenales para evaluar la densidad de poblacioacuten de Trichoderma sp en los
dos productos comerciales conservados a las diferentes temperaturas Esta
evaluacioacuten estaacute referida al nuacutemero de esporas viables Para ello se empleoacute la
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teacutecnica de las diluciones sucesivas (Tello et al 1991) El medio de cultivo
empleado fue Agar-Malta acidificado (aacutecido ciacutetrico al 025) Se realizaron 10
repeticiones (placas de Petri) por cada dilucioacuten Las diluciones estudiadas en
cada anaacutelisis fueron aquellas que en el anaacutelisis anterior mostraban la maacutexima
concentracioacuten asiacute como las dos diluciones inmediatamente maacutes concentradas
La incubacioacuten se realizoacute en el laboratorio a temperatura ambiente durante 2-5
diacuteas Transcurrido el tiempo indicado se procedioacute al conteo de las Unidades
Formadoras de Colonias (UFC) totales presentes en cada repeticioacuten
Recuento de conidias al microscopio
En todos los anaacutelisis realizados se procedioacute al recuento de conidias
presentes en las diluciones evaluadas Este procedimiento fue realizado
utilizando las diluciones preparadas para determinar la densidad de poblacioacuten
(contempladas en el apartado anterior) Los recuentos se llevaron a cabo con
caacutemara Neubauer (Brand Germany) Para ello se realizaron 3 recuentos de
cada muestra evaluada Para los recuentos del preparado soacutelido se empleoacute la
dilucioacuten 10-3 puesto que esa concentracioacuten permitiacutea un recuento de conidias
maacutes certero mientras que para el recuento en el preparado liacutequido se utilizoacute la
dilucioacuten 10-2 Finalmente el total de conidias se obtiene a partir de la siguiente
foacutermula
dilucioacutenmmcaacutemaradprofundidammcontadaSuperficie
contadasPartiacuteculasvoluacutemenlporPartiacuteculas
)()( 2
Evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su
coacutemputo directo al microscopio
Esta evaluacioacuten permitioacute establecer la viabilidad del hongo Se realizoacute
durante el periodo de conservacioacuten de 6 meses Los resultados se presentan
como el porcentaje de UFC en relacioacuten con el coacutemputo total de conidias al
microscopio
Anaacutelisis estadiacutestico de los datos
Los anaacutelisis realizados para las comparaciones entre diacuteas de
conservacioacuten consistieron en anaacutelisis de la varianza (ANOVA) simple Los
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meacutetodos empleados para la comparacioacuten de las medias fueron el
procedimiento de las diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD) y
el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD)
ambas al 95 de confianza Para la comparacioacuten de las dos temperaturas de
conservacioacuten (Tordf ambiente y 5ordmC) se realizoacute la prueba t-Student Asiacute mismo los
anaacutelisis estadiacutesticos realizados en la evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten
se han llevado a cabo con los datos obtenidos de la transformacioacuten del
arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1 En
todos los casos contemplados al tratarse de anaacutelisis parameacutetricos se
comprobaron previamente las asunciones de Normalidad y Homocedasticidad
El paquete estadiacutestico usado fue Statgraphic Plus 51 (Manugistic
Incorporated Rockville MD USA) para Windows
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Densidad de poblacioacuten en funcioacuten del tiempo y de la temperatura de
conservacioacuten
El estudio de la densidad de poblacioacuten de Trichoderma sp en los dos
preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a las
diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 1 y 2)
En el caso del preparado soacutelido cuando fue conservado a 5ordmC las diferencias
significativas aparecen entre anaacutelisis intermedios realizados durante el periodo
de conservacioacuten En cambio los resultados finales tras los 6 meses de
conservacioacuten no difieren de los resultados iniciales Sin embargo el preparado
soacutelido conservado a temperatura ambiente muestra un descenso en el nuacutemero
de UFC maacutes acusado mostrando mayores diferencias que son crecientes en
funcioacuten del tiempo Una vez comprobado que la conservacioacuten a temperatura
ambiente provocaba un mayor descenso en el nuacutemero de UFC a lo largo del
tiempo se procedioacute a evaluar a partir de queacute momento estas diferencias eran
significativas (ple005) entre las ambas temperaturas de conservacioacuten Los
resultados reflejan diferencias significativas y continuadas en el tiempo a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 1)
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En el caso del preparado liacutequido cuando fue conservado a 5ordmC auacuten
habiendo diferencias estadiacutesticamente significativas el test de diferencias
honestamente significativas de Tukey (HSD) no mostroacute diferencias en funcioacuten
del tiempo de conservacioacuten Sin embargo el preparado liacutequido conservado a
temperatura ambiente muestra un mayor descenso de UFC siendo en
comparacioacuten con el valor inicial significativo y continuado a partir de los 168
diacuteas de conservacioacuten Es a partir de la misma fecha cuando al comparar
ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias fueron significativas
(ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 2)
Llama la atencioacuten que en general los resultados de las evaluaciones
realizadas del preparado liacutequido muestran gran variabilidad en los resultados
Esto podriacutea ser debido a que las esporas tienden a depositarse en el fondo y
aunque el recipiente era bien agitado posiblemente no se lograba una total
homogeneidad
Respecto a los resultados obtenidos debe considerarse que auacuten siendo
descensos significativos (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten en
ninguacuten caso el descenso afectoacute a la potencia (107) que representa la densidad
de UFC de los preparados microbianos evaluados Asiacute mismo es importante
resentildear que en su evaluacioacuten inicial los preparados no mostraron valores del
orden de 108 UFCml-1 o g-1 como indicaban las etiquetas comerciales tan solo
el preparado soacutelido presentoacute valores bastante cercanos a los indicados
Porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su coacutemputo directo al
microscopio
Es comuacuten que las etiquetas indiquen una concentracioacuten de inoacuteculo pero
no se especifica si ese inoacuteculo se ha valorado como viable o simplemente por
conteo de esporas El siguiente ensayo trataba de conocer si hay una
correlacioacuten entre el nuacutemero de esporas en el formulado y el nuacutemero de esporas
viables (UFC) Al respecto el estudio del porcentaje de germinacioacuten de esporas
de Trichoderma sp en relacioacuten con su coacutemputo directo al microscopio en los
dos preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a
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las diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 3 y 4)
En el caso del preparado soacutelido el descenso de viabilidad de las
esporas es progresivo en el tiempo para ambas temperaturas de conservacioacuten
siendo este maacutes acusado cuando el preparado es conservado a temperatura
ambiente En este caso los resultados reflejan diferencias significativas y
continuadas en el tiempo entre las dos temperaturas de conservacioacuten a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 3) Es especialmente llamativo que en
ninguacuten caso se produce una germinacioacuten de esporas superior al 40 este
resultado muestra que en los anaacutelisis realizados durante el periodo de
conservacioacuten maacutes del 60 de las esporas presentes en el preparado soacutelido no
fueron viables
Asiacute mismo en el preparado liacutequido tambieacuten se aprecioacute un descenso
progresivo en la viabilidad de las esporas en funcioacuten del tiempo para ambas
temperaturas de conservacioacuten y al igual que el preparado soacutelido el descenso
fue maacutes acusado durante la conservacioacuten a temperatura ambiente En este
caso en general los resultados de las evaluaciones realizadas del preparado
liacutequido muestran gran variabilidad y es a partir de los 168 diacuteas de conservacioacuten
cuando al comparar ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias
fueron significativas (ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 4) Hay que
destacar que en estas evaluaciones el preparado liacutequido mostroacute valores
superiores al 100 lo que indica mayor nuacutemero de UFC que esporas contadas
en el hematociacutemetro Una explicacioacuten posible seriacutea que el preparado liacutequido no
soacutelo presenta esporas de Trichoderma sp como estructuras de germinacioacuten o
propaacutegulos sino que tambieacuten presenta otras estructuras capaces de germinar
en el medio de cultivo empleado en el ensayo tales como clamidosporas yo
fracciones de micelio o hifas del hongo Probablemente en la elaboracioacuten del
preparado liacutequido se emplean mecanismos no selectivos de esporas y se
produce el desprendimiento de otros tipos de estructuras yo propaacutegulos
Siguiendo la dinaacutemica de nuestros resultados Cejas et al (2000)
concluyen que los formulados a base de Trichoderma sp se conservan mejor a
bajas temperaturas y recomiendan almacenar los cultivos liacutequidos de
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Tharzianum con 1 de aacutecido soacuterbico y 1 de alumbre a temperaturas de
12ordmC Esto es debido a que despueacutes de cuatro meses de conservacioacuten el
porcentaje de germinacioacuten fue muy bajo cuando se almacenoacute a 26ordmC (inferior al
3) obteniendo mejores resultados cuando el producto fue almacenado a
12ordmC Asiacute mismo Lewis et al (1987) obtuvieron resultados anaacutelogos para la
conservacioacuten en caacutepsulas de alginato Este estudio evaluoacute la conservacioacuten de
tres cepas diferentes de Trichoderma tras 24 semanas almacenadas a 5 y
25ordmC Estos se conservaron mejor a bajas temperaturas (5ordmC) ya que a 25ordmC el
nuacutemero de UFC representaba menos del 5 sobre el nuacutemero de esporas
totales Otro estudio (Kuumlccediluumlk y Kıvanccedil 2005) muestra resultados en los que el
descenso en la viabilidad de las esporas parece ser maacutes acusado en
preparados soacutelidos mostrando que cuando T harzianum se almacenoacute en
graacutenulos a 30degC durante 24 semanas mostroacute menos del 1 de viabilidad Del
mismo modo Roussos et al (1989) en el estudio de diferentes teacutecnicas de
conservacioacuten (secado congelacioacuten y refrigeracioacuten) de Tharzianum concluyen
que la teacutecnica de refrigeracioacuten a 4ordmC mantiene las conidiosporas con un
porcentaje de viabilidad del 85-95 por un periodo de dos meses
CONCLUSIONES
Las conclusiones se han elaborado de manera concisa tratando de
mostrar las dificultades que entrantildea la ldquotipificacioacutenrdquo de preparados microbianos
para su comercializacioacuten
1- Los preparados comerciales estudiados se conservan mejor a bajas
temperaturas (5ordmC) independientemente de tratarse de un preparado soacutelido o
liacutequido
2- El descenso en la viabilidad de las esporas es maacutes acusado en el
preparado soacutelido que en el preparado liacutequido Debe considerarse que en
ninguacuten caso el descenso afecta a la potencia (107) que representa la densidad
de propaacutegulos iniciales aunque las etiquetas indicaban 108 UFC∙g-1 o ml-1
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REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
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Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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consecuencia este trabajo que surge del campo empresarial almeriense trata
de evaluar parte de estos aspectos y asiacute continuar indagando en lo que se
discute en el trabajo de Tello et al (2011) titulado ldquoReflexiones sobre algunos
preparados microbianos comerciales utilizados para el control de insectos y
hongos paraacutesitos de los cultivosrdquo
OBJETIVOS
El objetivo de este trabajo consiste en evaluar la densidad de poblacioacuten
y conservacioacuten en el tiempo de Trichoderma sp en dos preparados
comerciales uno soacutelido y otro liacutequido almacenados durante un periodo de seis
meses a diferentes temperaturas Asiacute mismo se evaluacutea el porcentaje de
germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su coacutemputo directo al microscopio
MATERIAL Y MEacuteTODOS
Preparados microbianos
Las evaluaciones se realizaron en dos preparados comerciales
Soacutelido preparado comercial en forma de graacutenulos dispersables
Compuesto seguacuten etiqueta comercial por las cepas Trichoderma sp
(A) (1 x 108 ufcg) y Trichoderma sp (B) (1 x 108 ufcg)
Liacutequido preparado comercial liacutequido Compuesto seguacuten etiqueta
comercial por una cepa de Trichoderma sp (1 x 108 ufcml)
Temperaturas y periodo de conservacioacuten
Los preparados comerciales se conservaron en recipientes opacos de 1
L de volumen a dos temperaturas diferentes Temperatura ambiente y 5ordmC El
periodo de conservacioacuten contemplado fue de 6 meses
Evaluacioacuten de la densidad de poblacioacuten
Durante los 6 meses que abarcoacute el trabajo se realizaron anaacutelisis
quincenales para evaluar la densidad de poblacioacuten de Trichoderma sp en los
dos productos comerciales conservados a las diferentes temperaturas Esta
evaluacioacuten estaacute referida al nuacutemero de esporas viables Para ello se empleoacute la
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teacutecnica de las diluciones sucesivas (Tello et al 1991) El medio de cultivo
empleado fue Agar-Malta acidificado (aacutecido ciacutetrico al 025) Se realizaron 10
repeticiones (placas de Petri) por cada dilucioacuten Las diluciones estudiadas en
cada anaacutelisis fueron aquellas que en el anaacutelisis anterior mostraban la maacutexima
concentracioacuten asiacute como las dos diluciones inmediatamente maacutes concentradas
La incubacioacuten se realizoacute en el laboratorio a temperatura ambiente durante 2-5
diacuteas Transcurrido el tiempo indicado se procedioacute al conteo de las Unidades
Formadoras de Colonias (UFC) totales presentes en cada repeticioacuten
Recuento de conidias al microscopio
En todos los anaacutelisis realizados se procedioacute al recuento de conidias
presentes en las diluciones evaluadas Este procedimiento fue realizado
utilizando las diluciones preparadas para determinar la densidad de poblacioacuten
(contempladas en el apartado anterior) Los recuentos se llevaron a cabo con
caacutemara Neubauer (Brand Germany) Para ello se realizaron 3 recuentos de
cada muestra evaluada Para los recuentos del preparado soacutelido se empleoacute la
dilucioacuten 10-3 puesto que esa concentracioacuten permitiacutea un recuento de conidias
maacutes certero mientras que para el recuento en el preparado liacutequido se utilizoacute la
dilucioacuten 10-2 Finalmente el total de conidias se obtiene a partir de la siguiente
foacutermula
dilucioacutenmmcaacutemaradprofundidammcontadaSuperficie
contadasPartiacuteculasvoluacutemenlporPartiacuteculas
)()( 2
Evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su
coacutemputo directo al microscopio
Esta evaluacioacuten permitioacute establecer la viabilidad del hongo Se realizoacute
durante el periodo de conservacioacuten de 6 meses Los resultados se presentan
como el porcentaje de UFC en relacioacuten con el coacutemputo total de conidias al
microscopio
Anaacutelisis estadiacutestico de los datos
Los anaacutelisis realizados para las comparaciones entre diacuteas de
conservacioacuten consistieron en anaacutelisis de la varianza (ANOVA) simple Los
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meacutetodos empleados para la comparacioacuten de las medias fueron el
procedimiento de las diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD) y
el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD)
ambas al 95 de confianza Para la comparacioacuten de las dos temperaturas de
conservacioacuten (Tordf ambiente y 5ordmC) se realizoacute la prueba t-Student Asiacute mismo los
anaacutelisis estadiacutesticos realizados en la evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten
se han llevado a cabo con los datos obtenidos de la transformacioacuten del
arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1 En
todos los casos contemplados al tratarse de anaacutelisis parameacutetricos se
comprobaron previamente las asunciones de Normalidad y Homocedasticidad
El paquete estadiacutestico usado fue Statgraphic Plus 51 (Manugistic
Incorporated Rockville MD USA) para Windows
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Densidad de poblacioacuten en funcioacuten del tiempo y de la temperatura de
conservacioacuten
El estudio de la densidad de poblacioacuten de Trichoderma sp en los dos
preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a las
diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 1 y 2)
En el caso del preparado soacutelido cuando fue conservado a 5ordmC las diferencias
significativas aparecen entre anaacutelisis intermedios realizados durante el periodo
de conservacioacuten En cambio los resultados finales tras los 6 meses de
conservacioacuten no difieren de los resultados iniciales Sin embargo el preparado
soacutelido conservado a temperatura ambiente muestra un descenso en el nuacutemero
de UFC maacutes acusado mostrando mayores diferencias que son crecientes en
funcioacuten del tiempo Una vez comprobado que la conservacioacuten a temperatura
ambiente provocaba un mayor descenso en el nuacutemero de UFC a lo largo del
tiempo se procedioacute a evaluar a partir de queacute momento estas diferencias eran
significativas (ple005) entre las ambas temperaturas de conservacioacuten Los
resultados reflejan diferencias significativas y continuadas en el tiempo a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 1)
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En el caso del preparado liacutequido cuando fue conservado a 5ordmC auacuten
habiendo diferencias estadiacutesticamente significativas el test de diferencias
honestamente significativas de Tukey (HSD) no mostroacute diferencias en funcioacuten
del tiempo de conservacioacuten Sin embargo el preparado liacutequido conservado a
temperatura ambiente muestra un mayor descenso de UFC siendo en
comparacioacuten con el valor inicial significativo y continuado a partir de los 168
diacuteas de conservacioacuten Es a partir de la misma fecha cuando al comparar
ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias fueron significativas
(ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 2)
Llama la atencioacuten que en general los resultados de las evaluaciones
realizadas del preparado liacutequido muestran gran variabilidad en los resultados
Esto podriacutea ser debido a que las esporas tienden a depositarse en el fondo y
aunque el recipiente era bien agitado posiblemente no se lograba una total
homogeneidad
Respecto a los resultados obtenidos debe considerarse que auacuten siendo
descensos significativos (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten en
ninguacuten caso el descenso afectoacute a la potencia (107) que representa la densidad
de UFC de los preparados microbianos evaluados Asiacute mismo es importante
resentildear que en su evaluacioacuten inicial los preparados no mostraron valores del
orden de 108 UFCml-1 o g-1 como indicaban las etiquetas comerciales tan solo
el preparado soacutelido presentoacute valores bastante cercanos a los indicados
Porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su coacutemputo directo al
microscopio
Es comuacuten que las etiquetas indiquen una concentracioacuten de inoacuteculo pero
no se especifica si ese inoacuteculo se ha valorado como viable o simplemente por
conteo de esporas El siguiente ensayo trataba de conocer si hay una
correlacioacuten entre el nuacutemero de esporas en el formulado y el nuacutemero de esporas
viables (UFC) Al respecto el estudio del porcentaje de germinacioacuten de esporas
de Trichoderma sp en relacioacuten con su coacutemputo directo al microscopio en los
dos preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a
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las diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 3 y 4)
En el caso del preparado soacutelido el descenso de viabilidad de las
esporas es progresivo en el tiempo para ambas temperaturas de conservacioacuten
siendo este maacutes acusado cuando el preparado es conservado a temperatura
ambiente En este caso los resultados reflejan diferencias significativas y
continuadas en el tiempo entre las dos temperaturas de conservacioacuten a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 3) Es especialmente llamativo que en
ninguacuten caso se produce una germinacioacuten de esporas superior al 40 este
resultado muestra que en los anaacutelisis realizados durante el periodo de
conservacioacuten maacutes del 60 de las esporas presentes en el preparado soacutelido no
fueron viables
Asiacute mismo en el preparado liacutequido tambieacuten se aprecioacute un descenso
progresivo en la viabilidad de las esporas en funcioacuten del tiempo para ambas
temperaturas de conservacioacuten y al igual que el preparado soacutelido el descenso
fue maacutes acusado durante la conservacioacuten a temperatura ambiente En este
caso en general los resultados de las evaluaciones realizadas del preparado
liacutequido muestran gran variabilidad y es a partir de los 168 diacuteas de conservacioacuten
cuando al comparar ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias
fueron significativas (ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 4) Hay que
destacar que en estas evaluaciones el preparado liacutequido mostroacute valores
superiores al 100 lo que indica mayor nuacutemero de UFC que esporas contadas
en el hematociacutemetro Una explicacioacuten posible seriacutea que el preparado liacutequido no
soacutelo presenta esporas de Trichoderma sp como estructuras de germinacioacuten o
propaacutegulos sino que tambieacuten presenta otras estructuras capaces de germinar
en el medio de cultivo empleado en el ensayo tales como clamidosporas yo
fracciones de micelio o hifas del hongo Probablemente en la elaboracioacuten del
preparado liacutequido se emplean mecanismos no selectivos de esporas y se
produce el desprendimiento de otros tipos de estructuras yo propaacutegulos
Siguiendo la dinaacutemica de nuestros resultados Cejas et al (2000)
concluyen que los formulados a base de Trichoderma sp se conservan mejor a
bajas temperaturas y recomiendan almacenar los cultivos liacutequidos de
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Tharzianum con 1 de aacutecido soacuterbico y 1 de alumbre a temperaturas de
12ordmC Esto es debido a que despueacutes de cuatro meses de conservacioacuten el
porcentaje de germinacioacuten fue muy bajo cuando se almacenoacute a 26ordmC (inferior al
3) obteniendo mejores resultados cuando el producto fue almacenado a
12ordmC Asiacute mismo Lewis et al (1987) obtuvieron resultados anaacutelogos para la
conservacioacuten en caacutepsulas de alginato Este estudio evaluoacute la conservacioacuten de
tres cepas diferentes de Trichoderma tras 24 semanas almacenadas a 5 y
25ordmC Estos se conservaron mejor a bajas temperaturas (5ordmC) ya que a 25ordmC el
nuacutemero de UFC representaba menos del 5 sobre el nuacutemero de esporas
totales Otro estudio (Kuumlccediluumlk y Kıvanccedil 2005) muestra resultados en los que el
descenso en la viabilidad de las esporas parece ser maacutes acusado en
preparados soacutelidos mostrando que cuando T harzianum se almacenoacute en
graacutenulos a 30degC durante 24 semanas mostroacute menos del 1 de viabilidad Del
mismo modo Roussos et al (1989) en el estudio de diferentes teacutecnicas de
conservacioacuten (secado congelacioacuten y refrigeracioacuten) de Tharzianum concluyen
que la teacutecnica de refrigeracioacuten a 4ordmC mantiene las conidiosporas con un
porcentaje de viabilidad del 85-95 por un periodo de dos meses
CONCLUSIONES
Las conclusiones se han elaborado de manera concisa tratando de
mostrar las dificultades que entrantildea la ldquotipificacioacutenrdquo de preparados microbianos
para su comercializacioacuten
1- Los preparados comerciales estudiados se conservan mejor a bajas
temperaturas (5ordmC) independientemente de tratarse de un preparado soacutelido o
liacutequido
2- El descenso en la viabilidad de las esporas es maacutes acusado en el
preparado soacutelido que en el preparado liacutequido Debe considerarse que en
ninguacuten caso el descenso afecta a la potencia (107) que representa la densidad
de propaacutegulos iniciales aunque las etiquetas indicaban 108 UFC∙g-1 o ml-1
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ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
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Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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teacutecnica de las diluciones sucesivas (Tello et al 1991) El medio de cultivo
empleado fue Agar-Malta acidificado (aacutecido ciacutetrico al 025) Se realizaron 10
repeticiones (placas de Petri) por cada dilucioacuten Las diluciones estudiadas en
cada anaacutelisis fueron aquellas que en el anaacutelisis anterior mostraban la maacutexima
concentracioacuten asiacute como las dos diluciones inmediatamente maacutes concentradas
La incubacioacuten se realizoacute en el laboratorio a temperatura ambiente durante 2-5
diacuteas Transcurrido el tiempo indicado se procedioacute al conteo de las Unidades
Formadoras de Colonias (UFC) totales presentes en cada repeticioacuten
Recuento de conidias al microscopio
En todos los anaacutelisis realizados se procedioacute al recuento de conidias
presentes en las diluciones evaluadas Este procedimiento fue realizado
utilizando las diluciones preparadas para determinar la densidad de poblacioacuten
(contempladas en el apartado anterior) Los recuentos se llevaron a cabo con
caacutemara Neubauer (Brand Germany) Para ello se realizaron 3 recuentos de
cada muestra evaluada Para los recuentos del preparado soacutelido se empleoacute la
dilucioacuten 10-3 puesto que esa concentracioacuten permitiacutea un recuento de conidias
maacutes certero mientras que para el recuento en el preparado liacutequido se utilizoacute la
dilucioacuten 10-2 Finalmente el total de conidias se obtiene a partir de la siguiente
foacutermula
dilucioacutenmmcaacutemaradprofundidammcontadaSuperficie
contadasPartiacuteculasvoluacutemenlporPartiacuteculas
)()( 2
Evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su
coacutemputo directo al microscopio
Esta evaluacioacuten permitioacute establecer la viabilidad del hongo Se realizoacute
durante el periodo de conservacioacuten de 6 meses Los resultados se presentan
como el porcentaje de UFC en relacioacuten con el coacutemputo total de conidias al
microscopio
Anaacutelisis estadiacutestico de los datos
Los anaacutelisis realizados para las comparaciones entre diacuteas de
conservacioacuten consistieron en anaacutelisis de la varianza (ANOVA) simple Los
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meacutetodos empleados para la comparacioacuten de las medias fueron el
procedimiento de las diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD) y
el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD)
ambas al 95 de confianza Para la comparacioacuten de las dos temperaturas de
conservacioacuten (Tordf ambiente y 5ordmC) se realizoacute la prueba t-Student Asiacute mismo los
anaacutelisis estadiacutesticos realizados en la evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten
se han llevado a cabo con los datos obtenidos de la transformacioacuten del
arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1 En
todos los casos contemplados al tratarse de anaacutelisis parameacutetricos se
comprobaron previamente las asunciones de Normalidad y Homocedasticidad
El paquete estadiacutestico usado fue Statgraphic Plus 51 (Manugistic
Incorporated Rockville MD USA) para Windows
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Densidad de poblacioacuten en funcioacuten del tiempo y de la temperatura de
conservacioacuten
El estudio de la densidad de poblacioacuten de Trichoderma sp en los dos
preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a las
diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 1 y 2)
En el caso del preparado soacutelido cuando fue conservado a 5ordmC las diferencias
significativas aparecen entre anaacutelisis intermedios realizados durante el periodo
de conservacioacuten En cambio los resultados finales tras los 6 meses de
conservacioacuten no difieren de los resultados iniciales Sin embargo el preparado
soacutelido conservado a temperatura ambiente muestra un descenso en el nuacutemero
de UFC maacutes acusado mostrando mayores diferencias que son crecientes en
funcioacuten del tiempo Una vez comprobado que la conservacioacuten a temperatura
ambiente provocaba un mayor descenso en el nuacutemero de UFC a lo largo del
tiempo se procedioacute a evaluar a partir de queacute momento estas diferencias eran
significativas (ple005) entre las ambas temperaturas de conservacioacuten Los
resultados reflejan diferencias significativas y continuadas en el tiempo a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 1)
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En el caso del preparado liacutequido cuando fue conservado a 5ordmC auacuten
habiendo diferencias estadiacutesticamente significativas el test de diferencias
honestamente significativas de Tukey (HSD) no mostroacute diferencias en funcioacuten
del tiempo de conservacioacuten Sin embargo el preparado liacutequido conservado a
temperatura ambiente muestra un mayor descenso de UFC siendo en
comparacioacuten con el valor inicial significativo y continuado a partir de los 168
diacuteas de conservacioacuten Es a partir de la misma fecha cuando al comparar
ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias fueron significativas
(ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 2)
Llama la atencioacuten que en general los resultados de las evaluaciones
realizadas del preparado liacutequido muestran gran variabilidad en los resultados
Esto podriacutea ser debido a que las esporas tienden a depositarse en el fondo y
aunque el recipiente era bien agitado posiblemente no se lograba una total
homogeneidad
Respecto a los resultados obtenidos debe considerarse que auacuten siendo
descensos significativos (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten en
ninguacuten caso el descenso afectoacute a la potencia (107) que representa la densidad
de UFC de los preparados microbianos evaluados Asiacute mismo es importante
resentildear que en su evaluacioacuten inicial los preparados no mostraron valores del
orden de 108 UFCml-1 o g-1 como indicaban las etiquetas comerciales tan solo
el preparado soacutelido presentoacute valores bastante cercanos a los indicados
Porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su coacutemputo directo al
microscopio
Es comuacuten que las etiquetas indiquen una concentracioacuten de inoacuteculo pero
no se especifica si ese inoacuteculo se ha valorado como viable o simplemente por
conteo de esporas El siguiente ensayo trataba de conocer si hay una
correlacioacuten entre el nuacutemero de esporas en el formulado y el nuacutemero de esporas
viables (UFC) Al respecto el estudio del porcentaje de germinacioacuten de esporas
de Trichoderma sp en relacioacuten con su coacutemputo directo al microscopio en los
dos preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a
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las diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 3 y 4)
En el caso del preparado soacutelido el descenso de viabilidad de las
esporas es progresivo en el tiempo para ambas temperaturas de conservacioacuten
siendo este maacutes acusado cuando el preparado es conservado a temperatura
ambiente En este caso los resultados reflejan diferencias significativas y
continuadas en el tiempo entre las dos temperaturas de conservacioacuten a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 3) Es especialmente llamativo que en
ninguacuten caso se produce una germinacioacuten de esporas superior al 40 este
resultado muestra que en los anaacutelisis realizados durante el periodo de
conservacioacuten maacutes del 60 de las esporas presentes en el preparado soacutelido no
fueron viables
Asiacute mismo en el preparado liacutequido tambieacuten se aprecioacute un descenso
progresivo en la viabilidad de las esporas en funcioacuten del tiempo para ambas
temperaturas de conservacioacuten y al igual que el preparado soacutelido el descenso
fue maacutes acusado durante la conservacioacuten a temperatura ambiente En este
caso en general los resultados de las evaluaciones realizadas del preparado
liacutequido muestran gran variabilidad y es a partir de los 168 diacuteas de conservacioacuten
cuando al comparar ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias
fueron significativas (ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 4) Hay que
destacar que en estas evaluaciones el preparado liacutequido mostroacute valores
superiores al 100 lo que indica mayor nuacutemero de UFC que esporas contadas
en el hematociacutemetro Una explicacioacuten posible seriacutea que el preparado liacutequido no
soacutelo presenta esporas de Trichoderma sp como estructuras de germinacioacuten o
propaacutegulos sino que tambieacuten presenta otras estructuras capaces de germinar
en el medio de cultivo empleado en el ensayo tales como clamidosporas yo
fracciones de micelio o hifas del hongo Probablemente en la elaboracioacuten del
preparado liacutequido se emplean mecanismos no selectivos de esporas y se
produce el desprendimiento de otros tipos de estructuras yo propaacutegulos
Siguiendo la dinaacutemica de nuestros resultados Cejas et al (2000)
concluyen que los formulados a base de Trichoderma sp se conservan mejor a
bajas temperaturas y recomiendan almacenar los cultivos liacutequidos de
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Tharzianum con 1 de aacutecido soacuterbico y 1 de alumbre a temperaturas de
12ordmC Esto es debido a que despueacutes de cuatro meses de conservacioacuten el
porcentaje de germinacioacuten fue muy bajo cuando se almacenoacute a 26ordmC (inferior al
3) obteniendo mejores resultados cuando el producto fue almacenado a
12ordmC Asiacute mismo Lewis et al (1987) obtuvieron resultados anaacutelogos para la
conservacioacuten en caacutepsulas de alginato Este estudio evaluoacute la conservacioacuten de
tres cepas diferentes de Trichoderma tras 24 semanas almacenadas a 5 y
25ordmC Estos se conservaron mejor a bajas temperaturas (5ordmC) ya que a 25ordmC el
nuacutemero de UFC representaba menos del 5 sobre el nuacutemero de esporas
totales Otro estudio (Kuumlccediluumlk y Kıvanccedil 2005) muestra resultados en los que el
descenso en la viabilidad de las esporas parece ser maacutes acusado en
preparados soacutelidos mostrando que cuando T harzianum se almacenoacute en
graacutenulos a 30degC durante 24 semanas mostroacute menos del 1 de viabilidad Del
mismo modo Roussos et al (1989) en el estudio de diferentes teacutecnicas de
conservacioacuten (secado congelacioacuten y refrigeracioacuten) de Tharzianum concluyen
que la teacutecnica de refrigeracioacuten a 4ordmC mantiene las conidiosporas con un
porcentaje de viabilidad del 85-95 por un periodo de dos meses
CONCLUSIONES
Las conclusiones se han elaborado de manera concisa tratando de
mostrar las dificultades que entrantildea la ldquotipificacioacutenrdquo de preparados microbianos
para su comercializacioacuten
1- Los preparados comerciales estudiados se conservan mejor a bajas
temperaturas (5ordmC) independientemente de tratarse de un preparado soacutelido o
liacutequido
2- El descenso en la viabilidad de las esporas es maacutes acusado en el
preparado soacutelido que en el preparado liacutequido Debe considerarse que en
ninguacuten caso el descenso afecta a la potencia (107) que representa la densidad
de propaacutegulos iniciales aunque las etiquetas indicaban 108 UFC∙g-1 o ml-1
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Elad Y Zimand G Zaqs Y Zuriel S Chet I 1993 Use of Trichoderma harzianum in combination or alternation with fungicides to control cucumber grey mould (Botrytis cinerea) under commercial greenhouse conditions Plant pathology 42(3) 324-332
Harman GE Howell CR Viterbo A Chet I Lorito M 2004 Trichoderma species-opportunistic avirulent plant symbionts Nature Reviews Microbiology 2 43-56
Infante D Martiacutenez B Gonzaacutelez N Reyes Y 2009 Mecanismos de accioacuten de Trichoderma frente a hongos fitopatoacutegenos Revista de Proteccioacuten Vegetal 24 (1) 14-21
Jenkins NE D Grzywacz 2003 Towards the Standardization of Quality Control of Fungal and Viral Biocontrol Agents In Quality Control and Production of Biological Control Agents Theory and Testing Procedures Van Lenteren JC (Ed) CAB International Wallingford Inglaterra
Kuumlccediluumlk Ccedil Kivanccedil M 2005Effect of Formulation on the Viability of Biocontrol Agent Trichoderma harzianum Conidia African Journal of Biotechnology 4(5) 483-486
Lewis JA Papavizas GC 1983 Production of chlamydospores and conidia by Trichoderma spp in liquid and solid growth media Soil Biology and Biochemistry 15 (3) 351-357
Lewis JA Papavizas GC 1984 Chlamydospore formation by Trichoderma spp in natural substrates Canadian Journal of Microbiology 30(1) 1-7
Lewis JA Papavizas GC Connick WJ 1987 Preparation of pellets containing fungi and nutrient for control of soilborne plant pathogens United States Department of Agriculture patents nordm 4668512
Lorito M 2006 The Molecular Biology of the Interactions Between Trichoderma phytopathogenic Fungi and Plants Opportunities for Developing Novel Disease Control Methods Memorias del Taller Latinoamericano Biocontrol de Fitopatoacutegenos con Trichoderma y Otros Antagonistas marzo 28-31 La Habana
MAGRAMA 2013 [En liacutenea] Registro de productos fitosanitarios lthttpwwwmagramagobeses_includeserrores404aspxgt [Consulta 19 de Julio de 2013]
Marrone PG 2007 Barriers to adoption of biological control agents and biological pesticides CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources 2(51) 12
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11
Ousley MA Lynch JM Whipps JM 1994 Potential of Trichoderma spp as consistent plant growth stimulators Biology amp Fertility of Soils 17 85-90
Papavizas GC 1985 Trichoderma and Gliocladium Biology Ecology and potential for biocontrol Annual review of phytopathology 23 23-54
Roussos S Aquiahuatl MA Brizuela MA Olmos A Rodriacuteguez W Viniegra G 1989 Produccioacuten conservacioacuten y viabilidad de inoculo de hongos filamentosos para las fermentaciones soacutelidas Micologiacutea Neotropical Aplicada 2 3-17
Schuster A Schmoll M 2010 Biology and biotechnology of Trichoderma Applied Microbiology and Biotechnology 87(3) 787-799
Sundh I Goettel MS 2013 Regulating biocontrol agents a historical perspective and a critical examination comparing microbial and macrobial agents Biocontrol 58 575-593
Tello JC Palmero D de Cara M Moreno A Ruiacutez C Boix A Garciacutea C Lacasa C Camacho F 2011 Reflexiones sobre algunos preparados microbianos comerciales utilizados para el control de insectos y hongos paraacutesitos de los cultivos Terralia 83 26-37
Windham MT Elad Y Baker R 1986 A Mechanism for increased plant growth induced by Trichoderma spp Phytopathology 76 518-521
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
12
ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
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Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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meacutetodos empleados para la comparacioacuten de las medias fueron el
procedimiento de las diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD) y
el procedimiento de las menores diferencias significativas de Fisher (LSD)
ambas al 95 de confianza Para la comparacioacuten de las dos temperaturas de
conservacioacuten (Tordf ambiente y 5ordmC) se realizoacute la prueba t-Student Asiacute mismo los
anaacutelisis estadiacutesticos realizados en la evaluacioacuten del porcentaje de germinacioacuten
se han llevado a cabo con los datos obtenidos de la transformacioacuten del
arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1 En
todos los casos contemplados al tratarse de anaacutelisis parameacutetricos se
comprobaron previamente las asunciones de Normalidad y Homocedasticidad
El paquete estadiacutestico usado fue Statgraphic Plus 51 (Manugistic
Incorporated Rockville MD USA) para Windows
RESULTADOS Y DISCUSIOacuteN
Densidad de poblacioacuten en funcioacuten del tiempo y de la temperatura de
conservacioacuten
El estudio de la densidad de poblacioacuten de Trichoderma sp en los dos
preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a las
diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 1 y 2)
En el caso del preparado soacutelido cuando fue conservado a 5ordmC las diferencias
significativas aparecen entre anaacutelisis intermedios realizados durante el periodo
de conservacioacuten En cambio los resultados finales tras los 6 meses de
conservacioacuten no difieren de los resultados iniciales Sin embargo el preparado
soacutelido conservado a temperatura ambiente muestra un descenso en el nuacutemero
de UFC maacutes acusado mostrando mayores diferencias que son crecientes en
funcioacuten del tiempo Una vez comprobado que la conservacioacuten a temperatura
ambiente provocaba un mayor descenso en el nuacutemero de UFC a lo largo del
tiempo se procedioacute a evaluar a partir de queacute momento estas diferencias eran
significativas (ple005) entre las ambas temperaturas de conservacioacuten Los
resultados reflejan diferencias significativas y continuadas en el tiempo a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 1)
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En el caso del preparado liacutequido cuando fue conservado a 5ordmC auacuten
habiendo diferencias estadiacutesticamente significativas el test de diferencias
honestamente significativas de Tukey (HSD) no mostroacute diferencias en funcioacuten
del tiempo de conservacioacuten Sin embargo el preparado liacutequido conservado a
temperatura ambiente muestra un mayor descenso de UFC siendo en
comparacioacuten con el valor inicial significativo y continuado a partir de los 168
diacuteas de conservacioacuten Es a partir de la misma fecha cuando al comparar
ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias fueron significativas
(ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 2)
Llama la atencioacuten que en general los resultados de las evaluaciones
realizadas del preparado liacutequido muestran gran variabilidad en los resultados
Esto podriacutea ser debido a que las esporas tienden a depositarse en el fondo y
aunque el recipiente era bien agitado posiblemente no se lograba una total
homogeneidad
Respecto a los resultados obtenidos debe considerarse que auacuten siendo
descensos significativos (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten en
ninguacuten caso el descenso afectoacute a la potencia (107) que representa la densidad
de UFC de los preparados microbianos evaluados Asiacute mismo es importante
resentildear que en su evaluacioacuten inicial los preparados no mostraron valores del
orden de 108 UFCml-1 o g-1 como indicaban las etiquetas comerciales tan solo
el preparado soacutelido presentoacute valores bastante cercanos a los indicados
Porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su coacutemputo directo al
microscopio
Es comuacuten que las etiquetas indiquen una concentracioacuten de inoacuteculo pero
no se especifica si ese inoacuteculo se ha valorado como viable o simplemente por
conteo de esporas El siguiente ensayo trataba de conocer si hay una
correlacioacuten entre el nuacutemero de esporas en el formulado y el nuacutemero de esporas
viables (UFC) Al respecto el estudio del porcentaje de germinacioacuten de esporas
de Trichoderma sp en relacioacuten con su coacutemputo directo al microscopio en los
dos preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a
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las diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 3 y 4)
En el caso del preparado soacutelido el descenso de viabilidad de las
esporas es progresivo en el tiempo para ambas temperaturas de conservacioacuten
siendo este maacutes acusado cuando el preparado es conservado a temperatura
ambiente En este caso los resultados reflejan diferencias significativas y
continuadas en el tiempo entre las dos temperaturas de conservacioacuten a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 3) Es especialmente llamativo que en
ninguacuten caso se produce una germinacioacuten de esporas superior al 40 este
resultado muestra que en los anaacutelisis realizados durante el periodo de
conservacioacuten maacutes del 60 de las esporas presentes en el preparado soacutelido no
fueron viables
Asiacute mismo en el preparado liacutequido tambieacuten se aprecioacute un descenso
progresivo en la viabilidad de las esporas en funcioacuten del tiempo para ambas
temperaturas de conservacioacuten y al igual que el preparado soacutelido el descenso
fue maacutes acusado durante la conservacioacuten a temperatura ambiente En este
caso en general los resultados de las evaluaciones realizadas del preparado
liacutequido muestran gran variabilidad y es a partir de los 168 diacuteas de conservacioacuten
cuando al comparar ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias
fueron significativas (ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 4) Hay que
destacar que en estas evaluaciones el preparado liacutequido mostroacute valores
superiores al 100 lo que indica mayor nuacutemero de UFC que esporas contadas
en el hematociacutemetro Una explicacioacuten posible seriacutea que el preparado liacutequido no
soacutelo presenta esporas de Trichoderma sp como estructuras de germinacioacuten o
propaacutegulos sino que tambieacuten presenta otras estructuras capaces de germinar
en el medio de cultivo empleado en el ensayo tales como clamidosporas yo
fracciones de micelio o hifas del hongo Probablemente en la elaboracioacuten del
preparado liacutequido se emplean mecanismos no selectivos de esporas y se
produce el desprendimiento de otros tipos de estructuras yo propaacutegulos
Siguiendo la dinaacutemica de nuestros resultados Cejas et al (2000)
concluyen que los formulados a base de Trichoderma sp se conservan mejor a
bajas temperaturas y recomiendan almacenar los cultivos liacutequidos de
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Tharzianum con 1 de aacutecido soacuterbico y 1 de alumbre a temperaturas de
12ordmC Esto es debido a que despueacutes de cuatro meses de conservacioacuten el
porcentaje de germinacioacuten fue muy bajo cuando se almacenoacute a 26ordmC (inferior al
3) obteniendo mejores resultados cuando el producto fue almacenado a
12ordmC Asiacute mismo Lewis et al (1987) obtuvieron resultados anaacutelogos para la
conservacioacuten en caacutepsulas de alginato Este estudio evaluoacute la conservacioacuten de
tres cepas diferentes de Trichoderma tras 24 semanas almacenadas a 5 y
25ordmC Estos se conservaron mejor a bajas temperaturas (5ordmC) ya que a 25ordmC el
nuacutemero de UFC representaba menos del 5 sobre el nuacutemero de esporas
totales Otro estudio (Kuumlccediluumlk y Kıvanccedil 2005) muestra resultados en los que el
descenso en la viabilidad de las esporas parece ser maacutes acusado en
preparados soacutelidos mostrando que cuando T harzianum se almacenoacute en
graacutenulos a 30degC durante 24 semanas mostroacute menos del 1 de viabilidad Del
mismo modo Roussos et al (1989) en el estudio de diferentes teacutecnicas de
conservacioacuten (secado congelacioacuten y refrigeracioacuten) de Tharzianum concluyen
que la teacutecnica de refrigeracioacuten a 4ordmC mantiene las conidiosporas con un
porcentaje de viabilidad del 85-95 por un periodo de dos meses
CONCLUSIONES
Las conclusiones se han elaborado de manera concisa tratando de
mostrar las dificultades que entrantildea la ldquotipificacioacutenrdquo de preparados microbianos
para su comercializacioacuten
1- Los preparados comerciales estudiados se conservan mejor a bajas
temperaturas (5ordmC) independientemente de tratarse de un preparado soacutelido o
liacutequido
2- El descenso en la viabilidad de las esporas es maacutes acusado en el
preparado soacutelido que en el preparado liacutequido Debe considerarse que en
ninguacuten caso el descenso afecta a la potencia (107) que representa la densidad
de propaacutegulos iniciales aunque las etiquetas indicaban 108 UFC∙g-1 o ml-1
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REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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Lewis JA Papavizas GC 1984 Chlamydospore formation by Trichoderma spp in natural substrates Canadian Journal of Microbiology 30(1) 1-7
Lewis JA Papavizas GC Connick WJ 1987 Preparation of pellets containing fungi and nutrient for control of soilborne plant pathogens United States Department of Agriculture patents nordm 4668512
Lorito M 2006 The Molecular Biology of the Interactions Between Trichoderma phytopathogenic Fungi and Plants Opportunities for Developing Novel Disease Control Methods Memorias del Taller Latinoamericano Biocontrol de Fitopatoacutegenos con Trichoderma y Otros Antagonistas marzo 28-31 La Habana
MAGRAMA 2013 [En liacutenea] Registro de productos fitosanitarios lthttpwwwmagramagobeses_includeserrores404aspxgt [Consulta 19 de Julio de 2013]
Marrone PG 2007 Barriers to adoption of biological control agents and biological pesticides CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources 2(51) 12
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
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Ousley MA Lynch JM Whipps JM 1994 Potential of Trichoderma spp as consistent plant growth stimulators Biology amp Fertility of Soils 17 85-90
Papavizas GC 1985 Trichoderma and Gliocladium Biology Ecology and potential for biocontrol Annual review of phytopathology 23 23-54
Roussos S Aquiahuatl MA Brizuela MA Olmos A Rodriacuteguez W Viniegra G 1989 Produccioacuten conservacioacuten y viabilidad de inoculo de hongos filamentosos para las fermentaciones soacutelidas Micologiacutea Neotropical Aplicada 2 3-17
Schuster A Schmoll M 2010 Biology and biotechnology of Trichoderma Applied Microbiology and Biotechnology 87(3) 787-799
Sundh I Goettel MS 2013 Regulating biocontrol agents a historical perspective and a critical examination comparing microbial and macrobial agents Biocontrol 58 575-593
Tello JC Palmero D de Cara M Moreno A Ruiacutez C Boix A Garciacutea C Lacasa C Camacho F 2011 Reflexiones sobre algunos preparados microbianos comerciales utilizados para el control de insectos y hongos paraacutesitos de los cultivos Terralia 83 26-37
Windham MT Elad Y Baker R 1986 A Mechanism for increased plant growth induced by Trichoderma spp Phytopathology 76 518-521
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
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ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
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Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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En el caso del preparado liacutequido cuando fue conservado a 5ordmC auacuten
habiendo diferencias estadiacutesticamente significativas el test de diferencias
honestamente significativas de Tukey (HSD) no mostroacute diferencias en funcioacuten
del tiempo de conservacioacuten Sin embargo el preparado liacutequido conservado a
temperatura ambiente muestra un mayor descenso de UFC siendo en
comparacioacuten con el valor inicial significativo y continuado a partir de los 168
diacuteas de conservacioacuten Es a partir de la misma fecha cuando al comparar
ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias fueron significativas
(ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 2)
Llama la atencioacuten que en general los resultados de las evaluaciones
realizadas del preparado liacutequido muestran gran variabilidad en los resultados
Esto podriacutea ser debido a que las esporas tienden a depositarse en el fondo y
aunque el recipiente era bien agitado posiblemente no se lograba una total
homogeneidad
Respecto a los resultados obtenidos debe considerarse que auacuten siendo
descensos significativos (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten en
ninguacuten caso el descenso afectoacute a la potencia (107) que representa la densidad
de UFC de los preparados microbianos evaluados Asiacute mismo es importante
resentildear que en su evaluacioacuten inicial los preparados no mostraron valores del
orden de 108 UFCml-1 o g-1 como indicaban las etiquetas comerciales tan solo
el preparado soacutelido presentoacute valores bastante cercanos a los indicados
Porcentaje de germinacioacuten de esporas en relacioacuten con su coacutemputo directo al
microscopio
Es comuacuten que las etiquetas indiquen una concentracioacuten de inoacuteculo pero
no se especifica si ese inoacuteculo se ha valorado como viable o simplemente por
conteo de esporas El siguiente ensayo trataba de conocer si hay una
correlacioacuten entre el nuacutemero de esporas en el formulado y el nuacutemero de esporas
viables (UFC) Al respecto el estudio del porcentaje de germinacioacuten de esporas
de Trichoderma sp en relacioacuten con su coacutemputo directo al microscopio en los
dos preparados comerciales (soacutelido y liacutequido) conservados durante 6 meses a
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las diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 3 y 4)
En el caso del preparado soacutelido el descenso de viabilidad de las
esporas es progresivo en el tiempo para ambas temperaturas de conservacioacuten
siendo este maacutes acusado cuando el preparado es conservado a temperatura
ambiente En este caso los resultados reflejan diferencias significativas y
continuadas en el tiempo entre las dos temperaturas de conservacioacuten a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 3) Es especialmente llamativo que en
ninguacuten caso se produce una germinacioacuten de esporas superior al 40 este
resultado muestra que en los anaacutelisis realizados durante el periodo de
conservacioacuten maacutes del 60 de las esporas presentes en el preparado soacutelido no
fueron viables
Asiacute mismo en el preparado liacutequido tambieacuten se aprecioacute un descenso
progresivo en la viabilidad de las esporas en funcioacuten del tiempo para ambas
temperaturas de conservacioacuten y al igual que el preparado soacutelido el descenso
fue maacutes acusado durante la conservacioacuten a temperatura ambiente En este
caso en general los resultados de las evaluaciones realizadas del preparado
liacutequido muestran gran variabilidad y es a partir de los 168 diacuteas de conservacioacuten
cuando al comparar ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias
fueron significativas (ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 4) Hay que
destacar que en estas evaluaciones el preparado liacutequido mostroacute valores
superiores al 100 lo que indica mayor nuacutemero de UFC que esporas contadas
en el hematociacutemetro Una explicacioacuten posible seriacutea que el preparado liacutequido no
soacutelo presenta esporas de Trichoderma sp como estructuras de germinacioacuten o
propaacutegulos sino que tambieacuten presenta otras estructuras capaces de germinar
en el medio de cultivo empleado en el ensayo tales como clamidosporas yo
fracciones de micelio o hifas del hongo Probablemente en la elaboracioacuten del
preparado liacutequido se emplean mecanismos no selectivos de esporas y se
produce el desprendimiento de otros tipos de estructuras yo propaacutegulos
Siguiendo la dinaacutemica de nuestros resultados Cejas et al (2000)
concluyen que los formulados a base de Trichoderma sp se conservan mejor a
bajas temperaturas y recomiendan almacenar los cultivos liacutequidos de
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Tharzianum con 1 de aacutecido soacuterbico y 1 de alumbre a temperaturas de
12ordmC Esto es debido a que despueacutes de cuatro meses de conservacioacuten el
porcentaje de germinacioacuten fue muy bajo cuando se almacenoacute a 26ordmC (inferior al
3) obteniendo mejores resultados cuando el producto fue almacenado a
12ordmC Asiacute mismo Lewis et al (1987) obtuvieron resultados anaacutelogos para la
conservacioacuten en caacutepsulas de alginato Este estudio evaluoacute la conservacioacuten de
tres cepas diferentes de Trichoderma tras 24 semanas almacenadas a 5 y
25ordmC Estos se conservaron mejor a bajas temperaturas (5ordmC) ya que a 25ordmC el
nuacutemero de UFC representaba menos del 5 sobre el nuacutemero de esporas
totales Otro estudio (Kuumlccediluumlk y Kıvanccedil 2005) muestra resultados en los que el
descenso en la viabilidad de las esporas parece ser maacutes acusado en
preparados soacutelidos mostrando que cuando T harzianum se almacenoacute en
graacutenulos a 30degC durante 24 semanas mostroacute menos del 1 de viabilidad Del
mismo modo Roussos et al (1989) en el estudio de diferentes teacutecnicas de
conservacioacuten (secado congelacioacuten y refrigeracioacuten) de Tharzianum concluyen
que la teacutecnica de refrigeracioacuten a 4ordmC mantiene las conidiosporas con un
porcentaje de viabilidad del 85-95 por un periodo de dos meses
CONCLUSIONES
Las conclusiones se han elaborado de manera concisa tratando de
mostrar las dificultades que entrantildea la ldquotipificacioacutenrdquo de preparados microbianos
para su comercializacioacuten
1- Los preparados comerciales estudiados se conservan mejor a bajas
temperaturas (5ordmC) independientemente de tratarse de un preparado soacutelido o
liacutequido
2- El descenso en la viabilidad de las esporas es maacutes acusado en el
preparado soacutelido que en el preparado liacutequido Debe considerarse que en
ninguacuten caso el descenso afecta a la potencia (107) que representa la densidad
de propaacutegulos iniciales aunque las etiquetas indicaban 108 UFC∙g-1 o ml-1
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ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
13
Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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las diferentes temperaturas (Temperatura ambiente y 5ordmC) presenta diferencias
significativas (p le 005) en funcioacuten del tiempo de conservacioacuten (Cuadros 3 y 4)
En el caso del preparado soacutelido el descenso de viabilidad de las
esporas es progresivo en el tiempo para ambas temperaturas de conservacioacuten
siendo este maacutes acusado cuando el preparado es conservado a temperatura
ambiente En este caso los resultados reflejan diferencias significativas y
continuadas en el tiempo entre las dos temperaturas de conservacioacuten a partir
de los 115 diacuteas de conservacioacuten (Figura 3) Es especialmente llamativo que en
ninguacuten caso se produce una germinacioacuten de esporas superior al 40 este
resultado muestra que en los anaacutelisis realizados durante el periodo de
conservacioacuten maacutes del 60 de las esporas presentes en el preparado soacutelido no
fueron viables
Asiacute mismo en el preparado liacutequido tambieacuten se aprecioacute un descenso
progresivo en la viabilidad de las esporas en funcioacuten del tiempo para ambas
temperaturas de conservacioacuten y al igual que el preparado soacutelido el descenso
fue maacutes acusado durante la conservacioacuten a temperatura ambiente En este
caso en general los resultados de las evaluaciones realizadas del preparado
liacutequido muestran gran variabilidad y es a partir de los 168 diacuteas de conservacioacuten
cuando al comparar ambas temperaturas de conservacioacuten las diferencias
fueron significativas (ple005) y continuadas en el tiempo (Figura 4) Hay que
destacar que en estas evaluaciones el preparado liacutequido mostroacute valores
superiores al 100 lo que indica mayor nuacutemero de UFC que esporas contadas
en el hematociacutemetro Una explicacioacuten posible seriacutea que el preparado liacutequido no
soacutelo presenta esporas de Trichoderma sp como estructuras de germinacioacuten o
propaacutegulos sino que tambieacuten presenta otras estructuras capaces de germinar
en el medio de cultivo empleado en el ensayo tales como clamidosporas yo
fracciones de micelio o hifas del hongo Probablemente en la elaboracioacuten del
preparado liacutequido se emplean mecanismos no selectivos de esporas y se
produce el desprendimiento de otros tipos de estructuras yo propaacutegulos
Siguiendo la dinaacutemica de nuestros resultados Cejas et al (2000)
concluyen que los formulados a base de Trichoderma sp se conservan mejor a
bajas temperaturas y recomiendan almacenar los cultivos liacutequidos de
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Tharzianum con 1 de aacutecido soacuterbico y 1 de alumbre a temperaturas de
12ordmC Esto es debido a que despueacutes de cuatro meses de conservacioacuten el
porcentaje de germinacioacuten fue muy bajo cuando se almacenoacute a 26ordmC (inferior al
3) obteniendo mejores resultados cuando el producto fue almacenado a
12ordmC Asiacute mismo Lewis et al (1987) obtuvieron resultados anaacutelogos para la
conservacioacuten en caacutepsulas de alginato Este estudio evaluoacute la conservacioacuten de
tres cepas diferentes de Trichoderma tras 24 semanas almacenadas a 5 y
25ordmC Estos se conservaron mejor a bajas temperaturas (5ordmC) ya que a 25ordmC el
nuacutemero de UFC representaba menos del 5 sobre el nuacutemero de esporas
totales Otro estudio (Kuumlccediluumlk y Kıvanccedil 2005) muestra resultados en los que el
descenso en la viabilidad de las esporas parece ser maacutes acusado en
preparados soacutelidos mostrando que cuando T harzianum se almacenoacute en
graacutenulos a 30degC durante 24 semanas mostroacute menos del 1 de viabilidad Del
mismo modo Roussos et al (1989) en el estudio de diferentes teacutecnicas de
conservacioacuten (secado congelacioacuten y refrigeracioacuten) de Tharzianum concluyen
que la teacutecnica de refrigeracioacuten a 4ordmC mantiene las conidiosporas con un
porcentaje de viabilidad del 85-95 por un periodo de dos meses
CONCLUSIONES
Las conclusiones se han elaborado de manera concisa tratando de
mostrar las dificultades que entrantildea la ldquotipificacioacutenrdquo de preparados microbianos
para su comercializacioacuten
1- Los preparados comerciales estudiados se conservan mejor a bajas
temperaturas (5ordmC) independientemente de tratarse de un preparado soacutelido o
liacutequido
2- El descenso en la viabilidad de las esporas es maacutes acusado en el
preparado soacutelido que en el preparado liacutequido Debe considerarse que en
ninguacuten caso el descenso afecta a la potencia (107) que representa la densidad
de propaacutegulos iniciales aunque las etiquetas indicaban 108 UFC∙g-1 o ml-1
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REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
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Marrone PG 2007 Barriers to adoption of biological control agents and biological pesticides CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources 2(51) 12
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Roussos S Aquiahuatl MA Brizuela MA Olmos A Rodriacuteguez W Viniegra G 1989 Produccioacuten conservacioacuten y viabilidad de inoculo de hongos filamentosos para las fermentaciones soacutelidas Micologiacutea Neotropical Aplicada 2 3-17
Schuster A Schmoll M 2010 Biology and biotechnology of Trichoderma Applied Microbiology and Biotechnology 87(3) 787-799
Sundh I Goettel MS 2013 Regulating biocontrol agents a historical perspective and a critical examination comparing microbial and macrobial agents Biocontrol 58 575-593
Tello JC Palmero D de Cara M Moreno A Ruiacutez C Boix A Garciacutea C Lacasa C Camacho F 2011 Reflexiones sobre algunos preparados microbianos comerciales utilizados para el control de insectos y hongos paraacutesitos de los cultivos Terralia 83 26-37
Windham MT Elad Y Baker R 1986 A Mechanism for increased plant growth induced by Trichoderma spp Phytopathology 76 518-521
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ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
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Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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Tharzianum con 1 de aacutecido soacuterbico y 1 de alumbre a temperaturas de
12ordmC Esto es debido a que despueacutes de cuatro meses de conservacioacuten el
porcentaje de germinacioacuten fue muy bajo cuando se almacenoacute a 26ordmC (inferior al
3) obteniendo mejores resultados cuando el producto fue almacenado a
12ordmC Asiacute mismo Lewis et al (1987) obtuvieron resultados anaacutelogos para la
conservacioacuten en caacutepsulas de alginato Este estudio evaluoacute la conservacioacuten de
tres cepas diferentes de Trichoderma tras 24 semanas almacenadas a 5 y
25ordmC Estos se conservaron mejor a bajas temperaturas (5ordmC) ya que a 25ordmC el
nuacutemero de UFC representaba menos del 5 sobre el nuacutemero de esporas
totales Otro estudio (Kuumlccediluumlk y Kıvanccedil 2005) muestra resultados en los que el
descenso en la viabilidad de las esporas parece ser maacutes acusado en
preparados soacutelidos mostrando que cuando T harzianum se almacenoacute en
graacutenulos a 30degC durante 24 semanas mostroacute menos del 1 de viabilidad Del
mismo modo Roussos et al (1989) en el estudio de diferentes teacutecnicas de
conservacioacuten (secado congelacioacuten y refrigeracioacuten) de Tharzianum concluyen
que la teacutecnica de refrigeracioacuten a 4ordmC mantiene las conidiosporas con un
porcentaje de viabilidad del 85-95 por un periodo de dos meses
CONCLUSIONES
Las conclusiones se han elaborado de manera concisa tratando de
mostrar las dificultades que entrantildea la ldquotipificacioacutenrdquo de preparados microbianos
para su comercializacioacuten
1- Los preparados comerciales estudiados se conservan mejor a bajas
temperaturas (5ordmC) independientemente de tratarse de un preparado soacutelido o
liacutequido
2- El descenso en la viabilidad de las esporas es maacutes acusado en el
preparado soacutelido que en el preparado liacutequido Debe considerarse que en
ninguacuten caso el descenso afecta a la potencia (107) que representa la densidad
de propaacutegulos iniciales aunque las etiquetas indicaban 108 UFC∙g-1 o ml-1
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REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
Bailey KL Boyethko SM Laumlngle T 2010 Social and economic drivers shaping the future of biological control A Canadian perspective on the factors affecting the development and use of microbial biopesticides Biological Control 52 (3) 221-229
Beniacutetez T Rincoacuten AM Limoacuten MC Codoacuten AC 2004 Biocontrol mechanisms of Trichoderma Strains International Microbiology 7(4) 249-260
Cejas A Fernaacutendez-Larrea O Diacuteaz R Nieves C Fuentes R 2000 Conservacioacuten de preparados liacutequidos de Trichoderma harzianum cepa A34 Fitosanidad 4 (3-4) 73-76
De Lintildeaacuten C 2013 Vademeacutecum de productos fitosanitarios y nutricionales 29ordf ed Madrid Ediciones Agroteacutecnicas
Elad Y Kirshner B 1993 Survival in the Phylloplane of an introduced biocontrol agent (Trichoderma harzianum) and populations of the plant pathogen Botrytis cinerea as modified by abiotic conditions Phytoparasitica 21(4) 303-313
Elad Y Zimand G Zaqs Y Zuriel S Chet I 1993 Use of Trichoderma harzianum in combination or alternation with fungicides to control cucumber grey mould (Botrytis cinerea) under commercial greenhouse conditions Plant pathology 42(3) 324-332
Harman GE Howell CR Viterbo A Chet I Lorito M 2004 Trichoderma species-opportunistic avirulent plant symbionts Nature Reviews Microbiology 2 43-56
Infante D Martiacutenez B Gonzaacutelez N Reyes Y 2009 Mecanismos de accioacuten de Trichoderma frente a hongos fitopatoacutegenos Revista de Proteccioacuten Vegetal 24 (1) 14-21
Jenkins NE D Grzywacz 2003 Towards the Standardization of Quality Control of Fungal and Viral Biocontrol Agents In Quality Control and Production of Biological Control Agents Theory and Testing Procedures Van Lenteren JC (Ed) CAB International Wallingford Inglaterra
Kuumlccediluumlk Ccedil Kivanccedil M 2005Effect of Formulation on the Viability of Biocontrol Agent Trichoderma harzianum Conidia African Journal of Biotechnology 4(5) 483-486
Lewis JA Papavizas GC 1983 Production of chlamydospores and conidia by Trichoderma spp in liquid and solid growth media Soil Biology and Biochemistry 15 (3) 351-357
Lewis JA Papavizas GC 1984 Chlamydospore formation by Trichoderma spp in natural substrates Canadian Journal of Microbiology 30(1) 1-7
Lewis JA Papavizas GC Connick WJ 1987 Preparation of pellets containing fungi and nutrient for control of soilborne plant pathogens United States Department of Agriculture patents nordm 4668512
Lorito M 2006 The Molecular Biology of the Interactions Between Trichoderma phytopathogenic Fungi and Plants Opportunities for Developing Novel Disease Control Methods Memorias del Taller Latinoamericano Biocontrol de Fitopatoacutegenos con Trichoderma y Otros Antagonistas marzo 28-31 La Habana
MAGRAMA 2013 [En liacutenea] Registro de productos fitosanitarios lthttpwwwmagramagobeses_includeserrores404aspxgt [Consulta 19 de Julio de 2013]
Marrone PG 2007 Barriers to adoption of biological control agents and biological pesticides CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources 2(51) 12
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Ousley MA Lynch JM Whipps JM 1994 Potential of Trichoderma spp as consistent plant growth stimulators Biology amp Fertility of Soils 17 85-90
Papavizas GC 1985 Trichoderma and Gliocladium Biology Ecology and potential for biocontrol Annual review of phytopathology 23 23-54
Roussos S Aquiahuatl MA Brizuela MA Olmos A Rodriacuteguez W Viniegra G 1989 Produccioacuten conservacioacuten y viabilidad de inoculo de hongos filamentosos para las fermentaciones soacutelidas Micologiacutea Neotropical Aplicada 2 3-17
Schuster A Schmoll M 2010 Biology and biotechnology of Trichoderma Applied Microbiology and Biotechnology 87(3) 787-799
Sundh I Goettel MS 2013 Regulating biocontrol agents a historical perspective and a critical examination comparing microbial and macrobial agents Biocontrol 58 575-593
Tello JC Palmero D de Cara M Moreno A Ruiacutez C Boix A Garciacutea C Lacasa C Camacho F 2011 Reflexiones sobre algunos preparados microbianos comerciales utilizados para el control de insectos y hongos paraacutesitos de los cultivos Terralia 83 26-37
Windham MT Elad Y Baker R 1986 A Mechanism for increased plant growth induced by Trichoderma spp Phytopathology 76 518-521
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ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
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Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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REFERENCIAS BIBLIOGRAacuteFICAS
Bailey KL Boyethko SM Laumlngle T 2010 Social and economic drivers shaping the future of biological control A Canadian perspective on the factors affecting the development and use of microbial biopesticides Biological Control 52 (3) 221-229
Beniacutetez T Rincoacuten AM Limoacuten MC Codoacuten AC 2004 Biocontrol mechanisms of Trichoderma Strains International Microbiology 7(4) 249-260
Cejas A Fernaacutendez-Larrea O Diacuteaz R Nieves C Fuentes R 2000 Conservacioacuten de preparados liacutequidos de Trichoderma harzianum cepa A34 Fitosanidad 4 (3-4) 73-76
De Lintildeaacuten C 2013 Vademeacutecum de productos fitosanitarios y nutricionales 29ordf ed Madrid Ediciones Agroteacutecnicas
Elad Y Kirshner B 1993 Survival in the Phylloplane of an introduced biocontrol agent (Trichoderma harzianum) and populations of the plant pathogen Botrytis cinerea as modified by abiotic conditions Phytoparasitica 21(4) 303-313
Elad Y Zimand G Zaqs Y Zuriel S Chet I 1993 Use of Trichoderma harzianum in combination or alternation with fungicides to control cucumber grey mould (Botrytis cinerea) under commercial greenhouse conditions Plant pathology 42(3) 324-332
Harman GE Howell CR Viterbo A Chet I Lorito M 2004 Trichoderma species-opportunistic avirulent plant symbionts Nature Reviews Microbiology 2 43-56
Infante D Martiacutenez B Gonzaacutelez N Reyes Y 2009 Mecanismos de accioacuten de Trichoderma frente a hongos fitopatoacutegenos Revista de Proteccioacuten Vegetal 24 (1) 14-21
Jenkins NE D Grzywacz 2003 Towards the Standardization of Quality Control of Fungal and Viral Biocontrol Agents In Quality Control and Production of Biological Control Agents Theory and Testing Procedures Van Lenteren JC (Ed) CAB International Wallingford Inglaterra
Kuumlccediluumlk Ccedil Kivanccedil M 2005Effect of Formulation on the Viability of Biocontrol Agent Trichoderma harzianum Conidia African Journal of Biotechnology 4(5) 483-486
Lewis JA Papavizas GC 1983 Production of chlamydospores and conidia by Trichoderma spp in liquid and solid growth media Soil Biology and Biochemistry 15 (3) 351-357
Lewis JA Papavizas GC 1984 Chlamydospore formation by Trichoderma spp in natural substrates Canadian Journal of Microbiology 30(1) 1-7
Lewis JA Papavizas GC Connick WJ 1987 Preparation of pellets containing fungi and nutrient for control of soilborne plant pathogens United States Department of Agriculture patents nordm 4668512
Lorito M 2006 The Molecular Biology of the Interactions Between Trichoderma phytopathogenic Fungi and Plants Opportunities for Developing Novel Disease Control Methods Memorias del Taller Latinoamericano Biocontrol de Fitopatoacutegenos con Trichoderma y Otros Antagonistas marzo 28-31 La Habana
MAGRAMA 2013 [En liacutenea] Registro de productos fitosanitarios lthttpwwwmagramagobeses_includeserrores404aspxgt [Consulta 19 de Julio de 2013]
Marrone PG 2007 Barriers to adoption of biological control agents and biological pesticides CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources 2(51) 12
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
11
Ousley MA Lynch JM Whipps JM 1994 Potential of Trichoderma spp as consistent plant growth stimulators Biology amp Fertility of Soils 17 85-90
Papavizas GC 1985 Trichoderma and Gliocladium Biology Ecology and potential for biocontrol Annual review of phytopathology 23 23-54
Roussos S Aquiahuatl MA Brizuela MA Olmos A Rodriacuteguez W Viniegra G 1989 Produccioacuten conservacioacuten y viabilidad de inoculo de hongos filamentosos para las fermentaciones soacutelidas Micologiacutea Neotropical Aplicada 2 3-17
Schuster A Schmoll M 2010 Biology and biotechnology of Trichoderma Applied Microbiology and Biotechnology 87(3) 787-799
Sundh I Goettel MS 2013 Regulating biocontrol agents a historical perspective and a critical examination comparing microbial and macrobial agents Biocontrol 58 575-593
Tello JC Palmero D de Cara M Moreno A Ruiacutez C Boix A Garciacutea C Lacasa C Camacho F 2011 Reflexiones sobre algunos preparados microbianos comerciales utilizados para el control de insectos y hongos paraacutesitos de los cultivos Terralia 83 26-37
Windham MT Elad Y Baker R 1986 A Mechanism for increased plant growth induced by Trichoderma spp Phytopathology 76 518-521
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
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ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
13
Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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Ousley MA Lynch JM Whipps JM 1994 Potential of Trichoderma spp as consistent plant growth stimulators Biology amp Fertility of Soils 17 85-90
Papavizas GC 1985 Trichoderma and Gliocladium Biology Ecology and potential for biocontrol Annual review of phytopathology 23 23-54
Roussos S Aquiahuatl MA Brizuela MA Olmos A Rodriacuteguez W Viniegra G 1989 Produccioacuten conservacioacuten y viabilidad de inoculo de hongos filamentosos para las fermentaciones soacutelidas Micologiacutea Neotropical Aplicada 2 3-17
Schuster A Schmoll M 2010 Biology and biotechnology of Trichoderma Applied Microbiology and Biotechnology 87(3) 787-799
Sundh I Goettel MS 2013 Regulating biocontrol agents a historical perspective and a critical examination comparing microbial and macrobial agents Biocontrol 58 575-593
Tello JC Palmero D de Cara M Moreno A Ruiacutez C Boix A Garciacutea C Lacasa C Camacho F 2011 Reflexiones sobre algunos preparados microbianos comerciales utilizados para el control de insectos y hongos paraacutesitos de los cultivos Terralia 83 26-37
Windham MT Elad Y Baker R 1986 A Mechanism for increased plant growth induced by Trichoderma spp Phytopathology 76 518-521
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ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
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Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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ANEXO 1 CUADROS
Conservacioacuten Preparado SOacuteLIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 97 plusmn 31ba 97 plusmn 31a
17 99 plusmn 22ba 96 plusmn 29a
31 98 plusmn 32ba 91 plusmn 21ba
45 110 plusmn 25a 76 plusmn 19cba
59 94 plusmn 13ba 73 plusmn 21dcba
73 70 plusmn 19b 65 plusmn 18dcba
87 80 plusmn 27ba 65 plusmn 24dcba
101 90 plusmn 18ba 72 plusmn 27dcba
115 102 plusmn 25ba 59 plusmn 20edcb
129 85 plusmn 18ba 47 plusmn 12fedc
143 69 plusmn 14b 42 plusmn 16fed
157 74 plusmn 13b 27 plusmn 18fe
170 95 plusmn 26ba 31 plusmn 16fe
181 85 plusmn 20ba 24 plusmn 14f
p-valor 00005 00000
Cuadro 1 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)
Conservacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas 5ordmC
(UFC x107g
-1)
Ambiente (UFC x10
7g
-1)
1 40 plusmn 21a 40 plusmn 21a
13 33 plusmn 18a 29 plusmn 10ba
28 -- 34 plusmn 21ba
45 51 plusmn 16a 40 plusmn 19a
56 51 plusmn 14a 28 plusmn 12ba
74 45 plusmn 22a 31 plusmn 20ba
84 39 plusmn 19a 42 plusmn 16a
98 40 plusmn 13a 30 plusmn 14ba
112 34 plusmn 11a 16 plusmn 12b
126 31 plusmn 14a 30 plusmn 16ba
140 36 plusmn 14a 33 plusmn 13ba
154 29 plusmn 11a 21 plusmn 10ba
168 42 plusmn 14a 13 plusmn 11b
181 35 plusmn 09a 16 plusmn 08b
p-valor 00255 00000
Cuadro 2 Recuento de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados muestran el promedio plusmn
desviacioacuten tiacutepica Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de confianza (ple005) entre
diacuteas de conservacioacuten mediante el test de diferencias honestamente significativas de Tukey (HSD)--
Valores anoacutemalos no considerados
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
13
Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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Germinacioacuten Preparado SOacuteLIDO
nordm conidias
(x108g
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
17 249 249 40a 39a
31 455 383 22cb 24b
45 462 427 24b 18dc
59 466 340 20dcb 22cb
73 401 382 18fedc 17dc
87 468 473 17fed 14ed
101 465 431 19edcb 17dc
115 605 643 17fed 9f
129 573 495 15gf 9fe
143 497 673 14gf 6gf
157 591 618 13g 4g
170 553 658 17fedc 5g
181 543 493 17gfe 5g
p-valor 00000 00000
Cuadro 3 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses a
diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
Germinacioacuten Preparado LIacuteQUIDO
nordm conidias
(x107ml
-1)
germinacioacuten
(UFCConidias x100)
Diacuteas 5ordmC Ambiente 5ordmC Ambiente
28 415 411 -- 83dcb
45 353 372 145a 108ba
56 359 329 142ba 85cb
74 331 358 136cba 87cb
84 357 299 109dcba 141a
98 349 322 115dcba 93cb
112 327 424 104dc 38e
126 293 364 106dcb 82dcb
140 361 358 100dc 92cb
154 341 353 85d 60edc
168 343 331 122dcba 39e
181 338 348 104dc 46ed
p-valor 00453 00000
Cuadro 4 Nuacutemero de conidias y porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el preparado
comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de seis meses
a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Distintas letras denotan diferencias estadiacutesticas al 95 de
confianza (ple005) entre diacuteas de conservacioacuten mediante el test de las menores diferencias significativas
de Fisher (LSD) Los anaacutelisis estadiacutesticos se han realizado con los datos obtenidos de la transformacioacuten
del arcoseno de la raiacutez cuadrada del porcentaje de germinacioacuten en tanto por 1
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
8
Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
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60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
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ANEXO 2 FIGURAS
Figura 1 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 2 Representacioacuten graacutefica del nuacutemero de unidades formadoras de colonia (x107g
-1) de
Trichoderma sp en el preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo
durante un periodo de seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Los resultados
muestran el promedio plusmn desviacioacuten tiacutepica Indica diferencias significativas al 95 de confianza (ple005)
entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Preparado SOacuteLIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
10
7 U
FC
g-1
0
2
4
6
8
10
12
14
16Tordf ambiente
5 ordmC
Preparado LIacuteQUIDO
Tiempo Conservacioacuten (Diacuteas)
1 13 28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
10
7 U
FC
mL
-1
0
2
4
6
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Tordf ambiente
5 ordmC
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Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
erm
ina
cioacute
n
0
20
40
60
80
100
120
140
160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
A
A
BBB
B
XI Congreso de SEAE laquoAgricultura ecoloacutegica familiarraquo Vitoria-Gasteiz (Aacutelava) 1-4 octubre 2014
15
Figura 3 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial SOacuteLIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Figura 4 Representacioacuten graacutefica del porcentaje de germinacioacuten de Trichoderma sp en el
preparado comercial LIacuteQUIDO en funcioacuten de la conservacioacuten en el tiempo durante un periodo de
seis meses a diferentes temperaturas 5ordmC y Ambiente Diferentes letras denotan diferencias
significativas al 95 de confianza (ple005) entre conservacioacuten a diferentes temperaturas mediante la
prueba t-Student de comparacioacuten de medias
Diacuteas Conservacioacuten
17 31 45 59 73 87 101 115 129 143 157 170 181
G
erm
inacioacute
n
0
10
20
30
40
50 Tordf ambiente
5 ordmC
A
BA
AA A
A A
B
B
B
B B B
Preparado SOacuteLIDO
Preparado LIacuteQUIDO
Diacuteas Conservacioacuten
28 45 56 74 84 98 112 126 140 154 168 181
G
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ina
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n
0
20
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160 Tordf ambiente
5 ordmCA
A
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