evaluaciÓn histoquÍmica de los proteoglicanos
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UNIVERSIDAD FINIS TERRAE
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
ESCUELA DE ODONTOLOGIA
EVALUACIÓN HISTOQUÍMICA DE LOS PROTEOGLICANOS
INTRATUBULARES DE LA DENTINA TRANSPARENTE
RADICULAR
VALENTINA FULLOLA ARRIAGADA
MACARENA GONZÁLEZ CANTERGIANI
Tesis presentada a la Facultad de Odontología de la Universidad Finis Terrae,
para optar al Título de Cirujano Dentista
Profesor Guía: Alejandro Oyarzún Droguett
Santiago, Chile
2018
2
Agradecimientos
Nos gustaría comenzar agradeciendo a nuestro profesor guía; Dr. Alejandro
Oyarzún, muchas gracias por apoyarnos y acompañarnos en este camino, por
dedicarnos tiempo y paciencia.
Queremos agradecer principalmente a nuestra familia y amigos, a ellos va
dedicado este trabajo, gracias por su apoyo constante año a año dándonos la
motivación suficiente para lograr terminar este proceso. Principalmente dar las
gracias a nuestros padres que han estado en cada momento a lo largo de la
carrera y han confiado en nosotras. A nuestros hermanos, que han sido parte de
este largo camino, por el apoyo incondicional.
Gracias a los que forman parte de nuestras vidas en este proceso final, cada
uno forma parte de nuestro crecimiento personal y formación como profesional.
3
Índice
RESUMEN.......................................................................................4-6
INTRODUCCIÓN..............................................................................7-8
MARCO TEÓRICO...........................................................................9-13
HIPOTESIS Y OBJETIVOS..............................................................14
MATERIAL Y MÉTODO....................................................................15-17
RESULTADOS..................................................................................18-29
DISCUSIÓN......................................................................................30-34
CONCLUSIÓN...................................................................................35
BIBLIOGRAFÍA..................................................................................36-38
4
Resumen
La dentina es un tejido mineralizado, compuesta por proteínas colágenas, no
colágenas y complejos proteoglicanos - glicosaminoglicanos (PGs-GAGs). Ésta se
modifica bioquímica y estructuralmente durante el ciclo de vida de una pieza
dentaria. Una de las modificaciones más importantes es la transparentación de la
matriz dentinaria inducida por la obliteración o esclerosis de los túbulos
dentinarios.
El propósito de este trabajo de investigación, es determinar la alteración de los
complejos PGs-GAGs intratubulares en la dentina transparente radicular. Para tal
efecto, se utilizarán piezas dentarias sanas libres de caries, extraídas por mal
pronóstico periodontal o protésico (N=10) y 5 premolares extraídos por indicación
protésica de pacientes entre 15 a 18 años con formación radicular completa. Se
realizarán cortes transversales mineralizados de 1 mm de espesor desde el borde
incisal o superficie oclusal hasta el ápice anatómico. Los cortes se
acondicionarÁn con ácido ortofosfórico al 37% durante 30 segundos, para
posteriormente ser incubados en una solución de Alcian Blue 8gx al 1%, en ácido
acético 0,1% durante 12 hrs a temperatura ambiente.
Los cortes serán observados mediante microscopia estereoscópica por
epiiluminación y las imágenes se almacenarán como archivo JPEG. Se observó,
que independientemente de la edad de los individuos, la dentina radicular se
transparenta progresivamente desde el límite amelocementario hasta el ápice
anatómico de las piezas dentarias estudiadas. La tinción histoquímica demostró
una reactividad positiva en las zonas de dentina opaca y una reactividad negativa
en las zonas de dentina transparente.
5
Se concluye que la transparentación dentinaria se relaciona con una
modificación o pérdida de los proteoglicanos intratubulares. Al igual que en otros
sistemas biológicos, los PGs de la matriz intratubular actuarían como inhibidores
de la mineralización biológica.
Abstract
Dentin is a mineralized tissue, composed by collagen proteins, non-collagen
and complex proteoglycans - glycosaminoglycans (PGs-GAGs). It changes
biochemically and structurally during the life cycle of a dental piece. One of the
most important modifications is the transparency of the dentin matrix induced by
the obliteration or sclerosis of the dentinal tubules.
The purpose of this research work is to determine the alteration of intratubular
complex PGs-GAGs in the transparency of the root dentine. For this purpose,
healthy teeth free of cavities, extracted by poor periodontal or prosthetic prognosis
(N = 10) and 5 premolars extracted by prosthetic indication of patients between 15
and 18 years old with complete root formation will be used. Mineralized cross
sections of 1 mm thickness will be made from the incisal edge or occlusal surface
to the anatomical apex. The cuts will be conditioned with 37% orthophosphoric acid
for 30 seconds, to be subsequently incubated in a solution of Alcian Blue 8gx 1%,
in 0.1% acetic acid for 12 hours at room temperature.
The slices will be observed by stereoscopic microscopy by epilumination and
the images will be stored as a JPEG file. It was observed that, regardless of the
age of the individuals, the root dentine progressively becomes transparent from the
amelocementary limit to the anatomical apex of the studied dental pieces.
Histochemical staining showed positive reactivity in the areas of opaque dentine
and a negative reactivity in the areas of transparent dentine.
6
It is concluded that the transparency of the dentin is related to a modification or
loss of intratubular proteoglycans. Likewise, in other biological systems, the PGs of
the intratubular matrix would act as inhibitors of biological mineralization.
7
Introducción
La dentina es un tejido mineralizado, que ocupa gran parte de la estructura
dental. A diferencia del esmalte, es un tejido vital y dinámico, lo que le permite
modificar su microestructura y composición como respuesta a procesos
fisiológicos (edad, atricción), o patológicos, tales como la erosión, la abrasión, la
abfracción o la caries. Morfológicamente está compuesta por túbulos dentinarios,
los que delimitan la matriz intertubular (1).
La dentina se modifica estructuralmente durante el envejecimiento lo que
involucra una transparentación de las matrices mineralizadas. La transparencia se
debe a la esclerosis tubular. Que se produce por una obliteración luminal por
material calcificado, lo que le otorga a la dentina una apariencia de vítrea cuando
se observa en los distintos tercios de la raíz dentaria. La dentina que ha sufrido
este cambio se conoce como "dentina transparente". (2)
La matriz dentinaria está compuesta por proteínas colágenas, no colágenas y
complejos PGs-GAGs. (3) Los proteoglicanos (PGs) son un grupo de
macromoléculas presentes en la superficie celular y en la matriz extracelular, que
están compuestos por un núcleo proteico, al cual se le unen covalentemente una o
más cadenas de glicosaminoglicanos (GAGs) que son polímeros lineales. (4) Los
PGs regulan la adhesión celular, el crecimiento celular y la formación de la matriz
de tejido conectivo. Tanto los GAGs como los PGs, han sido identificados en
predentina y dentina. Los PGs ricos en leucina (decorina, biglican y lumican) han
sido detectados en predentina. Además en dentina encontramos decorina en el
interior de los túbulos dentinarios.(5)
Estudios morfológicos cuantitativos previos determinaron que la dentina de
dientes senescentes presentaban una menor afinidad tintorial por colorantes
policatiónicos, sugiriéndose la pérdida de GAGs – PGs de la matriz mineralizada.
Sin embargo, las metodológías empleadas no relacionaron la pérdida de afinidad
tintorial con la transparencia dentinaria inducida por el envejecimiento. (6)
8
Considerando lo anterior, sería importante estudiar el comportamiento de los
complejos GAGs-PGs intratubulares durante el ciclo de vida de la pieza dentaria
para explicar fenómenos asociados a problemáticas relacionadas con terapeútica
endodóntica y rehabilitadora, entre otras.
9
Marco Teórico
La dentina es el tejido mineralizado que constituye la mayor parte de la
estructura dental y sus propiedades son determinantes en casi todos los
procedimientos de Odontología Restauradora. Es importante conocer las
propiedades mecánicas de la dentina para entender la fisiología de la masticación
y cómo, estas influyen sobre la terapéutica y el pronóstico de innumerables
procedimientos odontológicos que involucran a este tejido mineralizado. (7)
La dentina está compuesta en un 70% por una fase mineral, 20% por una
matriz orgánica y cerca de un 10% por agua. Por volumen, la fase mineral aporta
aproximadamente un 50%, la matriz orgánica un 30% y la fase acuosa un 20% (8).
Morfológicamente la dentina está compuesta por túbulos dentinarios, los que
delimitan la matriz intertubular. En el interior de los túbulos dentinarios se pueden
observar áreas hipermineralizadas que van disminuyendo el diámetro tubular
(dentina intratubular) (2).
Los túbulos dentinarios atraviesan toda la dentina y miden aproximadamente
de 1–3 μm y pueden curvarse continuamente desde la pulpa hasta el límite
amelodentinario. Estos se relacionan directamente con la permeabilidad del tejido.
(9) De gran importancia es la densidad y el diámetro tubular; la densidad disminuye
al aumentar la profundidad desde el límite amelocementario hasta el/los ápices (10).
Dentro de la matriz orgánica dentinaria podemos encontrar, proteínas
colágenas (principalmente colágeno tipo I) y proteínas no colágenas. Una
categoría de las proteínas no colágenas se denomina familia SIBLING (Small
Integrin-Binding Ligand, N-linked Glycoprotein), que incluye osteopontina,
sialoproteína ósea, proteína de matriz de dentina-1, dentina sialofosfoproteína y
fosfoglicoproteína de matriz extracelular. Otro grupo de macromoléculas
polianiónicas no colágenas presentes en la matriz de dentina son los
proteoglicanos (PGs) (11).
10
Las proteínas colágenas son el principal constituyente orgánico de la dentina,
con aproximadamente un 90% del total de la matriz dentinaria. El colágeno tipo I
es la especie molecular que se observa predominantemente en la dentina. La
presencia de colágeno tipo III es más controversial. Parece estar ausente en
dentina y predentina normal, pero se hace presente en algunas condiciones
patológicas, como Dentinogénesis Imperfecta (9). Colágeno tipo V ha sido
identificado en cultivos odontoblásticos y en gérmenes dentarios conformando un
3% del colágeno sintetizado y secretado por el odontoblasto (11).
El ensamblaje de estas fibras colágenas está dado por un complejo de fibrillas
de 70-90 nm de diámetro, conectadas a su vez, por fibrillas más pequeñas del
orden de los 20-40 nm de diámetro. Esta compleja organización molecular
involucra a otras proteínas no colágenas, tales como los proteoglicanos
dentinarios, que cumplen un importante rol en la estabilización de la trama fibrilar
colágena (12).
Los proteoglicanos (PGs) son un grupo de macromoléculas presentes en la
superficie celular y en la matriz extracelular, que están compuestos por un núcleo
proteico, al cual se le unen covalentemente una o más cadenas de
glicosaminoglicanos (GAGs). Los GAGs son polímeros lineales de unidades
disacáridas repetidas, compuestos principalmente por un ácido urónico y una
hexosamina, y son los principales hidratos de carbono que componen los PGs.
Estas cadenas de GAGs unidas a un núcleo proteico, son importantes en la
determinación de las características funcionales que presentan los diferentes PGs
(4).
Los PGs regulan la adhesión celular, el crecimiento celular y la formación de la
matriz de tejido conectivo. Por otra parte, pueden regular el paso y difusión de
macromoléculas a través del tejido conectivo. Debido a los grupos carboxilos y
sulfatos presentes en las cadenas de GAGs, los PGs son moléculas altamente
11
polianiónicas, acídicas e hidrofílicas, lo que les permite atraer agua y materiales
catiónicos a los tejidos. Tanto los GAGs como los PGs, han sido identificados en
predentina y dentina. Los PGs ricos en leucina (decorina, biglican y lumican) han
sido detectados en predentina. Además, en dentina encontramos decorina en el
interior de los túbulos dentinarios (5).
Topográficamemte, la dentina de la zona externa se conoce como dentina del
manto y se relaciona con el límite amelodentinario y cementodentinario. La dentina
circumpulpar, constituye el mayor volumen de la dentina mineralizada
relacionándose con la pulpa dental a través de la predentina. Histogenéticamente,
la dentina se divide en dentinas primaria, secundaria y terciaria. La dentina
primaria se sintetiza tempranamente durante la dentinogénesis, en forma
centrípeta a partir del límite amelocementario y limite amelodentinario. La dentina
secundaria se sintetiza a continuación de la primaria durante todo el ciclo de vida
de la pieza dentaria y es la responsable de la disminución del lumen de la cámara
pulpar y conductos radiculares. La dentina terciaria en sus modalidades reaccional
y reparativa, se sintetiza como respuesta a estímulos patológicos como caries
dental. (13)
Con el envejecimiento la dentina normal se modifica bioquímica y
morfológicamente, y se transparenta. La transparencia se debe a la esclerosis
dentinaria, que se produce por una obliteración de los lúmenes tubulares por
material calcificado, que da lugar a una apariencia vítrea a la dentina opaca
cuando se observa por transiluminación y epiiluminación. La dentina que ha
sufrido este cambio se conoce como "dentina transparente" (2).
La esclerosis tubular o la formación de dentina transparente, es un fenómeno
fisiológico que se inicia en la tercera década de la vida, en la región apical de la
raíz y avanza coronalmente con la edad. Las evaluaciones histológicas han
demostrado que la esclerosis comienza en la raíz y progresa hasta la corona.
Dentro de la raíz, la esclerosis se inicia en el límite cemento dentina y progresa
12
hacia la pulpa. Además, los cambios comienzan en los aspectos mesial y distal de
la raíz y luego se diseminan a las regiones lingual y bucal. Estas variaciones
regionales podrían deberse a la menor densidad de túbulos en las paredes distal y
mesial. (14)
La disminución del diámetro del lumen que acompaña al envejecimiento
reduce la profundidad de la penetración bacteriana dentro de los túbulos. Es por
esto que la infección en los túbulos dentinarios es menos extensa en pacientes
mayores con infecciones pulpares. Sin embargo, las fracturas radiculares
verticales son significativamente más prevalentes en pacientes mayores, es por
esto que la rehabilitación de dientes tiene un peor pronóstico que dientes más
jóvenes. De hecho, en los dientes que requieren tratamiento del conducto radicular
con postes, es más probable que se produzca una fractura de raíz vertical en los
dientes de pacientes mayores (más de 60 años). (15)
Con el objeto de estudiar la afinidad tintorial de colorantes policatiónicos sobre
la matriz dentinaria en distintas etapas del ciclo de vida de la dentición humana, se
realizó un ensayo histoquímico con Azure A en dentinas de diferentes grupos
etarios. Se observó que en grupos etarios más jóvenes (5 a 19 años) en
comparación con los grupos etarios de mediana edad o tercera edad (30 a 79
años) la reacción histoquímica fue más intensa. Los autores sugieren que el
decrecimiento de la tinción en las dentinas más viejas se debe a la pérdida de los
sitios aniónicos presentes en los GAGs dentinarios. Este estudio fue realizado en
cortes de dientes desmineralizados y la pérdida de la tinción de la dentina no fue
relacionada con la transparencia coronal o radicular. (16)
El envejecimiento de los tejidos dentarios mineralizados es un tema de interés
para la mayor parte de las especialidades odontológicas. El diente sufre ciertos
cambios con la edad, incluido el desgaste del esmalte, la formación de dentina
transparente o esclerótica, una disminución en el número de odontoblastos y un
aumento en el grosor de la dentina. Los cambios en la microestructura de la
13
dentina producen variaciones en sus propiedades mecánicas, que son importantes
para la valoración de tratamientos restauradores y /o rehabilitadores. (17)
Estudiar la matriz extracelular dentinaria durante el proceso de
transparentación dentinaria podría aportar al conocimiento general del proceso de
biomineralización y en particular al rol de estas macromoléculas durante la
dentinogénesis y sus implicancias clínicas específicas. Lo anterior nos lleva a
formular la pregunta de investigación: ¿cuál es el comportamiento de los PGs-
GAGs en las aéreas de dentina transparente radicular?
14
Hipótesis
Los PGs-GAGs de la dentina intratubular disminuyen en las zonas de dentina
transparente radicular.
Objetivos
1. Objetivo General:
Determinar la disminución de los proteoglicanos intratubulares en la dentina
transparente de la raíz dentaria.
2. Objetivos Específicos:
1. Analizar la distribución de PGs-GAGs en la dentina opaca y dentina
transparente radicular
2. Observar la distribución de PGs-GAGs en los tercios cervical, medio y
apical de la raíz dentaria.
15
Material y Método
Diseño
Se utilizó un diseño de estudio experimental descriptivo ex vivo.
Muestra
La muestra está constituida por 15 piezas dentarias, de distintos pacientes,
libres de caries. Diez especímenes fueron extraídos por mal pronóstico
periodontal/rehabilitador en pacientes de 50 años de edad y cinco especímenes
fueron obtenidos de pacientes de 15 años por indicación de ortodoncia con
formación radicular completa.
Criterios de elegibilidad:
- Criterios de inclusión:
Se incluyeron todas las piezas dentarias que no presenten caries entre
15 y 50 años de edad.
- Criterios de exclusión:
Se excluyeron a todas las piezas dentarias que presenten caries dental
y lesiones cervicales no cariosas.
Variables:
- Variable dependiente: Proteoglicanos intratubulares.
Definición conceptual: Los proteoglicanos (PGs) son un grupo de
macromoléculas presentes en la superficie celular y en la matriz extracelular, que
están compuestos por un núcleo proteico, al cual se le unen covalentemente una o
más cadenas de glicosaminoglicanos (GAGs).
16
Definición operacional: Histoquímica de proteoglicanos y análisis microscópico.
- Variable independiente: Dentina transparente.
Definición conceptual: Tejido dentinario hipermineralizado por obliteración de los
lúmenes de los túbulos dentinarios.
Definición operacional: Mediante microscopía estereoscópica por epiiluminación
y luz polarizada por transiluminación
Recolección de Datos
Los especímenes se obtuvieron en la Clínica de Cirugía de la asignatura de
Medicina Estomatológica y Clínica del Dolor (MED) de la Facultad de Odontología
de la Universidad Finis Terrae, con el consentimiento informado de cada paciente
entregado para cualquier procedimiento médico-quirúrgico (Convenio Prestación
de Servicios Odontológicos/Anexo Séptimo). Para esta investigación no se utilizó
información personal ni datos personales del paciente. Todos los procedimientos
post extracción del diente, para realizar la evaluación histoquímica de la estructura
dental, se realizaron en el Laboratorio Clínico de Ciencias Básicas de la Facultad
de Odontología de la Universidad Finis Terrae.
Cada espécimen se fijó en una solución de formaldehído al 10% durante 24
horas. Transcurrido este tiempo se realizó el siguiente procedimiento:
Los especímenes se incluyeron en metilmetacrilato y se realizaron cortes
transversales de 1 mm desde incisal a apical. Los cortes se realizaron en una
máquina cortadora de tejidos mineralizados (Isomet 1000, Buehler USA) bajo
refrigeración constante. Todos los cortes de todos los especímenes se
acondicionaron con ácido ortofosfórico al 37% durante 30 segundos, se lavaron
profusamente con agua destilada y se tiñeron con una solución de Alcian Blue al
0,5%, en ácido acético 0,1%, durante 12 horas a temperatura ambiente.
17
Las superficies de corte teñidas fueron observadas con un microscopio
estéreo Nikon SMZ-800 mediante epiiluminación y mediante luz polarizada por
transiluminación. Las zonas de interés fueron fotografiadas con una cámara digital
Nikon DS-Fi1. Las imágenes fueron guardadas como archivos JEPG. Como
control, se utilizó la dentina opaca de la corona dentaria de cada espécimen
Los datos obtenidos mediante microscopia estereoscópica, son presentados
como microfotografías digitales sobre las cuales se realizó un diagnóstico
histomorfológico.
18
Resultados
Análisis Macroscópico
A la inspección visual se observó que todos los especímenes de la muestra
presentaban las raíces dentarias de una coloración amarillenta con intensidades
variables que disminuía progresivamente a medida que se asciende hacia el tercio
apical.
Una observación destacable es que, al observar los especímenes embebidos
en agua por epiluminacion sobre un fondo negro, los tercios apicales de las raíces
dentarias de todos los especímenes de la muestra, presentaban pérdida de la
coloración amarillenta (Figura 1).
Figura 1. Incisivo Central Superior
Derecho.
19
Análisis microscópico
La observación microscópica de los cortes transversales, mediante
epiluminacion sobre fondo negro, permitió detectar nítidamente que la mayor parte
de la dentina circumpulpar de la corona dentaria se observa de un color blanco-
opaco (Figura 2- 2a)
La dentina del manto adyacente al límite amelodentinario se detectó de color
negro.
En los cortes transversales de 1 mm apical al límite amelocementario se
detectó la pérdida del color blanco-opaco en la dentina circumpulpar y un aumento
progresivo de la coloración negra desde el cemento radicular hacia la predentina
radicular. En los últimos milímetros del tercio apical, la dentina circumpulpar pierde
completamente la opacidad conferida por el color blanco, descrito previamente
(Figura 2- 2m/2n).
20
Figura 2
21
Leyenda de Figuras
Figura 2: Se observan cortes transversales de 1 mm de grosor, a partir del límite
amelocementario LAC (Figura 2a) hasta el milímetro final de la raíz (Figura 2n)
Obsérvese, la dentina periférica de color negro, produciéndose un aumento
progresivo de esta coloración desde el cemento radicular hacia el conducto
radicular. Además, se puede observar que la dentina circumpulpar de la corona
dentaria presenta un color blanco-opaco.
2a
2b
2c 2d
2f
2g
2h 2i
2k
2l
2m 2n
2e 2j
22
Detección histoquímica de los Proteoglicanos – Glicosaminoglicanos.
Se observó en los cortes transversales de los especímenes utilizados que la
reacción histoquímica se detectó como áreas de color azul-turquesa distribuidas
en la dentina circumpulpar, recorriendo el trayecto de los túbulos dentinarios
desde la predentina hacia el límite amelodentinario o amelocementario.
Se observó una reactividad positiva en todas las zonas de dentina
circumpulpar blanco-opaco. Las zonas de dentina circumpulpar de color negro,
fueron no reactivas a la reacción histoquímica.
A medida que los cortes ascendían a apical, desde el LAC, la tinción fue
disminuyendo progresivamente desde la periferia de la raíz hacia las paredes del
conducto radicular. Es así como, en los milímetros más apicales de la raíz la
tinción histoquímica solo fue evidenciada en la predentina y en zonas adyacentes
al conducto radicular (Figura 3-4-5-6).
23
Figura 3 3e 3j
24
Leyenda de Figuras
Figura 3: Se observan cortes transversales de 1 mm de grosor a partir de la
superficie oclusal de un premolar (Figura 3a) hasta el milímetro final de la raíz
(Figura 3o). Tinción con Alcian Blue.
Obsérvese, que la reacción histoquímica se detecta como áreas de color azul-
turquesa distribuidas en la dentina circumpulpar. Se observó una reactividad
positiva en todas las zonas de dentina circumpulpar blanco-opaco. Las zonas de
color blanco-amarillento no fueron reactivas a la tinción.
25
Figura 4
26
Leyenda de Figuras
Figura 4: Se observan cortes transversales de 1 mm de grosor a partir del LAC
(Limite Amelocementario) con tinción de Alcian Blue con un mayor aumento de la
Figura 3.
(Figura 4a) hasta el milímetro final de la raíz (Figura 4o) en Premolar Superior
Derecho.
La Figura 4a corresponde al recuadro mostrado en la Figura 3a,
La Figura 4b corresponde al recuadro mostrado en la Figura 3b.
La Figura 4c corresponde al recuadro mostrado en la Figura 3d.
La Figura 4d corresponde al recuadro mostrado en la Figura 3g.
La Figura 4e corresponde al recuadro mostrado en la Figura 3j.
La Figura 4f corresponde al recuadro mostrado en la Figura 3l.
La Figura 4g corresponde al recuadro mostrado en la Figura 3m.
La Figura 4h corresponde al recuadro mostrado en la Figura 3n.
27
Figura 5
28
Leyenda de Figuras
Figura 5: Se observan cortes transversales de 1 mm de grosor a partir borde
incisal (Figura 5a) hasta el milímetro final de la raíz (Figura 5o) de un Incisivo
Lateral Superior Derecho.
Obsérvese, la reacción histoquímica que se produce como áreas azul-turquesa
distribuidas en la dentina circumpulpar. Se observó una reactividad positiva en
todas las zonas de dentina circumpulpar blanco-opaco.
29
Figura 6
30
Leyenda de Figuras
Figura 6: Se observan Cortes Transversales de 1 mm de grosor a partir del LAC
(Limite Amelocementario) con tinción de Alcian Blue con un mayor aumento de la
Figura 5.
(Figura 6a) hasta el milímetro final de la raíz (Figura 4h) en Premolar Superior
Derecho.
La Figura 6a corresponde al recuadro mostrado en la Figura 5a.
La Figura 6b corresponde al recuadro mostrado en la Figura 5d.
La Figura 6c corresponde al recuadro mostrado en la Figura 5f.
La Figura 6d corresponde al recuadro mostrado en la Figura 5h.
La Figura 6e corresponde al recuadro mostrado en la Figura 5k.
La Figura 6f corresponde al recuadro mostrado en la Figura 5n.
La Figura 6g corresponde al recuadro mostrado en la Figura 5p.
La Figura 6h corresponde al recuadro mostrado en la Figura 5r.
31
Discusión
En la presente investigación, utilizamos métodos histoquímicos para analizar
el contenido de GAGs y PGs de la dentina transparente radicular humana. Con
nuestras observaciones, intentamos contribuir al conocimiento de la función de
estas macromoléculas extracelulartes en la dentina normal y durante el proceso de
transperentación.
El estudio de la dentina transparente se ha realizado clásicamente en cortes
de dientes mineralizados y observados con microscopías de epiilumninación,
transilumnación y luz polarizada. Con éstas técnicas la matriz dentinaria
transparente se observó como áreas de aspecto vítreo, translúcido, brillante y que
exhiben una birrefringencia negativa(18,19)
En el presente estudio, el que empleó cortes transversales de dientes
mineralizados de 1 mm de grosor, embebidos en agua y analizados a través de
microscopía de epiluminacion, sobre un fondo negro, logramos obtener imágenes
de las zonas transparentes con gran definición ya que se discrimina nítidamente
las zonas de dentina opaca de las zonas de dentina transparente. La distribución
de la dentina transparente observada en las raíces de todos los especímenes
concuerda con lo reportado en la literatura preexistente(18,19) La transparentación
comienza en la raíz y progresa hacia la corona, desde del límite cemento-dentina
hacia la predentina y conducto radicular. Además logramos identificar que la
presencia de dentina transparente en la raíz dentaria se encuentra en ambos
grupos etarios analizados. Sin embargo, la dentina transparente va aumentando a
medida que el diente envejece.
Observaciones morfológicas preliminares, utilizando histoquímica de
carbohidratos en cortes de dientes desmineralizados, demostraron que la dentina
se tiñó profundamente con Azure A en grupos de edad más jóvenes (5 a 19 años).
32
En los grupos de mayor edad (30 a 79 años), los especímenes se tiñeron
levemente o moderadamente. Los autores sugieren que la disminución de la
captación de la tinción por la dentina envejecida se debió a una pérdida de sitios
aniónicos en el tejido (20). Sin embargo este estudio, no logra relacionar la reacción
histoquímica con alguna zona definida de la dentina circumpulpar o con la
transparentación de la raíz ya que la desmineralización de los especímenes y la
inclusión en parafina histológica elimina la propiedad óptica de translucidez de la
dentina. El presente trabajo de investigación relaciona con presición la existencia
de reactividad histoquímica sólo en las áreas de dentina opaca y no en las de
dentina transparente.
Numerosos estudios histoquímicos para carbohidratos, en cortes de
dientes descalcificados, han demostrado que las dentinas son reactivas con PAS,
azul de alcian y azul de toluidina (21). El material que se tiñe con azul de toluidina y
azul de alcian se encontró solo en una ubicación intratubular, mientras que la
matriz intertubular se tiñó con PAS. Nuestro ensayo histoquímico en los cortes
mineralizados mostró una distribución intratubular de la reacción histoquímica con
azul de alcian, existiendo correspondencia con lo reportado por la literatura
previamente.
En nuestro estudio, la reacción de histoquímica de carbohidratos demuestra
claramente qué, en todos los cortes de los dientes, el material intratubular
alcianofílico se observa claramente en los túbulos dentinarios de la dentina opaca.
Independientemente de la edad, la tinción con azul alcian tiende a desaparecer en
las zonas de dentina transparentes.
La desmineralización total o parcial de los especímenes es un paso importante
para el análisis morfológico de los tejidos dentales. El proceso de
desmineralización extrae macromoléculas orgánicas de los tejidos, y la cantidad
de material extraído depende de la solución de descalcificación empleada. En este
estudio, para exponer las macromoléculas de la matriz de la dentina en cada
33
corte, utilizamos ácido ortofosfórico al 37% en lugar de EDTA u otros ácidos. La
pérdida de la afinidad tintorial por artefacto de la técnica es posible. Sin embargo,
la distribución de la coloración en cortes no acondicionados con ácido
ortofosfórorico fue similar sólo que para obtener el mismo grado de coloración se
necesitó tiempos de incubación mayores. (22).
Los PGs se han considerado como nucleadores de la mineralización ya que
pueden actuar como sitios de intercambio catiónico al atrapar iones de calcio, o
como inhibidores. Muchos estudios bioquímicos in vitro diferentes coinciden en
que los PGs inhiben la formación de hidroxiapatita (23). El uso de técnicas
bioquímicas y la extracción secuencial de GAGs demostró que la calcificación y
maduración del hueso se asocia con una disminución en el contenido de PGs de
la matriz orgánica. Además, los sistemas de cultivo celular proporcionan pruebas
sólidas de que los PGs son inhibidores de la mineralización (24).
En los tejidos, las primeras observaciones histoquímicas demuestran que se
produjo una pérdida de la tinción de proteínas y polisacáridos precisamente en el
frente de mineralización del hueso (25). Más recientemente, mediante el uso de
histoquímica, microscopía inmunoelectrónica y microanálisis de rayos X, se han
encontrado cantidades excesivas de PGs en las lagunas osteocíticas agrandadas
en la osteogénesis imperfecta tipo II. En contraste, todas las lagunas de osteocitos
aparecían negativas para PGs en hueso normal. Estas observaciones sugieren
que los PGs se consideran inhibidores de la mineralización ósea (26).La tinción
negativa de proteoglicanos en la matriz ósea mineralizada sugiere que una
pérdida o una disminución brusca de las PGs ocurren concomitantes con la
mineralización de la matriz ósea(27).
Se ha propuesto que las poblaciones de PGs sintetizadas dentro de la matriz
de la predentina desempeñan diferentes roles en la formación de la matriz y en la
prevención de la mineralización prematura, mientras que la decorina dentro de la
34
dentina circumpulpar puede funcionar en la regulación del proceso de
mineralización (28).
La dinámica molecular de los complejos GAGs - PGs durante la mineralización
de la dentina se ha estudiado principalmente en el frente de mineralización. En los
últimos 15 micrómetros antes de la mineralización, los datos inmunohistoquímicos
demuestran que el condroitin sulfato / dermatán sulfato y el queratan sulfato
mostraron gradientes inversos en predentina.Sin embargo, Desde este punto de
vista, la función de los PGs en la mineralización de la dentina humana y más
específicamente en la esclerosis intratubular durante la formación de la dentina
transparente no se conoce completamente(28).
El presente trabajo de investigación, entrega evidencia morfológica e
histoquímica, que los complejos PGs-GAGs disminuyen o desaparecen en los
túbulos dentinarios de la dentina transparente, los que nos haría suponer que en
esta localización los PG, actuarían como inhibidores de las mineralización
dentinaria.
La transparencia es un cambio común durante el ciclo de vida de la dentina
humana y se ha asociado con modificaciones en las propiedades mecánicas del
tejido con una mayor fragilidad de los dientes observada en personas mayores (29).
La comprensión de la dinámica molecular de la matriz dentinaria durante la
transparentación tisular nos permitiría entender el comportamiento de la raíz
dentaria durante la terapeútica en las distintas especialidades odontológicas.
35
Conclusiones
1. Los complejos PGs – GAGs desaparecen de la dentina intratubular en las
zonas de dentina transparente.
36
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