evaluaciÓn de la expresiÓn y fosforilaciÓn …5 resumen los estudios en resorción ósea son...
TRANSCRIPT
1
EEVVAALLUUAACCIIÓÓNN DDEE LLAA EEXXPPRREESSIIÓÓNN YY FFOOSSFFOORRIILLAACCIIÓÓNN DDEE CC SSRRCC,, SSYYKK YY EELL RREE--AARRRREEGGLLOO DDEE AACCTTIINNAA AASSOOCCIIAADDOOSS CCOONN LLAA AACCTTIIVVIIDDAADD RREESSOORRTTIIVVAA
DDEE CCMMNNSSPP FFUUSSIIOONNAADDAASS CCOONN PPOOLLIIEETTIILLEENNGGLLIICCOOLL
LLUUZZ MMAARRIINNAA CCAASSTTIILLLLOO LLOOAAIIZZAA
UUNNIIVVEERRSSIIDDAADD NNAACCIIOONNAALL DDEE CCOOLLOOMMBBIIAA
FFAACCUULLTTAADD DDEE MMEEDDIICCIINNAA
DDEEPPAARRTTAAMMEENNTTOO DDEE CCIIEENNCCIIAASS FFIISSIIOOLLÓÓGGIICCAASS..
MMAAEESSTTRRÍÍAA EENN BBIIOOQQUUÍÍMMIICCAA
BBooggoottáá,, 22001100..
2
EEVVAALLUUAACCIIÓÓNN DDEE LLAA EEXXPPRREESSIIÓÓNN YY FFOOSSFFOORRIILLAACCIIÓÓNN DDEE cc SSrrcc,, SSyykk YY EELL RREE--AARRRREEGGLLOO DDEE AACCTTIINNAA AASSOOCCIIAADDOOSS CCOONN LLAA AACCTTIIVVIIDDAADD RREESSOORRTTIIVVAA
DDEE CCMMNNSSPP FFUUSSIIOONNAADDAASS CCOONN PPOOLLIIEETTIILLEENNGGLLIICCOOLL..
LLUUZZ MMAARRIINNAA CCAASSTTIILLLLOO LLOOAAIIZZAA
CCooddiiggoo:: 559977665588
TTrraabbaajjoo ddee ggrraaddoo ppaarraa ooppttaarr aall ttííttuulloo ddee MMaaggiisstteerr eenn BBiiooqquuíímmiiccaa..
DDiirriiggiiddoo ppoorr::
CCAARRLLOOSS AARRTTUURROO GGUUEERRRREERROO FFOONNSSEECCAA.. MMDD.. MMSScc.. PPhhDD..
UUNNIIVVEERRSSIIDDAADD NNAACCIIOONNAALL DDEE CCOOLLOOMMBBIIAA
FFAACCUULLTTAADD DDEE MMEEDDIICCIINNAA
DDEEPPAARRTTAAMMEENNTTOO DDEE CCIIEENNCCIIAASS FFIISSIIOOLLÓÓGGIICCAASS..
MMAAEESSTTRRÍÍAA EENN BBIIOOQQUUÍÍMMIICCAA..
BBooggoottáá,, 22001100.
3
Hoy, doy gracias a Dios por su guía y sabiduría, la cual
me permitió culminar esta importante etapa de mi vida,
siendo un eslabón más de los sueños de mi niñez.
A mis padres amorosos, quienes a pesar de las situaciones
siempre me han apoyado y llevado por el camino de la verdad.
A mis sobrinos, quienes son la felicidad de mi vida.
A ti por ser paciente y comprensivo durante este proceso.
A mis amigos, quienes considero grandes maestros y hermanos.
A mis verdaderos profesores en este proceso, quienes me han guiado
y enseñado el gran camino de la ciencia.
… Gracias.
4
AAGGRRAADDEECCIIMMIIEENNTTOOSS
A la Universidad Nacional de Colombia y al Doctor y maestro Carlos A. Guerrero, por la oportunidad brindada para llevar a cabo mi proyecto de Maestría en el laboratorio de Biología Molecular de Virus. También, agradezco al Doctor y maestro Orlando Acosta, por su guía durante la realización de los experimentos que involucraron este proyecto.
5
RREESSUUMMEENN
Los estudios en resorción ósea son numerosos, ofreciendo diversos modelos
para la obtención in vitro de células similares a osteoclastos con actividad
resortiva.
Usando un nuevo modelo, barato y de corto tiempo de realización, basado en la
fusión celular, se evaluó la expresión de Syk, c-Src, el arreglo de la actina y la
actividad resortiva de las CMNSP fusionadas con PEG. Primero, en estas
CMNSP sembradas en láminas de hueso cortical, por 1, 7 a 14 días, usando un
anticuerpo monoclonal anti actina y uno anti-ratón conjugado a FITC o
“rhodamine”, se observó un arreglo de actina, similar a podosomas, cinturones
de actina y zonas de sellado; además, se extienden sobre superficies como
vitronectina, colágeno tipo I y SFB. Por citoquímica, usando pararrosalinilina
hexazotizada y α- naftol fosfato, se observó que formaban células multinucleares
con actividad TRAP. La evaluación de la morfología nuclear con Hoechst o
DAPI, mostró un fenotipo policarión. Cuando, estas células fueron lisadas,
usando NaOCl al 6%, 5.2% de NaCl y las láminas se colorearon con
Commassie, se determinó que tenían una alta actividad resortiva. Por
microscopia de fluorescencia, utilizando anticuerpos policlonales, estas células
con PEG expresaron CD13, RANK, anhidrasa carbónica II, ATPasa vacuolar VI,
receptor de calcitonina, catepsina K e integrina αvβ3; por microscopía de barrido
o SEM, estas células presentaron extensiones de membrana de adherencia
como filipodios y bordes en cepillo. Por último, con inmunoblot y co-
inmunoprecipitación, se asoció la expresión, fosforilación de Syk, así como de c-
Src con la adherencia y resorción ósea.
Palabras claves: osteoclasto, polietilenglicol, zona de sellado, podosoma,
actividad resortiva.
6
AABBSSTTRRAACCTT
Studies in bone resorption are numerous, offering different models to obtain in vitro osteoclasts like cells with resorptive activity.
Using a new model, cheap and short time of realization, based on cell fusion, we evaluated the expression of Syk, c-Src, the arrangement of actin and resorptive activity of CMNSP fused with PEG. First, in these CMNSP harvest on cortical bone slices for 1, 7 or 14 days, using a anti-actin monoclonal antibody and an anti-mouse conjugated to FITC or rhodamine, observed an arrangement of actin, similar to podosome, actin belts and sealing zone, also spread on surfaces such as vitronectin, collagen type I and FBS. For cytochemystry, using hexazo-tised pararosalinine and α-naphthol AS B1 phosphate showed that formed multinucleated cells with TRAP activity. Evaluation of nuclear morphology with Hoechst or DAPI showed a phenotype policarion. When cells were founding to have high resortive activity. For fluorescence microscopy, using polyclonals antibodies, these cells with PEG expressed CD13, RANK, carbonic anhydrase II, vacuolar type H+ - ATPase, calcitonin receptor, cathepsine k and integrin αvβ3; by scanning electron microscopy or SEM, the cells showed membrane extensions adherence as filipodiums and ruffled. Finally, immunoblot and co-immunoprecipitation, was associated with the expression, phosphorylation of Syk and c-Src to the adhesión and bone resorption.
Key words: osteoclasts, polyethilene glicol, sealing zone, podosome, resorptive activity.
7
CCOONNTTEENNIIDDOO
Pág
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………… 12
1. REMODELAMIENTO ÓSEO……………………………………………… 16
1.1 OSTEOCLASTOS………………………………………………………….. 18
2. FORMACIÓN DE PODOSOMAS Y ZONAS DE SELLADO EN
OSTEOCLASTOS…………………………………………………………. 20
2.1 CARACTERÍSTICAS DEL ARREGLO DE LA ACTINA EN LOS
PODOSOMAS........................................................................................ 20
3. PPRROOTTEEÍÍNNAA TTIIRROOSSIINNAA CCIINNAASSAA cc--SSrrcc PPRREESSEENNTTEE EENN LLAASS
CCÉÉLLUULLAASS OOSSTTEEOOCCLLAASSTTIICCAASS …………………………………………………………………………………… 25
3.1 CARACTERÍSTICAS DE LA ESTRUCTURA DE PP60 c Src………… 26
4. Syk (PROTEÍNA TIROSINA CINASA DE BAZO O SPLEEN
TYROSINE CINASA PROTEIN) EN OSTEOCLASTOS……………… 27
4.1 ASOCIACIÓN DE LAS CINASAS PP60 c Src y Syk CON EL
ARREGLO DEL CITOESQUELETO EN OSTEOCLASTOS …………. 28
5. MARCADORES OSTEOCLASTOGÉNICOS…………………………... 30
6. RANKL, INDUCTOR DE LA DIFERENCIACIÓN
OSTEOCLASTOGENICA………………………………………………… 31
7. MODELOS PARA LA GENERACIÓN in vitro DE CÉLULAS
SIMILARES A OSTEOCLASTOS……………………………………….. 33
8. FUSIÓN CELULAR………………………………………………………… 37
8.1 FUSIÓN CELULAR ESPONTÁNEA……………………………………… 37
8.2 FUSIÓN DE MEMBRANAS EN OSTEOCLASTOS Y MACRÓFAGOS 39
8.3 INDUCCIÓN EXPERIMENTAL DE LA FUSIÓN CELULAR.………….. 43
8.4 POLIETILENGLICOL (PEG)………………………………………………. 44
9. OBJETIVOS.……………………………………………………………….. 46
9.1. OBJETIVO GENERAL…………………………………………………….. 46
8
Pág
9.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS…………………………………………. 46
10. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………… 47
10.1 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL……………………………………. 47
10.2 LÁMINAS DE VIDRIO………………………………………………… 48
10.3. MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS…………………………… 48
10.4. AISLAMIENTO DE CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE
PERIFÉRICA (CMNSP) Y ESTIMULACIÓN CON
FITOHEMAGLUTININA (PHA) ………………………………………
49
10.5. DETERMINACIÓN DE ALGUNOS MARCADORES
POBLACIONALES……………………………………………………. 50
10.6. ESTANDARIZACIÓN DEL NÚMERO DE CÉLULAS Y VOLUMEN
DE POLIETILENGLICOL (PEG) NECESARIO PARA INDUCIR LA
FUSIÓN CELULAR……………………………………………..……..
50
10.7. VIABILIDAD DE LAS CMNSP………………………….……………. 53
10.7.1 ENSAYO DE MTT……………………………………………………... 53
10.7.2 AZUL DE TRIPAN…………………………………………………….. 54
10.7.3 FRAGMENTACIÓN NUCLEAR……………………………………….. 54
10.8. IDENTIFICACIÓN EN CMNSP TRATADAS CON PEG DEL
FENOTIPO POLICARIÓN, MARCADORES
OSTEOCLASTOGÉNICOS, PROTEINAS CINASAS C-SRC, SYK
Y EL ARREGLO DE ACTINA………………………………..………..
55
10.8.1 TINCIÓN CON HOECHST……………………………………………. 55
10.8.2 INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA E INDIRECTA…………… 55
10.8.3 ELECTROFORESIS SDS-PAGE E INMUNOBLOT………………. 57
10.8.4 CO-INMUNOPRECIPITACIÓN……………………………………… 61
10.8.5 CITOQUÍMICA…………………………………………………………. 62
9
pág
10.9. EVALUACIÓN DE LA MORFOLOGÍA CELULAR Y LAGUNAS DE
RESORCIÓN……………………………………………………………. 63
10.10. ACTIVIDAD RESORTIVA EN CMNSP TRATADAS CON PEG…… 63
11. ANALISIS ESTADISTICO……………………………………………. 65
12. RESULTADOS……………………………………………………….... 66
12.1 DETERMINACION DE MARCADORES POBLACIONALES EN
CMNSP………………………………………………………………….. 66
12.2 DETERMINACIÓN DEL NÚMERO DE CMNSP ESTIMULADAS
CON PHA-P DURANTE DIFERENTES TIEMPOS…………………. 66
12.3 VIABILIDAD DE LAS CMNSP………………………………………... 69
12.4 CORRELACIÓN ENTRE EL NÚMERO DE CMNSP Y EL
VOLUMEN DE POLIETILENGLICOL CON LA ACTIVIDAD
RESORTIVA Y EL FENOTIPO POLICARION……………………....
73
12.5 EVALUACIÓN DEL NÚMERO DE CÉLULAS MULTINUCLEARES
TRAP Y LA ACTIVIDAD RESORTIVA…………………………….… 78
12.6 EXPRESIÓN DE MARCADORES OSTEOCLASTOGÉNICOS EN
CMNSP………………………………………………………………..… 81
12.7 ANÁLISIS DE LA MORFOLOGIA CELULAR Y EXTENSIONES
DE MEMBRANA EN CMNSP.………………………………………… 87
12.8 ANALISIS DEL ARREGLO DE ACTINA EN CMNSP………………. 90
12.9 EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL PEG Y DE RANKL EN EL
ARREGLO DE LA ACTINA, LA ACTIVIDAD TRAP Y LA
RESORSION OSEA EN CMNSP……………………………………..
103
12.10 EXPRESIÓN, FOSFORILACIÓN Y LOCALIZACIÓN DE LAS
CINASAS C-SRC Y SYK EN CMNSP……………………………….. 108
13. DISCUSIÓN…………………………………………………………….. 116
14. CONCLUSIONES………………………………………………………. 130
15. BIBLIOGRAFIA………………………………………………………… 132
16. ANEXOS………………………………………………………………… 154
10
LLIISSTTAA DDEE TTAABBLLAASS
pág.
Tabla 1. Anticuerpo utilizados en el ensayo con FACS ..……………… 51
Tabla 2. Número de Células y volúmenes de PEG usados para
inducir la
fusión……………………………………………………………..
52
Tabla 3. Anticuerpo utilizados en el ensayo de
fluorescencia……………………………………………………… 58
Tabla 4. Controles isotipo………………………………………………..... 59
Tabla 5. Número de CMNSP obtenidas después de diferentes
tiempos de estimulación ……………………………………….. 68
Tabla 6. Correlación entre el número de CMNSP y volumen de PEG
para inducir la fusión……………………………………………. 74
Tabla 7. CMNSP tratadas con PEG sembradas en vidrio ……………. 154
Tabla 8. CMNSP no tratadas con PEG sembradas en vidrio………… 154
Tabla 9. CMNSP tratadas con PEG sembradas en matriz ósea……. 155
Tabla 10. CMNSP no tratadas con PEG sembradas en matriz
ósea……………………………………………………………….. 155
11
LLIISSTTAA DDEE FFIIGGUURRAASS
pág.
Figura 1. Bordes en cepillo y filipodios en OCls observadas con SEM 17
Figura 2. Arreglo dinámico de la actina, durante la diferenciación y
activación de OCls………………………………………………
19
Figura 3. RANKL inductor de la fusión celular y la
osteoclastogénesis……………………………………………... 32
Figura 4. Marcadores poblaciones en las CMNSP estimuladas con
fitohemaglutinina (PHA) ……………………………………….
67
Figura 5. Viabilidad de las CMNSP…................................................... 72
Figura 6. Correlación entre el número de CMNSP y volumen de PEG
con la actividad resortiva y el fenotipo policarión …………..
76
Figura 7. Actividad resortiva y número de células multinucleares
TRAP positivas en CMNSP…….……………………………..
80
Figura 8. Expresión y localización de marcadores osteoclastogenicos
en
CMNSP………………………………………………….………..
84
Figura 9. Expresión y localización de CD13 en CMNSP………………. 85
Figura 10. Morfología celular y extensiones de membrana en CMNSP. 89
Figura 11. Arreglo de la actina, actividad resortiva y número de
células multinucleares TRAP positivas en
CMNSP…………………………………………………………..
92
Figura 12. Arreglo de la actina en CMNSP cultivadas sobre diferentes
matrices…………………………………………………………..
97
Figura 13. Arreglo de actina, actividad TRAP y resortiva en CMNSP
sin estímulo con PHA-P ……………………………………….
101
Figura 14. Efecto del PEG en el arreglo de la actina, en la actividad de
la enzima TRAP y en la resorción de CMNSP cultivadas
con RANKL………………………………………………..…….
105
Figura 15. Expresión y localización de c-Src y Syk en CMNSP...……... 111
Figura 16. Co-inmunoprecipitación de c-Src y Syk en CMNSP……….. 114
12
IINNTTRROODDUUCCCCIIÓÓNN
La morfogénesis y remodelación del hueso son procesos controlados
fisiológicamente, que involucra la síntesis de matriz ósea y la resorción de
hueso. Las células encargadas de los procesos de formación son llamados
osteoblastos y las células que realizan la resorción de hueso son denominadas
osteoclastos (OCls).
Los OCls realizan su actividad resortiva en varios pasos: en el primer paso se
genera una célula policarionica en el sitio de resorción, debido a la fusión de
progenitores hematopoyéticos del linaje monocito/macrófago 1, 11; por lo cual los
OCls han sido descritos como células gigantes multinucleares 86, con tamaños
de aproximadamente de 300 µm 86, 95, mientras que sus células progenitoras
presentan tamaños de 5 a 10 µm 86, 95, 151; los OCls normalmente contienen más
de 3 núcleos, múltiples mitocondrias (requeridas para generar la energía del
proceso de resorción) y lisosomas (asociados con el transporte intra y
extracelular de enzimas ácidas, hacia el sitio de resorción). Después, los OCls
se adhieren, extienden y polarizan 1, 11, 30, 80, gracias a que las integrinas, como
la αvβ3 37, 76, 79, 82, reconocen secuencias RGD en proteínas de la matriz
extracelular y ósea, como la osteopontina y la sialoproteína9. Durante esta
adherencia se forma un borde de cepillo o “ruffle”, en donde se ha observado
una reorganización de la actina 67, conformando los “podosomas” 32, 66, 183 o
zonas de sellado o “sealing zone” 75, 183. En los OCls la polarización de la actina
es importante para generar el órgano de resorción, permitiendo la formación de
dos dominios como son el dominio basolaterial y el dominio con función
secretora178; este último dominio se observa hacia la matriz ósea, encerrando la
zona que será resorbida. Además, la adherencia y reorganización de la actina
posiblemente se asocia con la expresión y actividad de cinasas como c-Src y
Syk 49, 51, 54, 65, 102, 103, 106; así mismo, la participación de otras proteínas asociadas
al citoesqueleto se han descrito, como son los microtubulos 185, 190, leupaxin31,
talin73, paxilin100, Rho 58, 74, entre otras. Por debajo del borde de cepillo y la zona
de sellado se origina un microambiente extracelular aislado con un pH de
13
aproximadamente de 4 a 5, necesario para generar la disolución de la parte
mineral de la matriz ósea. La acidificación es realizada por la ATPasa vacuolar -
H+ 219, 238, acoplada a un canal de Cl-, formando así HCl que disuelve la
hidroxiapatita a Ca2+, HPO42- y H2O. Además, en la acidificación de este
microambiente participa la anhidrasa carbónica II 221, 222, 240, la cual genera
continuamente protones e hidrata el CO2, produciendo protones y HCO3- , a la
vez que se disuelve la parte mineral, también se degrada las proteínas de hueso
por la metaloproteinasa lisosomal, catepsina K 223, 239. Otra enzima localizada en
el borde de cepillo es la fosfatasa ácido resistente a tartrato (TRAP) 9, la cual
podría catalizar la hidrólisis de pirofosfato, removiéndolo antes de la
solubilización de la hidroxiapatita. La remoción del mineral disuelto y las
proteínas de hueso degradadas se realiza por endocitosis61 y trancitosis 61, para
finalmente secretarlos al fluido extracelular61. Después de varios ciclos de
resorción los OCls sufren apoptosis43, 210, por lo cual tiene una vida corta de 2 a
5 días 210. Además, se ha determinado que los OCls maduros expresan
receptores de calcitonina 217, por lo cual se ha descrito que la calcitonina 190, 191,
192, 216 regula la resorción, gracias a que inhibe la liberación de hidrolasas
ácidas, reduce la actividad del bombeo de Na+, K+, bloquea la ATPasa-H+ y
altera la localización de la anhidrasa carbónica II .
Los anteriores eventos en la dinámica de la resorción ósea han sido descritos
gracias a la generación de modelos celulares que utilizan progenitores
hematopoyéticos para obtener células similares a OCls in vitro o “osteoclasts-
like”. Los modelos iniciales permitieron obtener OCls por remoción mecánica en
huesos largos de ratones80, de conejos179 y de pacientes con osteosarcoma73.
Algunos modelos in vitro generan OCls mediante el co-cultivo de células
estromales u osteoblastos con monocitos procedentes de bazo o médula ósea 11, 13, o el co-cultivo de monocitos y linfocitos de sangre periférica14, 40, 145. Así
mismo, se ha inducido o incrementado cambios morfológicos en las células
similares a OCls mediante knockouts 53, 62. Con el hallazgo de algunas citocinas
y hormonas en el proceso de diferenciación osteoclástica22 se comienzan a
usar la interleuquina 127 (IL-1), el ligando del receptor RANK (RANKL) 20, 90, 202,
14
1α 25 hidroxivitamina D3 12, 207, hormona paratiroidea (PTH) 191 y el factor
estimulante de colonia macrófago (MCSF) 89, 91, 92,93. Sin embargo, el uso de
estos moduladores de la diferenciación osteoclástica aumenta los costos de las
investigaciones en el área de resorción ósea.
Por otra parte, los resultados en la regulación y en la función resortiva al usar
este tipo de modelos se encuentran limitados debido varias causas. Primero, la
respuesta en la actividad resortiva es inducida con altas concentraciones de
estos inductores osteoclastogenicos presentes en el cultivo. Estas
concentraciones pueden no estar asociadas a lo que realmente se observa a
nivel biológico. Segundo, por el tiempo prolongado, que puede variar entre 4 a
21 días, para obtener in vitro células semejantes a osteoclastos con actividad
resortiva. Finalmente, los estudios en donde se usan células y animales
obtenidos por knockout 53, 62, limitan la respuesta osteoclastogénica a un rango
de modificaciones inducidas por el investigador. En muchos casos estas
limitaciones pueden alejar los resultados de la realidad biológica y bioquímica
de estas células osteoclastogenicas.
Para evitar lo anterior, Murrillo, A (2005) y Manrique, E (2007) desarrollaron un
modelo in vitro para la obtención de células multinucleares con capacidad
resortiva, en un periodo corto de 2 a 7 días, sin el uso de inductores
osteoclastogénicos. Este modelo se basa en el proceso de fusión celular con
polietilenglicol (PEG) de progenitores hematopoyéticos como los macrófagos de
línea celular J774 y U937/A30, así como, la fusión de monocitos y linfocitos de
sangre periférica1. El propósito de este proyecto, es proponer a este modelo de
fusión celular con PEG como una herramienta para el estudio bioquímico y
molecular de la resorción ósea.
Sin embargo, el conocimiento acerca de la funcionalidad de las células
resortivas obtenidas por este modelo aun no esta completo, por lo cual, la
validación y demostración de que las células multinucleadas obtenidas por
PEG son similares a las descritas para OCls, se hace necesaria. Con base a lo
anterior, en este proyecto se evaluó la expresión de las proteínas cinasas Syk,
c-Src, así como el arreglo de la actina y su asociación con la actividad resortiva
15
de las Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMNSP) fusionadas con
polietilenglicol (PEG), además, por microscopía de fluorescencia se identificó la
expresión de marcadores osteoclastogénicos y la morfología de membrana por
SEM.
16
11.. RREEMMOODDEELLAAMMIIEENNTTOO ÓÓSSEEOO
El hueso es un órgano dinámico y altamente especializado, que sufre continuas
regeneraciones. Este proceso metabólico de remodelación ósea es realizado
por dos tipos de células, los osteoblastos, que son las células encargadas de la
formación de matriz ósea, y los OCls, responsables de la resorción de la matriz
ósea.
Estas células altamente especializadas mineralizan y desmineralizan la matriz
ósea durante toda la vida, incluyendo los espacios de las cavidades de la
médula ósea, canales vasculares, canículas y lagunas 5.
Una vez la masa ósea ha alcanzado su madurez, la regeneración continúa en
una forma periódica reemplazando el hueso viejo por uno nuevo en el mismo
sitio a micro escala. Este proceso es llamado remodelación ósea y es la
responsable de la regeneración completa del esqueleto adulto en un total de 10
años 6.
Tanto osteoblastos como OCls son células derivadas de precursores
hematopoyéticos de linaje monocito/macrófago11, 145. Los precursores de los
osteoblastos son células “stem” mesenquimales multipotentes, de las que
también se derivan las células estromales de médula ósea, condrocitos, células
musculares y adipocitos 5.
11..11.. OOsstteeoocc llaassttooss ((OOCCllss))
Las células multinucleares con capacidad resortiva fueron encontradas en la
osificación endocondrial. Kolliker (1873) propuso el nombre de osteoclastos
(OCls) a estas células con capacidad resortiva145. Los OCls son células
multinucleares gigantes86 con abundantes mitocondrias, numerosas lisosomas y
ribosomas libres 86. Además, son móviles, ya que alternan su actividad
resortiva8, 189, 198 con su migración82 en la matriz ósea, aunque el mecanismo de
migración aun no se ha dilucidado completamente.
Una de las características más marcadas en este tipo celular, son las
extensiones de membrana en forma de borde de cepillo o “ruffle” 60, 178, 224, 225,
17
(Figura 1) el cual conforma el órgano de resorción. Este sistema de extensiones
de membrana plasmática en forma de “dedo” o filipodio tiene como función
mediar la resorción de la matriz de hueso calcificado 5. Por lo cual, por debajo
de estas extensiones o prolongaciones de membrana se ha observado las
lagunas de resorción o “pits” 75, 232, 233, 234.
Además, se ha descrito que gracias a estas extensiones de membrana los OCls
se adhieren a la matriz ósea; esta adherencia es mediada no solo por las
integrinas como la αvβ337, 76, 79, 82, sino también por la polarización de la actina, la
cual permite la formación de una zona de sellado o “sealing o clear zone” 32, 64, 75,
183, la cual contiene filamentos de proteínas del citoesqueleto, principalmente
actina y en menor medida, vinculin, talin73, entre otras.
Figura 1. Bordes en cepillo y filipodios en OCls observadas con SEM: OCls
humanos cultivados por 24 h sobre láminas de hueso en presencia de partículas
de biomaterial presentan extensiones de membrana en forma de filipodios y
lagunas de resorción por debajo de las extensiones de membrana (A). OCls
originados del co-cultivo de células RAW 264.7 tipo CRL-2278 con células CRL
12257 de tipo osteoblasto sobre cubre-objetos, forman prolongaciones de
membrana en forma de bordes en cepillo o “ruffle” (B). Tomado y modificado de
Nicolin (2007)233 y Wang (1997)235.
Esta zona limita el área de adherencia del osteoclasto a la superficie del hueso y
encierra un área diferente de la superficie de hueso, la cual se encuentra
inmediatamente por debajo del osteoclasto y será excavada o sufrirá resorción 6.
18
El área de resorción por debajo de los bordes en cepillo es ácida, lo cual
favorece la disolución de los minerales del hueso. Las enzimas lisosomales de
OCls también son secretados hacia el área de resorción para degradar la matriz
ósea. Los productos de degradación de la matriz ósea, por debajo del borde en
cepillo son incorporados por vesículas a través de endocitosis, y luego llevadas
por trancitosis al dominio secretor, donde son exocitadas al espacio extracelular.
Este movimiento de las vesículas por trancitosis desde el borde en cepillo hasta
el dominio basolateral es mediado por la polimerización de los microtubulos190,
siendo importantes en la modelación de los podosomas en OCls180.
22.. FFOORRMMAACCIIÓÓNN DDEE PPOODDOOSSOOMMAASS YY ZZOONNAASS DDEE SSEELLLLAADDOO EENN OOCCLLSS ..
La adherencia a matriz ósea está dada por una delgada zona de sellado o
“sealing zone” o “clear zone”, que encierra la laguna de resorción. La zona de
sellado está definida como una única banda de puntos o acumulaciones de F-
actina. La formación de la zona de sellado procede a la iniciación de la resorción
ósea190.
La zona de sellado permiten la secreción de lisosomas, ya que, movilizan
enzimas ácidas degradadoras de la matriz ósea 180.
La identificación de estos sitios de resorción han permitido establecer que los
OCls organizan sus pequeñas estructuras de adhesión durante el ciclo de
diferenciación y maduración, permitiendo la actividad resortiva. Esta dinámica de
organización celular se caracteriza por un arreglo de la actina en diferentes
estructuras63, 180, 183, 203. Inicialmente se observa como “dot-like” o puntos de
acumulación, también algunos en forma de agrupaciones o “cluster” de actina
llamados podosomas 4, 32, 100, 177, 183. Luego, estos podosomas se aíslan
conformado nubes o “cloud” de actina, para conformar los denominados anillos
de actina 183, 203. Posteriormente, estos anillos de actina se colocan hacia la
periferia celular conformando los llamados cinturones o “belts” de actina 183, 203 y
finalmente, estas cinturones se observan como una estructura circular, ubicada
en el borde de cepillo encerrando la zona de resorción183; por lo cual, esta
estructura ha sido llamada zona de sellado 61, 183 (Figura 2). Entonces, los
19
podosomas 4, 183 son estructuras de adhesión primaria ricas en actina. Sin
embargo, los podosomas son estructuras dinámicas que no sólo se forman en
OCls, sino también en células derivadas de monocitos como macrófagos, células
dendríticas, células musculares, endoteliales, fibroblastos transformados y
algunas células epiteliales 62, 63,64, 66, 193.
Figura 2. Arreglo dinámico de la actina, durante la diferenciación y
activación de OCls. El ensamblaje de estos podosomas puede ser
monitorizado durante el tiempo de cultivo de los OCls, donde la disipación de los
podosomas se incrementa secuencialmente hasta formar diferentes estructuras
de actina. Por lo cual, la formación de estos podosomas y sus propiedades
dinámicas hacia el ensamblaje de la zona “sealing” es importante para la
actividad resortiva de los OCls. Tomado y modificado de Destaing, O (2003)180 y
Jurdic. P (2006)183.
20
22..11 CCaarraacctteerr íísstt iiccaass ddeell aarrrreegglloo ddee llaa aacctt iinnaa eenn llooss ppooddoossoommaass
El citoesqueleto está compuesto de tres elementos: filamentos de actina,
microtubulos y filamentos intermediarios.
Los podosomas en macrófagos y OCls, en estudios con microscopía electrónica
y de fluorescencia, se han observado que consisten en una red de filamentos de
actina centrales, de 0.3 mm de diámetro y 0.6 a 1mm de altura, que alrededor
presentan una acumulación o especie de nube o “cloud” de F-actina, así como
de monómeros de actina que corren perpendicularmente al sustrato. A lo largo
de la actina se han observado proteínas de asociación que regulan la nucleación
de la actina, en forma de grandes y dinámicos empaquetamientos 62, 66, 67, 68, 69.
Este centro o “cluster” de actina contiene a su alrededor adhesinas como la
integrina αvβ3 y otras proteínas de adhesión.
Por estudios de microscopía confocal se ha podido determinar que entre las
principales proteínas asociados a la actina se encuentran la cortactina, la
proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich (WASP), la proteína del complejo 2/3
de asociación a actina (Arp 2/3), gelsolin235 y dinamina 58,62,69,70,71,72,73 (Figura 3).
Así mismo se encuentra varias proteínas adaptadoras y de señalización como
paxilin100, vinculin73, talin73 y diferentes cinasas, entre ellas Pyk2, Src y Syk 58,74.
Recientes estudios han indicado que existe una interacción mutua entre los
filamentos de actina y los microtubulos190. Jurdic y colaboradores 183, han
demostrado que la despolimerización de los microtubulos por nocodazol, induce
la desorganización de los cinturones de podosomas, los cuales, re- aparecen en
estructuras de acumulaciones o “cluster” y anillos de actina, una vez se han
lavado las células y se extrae el nocodazol, permitiendo la estabilización del
cinturón de actina, hacia la periferia de la célula 183.
Por otra parte, la unión de la colchicina a la subunidad microtubular o tubulina,
previene la agregación de estas subunidades en microtubulos. Así, estos
filamentos se acumulan en ciertos lugares de los OCls tratados con colchicina, lo
cual ocasiona el rompimiento de los microtubulos, previniendo la formación del
borde en cepillo y la zona de sellado. Además, no se observa un incremento
progresivo de los filamentos de 100 Å 191.
21
Una explicación podría ser la pérdida del estímulo para inducir la polimerización
de los microtubulos, por lo cual la colchicina, inhibiría la polimerización de los
microtubulos al unirse a la tubulina 191
Hunter y colaboradores192, indicaron que el tratamiento con colchicina en OCls
causa una disminución progresiva de la acidez intracelular, sugiriendo que los
microtubulos median el transporte de las vesículas hacia el borde en cepillo; por
lo cual, la colchicina ha demostrado inhibir los estímulos de hormonas
calciotropicas como la PTH asociada con la degradación ácida de los
componentes de matriz ósea. La colchicina también causa un re- arreglo en el
esqueleto de la vimentina en las células, con la aparición de filamentos
agrupados en zonas o áreas aisladas 192.
Aunque, los microtubulos parecen que son importantes en la maquinaria básica
para la formación de los podosomas, sin embargo, se ha encontrado que al ser
tratados los macrófagos y los OCls con nocodazol, estos se adhieren a un
sustrato sin que se observe la desorganización del podosoma 180.
Además, los análisis de FRAP con β actina-e YFP en macrófagos, mostraron
que el flujo de la actina hacia el centro de los podosomas no se ve afectado por
la despolimerización de los microtubulos o la desestabilización con demelcolina
o paclitaxol, respectivamente. Así parece que los microtubulos no controlan la
maquinaria básica del flujo de actina en los podosomas. Pero si son importantes
para la formación de estos. De acuerdo a lo anterior, se ha hipotetizado que la
perturbación de la dinámica de los microtubulos, podría incrementar o disminuir
la vida media de los podosomas 183, 190. En macrófagos los agentes que
perturban la polimerización de los microtubulos, cambian la vida media de un
subgrupo de podosomas. En contraste en OCls, los efectos del nocodazol y del
paclitaxol en la vida media de los podosomas, no ha sido determinado183. Sin
embargo, la desestabilización de la polimerización de los microtubulos por el
tratamiento con paclitaxol también promueve una desestabilización de los
podosomas y más en la transición de acumulaciones de actina a anillos y
cinturones de actina183, 190. Así parece, que la regulación de los podosomas por
los microtubulos solo se da al final de la diferenciación de los OCls, durante la
22
transición de estas estructuras, por lo cual es la responsable de la estabilidad de
las zonas de sellado183. Se ha demostrado que durante la osteoclastogénesis,
las células presentan podosomas, cinturones de actina, donde se acumula
establemente los microtubulos, los cuales resisten al nocodazol y se encuentran
altamente acetilados183. Por ello, se ha propuesto que la maduración de OCls
está asociada con una acumulación de la polimerización estable de los
microtubulos acetilados. Además, en esta estabilización pareciera que se
regulara por las pequeñas GTPasas como Rho; la inhibición de Rho inhibe la
exoenzima C3, que induce la formación estable y la acetilación de los
microtubulos.
Entonces, la presencia de esos microtubulos está correlacionada con la
persistencia de los cinturones de actina y podosomas. Al parecer así la
acumulación de microtubulos acetilados depende de una vía regulada por Rho y
mDIA2, además, que Rho co-inmunoprecipita y se colocaliza en los microtubulos
junto con la HDAC6, una histona desacetilasa citosólicas, la cual, ha sido
descrita como que desacetilasa de los microtubulos183.
La importante función de la acetilación de los microtubulos es reforzada en los
ensayos sobre superficies similares a hueso, como complejos de colágeno y
apatita118, en las cuales, el citoesqueleto de los OCls se reorganiza durante dos
fases: la fase la inicial es la resortiva, caracterizada por la presencia de una zona
de sellado y la segunda que es la migratoria, asociada con la no formación de
una estructura específica de actina32. La acetilación de los microtubulos se
asocian solo con la zona de sellado, indicando una regulación especifica y
dinámica de los microtubulos en esta zona190. Después de varios ciclos de
despolimerización y polimerización de la zona de sellado, durante la migración y
expansión de los OCls, se observa un ciclo de resorción y migración75. Durante
ambos pasos se ha establecido que se detectan podosomas, los cuales solo se
observan sobre componentes de hueso de matriz extracelular como el colágeno
o la fibronectina, así como sobre vidrio, mientras que las zonas de sellado solo
se observan en sustratos que contengan cristales de apatita o mineralizados 32,
118, 183. Sin embargo, no es claro como las integrinas de estas células
23
osteoclastogenicas se encuentran implicadas en la interacción con la matriz
extracelular186, aunque podría ser activada por la misma apatita. Por lo cual, se
ha dicho que entre la actina, los microtubulos y las integrinas ocurre una
integración importante para la función de los OCls180.
Por otra parte, muchas de estas proteínas también han sido descritas en las
estructuras denominadas focos de adhesión en células como fibroblastos 59. Los
focos de adhesión son estructuras relativamente estables en el tiempo de
adherencia, mientras que los podosomas observados en OCls han sido descritos
como estructuras dinámicas de adherencia, que sufren un ensamblaje y
desensamblaje en minutos 75.
Una de las proteínas que permite la formación de la zona de sellado son las
integrinas como la αvβ3, junto con otras integrinas como la αIIβ1 y αvβ1 que han
sido reportadas en OCls originados de osteosarcomas76, 77, 78,79. A partir de esto,
en las integrina se ha centrado el estudio de la adherencia y organización del
citoesqueleto de OCls. Apartir de esto, la integrina αvβ3 ha sido usada como
blanco terapéutico en enfermedades relacionadas con resorción ósea como
osteoporosis y osteoartritis 81.
Por ejemplo Nakamura 236, en sus estudios con OCls obtenidos a partir de co-
cultivo de células osteoblásticas MB1.8 con precursores osteoclastogénicos de
médula ósea aislados de ratones Balb/c de 6 a 8 semanas, postuló a esta
integrina αvβ3 como una mediadora importante en la organización del
citoesqueleto de los OCls, evaluando la adherencia, migración y mantenimiento
de la estructura polarizada de los OCls y su asociación durante la actividad
resortiva82.
Sin embargo, Lakkakorpi 80, a partir de sus estudios con OCls obtenidos
mecánicamente de huesos largos de ratas y pollos bY, sugirió que aunque este
receptor de vitronectina es importante en la función osteoclástica, no media la
formación final de la zona de sellado y la adhesión de los OCls a superficies de
hueso mineralizado80. A su vez, estudios con OCls obtenidos de sangre
periférica de pacientes con trombastenia de Glanzmann (TG) de tipo Iraqi-
Jewish, deficientes de la subunidad β3 de las integrinas, demostraron que los
24
OCls expresan hasta cuatro veces otras integrinas, sobretodo la integrina α2β1,
la cual podría compensar la deficiencia genética de la integrina αvβ3 en los OCls
de pacientes con TG, permitiendo así la resorción ósea 83.
También, la integrina αvβ3 ha sido asociada con la migración y su activación
permite la fosforilación de otras proteínas tirosina cinasas presentes en el
podosoma, como son las cinasas c-Src y Pyk2 57, 64, 65, 74, 85.
En fibroblastos transfectados con el encogen v-Src, se ha sugerido que la
activación de Src podría entonces estar asociada con la formación de las fibras
de estrés de actina (focos de adhesión) posiblemente regulando la movilidad,
expansión y migración de estas células 59.
Pensando en el papel que representaría la proteína cinasa Src en los
mecanismos que regulan la formación de podosomas, se ha sugerido que la
fosforilación de esta tirosina permite el ensamblaje del podosoma, lo cual
concuerda con los estudios realizados en el rol de pp60c-Src en la actividad
resortiva de los OCls 64, 65, 74, 85
Pero aún, no se ha descrito claramente como Src estaría involucrada en la
señalización para la adhesión de los OCls y en el ensamblaje del podosoma,
únicamente se ha sugerido que posiblemente esta señalización se asocie a la
actividad cinasa de c Src sobre c Cbl, además de su asociación a los procesos
de fosforilación con Pyk2 y Syk 64, 65, 74, 85.
Luxenburg110, describió que al existir la fosforilación de la tirosina de estas
proteínas, los niveles de acumulaciones de actina durante la polarización de la
célula osteoclástica se incrementan. Por ello, se ha propuesto que la
fosforilación de las proteínas cinasas Src, Syk, Pyk2 y c Cbl podría actuar en
concierto para regular la organización de la actina y su dinámica durante el
proceso resortivo 64, 65, 74, 85.
En contraste, a los procesos de maduración y resorción de los OCls, se sabe
que durante el ciclo celular la actina es sintetizada preferiblemente por células
que se encuentran entre la fase Go y S 241. Pero, en el periodo de la interface
entre Go - G1, S y G2, no se observa la presencia de estructuras dinámicas de
la actina En las Células con una interface no mitótica, se ha observado que se
25
expanden y el citoesqueleto de actina se caracteriza por formar fibras de
estrés242, en el caso de los OCls podosomas y zonas de sellado180 que permiten
su contacto o adherencia a una superficie. Sin embargo, durante la mitosis, las
células son muy redondas y las estructuras dinámicas de la actina son
reemplazadas por una distribución difusa de la actina en el citoplasma 242, hasta
que la célula hija se separa de la madre, es allí donde la actina forma un anillo
contráctil o sitio rico en filamentos, que contribuye al clivaje de las células hijas, 242. Entonces, la actina no forma fibras de estrés cuando las células son
arrestadas en la fase Go, esto ocurre cuando las células son incubadas con
bajos niveles de suero o factores de crecimiento del suero o de confluencia o
cuando son deprivadas de SFB. Por lo cual, cuando se arrestan las células en
fase Go-S, el nivel de la síntesis de actina es menor, y por ello, la actina ha
sido descrita como un marcador para identificar la síntesis y la declinación de
proteínas en el ciclo celular. En conclusión, parece que existe una relación entre
las diferentes etapas del ciclo celular y la organización de la actina.
33.. PPRROOTTEEÍÍNNAA TTIIRROOSSIINNAA CCIINNAASSAA cc SSrrcc PPRREESSEENNTTEE EENN LLAASS
CCÉÉLLUULLAASS OOSSTTEEOOCCLLÁÁSSTTIICCAASS.
Peyton Rous en 191159, aisló de gallinas el virus de sarcoma de Rosu, el cual
fue determinado como la primera causa de cáncer por retrovirus. Este tipo de
retrovirus tiene una estructura genética sencilla, con tres genes (gag, pol y env)
como todos los retrovirus, que codifican para proteínas asociadas a la
replicación del genoma viral y para encapsular los viriones para una próxima
transmisión.
Un cuarto gen encontrado en este retrovirus es el gen vSrc (el cual procede de
su denominación en ingles viral sarcom), el cual, codifica para una cuarta
proteína denominada de igual forma, v-Src; esta proteína puede por si sola
inducir a las células en cultivo a cambios en la morfología y comportamiento
propio de las células cancerígenas, por lo cual, esta proteína fue descrita desde
ese momento como un oncogén.
26
Actualmente, la proteína cinasa pp60 c Src45 se ha descrito en las células
animales como una proteína homóloga a vSrc. Diversos estudios basados en
mutantes activados para pp60 cSrc la han descrito con características
oncogénicas, por lo cual la han postulado como un proto-oncogen. Estos
mutantes han permitido caracterizar a esta cinasa pp60 cSrc como una de las
principales proteínas en el control de señales de transducción de varios
receptores, como es el receptor del factor de crecimiento epidermial (EGFR), el
receptor de insulina, entre otros, que regulan el crecimiento y proliferación en
células animales.
Esta proteína no receptora de tipo tirosina cinasa pp60 c Src es un miembro de
la familia de nueve proteínas tirosina cinasa, que se asocia con la superficie
citoplasmática de la membrana celular y se encuentra asociada a adhesinas
como la integrina αvβ3 57.
33..11 CCaarraacctteerr íísstt iiccaass ddee llaa eesstt rruuccttuurraa ddee pppp6600 cc SSrrcc..
Las proteínas de la familia Src tirosina cinasa poseen un dominio común, con
segmentos que han sido designados como regiones homólogas a c Src. La
estructura de esta proteína permite ver hacia el extremo amino terminal
únicamente el dominio SH4, el cual tiene una miristoilación como señal de
localización de membrana, y difiere entre los miembros de la familia.
Seguido a esta miristoilación se encuentra la cadena peptídica para el dominio
SH3, el dominio SH2, el dominio tirosina cinasa (SH1), y una cola corta hacia el
extremo carboxi terminal, el incluye un residuo de tirosina crítico en su función.
Los dominios SH2 y SH3 media las interacciones proteína-proteína en cascadas
de señalización celular y se encuentra en muchas proteínas que no hacen parte
de la familia c Src. Estos dos dominios y la cola C-terminal tienen funciones en la
regulación de la actividad cinasa.
Nada y colaboradores 46 sugirieron que en la cola del extremo C-terminal de esta
proteínas, se encuentra una tirosina que tiene actividad de regulador de la
disposición de los dominios SH2 y SH3 para unirse a otras proteínas. Cuando
este residuo es fosforilado por una proteína cinasa específica, Csk (cinasa C-
27
terminal de la familia Src) inhibe la actividad catalítica de Src al crear un sitio de
unión intramolecular para el dominio SH2. Por lo cual, se ha sugerido que esta
interacción es resultado de la capacidad de auto inhibición que tiene este
proteína, llevando a la molécula a un estado inactivo.
La remoción de los dominios SH2 por la defosforilación del residuo de tirosina
527 (tyr 527) del extremo C-terminal o por unión competitiva de ligando al
dominio SH2/SH3, se permite la apertura del dominio cinasa, exponiendo a otro
residuo de tirosina importante en la actividad cinasa, el residuo tirosina 416, el
cual al ser expuesto es fosforilado. Se ha descrito a esta fosforilación de la
tirosina 416 (Tyr 416) el paso previo a la activación del loop del dominio cinasa 47,48, además se ha descrito como un regulador importante de la función de la
enzima.
En conclusión, la actividad cinasa de pp60 c Src es regulada por su
autofosforilación y fosforilación de sus residuos de tirosina, 416 (efector positivo)
y 527 (regulador negativo de la actividad cinasa).
44.. SSyykk ((PPRROOTTEEÍÍNNAA TTIIRROOSSIINNAA CCIINNAASSAA DDEE BBAAZZOO OO SSPPLLEEEENN TTYYRROOSSIINNEE CCIINNAASSAA PPRROOTTEEIINN)) EENN OOCCLLSS..
Syk es una proteína de la familia tirosina cinasa y junto con la proteína cinasa
pp60c-Src han sido ampliamente estudiada en leucocitos, plaquetas y OCls. Sin
embargo, la expresión de Syk también ha sido detectada en otros tipos
celulares como hepatocitos, fibroblastos, células endoteliales y neuronales, lo
cual sugiere que es una molécula de señalización ubicua. Su rol como gen
supresor de tumor en cáncer de seno ha sido estudiado y ha sido determinada
en leucemias linfoblásticas y carcinoma gástrico104, 102.
En las plaquetas, la proteína cinasa Syk es activada cuando el fibrinógeno se
une a la integrina αIIbβ3 permitiendo la unión de las plaquetas a una superficie,
además la activación de esta proteína cinasa se ha observado cuando las
plaquetas son tratadas con un anticuerpo activador (LIBS6) de la integrina
αIIbβ3 . El papel de Syk en la señales externas ha sido reportada en células
CHO transfectadas con la integrina αIIbβ3 y Syk, cuando se retira el dominio
28
citoplasmático de esta integrina evita que se active Syk. Por lo cual se ha
sugerido que esta actúa en las señales internas y externas en plaquetas durante
la adherencia de estas a una superficie 101,103.
A su vez, junto con la cinasas de la familia Src, Syk participa en las vías de
señalización en leucocitos. Sobre esta proteína, se ha hipotetizado que opera
conjuntamente con la activación de las cinasas de la familia de Src que procede
a la activación de Syk, estos estudios han facilitado la comparación de los
fenotipos de las células inmunes de ratones knockout para estas dos cinasas.
Actualmente se ha discutido el papel de estas cinasas no sólo con la unión a los
dominios citoplasmáticos de las integrinas sino también a los motivos de
señalización fosforilados del inmunoreceptor (ITAM) o “phosphorylated
immunoreceptor signaling motifs” 37.
44..11.. AAssoocciiaacciióónn ddee llaass cc iinnaassaass pppp6600 cc--SSrrcc yy SSyykk ccoonn eell aarrrreegglloo ddeell cc ii ttooeessqquueelleettoo eenn OOCCllss
Se ha descrito a c-Src o pp60src (proteína producto del gen c-Src homólogo a v-
Src) como una proteína ampliamente expresada en la parte terminal de la
diferenciación de muchos tipos celulares como plaquetas y neuronas49,
sugiriéndose que no sólo está asociada al crecimiento y proliferación celular sino
también a procesos de movilidad y adherencia relacionadas con el arreglo del
citoesqueleto; por ejemplo, en el sistema nervioso se localiza principalmente en
nervios terminales y en la mayoría de las vesículas pre sinápticas con actividad
tirosina cinasa, también se distribuye en los conos de crecimiento nervioso,
donde juega un rol importante en la guía de los neuritos hacia su blanco
sináptico (migración) por la modulación dinámica del citoesqueleto 50.
Esta proteína pp60 c-Src se ha encontrado en altas concentraciones en OCls
maduros51, sugiriendo que también está asociada a los procesos terminales de
la diferenciación de este tipo celular con actividad resortiva. Varios estudios la
han asociado a procesos de osteopetrosis, donde existe una disminución de la
resorción ósea realizada por los OCls cuando se inhibe la expresión de c-Src,
sin observarse otra anormalidad en la función de otros tejidos o células 2.
29
También, Src ha sido reportada como una molécula adaptadora de otras
proteínas asociadas a la modulación del citoesqueleto y adherencia de
plaquetas, fagocitos y células de esplenocitos embrionarios humanos 293
transfectadas con Pyk2 55,56,57, encontrándose que en estos tipos celulares
hematopoyéticos, la actividad cinasa de Src permitía asociarse a una actividad
adaptadora con otras proteínas como son la integrina αvβ3 y la proteína cinasa
Syk, c Cbl y Pyk2 importantes en la adherencia y movilidad de estos tipo
celulares, actividades asociadas a un arreglo en el citoesqueleto.
La función de Src en la actividad resortiva de los OCls podría relacionarse con
sus características de molécula adaptadora, posiblemente a través del residuo
K295, el cual permite a la proteína c-Src reclutar otras proteínas asociadas al
arreglo del citoesqueleto, como Pyk2, c Cbl y Syk 65.
Miyazaki y colaboradores54 usando mutantes como Src Y416F-Y527F y Src K295M
encontraron que la sobre expresión de este mutante Src Y416F-Y527F inhibe
parcialmente la actividad resortiva. Además, Schwartzberg y colaboradores56,
observaron que el fenotipo osteopetrotico podría presentarse mejor cuando se
encontraba este mutante Src Y416F que el mutante de Src del residuo asociado
con la actividad adaptadora, Src K295M. Sin embargo, respecto al arreglo del
citoesqueleto, principalmente la distribución de la actina, ambas mutaciones
permitían ver distribuciones diferentes de la actina, sin observarse la formación
de podosomas o zona de sellado o "sealing”, esto indicaría que tanto la
actividad adaptadora como la misma función cinasa de pp60 c Src, atribuida a
los residuos K295, 416, Y527 y K295 respectivamente, están asociados a la
actividad resortiva y adherencia, procesos celulares relacionados con el arreglo
de la actina.
Lakkakorpi y colaboradores 64 sugiriendo a través de sus estudios con ratones src-/- que los osteoclastos derivados de este mutante no podían adherirse y
extenderse apropiadamente en superficies cubiertas con vitronectina o
superficies de matriz ósea, teniendo una falla en la formación de las zonas de
sellado, características de los osteoclastos maduros con actividad resortiva 64.
Por otra parte una actividad excesiva de Src perturbaba la formación de focos de
30
adhesión e inducía la formación de podosomas en otros tipos celulares
diferentes a OCls, como fibroblastos.
Además, pp660 c-Src se ha asociado con el papel de Syk en OCls, el cual se ha
observado conjuntamente con el receptor ITAM, ya que durante la
osteoclastogénesis se ha postulado que existe una relación de la activación de
esta proteína cinasa Syk por este receptor ITAM, teniendo importancia en las
vías de señalización en la diferenciación de las células hematopoyéticas a OCls
que presentan posteriormente con actividad resortiva 37, 102.
Por lo anterior, se ha podido postular a la proteína cinasa c Src como una
proteína importante en la modulación del citoesqueleto y actividad resortiva en
OCls, sin dejar de lado que este arreglo del citoesqueleto, formación de
podosomas o zona "sealing", podría estar afectado por la actividad de otras
proteínas aun sin estudiar.
55.. MMAARRCCAADDOORREESS OOSSTTEEOOCCLLAASSTTOOGGÉÉNNIICCOOSS ..
La habilidad de la excavación o resorción del hueso por los osteoclastos se debe
entonces a la formación del borde en cepillo y la zona de sellado, la cual
presenta un microambiente ácido, con un pH de aproximadamente 4.5. Este
microambiente ácido es creado por la ATPasa H+ vacuolar 219, 238, cuya
localización se ha identificado en el borde de cepillo de la membrana, el
bombeo de protones acoplado a la bomba de Cl- que forma HCl que disuelve la
parte mineral de la matriz ósea 222 (Figura 3) Los demás componentes orgánicos
de la matriz ósea como el colágeno son degradados por las metaloproteinasas
de matriz, catepsina K, B y L7, 223, 239, (Figura 3).
Otra molécula presente en esta zona es la enzima Fosfatasa ácido resistente a
tartrato, denominada también TRAPasa o TRAP 9. Esta metaloenzima
monomérica glicosilada también localizada en el borde de cepillo, podría realizar
la defosforilación de la osteopontina y la sialoproteína de hueso, permitiendo así
que estas proteínas defosforiladas se unan al osteoclasto e induzcan la
migración de este hacia otras áreas donde realiza su actividad resortiva (Figura
3).
31
Otras enzimas importantes son la colagenasa, la proteoglicanasa y la anhidrasa
carbónica tipo II 221, 222, 240, esta última, por el bombeo de protones hidrata el CO2
a HCO3 + H+. (Figura 3)
Los productos de degradación de la matriz ósea son endocitados a través del
borde de cepillo y conducidos por trancitosis61 a un área opuesta a la membrana
del osteoclasto, donde son secretados a sangre periférica. Estos productos
metabólicos son utilizados como marcadores biológicos que indican resorción
ósea8.
Los OCls maduros expresan receptores de calcitonina 216, 217, 220, por lo cual se
ha descrito que la calcitonina 190, 191, 192, 216 regula la resorción, gracias a que
inhibe la liberación de hidrolasas ácidas, reduce la actividad del bombeo de Na+,
K+, bloquea la ATPasa-H+ y altera la localización de la anhidrasa carbónica II 221.
66.. RRAANNKKLL,, IINNDDUUCCTTOORR DDEE LLAA DDIIFFEERREENNCCIIAACCIIÓÓNN OOSSTTEEOOCCLLAASSTTOOGGEENNIICCAA ..
El descubrimiento del ligando del receptor activador del factor nuclear NF- B
llamado RANKL25, ha ayudado a dilucidar los mecanismos de diferenciación,
fusión148, 159 y activación in vitro de los OCls.
Esta proteína transmembranal encontrada en la superficie de las células que la
expresan y la cual es liberada proteolíticamente en forma soluble18, es un
ligando de la familia del factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) 16, 17. Se ha
descrito que induce la diferenciación de células hematopoyéticas y células
mononucleares de sangre periférica a OCls, en presencia del factor estimulador
de colonia macrófago (MCSF) 26, 27.
Al unirse RANKL a su receptor RANK, proteína miembro de esta familia TNFα,
permite la señalización intracelular que induce a la diferenciación, fusión y
activación de OCls, así como en el control de la masa ósea y el metabolismo del
Ca2+ 19, 20.
Otro receptor, denominado osteoprotegerina (OPG), el cual es producido por
osteoblastos, ha sido descrito como un receptor soluble para RANKL y que
32
inhibe la osteoclastogénesis14. La expresión de RANKL y OPG se ha descrito de
manera coordinada para regular la resorción ósea 21 (Figura 3).
Se ha sugerido por estudios in vitro, que RANKL es expresado no sólo por
osteoblastos sino también por células T activadas 18, observándose que in vitro
estas células pueden inducir la diferenciación a OCls, a través de RANKL,
(Figura 3).
Figura 3. RANKL inductor de la fusión celular y la osteoclastogénesis. Los
precursores monocito/macrófagos son diferenciados a OCls por acción de varios
factores pro-resorptivos, MCSF y RANKL, este citocina es importante durante la
fusión de los precursores, junto con DC-STAMP, CD47, MFR/SIRPα, entre
otras; también RANKL interviene en la diferenciación y maduración de la célula
osteoclástica, así como con la adherencia de estas células a matriz ósea,
activando a RANK, TRAF6 y cascadas de señalización donde se encuentra c
Src y Syk. Tomado y modificado de Sanborn, URL: http://
cancergrace.org/04/denosumabandimmunity.jpg. 2009.
33
Así mismo, se ha sugerido que in vivo, RANKL está asociado a un incremento
de la osteoclastogénesis y la pérdida de hueso15. La mutación en esta citocina
origina osteopetrosis 16. Además, RANKL no sólo está asociado a las etapas de
diferenciación sino, tal vez, a la activación resortiva de los OCls.
Además, se ha descrito que la actividad resortiva in vivo es controlada por
factores celulares y calciotrópicos, como la hormona paratiroidea (PTH) y la 1 α
25 hidroxivitamina D3 12, 22, 207. Los estrógenos tienen un impacto negativo en la
diferenciación de OCls, la deficiencia de los estrógenos lidera un incremento en
la diferenciación y activación de los OCls 23 (Figura 3).
Por otro lado, las interluquinas 1, 6, 11 y el TNF alpha (α) 24, 27, se ha sugerido
que inducen un incrementando en la resorción ósea, ya que estimulan tanto la
actividad y como la diferenciación osteoclastogénica (Figura 3)
La inteluquina 1 (IL-1) en OCls pre-fusionados induce la formación de anillos de
actina y la fosforilación de p130 cas, un sustrato conocido de c-Src, a su vez un
tratamiento con IL-1 permitió observar la precipitación de c-Src junto con otras
proteínas como TRAF6, proteína tirosina cinasa 2 24 (Figura 3).
Al contrario, la inhibición o disminución en la resorción ósea se ha descrito bajo
la influencia de IL-4 o INF- , mientras que el rol del factor de transformación de
crecimiento β es más complejo ya que al parecer afecta la proliferación de
precursores de OCls y la actividad resortiva, pero a la vez, incrementa la
expresión de dos marcadores de OCls como la integrina αvβ3 y el receptor de
calcitonina 25.
Entonces, las hormonas calciotrópicas y algunas citocinas e interluquinas pro-
resortivas se han sugerido que regulación de la expresión del ARNm de RANKL
en la línea celular de osteoblastos y cultivos primarios de linfocitos 28, 29, 89.
77.. MMOODDEELLOOSS PPAARRAA LLAA GGEENNEERRAACCIIÓÓNN IINN VVIITTRROO DDEE CCÉÉLLUULLAASS SSIIMMIILLAARREESS AA OOCCLLSS..
Los modelos biológicos in vitro para la generación de OCls han facilitado el
estudio detallado de muchos factores involucrados en la regulación de este
proceso de diferenciación 10.
34
Muchos de estos modelos han determinado un rol crítico de las células
estromales mesenquimales en esta diferenciación, un ejemplo lo constituye
Suda y colaboradores, quienes obtienen células similares a OCls a partir de la
maduración in vitro de macrófagos en presencia de células estromales de
médula; esta maduración se realizó usando co cultivos de línea celular
estromal, derivadas de médula de ratón (ST2) con células de bazo en presencia
de 1 α 25-dihidroxivitamina D3 y dexametasona 11.
Inicialmente, en el proceso de co cultivo fue sugerido que el contacto célula a
célula sería necesario para la diferenciación osteoclástica, además, se requieren
estímulos externos asociados con una actividad resortiva alta, como es la 1 α
25-dihidroxivitamina D3 12, 207 y la dexametasona12. Sin embargo, esta
interacción entre precursores y células estromales no es necesaria, como fue
demostrado en otros modelos.
Por ejemplo, Boyle W, J y colaboradores13, obtuvieron células similares a OCls a
partir de células de medula ósea no adherentes en presencia de CSF-1(llamado
también factor estimulante de colonia macrófago o MCSF) y RANKL (OPGL) 13.
Este ligando del receptor RANK (RANKL) ha sido identificado como una citosina
que reemplaza los requerimientos de las células estromales co cultivadas con
precursores hematopoyéticos, junto con la vitamina D3, glucocorticoides y
hormonas.
Suda y colaboradores11 sugieren que las células estromales y osteoblastos
expresan en su membrana esta citosina, RANKL, la cual actúa sobre los
precursores osteoclasticos que han sido estimulados con MCSF, además,
sugieren que in vitro el factor estimulantes de colonia macrófago (MCSF) y la
interleuquina 1 (IL 1) prolongan la vida del precursor y el osteoclasto.
A partir de este momento, los estudios de osteoclastogénesis usan modelos de
obtención in vitro no solo a partir de co cultivo de células
estromales/osteoblastos con células hematopoyéticas o de bazo, estimuladas
con vitamina D3, hormonas (PTH) o glucocorticoides, también, se comienzan a
usar los cultivos donde la diferenciación de precursores hematopoyéticos a OCls
se realizan bajo el estimulo con citosina como RANKL y MCSF.
35
Otros modelos obtienen células similares a OCls a partir de CMNSP cultivadas
con el factor estimulador de colonias de macrófagos 89, 91, 92,93 (M-CSF) y
RANKL20, 90, 202 sobre superficies plásticas o láminas de diente o hueso cortical
bovino 1, 98.
Otra característica de las CMNSP es la transcripción y expresión del ligando del
osteoprotegerina (OPGL) o también conocido como RANKL y TRANCE en los
linfocitos T 91, 98, 107, 124, 125. Así, una población adherente de células como los
monocitos de sangre periférica adquieren características fenotípicas de pre-
osteoclasto, bajo condiciones simples de cultivo de CMNSP de individuos
normales 96, 97.
Otro sistema para producir células similares a OCls es el uso del co cultivo de
linfocitos CD14+ y monocitos de sangre periférica 88. Este modelo de co cultivo
con la variable que ya no se usan células de bazo, médula ósea u osteoblastos
ha permitido observar y postular a los linfocitos T y los precursores de las
células B 222+/- , como sistemas celulares importantes en la formación de OCls 91,94.
El cultivo de CMNSP, también se ha usado de forma diversa, por ejemplo a
partir de un co-cultivo de Linfocitos CD14+ y precursores stem hematopoyéticos
CD34+ 88,90, se logra obtener células similares a osteoclastos con actividad
resortiva, esta formación de células con similaridad a los OCls ha podido ser
llevada a cabo gracias a la inducción in vitro con estimuladores
osteoclastogénicos como MSCF, RANKL, IL-7, IL-1 y PTH 39,89, 92.
Sin embargo, D´Amelio y colaboradores93, lograron obtener células similares a
osteoclastos de forma espontánea a partir de CMNSP de individuos normales y
mujeres con osteoporosis, en aproximadamente 21 días 93. En este trabajo se
analizaron las concentraciones de dos importantes citosinas como RANKL e IL-
1, las cuales se presentan en altas cantidades en sangre periférica, con llevando
a un incremento no sólo de las células dendríticas sino también de monocitos en
sangre periférica, lo que sugeriría la asociación entre la formación de un alto
número de células osteoclástica por la abundancia de precursores osteoclasticos
36
en sangre que podría llegar con mayor facilidad a hueso en individuos con
osteoporosis que en individuos normales.
No obstante, la generación de OCls también puede hacerse mecánicamente a
partir de huesos largos de rata o pollo 80.
La obtención células multinucleares similares a OCls puede realizarse mediante
la fusión de macrófagos, la cual da como resultado células multinucleadas
(MGC) que pueden ser las células gigantes de cuerpos extraños o “foreign body
giant cells” (FBGCs), células de “Langhans” y los osteoclastos 30,86. Al parecer la
multinucleación dota a estas células de la capacidad de resorber hueso, destruir
agentes infecciosos o material extraño y otros materiales demasiado grandes
para ser internalizados.
Murillo 30 obtiene por fusión con polietilenglicol a partir de macrófagos de líneas
celulares (U937/a y J774, propuestos en la literatura como precursores
osteoclasticos) células multinucleares con capacidad resortiva que expresan la
enzima TRAP, este modelo permite obtener células con características similares
a OCls en un tiempo corto, sin el uso de inductores de estimulación
osteoclastogénica como RANKL, MCSF, PTH, 1 α 25 hidroxivitamina D3 30,
entre otros. Además, representa una técnica de bajo costo y que puede ser
usada como modelo en los estudios de comportamiento celular a nivel de
biología molecular y bioquímica. Así mismo, Manrique1 presenta la formación de
células multinucleares similares a OCls, a partir de células mononucleares de
sangre periférica (CMNSP) obteniendo resultados que sugieren que la fusión
con PEG podría estar induciendo en las CMNSP, la expresión de proteínas
osteoclastogénicas y actividad resortiva propia de los osteoclastos, además,
esta función resortiva no es exclusiva de CMNSP de individuos normales, sino
también estaría asociada a las CMNSP de pacientes con osteogénesis
imperfecta, ya que estas células al trabajar en este modelo de fusión celular
mediada por PEG, presentaron una reducción en su actividad resortiva cuando
se colocaron en presencia de derivados de alendronato.1.
37
88.. FFUUSSIIÓÓNN CCEELLUULLAARR
La fusión celular es un evento en el cual las membranas al fusionarse se
acercan, entran en contacto y tras mezclar los lípidos de sus bicapas, forman un
poro de fusión el cual se expande y permite el contacto de los citoplasmas140, 142.
La habilidad de las células para fusionarse con otra es referida a su
fusogenicidad144. La fusión en organismos vivos es un complejo mecanismo,
pobremente entendido, que consiste en múltiples pasos que involucran:
1. Reconocimiento
2. Adhesión celular
3. Fusión de membrana 144
La fusión de membranas parece tomar parte en muchos procesos biológicos
como: secreción de macromoléculas de glándulas excretoras, liberación de
neurotransmisores, sinapsis, procesos de picnocitosis y fagocitosis 172. Por lo
cual, el proceso de fusión celular está presente desde el inicio de la vida144, 146,
cuando los gametos de los padres (femeninos y masculinos), funden sus
membranas, el desarrollo de los músculos se realiza bajo la fusión de mioblastos
en tejido sincitial146.
88..11.. FFuussiióónn cceelluullaarr eessppoonnttáánneeaa
La fusión celular ha sido descrita en el nematodo C. elegans de la siguiente
forma: la fusión aparece por un origen, donde se acercan las membranas
formando la unión apical y se expande a lo largo de la membrana y generando
una ola de fusión alargada basalmente 170, 171. La eliminación completa de la
membrana entre dos células fusionadas toma cerca de 30 minutos. La
expansión de la zona de fusión está acompañada por la migración de un
marcador denominado AJ o AJM-1, desde la posición apical a la basal171. La
proteína AJM-1 desaparece de la parte basal en 5 a 10 minutos, después de la
iniciación de la fusión de membrana. Sin embargo, Podbilewicz y White (1994)
determinaron que AJ no es necesario para la fusión de ciertas zonas del
nematodo como la parte dorsal y ventral 171. También se ha descrito que la
fusión de las membranas en este nematodo se realiza por la formación de
38
vesículas en la membrana en la zona fusionada. Estas vesículas son una parte
de la maquinaria de fusión la cual se inicia por un simple poro de fusión, el cual
ha sido descrito que en en la exocitosis de los mastocitos o durante la infección
viral mediad por hemaglutinina169.
Recientemente, se ha establecido múltiples poros intermediarios en C.elegans,
con diámetros que van desde los 20 hasta los 50 nm, donde se involucra la
proteína eff-1170, la cual al ser mutada en esta especie no permite la formación
del poro y fusión de membrana, además que le da especificidad de tejido a la
fusión170. Gracias al funcionamiento de esta proteína se ha podido distinguir
varias formas de fusión celular: la primera es la microfusión, en donde existen
zonas de contacto entre membranas, conformando una zona adherente,
compuesta por la proteína AJM-1, aquí no hay una fusión completa de las
membranas, la segunda es la macrofusión, en donde la zona adherente es
conformada por eff-1 y AJ-1, permitiendo la formación de una fusión macro o
total de las membranas 170.
Bajo estímulos ambientales el poro de fusión es formado, un canal acuoso entre
la vesícula y la membrana plasmática, a través de la cual las moléculas
cargadas se difunden hacia fuera del lumen vesicular llegando al exterior 176.
Una característica de muchos tipos de cáncer es la tendencia a cambios
graduales biológicos de tal manera que llegue a ser inexorablemente más
maligno 173, 174.
La progresión inherente en tumores malignos es debido a ala adquisición de
subpoblaciones que exhiben las anormalidades citogénicas caracterizadas por
aneuploidia y el re-arreglo cromosomal basado en la fusión de célula-célula, con
la generación de variantes, que pueden contribuir a la diversidad del tumor
celular 174, 175.
Al parecer los eventos fusogénicos entre las células estromales de ratón y
células epiteliales de cáncer de seno humano maligno, permiten que las células
epiteliales malignos que pueden adquirir la habilidad para transformar
genéticamente el microambiente estromal173.
39
Otra forma de fusión espontanea es la presencia de Ca2+ en concentraciones de
40 mM, a un pH 10.5, permite inducir la fusión de membranas172. Bajo estas
condiciones el porcentaje de fosfatidiletanolamina y lectinas son hidrolizadas y
forman compuestos lyso, sobre los cuales se hipotetiza son mediadores de la
formación de células homopolicarionicas 172.
88..22.. FFuussiióónn ddee mmeemmbbrraannaass eenn OOCCllss yy mmaaccrróóffaaggooss.
Se ha sugerido que la fusión de precursores monocito/macrófagos es un evento
importante, no solo para la formación de osteoclastos multinucleares, sino
también para la actividad resortiva realizada por ellos164, sin embargo, la
disminución del número de células multinucleares no garantiza la completa
abolición de la resorción 159,164.
Debido a su función, los OCls son células policarionicas gigantes, originadas a
través de la fusión celular homotrópica de sus precursores monocitos. Contrario
a otros procesos de fusión celular homotrópica y heterotrópica, la fusión de
células osteoclastogenicas ocurre con precursores de linaje monocito
homotrópico en dirección 2D, lo cual origina la actividad de estas células en el
hueso, teniendo una vida media corta, de aproximadamente 3 días, mientras que
la vida media de las células gigantes de macrófagos es más larga, por ejemplo
en granulomas 146. Además, la fusión celular tiene un efecto en el tamaño de la
célula osteoclástica 147, ya que el diámetro de la célula multinuclear es varias
veces mayor que su célula precursora, dependiendo claro está del número de
células usadas en la fusión. Por lo cual, ellos realizan más eficientemente su
actividad resortiva. Sin embargo, se ha encontrado que sin la formación de esta
célula multinuclear, los precursores de OCls son capaces de realizar resorción
de manera menor. Por lo cual la fusión celular no sería necesaria para dicha
actividad 147.
La fusión entre dos precursores osteoclastogenicos (monocitos) no es
completamente idéntica, se ha hipotetizado la existencia de células buscadoras
“founder”, las cuales ya están listas para la multinucleación, que se agarran a
células mononucleares, denominadas “follower”, células competentes para la
40
fusión, originando así la fusión entre estas células. Las células “founder” son
móviles, mientras que las células “follower” son altamente estáticas. Por lo cual,
se ha sugerido, que la fusión durante la osteoclastogénesis tiene cierta
direccionalidad y ocurre entre diferentes partes de la célula147, 149. Ante este
hecho se desconoce como estas células se distinguen y si existe diferencias
entre las células mononucleares y las células competentes para la fusión
“follower” 149. Esta hipótesis surge de los ensayos con policariones que expresa
DC –STAMP (Figura 3), lo cuales pueden en co-cultivo con células
mononucleares fusionarse con estas células 149.
La MFR o receptor de fusión de macrófagos, también llamada SIRPα es de las
primeras moléculas postuladas para la fusión celular osteoclastogénica 150, 151.
Este es un tipo de proteína transmembranal del tipo I, que pertenece a la
superfamilia de proteínas de inmonoglobulina (IgSF), identificada no solo en
OCls sino también macrófagos 162. Lundergberg y colaboradores, (2007), usando
quimeras de ratones D47-/- con bloqueos de anticuerpos específicos contra
SIRPα y D47 identificaron la posible asociación pivotal en la formación de
células multinucleares TRAP positiva (+), del receptor MFR/SIRPα con CD47
(proteína asociada a integrina/ IAP), el cual se asocia a integrinas, que estimula
la quimiotaxis, migración y activación de leucocitos 163, al parecer necesaria para
la fusión osteoclastogénica y la formación de células gigantes a partir de
macrófagos163, la cual se origina intercelularmente. Sin embargo, no es claro
como es la posible asociación entre estas dos proteínas y su relación con la
actividad resortiva en los OCls.
La posible asociación entre CD47 y SIRPα fue hipotetizada por Han y
colaboradores152, en macrófagos para formar células gigantes multinucleares;
CD47 puede unirse con la isoforma larga de MFR/SIRPα. Este evento induciría a
la forma corta de este receptor, contribuyendo a que las membranas plasmáticas
de dos células se acerquen lo suficiente para comenzar la fusión. Por lo cual
antes de la fusión, el reconocimiento célula-célula es un primer paso mediado
por MFR/SIRPα –CD47 152.
41
En macrófagos la unión de CD47 y SIRPα puede inhibir la fagocitosis, y al
parecer también regula la migración celular163. Frente a los ensayos de Han152,
no es del todo cierto, que estas proteínas sean las dos únicas moléculas
involucradas en la formación de células multinucleares, debido a que, ante la
ausencia o bloqueo de ellas en los progenitores monocito, persiste la formación
de células multinucleares, pero en menor número. Además, estos ensayos no
permitieron comparar la disminución del número de células multinucleares con la
actividad resortiva.
Otra proteína que ha sido postulada en los eventos de fusión célula-célula en
OCls y de macrófagos para formar células gigantes multinucleares es DC-
STAMP o proteína transmembranal específica de células dendríticas, la cual al
parecer es clave en la fusión celular durante la osteoclastogénesis y la formación
de macrófagos gigantes159. Cuando se usaron ratones transgénicos para DC-
STAMP 164 o ratones DC-STAMP-/- 159, 164, durante la osteoclastogénesis,
inducida por la estimulación con RANKL, esta citocina regula altamente la
expresión de esta proteína hacia la periferia de las células multinucleares 148, 164,
cuando se usa conjuntamente con M-CSF, aunque, con el estímulo de solo M-
CSF no se observo el mismo evento.
Además, el aumento del número de osteoclastos multinucleares se observó ante
una sobre expresión de esta DC-STAMP, mientras, que en ausencia de esta
proteína se observó una disminución del número de células multinucleares
obtenidos a partir de médula ósea de ratones DC-STAMP-/-. La sobre expresión
de DC-STAMP en médula ósea de ratones silvestres también fue observada con
el estímulo de GM-CSF e IL4, lo cual sugeriría que este tipo de proteína no sería
exclusiva de osteoclastos, sino también de otras células hematopoyéticas como
macrófagos o células gigantes multinucleares 159. Iwasaki y colaboradores164 no
muestran el efecto en la generación de células multinucleares.
Yagi y colaboradores149, también describieron en estudios con ratones DC-
STAMP-/-, que la ausencia de esta proteína evitaría obtener un número alto de
células multinucleares, no obstante, en ellas se seguía observando la expresión
del ARNm de marcadores osteoclastogénicos como ATPasa V-H+ y catepsina K,
42
después de 48 y 72 h de estímulo con RANKL y TNFα, por lo cual, la actividad
resortiva en estas células que no expresan DC-STAMP se siguió observando,
pero en menor proporción149, además, que esta proteína podría estar asociada
al mantenimiento y/o aumento de la masa ósea 159, 164, cuando no es observada,
lo cual corrobora, lo presentado por Ishii (2008), en el sentido que la fusión no es
totalmente necesaria para la actividad resortiva.
Se han postulado otras moléculas como inductores o participantes de la fusión
celular osteoclastogénica y de macrófagos como receptor de hialurónico (CD44) 153, CD98 154, CD200 155, la cadherina 156, 157 , el receptor purinergico P2X7 157,165
, la subunidad d2 de la ATPasa V-Vo158 y las proteínas de la superfamilia
tetraspanina (TM4SF) asociadas a microdominios de membrana,
específicamente la tetraspanina CD9 159, 160, 161, aunque, no es claro cómo regula
o participa de este evento de fusión.
Los macrófagos se fusionan y diferencian para formar células multinucleares
gigantes en sitios crónicos de inflamación y en hueso para formar OCls, la
formación de células gigantes de macrófago o granulomas es un evento
considerado cercano al fenómeno de la fusión celular durante la
osteoclastogénesis. Se ha sugerido que ambos tipos de células gigantes
formadas por la fusión de macrófagos tienen capacidad resortiva 148.
La formación de células policarionicas en macrófagos tiene dos principales
efectos en los macrófagos: uno es incrementar el tamaño y el otro es la de
realizar la resorción de grandes componentes que no pueden ser internalizados
en una célula mononuclear, permitiendo así degradar componentes
extracelulares por medio de lisosomas146, por lo cual al igual que los OCls, los
macrófagos poseen un número alto de lisosomas. Aunque tanto macrófagos
multinucleares como OCls tiene esa capacidad de resorber moléculas de
grandes tamaños, debido a un aumento en el volumen y diámetro celular, esa
capacidad es diversa en ambas células debido a la regulación génica diferente
que ocurre durante la formación de estas células. Lo cual hace que cada uno
tenga una especificidad por su “sustrato a degradar”, debido a esta especificidad
y los eventos que ocurren durante la osteoclastogénesis y la formación de
43
granulomas de macrófagos, hace que estas células gigantes de macrófagos
tengan baja actividad resortiva, frente a la realizada por OCls, los cuales son
capaces de resorber grandes áreas de hueso. A diferencia de los macrófagos y
neutrófilos, la degradación de material por parte de los osteoclastos es
extracelular.
En macrófagos se ha observado la actividad de receptor P2Z/P2X7 (gran
receptor/canal de la subfamilia P2X, de 595 aminoácidos) al igual que en
osteoclastos, para la formación de células gigantes multinucleares165, cuando los
macrófagos son incubados con Concavalina A y el INF-165, mientras que se
inhibe, en presencia de ATP oxidado, sin embargo no se ve afectada la
quimiotaxis, las agregaciones celulares y la expresión de CD11a, CD18 y CD54 165. Al parecer frente a una alta concentración de ATP y una elevada expresión
de este receptor, la fusión de las células en macrófagos se da, observándose
células gigantes multinucleares, con morfología similar a la de una células
osteoclasticas, en donde se observa fracturas localizadas entre las membranas
que interactúan durante la fusión celular157, 165. Pero, a una baja expresión de
este receptor causa que las células de macrófagos permanezcan pegadas
formando agregaciones celulares, similar a lo observado en células con
capacidad resortiva 157. Sin embargo, Ke y colaboradores167, describió la
presencia de células multinucleares con capacidad resortiva en ratones donde el
receptor P2X7 se expresaba, lo cual es corroborado por Lemaire y col (2006)157.
La subunidad d2 de la V-ATPasa Vo favorece la fusión de macrófagos y
osteoclastos, a diferencia de lo que ocurre en el C.elegans, en donde el
complejo ATPasa reprime la fusión de células en este organismo168.
88..33.. IInndduucccciióónn eexxppeerriimmeennttaall ddee llaa ffuussiióónn cceelluullaarr
Experimentalmente la fusión puede ser inducida: adicionando un agente
fusogénico como el polietilenglicol (PEG), colocando las células en contacto en
un campo eléctrico (electro fusión) o por láser 1, 30, o mediante la aplicación de
un campo eléctrico que alcanza o excede el potencial de la membrana induce la
formación de poros en la bicapa de fosfolípidos1, 30.
44
88..44.. PPoolliieettiilleenngglliiccooll ((PPEEGG))
El PEG es un es un polímero de óxido de etileno con un hidroxilo terminal
(C2H6O2. 1,2-dihidroxietano) cuya estructura molecular es:
Este polímero comenzó a ser usado en la década de los 70 en la producción de
hibridomas. Para la producción exitosa de hibridomas se han utilizado diversas
concentraciones y diferentes pesos moleculares, siendo importante el medio en
el que se disuelve este polímero 1, 42, 44.
El PEG, es soluble en agua a temperaturas moderadas a diferentes
concentraciones y sobre un amplio rango de pesos moleculares. En la fusión
celular, generalmente se utilizan pesos moleculares entre 100 y 10000 142, 208.
Existen dos pasos importante para que el PEG induzca la fusión de membranas
celulares: el primero es la agregación de las células antes de la fusión y
segundo, la desestabilización de las membranas de las células agregadas,
procediendo así a la fusión 208.
Arnold y colaboradores (1983, 1985) propusieron que el efecto del PEG sobre
las membranas puede ser explicado por la atracción que induce este polímero
entre ambas membranas 208.
Por lo cual, La fusión entre vesículas agregadas o entre células ocurre cuando
se utilizan altas concentraciones de PEG de bajos pesos moleculares208. El
mayor requerimiento para inducir la fusión con PEG es que debe existir una
extremada cercanía de las membranas a fusionar 142, 208.
El PEG contribuye a cerrar los espacios o “gaps” de la interbicapa lipídica.
Entonces, el PEG remueve las moléculas de agua entre las bicapas
adyacentes, debido a la alta afinidad que tiene este polímero por el agua.
Además, el solo PEG no puede disparar la fusión, si los fosfolípidos de
membrana se encuentran dañados o flácidos208. Entonces, la fusión ocurre solo
cuando la energía de superficie de las bicapas lipidicas es modificada por la
adición de componentes de bajo estrés 208.
45
Es interesante ver que mientras el umbral de la concentración de PEG para la
fusión es dependientemente de la composición y estructura de las membranas a
fusionar, mientras que el umbral para la agregación es ampliamente
independiente de ellas208. Esto indica que se necesita una fuerza diferente para
la fusión y otra para la agregación. Por lo cual, las fuerzas empleadas son
rangos cortos críticamente dependientes de la desestabilización de las bicapas
por deshidratación, mientras que la deshidratación depende de la adsorción del
PEG208.
Las células se agregan cuando se suspenden en la solución de PEG
concentrado 208. La extrema deshidratación y alta presión osmótica en las zonas
de contacto forza las proteínas integrales de membrana a alejar del área donde
las bicapas lipidicas se acercan, oponiéndose unas con otras, la segregación de
las proteínas de membrana en la zona de contacto puede ser visualizada por
una fractura libre, la cual puede ser observada por microscopía electrónica142.
Entonces, la fusión célula a célula es usualmente iniciada en las zonas de
contacto y la fusión del sitio se expande durante la subsecuente pasos de lavado
del PEG142, 208. Por lo cual, la dilución del PEG después del tratamiento en las
células es un paso crucial sin el cual la fusión que se produce es baja 142, 208.
46
99.. OOBBJJEETTIIVVOOSS
99..11.. OObbjjeettiivvoo ggeenneerraall
Evaluar la expresión y fosforilación de c-Src, Syk y el re-arreglo de la actina, asociados
con la actividad resortiva de CMSP fusionadas con polietilenglicol.
99..22.. OObbjjeettiivvooss eessppeeccííffiiccooss
1. Evaluar la expresión de marcadores osteoclastogénicos como la enzima
TRAP, las proteínas Anhidrasa carbónica II, ATPasa vacuolar, Catepsina K, el
Receptor Activador de NF-B (RANK) y el receptor de calcitonina en las CMNSP
fusionadas con polietilenglicol (PEG) adheridas a matriz ósea
2. Analizar la disposición de la actina en las CMNSP fusionadas con PEG sobre
matriz ósea, proteínas de matriz ósea como Vitronectina y Colágeno tipo I.
3. Evaluar el efecto del inductor de diferenciación osteoclastogénica, RANKL, en
la distribución de la actina y la actividad resortiva en las CMNSP fusionadas con
polietilenglicol (PEG).
4. Determinar si existe una correlación entre la expresión de las cinasas c-Src y
Syk con el arreglo de la actina y actividad resortiva en las CMNSP fusionadas
con polietilenglicol (PEG) adheridas a matriz ósea
47
1100.. MMAATTEERRIIAALLEESS YY MMÉÉTTOODDOOSS
1100..11.. EEssttrraatteeggiiaa eexxppeerriimmeennttaall
Se diseño un estudio experimental in vitro que utilizó como modelo las células
mononucleares de sangre periférica (CMNSP) de individuos normales con
edades entre 20 y 40 años. A estas células se les adicionó polietilenglicol (PEG)
para inducir la formación de células multinucleares que tuvieran capacidad
resortiva. Las CMNSP tratadas con polietilenglicol (PEG) fueron utilizadas como
grupo experimental y como grupo control se usaron las CMNSP sin tratar con
PEG.
48
lavaron doce veces con agua destilada hasta eliminar totalmente el detergente y
finalmente se esterilizaron con etanol al 70% por 60 minutos y se lavaron dos
veces con medio DMEM suplementado con 10% SFB 33.
1100..22.. LLáámmiinnaass ddee vviiddrriioo..
Se partió de láminas de cubreobjetos que se seccionaron con un corta fríos para
obtener láminas de 0.25 cm2. Estas láminas se sumergieron en HCl 2N por dos
horas, se lavaron diez veces con abundante agua, luego se colocaron en cajas
de 24 pozos y se esterilizaron bajo luz ultravioleta durante 60 minutos. Algunas
láminas se cubrieron con 10 µg/ml de vitronectina 181, 184 (VN, Sigma) ó 30 µg/ml
de colágeno tipo I 182,184 (CTI, Sigma) y se incubaron a 37°C por 60 y 120
minutos, respectivamente. Otras láminas se cubrieron con 20 µl de suero fetal
bovino al 10% 181 (SFB, Eurobium) Como control se utilizaron láminas
incubadas solo con medio DMEM ó 0.1% (p/v) de poli-L-lisina 181,184 (PLL,
Sigma), aunque, este polímero está cargado positivamente y se utiliza para
adherencia celular, no se encuentra relacionado con la formación de
acumulaciones de actina (podosomas) en células osteoclastogenicas. Una vez
incubadas con cada uno de los adherentes, se lavaron con PBS estéril a 4º C. El
secado de las láminas de hueso cortical bovino y de vidrio se realizó al aire libre
dentro de la cabina de flujo laminar.
1100..33.. MMeeddiiooss ddee ccuullttiivvoo yy rreeaaccttiivvooss..
Para separar las células mononucleares de sangre periférica (CMNSP) se
realizó un gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque-1077 (Sigma-Aldrich)105. El
medio de cultivo utilizado para las células de sangre periférica fue “Dulbecco´s
Modified Eagle´s Medium” (DMEM, in Vitrogen) con 10% (v/v) de suero fetal
bovino (SFB, Eurobium), 100 IU/ml de penicilina y 100 μg/ml de estreptomicina.
Las células fueron incubadas a 37°C con 5% de CO2 y 95% de humedad relativa
(HR). La estimulación de las células mononucleares separadas por Ficoll se
realizó con Fitohemaglutinina-P1, 121 (PHA-P, Sigma), la cual estimula y aglutina
linfocitos T 121. La PHA-P se disolvió en DMEM, se congeló a 1mg/ml y se
49
adicionó a las células durante 24, 48 ó 72 horas en concentraciones 5, 10, 20 ó
30 µg/ml. Para inhibir la polimerización de los microtúbulos se utilizó
colchicina191 (colchimedio, Bussié) preparada a partir de una tableta, la cual se
pulverizó y se disolvió en DMEM a una concentración de 20 µg/ml y se trabajó a
10 µg/ml por 24 horas. RANKL (R&D Systems) 100, es un inductor de la
diferenciación del linaje monocito/macrófagos a osteoclastos (OCls), por lo cual,
las CMNSP fueron cultivadas con 40 ng/ml (p/v) de RANKL por 48 horas ó con
50 ng/ml100 durante 1, 7 ó 14 días. La inducción de la fusión de las CMNSP se
realizó con polietilenglicol 1450 (PEG, Sigma), el cual se diluyó en PBS a una
concentración de 50% (p/v), se esterilizó a 15 libras de psi, 121 °C por 15
minutos y se almacenó en botellas ámbar.
Para determinar la viabilidad de las CMNSP se utilizó el ensayo de reducción de
MTT137 (3-(4,5-dimetilthiazol-2-il)-2,5-bromuro de difenil tetrazolio, Sigma). Este
ensayo mide espectrofotométricamente la actividad de un grupo de enzimas
mitocondriales, como la succinato reductasa (EC 1.3.99.1).
La evaluación de la fragmentación nuclear se hizo con DAPI (Sigma), para ello,
se preparó un “stock” a 5 mg/ml, se congeló y se utilizó a 1 µg/ml (p/v)33.
1100..44.. AAiissllaammiieennttoo ddee ccéélluullaass mmoonnoonnuucclleeaarreess DDEE ssaannggrree ppeerriifféérriiccaa ((CCMMNNSSPP))
yy eessttiimmuullaacciióónn ccoonn ffiittoohheemmaagglluuttiinniinnaa ((PPHHAA))
Las CMNSP se aislaron siguiendo el procedimiento modificado del descrito por
Böyum, (1968). Las muestras de sangre periférica de varios individuos normales
(en promedio cinco) se mezclaron con una solución salina en una dilución 1:1,
luego, las células fueron separadas, mediante centrifugación a 700 x g por 20
minutos, en un gradiente de densidad Ficoll-Hypaque-1077105, después, se
recolectaron las células mononucleares (linfocitos, células NK y monocitos) y se
evaluó su integridad de membrana con azul de Tripan al 4% (p/v), en cámara de
Neubauer.
Las células se cultivaron en DMEM, se estimularon con fitohemaglutinina–P y
en algunos casos no se estimularon con PHA-P. Del cultivo se recolectaron las
50
células en suspensión y adherentes; estas últimas se desprendieron con una
solución de PBS - EDTA 1mM (p/v) por 10 minutos a 37 °C. Después que las
células fueron recolectadas y centrifugadas a 1200 rpm durante 10 minutos1, se
les realizó la evaluación de la integridad de la membrana con azul de Tripan.
1100..55.. DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddee aallgguunnooss mmaarrccaaddoorreess ppoobbllaacciioonnaalleess..
La evaluación de marcadores poblacionales se realizó mediante citometría de
flujo (FACS) 38; para lo cual, las CMNSP separadas por Ficoll se fraccionaron en
cinco grupos, cada uno con 102.660 células/ml y se estimularon de manera
independiente con 0, 5, 10, 20 ó 30 µg/ml de PHA-P; al cabo de 24, 48 ó 72
horas, las células de cada fracción fueron recolectadas y analizadas como se
mencionó en el apartado 10.5. Luego, se tomaron 3 x 105 células/ml de cada
grupo estimulado con PHA-P, se resuspendieron en 100 μl de solución filtrada
de PBS con SFB al 1% (v/v) y se incubaron de manera independiente con los
anticuerpos que se muestran en la Tabla 1, a 4 ºC por 40 minutos. Luego, las
células se lavaron con 2 ml de PBS estéril con SFB al 1% y se centrifugaron a
2200 rpm por 7 minutos a 4 ºC; después de descartar el sobrenadante, las
células fueron resuspendidas en 300 μl de PBS estéril con 1% (p/v) de
paraformaldehido 38.
El análisis se realizó en un equipo Becton Dickinson, con un software versión
CXP 22. Como control se utilizaron CMNSP estimuladas sin la adición de
anticuerpos y no estimuladas con PHA-P. Cada ensayo fue realizado por
duplicado.
1100..66.. EEssttaannddaarriizzaacciióónn ddeell nnúúmmeerroo ddee ccéélluullaass yy vvoolluummeenn ddee ppoolliieettiilleenngglliiccooll
((PPEEGG)) nneecceessaarriioo ppaarraa iinndduucciirr llaa ffuussiióónn cceelluullaarr..
Para evaluar el número de células mononucleares y el volumen de PEG
necesarios para inducir la fusión141 se siguieron las recomendaciones de
Campbell (1984); Hui (1999) y Knutton (1979), quienes indicaron que por cada 8
a 10 x 105 células /ml se utilizan volúmenes de 40 a 50 µl para
51
concentraciones entre 34 y 50% de PEG 44, 139, 140, 141, 298. Los volúmenes de
medio DMEM para diluir el PEG se determinaron a partir de lo reportado por
Kräihling, H, 1981.
Tabla 1: Anticuerpo utilizados en el ensayo con FACS.
Origen Tipo Concentración
(µg/ml)
Antígeno que reconoce
Conjugado
Casa comercial
Ratón IgG2b
0.143 Células monocito/
macrófago CD14
Ficoeritrina
(PE)
BD Biosciences
Ratón
IgG1
0.0085
Linfocitos T CD4 ayudadores
Ficoeritrina
(PE)
BD Biosciences
Ratón
IgG1
0,025
Linfocitos T CD8 citotoxicos
PerCP
BD Biosciences
Ratón
IgG1
0.8
Células mielomonocito/
Dendríticas CD13
Fluoresceína isotiocianato
(FITC)
Santa Cruz
Las CMNSP estimuladas con 30 µg/ml de PHA-P se fraccionaron en ocho
grupos y se les trató con diferentes volúmenes de PEG durante 5 minutos y con
agitación suave ocasional; luego, se adicionaron los volúmenes de medio DMEM
que se mencionan en la Tabla 2 1, 30, 44, 141; cada uno de estos volúmenes de
52
medio se adicionaron cinco veces, en intervalos de un minuto hasta completar 5
minutos. Después de diluir el PEG, las células se centrifugaron por 7 minutos a
1000 rpm y se lavaron dos veces con medio DMEM. Cada densidad celular
tratada con PEG se resuspendió en 20 l de medio DMEM con 10% de SFB,
luego, se sembraron sobre láminas de hueso cortical bovino o láminas de vidrio
y se incubaron por 2 h a 37 °C. Después de este tiempo, cada lámina se lavó
suavemente con 300 µl de medio y se descartó este medio. Posteriormente, a
cada lámina se le adicionó 350 µl de medio DMEM con 10% SFB y se incubó a
37 °C por 48 h. Los ensayos fueron realizados por duplicado. Como control se
empleó el mismo número de células no tratadas con PEG.
Tabla 2: Número de Células y volúmenes de PEG usados para inducir la fusión.
Número
CMNSP/ml
Volumen (µl)
de PEG
1450 (50%)
Volumen (µl)
de DMEM para
la primera
dilución
Volumen (µl)
de DMEM para
la segunda
dilución
Volumen (µl)
de DMEM para
la tercera
dilución
3.2 x 105 10 10 20 80
4 x 105 15 10 20 80
5 x 105 20 10 20 80
6 x 105 25 20 60 120
7 x 105 35 20 60 120
8 x 105 50 40 80 160
9 x 105 50 40 80 160
10 x 105 50 40 80 160
Una vez se estableció el número de células y el volumen de PEG requeridos
para inducir la fusión celular, los siguientes ensayos en este proyecto se
realizaron con 8 x 105 a 10 x 105 células/ml con 50 µl de PEG 1450 por 5
minutos 1, 44, 140. La dilución del PEG se hizo como se menciona en la Tabla 2.
53
Los tiempos de incubación de las CMNSP tratadas con PEG y su grupo control
(CMNSP sin PEG) variaron según el tipo de ensayo realizado como se
mencionará para cada experimento.
1100..77.. VViiaabbiilliiddaadd ddee llaass CCMMNNSSPP
Para evaluar la viabilidad de las CMNSP antes y después del tratamiento con
PEG se realizó el método de reducción de MTT137, el análisis de integridad de
membrana con azul de Tripan y el análisis de la fragmentación nuclear con la
tinción de DAPI 33.
1100..77..11.. EEnnssaayyoo ddee MMTTTT
El procedimiento seguido fue una modificación, del descrito por Erl Wolfgang
(1999).
Al medio de cultivo donde están las CMNSP se adicionó 2 mg/ml de MTT
(Sigma-Aldrich) en una relación 1:1. Luego, se incubaron a 37 °C por 4 horas.
Después, el medio con MTT se recolectó por pipeteo y centrifugación; luego, los
cristales de formazan se solubilizaron por 120 minutos a 18 -25° C, bajo
oscuridad y agitación continua, usando una solución alcohólica ácida (0.04N
HCl en isopropanol). Con esta técnica se evaluaron las CMNSP estimuladas con
PHA-P, tratadas con PEG, sembradas o no sobre matriz ósea.
Como control negativo de la actividad de la succinato reductasa se utilizó la
absorbancia del lisado celular con MTT, esta lisis fue realizada por 10 minutos a
37 °C con una solución de 100 mM PBS pH 7.2, 0.029% EDTA y 1% Tritón X-
100. Los blancos usados fueron el buffer con Tritón x-100, la solución alcohol-
ácida y la solución de medio con 10 % de SFB sin MTT. Como absorbancia de
referencia se usó la correspondiente al medio con 10% de SFB y MTT, pero sin
células.
Los cristales de formazan disueltos fueron cuantificados a 555 nm, en un
espectrofotómetro (Ultramark microplate Imaging System Board). La viabilidad
fue expresa en densidad óptica (DO) de los cristales de formazan producidos por
54
las células. Todos los ensayos se hicieron por triplicado y cada lectura fue
realizada cuatro veces.
1100..77..22.. AAzzuull ddee TTrriippaann
La visualización y conteo de las células que excluyen el azul de Tripan (4%, p/v)
se llevo a cabo con una relación 1:1 y en una cámara de Neubauer, para ello,
se utilizó un microscopio de luz invertido marca Nikon E59. El porcentaje (%) de
células viables se determinó así:
Con esta técnica se evaluó la integridad de la membrana de las CMNSP
estimulada con PHA-P, tratadas con PEG, sembrada o no sobre matriz ósea, de
las CMNSP recién aisladas por Ficoll y las CMNSP del grupo control (sin PEG).
1100..77..33.. FFrraaggmmeennttaacciióónn nnuucclleeaarr..
Para determinar la morfología nuclear, las CMNSP sembradas sobre láminas de
hueso cortical bovino se fijaron con una solución de 4% de paraformaldehido y
0.2% de glutaraldehido, luego se les adicionó 1µg/ml (p/v) de DAPI 33, por 5
minutos a temperatura ambiente. Para retirar el colorante no unido, las láminas
de hueso y láminas de vidrio se lavaron suavemente durante un minuto por ocho
veces con la solución de PBS que contenía 50mM de NH4Cl. El análisis de los
núcleos normales, fragmentados y/o condensados, se evaluó con un
microscopio Nikon Eclipse E51i.
Este reactivo también se utilizó para identificar los núcleos de las células
incubadas con anticuerpos contra marcadores de membrana, como se describirá
más adelante.
55
1100..88.. IIddeennttiiffiiccaacciióónn ddeell ffeennoottiippoo ppoolliiccaarriióónn,, mmaarrccaaddoorreess
oosstteeooccllaassttooggéénniiccooss,, pprrootteeiinnaass cciinnaassaass cc--SSrrcc,, SSyykk yy eell aarrrreegglloo ddee aaccttiinnaa eenn
CCMMNNSSPP ttrraattaaddaass ccoonn PPEEGG..
1100..88..11.. TTiinncciióónn ccoonn HHooeecchhsstt
Para identificar el fenotipo policarión se utilizó Hoechst 3334233 (Sigma). Las
CMNSP sembradas sobre lámina de vidrio y hueso cortical bovino e incubadas
por 48 h se trataron con una solución al 3% de paraformaldehido por 20 minutos
a 37 °C, luego, se hicieron cinco lavados posteriores usando una solución de
PBS que contenía 50mM de NH4Cl; finalmente se adicionó 5 μg/ml (v/v) de
Hoechst 33342 33 y se incubaron por 15 minutos a 37 °C en cámara húmeda.
Para retirar el colorante no unido, las láminas de hueso y láminas de vidrio se
lavaron suavemente ocho veces, por un minuto cada vez, con la solución de
PBS que contenía 50mM de NH4Cl. La tinción con Hoechst se evaluó con un
microscopio Nikon Eclipse E51i.
1100..88..22.. IInnmmuunnoofflluuoorreesscceenncciiaa ddiirreeccttaa ee iinnddiirreeccttaa..
Para determinar si las CMNSP tratadas con PEG expresaban la glicoproteína
aminopeptidasa CD13 133, 212 se hizo una inmunofluorescencia directa,
siguiendo el método modificado de Nesbitt y Horton (2003). Las células tratadas
con PEG sembradas en hueso cortical bovino por 1, 7 ó 14 días se fijaron a 4 °C
durante 30 minutos con una solución modificada de Luxenburg (2006), la cual
contenía paraformaldehido al 4% y 0.2% de glutaraldehido. Luego, se lavaron
cuatro veces a 4 °C por cuatro horas bajo agitación, con una solución
amortiguadora de fosfatos, pH 7.2, con 0.05% de azida de sodio y 50 mM de
NH4Cl 8, 61. Posteriormente, se permeabilizaron a 4 °C por 30 minutos con una
solución de 80 mM Buffer HEPES, pH 7.2, 300 mM de sacarosa, 50 mM de
NaCl, 5 mM de MgCl .6H2O y 0.1% de Tritón-X 100. Luego, estas células se
bloquearon a 4 ° C durante toda la noche con 8% de albúmina de suero bovino
(BSA), en PBS con 0.05% de azida de sodio y 50 mM de NH4Cl. Finalmente, se
56
incubaron a 4 °C por 40 minutos con un anticuerpo anti-CD13 conjugado con
FITC (Tabla 3). Los lavados se realizaron bajo agitación en cinco ocasiones con
una solución fría de PBS con 0.05% de azida de sodio y 50 mM de NH4Cl. Estos
ensayos se realizaron por duplicado.
Para determinar en las CMNSP tratadas con PEG, la expresión de los
marcadores osteoclastogénicos: anhidrasa carbónica II (CA II), la subunidad C1
de la ATPasa Vacuolar H+ VI (ATPC1), catepsina K (CK), receptor de calcitonina
(RC), la subunidad β3 de la integrina αvβ3 (IB3) y el receptor RANK (R), se
realizó una inmunofluorescencia indirecta33 siguiendo el método modificado de
Mika (2003).
En este caso, las CMNSP estimuladas por 72 h con PHA-P y tratadas con PEG
se sembraron en matriz ósea y se incubaron durante 1, 7 ó 14 días. Al final de
estos tiempos de incubación, las células se fijaron a 4 °C por 30 minutos con
paraformaldehido al 4% y 0.2% de glutaraldehido y se permeabilizaron con una
solución de 0.1% de saponina, 80 mM Buffer HEPES, 50 mM de NH4Cl 8,61.
Luego, se incubaron a 37 ° C por 40 minutos con los anticuerpos señalados en
la Tabla 3. Se lavaron cinco veces con PBS que contenía 0.05% de azida y 50
mM de NH4Cl. Se incubaron a 4 °C durante 60 minutos con los anticuerpos
secundarios policlonales señalados en la Tabla 3. El grupo control (CMNSP sin
PEG) se incubó con los mismos anticuerpos. Estos ensayos se realizaron por
cuadruplicado.
Para evaluar la localización celular de las cinasas c-Src y Syk se realizó una
inmunofluorescencia indirecta siguiendo el método modificado de Nesbitt y
Horton (2003): las CMNSP tratadas con PEG sembradas en láminas de hueso e
incubadas durante 1, 7 ó 14 días se fijaron con paraformaldehido al 4% y se
permeabilizaron con 0.1% de saponina en 80 mM Buffer HEPES, 50 mM de
NH4Cl 8,61, luego, se bloquearon a 4 °C por 60 minutos con BSA al 3%.
Después, se incubaron a 37 ºC por 40 minutos con un anti- c-Src (Tabla 3). Para
disminuir el ruido de fondo fue necesario bloquear nuevamente a 37 °C por 60
minutos con BSA al 1%. Posteriormente, se adicionó el anticuerpo secundario
conjugado con FITC (Tabla 3) y se incubó a 4 ° C por 40 min. De nuevo, se
57
bloquearon a 4°C durante toda la noche con BSA al 1%, luego, se adicionó el
anticuerpo anti-Syk (Tabla 3), el cual se incubó a 37 ° C durante 60 min.
Finalmente, se lavaron y se incubaron a 4 °C por 40 minutos con el anticuerpo
secundario conjugado con “rhodamine” (Tabla 3). Cada ensayo se realizó por
duplicado.
Para evaluar la distribución de actina en las CMNSP, se siguió el procedimiento
descrito por Destaing (2001), con las siguientes algunas modificaciones. Las
CMNSP fueron lavadas dos veces a 37 °C con medio DMEM33, se
permeabilizaron a 4 °C durante 30 minutos con una solución de 0.1% de
saponina en 80 mM Buffer HEPES, 300 mM de sacarosa, 50 mM de NaCl, 5 mM
de MgCl .6H2O 33 y se bloquearon a 4° C durante toda la noche con 8% de
BSA. Luego, se incubaron a 37 °C por 40 minutos con un anticuerpo contra-
actina100 (Tabla 3). Después, se bloquearon con 8% de BSA, durante 60
minutos. Posteriormente, se realizó una incubación a 4 °C por 40 minutos con un
anticuerpo secundario conjugado con FITC ó conjugado con “rhodamine”32
(Tabla 3). Los ensayos fueron llevados a cabo por cuadruplicado.
La fluorescencia se evaluó con un microscopio Nikon Eclipse 50i, equipado con
un software de fotografía de detección de fluorescencia ACT-U2 (Nikon
corporation). Para cada anticuerpo primario usado en el método de
inmunofluorescencia, se llevó a cabo controles de isotipo señalados en la Tabla
4.
1100..88..33.. EElleeccttrrooffoorreessiiss SSDDSS--PPAAGGEE ee iinnmmuunnoobblloott..
La expresión de c-Src y Syk se realizó por inmunoblot, para lo cual se siguió la
metodología descrita por Decker (2002), con algunas modificaciones. Las
CMNSP tratadas con PEG, sembradas en matriz ósea e incubadas por 1, 7 y 14
días se lavaron con 100 mM PBS frío; luego se sumergieron en 400 µl del buffer
de lisis HNTG (Hepes 50 mM, pH 7.4, NaCl 150mM, EDTA 1mM, NaF 10 mM,
MgCl2 6 H2O 1.5mM, pirofosfato de sodio 10 mM, glicerol 10%, Tritón x-100 al
1%, sarcosil al 0.1%, ortovanadato de sodio 0.2mM y PMSF 2mM).
58
Tabla 3: Anticuerpo utilizados en el ensayo de fluorescencia.
Origen Tipo Concentración
(µg/ml) Antígeno que
reconoce Fluorógeno conjugado
Casa comercial
Ratón IgG1 0.2 Células mielomonocito/ Dendríticas CD13
Fluoresceína isotiocianato
(FITC)
Santa Cruz
Ratón IgG1 0.5 Dominio SH2-1 y SH2-2 de Syk
-- AbD Serotec
Ratón IgG1 1:250
(líquido ascítico) Actina --
Donado Lab.
Dr Carlos Arias (UNAM,
México)
Conejo IgG 0.2
Residuos de aminoácidos 191 a 260 de la anhidrasa carbónica II.
-- Santa Cruz
Conejo IgG 0.2 Sub unidad C1 de la ATPasa vacuolar
-- Santa Cruz
Conejo IgG 0.2 Residuos de aminoácidos 191 a 240 de la catepsina K.
-- Santa Cruz
Conejo IgG 0.2 Carboxi terminal del receptor de Calcitonina.
-- Santa Cruz
Conejo IgG 1 Dominio SH3 de c-Src
-- eBioscience
Cabra IgG 0.2 Sub-unidad Integrina 3
-- Santa Cruz
Cabra IgG 0.02 Dominio extracelular del receptor rhRANK derivado de NSO
-- BD
Biosciences
Asno IgG 0.25 anti- ratón FITC Santa cruz
Asno IgG 0.5 anti- ratón “rhodamine” Santa cruz
Asno IgG 0.25 Anti-conejo FITC Santa cruz
Asno IgG 0.25 anti- cabra FITC Santa cruz
59
Estas láminas permanecieron a 4 °C por 8 h bajo agitación continua y se
recolectó el lisado celular de cada lámina de hueso.
Luego, se realizó una sonicación a 10 amplitudes durante 1 minuto en un equipo
Branson Digital Sonifier (Biosystem). El sobrenadante se clarificó por
centrifugación a 12000 rpm a 4 °C durante 10 minutos.
La cuantificación de la proteína total en cada lisado celular se realizó a λ 280 nm,
en un equipo NanoDrop (Thermo Scientific 2000c), utilizando un patrón estándar
de 2mg/ml de BSA. 30 µg/ml de proteína total de cada lisado se mezcló con
buffer Leammli, luego fueron hervidas por 5 minutos; esta concentración de
proteína total fue cargada por bolsillo en un SDS/PAGE al 12%.
Tabla 4: Controles isotipo
Antígeno que reconoce
Tipo Concentración
(µg/ml)
Control isotipo para los anticuerpos
Casa comercial
Monoclonal contra neurofilamentos
200k Ab-1
IgG1
0.2
Monoclonal anti-actina,
anti- Syk y anti- CD13
Oncogene Science
Suero de cabra
IgG
1
Policlonal generado
en cabra anti-IB3 y
anti-RANK
Generado en nuestro lab
Inmonoglobulinas de conejo
IgG
0.4
Policlonal generado en conejo anti-CAII, anti-ATPC1, anti-CK, anti-RC y anti-c-Src
DAKOPATTS
La electroforesis se realizó con un voltaje constante a 20 mA, después se
transfirió a una membrana de PVF, a 32 mA corriente constante por 2 horas,
usando buffer de transferencia CAPS 100mM y metanol al 10%.
La transferencia se constató con rojo Ponceau, luego, cada membrana se lavó
cinco veces con PBS y se bloqueó a 37 °C por una hora con 2 % de leche
60
descremada/TBS34 (50mM Tris HCl, pH 7.5, 150mM de NaCl). Una membrana
se incubó a 4 °C por toda la noche, con 0.8 μg/ml de un anticuerpo policlonal
generado en conejo IgG anti- c-Src. Luego de tres lavados con PBS y una vez
con PBS-Tween 20 (0.05%) se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora
con 0.2 μg/ml del anticuerpo generado en asno anti-conejo IgG conjugado con
biotina y se lavó con PBS. De nuevo, se incubó por 30 minutos con 1µg/ml de
estreptavidina acoplada a peroxidasa (Vector Labs) junto con 2 μg/ml del
anticuerpo generado en asno contra conejo IgG conjugado a HRP.
Los revelados se realizaron por quimioluminiscencia (ECL)36 y posteriormente
con solución amino-etil-carbazol 50mM en buffer acetato de sodio pH 5.0 y
0.04% de H2O21.
Una vez la membrana se revelo y fotografió, se le retiraron los anticuerpos, para
ello, la membrana se sumergió en un buffer que contenía 2% de SDS, 62,5 mM
de Tris-HCl pH 6.8, 100mM de β-mercaptoetanol, por 60 minutos a 55 °C, bajo
agitación continua. Después, de lavar la membrana cinco veces con PBS-Tween
20 al 0.05%, por 25 minutos se procedió a bloquear con 2% de leche
descremada/TBS por 1 h a 37 °C. Esta membrana se incubó a 4 °C con 0.025
μg/ml de un anticuerpo primario monoclonal de ratón IgG1 anti-Syk, toda la
noche y se lavó con PBS-Tween 20. Después, la membrana se incubó a
temperatura ambiente por 120 minutos con 0.2 μg/ml de un anticuerpo anti-
ratón IgG conjugado a HRP. Por último, la membrana se lavo cuatro veces con
PBS pH 7.2 y una vez con PBS-Tween 20, cada lavado se realizó durante 25
minutos. El revelado se hizó primero por ECL y después con la solución amino-
etil-carbazol 50mM.
Como control de la expresión de estas proteínas se usaron los lisados de: las
CMNSP no cultivadas, las CMNSP adheridas a plástico estimuladas con PHA
por 72 horas, las CMNSP en suspensión estimuladas con PHA por 72 horas, las
CMNSP no estimuladas con PHA por 72 horas, las CMNSP estimuladas con
PHA tratadas con PEG pero no sembradas en matriz ósea y las CMNSP
estimuladas con PHA sin PEG. Cada ensayo se realizó por duplicado.
61
1100..88..44.. CCoo--iinnmmuunnoopprreecciippiittaacciióónn
La posible asociación de las proteínas cinasas c-Src y Syk en CMNSP tratadas
con PEG y sembradas en matriz ósea se evaluó por co-Inmunoprecipitación (co-
IP) utilizando los lisados celulares obtenidos con el buffer HNTG, como ya
describió anteriormente; para ello, se tomaron 500 μg/ml de proteína, de cada
tiempo de adherencia a hueso. Estos lisados se incubaron a 4 °C durante toda
la noche bajo agitación continua con 5 μg/ml de un anticuerpo generado en
conejo anti c-Src o el anticuerpo monoclonal IgG1 anti Syk. Luego, a esta
mezcla de proteína con anticuerpo se le adicionó la proteína A/G agarosa, se
incubaron a temperatura ambiente por 40 minutos, bajo agitación. Las proteínas
inmunoprecipitadas (IP) se lavaron tres veces con PBS y dos veces con el
buffer de lisis, centrifugándolas en cada lavado a 2100 rpm por 10 minutos.
A las proteínas IP se les adicionó buffer Leammli y se hirvieron durante 5
minutos. Las proteínas se separaron en geles de SDS-PAGE al 12% 37
adicionando 50 µg/ml por bolsillo. El gel fue transferido a una membrana PVF,
como se describió arriba. La membrana se incubó a 37 °C por 1 h con 0.025
μg/ml del anticuerpo monoclonal anti-Syk o con el anticuerpo generado en
conejo anti- c-Src. Luego, se lavó con PBS y PBS-Tween 20 al 0.05% y se
incubó con un anticuerpo secundario anti-ratón IgG conjugado con HRP o anti-
conejo IgG conjugado a HRP. El revelado se hizo por ECL y con la solución de
amino-etil-carbazol descrita arriba1
Para evaluar la fosforilación de las cinasas Src y Syk se retiraron de las
membranas los anticuerpos con una solución buffer de 2% SDS, 62,5 mM de
Tris-HCl pH 6.8 y 100mM de β-mercaptoetanol, luego, se lavaron cinco veces
con PBS-Tween 20 al 0.05% y se incubaron a 37°C por 40 minutos con 0.2
μg/ml del anticuerpo monoclonal anti fosfo-tirosina (PY20). Las bandas se
revelaron con la solución de amino-etil-carbazol, antes mencionada.
62
1100..88..55.. CCiittooqquuíímmiiccaa
Este procedimiento fue realizado según la metodología descrita por Murillo, A,
2005. Las CMNSP fueron fijadas con 4% de paraformaldehido y 0,02% de
glutaraldehido, permeabilizadas con 0.1% de saponina, se incubaron con una
solución compuesta por: buffer veronal que contenía barbitona de sodio (ácido
barbitúrico al 0.53% y 1.1% de NaOH) y 3.84% de acetato de sodio. A este
buffer veronal se le adicionó 2,8 mg/ ml de tartrato de sodio-potasio, luego, se
agregó una solución formada por 4% de pararrosanilina hexasotizada y 4% de
nitrito de sodio. Después, se adicionó 0.0126% de naftol fosfato MX-ASB1
(Sigma-Aldrich), usado como sustrato de la enzima TRAP. A esta solución se le
ajustó el pH a 4.3 +/- 0.2. Cada lámina fue incubada con 300 µl de esta solución
a 37 ° C durante 2 h. Después, se realizó una contra-coloración por 30 segundos
con 20 µl de hematoxilina según Mayer, el colorante no unido se lavó por 7
minutos bajo agitación con una solución de alcohol-ácido, que contenía etanol,
agua destilada y ácido acético glacial en una relación 70: 29: 1 (v:v) y finalmente
se hizo un solo lavado con agua destilada. Estas láminas se dejaron secar a
temperatura ambiente.
La evaluación de las células multinucleares TRAP positivas fue realizada
siguiendo un muestreo aleatorio en forma de W, evaluando siete campos
representativos de toda la lámina. Para esto se fotografiaron los campos con una
cámara Nikon DXM1200 adaptada a un microscopio Nikon Eclipse E600 de
Nikon.
El número de células multinucleares con actividad de la enzima fosfatasa ácido
resistente a tartrato (TRAP +) se calculo así:
En donde:
El número de células totales es igual al número de células mononucleares, más
el número de células multinucleares TRAP (positivas o negativas).
63
1100..99.. EEvvaalluuaacciioonn ddee llaa mmoorrffoollooggííaa cceelluullaarr yy llaagguunnaass ddee rreessoorrcciióónn..
Mediante la microscopia electrónica de barrido o escaneo (SEM) se determinó si
las CMNSP tratadas con PEG sembradas en matriz ósea presentan algunas
características de las células similares a osteoclastos como es el borde en
cepillo “ruffle”, filipodios y forman lagunas de resorción.
El procedimiento seguido fue una modificación, del descrito por Tehrani y
colaboradores (2006). Las CMNSP sembradas en láminas de hueso cortical
bovino e incubadas por 1, 7 ó 14 días, se lavaron con buffer fosfato 100mM pH
7.2 y se fijaron durante 3 horas a temperatura ambiente con una solución de
PBS 8.9 mM, pH 7,2, 2,5 mM MgCl2. 6H2O y 2,5% de glutaraldehido.
Posteriormente, se lavaron con buffer fosfato 100mM pH 7,2 y se trataron con
1% de tetraóxido de osmio (OsO4, Sigma Aldrich) a temperatura ambiente por
1h. Luego, se sumergieron dos veces en agua destilada durante 10 minutos y se
deshidrataron a temperatura ambiente con una serie de concentraciones de la
solución de etil-alcohol (25, 50, 70, 80 y 100%), cada concentración fue
adicionada cada 10 minutos. Las láminas se secaron al vacío por 8 horas y se
colocaron sobre grafito. Finalmente se cubrieron con 30 nm de oro coloidal. Las
láminas fueron observadas en un microscopio Fei modelo Quanta 200, alto
vacio, con magnificaciones de 500, 1000, 5000, 4000, 20000 y 30000X.
1100..1100.. AAccttiivviiddaadd rreessoorrttiivvaa eenn CCMMNNSSPP ttrraattaaddaass ccoonn PPEEGG..
Para evaluar la actividad resortiva se hizo una cuantificación de las áreas de
resorción en las láminas de hueso cortical bovino, de cada uno de los
procedimientos efectuados en este proyecto, siguiendo la metodología descrita
por Miyasaka y colaboradores (2006), con las siguientes modificaciones:
Después de la evaluación del número de células multinucleares con actividad
TRAP, las células fueron lisadas con una solución de NaOCl al 6% y 5.2% de
NaCl 39, bajo agitación continua por 15 minutos. Las láminas se lavaron cinco
veces con agua destilada, bajo agitación. Luego, estas láminas fueron
coloreadas con azul de Commassie por 5 minutos y dos veces enjuagadas por 1
minuto con una solución de metanol, ácido acético y agua, en una relación de
64
50:5:45 (v/v). Finalmente, las láminas fueron sumergidas por 20 segundos en
agua destilada, bajo agitación.
Las áreas de resorción fueron determinadas en un microscopio eclipse E600 de
Nikon con una cámara Nikon DXM1200, fotografiándose siete campos
representativos de toda la lámina, siguiendo un muestreo aleatorio en forma de
W, finalmente se visualizaron estos campos fotografiados en un software ACT-1
para DXM 1200 y DXM 1200F de Nikon.
Con el objeto de analizar las áreas “deprimidas” o con deformaciones,
depresiones o áreas que pudieran ser similares a las áreas de resorción,
obtenidas con las CMNSP se utilizaron dos controles de superficie ósea: láminas
de hueso tratadas con la solución de NaOCl y las láminas de hueso sin tratar
con esta solución. Ninguno de estos dos controles fueron incubados con
CMNSP.
La actividad resortiva fue dada en porcentaje (%) del área de resorción así:
Primero, se cuantificaron las “áreas semejantes a resorción” en las láminas
control. Segundo, para determinar el área de resorción real se restó el área de
resorción formada por las CMNSP con el “área semejante a resorción” de las
láminas control. El valor encontrado se dividió por el área total evaluada, es
decir el área de los siete campos de muestreo (sin y con resorción). Lo anterior
corresponde a la siguiente ecuación:
En donde:
A = área de resorción en mm2 hallada en las láminas sembradas con CMNSP
B = “área semejante a resorción” en mm2 cuantificada en las láminas control
C = área total evaluada en mm2 (con y sin resorción)
65
1111.. AAnnáálliissiiss eessttaaddííssttiiccoo
Los análisis estadísticos de los resultados se realizaron por la comparación de
las medias y sus errores estándar (ES). Además se hizo un análisis de ANOVA
univariante, cuando fue pertinente se realizó una prueba de Tukey y una de
Games Howell, utilizando el paquete estadístico SPSS 17, como se muestra en
el anexo 2. La diferencia estadísticamente significativa se consideró con un p
valor 0.05.
Las micrografías de inmunofluorescencia, de las células mono y multinucleares
TRAP (positivas o negativas), de la microscopia electrónica de barrido y las
usadas para la determinación de las áreas de resorción (en cm), se procesaron
digitalmente en el software ImageJ 1.4 del “National Institute of Health” de
EE.UU, enlace: URL: http://rsbweb.nih.gov.
66
1122.. RREESSUULLTTAADDOOSS
1122..11.. DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddee mmaarrccaaddoorreess ppoobbllaacciioonnaalleess eenn CCMMNNSSPP..
Para determinar el porcentaje de linfocitos T, células monocito/macrófago y
células mielomonocito/dendrítica se utilizaron anticuerpos contra marcadores
específicos de CD4, CD8, CD14 y CD13 respectivamente. La presencia del
antígeno de superficie se evaluó mediante FACS. En los cultivos estimulados
con 30 μg/ml PHA-P se encontró que el 44.96% correspondían a los linfocitos T
CD4+, 6.4% eran monocitos CD14+ y 5.17% eran mielomonocito/dendríticas
CD13+ (Figura 4A). En el cultivo control, el 0.49% correspondían a monocitos
CD14+ y 2.10 % eran células mielomonocito/dendríticas CD13+ (Figura 4A)
mientras, que la población de linfocitos T CD4+ se mostró con un porcentaje
similar al encontrado en las CMNSP estimuladas con PHA-P. Sin embargo, en
las CMNSP estimuladas con PHA-P y en el control no se presentaron linfocitos
T CD8+ (Figura 4A).
Cuando se evaluó la doble expresión de los antígenos de superficie celular CD4
y CD13 o CD4 y CD8, se encontró que 1.46% eran células CD4+CD13+ (Figura
4B) y 39.35% eran linfocitos T CD4+CD8- (Figura 4B). Estos porcentajes fueron
similares en las CMNSP control (Figura 4B). Los anteriores porcentajes
poblacionales fueron similares a los encontrados en los cultivos de CMNSP
estimulados con diferentes concentraciones de PHA-P (5, 10, 20, datos no
mostrados).
1122..22.. DDeetteerrmmiinnaacciióónn ddeell nnúúmmeerroo ddee CCMMNNSSPP eessttiimmuullaaddaass ccoonn PPHHAA--PP dduurraannttee
ddiiffeerreenntteess ttiieemmppooss
Para explorar si se obtiene un número diferente de CMNSP cuando se realiza la
estimulación en diferentes tiempos y concentraciones de PHA, se tomaron
102.600 CMNSP/ml y se estimularon de manera independiente con 5, 10, 20 ó
30 μg/ml de PHA-P, luego, cada grupo se incubó por 24, 48 ó 72 horas (Figura
4C). El número de CMNSP/ml obtenido se muestra en la Tabla 5.
67
Figura 4. Marcadores poblacionales en las CMNSP estimuladas con
fitohemaglutinina (PHA). Las CMNSP recién extraídas con Ficoll fueron
estimuladas con 30 μg/ml de PHA-P, durante 24, 48 y 72 hs de cultivo. Luego,
40 x 40 x
A
B C
D
Morfología de las CMNSP in vitro estimuladas con PHA
a b
68
_______________________________________________
Figura 4. Continuación....
por FACS se determinaron los antígenos de superficie para linfocitos T CD4,
CD8, mielomonocito/dendríticas CD13 y monocitos CD14. Los ensayos se
realizaron con 30 x 105 CMNSP/ml estimuladas con PHA-P y con los anticuerpos
monoclonales conjugados con los fluorógenos: CD4-PE, CD8-PerCP, CD13-
FITC y CD14-PE. El número de células y el porcentaje de células viables
después de la estimulación con PHA-P se determinó con azul de Tripan (1:1,
v/v). Como control se utilizaron las CMNSP no estimuladas con PHA-P. (A)
porcentajes poblaciones de linfocitos T CD4+ y CD8-, mielomonocito/dendríticas
CD13+ y monocitos CD14+. (B) poblaciones celulares con doble marcaje
CD4+CD8- o CD4+ CD13+. (C) número de CMNSP estimuladas con PHA durante
24, 48 y 72 hs. (D, a y b) morfología de las CMNSP con PHA durante 48 hs.
Aumento de 40x.
El número de células obtenido para cada uno de los tiempos de estimulación con
PHA presentó una diferencia estadísticamente significativa, cuando se
compararon con los respectivos tiempos en el cultivo control (prueba de Tukey, p
= 0.015, siguiendo los pasos que se muestran en el anexo 1).
Tabla 5. Número de CMNSP obtenidas después de diferentes tiempos de estimulación.
Tiempo (hs) de estimulo con PHA-P CMNSP/ml con 30 μg/ml CMNSP
control
24 6 x 105 1.2 x 105
48 23 x 105 15 x 105
72 32 x 105 23 x 105
También, se encontraron diferencias estadísticas entre los tres tiempos de
estimulación con PHA (prueba de Tukey, p = 0.01 y prueba de Games Howell, p
69
= 0.05). Mientras, que entre los diferentes días de incubación del cultivo control,
no se observó esta diferencia significativa (prueba de Tukey, p = 1.0).
Lo anterior indica que existe un aumento en el número de CMNSP en el tiempo
y se obtiene un mayor número de células cuando se estimulan con PHA-P
(Figura 4C).
Al estimular las CMNSP con diferentes concentraciones de PHA-P (5, 10, 20 ó
30 μg/ml) no se presentaron diferencias significativas entre si (ANOVA, p=
0.168) o cuando se compararon con el número de CMNSP del cultivo control
(dato no mostrado); sugiriendo que las concentraciones de PHA-P no son
importantes en la proliferación de CMNSP. Sin embargo, preferimos utilizar el
cultivo estimulado por 72 horas con 30 μg/ml de PHA-P.
Respecto, a la morfología celular, en el cultivo control las células permanecieron
individuales, tanto en suspensión como adheridas, sin la formación de rosetas
celulares. En cambio, las estimuladas formaron rosetas y se ubicaban sobre las
células adheridas al plástico, cuando se analizaron a las 48 horas de incubación
(Figura 4D, a y b).
1122..33.. VViiaabbiilliiddaadd ddee llaass CCMMNNSSPP
Se evaluó la viabilidad de CMNSP incubadas durante periodos cortos (24, 48 y
72 hs) y por periodos largos (1, 7 o 14 días).
La viabilidad evaluada con azul de Tripan para las CMNSP estimuladas con PHA
por un periodo corto fue del 93% y para el control fue de 97% (Figura 5A). No se
presentó una diferencia significativa, entre los tiempos cortos de las CMNSP
estimuladas con PHA-P, ni entre los tiempos del cultivo control (p = 0.986, p =
0.890, respectivamente) sugiriendo, que el tiempo de cultivo no afecta la
viabilidad.
Al analizar con azul de Tripan, el efecto del tratamiento con PEG en la viabilidad
de las CMNSP estimuladas con PHA-P sin cultivar, no se encontró una
diferencia significativa comparada con los controles (CMNSP recién extraídas
70
con Ficoll o CMNSP estimuladas con 30 μg/ml de PHA-P sin tratamiento con
PEG, Figura 5B), indicando que el tratamiento con PEG o la separación por
Ficoll no afectan la viabilidad celular (prueba de Tukey, valor de p = 0.130).
Cuando se evaluó con MTT la viabilidad de las CMNSP estimuladas con PHA y
tratadas con PEG sin sembrar en hueso, se encontró que estas CMNSP tratadas
con PEG presentaron una DO de 0.128, mientras que las CMNSP estimuladas
con PHA sin PEG (grupo control) tuvieron una DO de 0.126 (Figura 5C);
además, no se encontró una diferencia significativa entre estos dos cultivos
(prueba de Tukey, valor de p = 0.653), sugiriendo que el PEG no afecta la
viabilidad celular. Los DO que se muestran resultan de restar al grupo
experimental (células tratadas con PEG) las absorbancias de los controles.
Al examinar con MTT la viabilidad de las CMNSP estimuladas con PHA y
tratadas con PEG cultivadas sobre hueso durante periodos largos, se encontró
que las CMNSP presentaron DO de 0.276, 0.245, 0.1965, 0.1211, para 0, 1, 7 y
14 días, respectivamente (Figura 5D). Sin embargo, no se presentaron
diferencias significativas cuando se compararon las CMNSP de 0, 1 y 7 días
adheridas a hueso (prueba de Tukey, p= 0.99), pero, si se encontraron
diferencias significativas cuando se comparan estos tiempos con el día 14
(prueba de Tukey, p= 0.004, 0.006 y 0.008, respectivamente) sugiriendo que la
viabilidad decae después de siete días en las CMNSP estimuladas con PHA y
tratadas con PEG. Para el grupo control (CMNSP estimuladas con PHA y sin
PEG) la DO fue de0.25, 0.25, 0.21 y 0.1036, respectivamente (Figura 5D), sin
presentarse diferencias significativas entre ellas (prueba de Tukey, p = 0.397).
Al comparar los valores de OD en CMNSP tratadas con PEG desprendidas de
hueso (0.337, 0.1795, 0.1605, 0.1075 para 0, 1, 7 y 14 días respectivamente,
Figura 5D) y con el grupo control (CMNSP desprendidas sin PEG con DO de
0.32, 0.1765, 0.19 y 0.1645, Figura 5D) no se presentaron diferencias
significativas (prueba de Tukey, p= 0.353); sugiriendo que el PEG no altera la
viabilidad de las CMNSP no adheridas o adheridas.
Dado que los valores obtenidos en el tiempo cero entre CMNSP tratadas con
PEG adheridas (DO de 0.276) es menor respecto a las CMNSP desprendidas
71
con PEG (DO de 0.337), se sugiere que las 2 horas de incubación con el
hueso(tiempo cero), no son suficientes para obtener un buen número de células
adheridas (Figura 5D). Al hacer la misma comparación entre los demás valores,
la relación es inversa, esto sugiere que la viabilidad esta relacionada con la
adherencia.
Al examinar la fragmentación nuclear de CMNSP cultivadas durante 24 horas, se
observó que un 12% de las CMNSP tratadas con PEG presentaron
fragmentación nuclear cuando se sembraron en vidrio y del 20% en hueso,
mientras que los grupos control presentaron un 5% de fragmentación nuclear.
Esto sugiere que la fusión celular con PEG está relacionada con
aproximadamente con un 15% de apoptosis (núcleos fragmentados) en las
CMNSP tratadas con PEG sembradas en hueso.
Mientras que la fragmentación nuclear en las CMNSP tratadas con PEG y
sembradas sobre hueso durante 0, 1, 7 ó 14 días, mostró un aumento en el día
7 y 14, respecto al primer día de incubación (Figura 5F), sugiriendo que el
número de células que entran en apoptosis aumenta con los días de cultivo. Los
controles no presentaron fragmentación nuclear (Figura 5F).
72
Figura 5. Viabilidad de las CMNSP. CMNSP separadas por Ficoll se
estimularon con PHA por 24, 48 ó 72 hs. Luego, 8 x 105 CMNSP/ml fueron trata-
A B C
F
D E
73
_______________________________________________________
Figura 5. Continuación…
das con PEG no se sembraron en hueso; otras si se sembraron sobre hueso por
1, 7 ó 14 días. La evaluación de la viabilidad se realizó con azul de Tripan (1:1
v/v), MTT (2mg/ml) o DAPI (1µg/ml) en cada uno de los ensayos; Para DAPI, se
fijaron con paraformaldehido (4%) y glutaraldehido (0.2%), se permeabilizaron
con saponina (0.1 %) y se colorearon. Para MTT, a 150 µl del medio de cultivo
se adicionó 150 µl de MTT, se incubó por 2 hs a 37 °C; los cristales formados se
leyeron a 550 nm. Como control negativo y absorbancia de referencia se
utilizaron las células lisadas de hueso con 1% Triton X-100, 0.029% de EDTA y
el medio de cultivo con MTT, respectivamente. (A) CMNSP viables después del
estímulo con PHA-P. (B) viabilidad de las CMNSP no cultivadas, de las células
estimuladas con PHA-P tratadas con PEG y de las CMNSP sin PEG (control) no
sembradas. (C) DO de los cristales de formazan obtenidos por las CMNSP
estimuladas con PHA-P tratadas con PEG y su control, no sembradas. (D) DO
de los cristales de formazan obtenidos por las CMNSP tratadas con PEG en
hueso, con sus respectivas diferencias estadísticas significativas y (E) por las
CMNSP desprendidas de hueso. Los resultados son la media +/- error (ES) de
tres experimentos, valor de p 0.05. (F) Núcleos fragmentados de las CMNSP
con PEG y su control.
1122..44.. CCoorrrreellaacciióónn eennttrree eell nnúúmmeerroo ddee ccMMNNSSPP yy eell vvoolluummeenn ddee
ppoolliieettiilleenngglliiccooll ccoonn llaa aaccttiivviiddaadd rreessoorrttiivvaa yy eell ffeennoottiippoo ppoolliiccaarriioonn..
Para determinar si hay diferencias en la actividad resortiva de CMNSP tratadas
con diferentes volúmenes de PEG, se hicieron ocho grupos experimentales,
como se muestra en la Tabla 6.
La actividad resortiva en estos grupos experimentales fue evaluada después de
retirar las células y colorear las láminas de hueso con Coommassie39. Entre los
diferentes grupos de CMNSP con PEG frente a sus respectivos grupos control
74
se encontraron diferencias estadísticamente significativas (ANOVA y prueba de
Tukey, p = 0.01).
El mayor porcentaje de área de resorción fue del 28% para el grupo de 8 x 105
CMNSP/ml; mientras que su grupo control (con el mismo número de células)
tuvo un 12% (Figura 6A). Este mismo grupo, presentó una diferencia significativa
con los grupos de menos de 7 x 105 CMNSP/ml (prueba de Tukey, p = 0.017).
Tabla 6. Correlación entre el número de CMNSP y volumen de PEG para inducir
la fusión.
Número
CMNSP/ml 3.2 x105 4 x105 5 x105 6 x105 7 x105 8 x105 9
x105 10 x105
PEG 1450 (µl)
10 15 20 25 35 50 50 50
No se presentaron diferencias entre los grupos experimentales con
concentraciones celulares de 8 x 105, 9 x 105 y 10 x 105 CMNSP/ml (prueba de
Tukey, p = 0.55, 0.188 y 0.966, respectivamente).
Al comparar los resultados entre los grupos menores a 8 x 105 CMNSP/ml, no se
encontró una diferencia significativa (prueba de Tukey, p = 0.244). Cuando se
compararon los resultados obtenidos entre los grupos control con más de 8 x 105
CMNSP/ml y los grupos con menos de 7 x 105 CMNSP/ml respecto a su
actividad resortiva presentaron una diferencia significativa (valor de p = 0.02)
entre el 5 y 10% (Figura 6A).
Esto sugiere que las CMNSP no tratadas con PEG, cuando se concentran en un
número crítico (8 x 105 CMNSP/ml) pueden tener actividad resortiva; aunque,
estas células sin PEG no presentan una actividad resortiva tan alta como la
realizada por las CMNSP tratadas con PEG. Además, esta actividad resortiva
tanto para las células tratadas o no con PEG estaría influenciada por el número
de CMNSP adheridas o que permanecen en el hueso.
75
Al evaluar con Hoechst 3334233, el número de policariones obtenidos por los
diferentes grupos de CMNSP tratados con diversos volúmenes de PEG, se
observó que los grupos experimentales con más de 8 x 105 CMNSP/ml
presentaron 740 multinucleares por mm2, cuando se sembraron sobre vidrio y de
800 sobre hueso (Figura 6B y C, respectivamente). Los grupos control
presentaron 150 a 250 por mm2 sobre lámina de vidrio y 500 a 740 por mm2 en
lámina de hueso (Figura 6B y C). Mientras, que los grupos experimentales con
menos de 7 x 105 células /ml presentaron 2 a 100 por mm2 sembradas en vidrio
y 5 a 250 por mm2 sobre hueso (Figura 6B y C). Así, el grupo con más de 8 x
105 CMNSP/ml presentó una diferencia significativa con los grupos con menos
de 7 x 105 CMNSP/ml, tanto en lámina de vidrio como de hueso (prueba de
Tukey, p = 0.01). Esto sugiere que las CMNSP no tratadas con PEG, cuando se
concentran en un número crítico (8 x 105 CMNSP/ml) forman células
policarionicas; aunque el número de estos policariones nunca alcanza los
valores obtenidos al tratar este mismo número de CMNSP con PEG (Figura 6,
recuadros E, H, K y N).
También, se evaluó el porcentaje de CMNSP desprendidas, es decir, aquéllas
que no se permanecieron adheridas, una vez se sembraron sobre las láminas de
vidrio o de hueso. Para esto, cada 12 horas, durante 48 horas de cultivo, se
recolectó el medio de cultivo y se contó el número de células presentes
mezclándolas con azul de Tripan. En hueso se encontró en promedio un 25% de
células desprendidas con PEG viables y en vidrió 40 %, para los grupos con más
de 8 x 105 CMNSP con PEG (Tabla 7 y 9, anexo 1). Sus controles presentaron
31% en hueso y 51% en vidrio y (Tabla 8 y 10, anexo 1). Los grupos
experimentales con menos de 8 x 105 CMNSP/ml, presentaron 64% células
desprendidas viables de hueso y 60% de vidrio (Tabla 7 y 9, anexo 1).
Sus controles presentaron 30% para hueso y 50% para vidrio. (Tabla 8 y 10,
anexo 1). Lo anterior sugiere, que el volumen de PEG y el número de células es
crítico para la adherencia celular.
76
F
igura 6. Correlación entre el número de CMNSP y volumen de PEG con la
actividad resortiva y el fenotipo policarión. CMNSP estimuladas con PHA-P
A
Lamina de vidrio
B
Lámina de hueso
C
77
Figura 6. Continuación….
por 72 hs, se fraccionaron en ocho grupos: 3.2 x 105, 4 x 105, 5 x 105, 6 x 105,
7 x 105 , 8 x 105, 9 x 105 ó 10 x 105 células/ml; luego, se trataron con 10, 15,
20, 25, 35 ó 50 µl de PEG (50% v:v) y se sembraron en láminas de vidrio o
hueso cortical bovino, incubándose por 48 hs. Se fijaron con paraformaldehido
(4%) y glutaraldehido (0.2%), los núcleos se tiñeron con Hoechst (5 μg/ml),
durante 15 min a 37 °C; los datos se procesaron en el programa ImageJ1.4. Se
retiraron las células del hueso, utilizando NaOCl al 6% con 5.2% de NaCl y se
D E
G H I
M N O
F
J K L
78
_________________________________
Figura 6. Continuación….
adicionó Coomassie (0.1% p/v). Las CMNSP estimuladas con PHA, pero sin
PEG fue el grupo control. (A) relación entre volumen de PEG y número de
células como % del área resorbida. Número de células multinucleares por mm2
de lámina: (B) vidrio y (C) matriz ósea. Los resultados son la media +/- el error
estándar (ES), de cuatro experimentos, respecto a las células no tratadas con
PEG. Células multinucleares formadas por tratamiento con PEG sembradas
sobre: (D, E y F) vidrio o (J, K y L) matriz ósea y células multinucleares de los
grupos control (G, H y I) vidrio o (M, N y O) matriz ósea. Las barras
corresponden a 48 µm.
1122..55.. EEvvaalluuaacciióónn ddeell nnúúmmeerroo ddee ccéélluullaass mmuullttiinnuucclleeaarreess ttrraapp yy llaa aaccttiivviiddaadd
rreessoorrttiivvaa..
Para identificar el porcentaje de células multinucleares con actividad TRAP se
realizó una citoquímica con pararrosanilina hexasotizada, los núcleos fueron
identificados con una contra coloración con hematoxilina1, 30. Las CMNSP
tratadas con PEG de 7 días de incubación presentaron un 50% de células
multinucleares TRAP positivas y a los 14 días, un 43 % (Figura 7A), con una
diferencia significativa entre ellos (prueba de Tukey, 0.030). Al comparar los
resultados entre 1 y 14 días de cosecha, no se observó una diferencia
significativa (prueba de Tukey, valor de p = 0.439).
Las CMNSP con PEG de 1, 7 y 14 días presentaron diferencias significativas
respecto al grupo control (ANOVA, p = 0.03). Esto sugiere que el número de
células TRAP positivas aumenta entre 1 a 7 días de cultivo y se mantiene, con
tendencia a disminuir, después de este tiempo.
F
J K L
79
Las células multinucleares TRAP positivas, obtenidas en las CMNSP tratadas
con PEG, se observaron alargadas y expandidas sobre la matriz ósea. Las del
grupo control con actividad TRAP se observaron mononucleares (Figura 14G).
Al evaluar la actividad resortiva de las CMNSP tratadas con PEG (Figura 7B), se
observó que el día 1 se presentó un 20.61%; para el día 7 un 34.79% y para el
día 14 un 42.03%.
En el control, el área de resorción del día 1 fue de un 5%, del día 7 de un 10% y
del día 14 de un 18% (Figura 7B). Al hacer el análisis estadístico entre el grupo
experimental se encontró que únicamente existió una diferencia significativa
entre el día 1 y 14 (prueba de Tukey, p = 0.008); sin embargo, entre 1, 7 y 14
días se presentaron diferencias con el control (prueba de Tukey, p = 0.01).
Esto sugiere que las CMNSP tratadas con PEG tienen actividad resortiva desde
el día 1 y aumenta progresivamente hasta el día 14, aunque a menor velocidad
entre el 7 y 14 día. Igualmente, las CMNSP sin tratamiento con PEG también
pueden tener actividad resortiva, aunque en baja proporción.
80
Figura 7. Actividad resortiva y número de células multinucleares TRAP
positivas en CMNSP. 8 x 105 CMNSP/ml estimuladas con PHA-P por 72 hs y
tratadas con PEG (50% v:v), se sembraron en lamina de hueso y se incubaron
por 1, 7 ó 14 días. Para evaluar la actividad de la enzima TRAP, las células
fueron sumergidas en una solución de 4% de pararrosanilina hexazotizada, 4%
de nitrito de sodio, 3.84% de acetato de sodio, 2,8 mg/ ml de tartrato de sodio-
potasio, buffer veronal (ácido barbitúrico al 0.53% y 1.1% de NaOH) y 0.0126%
de naftol fosfato MX-ASB1, contra-coloreando con hematoxilina de Mayers. Se
retiraron las células con una solución de NaOCl al 6% con 5.2% de NaCl y se
colorearon con Coomassie (0.1% p/v). CMNSP sin PEG fue el control. (A) el
porcentaje de células multinucleares TRAP positivas y (B) porcentaje del área de
resorción. Los resultados presentan la media +/- error estándar (ES) de once
ensayos, respecto de las células no tratadas con PEG.
A
B
81
1122..66.. EExxpprreessiióónn ddee mmaarrccaaddoorreess oosstteeooccllaassttooggéénniiccooss eenn CCMMNNSSPP..
Se evaluó la expresión de los marcadores osteoclastogénicos en CMNSP
tratadas con PEG e incubadas por 1, 7 ó 14 días sobre matriz ósea, mediante
inmunofluorescencia indirecta33 de doble marcaje, con anticuerpos policlonales
contra los antígenos de superficie. Igualmente, se realizó una tinción de núcleos
con DAPI 33 (Figura 8).
En las CMNSP con PEG del día 1 se observó una alta fluorescencia en las
células marcadas con los anticuerpos contra la subunidad C1 de la ATPasa H+
vacuolar (ATPC1), receptor de calcitonina (RC) y de RANK (Figura 8B, E y F,
primer panel), lo cual sugiere la expresión de estas proteínas; pero, no se
identificó la presencia de la enzima anhidrasa carbónica II (CA II), ni la
subunidad β3 de la integrina αvβ3 (IB3). En el día 7 se observó una mayor
fluorescencia de la encontrada en el día 1, lo cual indicó la expresaron de CA II,
ATPC1, catepsina k (CK), la IB3, RC, sin embargo, una baja fluorescencia se
observó en las células marcadas con el anticuerpo contra RANK (Figura 8 A, B,
C, D, E y F, segundo panel) siendo casi imperceptible. A los 14 días se observó
una baja fluorescencia de en las células marcadas con anticuerpos contra
ATPC1, RANK, RC y de IB3, por lo cual, se encontraron en una baja expresión
(Figuras 8B, D, E y F, tercer panel); pero, no se observó la expresión las
enzimas CA II y CK, (Figura 8A y C, tercer panel). Esto sugiere que la expresión
de estos marcadores relacionados con OCls, en las CMNSP tratadas con PEG,
aumenta en forma progresiva desde el día 1 hasta los 7 días y posteriormente
disminuye.
En el control (CMNSP sin PEG), a los días 1, 7 y 14 no se expresó la CAII,
ATPC1, IB3, ni RC (datos no mostrados), aunque hubo una baja fluorescencia
de CK comparada con la observada en las CMNSP con PEG, sugiriendo que CK
es el único marcador osteoclastogénico que se expresa en las CMNSP
estimuladas con PHA sin PEG (Figura 8C, cuarto panel). Todos los marcadores
osteoclastogénicos fueron evaluados en células permeabilizadas.
82
Adicionalmente, se observó que las CMNSP tratadas con PEG se observaron
como “células gigantes” multinucleares (Figura 8, recuadros con los núcleos
teñidos con DAPI); mientras que en el grupo control las CMNSP se observaron
mononucleares o en agregados celulares, (Figura 8, cuarto panel).
Otro de los marcadores asociados a las células similares a OCls (fenotipo
policarión), es la glicoproteína de superficie aminopeptidasa N CD13133, 212.
Este marcador se evaluó mediante inmunofluorescencia directa8, utilizando un
anticuerpo monoclonal contra CD13 conjugado a FITC y simultáneamente se
realizó la tinción de núcleos con DAPI 33. La prueba se hizo en CMNSP tratadas
con PEG y cultivadas 1, 7 ó 14 días. En estas CMNSP del día 1 se expresó el
marcador CD13 en los aglomerados celulares, lo cual, permitió observar
delimitaciones entre estos aglomerados, tanto en las CMNSP tratadas con PEG
como en el grupo control (Figura 9A y B). En las CMNSP con PEG del día 7 y
14, se observó una expresión homogénea de CD13, además, los agregados se
observaron como “células gigantes” de más de 100µm (Figura 9C). Sin
embargo, la fluorescencia para CD13 en este día, permitió determinar que
algunas “células gigantes” no presentaron regiones homogéneas sino irregulares
con diferencias en la intensidad de la fluorescencia, permitiendo determinar que
esta glicoproteína CD13 se ubicaba intracelularmente en las “células gigantes”.
Lo anterior sugiere, que estas “células gigantes” no presentan una sola
membrana citoplasmática, sino una discontinuidad en su membrana que rodean
varios núcleos (Figura 9C). En el grupo control no se observó la formación de
“células gigantes” (Figura 9D); en su lugar, en el día 1 y 7 se observaron células
individuales o aglomeradas con una baja expresión de CD13, pero en el día 14
no se observó esta expresión (Figura 9B, D y F). Además, en la localización de
los núcleos en las “células gigantes” se observó diferencias, algunas con los
núcleos localizados en la parte central y otras con los núcleos hacia los
extremos. (Figura 9A y E). Así mismo, algunos de estos núcleos se observaron
picnóticos y fragmentados a los 7 y 14 días de incubación. Contrario a lo
observado en los núcleos de las CMNSP del grupo control.
83
Debido a que, las CMNSP tratadas con PEG expresan la glicoproteína
aminopeptidasa N CD13, relacionada con osteoclastos, se sugiere que el
tratamiento con PEG induce un fenotipo policarión en las CMNSP estimuladas
con PHA. Se descartó una auto-fluorescencia de las láminas de hueso cuando
se incubaron con los controles isotipo, mencionados en la metodología (Figura
9G). Las micrografías son representativas de lo observado por microscopía de
fluorescencia.
84
Figura 8. Expresión y localización de marcadores osteoclastogenicos en
CMNSP. CMNSP estimuladas con PHA-P por 72 hs, tratadas con PEG (50% v/v)
fueron sembradas en láminas de hueso cortical bovino e incubadas por 1, 7 ó 14
días. Para la inmunofluorescencia indirecta se fijaron con paraformaldehido al 4%
y glutaraldehido al 0.2%, por 20 min a 37 ° C; se permeabilizaron con 0.1% de
saponina y se bloquearon con 8% de BSA. Se incubaron por 1 h a 37 °C con 0.2
μg/ml de los anticuerpos generados en conejo: anti CAII, anti ATPC1, anti CK y
anti RC o con 0.2 μg/ml del anticuerpo generado en cabra anti IB3 ó 0.02 μg/ml
del anti RANK. Fueron incubadas a 4 °C por 40 min con 0.25 μg/ml de un
anticuerpo generado en asno anti cabra o anti conejo conjugado con FITC. Los
A B C D E F
85
___________________________________________
Figura 8. Continuación.
núcleos se tiñeron con 1µg/ml (p/v) de DAPI. CMNSP sin PEG fue el control. (A
- F) CMNSP tratadas con PEG y su grupo control. En los recuadros se observan
los núcleos de estas células. (G) en la parte inferior se presentan el control de
isotipos. Las barras corresponden a 250 μm.
Figura 9. Expresión y localización de CD13 en CMNSP. 8 x 105 CMNSP/ml
estimuladas con 30 μg/ml de PHA-P por 72 h, tratadas con PEG (50% v/v) y se
sembraron por lámina de hueso cortical bovino e incubaron por 1, 7 ó 14 días.
Las células se fijaron con 4% de paraformaldehido y 0.2% de glutaraldehido,
permeabilizadas con 0.1% de Tritón-X 100, a 4 °C durante 30 min; luego, se
bloquearon con 8% de BSA y se incubaron a 4 °C por 40 minutos, con un anti
CD13 conjugado a FITC (0.2 μg/ml); los núcleos fueron teñidos con DAPI
(1µg/ml). Como control se utilizaron las CMNSP estimuladas con PHA-P sin
PEG. (A, C y E) CMNSP tratadas con PEG y (B, D y F) CMNSP del grupo
control. (G) controles isotipo. Las barras corresponden a 250 µm.
A
B
C
1 día
86
C
D
E
F
G
7 día
s
14 días
87
1122..77.. AAnnáálliissiiss ddee llaa mmoorrffoollooggííaa cceelluullaarr yy eexxtteennssiioonneess ddee mmeemmbbrraannaa EENN
CCMMNNSSPP..
Para analizar la morfología de las CMNSP tratadas con PEG y sembradas sobre
hueso se empleó la microscopía electrónica de barrido o escaneo (SEM) 8, 112.
La prueba se realizó en CMNSP estimuladas con PHA y tratadas con PEG
incubadas por 1, 7 ó 14 días sobre hueso. Las CMNSP tratadas con PEG de 1
día de incubación se observaron aglomeradas (A); pero, con delimitaciones
entre las células mononucleares (M), que conformaban estos aglomerados.
Además, presentaron extensiones de membrana, señaladas por las flechas,
(Figura 10A y B); estas extensiones no se observaron inmersas en el hueso
(Figura 10A, B, E y F). Por debajo de los filipodios (F) de estas “células
gigantes”, señaladas por flechas, se observan cavidades o huecos (H), los
cuales, han sido llamados en la literatura “lagunas de resorción”. Las “células
gigantes” no se localizaron en los conductos de Havers, sino en toda la
superficie de la lámina ósea. El control a los 7 días (Figura 10I), no presentó
extensiones de la membrana, muchas permanecieron mononucleares (M) y/o
aglomeradas (A). Además, en las “células gigantes” (C) o en los aglomerados
celulares (A) se observaron protuberancias (P) durante todos los tiempos de
incubación (Figura 10A, C y E); estas protuberancias se ubicaron en lados
opuestos a la zona de las prolongaciones de membrana o filipodios (Figura 10E).
A los 14 días, además de lo descrito para el 7 día, se hizo más evidente los
filipodios, señalados con las flechas (Figura 10E y F). El control se observó
como células mononucleares (M), aglomerados celulares (A) y en una baja
proporción como “células gigantes” (Figura 10J). En conjunto, estos resultados
sugieren que las CMNSP tratadas con PEG y sembradas sobre láminas óseas
tienen morfología similar a la descrita en la literatura para los osteoclastos.
Una vez se retiraron las células de las láminas óseas se observaron diferencias
en su estructura ósea. Las láminas donde se sembraron las CMNSP tratadas
con PEG, tenían irregularidades y huecos de diferentes tamaños (Figura10c y
d). Mientras, que las láminas donde se retiraron las CMNSP sin tratar con PEG
88
(grupo control) y las láminas sin CMNSP sembradas, presentaron una matriz
ósea con estructura regular, homogénea y sin huecos de gran tamaño, pero con
hendiduras regulares, tal vez, producto de la solución de NaCOl con NaCl o el
pre-tratamiento con SDS (Figura 10a y b). Lo anterior, sugiere que las CMNSP
tratadas con PEG presentan una actividad resortiva similar a la descrita para los
osteoclastos, obtenidos a partir del linaje monocito/macrófago. Las micrografías
presentadas en la Figura 10 son las más representativas de los ensayos.
89
Figura 10. Morfología celular y extensiones de membrana en CMNSP. Para
microscopia electrónica (SEM) se tomaron 8 x 105 CMNSP/ml estimuladas con
30 μg/ml de PHA-P por 72 h, tratadas con PEG y sembradas por matriz ósea e
incubadas durante 1, 7 ó 14 días. Las células de cada lámina se fijaron con 2.5%
de glutaraldehido por 3 hs, bajo agitación y se trataron con 1% de OsO4 por 1 h,
se deshidrataron con un gradiente de etanol (25, 50, 70, 80 y 100%) y se
secaron al vacío por 8 hs a temperatura ambiente. Las láminas se cubrieron con
30 nm de oro coloidal. Como control se utilizaron las CMNSP no tratadas con
PEG y las láminas sin CMNSP. (A, B, C, D, E y F) morfología de las CMNSP
tratadas con PEG. (G, H e I) morfología de las CMNSP sin PEG. Las barras
corresponden a 10 y 5 µm. (a y b) estructura de la matriz ósea para láminas de
hueso, pre-tratadas con SDS al 10%, a las que no se les sembraron CMNSP. (c
90
__________________________________________________
Figura 10. Continuación.
y d) estructura de la matriz ósea para láminas, pre-tratadas con SDS al 10%, a
las cuales se les retiró las CMNSP tratadas con PEG mediante la solución de
NaOCl al 6% y 5.2% de NaCl . Las barras corresponden a 100 y 50 µm.
1122..88.. AAnnáálliissiiss ddeell aarrrreegglloo ddee aaccttiinnaa eenn CCMMNNSSPP..
La evaluación del arreglo de la actina se realizó mediante una
inmunofluorescencia indirecta, utilizando un anticuerpo monoclonal anti-actina y
un policlonal anti-ratón conjugado con FITC183, para ello, se tomaron 8 x 105
CMNSP/ml estimuladas con PHA-P, tratadas con PEG e incubadas por en una
lámina de matriz ósea por 1, 3, 5, 7, 9 ó 14 días.
Las CMNSP con 1 y 3 días de incubación presentaron la fluorescencia
distribuida en forma de acumulaciones o agrupaciones (dot-like), denominados
en la literatura como podosomas o agrupaciones de actina (Figura 11A, a y b).
A los 5 días estos podosomas aislados se observan hacia la periferia de cada
célula conformando lo que se denomina como “nubes” (cloud) de actina (Figura
11A, c). A los 7 y 9 días, la fluorescencia cambia de patrón y las “nubes” de
actina se distribuyen formando lo que ha sido denominado como “anillos de
actina” y zonas de sellado o “sealing” (Figura 11A, d y e). A los 5, 7 y 9 días, la
fluorescencia corresponde a un patrón de células no aglomeradas, sino que
permite observarlas como “células gigantes”, similar a lo mostrado con el
marcador CD13 o en la microscopía de barrido (Figura 9 y 10). A los 14 días, la
fluorescencia se torna homogénea y disminuye, con lo cual se observan menos
“anillos de actina” y zonas claras o de sellado (Figura 11A, f). En las CMNSP
control de 1, 3, 5, 7, 9 y 14 días, la fluorescencia se distribuyó intracelularmente,
de forma homogénea; además, se observaron como células mononucleares o
aglomerados celulares, pero sin un patrón de fluorescencia que indique la
formación de podosomas. (Figura 11A, s). Estos resultados sugieren que las
91
CMNSP, tratadas con PEG, presentan un arreglo de actina similar al descrito
para los osteoclastos cultivados en superficie ósea.
Por otra parte, se conoce que al forzar la despolimerización de microtubulos, se
desestabiliza la formación de podosomas en policariones190; igualmente, se sabe
que al interrumpir las zonas de sellado se suprime la actividad resortiva de los
osteoclastos 68, 185, 190. Así mismo, se conoce que al deprivar las células de SFB
se disminuye la formación de actina y cambia su organización. Por esto, se
analizó el efecto sobre el arreglo de la actina, la actividad TRAP y la resorción
ósea cuando se inhibe la tubulina por colchicina o sincronizan las células en
fase Go. Para esto, se tomaron 8 x 105 CMNSP/ml, con 96% de viabilidad,
incubadas con colchicina o deprivadas de SFB por 24h y se trataron con PEG;
luego, se sembraron en láminas de hueso cortical bovino y se incubaron por 1,
3, 5, 7, 9 y 14 días. Como control se utilizó las CMNSP estimuladas con PHA e
incubadas con SFB, las cuales, se cultivaron o no colchicina o sin SFB, y
recibieron o no el tratamiento con PEG (Figura 11A, g a la r).
Respecto a la distribución de la actina, las CMNSP cultivadas con colchicina y
las CMNSP desprovistas de SFB (Figura 11A, g a la r). no presentaron
diferencias con el control (Figura 11A, t y u)., en ningún día de cultivo, dado que
no hubo formación de podosomas, en su lugar se observó acumulaciones de
actina distribuida homogéneamente; en todos los casos las CMNSP se
observaron aglomeradas (Figura 11A, g a la r). Esto sugiere que al fusionar las
CMNSP en fase Go o cuando se bloquea la polimerización de tubulina, antes
tratarlas con PEG, se inhibe la formación de podosomas.
92
Figura 11. Arreglo de la actina, actividad resortiva y número de células
multinucleares TRAP positivas en CMNSP. 8 x 105 CMNSP/ml estimuladas
con PHA-P por 72 hs, o cultivadas sin PHA y con 10 µg/ml de colchicina, o
cultivadas deprivadas de SFB por 24 hs, se trataron con PEG (50% v/v) y se
colocaron en sendas láminas de hueso, incubándolas por 1, 3, 5, 7, 9 ó 14 días.
Se fijaron por 20 min a 37 °C con paraformaldehido (4%) y glutaraldehido
(0.2%), se permeabilizaron, con una solución de saponina (0.1%). Se
bloquearon con 8% de BSA y se incubaron a 37 °C, por 40 min, con un anti
actina monoclonal (1:250) y a 4°C por 40 min con un anti ratón conjugado a
FITC (0.25 μg/ml). Para la actividad TRAP y resortiva se realizó como se
a
1 día 3 días 5 días 7 días 9 días 14 días
Tra
tadas c
on
PE
G
PH
A+
SF
B
Co
lch
icin
a 10
µg
/ml (
24 h
s)
Dep
riv
adas
de
S
FB
(24
hs)
N
o t
rata
das
co
n
PE
G
PHA+ SFB Colchicina Deprivadas Control isotipos
b c d e f
g h i j k l
m n o p q r
s t u v w x
A
93
Figura 11. Continuación…
describió en la figura 7. Las CMNSP sin PEG fueron el grupo control. (A)
inmunofluorescencia indirecta utilizando anti actina en las CMNSP estimuladas
con PHA-P, tratadas con PEG (a - f), las CMNSP cultivadas con colchicina (g - l)
y las CMNSP deprivadas de SFB, por 24 hs (m-r) y los grupos control de 7 días
de incubación (s - u). Controles isotipo: láminas con CMNSP incubadas con un
monoclonal anti neurofilamentos 200k Ab-1 (0.2 μg/ml), con o sin el anticuerpo
anti ratón conjugado con FITC, mientras que las láminas sin células incubadas
con solo el anticuerpo anti ratón conjugado con FITC (v - x). Las barras
B
C
94
___________________________________
Figura 11. Continuación…….
corresponden a 250 µm. (B) porcentaje de células multinucleares TRAP
positivas. (C) porcentaje del área de resorción para los tres grupos celulares y
sus respectivos controles. Los resultados son el error estándar de cuatro
experimentos.
La distribución o arreglo de la actina no fue producto de la autofluorescencia de
la matriz ósea, como se muestra con los controles de isotipo (Figura 11A, v a la
x).
Respecto al porcentaje de células multinucleares con actividad TRAP, para las
CMNSP con colchicina tratadas con PEG presentaron un 2% y su grupo control
(colchicina, sin PEG) un 5% (Figura 11B). Este porcentaje fue bajo, respecto a
las CMNSP no tratadas con colchicina y estimuladas con PHA-P que fueron
tratadas con PEG, las cuales presentaron un 55% y para su control (sin PEG)
un 32% (Figura 11B). Para las CMNSP deprivadas de SFB, el porcentaje fue del
10% y su control mostró un 12% (Figura 11B). Para ambos experimentos, los
porcentajes obtenidos son después de los 14 días de incubación. Lo anterior,
sugiere que las CMNSP en fase Go o con un bloqueo en la polimerización de la
tubulina, antes tratarlas con PEG, no expresan la enzima TRAP, por lo cual, se
determinó un menor número de células multinucleares TRAP positivas, respecto
a lo encontrado con las CMNSP estimuladas en PHA, con SFB y tratadas con
PEG (Figura11B).
Las CMNSP con colchicina o las deprivadas de SFB por 24 horas, tratadas con
PEG, no presentaron resorción ósea (Figura 11C). Mientras que, las CMNSP
estimuladas con PHA-P, tratadas con PEG, de 5, 7 y 9 días presentaron una
actividad resortiva del 85, 90 y 95%, respectivamente. Esto sugiere que al
fusionar las CMNSP en fase Go o cuando se bloquea la polimerización de
tubulina, antes tratarlas con PEG, se inhibe la actividad resortiva (Figura 11C).
Debido a que las células tratadas con colchicina o deprivadas de SFB no
95
presentaron un arreglo de la actina, ni resorción ósea, pero forman un número
bajo de células multinucleares TRAP positivas, se decidió analizar el
desprendimiento de estas células de hueso, para poder determinar si los bajos
resultados con estas células se relacionan con un bajo número de células
adheridas. Para ello, se sembraron 8 x 105 CMNSP/ml con un 97.4% de
integridad de membrana, que previamente habían sido cultivadas en colchicina o
privadas de SFB, luego se trataron con PEG. Después, cada 24 horas se
recolectó el medio sobrenadante, para contar las células desprendidas.
Los resultados permitieron determinar que las CMNSP incubadas con colchicina,
presentaron un desprendimiento de hueso del 52% y su control (sin PEG) tuvo
un 56%, mientras que, las células deprivadas de SFB y su grupo control, se
desprendieron solo en un 34 y 22%, respectivamente. Las CMNSP no tratadas
con colchicina, incubadas con PHA-P y tratadas con PEG, mostraron un
desprendimiento del 39% y su control (sin PEG) solo tuvieron un 22%. Por lo
cual, se sugiere que la ausencia en el arreglo de actina, el bajo número de
células multinucleares TRAP positivas y la no actividad resortiva, en las CMNSP
con colchicina o sincronizadas en fase Go, no obedece a la ausencia de células
adheridas a la matriz ósea, ni a la pérdida de viabilidad de estas CMNSP.
Otro punto que se quiso evaluar fue si el arreglo de la actina de CMNSP
tratadas con PEG está influenciado por el tipo de matriz extracelular (MEC).
Para esto, las láminas de vidrio se cubrieron con vitronectina (VN) 181, 184 o
colágeno tipo I (CTI) 183, 184 o SFB 181. Luego, 8 x 105 CMNSP/ml fueron
sembradas sobre cada lámina; estas láminas se incubaron por 1, 7 y 14 días. El
control consistió en células no tratadas con PEG, sembradas sobre las mismas
MEC; láminas pre-incubadas con poli-L-Lisina (PLL) 184 y láminas de vidrio sin
recubrir con MEC (LSR) 181.
Las CMNSP sembradas sobre VN y CTI se observaron, al día 1, 7 y 14,
aglomeradas o como “células gigantes” de más de 100µm. Desde el primer día
de cultivo presentaron podosomas y “anillo” de actina (Figura 12D y E). Al día 7
y 14 sobre VN la formación de cinturones de actina se hizo más evidente (Figura
96
12E, panel dos y tres). Las CMNSP sembradas sobre láminas previamente
cubiertas con SFB, se observaron aglomeradas y no en forma de “células
gigantes” (Figura 12C). Pero, en estas CMNSP sobre SFB, en el día 1 y 7, se
presentaron podosomas aislados hacia la periferia, conformando anillos de
actina (Figura 12C, primer y segundo panel); sin que se presentaran a los 14
días, ya que en este tiempo la actina se observó distribuida homogéneamente
(Figura 12C, tercera panel).
En los grupos control, con CMNSP no tratadas con PEG, sembrados sobre VN,
CTI y SFB, no se observaron podosomas, anillos o cinturones de actina, durante
los 14 días de incubación y se mantuvieron individualizadas o aglomeradas, con
una distribución homogénea de la actina a nivel intracelular (Figura12, C, D y E,
tercer y cuarto panel). Las CMNSP tratadas con PEG, sembradas sobre la
matriz control (PLL), no presentaron un arreglo de actina en ninguno de los días
de incubación (datos no mostrados); sin embargo, las CMNSP sin PEG
presentaron podosomas solo en el día 7 (Figura 12B, cuarto panel). Las CMNSP
tratadas con PEG, sembradas sobre láminas de vidrio control (LSR) presentaron
al día 1 y 7 de incubación, una acumulación de actina en los aglomerados
celulares, similar a estructuras de anillos de actina y podosomas (Figura 12A,
primer y segundo panel). Sin embargo, a los 14 días estas células se
disgregaron o separaron, sin presentarse la formación de podosomas o anillos
de actina (Figura 12A, tercer panel).
Para determinar si la organización en estructuras dinámicas de actina de los
días 1 al 14 sobre MEC, obedece al tratamiento con PEG o al estímulo con PHA-
P, se recolectaron las CMNSP estimuladas con PHA-P no adheridas al plástico
(rosetas celulares en suspensión), luego se sembraron sobre una lámina de
vidrio sin recubrir (LSR) y se incubaron durante 1, 7 ó 14 días. En estas CMNSP
se encontró la formación de aglomerados celulares, mostrando una distribución
homogénea e intracelular de la actina (Figura 12F), similar a lo observado en las
97
+
Figura 12. Arreglo de la actina en CMNSP cultivadas sobre diferentes
matrices. Las láminas de vidrio fueron cubiertas con VN (10 µg/ml) ó CTI (30
µg/ml) ó 20 µl de SFB (10%); luego, sobre cada una de estas superficies se
A B C D E
Tra
tad
as
con
PE
G
No
tra
tad
as c
on
P
EG
CM
NS
P e
n
sus
pen
sió
n +
PH
A
Co
ntro
l de
iso
tipo
s
1 d
ía 7
día
s 1
4 días
7 días
98
________________________________________________
Figura 12. Continuación….
colocaron 8 x 105 CMNSP/ml estimuladas con PHA-P y tratadas con PEG,
incubándolas por 1, 7 ó 14 días. Las células fueron fijadas con paraformaldehido
(4%) y glutaraldehido (0.2%), a 37 °C por 20 min, permeabilizadas con saponina
(0.1%); después, se bloquearon con 8% de BSA; luego, se incubaron a 37 °C
por 40 min, con monoclonal anti actina (1:250) y con un anti ratón conjugado a
FITC (0.25 μg/ml) o a “rhodamine” (0.5 μg/ml), a 4°C por 40 minutos. Como
control se utilizaron las CMNSP sin PEG y láminas de vidrio cubiertas con 0.1%
de poli-L-lisina o sin recubrir. (A) CMNSP sobre láminas de vidrio sin recubrir, (B)
sobre poli-L-lisina, (C) sobre SFB, (D) sobre colágeno tipo I y (E) en
vitronectina. (F) se presentan las CMNSP estimuladas con PHA en suspensión
no tratadas con PEG. (G, H e I) controles de isotipo: láminas sin células
incubadas con un monoclonal anti-neurofilamentos 200k Ab-1 (0.2 μg/ml), junto
con o sin un anti-ratón conjugado con FITC. Las barras corresponden a 48 y 250
µm.
aglomeraciones de las CMNSP sin PEG, colocadas sobre PLL y LSR (Figura
12). En conjunto, los resultados obtenidos al sembrar las CMNSP sobre
diferentes proteínas de matriz extracelular sugieren que, estas proteínas de
MEC inducen el arreglo de actina de manera similar a lo descrito en la literatura
para osteoclastos, cultivados sobre las mismas superficies o MEC184. La
distribución o arreglo de la actina no fue producto de la autofluorescencia de las
MEC o de las superficies control, como lo muestran los controles de isotipo
(Figura 12G, H e I)
Debido a que en las CMNSP estimuladas con PHA-P sin PEG (grupo control),
no se observó un arreglo de la actina evidente, pero, si presentó una baja
formación de células multinucleares con actividad TRAP y resortiva, se decidió
99
analizar si el estímulo con PHA-P influye en el arreglo de la actina, la actividad
TRAP y resortiva de las CMNSP. Para ello, se tomaron 8 x 105 CMNSP/ml
recién extraídas con Ficoll (CMNSP no cultivadas y sin PHA-P) con un 96% de
integridad de membrana, luego, se trataron con PEG y se sembraron en láminas
de hueso, láminas de vidrio cubiertas con VN, CTI, SFB, PLL o sin recubrir
(LSR); estos ensayos se incubaron por 48 horas, para posteriormente, analizar
por inmunofluorescencia indirecta el arreglo de la actina, así como por
citoquímica evaluar la actividad TRAP y finalmente, con Coomassie, determinar
la resorción ósea (Figura 13).
Respecto al arreglo de la actina, tanto en las CMNSP no cultivadas, tratadas con
PEG como en su grupo control (sin PEG), cuando se sembraron sobre hueso, se
observó la formación de zonas claras y anillos de actina; además, se
presentaron como células de gran tamaño, de aproximadamente 50 μm, pero,
algunas se observaron como aglomerados celulares (Figura 13A, a y b).
Cuando estas CMNSP no cultivadas y tratadas con PEG se sembraron en
láminas de vidrio cubiertas con CTI, SFB y VN se observaron anillos de actina y
podosomas. (Figura 13A, d, e y f). Pero, cuando se colocaron sobre PLL y
lámina de vidrio sin recubrir no se presentaron estas estructuras de actina
(Figura 13A, b y c). En el grupo control (sin PEG) se presentaron anillos de
actina, cuando las CMNSP fueron sembradas sobre matriz ósea y VN (Figura
13A, a y f).
Respecto a la presencia de células multinucleares con actividad TRAP, las
CMNSP no cultivadas, tratadas con PEG y su grupo control (sin PEG)
presentaron un 40 y 43% respectivamente de células multinucleares TRAP
positivas (Figura 13B), sin encontrar una diferencia significativa entre ellas
(ANOVA, p= 0.130). Mientras que las CMNSP estimuladas con PHA-P tratadas
con PEG y su control presentaron un 46 y 30% respectivamente (Figura 13B),
con una diferencia significativa (ANOVA, p = 0.002). Al comparar las CMNSP no
cultivadas con las CMNSP estimuladas en PHA, no se encontraron diferencias
100
significativas, en la formación de células multinucleares con actividad TRAP
(ANOVA, p = 0.306).
Respecto a la resorción ósea, las CMNSP no cultivadas, tratadas con PEG y su
control (sin PEG) presentaron un 2.9 y 10.7%, respectivamente (Figura 13C), sin
una diferencia significativa entre ellos (ANOVA, p = 0.307). Mientras que, las
CMNSP estimuladas con PHA-P presentaron 39.64% y 14.44%,
respectivamente (Figura 13C), con una diferencia significativa entre ellas
(ANOVA, p = 0.005). Cuando se comparó la actividad resortiva, entre las
CMNSP no cultivadas y las CMNSP estimuladas con PHA, se encontró una
diferencia significativa entre estos dos cultivos (ANOVA, p = 0.001).
En conjunto, estos resultados sugieren que el PEG per se puede ser un inductor
del arreglo de actina y de la actividad resortiva; sin embargo, la PHA puede tener
un efecto en la formación de anillos de actina. Aparentemente, el número de
células multinucleares TRAP positivas no depende de PEG ni de la PHA.
101
Figura 13. Arreglo de actina, actividad TRAP y resortiva en CMNSP sin
estímulo con PHA-P. CMNSP recién extraídas con Ficoll sin PHA, y sin cultivar,
se trataron con PEG, se colocaron en cada lámina de hueso o lámina de vidrio
A
a b c
d e f
Lamina de hueso Lamina de vidrio Poly-L-Lys
SFB Colágeno tipo I Vitronectina
Tra
tad
as c
on
PE
G
No
tra
tad
as
con
PE
G
Tra
tad
as
co
n P
EG
N
o t
rata
das
co
n P
EG
102
Figura 13. Continuación….
cubierta con VN, o CTI, o SFB y se incubaron por 48 hs. Las células fueron
fijadas con paraformaldehido (4%) y glutaraldehido (0.2%), a 37 °C por 20 min,
permeabilizadas con saponina (0.1%) a 4°C por 30 min. Se bloquearon con 8%
de BSA e incubaron a 37 °C por 40 min, con un monoclonal contra actina (1:250)
y con un anti ratón conjugado a FITC (0.25 μg/ml) o uno conjugado a
“rhodamine” (0.5 μg/ml). El análisis de TRAP y la actividad resortiva se realizó
como se describe en la figura 7. Los controles fueron: las CMNSP sin PEG,
B
C
103
____________________________________________
Figura 13. Continuación….
CMNSP desprovistas de SFB y las láminas de vidrio cubiertas con 0.1% de poli-
L-lisina (PLL) o sin recubrir. (A) inmunofluorescencia indirecta de CMNSP sin
PHA sembradas sobre matriz ósea (primer panel, a), en vidrio sin recubrir
(segundo panel, b), sobre PLL (tercer panel, c), en SFB (cuarto panel, d), en CTI
(quinto panel, e) y en VN (sexto panel, f). Las barras corresponden a 48 y 250
µm. (B) células multinucleares con actividad de la enzima TRAP y (C) el
porcentaje (%) del área de resorción. Los datos presentan el error estándar de
cuatro experimentos.
1122..99.. EEvvaalluuaacciióónn ddeell eeffeeccttoo ddeell PPEEGG yy ddee RRAANNKKLL eenn eell aarrrreegglloo ddee llaa aaccttiinnaa,,
llaa aaccttiivviiddaadd TTRRAAPP yy llaa rreessoorrssiioonn oosseeaa eenn CCMMNNSSPP..
RANKL está asociado con la diferenciación y fusión de monocitos/macrófagos
para generar osteoclastos148, 149. Por otra parte, junto con los resultados
obtenidos en este trabajo, se podría sugerir que el PEG al inducir una fusión
celular estimula a las CMNSP para que expresen marcadores
osteoclastogénicos, realicen un arreglo de actina, presenten actividad TRAP y
resorción ósea; las cuales, son características que han sido descritas para
osteoclastos151. Ante esta evidencia, se quiso evaluar si existen cambios en el
arreglo de actina, en la actividad TRAP y en la resorción ósea cuando se
combina la presencia de RANKL con PEG.
Se tomaron 8 x 105 CMNSP/ml, con un 95% de integridad de su membrana,
para realizar dos tipos de experimentos:
1. Las CMNSP cultivadas en DMEM, 10% de SFB y 40 ng/ml de RANKL por 48
horas, no se adicionó PHA-P, luego se trataron con PEG y se sembraron en
hueso o lamina de vidrio cubierta con VN y se incubaron por 1, 7 ó 14 días.
Como control se usaron las CMNSP sin PEG sembradas en hueso o sembradas
sobre láminas de vidrio no recubiertas con VN.
104
2. Las CMNSP se cultivaron en DMEM, 10% de SFB sin PHA-P por 48h, luego,
se trataron con PEG, se sembraron en hueso o lamina de vidrio cubierta con VN
y se incubaron por 1, 7 ó 14 días con 50 ng/ml de RANKL. Como control se
usaron las CMNSP sin PEG sembradas en hueso e incubadas con 50 ng/ml de
RANKL o sembradas sobre láminas de vidrio no recubiertas.
Los resultados relacionados con el arreglo de Actina del primer experimento,
indicaron que las CMNSP en hueso, sobre VN o sus controles no se observaron
anillos de actina o podosomas (dato no mostrado). Para el segundo
experimento, en las CMNSP tratadas con PEG sembradas en hueso y cultivadas
con RANKL, no se presentaron podosomas, cinturones o anillos de actina y
muchas de estas células se observaron como aglomerados celulares (Figura
14A, a, b, y c). Sin embargo, en el grupo control, si se presentaron podosomas,
anillos y cinturones de actina durante los 14 días de cultivo con RANKL (Figura
14A, d, e y f).
Respecto al número de células multinucleares TRAP positivas del primer
experimento, no se determinaron células multinucleares con actividad TRAP en
hueso, ya que la mayoría de estas células permanecieron mononucleares con
actividad TRAP negativa (dato no mostrado). Para el segundo experimento, en
las CMNSP, tratadas con PEG cultivadas con RANKL, se encontró un 40.9%,
19.55% y 10.14% de células multinucleares TRAP positivas para 1, 7 y 14 días
respectivamente; mientras, sus controles (sin PEG) mostraron 48.57%, 23.15% y
5.76% de células con actividad TRAP, en los mismo días de cultivo (Figura
14E); sin encontrarse una diferencia significativa entre estos días de incubación
(ANOVA, valor de p = 0.456).
Por otra parte, la resorción ósea en el primer experimento no se presentó (dato
no mostrado). Para el segundo experimento, las CMNSP, tratadas con PEG,
presentaron 5.99%, 4.76% y 1.28% de resorción; mientras, que sus controles
(sin PEG) mostraron 17%, 9.115% y 6.897% de actividad resortiva, para 1, 7 y
14 días de cultivo, respectivamente (Figura 14F); además, se encontró una
105
diferencia significativa entre sus actividades resortivas, (ANOVA, valor de p=
0.031).
Como las CMNSP previamente estimuladas con RANKL, y luego tratadas con
PEG, colocadas en hueso, no presentaron estas actividades resortivas y TRAP.
Mientras, que las CMNSP sin PEG (control, modelo tradicional100) colocadas en
hueso y estimuladas con RANKL, si se observaron estos eventos, se sugiere
que la presencia simultánea de RANKL y PEG en las CMNSP, no permite o
bloquea el arreglo de la actina, además, disminuye la formación de células
multinucleares con actividad TRAP y la resorción ósea, sugiriendo que PEG
podría inhibir la actividad iniciada o inducida por RANKL.
Figura 14. Efecto del PEG en el arreglo de la actina, en la actividad de la
enzima TRAP y en la resorción de CMNSP cultivadas con RANKL.
A
a
b
c
d
e
f
106
B
C
Da b c
d e f
f c
b
a d
e
f c
b
a
1 día 7 días 14 días T
rata
da
s c
on
PE
G
No
tra
tad
as c
on
P
EG
d
e
1 d
ía
7 d
ías
14
día
s
D
107
Figura 14. Continuación….
CMNSP cultivadas por 48 hs con DMEM y 10% SFB sin PHA-P se trataron con
PEG, luego, se sembraron 8 x 105 células/ml en cada lámina de hueso o vidrio
E
F
G
H
20 x 20 x 20 x 20 x 20 x
20 x 20 x 20 x 20 x 20 x
108
________________________________________________
Figura 14. Continuación….
recubierta con VN (10 µg/ml) o sin recubrir y se cultivaron durante 1, 7 ó 14 días
con RANKL (50 ng/ml). Se fijaron con paraformaldehido (4%) y glutaraldehido
(0.2%). Se permeabilizaron con una solución de 0.1% de saponina por 30 min a
4°C, se bloqueó con 8% de BSA, se incubó a 37 °C por 40 min, con un
monoclonal anti actina (1:250) y a 4°C por 40 min, con un anti ratón conjugado a
FITC (0.25 μg/ml) o uno conjugado a “rhodamine” (0.5 μg/ml). Los núcleos
fueron teñidos con DAPI (1µg/ml). La evaluación de la actividad de la enzima
TRAP y resortiva se realizó como se describe en la figura 7. Como grupo control
se usó las CMNSP sin PEG adheridas a hueso y cultivadas con RANKL (modelo
tradicional). (A) arreglo de la actina en CMNSP con PEG (a, b y c) o sin PEG
(d, e y f), colocadas en hueso. (B) núcleos de CMNSP con PEG (d, e y f) y sin
PEG (a, b y c), sembradas en hueso. (C) arreglo de la actina para CMNSP con
PEG (a, b y c) o sin PEG (d, e y f) sembradas sobre vidrio sin recubrir y (D) para
las CMNSP con PEG (a, b y c) o sin PEG (d, e y f) colocadas sobre VN. Todos
los ensayos fueron estimulados continuamente con RANKL. Las barras
corresponden a 48 y 250 µm. (E) células multinucleares con actividad TRAP. (F)
el porcentaje (%) del área de resorción. (G) morfología de las células que
presentan TRAP y (H) el área de extensión de las lagunas de resorción,
encontradas en varios ensayos de este proyecto. Los datos son el error estándar
de dos experimentos.
1122..1100.. EExxpprreessiióónn,, ffoossffoorriillaacciióónn yy llooccaalliizzaacciióónn ddee llaass cciinnaassaass cc--SSrrcc yy SSyykk eenn
CCMMNNSSPP..
Diferentes reportes han descrito que c-Src y Syk se encuentran asociadas con la
adherencia, formación de la zona de sellado y la actividad resortiva de células
similares a osteoclastos32, 51, 55. Por lo cual, se evaluó si estas moléculas se
expresan en el modelo del presente trabajo, es decir, CMNSP estimuladas con
PHA-P, tratadas con PEG y sembradas sobre láminas de hueso, que fueron
109
incubadas durante 1, 7 ó 14 días. Al finalizar estos tiempos, la expresión de
estas dos proteínas cinasas se analizó mediante inmunofluorescencia indirecta
en células permeabilizadas o inmunoblot. Para ello, en el inmunoblot, las
CMNSP fueron lisadas con el buffer HNTG. Como controles se usaron los
siguientes: 1. CMNSP estimuladas con PHA sin PEG. 2. CMNSP recién
extraídas con Ficoll. 3. CMNSP cultivadas en plástico por 72 horas, sin PHA
(adheridas y en suspensión). 4. CMNSP estimuladas con PHA-P por 72 horas en
plástico, de las cuales solo se recolectaron las que estaban en suspensión. 5.
CMNSP estimuladas con PHA-P por 72 horas en plástico, de las cuales se
recolectaron las adheridas al plástico. 6. CMNSP estimuladas con PHA-P por 72
horas, tratadas con PEG, pero no sembradas en hueso o matriz.
Como se observa en la Figura 15B, en las CMNSP estimuladas con PHA-P,
tratadas con PEG y sembradas sobre hueso, Syk se expresó en el día 1 y 7
(carriles 10 y 11), mientras que, c Src se expresó en todos los días de
incubación (carriles 10, 11 y 12). Únicamente, en el día 1 para las CMNSP
estimuladas con PHA-P sin PEG y adheridas a hueso, se observó Syk (carril 7);
mientras que, c Src se expresó solo a los 7 días en hueso (carril 8). Los demás
controles no expresaron estas dos proteínas cinasas.
Cuando se analizó la localización y expresión de estas dos cinasas por
inmunofluorescencia indirecta de doble marcaje, se observó que en las CMNSP
estimuladas en PHA, tratadas con PEG y sembradas sobre hueso, la expresión
de c Src fue constante, desde 1 al 14 día de cultivo (Figura 15C, D y E). La
fluorescencia para Syk fue mayor para 7 días de cultivo; sin embargo, para el día
1 y 14 fue más baja, respecto a lo observado en 7 días (Figura 15C, D y E). En
las células del grupo control, estimuladas con PHA sin PEG y adheridas a
hueso, Syk y c-Src se expresaron del 1 al 14 día de incubación; aunque, la
fluorescencia de las dos proteínas fue mayor a los 7 días (Figura15F). Cuando
se sobreponen las imágenes de c-Src y de Syk, se observó una localización
110
cercana de estas dos proteínas cinasas (Figura 15C, D y E, sobre-posición), la
cual, fue mayor a los 7 días de cultivo (Figura 17D, sobre-posición).
La evaluación de la posible asociación de estas dos proteínas cinasas se realizó
mediante co-inmunoprecipitación (Co-IP), tomando como referencia los
resultados obtenidos en el inmunoblot e inmunofluorescencia. Para ello, se tomó
el lisado de las CMNSP tratadas con PEG de 1, 7 ó 14 días y el lisado de las
CMNSP sin PEG de 7 días de incubación. (Figura 16A) Los resultados
permitieron observar que Syk co-inmunoprecipitó con c-Src en el lisado de 1, 7 y
14 días de cultivo (Figura 16A, blot anti c Src); sin embargo, en el lisado de 1 y
7 días del inmunoprecipitado con c Src, no se presentó una co-IP con Syk
(Figura 16A, carril 1 y 2, blot anti Syk). En el grupo control a los 7 días, no co-
inmunoprecipitaron estas dos proteínas cinasas (Figura 16A, carril 4).
Tanto c Src como Syk se encontraron fosforiladas en sus residuos de tirosina
(Y), en las CMNSP tratadas con PEG del lisado del día 7 se presentó la
fosforilación de c Src y Syk (Figura 16, carril 2), mientras, el lisado de las
CMNSP con PEG del día 1 solo se encontró fosforilada c Src (Figura 16, carril
1), a los 14 días no se encontraron fosforiladas estas proteínas (Figura 16, carril
3). Ya en el grupo control (sin PEG), Syk se encontró fosforilada en el día 7
(Figura 16C, carril 4) pero c Src no se observó fosforilada (Figura 16C, carril 4)
En conjunto, estos resultados sugieren que en las CMNSP tratadas con PEG
adheridas a hueso, tanto c Src como Syk, se expresan desde el día 1 al 14
(inmunoblot y fluorescencia), también, se observó que solo en el día 7, estas dos
cinasas se presentaron en forma activa (fosforilación); al parecer estas dos
cinasas pueden co-inmunoprecipitar en el día 7 y 14.
111
Figura 15. Expresión y localización de c-Src y Syk en CMNSP. En cada
lámina de hueso se colocó 8 x 105 CMNSP/ml estimuladas con PHA-P por 72 hs,
tratadas con PEG, e incubadas por 1, 7 ó 14 días. Las células se lisaron con
buffer HNTG, sonicadas por 1 min; el lisado se separó por SDS/PAGE al 12%,
se transfirió y las membranas se incubaron con anti c Src (0.8 μg/ml, conejo). Se
adicionaron dos conjugados, primero un anti conejo con biotina (0.2 μg/ml) y
posteriormente, con estreptavidina acoplada a peroxidasa (1µg/ml), junto con un
anti conejo-HRP (2 μg/ml). Se retiraron los anticuerpos en un buffer disociador
A
B
112
_____________________________________
Figura 15. Continuación.
(100mM de β-mercaptoetanol, 2% SDS y 62,5 mM de Tris-HCl, pH 6.8). Se
incubó con anti Syk (0.025 μg/ml) y se adicionó un anti ratón conjugado con
HRP. Las bandas se detectaron primero por ECL y luego con amino-etil-carbazol
50mM. Para e ensayo de inmunofluorescencia indirecta, las células se fijaron
con pparaformaldehido (4%) y glutaraldehido (0.2%), permeabilizadas con
saponina (0.1%), bloqueadas con 3% de BSA e incubadas a 37 °C por 40 min,
con anti c Src (1 μg/ml) y con anti conejo conjugado a FITC (0.25 μg/ml).
Nuevamente se bloquearon con 1% de BSA, se adicionó anti Syk (0.5 μg/ml) y
con anti ratón conjugado a “rhodamine” (0.5 μg/ml). Los núcleos se tiñeron con
1µg/ml de DAPI. (A) SDS-PAGE 12% teñido con Commassie. Carril 1. Marcador
de peso molecular. 2. lisados control de CMNSP recién extraídas con Ficoll . 3.
CMNSP estimuladas con PHA-P, adheridas al plástico. 4. CMNSP estimulado
con PHA-P, en suspensión. 5. CMNSP cultivadas en DMEM con SFB pero sin
PHA-P. 6. CMNSP cultivas con PHA-P tratadas con PEG no sembradas en
hueso. 7, 8 y 9. CMNSP sin PEG en hueso por 1, 7 ó 14 días, respectivamente.
10, 11 y 12. CMNSP con PEG en hueso por 1, 7 ó 14 días. (B) inmunoblot para
c Src y Syk. (C, D y E) inmunofluorescencia de doble marcaje, para las CMNSP
con PEG y (F) sin PEG de 7 días. En los recuadros inferiores se observa los
núcleos (DAPI). Las barras corresponden a 250 µm.
113
Figura 15. Continuación.
Tra
tad
as c
on
PE
G
No
tra
tad
as c
on
P
EG
C
D
E
F
114
Figura 16. Co-inmunoprecipitación de c-Src y Syk en CMNSP. Los lisados
celulares totales (LCT) fueron obtenidos con el buffer HNTG y por sonicación.
500 μg/ml de proteína se incubó con 5 μg/ml de anti c-Src o de anti Syk, a 4 °C
toda la noche; se adicionó proteína A/G agarosa por 40 min. El
inmunoprecipitado (IP) se separó por SDS/PAGE al 12% (50 μg/ml/bolsillo). La
membrana transferida y bloqueda se incubó con anti Syk (0.025 μg/ml) para el
IP de c-Src. Otra membrana se incubó con anti c Src (0.025 μg/ml) para el IP de
Syk. Se adicionaron dos conjugados, primero un anti conejo con biotina (0.2
μg/ml) y posteriormente, con estreptavidina acoplada a peroxidasa (1µg/ml),
junto con anti conejo-HRP (2 μg/ml). Las bandas se detectaron primero por ECL.
A
B
115
______________________________________
Figura 16. Continuación.
Se retiraron los anticuerpos en un buffer disociador a 55 °C por 60 min. Se
incubaron con anti fosfotirosina (PY20, 0.2 μg/ml). El revelado se realizó con
amino-etil-carbazol 50mM. (A) co-IP de c-Src revelado con Syk y c Src (panel de
arriba). Co-IP de Syk revelado con c Src y Syk (panel del medio). Co-IP
revelada con PY20 (panel inferior). (B) Controles, IP con anticuerpos
irrelevantes: Carril 1. IP del LCT con anticuerpo primario no específico de
conejo. 2. IP del LCT con anticuerpo monoclonal anti neurofilamentos 200k Ab-1.
3. IP del LCT con proteína A/G agarosa. 4. IP del LCT con anti conejo. 5. IP del
LCT con anti ratón. 6. IP del LCT con 0.5 mg/ml de BSA.
116
1133.. DDIISSCCUUSSIIÓÓNN
La resorción de hueso es un proceso normalmente realizado por los
osteoclastos (OCls), los cuales proceden de células hematopoyéticas
pluripotenciales del linaje monocito/macrófago 5, 10, 11, 12, 14. De hecho, en los
estudios de diferenciación y función de OCls, los progenitores celulares
hematopoyéticos de bazo y médula ósea son los más ampliamente utilizados12,
14, 18, 22. Además, los procesos de diferenciación osteoclastogénica in vivo e in
vitro se han asociado con un incremento y activación de la población de
linfocitos T 12, 14, 18, 119. Por lo cual, en algunos modelos para la generación de
OCls se utiliza una mezcla de células mononucleares de sangre periférica
(CMNSP) 40, 93, 145, 214, en donde al estimular la proliferación de linfocitos T, con
1.5 a 5 μg/ml de fitohemaglutinina (PHA) se puede inducir in vitro la
diferenciación de monocitos a OCls 18, 90, 118. Sin embargo, este modelo es solo
descriptivo, ya que determina la morfología celular de los OCls, pero no
muestran la cuantificación de la actividad resortiva, ni establece una relación con
el número de monocitos utilizados para la diferenciación osteoclastogénica 90.
De otro lado, Manrique y Guerrero, 2007, diseñaron un nuevo modelo in vitro,
para inducir la formación de células con capacidad resortiva a partir de la fusión
con polietilenglicol (PEG) de CMNSP de individuos normales. En este modelo
antes de realizar la fusión, las CMNSP son estimuladas con PHA por 72 horas 1.
Sin embargo, la evaluación de las poblaciones presentes en la mezcla de
CMNSP después del estímulo con PHA no se realizó; ni se caracterizó el
fenotipo policarión, o el arreglo de la actina, la expresión de proteínas asociadas
con la formación de estructuras de actina, así como la presencia de marcadores
osteoclastogénicos, tampoco se determinó la posible relación de estas
características con la actividad resortiva.
Por esta razón, inicialmente se analizó la concentración de PHA, que permitiera
un incremento en el número de células y agregación celular, requerida para
facilitar la fusión con PEG. Los resultados indicaron que entre 5 a 30 µg/ml de
PHA-P, se podía obtener una adecuada proliferación celular (dato no mostrado).
117
No obstante, una mayor proliferación celular se determinó después de 72 horas
de cultivo, cuando se usó 30 µg/ml de PHA-P (Figura 4C). Estos hallazgos
concuerdan con los descritos en CMNSP de neonatos y adultos con 1 μg/ml de
PHA-P129, y en CMNSP de individuos normales, estimuladas con
concentraciones por encima de 20 μg/ml de PHA-P134. Sin embargo, en
nuestros resultados se evidenció que la proliferación celular dependía no de la
concentración de PHA, sino del tiempo de estimulación. La misma tendencia en
la proliferación celular se observó en los cultivos sin estímulo con PHA, pero en
una menor proporción respecto a los cultivos con PHA (Figura 4C).
A la vez, se evaluaron las poblaciones celulares presentes en las CMNSP,
antes del tratamiento con PEG; para ello, se realizó un análisis de FACS,
identificando los antígenos de superficie relacionados con la formación de
células osteoclasticas, como CD4, CD8, CD13 y CD14 14, 41, 98, 107, 113, 125, 133, 207,
215. La evidencia experimental mostró que los linfocitos T CD4+ representan la
mayor población y en menor porcentaje las células adherentes
monocito/macrófago CD14+ y las células de linaje mielomonocito/dendrítico
CD13+ (Figura 4A). Los anteriores resultados son similares a lo reportado en
CMNSP de individuos normales estimuladas con PHA122, 130. Además, se
observó una mayor presencia de la población CD4+CD8- , comparado con lo
encontrado con las células CD4+CD13+ (Figura 4B). Las mismas poblaciones
hematopoyéticas fueron encontradas en la mezcla de CMNSP estimuladas con
5, 10 ó 20 μg/ml de PHA (dato no mostrado). La presencia del marcador CD13 y
CD14 en las CMNSP estimuladas con PHA-P, sugiere que existen poblaciones
reportadas como precursores in vitro de las células similares a OCls 212, como
son las células mielomonocito/dendríticas133 CD13+ y los monocitos CD14+ 39, 40,
41,88, 214.
Además, la presencia de linfocitos T CD4+ podría deberse a que la PHA es
presentada como un antígeno a estos linfocitos T 130, 131,132, en el contexto del
complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC-II)130, 131 de los monocitos
CD14+. Además, se sugiere que por medio de este mecanismo se induce,
118
probablemente, la activación de los linfocitos T CD4+ 131,132, 135; lo anterior,
explicaría porque después de 48 horas de estímulo las células de los cultivos
con PHA se presentaron en forma de rosetas123, 130, 131, 132 colocadas sobre las
células adherentes al plástico.
Cuando se analizó la viabilidad de las CMNSP antes o después del tratamiento
con PEG, con azul tripan y MTT, se encontró que las CMNSP estimuladas o no
con PHA-P, sin PEG, no pierden su integridad de membrana, por ende son
viables durante los diferentes tiempos de cultivo (Figura 5A). Lo cual sugiere
que, el método de extracción y la estimulación con PHA no tiene un efecto en la
viabilidad de las CMNSP. Pero, cuando las CMNSP estimuladas con PHA-P
fueron tratadas con PEG, presentaron una disminución en su actividad
reductasa mitocondrial y su integridad de membrana (Figura 5B y C); la pérdida
de la actividad reductasa mitocondrial continuó sobre hueso; aunque, entre 1 y 7
días de incubación en hueso la actividad reductasa mitocondrial se mantuvo
constate, pero, si disminuyó a los 14 días (Figura 5D). Así mismo, al evaluar la
morfología nuclear (por medio de la tinción con Hoechst y DAPI), se observaron
algunos núcleos condensados, picnóticos y fragmentados 210, de característica
apoptótica230. Entonces, la frecuencia en la pérdida de la actividad reductasa
mitocondrial y la presencia de núcleos fragmentados y picnóticos, se hizo más
evidente al aumentar el tiempo de incubación en hueso, (Figura 5D, E y F). Los
anteriores hallazgos sugieren que: el tratamiento con PEG tiene un efecto en la
actividad reductasa mitocondrial, por ende se ve afectada la viabilidad de las
CMNSP en presencia del PEG, antes de sembrarlas en hueso; lo cual, podría
estar relacionado con los tiempos usados en el tratamiento con PEG 1, 30, 140 o
una mala dilución del PEG 140, 141. Además, la pérdida de esa viabilidad a medida
que transcurre el tiempo de incubación, podría indicar que, las CMNSP tratadas
con PEG presentan una vida media corta, cuando se siembran en hueso. Como
se ha descrito para las células similares a OCls 32, 58, 183, 198, 210; las cuales
presentan una vida media entre 2 y 5 días, en donde se encuentra un alto
número de núcleos fragmentados, a medida que transcurre el tiempo de
incubación en hueso.
119
Por otro parte, se correlacionó el número de CMNSP y el volumen de PEG44, 140,
141, 198 necesarios para inducir un fenotipo policarión1 y actividad resortiva. Los
resultados mostraron que a partir de 8 x 105 CMNSP/ml y 50 µl de PEG se
pueden obtener células multinucleares en hueso y vidrio, así como una alta
resorción en hueso (Figura 6B y C). Lo anterior, sugiere que el tratamiento con
PEG puede inducir la formación de células multinucleares y la pérdida de
hueso1, 30, similar a lo descrito con CMNSP estimuladas con otros factores
osteoclastogenicos o calciotropicos 40, 41, 88, 93, 97, 124, 145, 212. Así mismo, al utilizar
aproximadamente 8 x 105 CMNSP/ml tratadas con PEG, sembradas sobre
hueso e incubadas por 1, 7 ó 14 días, se determinó que la actividad resortiva fue
mayor durante los primeros 7 días de incubación, manteniéndose constante, sin
un aumento representativo hasta los 14 días (Figura 7B). Por lo cual, se puede
indicar que la actividad resortiva no es constante, sino que tiene un predominio,
después de las 24 horas post-fusión con PEG, alcanzando su mayor incidencia
en el día 7 y se mantiene sin cambios, hasta el día 14; probablemente, porque
hay una disminución en la viabilidad de estas células adheridas a hueso, como
antes se mencionó (Figura 5D y 7B).
Los resultados anteriores, son similares a los obtenidos con CMNSP sembradas
en hueso estimuladas con 50 ng/ml RANKL por 2 a 5 días 100 (Figura 14E y F).
También se ha reportado, que las CMNSP de individuos normales cultivadas con
50 ng/ml de RANKL y de M-CSF por 14 días 41, presentan una actividad
resortiva después de 2 días de cultivo en hueso. Ante esto, también se puede
indicar que el modelo con PEG, permite obtener células con capacidad
resortiva, en igual tiempo que en los modelos tradicionales in vitro donde se
utilizan citocinas como RANKL y MCSF, pero, de una forma directa sin el uso o
influencia de estas citocinas. Además, la formación de grandes lagunas de
resorción y la alta actividad resortiva por parte de las CMNSP estimuladas con
PHA-P y tratadas con PEG son comparables a la realizada con las CMNSP en
huesos estimulados con 50 ng/ml de RANKL 13, 100 (Figura 14 H).
120
Por otra parte, como el grupo control (CMNSP estimuladas en PHA-P no
tratadas con PEG) presentó actividad resortiva; aunque, menor a la obtenida con
las CMNSP estimuladas con PHA y tratadas con PEG (Figura 7B); se decidió
analizar, si el estímulo con PHA-P influye en la actividad resortiva de las CMNSP
de individuos normales. Para ello, se utilizaron CMNSP recién extraídas con
Ficoll no cultivadas y tratadas con PEG (Figura 13). Nuestros resultados
indicaron que el PEG per se puede inducir un arreglo de la actina y la actividad
resortiva; sin embargo, la PHA-P podría tener un efecto en estos eventos. (Figura
13). No obstante, al encontrarse una actividad resortiva en los controles (sin PEG
y no estimulados con PHA-P), se sugiere que el estímulo con PHA y el
tratamiento con PEG, no son necesarios para inducir una actividad resortiva en
las CMNSP 41, 98. Sin embargo, esta actividad puede ser mayor cuando las
células son estimuladas con PHA y tratadas con PEG. Entonces, se sugiere, que
la presencia de la PHA, al permitir un mayor contacto entre las CMNSP por su
presentación como antígeno, podría facilitar que las membranas celulares se
fusionen más fácilmente con PEG118 y al activar los linfocitos T CD4+ 90, ayudaría
así a incrementar y mantener la función resortiva de las CMNSP en el tiempo118.
Los efectos del estímulo con PHA en la resorción han sido descritos en OCls extraídos de
huesos de ratones adultos, en donde un incremento en el número de OCls y en la
actividad resortiva, ha sido asociado a la presencia de la PHA118.
Así mismo, en los OCls ha sido descrita la expresión y actividad de marcadores
osteoclastogénicos229 como la enzima anhidrasa carbónica II (CAII) 222, 227,
ATPasa vacuolar VI – H+ (ATPC1) 218, la integrina αvβ3 (IB3) 34, 37, 38, 55, 64 , el
receptor de calcitonica (RC) 216, 217, 221, catepsina K (CK) 7, 182, 223, el receptor
Rank (R)19, 88 y la enzima TRAP 41,107, 207. Los ensayos para observar la
expresión de estos marcadores osteoclastogénicos (inmunofluorescencia y
citoquímica), permitieron determinar que las CMNSP estimuladas con PHA y
tratadas con PEG, pueden expresar estos marcadores osteoclastogénicos
(Figura 8 y 9). Contrario a lo observado con las células control, la enzima TRAP
estuvo presente en las CMNSP sin PEG, pero en menor proporción a lo hallado
121
en las CMNSP tratadas con PEG. Lo cual, se debe a que los monocitos de
sangre periférica expresan esta enzima229. Por ende, se sugiere que TRAP no
sea utilizado como un marcador único para osteoclastos.
Cuando se relacionó la expresión de estos marcadores con la función resortiva,
se encontró que las CMNSP en el día 1 de incubación, expresaron la enzima
ATPC1, la enzima CK, los receptores RANK y de calcitonina. Además, en el
tiempo donde se presentó una mayor actividad resortiva (7 días), se observó la
expresión de las enzimas CAII, la subunidad C1 de la ATPasa, la enzima CK, la
subunidad β3 de la integrina αvβ3 y el receptor de calcitonina; pero, no se
observó la expresión del receptor RANK (Figura 8). Además, las CMNSP
estimuladas con PHA, tratadas con PEG se observaron como células
multinucleares con actividad de la enzima TRAP, durante los diferentes días de
la actividad resortiva, siendo mayor a los 7 días, donde ocurrió la máxima
actividad resortiva (Figura 7A y B). La expresión de estos marcadores en células
con capacidad resortiva ha sido reportada para las células similares a OCls in
vitro 79, 178, 182, 212, 217, 219, 224, 227, 228.
Sin embargo, no es posible afirmar que las CMNSP con PEG hacen su resorción
ósea por medio de la acción de estos marcadores osteoclastogénicos, ya que no
se realizaron ensayos de inhibición enzimática o de receptor-ligando, como por
ejemplo, ensayos donde se utilicen antibióticos como bafilomicina A1238,
concanamicina A238, acetazolamida240 que bloquean la actividad de enzimas
como la ATPC1 y la CAII, o ensayos con agonistas parciales y antagonistas para
el receptor de calcitonina, RANK, catepsina K y la integrina αvβ378, 220, 239 o la
inhibición de la expresión con RNAs de interferencia (siRNA) u
oligodesoxinucleotidos antisentido sobre catepsina K237.
Otra punto importante, en la morfología de las células con capacidad resortiva es
la presencia de filipodios, bordes de cepillo118, 231, además, de que han sido
descritas como células de gran tamaño y multinucleares 73, 86, 95, 120, 149. Por lo
cual, se analizó si las CMNSP tratadas con PEG presentaban estas
características morfológicas. Para ello, a un grupo de CMNSP estimuladas con
122
PHA y tratadas con PEG se les evaluó la expresión de la glicoproteína
aminopeptidasa N CD13 127, 133, por inmunofluorescencia directa, y a otro grupo
se le analizó por microscopia electrónica de barrido (SEM), la presencia de estas
estructuras morfológicas. Los hallazgos experimentales permitieron determinar
que las CMNSP expresan el marcador osteoclastogénico CD13 y la microscopía
electrónica de barrido, permitió observar que las CMNSP estimuladas con PHA
al ser tratadas con PEG, se presentan agregadas en los primeros días de
incubación en hueso (Figura 9 y 10), pero, al transcurrir el tiempo de incubación
pueden alcanzar tamaños cercanos a las 100 µm (Figura 9 y 10),
presentándose como “células gigantes”, extendidas sobre la superficie ósea
(Figura 10E), con una membrana discontinua en algunas partes, pero, continua
en otros lugares, lejanos a las extensiones de membrana; así mismo estas
extensiones se presentaron en forma de filipodios y borde de cepillo o “ruffle”,
localizados hacia la superficie de la matriz ósea (Figura 10); además, por debajo
de estas extensiones de membrana se observaron huecos y en lugares alejados
del borde de cepillo o filipodios se observaron protuberancias (Figura 10). Estas
características morfológicas se han reportado en células similares a OCls in vitro
sobre hueso 178,231, 232, 233, 234
Aunque, se ha reportado que los macrófagos presentan membranas
discontinuas y realizan resorción ósea198, pero en menor proporción y con
lagunas de resorción más pequeñas que las formadas por OCls198; se puede
indicar que en este modelo con PEG, se descarta la posibilidad de que las
“células gigantes” observadas por inmunofluorescencia y SEM, puedan ser
macrófagos policarionicos, debido a que, la expresión de marcadores como
catepsina K182, anhidrasa carbónica II y ATPasa vacuolar H+, relacionado con
la actividad resortiva en OCls212, no han sido reportadas en macrófagos 229.
Además, las áreas de resorción o lagunas formadas por las CMNSP fusionadas
con PEG son similares a las realizadas por las CMNSP sembradas y
estimuladas con 50 ng/ml de RANKL100 (Figura 14H).
123
Por otra parte, la formación de “células gigantes” con prolongaciones de
membrana no se observó en las CMNSP estimuladas en PHA-P y sin tratar con
PEG (Figura 10H e I); así mismo, estas CMNSP a los 14 días de cultivo no
expresaron CD13 (Figura 9), ni se encontraron extendidas sobre la superficie
ósea (Figura 10J), pero, si se observaron como “células gigantes” con
membranas rugosas a este tiempo (Figura 10J).
Lo anterior, sugiere que la formación inicial de agregados celulares y
posteriormente de “células gigantes” se debe a las dos funciones del PEG 168, 169,
170, como son la de agregar las células, cuando extrae el agua entre las
membranas y la de aumentar la fuerza osmótica, generando la fusión de las
membranas celulares. Sumado a esto, el estímulo con PHA, junto con la
capacidad de adherencia que existe entre los leucocitos 140,141, 142, 208, permitiría
generar un buen contacto entre las CMNSP, pero no el suficiente para formar
rápidamente “células gigantes”, ya que se requiere de periodos mayores a 7 días
para observar este fenotipo (Figura 10J), por lo cual, se requiere de la presencia
de un fusógeno como el PEG para formar estas células. Entonces, se podría
indicar que en la generación de “células gigantes” existe un efecto cooperativo
entre la PHA-P y el PEG, el cual en solo 7 días, permitiría observar un fenotipo o
morfología similar a la descrita en las células osteoclastogenicas 73, 86, 95, 120, 149,
muy diferente a lo observado en los cultivos solo estimulados con PHA90. Este
efecto cooperativo en la fusión celular ha sido reportado, en células de sangre
periférica estimuladas con PHA-P213 y fusionadas con bajas concentraciones de
PEG de pesos moleculares bajos. Por ende, se sugiere que el PEG podría
potencializar el contacto célula-célula dado por la PHA 208, 212. No obstante, se
duda que solo el estímulo con PHA-P estaría colaborando con la formación de
“células gigantes”, ya que en los ensayos con CMNSP no cultivadas con PEG
sembradas en hueso, VN o CTI en presencia de SFB, también se observaron
células agregadas o de gran tamaño; por lo cual, se podría hipotetizar, que el
contacto con componentes de matriz ósea y del SFB, así como la capacidad de
adherencia entre los leucocitos 208 estarían ayudando a la formación de células
de gran tamaño, después del tratamiento con PEG (Figura 13).
124
Otro aspecto importante para el uso de la PHA en la fusión con PEG, se debe a
que se ha reportado que la presencia de esta lectina, puede reducir la
citotoxicidad de este polímero dentro de la fusión213, lo cual, explicaría el porque
las CMNSP tratadas con PEG se mantienen viables después de 2 hs post fusión
y durante los primeros días de incubación en hueso (Figura 5B y D).
Por otra parte, se ha descrito que las células con actividad resortiva o similares a
OCls, presentan por encima del sitio de resorción, zonas de adherencia, en las
cuales se han observado filipodios, bordes de cepillo y se encuentra polarizada
la actina 62, 178, 225; esta morfología ha sido relacionada con la polarización de la
células osteoclástica, en donde se observa un arreglo de la actina en estructuras
llamadas podosomas, anillos, cinturones de actina o zonas de sellado 68, 75, 183.
Por lo cual, se evaluó si el tratamiento con PEG induce un arreglo de la actina en
las CMNSP, para ello, se realizó una inmunofluorescencia indirecta con un
anticuerpo monoclonal contra actina y un anticuerpo conjugado a FITC o
“rhodamine” (Figura 11). Los resultados permitieron observar que las CMNSP
tratadas con PEG adheridas a matriz ósea presentan en el día 1 de incubación,
una acumulación homogénea de la actina; ya en el día 3 se observaron puntos o
“dot-like” de actina, así como nubes o “cloud” de actina; en los días 5, 7 y 9 de
incubación se presentaron podosomas, anillos de actina y una polarización de la
actina hacia la periferia de las “células gigantes”, que permitió observar la
formación de cinturones de actina y zonas de sellado (Figura 11).; en el día 14
se observó una disminución en este arreglo de la actina (Figura 11). Estos
resultados son similares a los ya descritos en OCls obtenidos in vitro, a partir de
co-cultivos en hueso de monocitos CD34+ o CD40+ o CD14+ con linfocitos T o
por la mezcla de células mononucleares de sangre periférica, estimulados con
RANKL o con IL1 58, 100, 121.
Respecto al tiempo de formación de estas estructuras de actina, los anteriores
resultados son similares a los reportados en OCls in vitro, después de 4 y 5
días de haber sido originados de precursores hematopoyéticos de médula ósea
125
de ratones BALB/c, o de huesos largos de conejo o de células RAW 264.7,
diferenciadas con 20ng/ml RANKL y de M-CSF 32, 110, 177, 179, 180.
Así mismo, cuando las CMNSP con PEG se sembraron sobre CTI y VN,
también se observó “células gigantes” expandidas sobre estas matrices
extracelulares, en donde se presentó la formación de nubes y cinturones de
actina, así como de podosomas, con sectores donde se observó una
polarización de la actina, durante los 14 días de cultivo. (Figura 12D y E).
Entonces, la expansión de estas CMNSP con PEG sobre algunas matrices
extracelulares y hueso, sugiere que esa expansión y adherencia puede deberse
a la formación de podosomas80, 82, 184, 186, 190, 194, 191, 192; aunque, se ha reportado
que esas estructuras no son mediadoras de la actividad resortiva, pero, se
generan antes de realizar la actividad resortiva73, 80, 184, 236. Así mismo, se
sugiere que esta expansión y adherencia se daría por el reconocimiento que
tiene el receptor de vitronectina o integrina αvβ3 79, expresado en las CMNSP
tratadas con PEG (Figura 8D), por las proteínas extracelulares como VN y CTI;
al igual, los eventos de reconocimiento de esta integrina por la VN o el CTI, han
sido descritos para las células similares a OCls in vitro 68, 80, 82, 184. Sin embargo,
en este proyecto no se evaluó los mecanismos moleculares de expansión y
adherencia usados por las CMNSP con PEG, por lo cual no se puede afirmar la
función de la integrina αvβ3 en estas células.
Por otra parte, estos podosomas no se presentaron en las CMNSP adheridas a
PLL (Figura 12B). En concordancia con estas observaciones, se ha reportado
que las células similares a OCls murinos, obtenidas a partir de co-cultivo de
osteoblastos y células de médula ósea sobre VN, CTI182 y en presencia de SFB 184 presentan podosomas y cinturones de actina, pero no los forman sobre
PLL184. No obstante, en las CMNSP tratadas con PEG sembradas en SFB,
únicamente se presentaron podosomas en los primeros días del cultivo (Figura
12C). Lo anterior, podría deberse a los factores de adherencia que contiene el
SFB, como es la VN y la fibronectina 184, 187, 188. Cuando las CMNSP con PEG
se sembraron sobre vidrio (LSR) presentaron podosomas a 1 y 7 días de
incubación, pero, a los 14 días se mostraron disgregadas, sin ningún arreglo de
126
la actina (Figura 12A). Esto mismo ha sido observado en OCls in vitro,
obtenidos de monocitos de sangre periférica sembrados en vidrio y estimulados
con RANKL y MCSF, por 2 ó 4 días 32, 100, 177, 185, 187.
Contrario a lo anterior, las CMNSP sin PEG (grupo control) no presentaron un
arreglo de la actina en hueso o matriz extracelular (Figura 111 y 12).
Ante la pregunta si el arreglo de la actina en las CMNSP tratadas con PEG se
asocia a la actividad resortiva (Figura 11), se realizó un ensayo con CMNSP
desprovistas de SFB o tratadas con colchicina por 24 horas, encontrándose, que
estas CMNSP, así se traten con PEG, no forman zonas de sellado o
podosomas, pero, si se presenta una distribución o acumulación homogénea de
la actina intracelularmente; además, las CMNSP se encontraron disgregadas y
con tamaños relativamente menores a lo observado con las CMNSP cultivadas
en presencia de SFB y estimuladas con PHA-P (Figura 11); así mismo, el
porcentaje de células desprendidas de la lámina de hueso fue alto, comparado
con las CMNSP estimuladas con PHA-P tratadas con PEG. Lo anterior, sugiere
que las CMNSP al entrar en fase Go, debido a la deprivación de SFB, no
presentan un arreglo de la actina, como ya ha sido reportado en otros tipos
celulares241, 242. Sumado a esto, se sugiere que la despolimerización de los
microtubulos altera el arreglo de la actina, por lo cual, probablemente en la
formación de zonas de sellado o podosomas es importante la polimerización de
los microtubulos 67, 185. Lo anterior ha sido descrito en células similares a OCls180
cultivadas con la hormona paratiroidea (PHT), por 48 h y con colchicina 10-6 M
por 24, 48 ó 72 horas191. También, se ha observado que estas estructuras no se
forman en células similares a OCls, después del tratamiento con nocodazol (0.2
µM) 190.
Al comparar el arreglo de actina en las CMNSP tratadas con PEG con su
actividad resortiva, se encontró, que el tiempo donde se presentó los podosomas
y zonas de sellado, coincide con el periodo donde se encontró la máxima
actividad resortiva (Figura 11A y C), Lo anterior, fue corroborado, cuando se
bloqueó la formación de estas estructuras de actina con la sincronización en
fase Go y la inhibición de la polimerización de los microtubulos (Figura 11A y C).
127
La formación dinámica de la actina, es decir, la generación de podosomas y
zonas de sellado, durante el proceso de resorción ha sido descrita en OCls in
vitro177, 178, 182, 184, 186, 192.
Lo anterior, sugiere que en las CMNSP tratadas con PEG, la formación de zonas
de sellado y la polimerización de los microtubulos podrían estar relacionados con
la actividad resortiva.
Por otra parte, al observar que en ausencia del estímulo con PHA-P se presenta
actividad resortiva, se decidió evaluar si la PHA influye en el arreglo de la actina
de las CMNSP. Entonces, los resultados con CMNSP no cultivadas y sin
tratamiento con PEG permitieron determinar que en ausencia de PHA, se
presentan podosomas, anillos de actina y zonas de sellado sobre hueso, CTI,
SFB y VN (Figura 13A). Lo mismo, se observó en las CMNSP no cultivadas,
tratadas con PEG, sembradas sobre vidrio con SFB, CTI y VN (Figura 13A, d, e
y f) Al comparar, la formación de esas estructuras con la actividad resortiva, se
sugiere que la resorción ósea realizada por las CMNSP en ausencia de PHA,
estaría asociada con la presencia de estas estructuras de actina (Figura 13). Al
observar que en todos los ensayos se presentaron células agregadas y de gran
tamaño, se sugiere que cuando se acercan o agregan las CMNSP, sin importar
el mecanismo, se induce la formación de podosomas o zonas de sellado.
Como, RANKL, regula la diferenciación osteoclastogénica, junto con M-CSF 13, y
esta citocina de la familia TNFα se encuentra asociada con la proteína de fusión
DC-STAMP 148, 149 durante la fusión de progenitores osteoclasticos para obtener
OCls maduros; y al ver que, el polietilenglicol (PEG) es una agente fusogénico
que permite obtener células con capacidad resortiva1, 30, se evaluó el efecto del
PEG en la actividad resortiva y en el arreglo de la actina, en las CMNSP
inducidas a diferenciación osteoclastogénica con RANKL. En este trabajo, las
CMNSP cultivadas inicialmente con 40 ng/ml de RANKL por 48 h, tratadas con
PEG y sembradas en hueso, no presentaron un arreglo de la actina, además,
mostraron núcleos fragmentados y condensados, y no realizaron resorción ósea
(dato no mostrado); la formación de podosomas o zonas de sellado tampoco se
128
observó en las CMNSP cultivadas en DMEM, SFB, tratadas con PEG,
sembradas en hueso y cultivadas con 50 ng/ml de RANKL100 (Figura 14). Caso
contrario, se observó en el modelo tradicional propuesto por Pfaff (2001), en
donde la formación de podosoma se da en las CMNSP sembradas en hueso y
estimuladas con 50 ng/ml de RANKL100, en ausencia de PEG (Figura 14). Estos
resultados sugieren que la presencia de ambas moléculas, PEG y RANKL,
afecta la formación de podosomas y por ende la actividad resortiva. Similar a lo
descrito con macrófagos J744 y U937/A fusionadas con PEG30. Entonces, se
sugiere que el PEG podría desencadenar eventos similares a los observados
con la citocina RANKL 148,149, para la obtención de células similares a OCls in
vitro.
Se ha descrito que la tirosina cinasa no receptora c-Src 45, 47, 48, 50 y la tirosina
cinasa Syk 101, 102, 103, 104, 204, 205 se asocian con la activación de células
fagocíticas 56, la adherencia 34, 57, arreglo de la actina 58 y la resorción ósea en
células semejantes a OCls 37, 49, 51, 52 55, 57, 65, 102, 106; por esto, se analizó si las
CMNSP tratadas con PEG expresan c-Src y Syk por inmunofluorescencia e
inmunoblot. Los resultados indicaron que las CMNSP estimuladas con PHA-P y
tratadas con PEG, expresan las cinasas c-Src y Syk, al igual que las CMNSP no
tratadas con PEG (Figura 15). Mientras que las CMNSP no sembradas en hueso
no presentan la expresión de estas dos cinasas. Los resultados nos indicaron
que las CMNSP estimuladas en PHA-P expresan las cinasas c-Src y Syk. Estos
resultados sugieren que estas dos cinasas en las CMNSP se expresan durante
la adherencia a matriz ósea, como ya ha sido descrito en células similares a
OCls 37, 56, 63, 64, 101, 103, 104, 106, 204, 205. La localización en las CMNSP tratadas con
PEG de Syk y c-Src se observó en áreas contiguas y hacia la periferia de las
“células gigantes” a los 7 días e intracelularmente a 1 y 14 días. (Figura 15). Lo
anterior es similar a lo encontrado en células similares a OCls 37, 52. Ante los
resultados de la localización contigua, se decidió evaluar si c-Src y Syk se
encuentran asociadas en las CMNSP. Para ello, se realizó una co-
inmunoprecipitación, con los lisados de las CMNSP con PEG y del grupo control.
Los hallazgos determinaron que las CMNSP con PEG presentan una posible
129
asociación entre c-Src y Syk durante la adherencia a hueso; mientras que en las
CMNSP sin PEG no se presentó esta asociación (Figura 16). Además, en este
modelo con PEG para el día 1 y 7 de adherencia a hueso, se sugiere que c-Src
puede estar asociada a Syk a través del domino SH3 de esta cinasa, debido a
que este es el sitio de unión del anticuerpo, mientras que en el día 14 podrían
estas dos cinasas asociarsen por otro dominio diferente a SH3, por lo cual no se
observó en el blot la co inmunoprecipitación entre ellas. Así mismo, Syk y c-Src
solo se encontraron fosforiladas en sus tirosinas, durante el día 7 de adherencia
a hueso, tiempo en el cual se presentó la máxima actividad resortiva. En
conjunto, estos resultados sugieren al tratar con PEG las CMNSP se adhieren al
hueso, expresando c Src y Syk, permitiendo observar una forma activa de las
dos cinasas (fosforilación) a los 7 días, tiempo en el cual, estas proteínas al
parecer formando un complejo (co-inmunoprecipitación).
Al realizar una comparación entre el tiempo en donde se observó la expresión y
localización de Syk y c-Src, con el tiempo en el cual se presentó la mayor
actividad resortiva y un arreglo de la actina, se sugiere, que a los 7 días de
adherencia a hueso, las CMNSP tratadas con PEG posiblemente expresan
simultáneamente Syk y c-Src, forman cinturones de actina y zonas de sellado,
siendo estos eventos paralelos con la máxima actividad resortiva 51, 52, 55, 57, 65,
102, 106., similar a lo descrito en OCls, obtenidas de médula ósea, cultivados con
100 ng/ml de RANKL y 26 ng/ml de M-CSF por 5 días sobre dentina 37.
Los resultados del presente trabajo sugieren que el tratamiento con PEG puede
inducir a que las CMNSP de individuos normales, presenten características
similares a las reportadas para las células con capacidad resortiva, como son
marcadores de superficie celular, arreglos de actina, expresión, fosforilación de
c-Src y Syk. Por lo cual, podemos proponer que las CMNSP tratadas con PEG
tienen una actividad similar a las células con capacidad resortiva, conocidas en
la literatura como “osteoclast-like” o células similares a OCls.
130
CCOONNCCLLUUSSIIOONNEESS
1. El tratamiento con PEG per se puede inducir en las CMNSP características
fenotípicas que han sido descritas en las células similares a osteoclastos in
vitro o “osteoclasts like”, como es la generación de células de gran tamaño,
multinucleares, con filipodios, bordes en cepillo, que expresan marcadores
osteoclastogénicos como ATPasa vacuolar, anhidrasa carbónica II, fosfatasa
ácido resistente a tartrato (TRAP), catepsina k, el receptor de calcitonina, el
receptor RANK y la subunidad β3 de la integrina αvβ3.
2. La alta actividad resortiva de las CMNSP fusionadas puede estar asociada a
un efecto cooperativo entre el PEG y la PHA, ya que, el estímulo con PHA
permitiría mantener viables a las CMNSP y tener en la mezcla de células
fusionadas, linfocitos T CD4+, monocito/macrófago CD14+ y células
mielomonocito/dendríticas CD13+, que han sido relacionados con los
procesos de diferenciación osteoclastogénica y resorción ósea.
3. La formación de podosomas, anillos, cinturones de actina y zonas de sellado
en las CMNSP, podría deberse a la fusión con PEG, por los componentes de
matriz ósea y extracelular, así como por la polimerización de los
microtubulos, lo cual permitiría la adherencia y expansión celular, necesaria
para la actividad resortiva, tal como se ha descrito para células similares a
osteoclastos in vitro.
4. La expresión de c Src y Syk en CMNSP fusionadas con PEG podría
asociarse con los procesos de adherencia, expansión, formación de zonas de
sellado y una alta actividad resortiva, como se ha descrito en las células
similares a osteoclastos in vitro.
5. El tratamiento con PEG en las CMNSP, podría inducir efectos similares a los
descritos para RANKL, dando así origen a células fusionadas de gran
tamaño, con características fenotípicas y con función resortiva; entonces, el
modelo de fusión con PEG permitiría estudiar eventos moleculares asociados
con la fusión celular y diferenciación osteoclastogénica, en tiempos más
cortos, a lo que pueden ofrecer algunos modelos tradicionales, donde se
131
usan co-cultivos celulares, con citocinas y factores calciotropicos; lo cual,
hace que el modelo con PEG sea económico y viable de usar en los estudios
de resorción in vitro.
132
15. BIBLIOGRAFIA
1. Manrique E. 2007. Evaluación del efecto de fármacos anti-resortivos en el fenotipo y actividad resortiva de células mononucleares de sangre periférica fusionadas con polietilenglicol. Tesis. Facultad de medicina. Universidad Nacional de Colombia.
2. Soriano, P., Montgomery, C., Geske, R., and Bradley, A. 1991. Targeted disruption of the c-Src proto-oncogene leads to osteopetrosis in mice. En: Cell. Vol. 64, no. 4,. p. 693-702.
3. Gupta, A. et al. 2003. Leupaxin is a critical adaptor protein in the adhesion zone of the osteoclast. En: J. Bone Miner. Res. Vol. 18, no. 4,. p. 669-685.
4. Spinardi. L., and Marchisio, P.C. 2006. Podosomes as smart regulators of cellular adhesion. En: Eur J Cell Biol. Vol. 85, no. 3-4,. p. 191-194
5. Monologas, S. 2000. Birth and Death of bone cells: Basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis. En: Endocrinology rev. Vol. 21, no. 2,. p. 115 - 137.
6. Frost, H. M. 1973. Bone remodeling and its relationship to metabolic bone disease. Ed Charles C. Thomas. Springfield, MA.
7. Bossard, M.J. et al. 1996. Proteolytic activity of human osteoclasto cathepsin k expression, purification, activation and substrate identification. En: J Biol chem. Vol. 271, no. 21,. p. 12517 -12524.
8. van den Bos, T., Speijer, D., Bank, R. A. , Brömme, D., and Everts, V. 2008. Differences in matrix composition between calvaria and long bone in mice suggest differences in biomechanical properties and resorption: Special emphasis on collagen. En: Bone. Vol. 43, no. 3,. p. 459-468.
9. Ek-Rylander, B. et al. 1994. Dephosphorylation of osteopontin and bone sialoprotein by osteoclastic tartrate-resistant acid phosphatase. Modulation of osteoclast adhesion in vitro. En: J Biol Chem. 269, no. 21,. p. 14853-14856.
10. Orcel, P., and Roux, S. 2000. Bone loss. Factors that regulate osteoclast differentiation: an update. En: Arthritis Res. Vol. 2, no. 6,. p. 451–456
11. Suda, T. et al. 1990. Origin of osteoclasts: mature monocytes and macrophages are capable of differentiating into osteoclasts under a suitable microenvironment prepared by bone marrow-derived stromal cells. En: Proc. Natl Acad. Sci. USA. Vol. 87, no. 18,. p. 7260-7264.
133
12. Kahn, A.J. et al. 1983. Induction of monocytic differentiation and bone resorption by 1,25-dihydroxyvitamin D3.En: Proc. Natl Acad. Sci. USA. Vol. 80, no. 19,. p. 5907-5911.
13. Boyle, W. J. 1998. Osteoprotegerin ligand Is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. En: Cell. Vol. 93, no. 2,. p. 165–176.
14. Udagawa, N. 2003. The mechanism of osteoclast differentiation from macrophages: possible roles of T lymphocytes in osteoclastogenesis. En: J Bone Miner Metab. Vol. 21, no. 6,. p. 337–343
15. Ishimi, Y., Abe, E., Jin, C.H., Miyaura, C., Hong, M.H, Oshida, M., Kurosawa, H., Yamaguchi, Y., Tomida, M., and Hozumi, M. 1992. Leukemia inhibitory factor/ Differentiation-stimulating factor (LIF/D-Factor): regulation of its production and possible roles in bone metabolism. En: J. Cell Physiol. Vol. 152,. p. 71–78.
16. Kong, Y. Y., Yoshida, H., Sarosi, I., Tan, H.L., Timms, E., Capparelli, C., Morony, S., Oliveira-dos-Santos, A.J., Van, G., Itie, A., Khoo, W., Wakeham, A., Dunstan, C.R., Lacey, D.L., Mak, T.W, Boyle, W.J, and Penninger, J.M. 1999. OPGL is a key regulator of osteoclastogenesis, lymphocyte development and lymph-node organogenesis. En: Nature. Vol. 397, no 6717,. p. 315–323.
17. Wong, B. R. et al. 1997. TRANCE is a novel ligand of the tumor necrosis factor receptor family that activates c-jun N-terminal kinase in T cells. En: J. Biol. Chem. Vol. 272, no. 40,. p. 25190- 25194.
18. Nakashima, T., and Takayanagi, H. 2009. Osteoclasts and the immune system. En: J. Bone Miner. Metab. Vol 27, no. 5,. p. 519-529
19. Li, J. et al. 2000. RANK is the intrinsic hematopoietic cell surface receptor that controls osteoclastogenesis and regulation of bone mass and calcium metabolism. En: Proc. Natl Acad. Sci. USA. Vol. 97, no. 4,. p. 1566–1571
20. Komarova, S. et al. 2003. RANK ligand-induced levation of cytosolic Ca2+ accelerates nuclear translocation of nuclear factor B in osteoclasts. En: J. Biol. Chemis. Vol. 278, no. 10,. p. 8286-8293.
21. Simonet, N.S. et al. 1997. Osteoprotegerin: a Novel Secreted Protein Involved in the Regulation of Bone Density. En: Cell. Vol. 89, no. 2,. p. 309-319.
22. Suda, T., Takahashi, N., and Martin, T.J. 1992. Modulation of osteoclast differentiation. En: Endo. Rev. Vol. 13,. p. 66–80.
134
23. De Vernejoul, M.C., Cohen-Solal, M., and Orcel, P. 1993. Bone cytokines. En: Curr. Opin. Rheumatol. Vol. 5,. p. 332–338.
24. Nakamura, I., et al. 2002. IL-1 Regulates Cytoskeletal Organization in Osteoclasts Via TNF Receptor-Associated Factor 6/c-Src Complex. En: J. Immunology. Vol. 168, no. 10,. p. 5103-5109.
25. Yasuda, H., Shima, N., Nakagawa, N., Yamaguchi, K., Kinosaki, M., Mochizuki, S., Tomoyasu, A., Yano, K., Goto, M., Murakami, A., Tsuda, E., Morinaga, T., Higashio, K., Udagawa, N., Takahashi, N., Suda, T. 1998. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. En: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 95,. p. 3597–3602.
26. Felix, R., Cecchini, M.G., and Fleisch, H. 1990. Macrophage colony stimulating factor restores in vivo bone resorption in the op/op osteopetrotic Mouse. En: Endocrinology. Vol. 127, no. 5,. p. 2592-2594.
27. Fujikawa, Y., Sabokbar, A., Neale, S.D., Itonaga, I., Torisu, T., and Athanasou, A. 2001. The effect of macrophage- colony stimulating Factor and other humoral factors (IL 1, IL3, IL 6 and IL 11, TNFα and GMCSF) on human osteoclast formation from circulating cells. En: Bone. Vol. 28, no. 3,. p. 261-262
28. Chagraoui, H. et al. 2003. Stimulation of osteoprotegerin production is responsible for osteosclerosis in mice overexpressing TPO. En: Blood. Vol. 101, no. 8,. p.2983-2989
29. Boyle, W., Simonet, W. S., and Lacey, D. 2003. Osteoclasts differentiation and activation. En: J. Cell Biol. Vol. 423,. p. 337-342.
30. Murillo, Andrea. 2005. Evaluación de la actividad resortiva de macrófagos de la línea celular humana y de ratón fusionados con polietilenglicol (PEG). Tesis. Facultad de medicina. Universidad Nacional de Colombia.
31. Sahu, S.N., Khadeer, M.A., Robertson, B.W., Núñez, S.M, Bai. G., and Gupta, A. 2007. Association of leupaxin with Src in osteoclasts. En: Am. J. Physiol. Cell Physiol. Vol. 292, no. 1,. p. C581-90
32. Luxenburg, C., Geblinger, D., Klein, E., Anderson, K., Hanein, D., Geiger, B., and Addadi, L. 2007. The Architecture of the Adhesive Apparatus of Cultured Osteoclasts: From Podosome Formation to Sealing Zone Assembly. En: PLoS ONE. Vol. 2, no. 1,. p. e179. doi:10.1371/journal.pone.0000179
33. Miep, H. Helfrich, P. and Stuart, H. Ralston, M.D. 2003. Bone Research protocols. New Jersey. E - ISBN 1-59259-366-6. Humana Press Inc.
135
34. Adapala, N.S., Barbe, M.F., Langdon, W.Y., Tsygankov, A.Y., and Sanjay, A. 2010. Cbl-phosphatidylinositol 3 kinase interaction differentially regulates macrophage colony-stimulating factor-mediated osteoclast survival and cytoskeletal reorganization. En: Ann. NY. Acad. Sci. Vol. 1192, no. 1,. p. 376-84.
35. Yogo, K. et al. 2006. Src Homology 2 (SH2) containing 5´inositol Phosphatase localize to podosome, and SH2, domain is implicated in the attenuation of bone resorption in osteoclasts. En: Endocrinology. Vol. 147, no. 7,. p. 3307-3317.
36. Arias-Salgado, E. G. et al. 2003. Src kinase activation by direct interaction with the integrin β cytoplasmic domain. En: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 100, no. 23,. p. 13298-13302.
37. Teitelbaum, S.L. et al. 2007. Syk, c-Src, the αvβ3 integrin, and ITAM immunoreceptors, in concert, regulate osteoclastic bone resorption. En: J. Cell Biol. Vol. 176, no. 6,. p. 877-888.
38. Faccio, R. et al. 1998. Activation of αvβ3 integrin on human osteoclast-like cells stimulates adhesion and migration in response to osteopontin. En: Bioch. Bioph. Res. Commu. Vol. 249, no. 2,. p. 522–525
39. Miyasaka, N., et al. 2006. Identification of a human peripheral blood monocyte subset that differentiates into osteoclasts. En: Arthritis Res. Ther. Vol. 8, no.5,. p. 1-14
40. Yuasa, K. et al. 2007. Characterization of two types of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. En: Bioch. Bioph. Res. Commu. Vol. 356, no. 2,. p. 354–360.
41. Kobayashi, M. et al. 2003. Resting T cells negatively regulate osteoclast generation from peripheral blood monocytes. En: Bone. Vol. 33, no. 4,. p. 711-729.
42. Orozco, O. et al. 1988. Manual de laboratorio: curso práctico aplicación de anticuerpos monoclonales en biología. Instituto de inmunología. Hospital San Juan de Dios. Universidad Nacional. Bogotá.
43. MCDonald, M. J. et al . 2003. Osteoclast apoptosis: the role of Fas in vivo and in vitro. En: Endocrinol. Vol. 144, no. 12,. p. 5545–5555.
44. Campbell, A. M. 1984. “Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, monoclonal antibody technology”. Editor R.H Burdon y P.H. van Knippenberg. Editorial Elsevier Science Publisher. New York. Vol 13,. p. 120-134.
136
45. Martin, G. S. 2001. The Hunting of the Src. En: Nature Revi Mol Cell Biol. Vol. 2, no. 6,. p.467-475.
46. Nada, S., Okada, M., MacAuley, A., Cooper, J.A, and Nakagawa, H. 1991. Cloning of a complementary DNA for a protein-tyrosine kinase that specifically phosphorylates a negative regulatory site of p60c-src. En: Nature. Vol. 351, no. 6321,. p. 69–72.
47. Xu, W., Harrison, S.C., and Eck, M.J. 1997. Three-dimensional structure of the tyrosine kinase c-Src. En: Nature. Vol. 385, no. 6617,. p. 595–602.
48. Xu, W., Doshi, A., Lei, M., Eck, M.J., and Harrison, S.C. 1999. Crystal structures of c-Src reveal features of its autoinhibitory mechanism. En: Mol. Cell. Vol. 3, no. 5,. p. 629–38.
49. Miyazaki, T., Tanaka S., Sanjay, A., and Baron, R. 2006. The role of c-Src kinase in the regulation of osteoclast function. En: Mod. Rheumatol. Vol. 16, no. 2,. p. 68–74
50. Zhao, W., Cavallaro, S., Gusev, P., and Alkon, D.L. 2002. Nonreceptor tyrosine protein kinase pp60c-src in spatial learning: synapse-specific changes in its gene expression, tyrosine phosphorylation, and protein–protein interactions. En: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 97, no. 14,. p. 8098-8103
51. Reeve, J, et al. 2009. SLP - 76 couples Syk to the osteoclast cytoskeleton. En: J. Immunol. Vol. 183, no. 3,. p. 1804-1812.
52. Horne, W. C., Neff, L., Chatterjee, D., Lomri, A., Levy, J. B., and Baron, R. 1992. Osteoclasts express high levels of pp60c-src in association with intracellular membranes. En: J. Cell Biol. Vol. 119, no. 4,. p. 1003–1013
53. Lowe, C., Yoneda, T., Boyce, B.F., Chen, H., Mundy, G.R., and Soriano, P. 1993. Osteopetrosis in Src-deficient mice is due to an autonomous defect of osteoclasts. En: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 90, no. 10,. p. 4485–4489
54. Miyazaki, T., Sanjay, A., Neff, L., Tanaka, S., Horne, W.C., and Baron, R. 2004. Src kinase activity is essential for osteoclast function. En: J. Biol. Chem. Vol. 279, no. 17,. p.17660–17666
55. Felsenfeld, D. P., Schwartzberg, P. L., Venegas, A., Tse, R., and Sheetz, M. P. 1999. Selective regulation of integrin-cytoskeleton interactions by the tyrosine kinase Src. En: Nature Cell Biol. Vol. 1, no. 4,. p. 200–206.
56. Schwartzberg, P. L., Xing, L., Hoffmann, O., Lowell, C. A., Garrett, L., Boyce, B. F., and Varmus, H. E. 1997. Rescue of osteoclast function by
137
transgenic expression of kinase-deficient Src in src / mutant mice. En: Genes Dev. Vol. 11, no.21,. p. 2835–2844.
57. Gerald, S., Davis, A., Brody, R., and Adler, K. B. 1979. Functional and physiologic correlates of human alveolar macrophage cell shape and surface morphology. En: Chest. Vol. 75, no. 2 (supplement),. p. 280-282.
58. Luxenburg C., Parsons T., Addadi L., and Geiger B. 2006. Involvement of the Src-cortactin pathway in podosome formation and turnover during polarization of cultured osteoclastos. En: J Cell Scie. Vol. 119, no. Pt 23,. p. 4878-4888.
59. Tarone, G., Cirillo, D., Giancotti, F. G., Comoglio, P. M. and Marchisio, P. C. 1985. Rous sarcoma virus-transformed fibroblasts adhere primarily at discrete protrusions of the ventral membrane called podosomes. En: Exp. Cell Res. Vol. 159, no. 1,. p. 141-157.
60. Baron, R., Ravesloot, J.H., Neff, L., Chakraborty, M., Chatterjee, D., and Lomri, A. et al. 1993. Cellular and molecular biology of bone. Editor In: Noda M. San Diego: Academic. p. 445–95.
61. Nesbitt, S. A., and Horton, M. A. 1997. Trafficking of matrix collagens through bone resorbing osteoclasts. En: Science. Vol. 276, no. 5310,. p. 266-269.
62. Calle, Y., Jones, G. E., Jagger, C., Fuller, K., Blundell, M. P., Chow, J., Chambers, T., and Thrasher, A. J. 2004. WASp deficiency in mice results in failure to form osteoclast sealing zones and defects in bone resorption. En: Blood. Vol. 103, no. 9,. p. 3552-3561.
63. Lakkakorpi, P. T., Helfrich, M. H., Horton, M. A. and Vaananen, H. K. 1993. Spatial organization of microfilaments and vitronectin receptor, alpha v beta 3 in osteoclasts. A study using confocal laser scanning microscopy. En: J Cell Sci. Vol. 104, no. Pt 3,. p. 663-670.
64. Lakkakorpi, P. T., Nakamura, I., Young, M., Lipfert, L., Rodan, G. A. and Duong, L. T. 2001. Abnormal localisation and hyperclustering of (alpha)(V)(beta)(3) integrins and associated proteins in Src-deficient or tyrphostin A9-treated osteoclasts. En: J. Cell Sci. Vol. 114, no. Pt.1,. p. 149-160.
65. Duong, L. T., Lakkakorpi, P.T., Nakamura, I., Machwate, M., Nagy, R.M., and Rodan, G.A. 1998. PYK2 in osteoclasts Is an adhesion kinase, localized in the sealing zone, activated by ligation of a αvβ3 integrin, and phosphorylated by Src kinase. En: J. Clin. Invest. Vol. 102, no. 5,. p. 881–892
66. Linder, S., and Aepfelbacher, M. 2003. Podosomes: adhesion hot-spots of invasive cells. En: Trends Cell Biol. Vol. 13, no. 7,. p. 376–385.
138
67. Saltel, F., Chabadel, A., Bonnelye, E., and Jurdic, P. 2008. Actin cytoskeletal organisation in osteoclasts: a model to decipher transmigration and matrix degradation. En: Eur. J. Cell Biol. Vol. 87, no. 8-9,. p.459-68
68. Akisaka, T., Yoshida, H., Inoue, S., and Shimizu, K. 2001. Organization of cytoskeletal F-actin, G-actin, and gelsolin in the adhesion structures in cultured osteoclast. En: J. Bone Miner. Res. Vol. 16, no. 7,. p.1248 –1255.
69. Chellaiah, M., Kizer, N., Silva, M., Alvarez, U., and Kwiatkowski, D. et al. 2000. Gelsolin deficiency blocks podosome assembly and produces increased bone mass and strength. En: J. Cell Biol. Vol. 148, no. 4,. p. 665–678.
70. Ochoa, G. C., Slepnev, V. I., Neff, L., Ringstad, N., Takei, K., Daniell, L., Kim, W., Cao, H., McNiven, M., and Baron, R. et al. 2000. A functional link between dynamin and the actin cytoskeleton at podosomes. En: J. Cell Biol. Vol. 150, no. 2,. p.377-389.
71. Hiura, K., Lim, S. S., Little, S. P., Lin, S. and Sato, M. 1995. Differentiation dependent expression of tensin and cortactin in chicken osteoclasts. En: Cell Motil. Cyto. Vol. 30, no. 4,. p. 272-284.
72. Hurst, I.R., Zuo, J., Jiang, J., and Holliday, L.S. 2004. Actin-related protein 2/3 complex is required for actin ring formation. En: J. Bone Miner. Res. Vol. 19,. p. 499-506.
73. Zambonin, Z. A., Teti, A., Grano, M., Rubinacci, A., Abbadini, M., Gaboli, M., and Marchisio, P.C. 1989. Immunocytochemical distribution of extracellular matrix receptors in human osteoclasts: a beta 3 integrin is colocalized with vinculin and talin in the podosomes of osteoclastoma giant cells. En: Exp. Cell Res. Vol. 182, no. 2,. p. 645-652.
74. Zambonin, Z. A., Teti, A., Gaboli, M., and Marchisio, P.C. 1989. Beta 3 subunit of vitronectin receptor is present in osteoclast adhesion structures and not in other monocyte-macrophage derived cells. Connect. En: Tissue. Res. Vol. 20, no. 1-4,. p. 143–149.
75. Väänänen, H., and Horton, M. 1995. The osteoclast clear zone is a specialized cell-extracellular matrix adhesion Structure. En: J. Cell Sci. Vol. 108, Pt 8,. p. 2729-2732
76. Davies, J., Warwick, J., Totty, N., Philp, R. and Horton, M. 1989. The osteoclast functional antigen, implicated in the regulation of bone resorption, is biochemically related to the vitronectin receptor. En: J Cell Biol. Vol. 109, no 4 (Pt 1),. p. 1817-1826.
77. Horton, M. A., Taylor, M. L., Arnett, T. R., and Helfrich, M. H. 1991. Arg-Gly-Asp (RGD) peptides and the anti-vitronectin receptor antibody 23C6 inhibit
139
dentine resorption and cell spreading by osteoclasts. En: Exp. Cell Res. Vol. 195, no. 2,. p.368-375.
78. Helfrich, M. H., Nesbitt, S. A., and Horton, M. A. 1992. Integrins on rat osteoclasts: characterization of two monoclonal antibodies (F4 and F11) to rat β3. En: J. Bone Miner. Res. Vol. 7,. p. 345-351.
79. Nesbitt, S., Nesbit, A., Helfrich, M., and Horton, M. 1993. Biochemical characterization of human osteoclast integrins. Osteoclasts express alpha v beta 3, alpha 2 beta 1, and alpha v beta 1 integrins. En: J. Biol. Chem. Vol. 268, no. 22,. p. 16737-16745.
80. Lakkakorpi P T., Horton M. A., Helfrich M. H., Karhukorpi E.-K., and Vaananen. H. K. 1991. Vitronectin receptor has a role in bone resorption but does not mediate tight sealing zone attachment of osteoclasts to the bone surface. En: J Cell Biol. Vol. 115, no. 4,. p.1179-1186
81. Wilder R L . 2002. Integrin alpha V beta 3 as a target for treatment of rheumatic diseases. En: Ann. Rheum. Dis. Vol. 61, suppl. 2: ii p. 96-99
82. Nakamura, I., Pilkington, M.F., Lakkakorpi, P.T., Lipfert, L., Sims, S.M., Dixon, S.J., Rodan, G.A., and Duong, L. 1999. Role of αvβ3 integrin in osteoclast migration and formation of the sealing zone. En: J. Cell Sci. Vol. 112,. p.3985-3993
83. Horton, M.A., Massey, H.M., Rosenberg, N., Nicholls, B., Seligsohn, U., and Flanagan, A.M. 2003. Upregulation of osteoclast α2β1 integrin compensates for lack of αvβ3 vitronectin receptor in Iraqi-Jewish-type Glanzmann thrombasthenia. En: British. J. Haema. Vol. 122,. p. 950–957
84. Wayner, E.A., Orlando, R.A., and Cheresh, D. 1991. Integrins ctv/33 and ov/35 contribute to cell attachment to vitronectin but differentially distribute on the cell surface. En: J. Cell Biol. Vol. 113,. p. 919-929
85. Meng, F., and Lowell, C.A. 1998. β1 integrin signaling pathway involving Src-family kinases, Cbl and PI-3 kinase is required for macrophage spreading and migration. En: EMBO. Vol. 17,. p. 4391–4403.
86. Anderson, J. 2000. Multinucleated giant cells. En: Curr. Opin. Hematol. Vol. 7,. p. 40-47.
87. D'Amelio, P., Grimaldi, A., Bernabei, P., Pescarmona, G.P., and Isaia, G. 2006. Immune system and bone metabolism: does thymectomy influence postmenopausal bone loss in humans? En: Bone. Vol. 39, no. 3,. p. 658–665
140
88. Nicholson G.C. et al. 2000. Induction of osteoclasts from CD14-positive human peripheral blood mononuclear cells by receptor activator of nuclear factor B ligand (RANKL). En: Clin. Sci. Vol. 99, no. 2,. p. 133–140.
89. Gradaigh, D.O., Ireland, D., Bord, S., and Compston, J.E. 2004. Joint erosion in rheumatoid arthritis: interactions between tumour necrosis factor α, interleukin 1, and receptor activator of nuclear factor B ligand (RANKL) regulate osteoclasts. En: Ann. Rheum. Dis. Vol. 63, no. 4,. p. 354–359
90. Weitzmann, M.N., Cenci, S., Rifas, l., Haug, J., Dipersio, J., and Pacifici, R. 2001. T Cell activation induces human osteoclast formation via receptor activator of nuclear factor kB ligand–dependent and independent mechanisms. En: J. Bone Miner. Res. Vol. 16, no. 2,. p. 328-337.
91. Gradaigh, D.O., and Compston, J. E. 2004. T-cell involvement in osteoclast biology: implications for rheumatoid bone erosion. En: Rheumatology. Vol. 43, no. 2,. p.122–130.
92. Weitzmann M.N, Cenci S., Rifas L., Brown C., and Pacifici R. 2000. Interleukin-7 stimulates osteoclast formation by up-regulating the T-cell production of soluble osteoclastogenic cytokines. En: Blood. Vol. 96, no. 5,. p.1873-1878.
93. D’Amelio, P., Grimaldi, A., Pescarmona, G. P., Tamone, C., Roato, I., and Isaia, G. 2005. Spontaneous osteoclast formation from peripheral blood mononuclear cells in postmenopausal osteoporosis. En: FASEB J. Vol. 19, no. 3,. P. 410- 412.
94. Manabe, N. et al. 2001. Connection between B lymphocyte and Osteoclast differentiation pathways. En: J. Immunol. Vol. 167, no. 5,. p. 2625–2631.
95. Vignery, A. 2000. Osteoclast and giant cells: macrophage-macrophage fusion mechanism. En: Int. J. Exp. Path. Vol. 81,. p. 291-304.
96. Zenger, S., Ek-Rylander, B., and Andersson, G. 2010. Long bone osteoclasts display an augmented osteoclast phenotype compared to calvarial osteoclasts. En: Biochem. Bioph. Res. Commun. Vol. 394, no. 3,. p. 743-749.
97. Matsuzaki, K., Udagawa, N., Tamaguchi, K., Yasuda, H., Shima, N., Morinaga, T., Yabe, Y., Higashiro, K., and Suda, T. 1998. Osteoclast differentation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. En: Bichem. Bioph. Res. Commun. Vol. 246,. p. 199-204.
141
98. Young-Yun, K. et al. 1999. Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand. En: J. Cell Biochem. Vol 72, no 6759,. p. 67-80.
99. Chermomordik, L. V., Leikina, E., Frolov, V., and Zimmerberg, J. 1997. An early stage of membrane fusion mediated by the low pH conformation of influenza hemmagglutinin depends upon membrane lipids. En: J. Cell Biol. Vol. 136, no 1,. p. 81-93.
100. Pfaff, M., and Jurdic, P,. 2001. Podosomes in osteoclast-like cells: structural analysis and cooperative roles of paxillin, proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2) and integrin αVβ3. J Cell Scien. Vol. 114 (pt 15), . p. 2775-2786
101. Sarkar, S., Rooney, M., and Lord, S.T. 1999. Activation of integrin-β3-associated syk in platelets. Biochem J. Vol. 338 (pt 3),. p. 677±680
102. Mócsai, A,. et al. 2004. The immunomodulatory adapter proteins DAP12 and ITAM regulate development of functional osteoclasts through the Syk tyrosine kinase. En: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 101, no. 16,. p. 6158–6163.
103. Woodside, D.G,. et al. 2001. Activation of Syk protein tyrosine kinase through interaction with integrin β cytoplasmic domains. En: Current Biol .Vol.11, no. 22,. p.1799–1804.
104. Zyss, D,. et al. 2005. The Syk Tyrosine Kinase Localizes to the centrosomes and negatively affects mitotic progression. En: Cancer Res. Vol. 65, no 23,. p. 10872-10880
105. Böyum, A. 1968. Separation of leukocytes from blood and bone marrow. En: Scand J. Clin Lab Invest. Vol. 97, no 21,. p. 77.
106. Sanjay,. et al. 2001. Cbl Associates with Pyk2 and Src to regulate Src kinase activity, vß3 integrin-mediated signaling, cell adhesion, and osteoclast motility. En: J. Cell Biol. Vol. 152, no. 1,. p. 181-196.
107. Vanchit, J,. et al. 1996. A Role for CD8+ T lymphocytes in osteoclast differentiation in vitro. En: Endocrinology. Vol. 137, no. 6,. p. 2457- 2463.
108. Yen-Tung, A,. et al. 2000. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. En: J. Clin. Invest. Vol. 106, no. 6,. p. R59–R67.
109. Hadden, J.W, et al. 1976. Isoprinosine augmentation of phytohemagglutinin - induced lymphocyte proliferation. En: Infect. Immunity. Vol. 13, no. 2,. p. 382-387.
142
110. Luxenburg, C,. et al. 2006. The molecular dynamics of osteoclast adhesions. En: Eur. J. Cell Biol. Vol. 85, no. 3-4,. p. 203–211.
111. Ikeda, T,. et al. 1998. A new cytokine-dependent monoblastic cell line with t (9;11) (p22;q23) differentiates to macrophages with macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and to osteoclast-like cells with M-CSF and interleukin-4. En: Blood. Vol. 91,. p. 4543-4553.
112. Tehrani,. et al. 2006. Cortactin has an essential and specific role in osteoclast actin assembly. En: Molec. Biol. Cell. Vol. 17,. p. 2882–2895.
113. Alnaeeli, M. Penninger, J, .M., and Yen-Tung, A,.T. 2006. Immune interactions with CD4+ T cells promote the development of functional osteoclasts from murine CD11c dendritic cells. En: J. Immunology. Vol. 177,. p. 3314–3326.
114. Akiyama, T,. et al. 2005. In vitro and in vivo assays for osteoclast apoptosis. En: Biol. Proced. Vol. 7. No. 1,. p. 48-59.
115. Wolfgang, E., Goran, H., de Martin, R., Draude, G., Weber, K. S. C., and Weber, C. 1999. Nuclear Factor-kappa B regulates induction of apoptosis and inhibitor of apoptosis protein-1 expression in vascular smooth muscle cells. En: Circul. Res. Vol. 84, no. 6,. p. 668-677.
116. Penolazzi, L,. et al. 2008. Induction of apoptosis of human primary osteoclasts treated with extracts from the medicinal plant Emblica officinalis. En: BMC Complem. Alter. Medicine. Vol. 8, no. 59,. p. 1-11.
117. Takayanagi, H,. et al 2005. Mechanistic insight into osteoclast differentiation in osteoimmunology. En: J. Mol. Med. Vol. 83, no. 3., p. 170–179.
118. Wang, TM., Jee, WS., Woodbury, LA., and Matthews, JL. 1982. Effects of phytohemagglutinin-P (PHA-P) on bone of the growing rat. En: Metab. Bone. Dis. Relat. Res. Vol. 4, no. 3,. p. 193-199.
119. Duke-Cohan, J.S,. et al. 1985 Immunological function in osteoporosis. En: Clin. Immunol. Immunopathol. Vol. 35,. p. 125–129.
120. Maeda, T,. et al. 2001. Differentiation of monocytes into multinucleated giant bone resorbing cells: two-step differentiation induced by nurse-like cells and cytokines. En: Arthritis Res. Vol. 3, no 5,. p. 306-310.
121. Lorenzo,. et al. 1987. Comparison of the bone-resorbing activity in the supernatants from phytohemagglutinin-stimulated human peripheral blood mononuclear cells with that of cytokines through the use of an antiserum to inter leukin 1. En: Endocrinology. Vol. 121, no 3,. p. 1164-1170.
143
122. Stanley,. et al. 1971-1976. Localization of 3H-Phytohemagglutinin within human lymphocytes and monocytes. Publicada en: "Proceedings of the fourth annual leukocyte culture conference", (McIntyre OR, ed). New York: Appleton-Century-Crofts,. p.1-11.
123. Frenster, J.H,. 1975. Phytohemagglutinin-Activated Autochthonous lymphocytes for systemic immunotherapy of human neoplasms. En: Annals of the New York Academy of Science. Vol. 277, no. 5-7,. p. 45-51.
124. Kim, Y.G,. et al, 2007. CD4+CD25+ regulatory T cells inhibit the differentiation of osteoclasts from peripheral blood mononuclear cells. En: Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 357, no. 4,. p. 1046-52.
125. Gillespie, M. T,. 2007. Impact of cytokines and T lymphocytes upon osteoclast differentiation and function. En: Arthritis Res. Ther. Vol. 9, no. 2,. p. 103.
126. Teng, Y.T,. 2000. Functional human T-cell immunity and osteoprotegerin ligand control alveolar bone destruction in periodontal infection. En: J. Clin. Inv. Vol. 106, no. 6,. p. R59-67.
127. Look, A.T,. et al. 1989. Human Myeloid Plasma Membrane Glycoprotein CD13 (gp150) Is Identical to Aminopeptidase N. En: J. Clin. Invest. Vol. 83,. p. 1299-1307.
128. Varsani, H,. et al. 2003. Synovial dendritic cells in juvenile idiopathic arthritis (JIA) express receptor activator of NF-kB (RANK). En: Rheumatology . Vol. 42, no. 8,. p. 1- 8.
129. Hutchins, D,. 1983. Phytohaemagglutinin-induced proliferation of human T lymphocytes: differences between neonate and adults in accessory cell requirements. En: Clin. Exp. Immunol. Vol. 52,. p. 355-364.
130. Dayton, E. T,. et al 1983. Correlation between differentiation, expression of monocytic-specific antigens, and cytotoxic functions in human promyelocytic cell lines treated with leukocyte condition medium. En: J. Immunol. Vol. 130,. p. 1120-1128.
131. Duda, P.W,. 2000. Human and murine CD4 Tcell reactive to a complex antigen: recognition of the synthetic random polypeptide glatiramer acetate. En: J. Immunol. Vol. 65,. p. 7300-7307.
132. Piatier-Tonneau, D,. et al. 1991. Interaction of CD4 with HLA class II antigens and HIV gp120. En: Immunogenetics. Vol. 34, no. 2,. p. 121–8.
133. Zhuang, Y. 2006. Characterization of a phenotypically unique population of CD13- Dendritic cells resident in the spleen. En: Clin. Vac. Immun. Vol. 13, no 9,. p.1064–1069.
144
134. Sofuni, T,. et al. 1992. Combined use of several mitogens for mitotic stimulation to human lymphocytes. En: J. Radiat.Res. Vol. 33,. p. 222-230.
135. Ying-Mei, T. 2005. Kinetics of phytohemaglutinin-induced IFN-γ and TNF-α expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis B after liver transplantation. En: World J. Gast. Vol. 11, no. 29,. p. 4574-4578.
136. Bushkin, Y. 1990. Activation of human CD8-positive T cells via the CD8/HLA class I complex. En: Cell Immunol. Vol. 126, no. 1,. p. 185-95.
137. Edmondson, J. M,. et al. 1988. A rapid and simple MTT-based spectrophotometric assay for determining drug sensitivity in monolayer cultures. En: Meth. Cell. Sci. Vol. 11, no. 1,. p. 15-17.
138. Altman, S. A,. et al. 1993. Comparison of trypan blue dye exclusion and fluorometric assay for mammalian cell viability determinations. En: Biotechnol. Prog. Vol. 9, no. 6,. p. 671-674.
139. Wojcieszyn, J.W,. et al. 1983. Studies on the Mechanism of Cell Fusion Using Fluorescent Probes Polyethylene Glycol-mediated Membrane and Cytoplasmic. En: J. Cell biology. Vol. 96,. p. 151-159.
140. Knutton, S. 1979. Studies of membrane fusion. III. Fusion of erythrocytes with polyethylene glycol. En: J. Cell Sci. Vol. 36,. p. 61-72.
141. Kräihling, H. 1981. Investigations on polyethylene glycol-induced cell fusion—freeze fracture observations. En: Acta Histochemica (SuppL).-Band X X Ill S,. p. 219-223.
142. Boni, L. T., Stewart, T. P., Alderfer, J. L., and Hui, S. W. 1981. Lipid-polyethylene glycol interactions. II. formation of defects in bilayers. En: J. Membr. Bio. Vol. 62,. p. 71-77
143. Cohen, F., Akabas, M., and Finkelstein, A. 1982. Osmotic swelling of phosphospholipid vesicles causes them to fuse with a planar phosphoilpid bilayer membrane. En: Science. Vol. 217,. p. 458-460.
144. Duelli, D., and Lazebnik, Y. 2003. Cell fusion: A hidden enemy?. En: Cancer Cell. Vol. 3,. p. 445-447.
145. Shih, C., and Bernard, G.W. 1996. Peripheral blood mononuclear cells develop into multinucleated osteoclasts in tissue culture. En: Anatomical record. Vol. 245,. p. 41-45.
146. Chen, E.H., Grote, E., Mohler, W., and Vignery, A. 2007. Cell – cell fusion. En: FEBS Lett. Vol. 581,. p. 2181–2193.
145
147. Ishii, M,. et al. 2008. Osteoclast cell fusion: mechanisms and molecules. En: Modern Rheum. Vol. 18,. p. 220-227.
148. Kukita, T,. et al. 2004. RANKL-induced DC-STAMP is essential for osteoclastogenesis. En: J. Exp. Med. Vol. 200, no. 7,. p. 941–946.
149. Yagi, M,. et al. 2005. DC-STAMP is essential for cell–cell fusion in osteoclasts and foreign body giant cells. En: J. Exp Med. Vol. 202, no. 3,. p. 345–351.
150. Saginario, C., Qian, H.Y., and Vignery, A. 1995. Identification of an inducible surface molecule specific to fusing macrophages. En: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 92, no. 26,. p. 12210–12214.
151. Vignery, A. 2005. Macrophage fusion: the making of osteoclasts and giant cells. En: J Exp Med. Vol. 202, no. 3,. p. 337-340
152. Han, X,. et a.l 2000. CD47, a ligand for the macrophage fusion receptor, participates in macrophage multinucleation. En: J. Biol. Chem. Vol. 275, no. 48,. p. 7984–7992.
153. Sterling, H., Saginario, C., and Vignery, A. 1998. CD44 occupancy prevents macrophage multinucleation. En: J. Cell. Biol. Vol. 143, no. 3,. p. 837–847.
154. Ohgimoto, S,. et al. 1995. Molecular characterization of fusion regulatory protein-1 (FRP-1) that induces multinucleated giant cell formation of monocytes and HIV gp160-mediated cell fusion. FRP-1 and 4F2/CD98 are identical molecules. En: J. Immunol. Vol.155, no. 7,. p. 3585–3592.
155. Cui, W,. et al. 2007. CD200 and its receptor, CD200R, modulate bone mass via the differentiation of osteoclasts. En: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 104, no. 36,. p. 14436–14441.
156. Mbalaviele G, et al. 1995. The role of cadherin in the generation of multinucleated osteoclasts from mononuclear precursors in murine marrow. En: J. Clin. Invest. Vol. 95, no. 6,. p. 2757–2765.
157. Lemaire, I,. et al. 2006. Involvement of the purinergic P2X7 receptor in the formation of multinucleated giant cells. En: J. Immunol. Vol. 177,. p. 7257–7265.
158. Lee, SH,. et al. 2006. v-ATPase V0 subunit d2-deficient mice exhibit impaired osteoclast fusion and increased bone formation. En: Nat Med. Vol. 12, no. 12,. p. 1403–1409.
159. Ishii, M., Iwai, K,. et al. 2006. RANKL induced expression of tetraspanin CD9 in lipid raft membrane microdomain is essential for cell fusion during osteoclastogenesis. En: J Bone Miner Res. Vol. 21, no. 6,. p. 965–976.
146
160. Yi, T,. et al 2006. Tetraspanin CD9 regulates osteoclastogenesis via regulation of p44/42 MAPK activity. En: Biochem Biophys Res Commun. Volumen 347, no. 1,. p. 178–184.
161. Yamane, H,. et al. 2005. Propionibacterium acnes-induced hepatic granuloma formation is impaired in mice lacking tetraspanin CD9. En: J Pathol. Vol. 206, no. 4,. p. 486–92.
162. Saginario, C,. et al. 1998. MFR, a putative receptor mediating the fusion of macrophages. En: Mol. Cell. Biol. Vol. 18, no. 11,. p. 6213–6223.
163. Lundberg, P,. et al. 2007. Osteoclast formation is strongly reduced both in vivo and in vitro in the absence of CD47/SIRPa-interaction. En: Biochem. Biophy. Reser. Comun. Vol. 352, no. 2,. p. 444-448.
164. Iwasaki, R,. et al. 2008. Cell fusion in osteoclasts plays a critical role in controlling bone mass and osteoblastic activity. En: Bioch. Biophy. Reser. Comun. Vol. 377, no. 3,. p. 899-904.
165. Falzoni, S., Munerati, M., Ferrari, D., Spisani, S., Moretti, S., and Di Virgilio, F. 1995. The purinergic P2Z receptor of human macrophage cells: characterization and possible physiological role. En: J. Clin. Invest. Vol. 95, no. 3,. p. 1207–1216.
166. Kobayashi, M,. et al. 2005. Interleukin-4 inhibits RANKL-induced expression of NFATc1. En: J. I mmunol. Vol. 329, no. 3,. p. 839-845.
167. Ke, H. Z., Qi, H., Weidema, A. F., Zhang, Q., Panupinthu, N., Crawford, D. T., Grasser, W. A., Paralkar, V. M., Li, M., Audoly, L. P., Gabel, C. A., Jee, W. S., Dixon, S. J., Sims, S. M. and Thompson, D. D. 2003. Deletion of the P2X7 nucleotide receptor reveals its regulatory roles in bone formation and resorption. En: Mol. Endocrinol. Vol. 17, no. 7,. p. 1356–1367.
168. Kontanl, K,. et al. 2005. Repression of cell-cell fusion by components of the C. elegans vacuolar ATPase complex. En: Develop.Cell. Vol. 8, no. 5,. p. 787-794.
169. Monck, J.R., and Fernandez, J.M. 1996. The fusion pore and mechanisms of biological membrane fusion. En: Current. Opin. Cell. Biol. Vol. 8, no. 4,. p. 524-533.
170. Shemer, G., Suissa, M., Kolotuev, I., Nguyen, K.C.Q., Hall, D.H., and Podbilewicz, B. 2004. EFF-1 is sufficient to initiate and execute tissue-specific cell fusion in C. elegans. En: Curr. Biol. Vol. 14,. p. 1587–1591.
171. Podbilewicz, B., and White, J. G. 1994. Cell fusions in the developing epithelia of C. elegans. En: Dev. Biol. Vol. 161,. p. 408–424.
147
172. Toister, Z., and Loyter, A. 1973. The mechanism of cell fusion. En: J. Biol. Chem. Vol. 248, no. 2,. p. 422-432.
173. Jacobsen, B.M,. et al. 2006. Spontaneous fusion with, and transformation of mouse stroma by malignant human breast cancer epithelium. En: Cancer. Res. Vol. 66, no. 16,. p. 8274 - 8279.
174. Kerbel, R,. et al. 1983. Spontaneous fusion in vivo between normal host and tumor cells: possible contribution to tumor progression and metastasis studied with a lectin-resistant mutant tumor. En: Molec. Cellular.Biol. Vol. 3, no. 4,. p. 523-538.
175. Oberleithner, H,. et al. 1986. Fusion of renal epithelial cells: a model for studying cellular mechanisms of ion transport. En: Proc.Natl.Acad.Sci. Vol. 83, no. 10,. p. 3547-3551.
176. Vardjan, N,. et al. 2007. Elementary properties of spontaneous fusion of peptidergic vesicles: fusion pore gating. En: J.Physiol. Vol. 585, no. 3,. p. 655-661.
177. Kanehisa, J,. et al. 1990. A band of F-actin containing podosomes is involved in bone resorption by osteoclasts. En: Bone. Vol. 11, no. 4,. p. 287-293.
178. Mika, T., Mulari, K., Haibo, Z., Lakkakorpi, P., and Väänänen, H. K. 2003. Osteoclast ruffled border has distinct subdomains for secretion and degraded matrix uptake. En: Traffic. Vol. 4, no. 2,. p. 113–125.
179. Holtrop, M. E., and King, G. J. 1977. The ultrastructure of the osteoclast and its functional implications. En: Clin. Orthop. Relat. Res. Vol. 123,. p. 177-196.
180. Destaing, O,. et al. 2003. Podosomes display actin turnover and dynamic self-organization in osteoclasts expressing actin-Green Fluorescent Protein. En: Mol. Biol. Cell. Vol. 14, no. 2., p. 407–416.
181. Granot-Attas, S., Luxenburg, C., Finkelshtein, E., and Ari, Elson. 2009. Protein tyrosine phosphatase epsilon regulates integrin-mediated podosome stability in osteoclasts by activating Src. En: Mol. Biol. Cell. Vol. 20, no. 20., p. 4324–4334.
182. Wilson, S. R., Christoph, P., Saftig, P., and Brömme, D. 2009. Cathepsin K activity-dependent regulation of osteoclast actin ring formation and bone resorption. En: J. Biol. Chem. Vol. 284, no. 4,. p. 2584–2592.
183. Jurdic. P,. et al. 2006. Podosome and sealing zone: specificity of the osteoclast model. En: Euro. Jour. Cell Biol. Vol. 85,. p. 195–202.
148
184. Nakamura, I., Takahashi, N., Sasaki, T., Jimi. E., Kurokawa, T., and Suda, T. 1996. Chemical and physical properties of the extracellular matrix are required for the actin ring formation in osteoclasts. En: J. Bone. Miner. Res. Vol. 11, no. 12,. p. 1873–1879.
185. Gil-Henn, J,. et al. 2007. Defective microtubule-dependent podosome organization in osteoclasts leads to increased bone density in Pyk2−/− mice. En: J. Cell. Biol. Vol. 178, no. 6,. p. 1053-1064.
186. Duong, L.T., et al. 1998. PYK2 in Osteoclasts is an adhesion kinase, localized in the sealing zone, activated by ligation of αvβ3 integrin, and phosphorylated by Src kinase. En: J. Clin. Invest. Vol. 102, no. 5,. p. 881-889.
187. Hayman, E. G., Pierschbacher, M. D., Ohgren, Y., and Ruoslahti, E. 1983. Serum spreading factor (vitronectin) is present at the cell surface and in tissues. En: Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 80, no. 13,. p. 4003-4007.
188. van der Valki, J,. et al. 2004. The humane collection of fetal bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture. En: Toxic. in vitro. Vol. 18, no. 1,. p. 1-12.
189. Takamatsu, Y,. et al. 1998. Osteoclast-mediated bone resorption is stimulated during short-term administration of granulocyte colony-stimulating factor but is not responsible for hematopoietic progenitor cell mobilization. En: Blood. Vol. 92, no. 9,. p. 3465-3473.
190. Okumura, S,. et al. 2006. Coordination of microtubules and the actin cytoskeleton is important in osteoclast function, but calcitonin disrupts sealing zones without affecting microtubule networks. En: Bone. Vol. 39, no. 4,. p. 684-693.
191. Holtrop, M. E., RAaisz, L. G., and Simmons, H. A. 1974. The effects of parathyroid hormone, colchicines and calcitonin on the ultrastructure and the activity of osteoclastos in organ cultures. En: J. Cell. Biol . Vol. 60,. p. 346-355.
192. Hunter, S., Schraer, H. and Gay, C. 1989. Characterization of the cytoskeleton of isolated chick osteoclasts: Effect of Calcitonin. En: J. Histo. Cytoche. Vol. 37, no 10,. p. 1529-1537.
193. Burgstaller, G and Gimona, M. 2005. Podosome-mediated matrix resorption and cell motility in vascular smooth muscle cells. En: Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. Vol. 288, no. 6,. p. H3001–H3005,
194. Zambonin. Z,. et al. 1983. Osteoclasts and monocytes have similar cytoskeletal structures and adhesion property in vitro. J. Anat. En: Vol. 137, no. 1,. p. 57-70.
149
195. Danks, L., Sabokbar, A., Gundle, R,. and Athanasou. N. A. 2002. Synovial macrophage-osteoclast differentiation in inflammatory arthritis. En: Ann Rheum Dis. Vol. 61, no. 10,. p. 916–921.
196. Doshi, N,. et al. 2010. Macrophages recognize size and shape of their targets. En: PLoS One. Vol. 5, no, 4,. e10051.
197. Wakkach, A., et al. 2008. Bone marrow microenvironment controls the in vivo differentiation of murine dendritic cells into osteoclastos. En: Blood. Vol. 112, no. 13,. p. 5074-5083.
198. Teitelbaum, L,. et al. 1997. Osteoclasts, macrophages, and the molecular mechanisms of bone resorption. En: J. Leuk. Biol. Vol. 61, no. 4., p. 381- 388.
199. Fujikawa, Y., Sabokbar, A., Neale, S., and Athanasou, N. A. 1996. Human osteoclast formation and bone resorption by monocytes and synovial macrophages in rheumatoid arthritis. En: Ann. Rheum. Dis. Vol. 55, doi:10.1136/ard.55.11.816,. p. 816-822,
200. Barry, R., Rifkin, R., Baker, L., and Coleman, S. J. 1979. An ultrastructural study of macrophage-mediated resorption of calcified tissue. En: Cell Tissue Res. Vol. 202, no. 1,. p. 125-132.
201. Latha, S., Mangashetti, S., Khapli, M., and Wani, M. R. 2005. IL-4 inhibits bone-resorbing activity of mature osteoclasts by affecting NF-B and Ca2+ signaling. En: J Immunol. Vol. 175, no. 2 ,. p. 917–925.
202. Jimi, E,. et al. 1999. Osteoclast differentiation factor acts as a multifunctional regulator in murine osteoclast differentiation and function. En: J. Immunol. Vol. 163, no. 1,. p. 434–442.
203. Geblinger, D., Geiger, B and Addadi, L. 2009. Surface- Induced Regulation of Podosome Organization and Dynamics in Cultured Osteoclasts. En: Chem. Bio. Chem. Vol. 10, no 10,. p. 158 – 165.
204. Mócsai, A,. et al. 2002. Syk is required for integrin signaling in neutrophils. En: Immunity. Vol. 16, no. 4,. p. 547–558,
205. Melander, F., Andersson, T., and DIB, K. 2003. Fr but not Syk tyrosine kinase is a target for β2 integrin-induced c-Cbl-mediated ubiquitination in adherent human neutrophils. En: J. Biochem. Vol. 370,. p. 687 - 694
206. Kim, Y. G., Lee, C. K., Nah, S. S., Mun, S.H., Yoo, B., and Moon, H.B. 2007. Human CD4+CD25+ regulatory T cells inhibit the differentiation of osteoclasts from peripheral blood mononuclear cells. En: Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 357, no 4,. p. 1046-1052
150
207. Grcevic, D., Lee, S.Y., Marusic, A., and Lorenzo, J. A. 2000. Depletion of CD4 and CD8 T lymphocytes in mice in vivo enhances 1, 25-Dihydroxyvitamin D3 stimulated osteoclast-like cell formation in vitro by a mechanism that is dependent on prostaglandin synthesis. En: J. Immunol. Vol. 165, no 8,. p. 231-4238.
208. Hui, S.W., Kuhl, T.L., Guo, Y.Q, Israelachvili, J. 1999. Use of poly (ethylene glycol) to control cell aggregation and fusion. En: Coll. Surf. B. Bioin. Vol. 14,. p. 213–222
209. Wei, S. et al. 2002. Interleukin-4 Reversibly Inhibits Osteoclastogenesis via Inhibition of NF-B and Mitogen-activated Protein Kinase Signaling. En: J. Biol. Chemis. Vol. 277, no. 8,. p. 6622–6630.
210. Akiyama, T. et al. 2005. In vitro and in vivo assays for osteoclast apoptosis. En: Biol. Proced. Vol. 7, no. 1,. p. 48-59.
211. McAvoy, J.W. et al. 2001. Requirement for TGFβ receptor signaling during terminal lens fiber differentiation. En: Development. Vol. 128, no.20,. p. 3995-4010.
212. Athanasou, N. A and Quinn, J. 1990. Immunophenotypic differences between osteoclasts and macrophage polykaryons: immunohistological distinction and implications for osteoclast ontogeny and function. En: J. Clin. Pathol. Vol. 43, no. 12,. p. 997-1003.
213. Mercer, W. E and Schlegel, R. A. 1979. Phytohemagglutinin enhancement of cell fusion reduces polyethylene glycol cytotoxicity. En: Exp. Cell Resear. Vol. 120, no. 2,. p. 417-421
214. Zambonin, Z., Teti, A and Primavera, M. V. 1984. Monocytes from circulating blood fuse in vitro with purified osteoclasts in primary culture. En: J. Cell Sci. Vol. 66,. p. 335-342.
215. Toyosaki-Maeda, T. et al. 2001. Differentiation of monocytes into multinucleated giant boneresorbing cells: two-step differentiation induced by nurse-like cells and cytokines. En: Arthritis Res. Vol. 3, no. 5,. p. 306–310
216. Nishikawa, T., Ishikawa, H., Yamamoto, S and Koshihara Y. 1999. A novel calcitonin receptor gene in human osteoclasts from normal bone marrow. En: FEBS Letters. Vol. 458, no. 3,. p. 409 – 414.
217. Martin, T. J., Nicholson, G. C., Moseley, J. M., Sexton, P. M and Mendelsohn, F. A. O. 1986. Abundant calcitonin receptors in isolated rat osteoclasts. En: J. Clin. Invest. Vol. 78,. p. 355-360.
151
218. Sun-Wada, G.H. et al. 2003. Mouse proton pump ATPase C subunit isoforms (C2-α and C2-β) specifically expressed in kidney and lung. En: J. Biol. Chem. Vol. 278, no. 45,. p. 44843–44851.
219. Toyomura, T. et al. 2003. From lysosomes to plasma membrane: localization of vacuolar type H+- ATPase with the α3 isoform during osteoclast differentiation. En: J. Biol. Chem. Vol. 278, no. 24,. p. 22023-22030.
220. Quinn, J. M. W. et al. 1999. Calcitonin receptor antibodies in the identification of osteoclasts. En: Bone. Vol. 25, no. 1,. p. 1–8
221. Fliegel, J. et al. 2002. Carbonic anhydrase II binds to and enhances activity of the Na+ / H+ exchanger. En: J. Biol. Chem. Vol. 277, no. 39,. p. 36085–36091.
222. Vince, J., and Reithmeier, R. A. F. et al. 2000. Identification of the carbonic anhydrase II binding site in the Cl- / HCO3
- anion exchanger AE1. En: Biochemistry. Vol. 39, no. 18,. p. 5527–5533
223. Drake, F. H. et al. 1996. Cathepsin K, but not cathepsins B, L, or S, is abundantly expressed in human osteoclasts. En: J. Biol. Chem. Vol. 271, no. 21,. p. 12511–12516.
224. Mattsson, J. P. et al. 1997. Characterization and cellular distribution of the osteoclast ruffled membrane vacuolar H+ - ATPase B subunit using isoform-specific antibodies. En: J. Bone. Mineral. Reser. Vol. 12, no. 5,. p. 753-760.
225. Stenbeck, G. et al. 2002. Formation and function of the ruffled border in osteoclasts. En: Cell. Develop. Biol. Vol. 13, no. 4,. p. 285–292.
226. Jouret, F. et al. 2005. Ubiquitous and kidney-specific subunits of vacuolar H_-ATPase are differentially expressed during nephrogenesis. En: J Am Soc Nephrol. Vol. 16, doi: 10.1681/ASN.2004110935,. p. 3235–3246.
227. Kristen, D., Brubaker, F.M., and Gay, C. V. 1999. Localization of carbonic anhydrase in living osteoclasts with bodipy 558/568-modified acetazolamide, a thiadiazole carbonic anhydrase Inhibitor. En: J. Histo. Cyto. Vol. 47, no. 4,. p. 545–550.
228. Littlewood-Evans, A. et al. 1997. Localization of Cathepsin K in human osteoclasts by in situ hybridization and immunohistochemistry. En: Bone. Vol. 20, no. 2,. p. 81-86
229. Faust, J. et al. 1999. Osteoclast markers accumulate on cells developing from human peripheral blood mononuclear precursors. En: J. Cell. Bioch. Vol. 72, no. 1,. p. 67 – 80
152
230. Krysko, DV. et al. 2006. Macrophages use different internalization mechanisms to clear apoptotic and necrotic cells. En: Cell Death Differ. Vol. 13, no. 12,. p. 2011–2022
231. Suzumoto, R., Takami, M., and Sasaki, T. 2005. Differentiation and function of osteoclasts cultured on bone and cartilage. En: J. Elec. Micros. Vol. 54, no. 6,. p. 529–540.
232. Wang, W. et al. 1997. Biomaterial particle phagocytosis by bone-resorbing osteoclasts. En: J Bone Joint Surg. Vol. 79-B, no. 5,. p. 849 - 56.
233. Nicolin, V. et al. 2006. Morphological features of osteoclasts derived from a co-culture system. En: J Mol Hist. Vol. 37, no. 3 – 4,. p. 171 – 177.
234. Nicolin, V. et al. 2007. Effects of neridronic acid on osteoclasts derived by physiological dual-cell cultures. En: Act. Histoch. Vol. 109, no. 5,. p. 397—402
235. Wang, Q. et al. 2003. Regulation of the formation of osteoclastic actin rings by proline-rich tyrosine kinase 2 interacting with gelsolin. En: J. Cell Biol. Vol. 160, no. 4,. p. 565 – 575.
236. Nakamura, I. et al. 1998. Echistatin inhibits the migration of murine prefusion osteoclasts and the Formation of Multinucleated Osteoclast-Like Cells. En: Endocrin. Vol. 139, no. 12,. p. 5182 – 5193.
237. Selinger, C. I., Day, C. J., Morrison, N. A. 2005. Optimized transfection of diced siRNA into mature primary human osteoclasts: inhibition of cathepsin K mediated bone resorption by siRNA. En: J Cell Biochem. Vol. 96, no. 5,. p. 996 - 1002.
238. Yao, G.F. et al. 2007. Characterization of vacuolar-ATPase and selective inhibition of vacuolar-H(+)-ATPase in osteoclastos. En: Bioche.Bioph. Res. Commun. Vol. 357, no. 4,. p. 821 – 827.
239. Takashi, I. et al. 1997. Cathepsin K antisense oligodeoxynucleotide inhibits osteoclastic bone resorption. En: J. Biol. Chem. Vol. 272, no. 13,. p. 8109 – 8112.
240. Lehenkari, P. et al. 1998. Carbonic anhydrase II plays a major role in osteoclast differentiation and bone resorption by effecting the steady state intracellular pH and Ca2+. En: Experim. Cell Reser. Vol. 242, no. 1,. p. 128 – 137.
241. Riddle, V., Dubrow, R., and Pardeet, A. B. 1979. Changes in the synthesis of actin and other cell proteins after stimulation of serum-arrested cells. En: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 76, no. 3,. p. 1298-1302.
153
242. Jacksont, P., and Bellett A.J.D. 1989. Relationship between Organization of the Actin Cytoskeleton and the Cell Cycle in Normal and Adenovirus-Infected Rat Cells. J.VIROL. Vol. 63, no. 1,. p. 311-318.
154
1166.. AANNEEXXOOSS
Anexo 1.
Tabla 7: CMNSP tratadas con PEG sembradas en vidrio
Tabla 8: CMNSP no tratadas con PEG sembradas en vidrio.
155
Tabla 9: CMNSP tratadas con PEG sembradas en matriz ósea.
Tabla 10: CMNSP no tratadas con PEG sembradas en matriz ósea.
156
Anexo 2.
Factores inter-sujetos
N
V2 24 4
48 4
72 4
Pruebas de los efectos inter-sujetos
Origen
Suma de cuadrados
tipo III gl Media
cuadrática F Sig.
Modelo corregido
1.134E8 1 1.134E8 1.642 .229
Intersección 4.230E9 1 4.230E9 61.235 .000
V1 1.134E8 1 1.134E8 1.642 .229
Error 6.908E8 10 6.908E7
Total 5.034E9 12
Total corregida 8.042E8 11
Comparaciones múltiples:
(I)V2 (J)V2
Diferencia de medias (I-
J) Error típ. Sig.
DHS de Tukey
24 48 -9525.35* 2673.294 .015
72 -18375.37* 2673.294 .000
48 24 9525.35* 2673.294 .015
72 -8850.02* 2673.294 .022
72 24 18375.37* 2673.294 .000
48 8850.02* 2673.294 .022
Games-Howell
24 48 -9525.35 2769.412 .052
72 -18375.37* 2095.408 .001
48 24 9525.35 2769.412 .052
72 -8850.02 3062.536 .070
72 24 18375.37* 2095.408 .001
48 8850.02 3062.536 .070