EVALUACIÓN DE FLUJO Y VARIABILIDAD GENÉTICA DE LA RANA RUBÍ (Dendrobates bombetes) EN LAS RESERVAS DE YOTOCO (VALLE DEL CAUCA, COLOMBIA) Y BREMEN

(QUINDIO, COLOMBIA)

PROPONENTE: JUAN CAMILO MARTNEZ BARGUIL

EST. INGENIERÍA QUÍMICA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

PARA:

GRUPO DE APOYO FONDO NACIONAL AMBIENTAL

FONAM

GRUPO DE APOYO EL DEPARTAMENTO ADMINISTRATIVO DE CIENCIA TECNOLOGÍA E INNOVACIÓN

COLCIENCIAS

JUNIO 2010

Tabla De Contenido

1. Planteamiento del problema

2. Justificación

3. Objetivos

3.1. Objetivo general

3.2. Objetivos específicos

4. Marco teórico

4.1 La familia Dendrobatidae

4.2 Dendrobates bombetes

4.2.1 Sinónimos

4.2.2 Descripción

4.2.3 Clasificación taxonómica

4.2.4 Distribución geográfica

4.2.5 Reproducción

4.3 Marcadores moleculares y Microsatélites

4.4 Diversidad Genotípica

5. Metodología

5.1 Marcadores moleculares

5.2 Localidad y área de muestreo

5.3 Descripción de muestreo

5.4 Análisis Morfométrico

5.4.1 datos morfométricas

5.4.2 Análisis de datos Morfométrico

5.5 Estudio genético

5.5.1 Análisis de laboratorio

5.5.2 Extracción de ADN

5.5.3 Análisis de datos genéticos

6. Cronograma de actividades

7. Presupuesto

7.1 Fuentes de financiación

7.2 Valor total del proyecto

7.3 Rubros financiados

7.4 Detalles de rubros

7.4.1 Gastos de personal

7.4.2 Compra de equipos

7.4.3 Materiales y suministros

7.4.4 Salidas de campo

7.4.5 Uso de equipos y laboratorio

8. Bibliografía

9. Resultados Esperados

1. Planteamiento del problema

Los anfibios hacen parte de un eslabón fundamental en la cadena trófica puesto que estos se alimentan de un sin número de insectos y a su vez sirven de alimentos a muchos animales, pero en los últimos años se está presentando una reducción o extinción de un sinnúmero de especies lo cual es considerado una especie de “bioindicador” que busca alertar que algo no está bien (Fernández 2007).

Como es natural, el hombre hace caso omiso a estas advertencias por lo cual el problema ha seguido aumentando tanto que el ritmo de desaparición de especies de anfibios es cada vez mayor. En la Lista Roja de Especies Amenazadas, editada por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN), se señala que, de las 5.743 de especies conocidas, un tercio está en peligro de extinción. En los últimos 25 años, los científicos creen que al menos 122 especies han desaparecido (UICN 2006, Fernández 2007).

Colombia es un país rico en mucha diversidad y alberga una gran cantidad de especies de anfibios de las cuales muchos se encuentran en peligro y necesitan ser protegidas para su conservación. La especie Dendrobates bombetes (conocida también como rana venenosa del Valle), vive en parches de bosque conservado, entre 1300 y 2000 m sobre el nivel del mar en la Cordillera Central (Reserva Natural de Bremen:) y Cordillera Occidental (Reserva Natural del Yotoco) de Colombia. Además de esta distribución de montaña, se informa que esta se ha encontrado también en el lado Pacífico de la Cordillera Occidental, en una zona muy árida conocida como Cañón del Dagua (Suárez 2002). Esta llamativa y hermosa especie de rana endémica, está clasificada en estado vulnerable (VU) (Rueda 1998), aunque según otra fuente más actual esta en peligro (EN) (IUCN 2010), esto se debe posiblemente al aumento de la actividad agrícola y ganadera, además del alto trafico de estas puesto que son muy apetecidas como mascotas.

Para el caso de la reserva de Yotocó, la carretera de tráfico pesado, probablemente está aislando poblaciones de D. bombetes Esta afectación podría ocasionar que los individuos de estas poblaciones deban recurrir a la endogamia, lo cual a su vez puede disminuir la variabilidad genética de la especie. Cabe resaltar que esta rana a diferencia de la mayoría de los anfibios no se reproduce masivamente, puesto que solo pone un único huevo en cada ciclo de apareamiento (Pérez 2006) Esta información puede ser un punto clave a tener en cuenta al momento de realizar estudios que buscan la conservación de especies amenazadas.

En el presente proyecto, se quiere evaluar el grado de variabilidad genética de las poblaciones de D. bombetes presentes en la reserva de Yotocó. Además, debido a las afectaciones ambientales a que está sometida esta especie, se quiere determinar el nivel de estructuración genética de sus poblaciones. La información obtenida a partir de esta investigación, podría servir como una estrategia de manejo para Dendrobates bombetes, y a su vez, como información de base para futuras investigaciones con esta y otras especies que hacen parte de la biodiversidad Colombiana.

2. Justificación

El uso actual de la biodiversidad en Colombia es una actividad de la que se derivan beneficios alimentarios, económicos, sociales y culturales principalmente en zonas rurales del país. Es así como la línea de Saberes Locales y Uso de la Biodiversidad del Instituto Humboldt, realiza sus investigaciones con miras a caracterizar el uso y manejo de los recursos de la biodiversidad, en diferentes regiones del país. De este modo, se espera contribuir con la investigación al diseño de estrategias de manejo que contribuyan a la promoción de sistemas de manejo sostenibles de la fauna, flora y otros recursos silvestres como mecanismos para mejorar la calidad de vida de las comunidades locales, incrementar el conocimiento asociado a los recursos y buscar nuevas oportunidades de manejo y conservación de la biodiversidad. En este contexto, surge la necesidad de replantear los esquemas de conservación de la biodiversidad partiendo de la base según la cual las comunidades locales pueden y deben ser responsables del manejo de los recursos silvestres, de los cuales han dependido y han desarrollado técnicas de uso y manejo que aun siendo tradicionales, deben ser valoradas, no solo con el fin de garantizar su propia subsistencia, sino como una estrategia de conservación de la biodiversidad. Como se ha visto en los últimos tiempos, un plan conservacionista en algunos casos, es menos efectivo en términos de servicios a las comunidades locales, incluso cuando se trata de mantener especies objeto de uso. Para esto el Instituto Humboldt ha comenzado por hacer caracterizaciones de Uso de Biodiversidad con el fin de indagar acerca de intereses que tienen las comunidades en cuanto a la implantación de alternativas productivas basadas en el uso sostenible de productos silvestres, enfocándose en usos, espacios de uso y usuarios.(Angel y Vieira 2004)

Por otro lado Los venenos animales y vegetales son y seguirán siendo una fuente de sustancias de aplicación terapéutica en humanos; esto se observa en algunos miembros de la familia de anuros venenosos Dendrobatidae, los cuales secretan a través de la piel alcaloides tóxicos. Dicha toxicidad particular ha permitido que estos componentes aislados en los extractos de piel, se destaquen en la actualidad como sustancias importantes para el tratamiento del dolor en enfermedades como el cáncer, entre otras, y cuyo poder es comparable al de la morfina, con propiedades analgésicas mucho más intensas y al parecer no adictivas (Celis 2005) Las ranas del genero Dendrobates entre las cuales está D. bombetes, son una fuente alternativa para mejorar la calidad de vida humana, además de ser unas excelentes controladoras de plagas pues se alimentan de un sin número de insectos, por lo que vale la pena buscar la conservación de las especies en peligro, claro está toda especie por inútil que parezca desempeña un papel importante en la naturaleza, por lo que merece ser protegida.

3. Objetivos

3.1 Objetivo General

- Evaluar los niveles de estructuración (flujo genético) y Variabilidad genética de la especie Dendrobates bombetes entre las Poblaciones establecidas en las reservas del Yotocó y la reserva del Bremen, además de verificar estos mismos datos entre las subpoblaciones establecidas dentro de la reserva natural del Yotocó.

3.2 Objetivos específicos:

- Determinar la variabilidad genética de D. bombetes utilizando marcadores moleculares (microsatélites).

- Establecer los niveles de estructuración existentes entre las distintas poblaciones estudiadas de D. bombetes.

- Evaluar la morfometría de los individuos colectados con respecto al tamaño y los patrones de coloración.

4. Marco teórico

4.1 La familia Dendrobatidae

En Colombia existen cinco géneros de los nueve conocidos a nivel mundial para la familia Dendrobatidae, exclusiva de Sur y Centroamérica. Los dendrobátidos son ranas pequeñas cuya longitud rostro-cloacal puede variar desde menos de un centímetro a cinco centímetros; además, la mayoría de las hembras son de mayor tamaño que el macho, aspecto asociado con la reproducción, pues muestran un “amplexus” o abrazo sexual, durante el cual el macho, sobre la zona dorsal de la hembra hace presión en la parte lateral del abdomen para llevar a cabo la fecundación externa (Myers & Daly, 1983), de acuerdo con esto, muchos machos se relacionan con altos niveles de territorialidad e inversión de tiempo y energía durante el periodo reproductivo.

Son ranas de hábitos diurnos, y se caracterizan por poseer dos escudos dermales en el extremo distal de los dedos y por el comportamiento de cargar renacuajos en la espalda como parte del cuidado parental. Muchas especies excretan por su piel venenos alcaloides que les sirven como defensa en contra de depredadores. Las especies más tóxicas también se caracterizan por tener una coloración vistosa (aposemática) que sirve de advertencia a predadores. Al parecer, los alcaloides los obtienen de hormigas y otros insectos consumidos como parte de su dieta (Ron 2009).

Se reconocen diferentes patrones de coloración tanto intra como interespecíficos, pues esta familia de hábitos diurnos, incluye tanto especies aposemáticas aparentemente relacionadas con niveles de toxicidad (Dendrobates, Phyllobates y algunas Epipedobates) como crípticas (Colostethus) (Santos, et al 2003) Los géneros venenosos poseen sistemas muy eficientes para acumular selectivamente en la piel una variedad de alcaloides mediante la alimentación, sin embargo, los individuos en condiciones de cautiverio pierden su toxicidad al igual que su progenie (Daly et al, 1997).

4.2 Dendrobates bombetes

4.2.1 Sinónimos:

Dendrobates bombetes (Myer & Daly, 1980), Rana Rubí (Peréz 2006), Cauca poison Frog (Ramírez et al 2004), Minyobates bombetes (Myers, 1987), Ranitomeya bombetes (Grant et al 2006), Minyobates bourdonnant (Ostrowski 2010)

4.2.2 Descripción:

Son ranas muy pequeñas, que por lo general alcanza entre los 16-20 mm de longitud.

Carecen de histrioni – cotoxinas. No poseen dientes ni membranas pediales

interdigitales (Peréz 2006). Cromáticamente varían mucho, El color de fondo varia del

negro al marron oscuro con dos franjas dorsolaterales de color rojo o anaranjado que

comienzan por encima de la boca y que llegan a la mitad del cuerpo, a veces en toda

la espalda. La parte superior de las extremidades delanteras son del mismo color que

las franjas, el resto y las extremidades traseras suelen ser marrón-rojizo o verdoso, la

zona ventral es de color blanco-grisáceo con un moteado negro, verde pálido, azul

pálido (Schwarz et al 2009).

Sus larvas tiene el disco oral indentado, con un espacio medial en el labio inferior y 2/3

hileras de dentículos queratinizados.(Peréz 2006)

4.2.3 Clasificación taxonómica:

Reino:Animalia >> Phylum: Chordata >> Clase: Amphibia >> Orden: Anura >>

Familia: Dendrobatidae >> Género: Dendrobates >> Especie: Dendrobates

bombetes (Pérez 2006).

4.2.4 Distribución geográfica

La especie Dendrobates bombetes vive en parches de bosque conservado, entre 1300 y 2000 m sobre el nivel del mar en la Cordillera Central (Reserva Natural de Bremen:) y Cordillera Occidental (Reserva Natural del Yotoco) de Colombia. Además de esta distribución de montaña, se informa que esta se ha encontrado también en el lado Pacífico de la Cordillera Occidental, en una zona muy árida conocida como Cañón del Dagua (Suárez 2002).

4.2.5 Reproducción

La especie es capaz de reproducirse durante todo el año. Tras un cortejo elaborado en el que el macho guía a la hembra al sitio de postura (siempre en sitios húmedos) se produce un apareamiento sin amplexo y la hembra deposita un único huevo en ausencia de macho; el huevo no es custodiado permanentemente por sus padres. Los huevos eclosionan al cabo de 22 días y las larvas son recogidos por su padre para ser transportadas a los tanques de agua que se forman en las axilas de las hojas de las bromelias. La metamorfosis se completa al cabo de 140 días aproximadamente (Suárez 2002).

4.3 Marcadores moleculares y Microsatélites

Los marcadores moleculares son secuencias polimórficas de proteínas o de ADN que pueden ser utilizadas como indicadoras de la variación genética y nos pueden ayudar a responder preguntas en ecología que son difíciles de resolver de otra manera. Son fragmentos del genoma generalmente muy pequeños, que son tratados como loci, aunque no codifiquen para proteínas. El nivel de polimorfismo puede variar entre cero y cientos de alelos en una especie. La gran ventaja que tienen es que la variación en los marcadores puede ser cuantificada, lo que permite utilizar la estadística para hacer comparaciones. Hay distintos tipos de marcadores, cada uno con ventajas e inconvenientes (alozimas, RFLP, RAPD, minisatélites, microsatélites…), pero en los últimos años los microsatélites se han hecho muy populares para resolver muchos aspectos de la ecología molecular (González, 2003; Beebee & Rowe, 2004).

Un buen marcador molecular debe reunir una serie de características para maximizar su utilidad: buena distribución a lo largo del genoma, alto grado de polimorfismo, la técnica para analizar el

marcador debe ser rápida y práctica, y debe poder repetirse con fiabilidad en otros laboratorios (Aranguren et al 2001). Los marcadores microsatélites o Secuencias Simples Repetidas (SSRs) son regiones del genoma en las que una secuencia corta, se repite un cierto número de veces. Cada locus microsatélite tiene alelos con distinto número de repeticiones, lo cual se evidencia en bandas de distinto tamaño luego de su amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Estos marcadores se heredan de manera codominante, permitiendo diferenciar bandas en individuos homocigotos y heterocigotos (Zhang, 2004). Los microsatélites presentan altas tasas de mutación, lo que permite diferenciar individuos estrechamente emparentados (Zhang, 2004). Esta alta variabilidad genética es muy útil para describir la estructura y flujo genético en poblaciones de insectos (Espinoza et al 2007).

Los marcadores microsatélites son segmentos cortos de ADN de 1 a 6 pares de bases (pb), los cuales se repiten en tándem y de forma aleatoria en el genoma de los seres vivos (figura 1). Una de las ventajas de estos marcadores versus otros (minisatélites, RFLP, RAPD, etc.) radica en que están considerados, por la mayoría de autores como la más poderosa herramienta para los estudios de genética de poblaciones (Cheng y Crittenden,1994), ya que son muy polimórficos, presentan herencia mendeliana simple, son codominantes (pudiéndose diferenciar los individuos homocigotos de los heterocigotos), son fáciles de medir y analizar, y son cien por cien fiables, repetitivos y automatizables (Aranguren et al 2001)

Desde el desarrollo de la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) por Mullis y col. (1986), que consiste en la amplificación o reproducción “in vitro” de grandes cantidades de una región particular del ADN, a partir de una pequeña cantidad original de ADN (molde) y con el uso de dos secuencias cortas e informativas de oligos, denominados “primers” que resultan ser específicos de la región de interés y que garantizan que sólo esa parte, y ninguna otra, va a amplificar, se han ido desarrollando una serie de técnicas para realizar estudios de variabilidad genética en las especies animales (Aranguren et al 2001). El mayor inconveniente de los microsatélites es que necesitan ser aislados de novo en cada especie, debido a que se encuentran habitualmente en regiones no codificantes del genoma donde la tasa de sustitución de nucleótidos es muy alta, por lo que no existen primers o cebadores universales como en el ADN mitocondrial, lo que supone un elevado esfuerzo. Últimamente, y cada vez con mayor frecuencia, se intenta la amplificación cruzada con cebadores de una especie

en otra distinta, obteniéndose en algunos casos resultados positivos (Schlötterer et al., 1991; González, 2003; Strecker, 2006). En el grupo de los anfibios la utilización de microsatélites es muy frecuente para realizar estudios poblacionales enfocados a la conservación (Rowe et al., 2000; Beebee & Rowe, 2001; Vos et al., 2001; González, 2003; Burns et al., 2004) y se han aislado en muchas especies (Brede et al., 2001; Wieczorek et al., 2002; Julian & King, 2003; Chan, 2007)

4.4 Diversidad Fenotípica

Uno de los atributos universales observados en las poblaciones naturales es la diversidad fenotípica respecto a gran parte de sus caracteres (Hartl & Clark, 1997). Estas diferencias en el fenotipo observadas en las distintas poblaciones son atribuibles a un proceso continuo de selección, en la cual diversos caracteres pueden ser, en su conjunto, adaptativos (Mayr, 1968). Pese a que las poblaciones naturales de casi todas las especies generalmente se presentan subdivididas, a escalas geográficas más amplias, estas pueden mostrar un mayor grado de diferenciación genética debido a factores asociados, principalmente la presencia de barreras geográficas, disponibilidad de recursos y/o el aislamiento por distancia, entre otros.

5. Metodología

5.1 Marcadores moleculares

Se seleccionaron marcadores (microsatélites) específicos (tabla 1) diseñados por Martínez Barguil (2010) a partir de la secuencia EU342669 (Genbank) procedente de mitocondrias de dendrobates bombetes. Tabla 1. Marcadores Moleculares (Martínez 2010)

Marcador Molecular

LEFT PRIMER RIGHT PRIMER

DB1 CCTTAGAAGCCCACAAACGA GGCTCCTCTAGGGGGATATG

DB2 AACATCGCCTCCTGCATAAC AGGTTTATCCCCGCTTCTTC

DB3 CCTTAGAAGCCCACAAACGA GCTCCTCTAGGGGGATATGG

DB4 CAGCTTACCACGTGAGCGTA AGTGCCGGGTTAAAAAGGAC

5.2 Localidad y área De muestreo

Para el muestreo fueron seleccionadas 2 reservas forestales protegidas en las cuales se encuentra la mayor parte de la distribución de la especie estudiada, dichas reservas se muestran a continuación:

- La Reserva Forestal Yotocó (03°52’N 76°21’O), está localizada en el municipio de Yotocó, departamento del Valle del Cauca. Tiene una extensión de 559 hectáreas de bosques que se encuentran entre los 1.200 y 1.950 m de altitud, en la vertiente oriental de la cordillera Occidental. Este pequeño y aislado parche de bosque es uno de los últimos remanentes de bosque subtropical húmedo del Valle del Cauca, con árboles que superan los 50 metros de altura. Gran parte de la extensión total de la Reserva está bien conservada, aunque está dividida por una carretera de tráfico pesado que comunica Buga-Loboguerrero-Buenaventura (en los kilómetros 17 y 18 de la ciudad de Buga) (Franco & Bravo 2005). La clasificación holdridge para zonas de vida en esta reserva es Bh-PM (Jiménez et. al 2007)

El bosque de Yotocó pertenece a la Universidad Nacional de Colombia y es manejado por la CVC. La Reserva se encuentra bien protegida y CVC recientemente compró terrenos adicionales para expandir sus límites (FRANCO et. al 2005).

- La reserva de Bremen (04°40'27''N 75°37'56''O), está ubicado entre los 1.500 y 2.100 m de altitud sobre la vertiente occidental de la cordillera Central de los Andes en Colombia en

los municipios de Filandia y Circasia (Quindío) (BirdLife Internacional, 2009). Esta reserva además se identifica con un clima frío y muy húmedo (F-MH), donde la temperatura oscila entre 12 y 18 °C; y la precipitación promedio anual es entre 2.000 y 4.000 mm (convenio instituto de investigaciones de recursos biológicos Alexander Von Humboldt corporación autónoma regional de Risaralda, CARDER 2007).

La Reserva Forestal Bremen-La Popa (747 ha), propiedad de la Corporación Autónoma Regional del Quindío desde el año de 1970. Adicionalmente, los municipios de Filandia (Quindío) y Pereira (Risaralda) han establecido en sus planes de ordenamiento territorial esta área como una Zona de Especial Significación Ambiental, lo que la favorece y, de alguna manera, restringe su explotación en el futuro (BirdLife Internacional, 2009).

Por la condición de protección a las que están sometidas estas zonas se solicitan legalmente ante las autoridades ambientales los permisos para hacer el muestreo.

5.3 Descripción De Muestreo

- En La reserva De Bremen:

Se seleccionaran 80 individuos (D. Bombetes) adultos

- En la reserva forestal del Yotocó:

Se seleccionaran 80 individuos (D. Bombetes), teniendo en cuenta que se tomaran 40 a un lado de la carretera de trasporte pesado que atraviesa la reserva, los 40 faltantes serán recolectados del lado restante de dicha carretera.

A cada ejemplar con ayuda de una espátula se le raspara cuidadosamente el paladar para obtener saliva y almacenarla adecuadamente para los análisis posteriores.

5.4 Analisis morfométrico

5.4.1 Medidas Morfometricas

A cada ejemplar (D. Bombetes) se le tomará la longitud rostro – cloaca utilizando un vernier de 0.001 de precisión teniendo en cuenta de que una misma persona haga las mediciones para reducir errores por la percepción.

Los individuos se pesan utilizando una balanza analítica digital de marca OHAUS Pro AV624 de 0.01 g de precisión.

Además de esto se debe describir la coloración presente en cada individuo. Esto con soporte fotográfico.

5.4.2 Análisis de datos Morfométricos

Se clasificaran los individuos de acuerdo a su coloración, tamaño sitio en el cual fueron encontrados y luego se verificara las variaciones entre estos, mediante un análisis estadístico.

5.5 Estudio Genético

5.5.1 Análisis de laboratorio

Las técnicas moleculares y el análisis de los datos se desarrollarán en el Banco de Tejidos/Laboratorio de Biología Molecular, Instituto de Investigación de Recursos Biológicos “Alexander von Humboldt” , ubicado en el Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) en el municipio de Palmira, Valle del Cauca.

5.5.2 Extracción de ADN El ADN se extraerá utilizando el método de fenol-cloroformo, o en su defecto mediante extracción por el método de salting-out (Sambrook et al., 1989). La cantidad y calidad del ADN extraído se evaluará en gel de agarosa al 0.8% teñido con bromuro de etidio, y se cuantificará con transiluminador.

5.5.3 Amplificación de loci microsatélites:

Se realizará una PCR para los loci microsatélites hipervariables DB1, DB2, DB3, DB4, diseñados para Dendrobates Bombetes por Juan Camilo Martinez Barguil (2010). Se amplificará 100 ng de ADN en un volumen final de 50µl utilizando las condiciones siguientes (González et. al 1995): dNTPs - - - - - - - - - - - - - - - 0,2mM MgCl2 - - - - - - - - - - - - - - - 1,5mM Buffer - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 X

Taq Pol - - - - - - - - - - - - - 2,0-2,5U Primers - - - - - - - - - - - - - - -0,2µM

Luego se hace un pcr en “tocuhdown”, teneindo en cuenta la temperatura de aliniamiento de cada primer. Iniciar con un annealing 10°C por encima de la temperatura de cada primer e ir disminuyendo 1°C por un ciclo hasta llegar a la temperatur apropia del primer. Denaturar a 94°C durante 1 minuto Denaturación : 94°C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 10 seg Alineamiento: 66°C – (1°C/Ciclo) - - - - - - - - - - 1 min Extension: 72°C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 min Hacer 10 ciclos Denaturar a 94°C durante 1 minuto Denaturación : 94°C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 10 seg Alineamiento: 56°C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 1 min Extension: 72°C - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 2 min Hacer 20 ciclos

Ahora un paso final de extensión de 72°C Se procede con la adición de 15 a 20µl del producto en gel de poliacrilamida. Se corre esta mezcla en TBE 1X a 300 V por el tiempo requerido (Aproximadamente 2 horas) Como paso siguiente se tiñe con bromuro de etidio a una concentración de 1 µg/ml durante 3 minutos y para finalizar se realiza el fotografiado Para el gel de poliacrilamida se requiere (González et. al 1995): Acrilamida/Bis-acrilamida(29:1) 30% - - - - - - - - - - 16.6 ml 10X TBE - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 5.0 ml Persulfato de amonio 10% (Recien Preparado) - - - 0.35 ml H2O - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 28.0 ml Desgasificar aplicando Vacio durante 10 min Temed - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - 0.04 ml Verter el gel y dejar polimerizar durante una hora

5.5.4 Análisis de datos genéticos

Para estimar el nivel de diversidad genética se utilizará el programa POPGEN versión 1.31 (Yeh et al., 1999), para lo cual se construirá una matriz con los genotipos de cada individuo evaluado. Se obtendrán medidas de diversidad genética general como el número total de alelos, número efectivo de alelos (Kimura & Crow, 1964), frecuencias alélicas, heterocigosidad observada (Ho), heterocigosidad esperada o índice de diversidad genética (He), y estructura genética (GST) (Nei, 1973).

6. Cronograma de actividades

ACTIVIDAD

Meses

1

2

3

4

5

6

7

Estandarización de técnicas y solicitud de permisos ambientales

X

Revisión de información sobre la zona de muestreo

X

Desplazamiento al sitio de muestreo y toma de muestras.

X

Desplazamiento al municipio de Palmira para llevar a cabo los análisis de laboratorio

X

X

X

Análisis De Datos

X

X

X

X

Entrega del informe final

X

7. Presupuesto.

7.1 Fuentes De Financiación

Tipo de Fuente

Fuente

Valor Aportado ($)

Externa

FONAM

37.000.000

Externa

Colciencias

40.000.000

Interna

Universidad Nacional De Colombia (contrapartida)

35.000.000

7.2 Valor total del proyecto

Costos Totales ($)

112.000.000

7.3 Rubros Financiados

Tipo De Rubro

Valores (% Total)

Personal

41,4

Equipos

12,6

Materiales y Suministros

11

Salidas de Campo

19.5

Uso de Equipos y Laboratorios

15.5

Total

100%

7.4 Detalles de Rubros 7.4.1 Gastos de Personal

Descripción

Valor ($)

Estudiante Maestría

12.930.000

Estudiantes Pregrado

5.120.000

Director de tesis (contrapartida UN)

12.000.000

Asesor (Contrapartida Un)

12.000.000

Auxiliares De Campo

4.318.000

Total

46.368.000

7.4.2 Compra de Equipos

Descripción

Valor ($)

Computador

4.500.000

Equipo Fotográfico

4.800.000

Equipo De caza De Ranas

4.812.000

Total

14.112.000

7.4.3 Materiales y suministros

Descripción

Valor ($)

Plásticos y fungibles (frascos, jeringas, bolsas, nevera portátil, viales 0.2, 1.5 y 2.0 ml, puntas micropipeta, toallas de papel, guantes, cuchillas)

200.000

Papelería, fotocopias, marcadores indelebles, libretas de campo

230.000

Secuencias cebadoras (primers) para PCR

3.000.000

Enzimas y reactivos para PCR

5.437.000

Material para Extracción de ADN

3.652.800

Total

12.320.000

7.4.4 Salidas de Campo

Lugar

Costo Unitario ($)

Cantidad

Valor ($)

Viáticos y transporte para tres personas durante12 días en los puntos de muestreo en cada salida

10.920.000

2

21.840.000

7.4.5 Uso de equipos y laboratorio

Item Valor ($)

Uso de los Laboratorios de Biología molecular y Banco De Tejidos en las instalaciones del instituto de investigación de recursos biológicos “Alexander Humboldt”, así como los equipos necesarios para los procedimientos requeridos para el estudio (Termocicladores, computadores, GPS, cámara fotográfica, balanzas analíticas, micropipeteadores, autoclave para esterilización, ultra purificador y destilador de agua, baño maría, microcentrífugas, fuentes de poder y congeladores, cámara de Extracción, neveras)

17.360.000

8. Bibliográfia

1. Acelas-Mantinilla, M. de J.; Rosales-Solano, H. F Universidad industrial de. Santander, Colombia; Toxinas y alcaloides de las ranas de la familia dendrobatidae.

2. Angel D. y Vieira M. I. 2004. Caracterización preliminar del uso de la biodiversidad en los hatos Guamito y Santa Trinidad, municipio Hato Corozal, Casanare. Informe presentado por la línea de Uso de biodiversidad. Proyecto Orinoquía. Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt. Bogotá, Colombia. 50 P.

3. Aranguren-Méndez, José A. y Jordana Jordi, Utilización de marcadores de ADN (microsatélites) en poblaciones de animales domésticos en peligro de extinción, 2001

4. Beebee, T.J.C. & Rowe, G. 2004. An introduction to molecular ecology. Oxford University Press. 346p

5. Beebee, T. J. C. & Rowe, G. 2001. Application of genetic bottleneck testing to the investigation of amphibian declines: a case study with Natterjack Toads. Conservation Biology, 15(1): 266-270.

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9. Resultados esperados Al momento de la finalización de este proyecto se tendrá información considerable para la mejorar y estipular nuevas decisiones acerca de la conservación de la especie Dendrobates bombetes pues conoceremos detalladamente si existe o no flujo genético y variabilidad entre los parches ubicados en los andes. Además de esto este trabajo puede ser motivo de nuevas investigaciones y fuente de información puesto que la existente acerca de esta hermosa y útil rana es muy limitada.