evaluación del efecto de consumo de festuca tóxica sobre
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I
Facultad de Ciencias Veterinarias
-UNCPBA-
“Evaluación del efecto de consumo de festuca tóxica sobre la calidad seminal en toros
Aberdeen Angus”
Nicanor Freije, Ernesto E. Freije, Jorge Cabodevila, Santiago Callejas
Marzo, 2019
Tandil
II
“Evaluación del efecto de consumo de festuca tóxica sobre la calidad seminal en toros Aberdeen Angus”
Tesina de la Orientación Sanidad Animal, presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Veterinario del alumno: Nicanor Freije. Tutor: Méd. Vet; Freije, Ernesto Director: Méd. Vet; Dr. Cabodevila, Jorge
Codirector: Méd. Vet; M Sc., Dr. Callejas, Santiago
Evaluador: Méd. Vet; Esp. Gabriela Cadenazzi
III
DEDICATORIA
A mis padres y mis hermanos, a María, quienes incondicionalmente
estuvieron a mi lado, sobre todo en los momentos difíciles. A mi madre
especialmente.
A mis abuelos Amaro y Marta, por ser unos segundos padres, por ser
cómplices más de una vez.
A mis abuelos Roberto y Dorita, por su cariño, su presencia y sus
llamadas de siempre.
A mi tío y padrino, Juan Pablo, por su simpleza para ver las cosas y
ser un oído cuando lo necesite.
A la Facultad de Ciencias Veterinarias de Tandil, la cual me brindó la
oportunidad de crecer, formarme y conocer personas increíbles.
A Tandil, y los amigos que me llevé, anécdotas, charlas, consejos;
gracias a todos ellos. Los tengo siempre presentes.
A los amigos de Ayacucho, por ser auténticos, por ser particularmente
únicos. Porque cada instante vivido con ellos es una locura diferente.
Al “gordo”, por enseñarme que no recordamos los días, sino los
pequeños momentos junto a las buenas personas.
IV
AGRADECIMIENTOS
A mi padre, porque además de haber sido mi tutor de residencia,
siempre lo fue en la vida.
A Alberto Areco, por brindar los animales para poder realizar el trabajo,
por su generosidad y paciencia.
A Santiago Pérez Wallace, por sus correcciones, por tenerme en
cuenta siempre, por su amistad.
A Nicolás Fiel, por las charlas, su amistad y su ayuda, sobre todo en
la residencia.
A Cesar Fiel, “el gallego”, porque además de un gran docente y amigo,
fue un consejero.
A Martin Narbaitz, por la gigante mano que me dio con el trabajo, y
sobre todo por ser un libro abierto y dejarme participar y aprender.
A Joaquín Armendano, por facilitarme material y por su ayuda
desinteresada.
A Jorge Cabodevila, director de la tesina, por tener siempre la mejor
disposición.
V
RESUMEN
En Argentina, numerosos estudios han demostrado el efecto de la festucosis en
vacas, pero son pocos los datos que se tienen sobre su impacto en el toro. La
presentación más común de la intoxicación se da durante los meses cálidos
coincidiendo con la época de entore, debido a ello se decidió realizar este trabajo
cuyo objetivo fue evaluar el efecto del consumo de festuca tóxica sobre la calidad
espermática (CE) en toros Aberdeen Angus de 2 años. Adicionalmente, se
estudió el efecto de la festucosis sobre perímetro escrotal (PE), temperatura
rectal (TR) y ganancia de peso vivo (GPV). Al día 0, se efectuó una extracción
de semen y se evaluó motilidad en masa, porcentaje de espermatozoides vivos;
morfología espermática y concentración. A partir de ese momento, a los toros se
los asignó a los grupos Ergo (n=8), el cual pastoreó durante 90 días un potrero
con festuca tóxica (grado de infestación 82%) y Control (n=2), el cual consumió
por igual período una pastura implantada, compuesta por cebadilla, pasto ovillo
y trébol blanco, compartiendo la misma fuente de agua. Las evaluaciones de
semen se repitieron cada 40 días aproximadamente, efectuándolas siempre
entre las 9 y 11 h. Luego de la tercera evaluación, a los toros del grupo Ergo se
los llevó al potrero del grupo Control. Pasados 72 días, se procedió a realizar
una última extracción de semen para comprobar, en caso de haber sido afectada
la calidad seminal, si los parámetros volvían a la normalidad. En conclusión, la
festucosis no afecta el PE ni la TR. En cambio, afecta la GDPV y la CE,
específicamente el porcentaje de anormalidades primarias, notándose su
impacto durante los meses más calurosos: diciembre, enero y febrero. Esta
afección es temporaria dado que, una vez retirados los toros de la pastura tóxica,
la CE vuelve a sus parámetros normales. Teniendo en cuenta que la época de
entore coincide con los meses donde la toxicidad de la festuca aumenta, las
evidencias preliminares de este experimento deberían corroborarse en futuros
trabajos que incluyan un número mayor de animales y la realización de estudios
hormonales que posibiliten evidenciar con certeza el efecto del hongo sobre el
animal.
Palabras claves: festucosis, calidad seminal, toros Aberdeen Angus.
VI
INDICE
1. INTRODUCCIÓN .......................................................................................................... 1
2. ANTECEDENTES ........................................................................................................ 3
2.1. Termorregulación testicular................................................................................ 3
2.2. Espermatogénesis bovina .................................................................................. 5
2.3. Efectos del aumento de la temperatura testicular en la calidad del semen...... 9
3. OBJETIVOS ............................................................................................................... 12
3.1. Objetivo general ............................................................................................... 12
3.2. Objetivo secundario.......................................................................................... 12
4. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 13
4.1. Lugar y período de estudio: ............................................................................. 13
4.2. Animales: .......................................................................................................... 13
4.3. Porcentaje de infestación de la pastura........................................................... 13
4.4. Procedimiento .................................................................................................. 13
4.5. Clasificación de anormalidades ....................................................................... 14
4.6. Análisis estadístico ........................................................................................... 15
5. RESULTADOS ........................................................................................................... 16
5.1. Perímetro escrotal ............................................................................................ 16
5.2. Temperatura rectal ........................................................................................... 16
5.3. Aumento diario de peso vivo ............................................................................ 17
5.4. Calidad seminal ................................................................................................ 18
5.4.1. Motilidad en masa microscópica ......................................................... 18
5.4.2. Porcentaje de espermatozoides vivos................................................. 19
5.4.3. Morfología espermática ....................................................................... 19
5.4.3.1. Porcentaje de anormalidades primarias ............................... 19
5.4.3.2. Porcentaje de anormalidades secundarias .......................... 20
5.4.4. Concentración espermática ................................................................. 20
6. DISCUSIÓN ................................................................................................................ 26
7. CONCLUSIÓN ........................................................................................................... 27
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 28
1
1. INTRODUCCIÓN
La cría bovina en Argentina se desarrolla mayoritariamente en campos
naturales y pasturas implantadas, siendo la festuca (Festuca arundinacea Schreb.) la
principal gramínea perenne cultivada, la cual se puede observar en pureza o
consociada con otras especies. Estimativamente, ocupa un área mayor al 30% del
total de las áreas cultivadas en Argentina, y más de un 70% en Uruguay (De Battista
et al., 1995; Milne, 2009). La difusión de este cultivo se inició en la década del ’50,
representando un recurso forrajero muy valioso para la zona ganadera en la cuenca
del Río Salado (Borrajo, 2015), estimándose la superficie implantada entre 3,5 y 4
millones de hectáreas (Bence, 2016).
La festuca puede ser infectada por el hongo endófito Epichloë coenophiala con
el cual mantiene una asociación simbiótica mutualista, siendo responsable de la
toxicidad para el ganado en pastoreo, lo que comúnmente conocemos como
“festucosis” lo cual ha significado un cambio drástico en la producción agrícola-
ganadera mundial.
La importancia agroeconómica de la infección de la festuca está relacionada
con la distribución y el uso de los pastos de alto valor forrajero que se cultivan en
Argentina. Entre los años 1986 y 1988, para la zona del norte de Buenos Aires, más
del 60 % de los lotes de semillas estaban fuera de condición para ser comercializados
y la principal limitante era la infección con el endófito (Delgado et al., 2013). Similar
difusión se ha observado en USA con un área de 15 millones de hectáreas, donde por
los problemas asociados a la presencia de festuca tóxica (FT) se han estimado
pérdidas anuales de 600 a 800 millones de dólares. En Argentina, las pérdidas están
estimadas en el equivalente a 410.000 terneros de destete de 170 kg de peso
(Campero, 1996).
Los ergoalcaloides, principalmente la ergovalina, se asocian con la festucosis,
siendo los responsables de la toxicidad en el ganado. En el bovino se han descriptos
diferentes cuadros clínicos:
- Pie de festuca: se produce durante el otoño-invierno, una vez pasadas las
dos semanas de pastoreo. Los alcaloides actúan sobre el sistema circulatorio
2
produciendo vasoconstricción periférica, dando como sintomatología
renguera y crecimiento anormal de las pezuñas (zapato chino); en casos
graves puede llegar a producirse el desprendimiento de las pezuñas.
También es común que presenten gangrena con pérdida de la cola y bordes
de las orejas. Esto se acentúa por las bajas temperaturas.
- Síndrome distérmico: este síndrome se produce en primavera y verano,
cuando la temperatura supera los 25°C y los animales se encuentran
pastoreando festuca parasitada. Los animales presentan el pelo largo, opaco
y se meten en el agua tratando de disipar el calor. Además de esta conducta
que puede ser adoptada por animales sanos, veremos otros signos que
denotan la enfermedad tales como el babeo, aumento de la frecuencia
respiratoria y fiebre. La temperatura corporal puede ascender hasta los 42°C
cuando lo normal es 38°C. Otros síntomas son la disminución de la
producción de leche que traerá aparejado menor peso de los terneros al
destete (mermas del 30 a 40 %), asoleamiento, renguera, bajo incremento de
peso y disminución de la eficiencia reproductiva, con porcentajes de preñez
con mermas de un 20 a 30%. Estos síntomas se acentúan durante los
encierres, pudiendo ocasionar la muerte de animales.
Numerosos estudios han demostrado el efecto de la festucosis en la vaca
(Porter y Thompson, 1992; Burke et al., 2001; Burns, 2012), pero son pocos
los datos que se tienen en Argentina, sobre su impacto en el toro. Teniendo
en cuenta que en nuestro país la presentación más común de la intoxicación
se da durante los meses más cálidos (diciembre, enero, febrero) coincidiendo
con la época de entore o servicio, se decidió realizar este trabajo, cuyo
objetivo fue evaluar el efecto del consumo de festuca tóxica sobre la calidad
espermática de toros Aberdeen Angus.
3
2. ANTECEDENTES
El estrés ambiental puede provocar baja calidad seminal, a
consecuencia de ello, las tasas de fertilización disminuyen y se afecta la fertilidad. Al
estar los testículos suspendidos en el escroto, la espermatogénesis es afectada al
exponerse a altas temperaturas externas, disminuyendo la calidad espermática, lo
cual también está directamente relacionado con la calidad del eyaculado (Nezhad et
al., 2013; Wechalekar et al., 2010; Rodríguez, 2007; Coubrough, 1985; Chemineau,
1993). Esta baja calidad seminal es debida principalmente a las afectaciones que
sufren las células de Sertoli por el estrés calórico; éste a su vez induce apoptosis,
estrés oxidativo en dichas células, el cual puede inducir a la infertilidad, por el daño
que ocasiona en los lípidos y proteínas de la membrana del espermatozoide, y por el
daño que provoca en el ADN del espermatozoide, lo cual se traduce a un pobre
desarrollo embrionario y abortos (Nezhad et al., 2013; Aitken y De Luliis, 2010;
Tremellen, 2008; Jung y Schuppe, 2007).
A los efectos de una mejor comprensión de los mecanismos de acción de la
festucosis en el macho, el planteo de la situación se hará según lo propuesto por
Bozlur Rahman et al., (2017) quienes consideran conveniente analizar en primera
instancia la termorregulación testicular, luego la espermatogénesis del bovino y, por
último, el efecto del aumento de la temperatura testicular sobre la calidad del semen.
2.1. Termorregulación testicular
Generalmente en los mamíferos, para una normal espermatogénesis, los
testículos requieren una temperatura de 4-5ºC más baja que la temperatura central
del cuerpo (33,4ºC). Esto se logra mediante la localización de los testículos en el
escroto, fuera de la cavidad abdominal.
En los toros, la piel del escroto es delgada, desprovista de grasa subcutánea y
bastante lampiña. La extensa vasculatura y la disposición linfática de los testículos
con los vasos sanguíneos superficiales del escroto, facilitan la eliminación de calor de
los testículos. El músculo liso de las arteriolas cutáneas del escroto, está inervado por
neuronas simpáticas. La estimulación de estas neuronas por bajas temperaturas
4
causa vasoconstricción; y, por otro lado, el calor causa una vasodilatación de las
arteriolas, disminuyendo o aumentando el suministro de sangre al escroto. Justo por
debajo de la piel del escroto, hay dos músculos importantes: la túnica dartos y el
músculo cremaster, que desempeñan un papel fundamental en la termorregulación.
La túnica dartos es una lámina delgada de músculo liso, que se encuentra bajo
el control tónico de los nervios del sistema simpático lumbar, que posiciona
rápidamente el escroto hacia el abdomen o lejos de éste, en respuesta a ambientes
fríos y cálidos, respectivamente. Debido a la característica tónica de este músculo, la
naturaleza contráctil puede mantenerse durante un período prolongado,
especialmente en ambientes fríos. La función del músculo cremaster es también llevar
los testículos cerca del abdomen tras la contracción. Sin embargo, debido a la
naturaleza estriada de este músculo, no puede sostener la contracción durante un
período prolongado.
Además de estas contracciones musculares, un rol importante en el
enfriamiento de los testículos posee el sistema vascular. La arteria testicular trae
sangre caliente del núcleo del cuerpo a los testículos. Esta arteria está íntimamente
enmarañada por una compleja red venosa, llamada plexo pampiniforme, y toda la
estructura (la red venosa y la arteria) se denomina cono vásculo-testicular. Debido a
esta vasculatura característica, los testículos poseen un sistema de circulación
sanguínea en contracorriente. Como resultado, la sangre arterial que ingresa a los
testículos se enfría en cierta medida por la sangre venosa que sale de estos.
Por otra parte, las glándulas sudoríparas también tienen un papel importante
controlando la temperatura testicular, dado que en los toros la densidad de éstas es
más alta en la piel del escroto que en las otras regiones del cuerpo. Además de la
protección de los testículos, la piel escrotal tiene un papel vital en la termorregulación
testicular. Por lo tanto, los toros que tienen un escroto normal con una circunferencia
escrotal adecuada pueden sobrellevar el estrés por calor hasta cierto punto.
5
2.2. Espermatogénesis bovina
La espermatogénesis es el proceso de desarrollo de espermatozoides a partir
de células germinales primordiales (CGP). Es un proceso continuo de diferenciación
y desarrollo y, de hecho, las CGP derivan de un pequeño subconjunto de células
embrionarias. En los mamíferos, después de alcanzar la pubertad, la
espermatogénesis se inicia principalmente a través de la influencia de la proteína
morfométrica ósea 8B. En toros, la espermatogénesis se logra a través de tres fases
distintas que consisten en espermatocitogénesis, meiosis y espermiogénesis que
duran aproximadamente 21, 23 y 17 días, respectivamente. Durante la
espermatocitogénesis, las CGP se dividen por mitosis para formar espermatogonias
de tipo A1. Ellas son las células madre. Una parte importante de esta fase es la
renovación de células madre. Algunas espermatogonias de tipo A1 vuelven a células
madre y continúan el proceso, a partir del cual pueden formarse nuevas
espermatogonias. Las otras espermatogonias de tipo A1 se dividen progresivamente
por mitosis para formar espermatogonias tipo A2, tipo A3 y tipo A4. Las
espermatogonias tipo A4 nuevamente se dividen para formar espermatogonias
intermedias (tipo Int) para luego formar espermatogonias de tipo B. Todas estas
divisiones tienen lugar en la parte basal de los túbulos seminíferos. Las
espermatogonias tipo B nuevamente se dividen por mitosis al menos una o dos veces
para formar espermatocitos primarios.
La meiosis se completa con dos pasos: meiosis I y meiosis II. Durante la meiosis
I, los espermatocitos primarios duplican su ADN y experimentan cambios nucleares
progresivos de la profase meiótica, conocida como preleptotene, leptotene, zigotene,
paquitene y diplotene, antes de dividirse para formar espermatocitos secundarios. Los
espermatocitos secundarios se someten a una segunda división meiótica para formar
células haploides, que se conocen como espermátides redondas. Las etapas
meióticas de la división celular tienen lugar en el compartimento adluminal de los
túbulos seminíferos. El proceso adicional durante el cual la espermátide se desarrolla
gradualmente en el espermatozoide se llama espermiogénesis.
Durante la espermiogénesis, los cambios que se producen son, la
condensación de la cromatina nuclear, la formación del flagelo o la cola del esperma
6
y el desarrollo del capuchón acrosomal. Esta fase también tiene lugar en el
compartimiento adluminal de los túbulos seminíferos. Las espermátides alargadas
resultantes, se mueven más cerca de la luz de los túbulos seminíferos.
Por último, las espermátides alargadas se liberan en la luz de los túbulos
seminíferos, mientras se someten a un proceso de transformación adicional conocido
como espermiación, antes de pasar al epidídimo para su maduración y
almacenamiento final. Los espermatocitos y/o las espermátidas experimentan una
remodelación extensa durante las fases meióticas y espermiogénicas del desarrollo:
inicialmente las histonas nucleoproteínicas se reemplazan por proteínas de transición
y finalmente, por protaminas. Las protaminas están involucradas en el
empaquetamiento de la cromatina espermática de tal manera que el genoma paterno
permanece funcionalmente inerte y protegido, y se logra una reducción notable en el
volumen nuclear.
Aunque los espermatozoides adquieren madurez durante el tránsito epididimal,
no alcanzan la capacidad de fertilización completa. Para alcanzar la capacidad
máxima de fertilización, los espermatozoides deben viajar y residir en el tracto
reproductivo femenino durante un período mínimo. Durante su estancia en el tracto
reproductivo femenino, los espermatozoides experimentan algunos cambios
bioquímicos que se conocen como capacitación. Esto incluye la eliminación de una
gran parte de las proteínas de recubrimiento extracelular que previenen la adhesión
durante el tránsito de los espermatozoides en el útero.
El proceso de fertilización implica una serie de interacciones específicas entre
los espermatozoides y los ovocitos. En primer lugar, en el oviducto, el patrón de
movilidad de los espermatozoides se vuelve hiperactivo, lo que se considera que
facilita la interacción espermatozoide-ovocito. En segundo lugar, algunas proteínas
específicas de la membrana plasmática que recubren el acrosoma están expuestas y
se unen a la zona pelúcida del ovocito. La unión de la zona probablemente inicia una
reacción acrosómica. La reacción acrosómica permite la liberación de una variedad
de enzimas, principalmente acrosina y hialuronidasa, que hidrolizan las proteínas de
la zona. Posteriormente, la fuerza mecánica generada por la acción flagelar de la cola,
empuja al espermatozoide hacia el espacio perivitelino del ovocito. Luego, el
7
espermatozoide entra en contacto directo con la membrana plasmática del ovocito. En
el momento del contacto directo, las proteínas de la superficie de los espermatozoides,
particularmente Izumo, localizadas en el segmento ecuatorial de la cabeza del
espermatozoide, están involucradas en la adhesión y fusión con la membrana
plasmática del ovocito. La fusión de espermatozoides y oocitos conduce a la
despolarización del oolema, que desencadena la liberación de gránulos corticales
localizados debajo de la superficie del ovocito y da como resultado el bloqueo de la
polispermia. Poco después de la fusión de la membrana, el núcleo del esperma
comienza a descondensarse, lo cual es necesario para preparar los cromosomas
paternos para que se emparejen con los cromosomas maternos. La descondensación
del núcleo del esperma comienza a través de la reducción de los enlaces disulfuro
entre las protaminas por un agente reductor primario, el glutatión. Después de la
descondensación del material nuclear, los pronúcleos paterno y materno se alinean
para formar un zigoto. Sin embargo, todos los eventos que incluyen la unión a la zona
y la penetración son altamente dependientes de la membrana plasmática intacta, el
acrosoma, las mitocondrias y el material nuclear de alta calidad de un espermatozoide.
Son varias las causas que podrían producir una espermatogénesis anormal
(IRAC, 1998). La mayoría de ellas pueden ser relacionadas con las elevadas
temperaturas o con el estrés. El aumento de 0,5 a 1ºC de temperatura en los testículos
de un toro, por algunos días, es suficiente para causar un desorden notorio en la
espermatogénesis. Aparentemente el mecanismo de daño por temperatura ocurre a
través de la hipoxia testicular. Debido a la peculiar anatomía del abastecimiento de
sangre a los testículos, el tejido testicular opera normalmente en un punto muy
cercano a la hipoxia. Al elevar la temperatura testicular aumenta la actividad
metabólica, para activar los mecanismos de pérdida de calor, hay vasodilatación y no
hay un aumento correspondiente en el abastecimiento de oxígeno, por lo tanto, el
tejido se encuentra en hipoxia.
Las funciones normales del epidídimo y del epitelio seminífero dependen de
niveles muy altos de testosterona. Hay evidencias de que las altas temperaturas
provocan una disminución de la liberación de LH, lo que resulta en niveles más bajos
de testosterona disponible para las células germinales en crecimiento, lo cual es
8
agravado por la hipoxia. Por ejemplo, las células de Sertoli, concentran testosterona
por medio de la producción de la proteína fijadora de andrógenos. Un mal
funcionamiento de las células de Sertoli o de las células de Leydig también puede
determinar una insuficiencia de testosterona.
El estrés en general, afecta la función testicular a través del mecanismo
endócrino descripto, induciendo la producción excesiva de cortisol, que a su vez
reduce la secreción de LH por la pituitaria y esto produce una disminución en la
producción de testosterona por las células de Leydig; además del efecto directo de la
adrenalina sobre el flujo sanguíneo.
Algunas células como las de Sertoli y las espermatogonias son más sensibles
y se degeneran, dejando espacios vacíos en el estrato germinal que luego se traduce
en una producción reducida de espermatozoides. Las espermátides también son
sensibles y forman espermatozoides anormales por efecto del estrés. Por ejemplo, el
resultado de una alteración en la espermatogénesis puede producir una mala
condensación de la cromatina nuclear, formación de vacuolas, cabezas de formas
anormales, mala disposición de las mitocondrias en la parte central, o falta de
adherencia entre las fibras de la cola del espermatozoide.
El resultado de severas alteraciones en la espermatogénesis es la
degeneración y descamación de estratos celulares al lumen del túbulo, quedando en
el epitelio germinal solo las células de Sertoli y las espermatogonias. Los túbulos
vacíos pierden turgencia y por esta razón los testículos que han sufrido una
degeneración se vuelven más blandos y más chicos. Después que desaparece el
daño, las espermatogonias repueblan los túbulos, los testículos vuelven a su tamaño
y consistencia normales y se produce semen de calidad y concentración normales.
Generalmente, cuando hay una alteración en la espermatogénesis, no todos
los túbulos son afectados en el mismo grado. Dentro de una sección histológica,
algunos túbulos podrían ser completamente normales y otros presentar daños
celulares. Por lo tanto, las muestras de semen tienen proporciones variadas de células
normales y anormales.
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2.3. Efectos del aumento de la temperatura testicular en la calidad del semen
En general, los testículos operan al borde de la hipoxia. El aumento de la
temperatura aumenta el metabolismo testicular, con una mayor necesidad de oxígeno
para mantener el metabolismo aeróbico. Sin embargo, el flujo sanguíneo testicular
aumenta muy poco en respuesta al aumento de la temperatura testicular y, en
consecuencia, los testículos se vuelven más hipóxicos. Como resultado, algunos
estudios anteriores muestran claramente los cambios en la calidad del esperma.
Casady et al. (1953) expusieron dos toros Bos taurus (Guernsey) a 37ºC con
81% de humedad relativa durante 12 h por día, durante 17 días consecutivos. Se
descubrió que los eyaculados contienen 30-40% de espermatozoides
morfológicamente anormales (en su mayoría colas en espiral y cabezas desprendidas)
con una disminución profunda en el recuento total de espermatozoides, la
concentración y la motilidad.
En otro estudio, toros Bos taurus (Frisones) y Bos indicus (Afrikáner) se
expusieron a una temperatura ambiente de 40ºC con una humedad relativa del 35-45%
durante tan solo 12 h. A pesar que la exposición al estrés por calor en los toros fue
corta, se observó una disminución significativa en la motilidad y en el porcentaje de
espermatozoides vivos de ambas razas junto con un aumento significativo en el
porcentaje de espermatozoides morfológicamente anormales. Además, los toros Bos
taurus se encontraron más susceptibles al estrés por calor en comparación con los
toros Bos indicus.
Del mismo modo, Johnston et al. (1963) informaron que los toros mestizos (Bos
indicus x Bos taurus) expuestos a la alta temperatura ambiente eran comparativamente
menos susceptibles al estrés por calor en términos de calidad del semen y se
recuperaban más rápidamente que los toros Holstein.
Desde entonces, varios estudios han investigado las influencias estacionales en
la calidad del semen en diferentes razas de toros. Mathevon et al. (1998) realizaron un
estudio detallado para evaluar la influencia estacional en la calidad del semen en 198
toros Holstein durante las temporadas de verano e invierno y observaron que la
temporada de verano afectó significativamente todos los parámetros de calidad del
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semen. Además, se investigó la influencia estacional sobre la calidad del semen en 6
toros Bos taurus (3 Limousine y 3 Simmental) y 5 toros Bos indicus (Nelore) donde los
toros Bos taurus se encontraron más susceptibles al calor en términos de producir un
gran número de cabezas anormales seguidas por gotas citoplásmicas durante todo el
período de estudio.
En otro estudio, Balic et al. (2012) investigaron la influencia estacional en 19
toros Bos taurus (Simmental): observaron que el estrés térmico del verano disminuyó
la calidad del semen y pudieron relacionar este hallazgo con la presencia de una alta
peroxidación lipídica (determinada por sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico).
Además, los autores observaron que el semen obtenido de toros jóvenes durante la
temporada de verano se asoció con un daño proteico oxidativo más intensivo. A nivel
celular, el estrés por calor ejerce sus efectos adversos al desplegar y agregar
directamente las proteínas. El estrés térmico induce la activación de factores de
transcripción de choque térmico (HSF), principalmente HSF1, que permite la
producción de proteínas de choque térmico (HSP) para reducir los efectos perjudiciales
de la carga de calor. Si el estrés por calor continúa, la producción de HSP se altera y
se producen cambios alterando el estado fisiológico junto con una mayor producción
de especies reactivas de oxígeno (ROS). Las especies de oxígeno reactivo son
pequeñas moléculas basadas en oxígeno que son altamente reactivas debido a los
electrones desapareados. Los ROS más destacados son el anión superóxido (O2-), el
peróxido de hidrógeno (H2O2) y el ion hidroxilo (OH-). Fisiológicamente, se requiere una
cierta cantidad de ROS para la regulación de varias vías de transducción de señales
transmembrana en células somáticas y para la capacitación y la reacción acrosómica
en los espermatozoides. Por el contrario, las altas concentraciones de ROS reducen la
motilidad y la viabilidad de los espermatozoides, que culminan en una pobre unión a la
zona pelúcida. Por lo tanto, es evidente que el aumento de la temperatura tiene un
efecto adverso sobre la calidad del semen, que podría estar relacionado con el
aumento de la producción de ROS. El fracaso en lograr este delicado equilibrio de ROS
en el plasma seminal puede dar como resultado una fertilidad comprometida.
Estudios realizados por Rutledge (2001), sugirieron que el efecto del estrés
sobre la calidad de los espermatozoides, puede mejorarse con la puesta en marcha de
11
la tecnología de la congelación seminal; sin embargo, el útero de las hembras, pueden
representar estrés térmico para los espermatozoides.
Wang et al. (2009) postula que los alcaloides ergóticos ejercen sus efectos
tóxicos a través de receptores de membrana, sugiriendo que lo harían por la vía de los
receptores alfa adrenérgicos, causando disminución en el porcentaje de
espermatozoides mótiles. Por otra parte, Schuenemann et al. (2005) realizaron un
trabajo para comprobar el efecto de la ergotamina (ET) sobre los parámetros
seminales, perfil endocrinológico, y la capacidad de desarrollo de ovocitos fecundados
in vitro con semen de toros alimentados con ET.
En su trabajo experimental utilizó dieciséis toros de un año para investigar la
administración de tartrato de ET y sus efectos en los parámetros del semen.
Los toros fueron asignados a una dieta de maíz agrietado, ensilaje de maíz y
harina de soja para el grupo control y una dieta suplementada diariamente con 40
mg/kg de tartrato de ET para el grupo restante.
Se midió diariamente circunferencia escrotal, recolectándose los datos de
temperatura rectal cada 14 días. Las muestras de semen se obtuvieron cada 60 días
y se evaluó la motilidad y la morfología. Las temperaturas escrotales se obtuvieron por
termografía inmediatamente antes de la electroeyaculación.
El semen de un subconjunto de toros de cada tratamiento también se evaluó
para la fertilización in vitro.
La administración de ET aumentó la temperatura rectal y resultó en
temperaturas escrotales más bajas en comparación con los toros control. Sin embargo,
la prolactina, la circunferencia escrotal, la testosterona, la motilidad y la morfología del
semen no difirieron entre los grupos durante todo el período experimental (224 días).
Las tasas de división de embriones derivados de la fertilización in vitro con semen de
toros, alimentados con ET, se redujeron en comparación con el grupo control; sin
embargo, los embriones desarrollados hasta blastocisto no difirieron entre los
tratamientos. En conclusión, la exposición prolongada de toros a ET pareció reducir el
potencial de fertilización de los espermatozoides.
12
Se observó un aumento general de la temperatura rectal en toros ET (39,4 ±
0,06 º C) en comparación con toros del grupo control (39,0 ± 0,04 º C), lo que indica
que los toros se vieron afectados por la administración de ET para simular toxicosis por
festuca. Por otra parte, las temperaturas rectales se elevaron en el momento de la
recolección de semen en los toros con ET en comparación con el grupo control. Los
toros que recibieron ET (70,8 ± 7,8 ng/ml) tuvieron concentraciones plasmáticas
similares de prolactina en comparación con los toros control (65,9 ± 7,8 ng /ml).
En cuanto a la respuesta testicular, ni el crecimiento diario promedio en la
circunferencia escrotal (0,034 ± 0,002 cm/día) ni las concentraciones de testosterona
(8,38 ± 1,1 ng/ml) se vieron afectados por la administración de ET.
Además, la ET no comprometió la motilidad de los espermatozoides. La
evaluación morfológica del semen indicó que la exposición prolongada a ET no alteró
el porcentaje de espermatozoides normales o el porcentaje de anomalías primarias y
secundarias. La motilidad de los espermatozoides medida en el momento de la
recolección del semen no difirió entre los toros que recibieron ET y los del grupo control.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general: Evaluar el efecto del consumo de festuca tóxica sobre la calidad
espermática (CE) en toros Aberdeen Angus de dos años de edad.
3.2. Objetivo secundario: Evaluar el efecto del consumo de festuca toxica sobre
circunferencia escrotal, temperatura y peso en toros Aberdeen Angus de dos años de
edad.
13
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Lugar y período de estudio: El ensayo se realizó en un establecimiento, ubicado
en cercanías de Coronel Vidal, partido de Mar Chiquita, provincia de Buenos Aires, en
el período comprendido entre diciembre de 2016 y mayo de 2017.
4.2. Animales: Para realizar el trabajo se utilizaron 10 toros de dos años, raza
Aberdeen Angus, que se encontraban pastoreando una pastura compuesta por
cebadilla, pasto ovillo y trébol blanco.
4.3. Porcentaje de infestación de la pastura
Se determinó la presencia del hongo endófito E. coenophiala asexual siguiendo
la metodología descripta por Bacon y White (1994), a partir de muestras de macollos
de festuca de diferentes sitios al azar del potrero. De cada sitio se retiraron 3 macollos
(uno adelante, otro a la izquierda y otro a la derecha de la persona que realizaba el
muestreo), conformando esto una muestra. Una vez en el laboratorio, se obtuvo tejido
a partir de vainas basales externas (entre la base del tallo y el primer nódulo) de los
macollos con una hoja de bisturí. Brevemente se cortó el tallo longitudinalmente y se
extrajo material del sector medular, mediante un suave raspaje. El material fue
colocado en un portaobjeto, extendido y teñido con la solución de azul de anilina (100
ml de ácido láctico, 1 g de azul de metileno o anilina, 100 ml de glicerina y 500 ml de
agua destilada) y luego observadas mediante microscopio óptico (Casaro, 1986). De
esta manera se determinó el porcentaje de infestación de las pasturas.
4.4. Procedimiento
Al día 0, en el horario comprendido entre las 9 y 11 h, a los reproductores se
les efectuó determinación de peso, temperatura corporal y circunferencia escrotal.
Simultáneamente, se efectuó extracción de semen mediante electroeyaculación
(Electrojack 5) procediendo a evaluar motilidad masal e individual, porcentaje de
espermatozoides vivos, morfología y concentración espermática. A tal fin, se utilizó un
microscopio óptico con contraste de fase (Nikon Eclipse E200).
La motilidad en masa se evaluó a 4X a partir de una gota de semen puro,
colocada sobre un portaobjetos, utilizando una escala creciente de 0 a 5. La motilidad
14
individual se evaluó a 10x a partir de una dilución 1/20 de semen en solución
fisiológica. La concentración se determinó mediante espectrofotometría
(Spermacue, Minitub). Por último, se efectuó un frotis que fue coloreado con
eosina nigrosina para establecer la relación espermatozoides vivos/muertos y evaluar
la morfología espermática a 100X, utilizando aceite de inmersión. Las anormalidades
morfológicas se clasificaron en primarias o secundarias según Barth (2007).
A partir de ese momento se conformaron 2 grupos: Ergo (n=8) y Control (n=2).
A los animales del primer grupo, se los alojó durante un período de 90 días en un
potrero donde pastoreaban festuca tóxica con un grado de infestación del 82%, según
evaluación del INTA Balcarce, mediante la técnica descripta por Bacon y White
(1994). Los animales del otro grupo permanecieron por igual período en un potrero
contiguo, compartiendo la misma fuente de agua y consumiendo una pastura
implantada, compuesta por cebadilla, pasto ovillo y trébol blanco.
Las determinaciones y extracciones de semen efectuadas al día 0, se repitieron
cada 40 días aproximadamente. Inmediatamente de efectuada la 3ra extracción, los
toros del grupo Ergo fueron trasladados al potrero donde se encontraban los
animales del grupo Control. Transcurridos 72 días se procedió a realizar una última
extracción con el objetivo de evaluar, en caso de verse afectada la calidad seminal, si
los parámetros volvían a los valores iniciales.
4.5. Clasificación de anormalidades
Se efectuó según Barth (2000), quién caracteriza a los espermatozoides
morfológicamente anormales según la porción de la célula afectada y/o el origen del
daño. Las anormalidades según este criterio se clasifican en primarias y secundarias.
Se consideran anormalidades primarias, aquellas que ocurren o tienen su origen
durante la espermiogénesis dentro del testículo, mientras que las anormalidades
secundarias, se originan dentro del epidídimo o en el laboratorio.
15
Anormalidad Clasificación
Acrosoma Nudoso Primaria Cabeza Angosta Primaria Cabezas Piriformes Primaria Microcefalia Primaria Vacuolas Nucleares Primaria Formas Teratoides Primaria Gota Citoplasmática Proximal Primaria Defecto de Dag Primaria Cabezas Sueltas Secundaria Espermatozoides Decapitados Secundaria Gota Citoplasmática Distal Secundaria Pieza Medio Distal Doblada Secundaria Cola Enrollada Secundaria Cola Corta Secundaria Colas Abaxiales Secundaria Colas Accesorias Secundaria Colas Múltiples Secundaria Espermatozoides de cola corta Secundaria
4.6. Análisis estadístico
Las diferentes variables fueron analizadas empleando modelos lineales mixtos
(Proc. GLIMMIX, SAS Institute Inc., Cary, NC, EEUU). Se incluyó al grupo, el día y su
interacción como efectos fijos y al animal como efecto aleatorio. Se asumió una
estructura de correlación autorregresiva continua de primer orden entre las
observaciones realizadas en un mismo animal. Las comparaciones múltiples post
hoc fueron ajustadas, cuando fue necesario, empleando el método HSD de Tukey-
Kramer. Los valores se expresan como media de mínimos cuadrados ± error estándar
(media ± EE).
Las estructuras de correlación fueron seleccionadas de acuerdo con el criterio
de selección de Akaike. La homocedasticidad y simetría de los residuales fueron
corroborados mediante métodos gráficos, modelándose la heterogeneidad de
varianza cuando fue necesario.
16
5. RESULTADOS
5.1. Perímetro escrotal
Como se puede apreciar en la Figura 5.1, no se observó interacción ni
diferencias significativas entre los grupos. Sólo se vio una diferencia significativa entre
los días de medición (efecto día), aunque son pequeñas, manteniéndose dentro de
los parámetros normales.
Figura 5.1: Evolución del perímetro escrotal (cm) en los grupos Ergo y Control.
5.2. Temperatura rectal
Como se puede apreciar en la Figura 5.2, en la temperatura (TR) no se observó
una interacción significativa, pero sí un efecto del día, con la TR más elevada los días
77 y 130, aunque manteniéndose dentro de los rangos normales y sin diferencias entre
grupos.
17
Figura 5.2: Resultados de los controles de temperatura rectal (ºC) en los grupos Ergo y
Control.
5.3. Aumento diario de peso vivo
Como se puede apreciar en la Figura 5.3, la ganancia global de todo el
experimento fue significativamente menor en el grupo consumiendo festuca tóxica. Si
bien no se observó una interacción significativa (P<0,05), se registró una diferencia
numérica muy acentuada entre grupos en la ganancia de peso del primer período
(Diciembre-Febrero).
Figura 5.3: Resultados de la evolución de peso vivo (Kg/día) en los grupos Ergo y
Control.
18
En la Tabla 1, se presenta una síntesis de los valores registrados en lo que
respecta a perímetro escrotal, temperatura y peso corporal a lo largo del experimento.
Tabla 1. Resultados promedio de perímetro escrotal, temperatura corporal y peso corporal del
Grupo Ergo vs Grupo Control.
Grupo
27-12-16 02-02-17 14-03-17 06-05-17
P.E. T.C. P.C P.E. T.C. P.C P.E. T.C. P.C P.E. T.C. P.C
Ergo
37,0 38,6 451,8 37,4 39,1 452 37,9 39,5 466,4 38,8 39,6 480,8
Rango 32,0
41,0
37,6
40,1
408
496
33,5
41
38,7
39,5
410
500
35,5
41,5
39,2
39,5
424
492
36,0
43,0
39,2
39,9
437
504
Control
35,0 38,6 398 35,7 38,5 404,5 36,7 39,6 421,5 38,0 39,7 439,5
Rango 34,0
36,0
38,0
39,2
396
400
35,0
36,5
38,3
38,7
401
408
34
36
39,4
39,9
418
425
34
36
39,6
39,9
436
443
Referencias: P.E.: Perímetro escrotal; T.C.: Temperatura corporal y P.C.: Peso corporal
5.4. Calidad seminal
5.4.1. Motilidad en masa microscópica
Como se puede apreciar en la Figura 5.4.1, no se observaron interacción ni
diferencias significativas entre grupos y días.
Figura 5.4.1: Resultados de la evaluación de la motilidad en masa microscópica (Score 0-
5) en los grupos Ergo y Control.
19
5.4.2. Porcentaje de espermatozoides vivos
Como se puede apreciar en la Figura 5.4.2, no se observó interacción ni
diferencias significativas entre grupos y días.
Figura 5.4.2: Resultados de la evaluación de espermatozoides vivos (%) en los grupos
Ergo y Control.
5.4.3. Morfología espermática
5.4.3.1. Porcentaje de anormalidades primarias
Se observó interacción grupo x día. Al día 77 se registró un porcentaje
significativamente mayor de anormalidades primarias en el grupo Ergo. Estas
diferencias no fueron observadas en los restantes días de medición (Figura 5.4.3.1).
Figura 5.4.3.1: Presencia de anormalidades primarias (%) en los grupos Ergo y Control a
lo largo del experimento.
20
5.4.3.2. Porcentaje de anormalidades secundarias
Como se puede apreciar en la Figura 5.4.3.2, no se observó interacción ni
diferencias significativas entre grupos. Si se registró una diferencia significativa entre
los días de medición.
Figura 5.4.3.2: Presencia de anormalidades secundarias (%) en los grupos Ergo y Control
a lo largo del experimento.
5.4.4. Concentración espermática
Como se puede apreciar en la Figura 5.4.4, no se observó interacción ni diferencias
significativas entre grupos y días.
Figura 5.4.4.: Resultados de la evaluación de la concentración espermática (EZ/mL)
en los grupos Ergo y Control a lo largo del experimento.
21
En la Tabla 2 se detalla el tipo de anormalidad promedio de cada muestreo, y
el promedio total de anormalidades, reflejando las diferencias significativas.
Tabla 2: Promedio ( ) de anormalidades espermáticas del Grupo Ergo vs Grupo
Control a lo largo de todo el ensayo.
Anomalía
Fecha de Evaluación
Diciembre Febrero Marzo Mayo
Ergo Control Ergo Control Ergo Control Ergo Control
Acrosoma nudoso 0,49 0 0 0 0,76 0 0,19 0
Cabeza angosta 0,18 0,4 1,14 0 6,64 0 1,43 0
Cabeza piriforme 1,24 0,4 0,71 1,09 3,76 0,4 1,06 1,15
Microcefalia 0,1 1,18 0 0 0,35 0 0 0,38
Vacuolas
nucleares
0,58 1,17 0,6 4,68 0,78 2,18 0 0,38
Formas teratoides 0,37 0,4 0,24 0 0,54 1,05 0,1 1,53
Gota
citoplasmática
proximal
1,43 4,28 2,57 1,86 2,09 0,69 1,06 1,91
Defecto Dag 0 0 0,45 0 0 0 0 0
Cabezas sueltas 2,29 1,57 1,7 0,38 2,96 0,35 1,43 0
Espermatozoide
decapitado
0,84 1,17 0 0,36 1,07 0,35 0,57 0,38
Gota
citoplasmática
distal
0 0 1,39 0 0 0 0 0
Pieza medio distal
doblada
10,01 5,88 16,93 8,89 11,99 10,72 6,16 3,44
Cola enrollada 0,19 0 0,22 0,38 0,15 0,35 0,28 0,38
Cola corta 0 0 0 0 0,05 0 0 0
Colas abaxiales 0,1 0 0 0 0 0 0 0,38
Colas accesorias 0 0 0,09 0 0,13 0,35 0,09 0
Colas múltiples 0 0 0,28 0 0,15 0 0,1 0
Espermatozoides
de cola corta
0 0 0 0,05 0 0 0 0
Promedio total 17,82 16,43 26,33 17,62 31,41 16,43 12,45 9,93
Promedio
anormalidades
primarias
4,39 7,81 5,72 7,63 14,92a 4,32b 3,83 5,35
Promedio
anormalidades
secundarias
13,43cd 8,62cd 20,61c 10c 16,49c 12,12c 8,62d 4,58d
a y b difieren significativamente (Efecto Grupo x Día; P=0,01); c y d difieren significativamente (Efecto Día; P< 0,01)
22
Como muestra la Tabla 2, el promedio de anormalidades primarias refleja
diferencias significativas entre los grupos Ergo y Control.
En la Tabla 3, se presenta una síntesis de los valores registrados en lo que
respecta a motilidad en masa, porcentaje de espermatozoides vivos, morfología y
concentración espermática.
26
Tabla 3. Resultados de motilidad masal, porcentajes de espermatozoides vivos y de anormalidades totales del Grupo Ergo vs
Grupo Control a lo largo del ensayo.
Grupo
Diciembre Febrero Marzo Mayo
M.M. %V %AT C M.M. %V %AT C M.M. %V %AT C M.M. %V %AT C
Ergo
4,3 85,6 17,9 1,4x106 4,3 85,0 26,3 1,3x106 4,5 83,7 31,4 1,5x106 4,1 85,0 12,5 1,6x106
Rango 3,0
5,0
70
90
13,7
31,1
0,8x106
1,8x106
3,0
5,0
60
95
10,6
57,2
0,6x106
1,9x106
3,0
5,0
60
90
20,5
46,3
1,1x106
1,9x106
3,0
5,0
70
95
3,8
23,0
1,3x106
2,0x106
Control
3,5 72,5 16,4 1,0x106 3,5 72,5 17,6 1,4x106 4,0 82,5 16,4 1,3x106 3,5 77,5 9,9 1,3x106
Rango 3,0
4,0
65
80
16,4
19,6
0,9x106
1,1x106
3,0
4,0
65
80
15,7
19,5
0,7x106
1,6x106
4,0
4,0
80
85
12,8
20,0
1,3x106
1,4x106
3,0
4,0
75
80
8,3
11,4
1,4x106
1,2x106
Referencias: M.M.: Motilidad masal; %V: Porcentaje de espermatozoides vivos; %AT: Porcentaje de anomalías totales; C: Concentración espermática
expresada por mm3.
26
6. DISCUSIÓN
En la totalidad de los toros involucrados en el experimento, el perímetro
escrotal, indicador del tamaño testicular, superó el valor mínimo que deben tener los
toros de razas de razas productoras de carne a los 2 años de vida que es de 30 cm
(IRAC, 1998), no observándose interacción ni diferencias significativas entre grupos a
lo largo del ensayo coincidiendo con lo observado por Schuenemann et al. (2005).
Al igual que Jones et al. (2004), se evaluó también cambios en la temperatura
rectal y escrotal, coincidiendo en que las temperaturas rectales no fueron elevadas en
el grupo de tratamiento con dieta endofítica. Este resultado podría deberse a la
temperatura del día en que se efectuaron las evaluaciones de este parámetro, entre
las 7:00 hs a.m. y las 9:00 hs a.m., o debido a la aplicación de agua a los toros para
reducir el estrés por calor según lo exige el protocolo de cuidado de los animales.
En cuanto a la ganancia de peso vivo, esta fue significativamente menor en el
Grupo Ergo (efecto grupo) a lo largo de todo el ensayo, observándose una diferencia
numéricamente más acentuada en el primer periodo.
Respondiendo al objetivo principal del trabajo, el cual fue evaluar cambios en
los parámetros de calidad seminal, se observó que, tanto en la motilidad en masa
microscópica, porcentaje de espermatozoides vivos y concentración espermática no
se vieron diferencias significativas, difiriendo de lo expuesto por Casady et al. (1953)
y coincidiendo con lo expuesto por Schuenemann et al. (2005).
En coincidencia con lo descripto por Mathevon et al. (1998) y Casady et al. (1953)
se observa un porcentaje significativamente mayor de anormalidades primarias en el
grupo Ergo (efecto grupo al día 77), y una diferencia significativa entre los días de
medición (efecto día) en el porcentaje de anormalidades secundarias.
27
7. CONCLUSIÓN
De este experimento surge que la festucosis afecta la ganancia de peso
vivo, no así el perímetro escrotal y temperatura rectal (bajo las condiciones en
las que se realizó el experimento). En cambio, afecta la calidad espermática,
específicamente el porcentaje de anormalidades primarias, notándose su
impacto durante los meses más calurosos: diciembre, enero y febrero. Si bien
esta afección es temporaria, ya que, una vez retirados los toros de la pastura
tóxica e iniciado un nuevo proceso de espermatogénesis, la calidad seminal
vuelve a sus parámetros normales, debe tenerse en cuenta que la época de
entore coincide con los meses donde la toxicidad de la festuca aumenta. Es por
esto que las evidencias preliminares de este experimento deberían corroborarse
en futuros trabajos que incluyan un número mayor de animales y la realización
de estudios hormonales (análisis de prolactina), que posibiliten evidenciar con
certeza el efecto del hongo sobre el animal, permitiendo así evaluar de manera
más clara una de las variables que puede afectar considerablemente el resultado
de preñez de un rodeo.
28
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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