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Evaluación de la actividad y la diversidad bacteriana con potencial
bioremediador asociada a diferentes profundidades en el suelo del morro de Moravia mediante análisis de secuencias del Gen 16s rDNA
ANDRÉS GÓMEZ ZAPATA
TESIS DE MAESTRÍA
Directora Claudia Moreno (Bacterióloga, Ph.D)
Codirectora Gloria Ester Cadavid Restrepo. (Bacterióloga, M.Sc. Ph.D.)
MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MEDELLÍN
2011
RESUMEN En el presente trabajo, se evaluó y comparó la diversidad bacteriana más
representativa a diferentes profundidades (0, 10, 20 y 30 metros) en un antiguo
botadero de basuras. En el antiguo relleno sanitario de Moravia, se dispuso de
desechos de todo tipo sin control alguno por 12 años, entre los años 1972 y
1984. El lugar presenta altos niveles de contaminantes a diferentes
profundidades como cianuro y sulfuro de hidrogeno, metano, cromo, plomo y
compuestos aromáticos como toluenos, bencenos, fenoles y xilenos, tanto en la
matriz de residuos como en el lixiviado. En la determinación de la estructura de
las comunidades bacterianas se utilizaron técnicas independientes de cultivo,
basadas en el análisis y la amplificación de secuencias del gen 16SrRNA. Los
productos de la amplificación fueron analizados y caracterizados en librerías de
clones, en geles de poliacrilamida según su comportamiento denaturante y
movilidad electroforética, y según la longitud de fragmentos terminales
producidos con tres enzimas de restricción. Los amplicones obtenidos del gen
16S rDNA fueron secuenciados y comparados con secuencias encontradas en
bases de datos. La longitud de los fragmentos terminales fue igualmente
contrastada con aquellas encontradas en bases de datos en línea. Estas
afiliaciones permitieron inferir relaciones filogenéticas, ecológicas, espaciales y
funcionales de las poblaciones bacterianas asociadas al morro de Moravia,
encontrando que los patrones de diversidad y abundancia son altamente
variables aumentando con la profundidad. El análisis de diversidad muestra
que las comunidades bacterianas está dominada en su orden por miembros del
phylum Proteobacteria y sus tres divisiones α, β y λ y miembros del Phylum
Actinobacteria. Estos resultados fueron corroborados mediante aislamiento y
secuenciación de bacterias en medio de cultivo suplementado con hexadecano
como única fuente de carbono y por marcación de fenoles con isotopos estables
mediante la prueba SIP. Este trabajo permitió caracterizar patrones de
diversidad bacteriana a diferentes profundidades en un sitio altamente
contaminado; y sugiere que en estos ambientes, los patrones de diversidad
bacteriana están altamente influenciados por interacciones químicas complejas
inherentes a la calidad y cantidad de los contaminantes presentes, más que por
relaciones meramente espaciales como ocurre en suelos de formacion natural.
Igualmente se sugiere que la fracción de bacterias previamente cultivadas, tiene
un rol fundamental en los procesos de transformación y mineralización de
xenobióticos este sitio en particular. Estos datos son de gran valor a la hora de
implementar futuras tecnologías de recuperación de suelos como la
biorremediación y la fitorremediación.
ABSTRACT
A combination of culture dependent and culture independent methods was used
to asses bacterial diversity and function at different depths in the soil of a former
solid waste dump. The soil and leachate show high levels of gases like hydrogen,
sulfur cyanide and methane in acute levels, heavy metals as chromium and lead,
and aromatic compounds as benzene and phenols. Due to the especial
physicochemical conditions, it is thought that bacteria may play a significant role
for intrinsic bioremediation through all the soil profile. In order to infer possible
bioremediation processes, bacterial diversity patterns were determined. Total
DNA was extracted at 0, 10, 20 and 30 m and 16S rDNA genes were amplified
and separated through Temporal Temperature Gradient electrophoresis. Also the
fragments obtained were digested to obtain terminal restriction fragments of
different lengths to relate sequences and fragment size to specific phylogenetic
groups. The diversity patterns in among the 4 different depths were quite
variable, showing higher values in deeper samples. The culture independent
analysis showed dominance of the phylum Proteobacteria and its three divisions
λ, β, and α and Actinobacteria. These findings were supported by isolation of
bacteria using hexadecane as sole carbon source and use of stable isotope
probing to identify bacteria involved in phenol degradation. This research offers
new clues regarding bacterial diversity patterns through different depths in
polluted environments with unique physicochemical conditions, suggesting that in
these places the patterns may be most highly influenced by complex chemical
traits rather than being influenced by mere spatial or physicochemical
relationships and that the readily culturable fraction might be of vital importance
in this perturbed environment. These data could provide vital information in order
to implement future soil recovery techniques in the Moravia Hill based on
bioremediation.
AGRADECIMIENTOS
Este proyecto no hubiese sido posible sin el patrocinio del área metropolitana y
la Empresa de Desarrollo Humano EDU. Muchas gracias ante todo a la doctora
Gloria Ester Cadavid por haberme dado la oportunidad de trabajar bajo su
supervisión y por su constante apoyo durante la ejecución de esta tesis y mi
desarrollo profesional. Igualmente, muchas gracias a la doctora Claudia Ximena
Moreno por su asesoría técnica y profesional en el desarrollo de este proyecto.
Muchísimas gracias a la Sociedad Americana de Microbiología por haberme
otorgado la beca que permitió mejorar muchos aspectos de este trabajo. Gracias
al doctor Jerry Sims USDA –ARS (United States Department of Agriculture-
Agricultural Research Service) en la Universidad de Illinois en urbana-
Champaign U.S.A por darme la oportunidad de trabajar en su laboratorio y por el
gran apoyo intelectual, personal y económico que ofreció durante la ejecución de
esta tesis. Gracias igualmente al doctor Anthony Yannarell y la doctora Angela
Kent en la misma Universidad por sus constantes consejos técnicos y
disposición. Gracias a las técnicas de laboratorio Lynn Connor y Theresa
Holman (USDA-ARS) y los estudiantes Yu-Chi y Derrick Lee de la Universidad
de Illinois en Urbana Champaign por su apoyo técnico. Agradecimiento muy
especial a los profesores Mauricio Marín y Walter Osorio por haber sido modelos
de excelentes educadores y asesores durante el curso de mi maestría. Gracias
al profesor Benjamín Rojano por su colaboración en la consecución de reactivos
y por sus consejos. Al postgrado de Biotecnología y muy especialmente a Leidy
Londoño Vega, secretaria del área curricular por su constante colaboración.
Gracias muy especiales a Moisés Posada por ser un gran amigo y por toda su
ayuda y apoyo. Y por último a las personas más importantes de mi vida, mi
familia; mi padre Manuel Salvador, mi madre Stella y mis hermanos Carolina y
Julián, y por supuesto a mi esposa Ana María, sin duda, nada de esto hubiese
sido posible sin su amor, su comprensión y apoyo incondicional.
INDICE
CAPITULO 1.
1.1. INTRODUCCIÓN. Moravia, Antiguo relleno sanitario: una mirada al
problema contemporaneo de la disposición de residuos
……………………………………………….…………………………….. ..1
1.2. ESTADO DEL ARTE.
1.2.1. Contaminantes de importancia derivados de los procesos de
disposicion de residuos sóilidos – dinámica en el ambiente y
panorma
mundial………………………………………………………………..…5
1.2.2. Análisis y evaluación de la diversidad
microbiana……………………………………………………………….6
1.2.3. Ecología y diversidad microbiana en las profundidades del suelo y
en rellenos
sanitarios……………………………………………………………….10
1.2.4. Mecanismos y vías de biodegradación de
contaminantes…………………………………………………………14
1.2.5. Técnicas moleculares de detección e identificación de la
diversidad bacteriana y su funcion potencial en estudios de
Bioremediación………………………………………………………..19
1.2.6. Técnicas que relacionan estructura y funcion: el nuevo reto de los
estudios de
microbiodiversidad.......………………………………………………24
1.3. El presente estudio………………………………………………………..31
OBJETIVO GENERAL……..………………………………………………….……..28
OBJETIVOS ESPECIFICOS………………………………………………………....28
CAPITULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS………………………….…………….29
2.1 Practicas generales de laboratorio..………………..………………… 29
2.2 Muestras de suelo……………………………………………………….30
2.3 Extracción de ADN………………………………………………………30
2.4 Amplificación del Gen ribosomal 16s rADN y región espaciadora ITS
…………………………………………………………………………… 33
2.5 Clonación de fragmentos del gen 16S rADN
……………………………………………………………………………..34
2.6 Análisis de electroforesis en Geles de Poliacrilamida en
Temperatura Temporal (TTGE)…………………………………..35
2.6.1 Análisis de los patrones de bandeo y secuencias
obtenidas……………………………………………………….36
2.7 Análisis del polimorfismo en longitud de fragmentos de restricción
terminales (T-RFLP)……………………………………………………..37
2.8 Análisis de comunidades bacterianas involucradas en la degradación
de fenoles por la técnica de marcación con isotopos estables SIP
(Stable Isotope Probing)…………………………………………………38
2.9 Cultivo y aislamiento de bacterias en Hexadecano como única fuente
de Carbono………………………………………………………………..41
2.9.1 Aislamiento de las bacterias…………………………….......41
2.9.2 Caracterización molecular de los aislados………………….41
CAPITULO 3. RESULTADOS……………………………………………………….43
3.1 Determinación de Carbono elemental y pH……..………………………43
3.2 Extracción de ADN y amplificación del GEN 16S Radn……….….......43
3.3. Análisis de clones del gen 16S rADN obtenidos en el Estudio piloto
para la recuperación del morro de Moravia fase
I.……..………………………………….…………..………………………47
3.4 Análisis de patrones de diversidad por TTGE…….…………………..48
3.5 Análisis de patrones de diversidad por T-RFLP………………………..57
3.6 Identificación de bacterias asociadas a la degradación de fenoles por
SIP (Stable Isotope Probing)...............................................................59
3.7 Identificación y caracterización de bacterias aisladas en medios
suplementados con Hexadecano como única fuente de
Carbono……………………………………………………………………...71
CAPITULO 4.DISCUSION……………………..…………………………………….77
4.1 Diversidad bacteriana a diferentes profundidades en el Morro de
Moravia… …………………………………………………………….77
4.1.1 Análisis de perfiles de diversidad por TTGE y T-RFLPs
…………………………………………………………………79
4.2. Análisis de bacterias involucradas en la degradación de Fenoles
mediante la prueba SIP………………………………………………….84
4.3. Análisis de la fracción cultivable degradadora de Hexadecano……89
CAPITULO 5. CONCLUSIONES…………………………………………………….94
BIBLIOGRAFÍA..………………………………………………………..…………….97
ANEXOS………………………………………………………………………………119
LISTADO DE TABLAS
Tabla 1 Localización de las muestras analizadas y técnicas utilizadas para el
análisis de la diversidad bacteriana a varias profundidades en la matriz de
residuos de Moravia………………………………………………………………….. 32
Tabla 2. Iniciadores utilizados en las reacciones de amplificación del gen 16S
rADN para las técnicas de detección de diversidad bacteriana a diferentes
profundidades en la matriz de residuos del morro de Moravia…………………...42
Tabla 3. Valores de carbono elemental a diferentes profundidades. …………..43
Tabla 4. . Identidad de los clones obtenidos durante el estudio piloto para la
recuperación del morro de Moravia fase......................................………………..48
Tabla 5. Homologías de las secuencias obtenidas con individuos registrados en
bases de datos en línea………………..………………………………………….….52
Tabla 6. Porcentajes de degradación de fenol por días en cada profundidad y
momentos en los cuales se extrajo ADN……………………………………………59
Tabla 7. Fragmentos dominantes obtenidos con tres enzimas de restricción en
ADN marcado con el Isotopo estable 13C mediante la técnica de marcación con
isotopos estables durante dos días de extracción de ADN (Días 4 y 6)
……………………………………………………………………………………...……65
Tabla 8. Fragmentos terminales y afiliación taxonómica de los de los clones
seleccionados en cada profundidad, obtenidos mediante la técnica de marcación
de sustratos con isotopos estables…………………………………………………68
Tabla 9. Conteo de bacterias degradadoras de hidrocarburos en medio BH
(Bushnell-Haass) obtenidas de diferentes profundidades en la matriz de residuos
de Moravia. ………………………………………………….………………………...72
Tabla 10. Caracterización taxonómica de 17 aislamientos obtenidos en medio
suplementado con hexadecano como única fuente de carbono a diferentes
profundidades en la matriz de residuos de Moravia
…………………………………………………………………………………………...74
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1. Muestras provenientes de la matriz de residuos de Moravia tomadas a
20m de profundidad…………………………………………………………………….4
Figura 2. Panorámica de la posición y distribución de los asentamientos
humanos sobre la matriz de residuos del morro de Moravia………………………4
Figura 3. Electroforesis de extracción de ADN de muestras de suelo tomadas de
5 puntos muestreados a 0, 5, 10, 20 y 30m. ADN aislado utilizando el
PowerSoil™ ADN extraction Kit (MoBio Laboratories, CA, USA)………………..45
Figura 4. Electroforesis de Extracción de ADN de muestras de suelo tomadas a
partir de la mezcla de 5 puntos muestreados a 0, 5, 10, 20 y 30m. ADN aislado
utilizando el FAST ADN spin kit™ (QIAGEN, CA, USA)………………………… 46
Figura 5. Análisis de polimorfismo de fragmentos de restricción para 14 clones
obtenidos con las enzimas Alu I y Rsa I en el proyecto piloto para la
recuperación del Morro de Moravia fase I…………………………………………..47
Figura 6. Gel de electroforesis en gradiente de temperatura temporal (TTGE) con
los puntos muestreados individualmente a 0 10, 20 y 30
m……………………………….………………………………………………………..51
Figura 7. Dendograma construido para las secuencias del gen 16S rADN
obtenidas en la técnica TTGE ……………………………………………………….53
Figura 8. Dendograma construido a partir de los fragmentos 16S rADN obtenidos
en cada punto y profundidad muestreadas ………………………………………...54
Figura 9. Gel de Electroforesis en gradiente de temperatura temporal
complementario (TTGE) con las muestras provenientes de las mezclas de los 6
puntos muestreados a 0, 10, 20 y 30 m
…………………………………………………………………………………………...55
Figura 10. Dendograma construido a partir de los fragmentos del gen 16S rADN
obtenidos en las mezclas de cada punto muestreado a 0, 10 20 y 30 m.
…………………………………………………………………………………………...56
Figura 11. Dendograma construido a partir de los patrones de restricción
obtenidos mediante la técnica T-RFLP para las mezclas de cada punto
muestreado a 0, 10 20 y 30 m ……………………………………………………....58
Figura 12. Electroforesis de la amplificación del gen 16S rADN en las fracciones
obtenidas con el ADN no marcado (A) y marcado con el isotopo estable 13C (B)
para la segunda extracción de ADN (Día 6) en la muestra de suelo a 20m
…………………………………………………………………………………………...60
Figura 13 A. Patrones T-RFLP de 368 y 369 bp del gen 16S rADN obtenidos con
la enzima HhaI en muestras de suelo a 0 m en 2 momentos de extracción de
ADN (4 y 6 días)....…………………………………………………………………….66
Figura 13 B. Patrones T-RFLP de 474 bp del gen 16S rADN obtenidos con la
enzima RsaI en muestras de suelo a 10 m en 2 momentos de extracción de ADN
(4 y 6 días)………………………………………………………………...…………...67
Figura 13 C. Patrones T-RFLP de 500 bp del gen 16S rADN obtenidos con la
enzima MspI en muestras de suelo a 20 m en 2 momentos de extracción de
ADN (4 y 6 días)…………………………………………………………………….…68
Figura 13 D. Patrones T-RFLP de 422 y 455 bp del gen 16S rADN obtenidos con
la enzima RsaI en muestras de suelo a 30 m en 2 momentos de extracción de
ADN (4 y 6 días)…………………………………………………………………….…69
Figura 14. Dendograma para las secuencias del gen 16s rADN de los clones
caracterizados mediante la prueba SIP. ……………………………………………70
Figura 15. Dendograma construido con los patrones de regiones espaciadoras
intergénicas (ITS) de los individuos aislados en medio suplementado con
hexadecano como única fuente de carbono …………………………………….…73
Figura 16. Dendograma para las secuencias del gen 16s rADN de los
aislamientos caracterizados.……………………………………………………..…..77
LISTADO DE ANEXOS
Anexo 1. Localización de los inclinómetros y piezómetros instalados en el Morro
de Moravia…………………………………………………………………...............119
Anexo 2. Extracción de ADN de bacterias aisladas en hexadecano como única
fuente de carbono (Adaptado de Sambrook y Russel, 2003)…………………...120
Anexo 3. Protocolo de restricción con las enzimas HhaI, RsaI, MspI…............121
Anexo 4. Tinción de geles de poliacrilamida con nitrato de plata………………121
Anexo 5. Protocolo de elución de bandas en geles de poliacrilamida (Crush and
Soak Method, Sambrook y Russel, 2001)…………………………………………122
Anexo 6. Ilustración del protocolo de fraccionamiento y separación del ADN
marcado con el isotopo estable 13C………………………………………………..123
Anexo 7. Preparación de medio de cultivo Bh (Bushnell-Haas) para aislamiento
de bacterias degradadoras de hexadecano como única fuente de
carbono………………………………………………………………………………..124
Anexo 8. Listado de aislamientos en medios suplementados con hidrocarburos
como única fuente de carbono en la matriz de residuos de
Moravia………………………………………………………………………………..125
Anexo 9. Fotografías de morfología y tinción de Gram para los aislados
dominantes Acinetobacter sp y Bacillus sp en el análisis de bacterias aisladas en
hexadecano como única fuente de carbono………………………………………127
Anexo 10. Dendograma construido mediante el método Neighbor joining para las
secuencias 16s todas las secuencias obtenidas……………………………,,…..129
1
CAPÍTULO 1.
1.1 INTRODUCCIÓN.
Moravia, antiguo relleno sanitario: Una mirada al problema contemporáneo
de la disposición de residuos
El problema de la disposición de residuos ha sido de gran preocupación para el
hombre. Anteriormente era suficiente con cubrir y enterrar o incinerar residuos de
cualquier clase en un área determinada (Leung, 2004). Sin embargo estas
acciones empezaron a mostrar su lado negativo una vez que las fuentes de agua
subterránea y la atmósfera empezaron a mostrar altos grados de contaminación,
amenazando la integridad y la salud de los asentamientos humanos (USEPA,
2004). Varios autores han reportado los efectos adversos de vivir en regiones
cercanas a rellenos sanitarios (Norton, 2007; Palmer et al, 2005) aun en donde se
llevan controles estrictos de disposición de residuos utilizando aisladores plásticos
y sistemas de recolección de lixiviado y gases.
Estos altos niveles de residuos sólidos generados por las grandes tasas de
crecimiento de la población han hecho que el número de sitios adecuados
cercanos a las ciudades para la disposición de residuos antes de su tratamiento
sea cada vez más limitado, sobreexplotando su vida útil, tornando los residuos en
recalcitrantes y permitiendo su acumulación en los sistemas tróficos (Rushton,
2003; Jordening y Winter, 2005; Norton et al 2007; Vinceti et al, 2009). Además,
las grandes cantidades de metano liberado en la atmosfera producto de los
procesos de biodegradación en el suelo, contribuyen en gran medida al
fenómeno de cambio climático mundial (http://www.waste-management-
world.com, 2009; Singh et al, 2009).
En Colombia, la principal opción para el manejo de los desperdicios sólidos
urbanos son los rellenos sanitarios, alrededor del 90 % de los residuos son
depositados en rellenos sanitarios semi-controlados o tecnificados con algún
grado de control sobre aguas subterráneas y fuentes de aire; el 10 % restante, es
2
dispuesto de forma ilegal en botaderos al aire libre, fuentes de agua como ríos,
quebradas y bahías, sometido a incineración o sepultados; menos del 1 % es
dispuesto en plantas especializadas para su tratamiento (Clean Development
Mechanism: http://cdm.unfccc.int, 2008, Ministerio de Medio Ambiente y
Desarrollo Territorial: http://www.minambiente.gov.co/portal/default.aspx)
En el morro de Moravia, ubicado sobre depósitos aluviales del río Aburrá en el pie
de monte de la ladera nororiental de la ciudad de Medellín; se dispuso de grandes
cantidades de residuos sin control alguno en el período comprendido entre 1972 y
1984. En la fase inicial de operación, se depositaban unas cien toneladas diarias
de basura, cantidad que con el tiempo fue en aumento. Después de haberse
depositado desechos de diverso origen como industrial, hospitalario y casero, se
formó una montaña de 37 m de desechos sobre la cual se asentaron más de
7,000 familias (Peñuela et al, 2009; Rodriguez and Peñuela, 2009; Sanchez et al.,
2010).
El material portante del morro de Moravia dista en gran medida del concepto de
suelo. Hay material rocoso fragmentado a diferentes concentraciones y diámetros
(hasta 40 % en concentración y 5 cm de diámetro). Pero tal vez la característica
que más llama la atención es la presencia de plásticos, vidrios, piezas metálicas y
trozos de tela en concentraciones que varían a diferentes puntos y profundidades
(hasta un 40 %). (FIGURA 1). La textura del suelo varía entre arcillosa y limosa
principalmente con contenido variable de gravas y alta contenido de humedad y
materia orgánica (Peñuela et al, 2009; Sánchez et al, 2010).
El suelo del morro de Moravia ha sido sometido a presión constante desde que los
primeros asentamientos humanos empezaron a poblar el sitio. Se estima que para
el año 2003 habían 7532 viviendas, factor que pudo contribuir en gran medida a
definir las características físicas del suelo (FIGURA 2). Adicionalmente, en el suelo
se encuentran varios contaminantes que sobrepasaban los límites permisibles;
gases como el cianuro de hidrogeno y metano cerca al límite de explosividad,
3
metales pesados como cromo, plomo y cadmio, también cianuro y sulfuro en el
lixiviado, gases como el sulfuro de hidrogeno e hidrocarburos complejos cíclicos
aromáticos como benceno, fenoles, tolueno y xileno (Peñuela et al, 2009 et al.,
2009; Rodriguez and Peñuela et al, 2009, 2009). Las consecuencias de la
exposición a los contaminantes mencionados, han sido descritas por varios
autores y entidades ambientales gubernamentales alrededor del mundo (Daulton
et al, 2002; Parnell et al2006; Islam et al, 2006; Jing et al, 2007; ATSDR-Agencia
para las sustancias toxicas y registro de enfermedades- USA, 2009).
Por la inminente amenaza de estos compuestos sobre las más de 7000 familias
residentes, el lugar fue declarado calamidad pública (Resolución 31, del 28 de
junio del 2006, del Ministerio del Interior y de Justicia) y se decidió reubicar la
población y formular en el corto y mediano plazo un plan de manejo ambiental y
sanitario para mitigar la problemática allí existente (Peñuela et al, 2009).
4
FIGURA 1. Muestras provenientes de la matriz de residuos de Moravia tomadas a 20m de profundidad.
FIGURA 2. Panorámica de la posición y distribución de los asentamientos humanos sobre la matriz de residuos del morro de Moravia.
5
1.2. ESTADO DEL ARTE
1.2.1. Contaminantes de importancia derivados de los procesos de
disposición de residuos sólidos – dinámica en el ambiente y panorama
mundial.
Existen alrededor de 16 millones de compuestos orgánicos de origen natural o
antropogénico, de los cuales alrededor de 40,000 son esenciales en nuestra vida
diaria (Hou, et al, 2003; Gómez et al, 2007; Singh et al, 2009). La utilización de
estos compuestos como materia prima para productos de consumo actuales y
sus procesos de conversión no son 100 % eficientes, por lo tanto en cualquier
actividad industrial, a mayor o menor escala, se generan productos de desecho
generalmente depositados en el ambiente después de su utilización completa,
provocando un impacto ambiental significativo (Junca, 2004).
Entre los contaminantes orgánicos más recurrentes se incluyen los alcanos o
hidrocarburos saturados en cuya estructura hay ausencia de doble ó triple enlace
ó enlaces aromáticos; los compuestos aromáticos monocíclicos o policíclicos de
los cuales los hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH’s) y sus derivados,
además de ser los más comunes, son considerados los más peligrosos. Son
también relevantes los nitroaromáticos, hidrocarburos clorinados, halógenos y
bifenilos policlorados (Van, Hamme et al, 2003; Atlas y Philips, 2005; Junca,
2004, Yong y Mulligan, 2004; Jordening y Winter, 2005; Singh et al, 2009;
http://www.epa.gov/, 2009). Algunos de estos compuestos forman mezclas
complejas recalcitrantes entre sí y con compuestos propios de las matrices
ambientales en donde se encuentran como ácidos orgánicos (Singh, et al, 2009;
Zhou et al, 1996; Young y Mulligan, 2004).
Además de los compuestos orgánicos, los metales pesados y los fertilizantes
químicos inorgánicos son de igual manera contaminantes de gran importancia.
Los metales pesados son elementos que pierden electrones fácilmente y que son
susceptibles a formar iones positivos y por lo tanto son altamente reactivos.
Aunque hay 39 elementos clasificados como metales pesados, los más comunes
6
en la contaminación de suelos son el cromo, cadmio, plomo, hierro, mercurio,
zinc, cobre, y plata (Young y Mulligan, 2004).
Los contaminantes se pueden encontrar entre una fase soluble o adsorbidos
sobre materiales y compuestos propios del suelo (orgánicos e inorgánicos)
formando interacciones complejas dipolo-dipolo, interacciones hidrofóbicas,
puentes de hidrogeno o uniones covalentes que en ultimas determinan su
disponibilidad para reacciones químicas, físicas y biológicas (Dean, 2007; Singh
et al, 2009). Igualmente la capacidad de reacción de los contaminantes del suelo
está determinada por el perfil hidrogeológico, reacciones de óxido reducción,
carga iónica, acidez de la matriz y por supuesto naturaleza del contaminante;
polaridad, grupos funcionales asociados y solubilidad en agua (Young y Mulligan,
2004).
1.2.2. Análisis de la diversidad microbiana e implementación de programas
de recuperación de matrices contaminadas.
Una de las soluciones al problema de la disposición de residuos la constituye la
implementación de técnicas de remediación biológica como la biorremediación;
cuyo fin es la degradación o transformación de contaminantes en compuestos o
elementos menos peligrosos o no peligrosos, utilizando las baterías enzimáticas
de microorganismos como bacterias, hongos e incluso algas (Leung, 2004; Van
Hamme, 2003). Dicha técnica comprende métodos seguros y menos costos en
comparación con otros procesos de remediación químicos y/o físicos de el
tratamiento de residuos como la incineración, la extracción de vapor, la desorción
térmica, el lavado de suelos y el empleo de rellenos sanitarios (Junca, 2004;
Philip y Atlas, 2005; Singh et al, 2009).
En Colombia, varios estudios recientes, sugieren el tratamiento preliminar de los
desechos por técnicas de biodegradación para la remoción de residuos tóxicos;
algunos autores recomiendan alternativas como la digestión anaerobia y el uso
de biorreactores anaeróbicos como una forma de remediar el problema ambiental
en sitios destinados a la disposición de residuos o en lugares donde se dispone
7
de residuos en suelos, aguas residuales de forma accidental o circunstancial
(Ramírez et al, 2001, Díaz y Espita 2001; Castillo et al, 2006).
Varios estudios recientes en Colombia han caracterizado metabólicamente la
acción de algunos grupos bacterianos específicos o consorcios sobre
contaminantes particulares como metales pesados, compuestos inorgánicos y
orgánicos como el cianuro fenoles e hidrocarburos, todos producto de la
manufactura a nivel industrial (Valderrama et al, 2002; Gocke et al, 2003;
Velásquez y Dussan, 2009). No obstante en dichos trabajos, no hay una
caracterización completa de la diversidad microbiana asociada a estos procesos
de remediación. Sin embargo, Mostafa y Helings (2003), hicieron una
identificación de algunos aislados asociados a la degradación de químicos
utilizados en el control del cultivo de estupefacientes por técnicas dependientes
de cultivo.
La determinación de la diversidad microbiana debe realizarse como primer paso
en los procesos de recuperación ambiental para entender el rol fundamental de los
microorganismos responsables de los ciclos biogeoquímicos y como sensores de
cambios ambientales, centrando al mismo tiempo su valor como fuente abundante
de recursos biotecnológicos (Tiedje, 1994). El perfil de la diversidad microbiana
puede representar la capacidad del suelo para enfrentarse a perturbaciones
externas y puede ser un indicador para evaluar su calidad (Hartmann et al, 2006).
Adicional a esto, estudios recientes relacionados con el potencial bioremediador
de microorganismos en procesos de recuperación ambiental como la atenuación
natural de metales pesados, radiactivos y de compuestos orgánicos, sugieren de
antemano tener un conocimiento completo de la diversidad, ecología, fisiología y
filogenia de las comunidades microbianas. Estos estudios de microbiodiversidad
han revelado la presencia de grupos bacterianos con potencial bioremediador y
por lo tanto de genes de interés en procesos catabólicos importantes (Abulencia et
al, 2006; Singh et al, 2009).
8
En los métodos biológicos ex - situ e in-situ, utilizados como técnicas de
recuperación de suelos contaminados, se destaca con atención el rol fundamental
de las comunidades microbianas. Por ejemplo, en el uso de biopilas (compost) y
biorreactores, se estimulan las poblaciones naturales microbianas mediante
incorporación de agua, aire y nutrientes para controlar y manipular su crecimiento
e influir en la degradación y disminución de la concentración de contaminantes. En
las técnicas de biolixiviado, bioestimulación y bioventeo se inocula el sitio con
grupos bacterianos específicos estimulando igualmente las comunidades
microbianas existentes mediante la incorporación de agua, aire y nutrientes.
En la fitorremediación se utilizan plantas superiores para inactivar contaminantes
mediante inmovilización, absorción a través de tejidos, y/o liberación a la
atmosfera, muchas veces formando interacciones con las comunidades
bacterianas asociadas a la rizósfera. En el monitoreo de atenuación natural se
siguen con atención los procesos naturales de degradación en función de tiempo
mediante el monitoreo periódico de la composición, abundancia y procesos
metabólicos de las comunidades microbianas presentes. (Singh et al, 2009; Atlas y
Philips, 2005, Van Hamme, 2003)
Es claro que las comunidades microbianas juegan un papel fundamental en
cualquiera de las técnicas de remediación biológica, dependiendo por supuesto,
de las características fisicoquímicas de la matriz bajo estudio, el lugar,
presupuesto y tiempo disponible. La caracterización de la microbiodiversidad
cobra gran importancia a la hora de determinar la cantidad y naturaleza de los
nutrientes y/o elementos destinados a estimular el crecimiento microbiano en las
técnicas de bioestimulación. Igualmente, esta información es importante al
momento de decidir qué tipo de plantas y/o microorganismos se pueden incorporar
en programas de fitorremediación y biorremediación.
9
En programas de recuperación por bioaumentación, la determinación de la
microbiodiversidad es vital para establecer el análisis de relaciones metabólicas,
cometabólicas y ecológicas entre las nuevas comunidades de organismos
incorporados y los existentes. Más aun después de aplicar programas de
biorremediación, una de las evidencias de remoción de los contaminantes de
interés, además de la determinación de las tasas de disminución de dicho
contaminante, es el cambio en los perfiles de las comunidades microbianas y sus
diferencias espaciotemporales en cuanto al cambio en los perfiles de diversidad y
abundancia (Atlas y Philips, 2005; Singh et al, 2009).
Es precisamente, en la evaluación de la diversidad microbiana de especies
bacterianas nuevas y poco caracterizadas hasta ahora, donde se ofrece una
solución potencial al problema ambiental de basureros como el morro de
Moravia. Esto cobra un interés particular cuando el porcentaje de bacterias que
han podido ser cultivadas en la mayoría de ambientes contaminados o no, hasta
ahora no sobrepasa un 5% lo que tiende un manto de incertidumbre sobre el
potencial real en términos biotecnológicos de los individuos que no han podido
ser cultivados aún, teniendo en cuenta que los procesos biodegradadores no son
producto de las actividades de comunidades microbianas de forma simple y
aislada, sino que ocurren en procesos complejos de innumerables interacciones
interconectadas entre sí (Junca, 2004).
Por lo tanto, la caracterización de la diversidad bacteriana en el morro de
Moravia, permitiría inferir y caracterizar las posibles funciones de especies
individuales y comunidades bacterianas en procesos de recuperación ambiental,
deducir procesos catabólicos complejos presentes y entender los factores
limitantes potenciales que rigen los mecanismos reguladores genéticos y
biogeoquímicos que se llevan a cabo allí. Eventualmente, sería posible extender
nuestro conocimiento sobre las vías catabólicas presentes en los procesos de
degradación de xenobióticos y demás desechos de origen antropogénico, de las
cuales solo se han caracterizado cerca de 900 después de 60 años de estudio
(Gómez et al, 2007).
10
1.2.3 Ecología y diversidad microbiana en las profundidades del suelo y en
rellenos sanitarios.
Los suelos son considerados los ambientes más diversos desde el punto de vista
microbiano en la tierra debido a su gran heterogeneidad física, química y biológica.
Por ejemplo, se pueden encontrar hasta 10 9 bacterias en un gramo de suelo con
una diversidad de hasta más 4,600 genomas distintos (Hansel et al, 2008; Singh et
al, 2009); (Hugenholtz 2002). Lo anterior representa una evidente dificultad al
momento de caracterizar la diversidad bacteriana, pero a la vez ofrece un
panorama promisorio en cuanto al potencial bioremediador de las comunidades
nativas en el suelo. Adicionalmente, es bien sabido que los microorganismos
sostienen casi todas las otras formas de vida en la tierra y son esencialmente
importantes para la vida humana influenciando el clima, la salud, la actividad
agrícola y el destino final de los contaminantes en un sitio determinado (Schloss et
al, 2006).
En estudios taxonómicos de la diversidad microbiana del suelo, Janssen (2006)
hace alusión a un listado publicado en la década de los 70 en donde por métodos
dependientes de cultivo, fueron aislados nueve géneros bacterianos
predominantes en el suelo: Agrobacterium, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus,
Flavobacterium, Micromonospora, Nocardia, Pseudomonas y Streptomyces. En la
actualidad, con los análisis de secuencias del gen 16S rADN a partir del ADN
genómico del suelo por técnicas independientes de cultivo, se ha revelado que los
nueve géneros descritos en esa época, constituyen solamente entre 2.5 % y 3.2 %
de las bacterias del suelo (Janssen, 2006). Esto quiere decir que existe una gran
diversidad microbiana determinada por diversos factores físicos, químicos y
biológicos que sólo ahora está siendo conocida gracias a la aplicación de las
técnicas moleculares.
11
Desde el advenimiento de las técnicas moleculares utilizando marcadores
filogenéticos como el gen ribosomal 16S, se han constituido librerías genómicas
cuyos miembros de diferentes grupos y sub-grupos incluyen en su orden:
Proteobacteria, Acidobacteria, Actinobacteria, Verrucomicrobia, Bacteroidetes,
Chloroflexi, Planctomycetes, Gemmatimonadetes y Firmicutes (como los más
abundantes), destacando a los miembros de Acidobacteria y Verrucomicrobia
como grupos emergentes a partir del uso de las técnicas moleculares (Forney,
2004). Adicionalmente, el uso de este marcador permitió la caracterización de el
dominio Arquea, y particularmente el phylum Chrenarcheota, el cual es igualmente
abundante en suelos, cumpliendo un rol fundamental desde el punto de vista
metabólico. (Hansel et al, 2008; Forney, 2004).
En general, la mayoría de los estudios de diversidad microbiana en suelo se han
enfocado en análisis comparativos entre sitios distintos y/o adyacentes, en los
mismos suelos o en diferentes tipos de suelos. Sumado a esto, la mayoría de
estudios se centran en la caracterización de comunidades microbianas en la
superficie (hasta 25 cm.) donde hay más densidad de microorganismos (Fierer et
al, 2003). Por otro lado, pocos estudios se han concentrado en determinar la
diversidad en la profundidad del suelo o a través de todo su perfil. Hansel y
colaboradores (2008) aducen que la abundancia, composición y la diversidad de
las comunidades microbianas en el suelo están fuertemente relacionadas con el
nivel de profundidad.
La biomasa bacteriana, la concentración de genes 16S rADN tanto de bacterias
como de arqueas, el numero de picos obtenidos por la técnica de T-RFLP
(Polimorfismo en la longitud de fragmentos de restricción terminales), el numero
de bandas obtenidas por DGGE (Electroforesis en gel de gradiente denaturante) y
la cantidad de bacterias Gram negativas con respecto a Gram positivas, son todos
valores que disminuyen a medida que se aumenta en profundidad, en
comparación con los valores obtenidos en la superficie del suelo.
12
A pesar de estas diferencias entre la superficie y las profundidades, los
microorganismos de la sub-superficie, juegan también un papel fundamental en la
formación del suelo, en la estructura del ecosistema, en sus características
biogeoquímicas, en la degradación de contaminantes y en la calidad del agua
subterránea. Teniendo en cuenta las diferencias fisicoquímicas y las de carácter
biomolecular entre los distintos perfiles del suelo, una caracterización morfológica,
molecular y metabólica de las comunidades microbianas solo a nivel de superficie,
no puede ser un indicativo de la diversidad microbiana a profundidad (Fierer et al,
2002).
En estudios donde se desea determinar cómo las comunidades microbianas
responden a cambios y disturbios de origen antropogénico y como la estructura de
la comunidad podría ofrecer una visión de estos cambios, es necesario dar cuenta
de la heterogeneidad espacial por medio de estudios multi escala. (Franklin y Mills,
2007). Teniendo en cuenta que los procesos bio-geo-físico-químicos se visualizan
en función de redes de comunidades interconectadas entre sí, el concepto de los
estudios multi escala es de vital importancia cuando se trata de determinar como
algunas variables ambientales como abundancia, diversidad y actividad, fluctúan
en diferentes espacios, y como estos parámetros dan cuenta de procesos de
cambio, biodegradación y distribución y movimiento de microorganismos cuando
se introducen individuos con fines bioremediadores como ocurre en técnicas de
fitorremediación y bioaumentación. El conocimiento de estos procesos podría
ofrecer predicciones acerca del comportamiento de posibles fenómenos de
biodegradación (Junca, 2004; Franklin y Mills, 2007).
Entre los factores geofísicos y químicos que cambian con la profundidad y que
afectan por lo tanto las comunidades microbianas a nivel del suelo, tenemos el
tamaño de la partícula, contenido de agua, concentración de oxígeno, el pH,
contenido de carbono orgánico, disponibilidad de nutrientes y aceptores de
electrones terminales, (Hansel et al, 2008; Allison et al, 2007; Holden et al, 2005).
Por ejemplo el contenido y calidad de sustratos de carbono en suelos decrece con
13
la profundidad, es por esto que en la superficie, debido a los ciclos de
congelamiento y descongelamiento, los periodos de desecamiento, la alta cantidad
de oxígeno, los exudados de la raíz, la hojarasca y la descomposición de la
materia orgánica, se podría esperar una amplia riqueza y variación de estos
sustratos carbonados. En contraste, en los horizontes más bajos, la disponibilidad
de estos materiales tiende a ser limitada. Estas diferencias tienen gran influencia
en la composición de las comunidades microbianas (Fierer et al, 2002 Allison et al,
2007). Sin embargo, a nivel de profundidad, es difícil predecir el potencial
bioremediador en función de patrones de diversidad, debido a que los patrones de
biomasa bacteriana y actividad metabólica ya mencionados, son altamente
influenciados por la naturaleza fisicoquímica de los contaminantes presentes
(Holden y Fierer, 2005). Esta idea refuerza la propuesta de ejercer estudios a
escalas múltiples en términos espaciales y temporales, mas aun cuando no se
tiene un conocimiento previo de las comunidades en la matriz bajo estudio
(Franklin y Mills, 2007).
Varios trabajos se han enfocado en determinar la diversidad bacteriana en
ambientes relacionados con rellenos sanitarios o sitios contaminados ya sea en el
lixiviado o en el suelo como tal, pero no se conocen hasta ahora estudios
relacionados con la diversidad bacteriana a nivel de profundidad en sitios con
características similares al morro de Moravia en donde la disposición de residuos
se llevó a cabo sin controles de aislamiento entre capas de residuos y sistemas de
liberación de gases. Estudios previos efectuados con el fin de caracterizar la
diversidad bacteriana en muestras de agua subterránea obtenidas de rellenos
sanitarios por extracción de ADN y comparación de las secuencias del gen 16S
rADN, muestran el phylum Proteobacteria como la división dominante, seguido por
Bacteroidetes, Cianobacteria, Actinobacteria y Firmicutes. Desde el punto de vista
metabólico, muchas de las secuencias están relacionadas con microbios
anaerobios fermentativos, metilotrófos, metanotrófos, desnitrificantes,
degradadores de halobenzoatos y reductores de percloratos (compuestos
14
comunes en desinfectantes, herbicidas y blanqueadores) (Tian, et al, 2005, Roling
et al, 2001).
1.2.4. Mecanismos y vías de biodegradación de contaminantes
La biodegradación se define como la reducción en la complejidad de compuestos
químicos por catálisis biológica basada en la capacidad que tienen los
microorganismos de degradar casi cualquier sustancia química orgánica e
inorgánica (Jordening y Winter, 2005). Los estudios de química ambiental y
ecología microbiana han logrado caracterizar las vías de biodegradación de un
sinnúmero de contaminantes incluyendo hidrocarburos aromáticos, alifático,
policíclicos, bifenilos policlorados, pesticidas y metales pesados entre otros
(Bonaventura y Johnson, 1997).
Los microorganismos tienen acceso a compuestos adsorbidos sobre las partículas
del suelo y / ó a contaminantes depositados en las fase solubles del suelo. Los
mecanismos de degradación pueden llevarse acabo mediante generación de
cambios en gradientes de concentración y mecanismos de transporte intra y extra
celular, micro cambios en pH, secreción de enzimas extracelulares, producción de
surfactantes y emulsificantes para acceder a sustancias orgánicas insolubles,
agentes quelantes y solventes (Van Hamme, 2007; Singh et al, 2009). Además,
teniendo en cuenta el origen biológico de los contaminantes orgánicos como los
hidrocarburos aromáticos y alifáticos, es fácil entender como los microorganismos
han adaptado su crecimiento a las diferentes concentraciones de estos
compuestos a través de su evolución y la evolución antropogénica social e
industrial (Jordening y Winter, 2005)
Las vías metabólicas mas caracterizadas en la biodegradación de los compuestos
orgánicos aromáticos, alifáticos y cíclicos, son principalmente de carácter aeróbico
y son a su vez las más rápidas ofreciendo generalmente una mineralización
completa (transformación a CO2 y H2O). Esto se debe a que en presencia de
oxigeno, los compuestos contaminantes son fácilmente hidroxilados por baterías
15
enzimáticas microbianas (monoxigenasas, dioxigenasas e hidroxilasas) en
reacciones bioquímicas energéticamente favorables para luego ser transformados
hasta su eventual mineralización (Junca, 2004). En contraste, los procesos de
degradación anaeróbica deben estar acopladas a condiciones de reducción, no
siempre disponibles en todos los ambientes y con un alto costo energético
(Jordening y Winter, 2005). Los pasos iniciales en la biodegradación aeróbica
incluyen la oxidación del sustrato por enzimas de la subclase oxigenasas y
peroxidasas mediante incorporación de átomos de oxígeno (1 o 2 dependiendo de
la naturaleza del sustrato y batería enzimática disponible) a una enorme variedad
de sustratos, los cuales se utilizan como fuente para generar energía
convirtiéndose subsiguientemente en alcoholes y epóxidos entre otros
subproductos (Atlas, 1995; Atlas y Philip, 2005; Jordening y Winter, 2005; Singh et
al, 2009).
En la biodegradación aeróbica de los compuestos aromáticos como bencenos,
Toluenos, Xilenos, Naftalenos, Fenoles y sus derivados, los anillos son
hidroxilados para formar dioles, luego son fracturados con la subsiguiente
formación de catecoles y protocatecoato, los cuales son degradados a productos
intermedios del ciclo de ácidos tricarboxílicos como el semialdehído
hidroximucónico. Cabe anotar que los hongos y las bacterias producen
intermediarios con diferente estereoquímica; los complejos enzimáticos eucariotas
forman trans-dioles, metabolitos potencialmente carcinogénicos, en cambio la
maquinaria enzimática bacteriana forma cis-dioles, inactivos biológicamente. Esta
es otra de las razones por las cuales la biorremediación con bacterias presenta
una ventaja frente una remediación fúngica, adicionalmente, muchos de estas
enzimas son codificadas por elementos plasmídicos en procariotas, lo que
conlleva a una gran plasticidad genética y un amplio espectro de bacterias
envueltas en procesos degradativos (Atlas & Philips, 2005; Jordening y Winter,
2005; Singh et al, 2009).
16
Sin embargo, la degradación de muchos compuestos aromáticos recalcitrantes
con algún grado de halogenación (sustituciones cloradas) como los bifenilos
policlorados, dioxinas y algunos pesticidas como DDT, ocurre más comúnmente
bajo condiciones anaerobias. Esto se debe a que dichos compuestos son
generalmente resistentes al ataque nucleofílico por las oxigenasas de bacterias
aeróbicas, una vez estos procesos de deshalogenación se llevan a cabo, estos
compuestos pueden ser susceptibles a ataque por oxigenasas en procesos
enzimáticos aerobios (Jordening y Winter, 2005). Los procesos de degradación
anaerobia ocurren a través de varios procesos de aceptores de electrones
terminales en medios metanogénicos, nitrato reductores, sulfato reductores y ferro
reductores. Esta degradación anaeróbica es igualmente de particular interés en la
descontaminación de aguas subterráneas donde los niveles de oxígeno se agotan
rápidamente. Por estas razones, La oxidación se constituye en la ruta de
biotransformación más importante cerca de la superficie (procesos aeróbicos),
mientras que la reducción predomina en sedimentos sumergidos en las
profundidades del suelo (Mancini et al, 2003).
Sin embargo en el caso de los compuestos más recalcitrantes como los bifenilos
policlorados, los procesos degradativos debe llevarse a cabo en redes
cometabólicas, donde convergen procesos tanto anaerobios como dependientes
de la presencia de oxígeno molecular (Jordening y Winter, 2005). Otros
microorganismos inician procesos de degradación de contaminantes orgánicos
con diferentes sistemas enzimáticos del complejo citocromo P-450, donde hay
adición de un solo átomo de oxígeno al sustrato y los productos finales pueden
formar compuestos con azucares, aniones e incluso con ADN (Atlas & Philips,
2005). En la biodegradación de hidrocarburos y compuestos aromáticos, además
de dióxido de carbono se obtiene también, una relativa producción de biomasa
celular (proteína primordialmente) que puede ser asimilada dentro de la cadena
trófica en diferentes sistemas (Atlas, 1995).
17
Es así como diferentes bacterias aerobias en cultivos puros y consorcios
bacterianos en suelo, han mostrado una actividad degradadora de hidrocarburos
aromáticos policíclicos (PAH por su sigla en Ingles) e hidrocarburos alifáticos. En
los últimos 10 años se reportan especies de Acinetobacter, Pseudomonas,
Alcaligenes, Arthrobacter, Achromobacter, Flavobacterium y Nocardia como
degradadoras de hidrocarburos por excelencia (Singh et al, 2009). Igualmente en
la degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAH’s) se han reportado
cepas de Mycobacterium y Pseudomonas aeruginosa (Grostern & Edwards, 2006).
Pseudomonas putida es una de las cepas más reportadas en la literatura y está
asociada con procesos de degradación anaeróbicos y aeróbicos vía oxidación de
compuestos anillados u oxidación de grupos metil. Adicionalmente, también se
reporta en la degradación de benceno, clorobenceno y triclorobenceno a través de
genes que codifican para benceno oxigenasas, dihidrodiol deshidrogenasas y
catecol dioxigenasas. En el caso de bifenilos policlorados, genes que codifican
para dihidroxibifenil dioxigenasas han sido identificados en géneros tanto Gram
negativos como Gram positivos, tal es el caso de del género Mycobacterium como,
Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus globerulus y Bukholderia xenovorans que
catabolizan bifenilos a benzoatos y a 2-hidroxi penta-2-4 dienoato (Mancini et al,
2003).
Con relación a procesos bioremediadores asociados a la remoción de metales
pesados, los mecanismos son variados teniendo en cuenta que los metales
pesados en el ambiente no son eliminados; por el contrario, son sometidos a
procesos de transformación o inmovilización para disminuir su biodisponibilidad y
por ende su poder tóxico. Además de agentes fisicoquímicos como presencia de
quelantes, arcillas en el suelo y cambios en el pH, los microorganismos ejercen
mecanismos de acomplejamiento, adsorción y solubilización mediante reacciones
de óxido reducción directa o indirecta, metilación, dealquilación y precipitación
(Mitchell and Gu, 2010; Singh et al 2009; Prasad et al, 2006).
18
Los mecanismos de adsorción consisten en la propiedad que tienen las paredes
celulares bacterianas de adherir a ellas metales en diversos sitios mediante la
unión a exopolisacáridos, lipopolisacáridos, proteínas y carbohidratos con diversos
grupos funcionales como fosforil, carboxil (los más dominantes), hidroxil y amino
entre otros. Particularmente las bacterias Gram positivas con mayores cantidades
de exopolímeros no anclados a la pared celular pueden acumular más iones
metálicos. La adhesión de los metales a estos sitios en las paredes celulares
disminuye su biodisponibilidad dependiendo claro esta de la diversidad bacteriana
presente, el pH, el tipo de suelo y el tipo de metal a adsorber (Mitchell and Gu,
2010; Singh et al, 2009; Prasad et al, 2006).
Se han encontrado operones que proveen resistencia a elementos como el cadmio
y el cromo en Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Stenotrophomonas
maltophilia y Pseudomonas putida. Igualmente se ha observado actividad
bioremediadora en bacterias anaeróbicas sulfato reductoras como Desulfovibrio
desulfuricans y Desulfococcus multivoran las cuales son capaces de formar
complejos insolubles de sulfidos con metales pesados como cadmio, cobre, cromo
y aluminio (Naz et al, 2005). Otras bacterias ferro reductoras como Geobacter
sulfurreducens han sido asociadas a procesos indirectos de insolubilización de
metales pesados como el cromo (Lloyd et al, 2001). Igualmente Pseudomonas
ambigua y Shewanella oneidensis muestran actividad reductora de cromo bajo
condiciones anoxigénicas (Daulton et al, 2002). Algunas interacciones
rizobacteriales han mostrado que Kluyvera ascorbata, Pseudomonas tolaasii,
Pseudomonas fluorescens, Variovorax paradoxus Rhodococcus sp. y
Flavobacterium sp. además de promover el crecimiento de gramíneas, canola y
tomate, muestran resistencia a Cd, Zn, Cu, Ni, Co, Cr y Pb (Ping et al, 2007).
En síntesis, es adecuado pensar que la caracterización la diversidad bacteriana
relacionada con procesos de degradación de xenobióticos ofrece un amplio
panorama y un gran número de alternativas para el estudio y la ejecución de
procesos de biorremediación y recuperación de ambientes contaminados. Sin
19
embargo es importante precisar que los microorganismos mencionados en los
anteriores procesos de degradación, pertenecen solo a la fracción cultivable del
dominio bacteria.
1.2.5. Técnicas moleculares de detección e identificación de la diversidad
bacteriana y su función potencial en estudios de biorremediación
Los enfoques utilizados para caracterizar la diversidad y función de las
comunidades y ecosistemas microbianos pueden ser dependientes o
independientes de cultivo; ambos incluyen técnicas de caracterización genética
(Van Hamme et al, 2003). En particular el análisis y la identificación de las
comunidades microbianas que toman parte en la degradación in situ de
hidrocarburos y compuestos aromáticos han sido un reto para los microbiólogos
debido a que la mayoría (90-99 %) de las especies que conforman las
comunidades degradadoras competentes, no forman colonias cuando se usan
técnicas de laboratorio dependiente de cultivo (McNaughton et al, 1999). Aun si un
microorganismo es cultivado, su rol en la comunidad y contribución a la función del
ecosistema no son necesariamente revelados (Van Hamme et al, 2003).
En general las técnicas tradicionales dependientes de cultivo como el conteo en
placa, NMP (Numero Mas Probable) y Biolog son capaces de aislar individuos,
detectar sus actividades metabólicas y son relativamente fáciles de usar, pero en
ocasiones no permiten obtener individuos para estudios posteriores ya que la
proporción de las comunidades detectadas en los sustratos de interés es baja y
los organismos cultivados son sensibles al tamaño del inoculo y a efectos de la
incubación. Estas limitaciones impiden determinar las funciones detalladas de los
ecosistemas microbianos (Van Hamme et al, 2003), lo que ha llevado a los
estudios microbiológicos a no depender enteramente de técnicas de cultivo.
De la misma manera las técnicas en donde se hace un enriquecimiento, buscando
aislar grupos de microorganismos específicos, no reflejan las relaciones co-
metabólicas que ocurren en la biodegradación (Atlas y Barta, 2003; Singh et al,
20
2009). Este enfoque deja bajo análisis solo los microorganismos capaces de
crecer tomando al contaminante en cuestión como sustrato y que tienen baterías
enzimáticas completas capaces de mineralizar dichos compuestos de principio a
fin, dejando atrás aquellos individuos y/o comunidades que forman relaciones
simbióticas en los procesos de degradación y que solo pueden crecer sobre los
sustratos previos o subsiguientes subproductos de la degradación. De hecho no
existe técnica tal de enriquecimiento capaz de recuperar todos los
microorganismos de importancia cometabólica (Singh et al, 2009).
Los estudios moleculares de ecología microbiana (Cultivo independiente)
comenzaron a mediados de los noventa con experimentos de reasociación de
moléculas de ADN por Torsvik y la directa amplificación y secuenciamiento del gen
16S rRNA a partir de una muestra ambiental. Estos experimentos revolucionaron
el estudio de los ecosistemas microbianos, y han contribuido rápidamente a un
mejor conocimiento de la diversidad, abundancia y función bacteriana (Case et al,
2007; Woese et al 1990; Delong, 1992).
El estudio de la biodiversidad basado en la extracción y análisis de todo el ADN
total de una muestra ambiental permite determinar la estructura y función de los
genes y caracterizar genéticamente la diversidad de los individuos presentes en
una muestra sin necesidad de aislar y cultivar especies individuales (Rondon et al,
2000). En particular, el gen ribosomal 16S rRNA es considerado un excelente
marcador molecular debido a la cantidad de regiones conservadas a lo largo del
gen 16S rRNA que sirven de blanco para un gran espectro de iniciadores. Entre
estas regiones altamente conservadas, se encuentran regiones variables que
permiten detectar un amplio número de individuos filogenéticamente diversos.
Adicionalmente, la posibilidad de divergencia intragenómica debido a una posible
transferencia horizontal de genes ribosomales es prácticamente nula (Atlas &
Philips, 2005).
21
La utilización de herramientas moleculares en el estudio de la diversidad en
muestras ambientales, basadas en la amplificación de genes informacionales
como el gen 16S rRNA, han contribuido en gran medida a estudios de diversidad
filogenética. Sin embargo el uso de dichas técnicas está sujeto a varias
limitaciones que van desde la pertinencia de la utilización de iniciadores
complementarios y universales a todos los grupos microbianos de interés
(Eubacteria y Arquea), problemas con la afiliación taxonómica de las secuencias
obtenidas debido a una definición concreta del concepto de especie en
procariotas y sesgos en la obtención de ADN representativo de la matriz bajo
estudio (Hughes et al, 2001; Curtis et al, 2002; Roesch et al, 2007; Rappe y
Giovannoni, 2003; Dijkshroon et al, 2000; Staley, 2006; Rosello-Mora y Aman,
2001; Forney et al 2004).
Rossello-Mora (2001), Clarridge (2004) y Case (2007) sugieren que el el gen 16S
rRNA carece de resolución filogenética a nivel de especies y que no muestra una
representación exacta de las comunidades microbianas. Hay casos en donde
especies distintas muestran secuencias altamente similares (≥ 97 %) del gen 16S
rRNA, y aun donde dentro de la misma especie se presenta una micro
heterogeneidad ribosomal intragenómica (Moreno et al, 2002). Adicionalmente se
citan casos excepcionales de individuos con dos o más operones con secuencias
distintas del gen (Moreno et al, 2002). Estas aparentes limitaciones han hecho que
se considere el uso de otros genes constitutivos (Ejemplo: rpoB - subunidad β de
la RNA polimerasa) - como marcadores moleculares (Case et al, 2007).
Estas limitaciones han hecho que se adopte el concepto de “representatividad” en
lugar de “diversidad” bacteriana para advertir las limitaciones que el uso de una
técnica molecular específica puede representar; por ejemplo poblaciones
ecológicamente importantes presentes en menor concentración pueden pasar
desapercibidas por dichas técnicas. Es por esto que en estudios de diversidad
microbiana se recomienda abordar el problema desde un enfoque polifásico que
permita utilizar varias técnicas de screening o detección molecular (DGGE, T-
22
RFLP, FISH entre otros) combinadas incluso con enfoques cultivo dependiente, y
así suplir en alguna medida el sesgo que representan los estudios basados en una
sola técnica (Nanipieri, 2006).
Algunas técnicas moleculares utilizan sondas para localizar ciertos miembros
conocidos de comunidades especificas o ciertos genes con funciones particulares,
lo que significa que se requiere algún conocimiento previo de organismos o genes
particulares (Van Hamme et al, 2003). Entre estas tenemos los micro arreglos de
ADN, hibridación in situ utilizando fluorescencia (FISH), cuantificación de genes
catabólicos específicos y genes reporteros (Atlas & Philips, 2005). Los estudios de
identificación bacteriana en sitios contaminados se han concentrado en la
amplificación del gen 16S rRNA como criterio de screening o búsqueda. La técnica
DGGE (Denaturant gradient gel electrophoresis), separara fragmentos obtenidos
de la amplificación del gen 16s rADN y de otros genes de acuerdo a su secuencia
y comportamiento denaturante (Muyzer, 1993); se ha utilizado en general para
determinar los patrones de diversidad genetica en comunidades microbianas
presentes en función de espacio o tiempo.
En estudios de diversidad bacteriana en sitios contaminados se ha logrado
caracterizar las comunidades presentes durante la degradación de hidrocarburos,
residuos sólidos en biorreactores o muestras ambientales en general (Dilly et al,
2004; Diez et al, 2001; Hori et al, 2006; Takaku et al, 2006; Brons y van Elsas,
2008; Taniguchi y Hamasaki, 2008; Liu et al, 2008). Una variante de la prueba
DGGE, la prueba TTGE (Temporal Temperature gel electrophoresis) en donde se
utiliza temperatura en lugar de formamida como agente denaturante del producto
de la amplificación del gen 16s rADN, ha sido también utilizada en el análisis del
perfil de diferentes comunidades bacterianas durante diversos procesos (Walter et
al, 2000; Casamayor et al, 2000; Van Dyke y McCarthy, 2002; Moreno et al, 2006).
23
T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism) se ha utilizado
igualmente para caracterizar cambios en las comunidades microbianas en función
espacio temporal en suelos, aguas y otros sustratos. La técnica consiste en
caracterizar la longitud de fragmentos terminales en el gen 16s rADN, mediante la
incorporación de una sonda fluorescente en uno de los iniciadores y subsiguiente
digestión enzimatica (Liu et al, 1997; Kent et al, 2003; Tiquia, 2005; Danovaro et
al, 2006; Thies, 2007; Varma y Oelmuller, 2007; Schutte et al, 2008). Se ha
utilizado con éxito en el monitoreo de grupos bacterianos de interés en procesos
de remediación in-situ y ex-situ (Singh et al, 2009), particularmente ha revelado la
composición de las comunidades bacterianas en procesos de degradación de
bifenilos policlorados, diesel, hidrocarburos aromáticos policíclicos (Bordenave et
al, 2007; Wagner et al, 2009) procesos fitoremediadores de remoción de metales
pesados (Idris et al, 2004; Reardon et al, 2004). La utilización de la técnica ha
permitido establecer perfiles de comunidades bacterianas relevantes durante
procesos de degradación y clarificar relaciones sintróficas entre organismos
difíciles de cultivar simultáneamente (Atlas y Philip, 2005).
RISA (Ribosomal Intergenic spacer analysis) y su versión automatizada ARISA
(Automated) se valen del poder de resolución que se deriva de la gran
heterogeneidad de la región ribosomal espaciadora localizada entre el 16s y el 23s
rADN, dicha región presenta diferencias en secuencia y extensión, lo que permite
obtener diferentes patrones entre comunidades muestreadas o individuos (Jensen,
1993; García-Martínez et al, 1993; Borneman y Triplett, 1997; Fisher y Triplett,
1999). Se ha utilizado para caracterizar diversidad en distintos tipos de suelo
contaminados con hidrocarburos, metales pesados, y aguas (Ranjard et al, 2000;
Kent et al, 2004; Hernandez et al, 2006; Jones et al, 2007).
Otras técnicas como SSCP (Single stranded conformational polimorfism), ARDRA
(Amplified ribosomal ADN restriction analysis), LH-PCR (Length heterogeneity
PCR), AFLP (Amplified fragment length polimorfism) han sido también utilizadas
sin los sesgos que representan las técnicas dependientes de cultivo y la ardua
24
labor y dificultad en el análisis que representa establecer librerías de clones del
gen 16s rADN (Amann, 1995; Kirk et al, 2004; Nanipieri y Smalla, 2006; Smalla,
2007; Singh et al, 2009).
Todas estas técnicas pueden determinar la presencia de grupos bacterianos,
inferir relaciones sintróficas y por ende visualizar la posible presencia de rutas
metabólicas que intervienen en los procesos de degradación (Van Hamme et al,
2003, Atlas & Philips, 2005), sin embargo, el reto sigue siendo ligar estructura de
la comunidad con una completa caracterización de la función.
1.2.6. Técnicas que relacionan estructura y función: el nuevo reto de los
estudios de microbiodiversidad.
Aunque los perfiles de diversidad y estructura microbiana en ambientes tan
complejos como el suelo pueden ofrecer un panorama sobre el potencial
metabólico de las comunidades (en lo que se denomina señales filogenéticas de
caracteres fisiológicos (Allison y Martiny, 2008)), se ha encontrado que las
relaciones entre la estructura - diversidad y los procesos funcionales en el suelo
no son lineales; más aún, se ha demostrado que existe una pobre correlación
entre el contenido ribosomal y las actividades metabólicas (Forney, 2004),
principalmente debido a la cantidad de micro ecosistemas en cada uno de los
perfiles, poros y micro poros que componen esta matriz compleja (Nanipieri,
2006).
Adicionalmente, cuando se hace un escrutinio de genes funcionales específicos
por PCR en tiempo real, qPCR, genes reporteros, o FISH, no se tiene información
específica sobre los mecanismos de regulación de la transcripción, diferencias
cinéticas enzimáticas (Km), redundancia génica (Ortóloga, paráloga o existencia
de isozimas) o preferencia por sustratos específicos (Nanipieri, 2006; Zhou et al,
2004).
25
Recientemente, técnicas como el uso de BAC (Bacterial Artificial Cromosomes)
(Rondon et al, 2000), la secuenciación simultanea de fragmentos de un gran
número de genomas como la piro secuenciación (Roesch, 2007; Phuler, 2008;
Singh et al, 2009) y técnicas de micro arreglos como el NCBI-GEO chip en donde
se tiene un gran número ya caracterizado de genes tanto informacionales (16s)
como funcionales de múltiples organismos (Barrett et al, 2005; Nanipieri y Smalla,
2006), han sido importantes para descifrar la diversidad bacteriana y la diversidad
funcional. Sin embargo, en matrices complejas como lo es un suelo, sigue siendo
complicado localizar aquellos grupos microbianos o funciones que a pesar de
estar en baja abundancia, siguen siendo importantes en los procesos llevados a
cabo en el ecosistema.
La técnica SIP (Stable Isotope Probing), se vale de la utilización de isotopos
estables (13C y 15N) para marcar sustratos de interés y caracterizar las
comunidades involucradas en procesos degradativos mediante la incorporación de
estos isótopos en sus componentes celulares; ADN, ARN y fosfolípidos durante la
metabolización de los sustratos marcados. Estos componentes celulares
marcados son después sometidos a separación física mediante ultracentrifugación
y analizados por T-RFLP y DGGE, en el caso de ADN. (Adamzyk et al, 2003;
Lueders et al, 2004; Manefield et al, 2004; Atlas y Philips, 2005; Cardon y Gage,
2005; Cupples et al, 2006; Sims, 2007; Neufeld et al, 2007; Kreuzer-Martin, 2007;
Nanipieri, 2006).
La técnica se ha usado con éxito en la identificación de microorganismos ligados a
funciones especificas sin necesidad de cultivarlos (Radajewski et al, 2000).
Específicamente, SIP se ha utilizado en la identificación de microorganismos
involucrados en la degradación de benzoatos, naftalenos, silicatos, fenantrenos,
bifenilos policlorados bencenos, fenoles y herbicidas entre otros (Gallagher et al,
2005; Jeon et al, 2003; Singleton et al, 2005; Kasai et al, 2006; Cupples y Sims,
2006). Todas estas técnicas han sido utilizadas en conjunto con las técnicas de
26
identificación general, no solo para saber cuáles son las comunidades activas del
ecosistema; “Quien hay allí?” sino también su función; “Que está haciendo?”
(Singh et al, 2009).
1.3. El presente estudio
Este estudio surgió dentro del proyecto de extensión “Estudio piloto para la
recuperación del morro de Moravia. Fase I” (Feb. -Nov. /2008) financiado por la
Empresa de Desarrollo Urbano (EDU) y el Área Metropolitana del Valle de Aburrá.
Los datos obtenidos por otros grupos de investigación de la Universidad Nacional
y Universidad de Antioquia involucrados en el estudio, complementaron la
interpretación de resultados en esta investigación. Este estudio implica aspectos
nuevos relacionados con la ecología microbiana en términos espaciales y
actividad catabólica sobre xenobióticos en lugares destinados a la disposición de
residuos sin control alguno. El objetivo a corto y largo plazo es, utilizar los datos
obtenidos sobre diversidad bacteriana para direccionar obras de biorremediación y
fitorremediación encaminadas a recuperar el suelo en el morro de Moravia.
En el presente trabajo se hizo una evaluación y caracterización de la diversidad y
posible función de las comunidades bacterianas representativas en la matriz de
residuos del antiguo botadero de basuras de Moravia. Para determinar dicha
diversidad, se utilizaron técnicas independientes de cultivo como PCR-TTGE y
T-RFLP. Para caracterizar representantes de la fracción cultivable con potencial
bioremediador, se aislaron bacterias en medios suplementados con
hidrocarburos como única fuente de carbono y se identificaron molecularmente
mediante amplificación del gen 16S rRNA y caracterización de regiones
espaciadores intergénicas. Adicionalmente, se utilizó la técnica SIP (Stable
Isotope Probing) para analizar las comunidades bacterianas involucradas en la
degradación de fenol marcado con isotopos estables. Los patrones de diversidad
bacteriana y función se correlacionaron con los perfiles de profundidad a 0, 10,
20 y 30 m. La evaluación de la diversidad permitió establecer relaciones
27
filogenéticas de bacterias presentes en la matriz de residuos de Moravia e
identificar grupos bacterianos con diferentes perfiles metabólicos que podrían ser
utilizados en procesos de remediación biológica.
28
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la diversidad bacteriana a diferentes profundidades en el suelo del morro
de Moravia mediante el análisis de secuencias del 16S rADN y aislar e identificar
bacterias con capacidad de degradar hidrocarburos.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Identificar y evaluar la diversidad bacteriana por técnicas moleculares en
varios puntos de suelo del morro de Moravia por cotas de profundidad.
2. Analizar las relaciones filogenéticas de las bacterias identificadas en las
diferentes cotas de profundidad.
3. Seleccionar bacterias mediante cultivos en medios complementados con
hexadecano, a partir de las muestras de suelo del morro de Moravia.
4. Identificar molecularmente bacterias aisladas en los medios de cultivo
complementados con hexadecano e identificar bacterias involucradas en la
degradación de fenoles mediante la técnica de marcación con isotopos
estables SIP (Stable Isotope Probing) a partir de las muestras de suelo del
morro de Moravia.
5. Relacionar bacterias con posible potencial bioremediador en el suelo del
morro de Moravia.
29
CAPÍTULO 2. MATERIALES Y MÉTODOS.
Para analizar la diversidad microbiana asociada a la matriz de residuos del morro
de Moravia se utilizaron métodos de biología molecular tales como análisis de
diversidad en geles de poliacrilamida en temperatura temporal, análisis de la
longitud de fragmentos de restricción terminales y utilización de isotopos estables
para analizar comunidades bacterianas involucradas en procesos de degradación
de interés. Igualmente se utilizaron técnicas dependientes de cultivo como el
aislamiento de bacterias capaces de utilizar hidrocarburos como única fuente de
carbono. Este enfoque polifásico, permitió tener un amplio panorama de las
comunidades bacterianas que dominan en la matriz de residuos del morro de
Moravia y al mismo tiempo sirvió como herramienta para inferir posibles procesos
metabólicos presentes, importantes en procesos de degradación de residuos.
2.1 Prácticas generales de laboratorio Todos los análisis moleculares y microbiológicos se llevaron a cabo en los
laboratorios de Biología Celular y Molecular y de Microbiología Industrial de la
Universidad Nacional de Colombia sede Medellín y los laboratorios de Control de
malezas y Ciencias del suelo del Departamento de Agricultura de Los Estados
Unidos en la Universidad de Illinois bajo estrictas medidas y procedimientos de
asepsia. Los reactivos y materiales fungibles en general fueron autoclavados a
121 oC por 15 minutos a 15 libras de presión a menos que hubiesen sido
previamente autoclavados por el fabricante. El material metálico o de vidrio como
asas, espátulas o pinzas fue esterilizado en etanol al 70-90 % y luego flameado
con ayuda de mechero antes de su uso. Todos los ensayos microbiológicos fuero
realizados en cámara de flujo laminar o con mechero para mantener un ambiente
estéril. Se utilizaron guantes de látex en todos los procedimientos para reducir el
riesgo de contaminación por microorganismos o enzimas. Todas las soluciones,
reactivos y demás compuestos fueron preparados con agua bidestilada
autoclavada y/o filtrados utilizando filtros de 0.2 m y jeringas de 25 mm.
30
2.2 Muestras de suelo
Las muestras de suelo provenientes de la matriz de residuos del morro de basuras
de Moravia fueron colectadas dentro del marco del proyecto de extensión “Estudio
piloto para la recuperación del morro de Moravia fase I” a partir de perforaciones
geotécnicas realizadas utilizando cuatro inclinómetros y dos piezómetros en seis
puntos distintos del morro a 0, 5, 10, 20, 30 metros (ANEXO 1). Las muestras de
suelo fueron colectadas entre marzo y junio de 2008 en diversos intervalos de
tiempo y fueron rotuladas según su procedencia y profundidad: Inclinómetro 1, 2, 3
y 4, a 0,10 y 20 m (I1-0, I1-10, I1-20, I2-0, I2-10, I2-20, I3-0, I3-10, I3-20, I4-0, I4-
10 e I4-15), piezómetro 1 y 2 a 0,10,20 y 30 m (P1-0, P1-10, P1-20, 2-0,P2-10, P2-
20 y P2-30) (TABLA 1).
Luego de su recolección, las muestras fueron depositadas en bolsas plásticas con
cierre hermético y almacenado a -4 ºC en el laboratorio de Geotecnia y
pavimentos de la facultad de Minas- Universidad Nacional de Colombia sede
Medellín hasta extracción de ADN total. Alícuotas de aprox. 30 g de cada muestra
de suelo fueron almacenadas en glicerol al 20 % a -20 oC en tubos de 50 ml para
posterior análisis y conservación de las poblaciones bacterianas. Los suelos de
cada punto fueron mezclados y tamizados hasta 4 mm para obtener valores de
carbono elemental a 0, 10, 20 y 30 m. Los valores de carbono elemental fueron
determinados por análisis de combustión (Costech Analytical Elemental
Combustion System 4010, Valencia, CA.
2.3 Extracción de ADN
La extracción de ADN total se llevó a cabo utilizando el kit de extracción
PowerSoil™ (MoBio Laboratories, CA, USA) para el análisis TTGE y aislamiento
de bacterias degradadoras de hidrocarburos. El Fast ADN SPIN kit™ (QIAGEN
CA, USA) se utilizópara los análisis TTGE II, T-RFLP y SIP siguiendo las
recomendaciones de los fabricantes (TABLA 1). La integridad del ADN extraído
31
durante todo el experimento fue evaluada en geles de agarosa al 0,8 %, teñidos
con bromuro de etidio o utilizando EZ -VISION® (Amresco, U.S.A) como colorante.
Los geles fueron corridos con tampón TBE en cámaras de electroforesis
horizontales a 80 Voltios por 45 o 60 min. Se utilizó el marcador de peso
molecular de 1.5 Kb y 100 bp (Fermentas, U.S.A). La concentración del ADN fue
determinada por espectrofotometría con espectrofotómetro Termo scientific (Fisher
Scientific, MA, USA) y ND-100 Nanodrop (Nanodrop Technologies, Wilmington,
DE, USA) y cualitativamente por concentración e intensidad de bandas en los
geles de agarosa usando el marcador lambda de 1.5 Kb (Fermentas U.S.A) como
referencia. El ADN extraído fue almacenado a – 20 °C hasta su procesamiento y
análisis. El ADN de las colonias aisladas por técnicas de cultivo estándar fue
extraído mediante modificación del protocolo Fenol-Cloroformo (Sambrook y
Russel, 2003) (ANEXO 2).
32
Tabla 1. Localización de las muestras analizadas y técnicas utilizadas para el
análisis de la diversidad bacteriana a varias profundidades en la matriz de
residuos de Moravia.
Muestra Procedencia Analisis
Inclinómetro 1 0, 5,10, 20 m Kit de extracción de ADN
Power Soil, TTGE, Cultivables,
Clonación Fase I.
Inclinómetro 2 0, 5,10, 20 m Kit de extracción de ADN
Power Soil, TTGE, Cultivables,
Clonación Fase I.
Inclinómetro 3 0, 5,10, 20 m Kit de extracción de ADN
Power Soil, TTGE, Cultivables,
Clonación Fase I.
Inclinómetro 4
Piezómetro 1
0, 5,10, 20 m
0, 10, 20, 30m
Kit de extracción de ADN
Power Soil, TTGE, Cultivables,
Clonación Fase I.
Kit de extracción de ADN
Power Soil, TTGE, Cultivables,
Clonación Fase I.
Piezómetro 2 0, 5, 10, 15, 20, 25m Kit de extracción de ADN
Power Soil, TTGE, Cultivables,
Clonación Fase I.
Mezcla 0 Mezcla de todos los puntos a
0m
Kit de extracción FAST ADN,
TTGE II, T-RFLP, SIP
Mezcla 10 Mezcla de todos los puntos a
10m
Kit de extracción FAST ADN,
TTGE II, T-RFLP, SIP
Mezcla 20 Mezcla de todos los puntos a
20m
Kit de extracción FAST ADN,
TTGE II, T-RFLP, SIP
Mezcla 30 Mezcla de todos los puntos a
30m
Kit de extracción FAST ADN,
TTGE II, T-RFLP, SIP
33
2.4 Amplificación del gen ribosomal 16S y región espaciadora ITS
Todas las reacciones de amplificación del gen 16S rADN y la región intergénica
16S-23S, fueron realizadas en tubos de 0.2 ml de pared delgada ó en platos de 96
pozos en termocicladores T3 Thermocycler (Biometra, U.S.A) ó Thermal Cycler
PTC-200 Engine (Bio-Rad U.S.A) en las siguientes condiciones: concentración de
1X de buffer para Taq polimerasa, 2 mM de Cloruro de Magnesio, 0,2-0,25 mM de
cada desoxinucleotido fosfato, 0.05-2.5 U de Taq polimerasa, 25 a 50 pmol de
cada par de iniciadores (TABLA 2) y ADN molde fluctuando entre 50 y 100 ng/µl
para garantizar una adecuada concentración de los amplicones. Todas las
reacciones se llevaron a un volumen final de 20 (Para TTGE, ITS) ó 100 µl (Para
T-RFLP) en agua bidestilada utilizando Purelab Maxima (Elga, U.S.A).
Adicionalmente, en las reacciones de PCR para la prueba T-RFLP, se utilizó
proteína T4 Gene 32, cuya adición ha mostrado estimular la reacción de PCR
(Schwarz et al, 1990; Tebbe et al, 1993; Villalba et al, 2001). La región blanco de
ADN, los iniciadores utilizados para la amplificación y sus secuencias se muestran
en la TABLA 2.
En cada reacción de PCR se utilizó como control positivo, una muestras de ADN
de Shigella sonnei 203 ó Escherichia coli El protocolo de amplificación del gen
16S rRNA utilizando iniciadores universales, 27F y 1492R (Tamaño de fragmento
de 1.5 Kb aproximadamente), 357F y 907R (Tamaño de fragmento de 586 bp
aproximadamente) y de la región espaciadora (ITS) entre el gen ribosomal 23S y
16S utilizando los iniciadores L1 y G1 (Jensen et al, 1993) fue el siguiente: una
primera etapa de 95 °C, 3 min; 58 °C, 6 min; 72 °C, 1.5 min; seguida de 95 °C, 1.5
min; 58 °C, 3 min; 72 °C, 1.5 min; 27 ciclos de 95 °C, 1.5 min; 58 °C, 1.5 min; 72
°C, 1.5 min y una etapa final de 95 °C, 1.5 min; 58 °C, 1.5 min; 72 °C, 10 min
(Espejo et al, 1998).
34
El protocolo de amplificación del gen 16S rADN para el análisis de electroforesis
de geles de poliacrilamida en temperatura temporal (TTGE) utilizando los
iniciadores 341F-(GC) y 907R (Tamaño de fragmento de aproximadamente586
bp) fue el siguiente: Una primera etapa de 95 °C, 10 min; seguido de 30 ciclos de
94 °C, 1 min; 56 °C, 30min; 72 °C por 1min y por ultimo una etapa de extensión
final de 72 °C, 10 min (Moreno et al, 2002). El protocolo de amplificación del 16S
rADN para la prueba de polimorfismo en fragmentos de restricción terminales (T-
RFLP) utilizando los iniciadores 6-FAM (5’-6-carboxiflourescein) y 1492R
(Integrated ADN Technologies, Inc. U.S.A) (Tamaño de fragmento de
aproximadamente1.5 Kb) fue el siguiente: Una primera etapa de 94°C por 5 min
seguido por 25 ciclos de 94°C por 1.5 min; 55°C por 1.5 min; 72°C por 1.5 min y
una etapa de extensión final de 72°C por 10 min. Los productos de las
amplificaciones se evaluaron en geles de agarosa al 1.2 % en las condiciones
especificadas anteriormente.
2.5 Clonación de fragmentos del gen 16S rADN
Se elaboraron dos librerías de clones durante todo el experimento. La primera
durante el proyecto piloto para la recuperación del moro de Moravia fase I, y la
segunda durante la identificación de bacterias degradadoras de fenoles mediante
la técnica de marcación con isotopos estables (SIP). En el primer experimento de
clonación (Moravia fase I) se mezclaron las muestras provenientes de los puntos
I1, I2, I3, I4, P1 y P2 (I= inclinómetro, P=piezómetro) para obtener muestras de 0,
5, 10, 15, 20, 25 y 30m (C-0 (C por cota de profundidad), C-5, C-10, C-20, A
(Piezómetro 1 mezcla de 0, 5, 10 m), B (Piezómetro 1 mezcla de 15, 20, 25 m), C
(Piezómetro 2 mezcla de 0 y 10 m) y D (Piezómetro 2 mezcla de 20 y 30 m) .
En el segundo experimento de clonación (Prueba SIP), se mezclaron las muestras
de todos los seis puntos (I1, I2, I3, I4, P1 y P2) para obtener cuatro muestras
únicas; 0, 10, 20 y 30m. Los productos de la amplificación del gen 16S rRNA de
las muestras mencionadas (1.5 Kb aproximadamente), fueron purificados con
35
QUIAquick PCR Purfification Kit (QIAGEN CA, U.S.A) y ligados en los vectores
cloneJET TM (Fermentas, U.SA) ó pGEM-T Easy de acuerdo a las
especificaciones de los fabricantes.
El producto de la ligación se utilizó para transformar células competentes E. coli
DH5- preparadas con CaCl2 (Sambrook et al, 2000) ó células competentes de
alta eficiencia JM109 (Promega, U.S.A). Luego se seleccionaron de 20 a 25
colonias de cada cota de profundidad en medio LB con ampicilina y se procedió a
realizar el tamizado de clones positivos utilizando los iniciadores del vector
(iniciadores universales contenidos en los kits) mediante el protocolo de colony
PCR y tampón de lisis (Sambrook et al; 2000) para verificar la presencia del
inserto de alrededor de 1.5 Kb (Tamaño del gen 16S rADN completo) (Lane et al,
1985). Los clones que mostraron presencia del inserto fueron sometidos a un
análisis de restricción con las enzimas HhaI, MspI, AluI y RsaI (Fermentas, U.S.A
y New England Biolabs, U.S.A) a 37°C por 12 horas (ANEXO 3), para seleccionar
patrones de bandeo únicos. Los clones diferentes fueron sometidos a extracción
de plásmido mediante el protocolo Miniprep (Sambrook et al, 2003) y QIAprep
Spin Miniprep Kit (QIAGEN, CA, U.S.A).
2.6 Análisis de electroforesis en Geles de Poliacrilamida en Temperatura
Temporal (TTGE).
El ADN total para cada uno de las muestras de suelo fue sometido a amplificación
del gen 16S rRNA entre las regiones V3 y V6 utilizando los iniciadores 341F-(GC)
y 907R (TABLA 2), arrojando un producto de amplificación de 586 bp. El iniciador
341F-GC presenta un extremo compuesto por aproximadamente 40 bp de
desoxinucleotido fosfatos guanina-citosina para estabilizar el comportamiento
denaturante del fragmento de interés (Muyzer, 1993). La técnica TTGE fue llevada
a cabo utilizando el DCode Universal Mutation Detection System (BioRad, U.S.A)
siguiendo instrucciones del fabricante. En cada pozo de los geles de poliacrilamida
al 7 %, Urea 7 M, se cargo aproximadamente la misma concentración del producto
36
de PCR proveniente del ADN de cada muestra de suelo mezclados con una
cantidad igual de buffer de carga 2X. Igualmente, se estableció un carril con
productos de PCR del 16S de bacterias conocidas pertenecientes a 3
subdivisiones diferentes en el dominio bacteria (B. subtilis, T. ferroxidans y S.
sonei) como marcador de referencia en los patrones de corrido y temperatura de
denaturacion (http://www.changbioscience.com/primo/primomel.html) y un
marcador estándar de 100 bp (Fermentas, U.S.A) en varios carriles en el gel.
Como buffer de corrido se utilizó Tris-Acetato (TAE) 1.5X (EDTA 1 mM pH 8.0, Tris
base 40 mM y ácido acético glacial). La electroforesis se corrió a 65 voltios
constantes por 15 hrs con una temperatura inicial de 66 ºC y final de 69 ºC; la
rampa de temperatura fue de 0.2 ºC X h-1. Los geles fueron teñidos utilizando
protocolo de tinción por nitrato de plata (ANEXO 4).
2.6.1 Análisis de los patrones de bandeo y secuencias obtenidas en la
prueba TTGE
Las diferencias entre los patrones de bandeo en la prueba TTGE para cada carril
correspondiente a una muestra de suelo, fueron analizadas utilizando el software
Gelcompare® (Applied Maths Biosystems, Bélgica). Una vez alineados los carriles
representantes de cada muestra de ADN, se realizó un análisis de agrupamiento
por el método de correlación de Pearson (Fierer and Jackson, 2005; Schloss,
2010) utilizando el coeficiente de similitud Complete linkage (Koeppel et al, 2007).
Las bandas con patrones únicos de migración con respecto a los marcadores
establecidos (100 bp y cepas de referencia) y de mayor intensidad, fueron
escindidas por duplicado en lo posible. El ADN de cada una de las bandas fue
recuperado por el protocolo de elución de bandas en geles de poliacrilamida
(Crush and Soak Method, Sambrook y Russel, 2001) (ANEXO 5). Cada muestra
de ADN eluída fue reamplificada utilizando los iniciadores 357F y 907R para la
identificación por secuenciación (MACROGEN – Korea). Con el objeto de
37
corroborar los patrones de migración de cada banda, se realizó una segunda
amplificación, esta vez con el iniciador 341F (GC).
Las secuencias de los genes ribosomales obtenidas fueron editadas mediante el
software BioEdit® (Hall 1999) y contrastadas contra el servidor BLAST (Altschul et
al; 1997) del National Centre for Biotechnology Information (NCBI) y el rRNA
Database Project (RDP, Cole et al, 2007). Las relaciones entre las secuencias
obtenidas y las secuencias encontradas en las bases de datos fueron calculadas
mediante alineamiento múltiple utilizando el software Clustal W (Thompson et al,
1994). Las matrices de distancia fueron generadas a partir de alineamientos de las
secuencias y los dendogramas fueron construidos mediante el software MEGA
(http:www.megasoftware.net).
Un segundo análisis TTGE fue llevado a cabo utilizando ADN de mezclas de todos
los puntos (I1, I2, I3, I4, P1 y P2) a 0, 10, 20 y 30 m utilizando el FAST ADN spin
kit. Este análisis se llevo a cabo con el fin de descartar posibles sesgos
ocasionados por el uso de un segundo kit de extracción de ADN distinto en la
prueba T-RFLP (descrita mas adelante). Las cepas de referencia utilizadas en
este análisis fueron previamente aisladas como bacterias degradadoras de
hexadecano en el suelo del moro de Moravia y corresponden a Pseudomonas.
putida, Bacillus. subtilis, Intrasporangium calvum, Acinetobacter sp. y Shigella.
sonei. Ninguna de las bandas obtenidas en este segundo gel fue sometida a
identificación por secuenciación.
2.7 Análisis del polimorfismo en longitud de fragmentos de restricción
terminales (T-RFLP)
Las muestras de suelo de cada uno de los seis puntos (I1, I2, I3, I4, P1 y P2)
fueron mezcladas para obtener cuatro muestras únicas representantes de las
cuatro profundidades a analizar: 0, 10, 20 y 30m, adicionalmente fueron tamizadas
a 4 mm. El ADN total para cada una de las muestras fue extraído utilizando el Fast
38
ADN SPIN kit ™ (QIAGEN CA, USA) siguiendo las recomendaciones de los
fabricantes. El gen 16S rRNA fue amplificado utilizando los iniciadores 6-FAM (5’-
6-carboxiflu-orescein) y 1492 R en las condiciones previamente especificadas. El
producto de la amplificación fue purificado y sometido a análisis de restricción con
tres enzimas por separado: HhaI, MspI y RsaI (New England Biolabs, U.S.A) a 37
ºC por 12 horas (ANEXO 3).
Los fragmentos fluorescentes obtenidos, producto de la digestión con cada una de
las enzimas, fueron separados por electroforesis capilar (3730XL Genetic
Analyzer, Applied Biosystems, U.S.A) en el centro W.M Keck de la Universidad de
Illinois en Urbana-Champaign, U.S.A. Los datos obtenidos permitieron elaborar un
análisis de agrupamiento mediante el método de correlación mínima y Complete
linkage (Fierer and Jackson, 2005; Schloss, 2010; Koeppel et al, 2007) utilizando
el software GeneMarker 1.85 (Soft Genetics, PA, U.S.A). Los tamaños de los
fragmentos terminales fueron comparados con aquellos encontrados en la base de
datos en línea MiCA-virtual digest (Microbial Community analysis III, Shyu et al,
2007) para establecer posibles relaciones de identidad con individuos previamente
caracterizados. La abundancia de cada fragmento fue determinada según el área
del pico obtenido (Liu et al, 1997).
2.8 Análisis de comunidades bacterianas involucradas en la degradación de
fenoles por la técnica de marcación con isotopos estables SIP (Stable
Isotope Probing).
Las muestras de suelo para el análisis SIP fueron preparadas de la misma manera
que aquellas destinadas para el análisis T-RFLP mezclando los suelos de los seis
puntos, para obtener cuatro muestras totales. A las muestras 0, 10 y 20 m se les
ajustó la capacidad de retención de agua para simular condiciones ideales de
biodegradación (Margesin y Schinner, 2005), sin embargo, debido a que la
muestra de la matriz de residuos a 30 m mostraba grandes niveles de
compactación por humedad, se procedió a simular condiciones de completa
39
saturación en los viales adicionando agua hasta cubrir la muestra, y
proporcionando por ende un ambiente completamente anaerobio.
Para cada muestra de suelo a 0, 10, 20 y 30 m se prepararon tres recipientes
grandes (Tres replicas). En cada una se depositaron 3 viales con 4 gramos de
suelo. Uno de los viales se suplemento con aproximadamente 100 ppm de fenol
marcado (99% 6-C) con el isotopo estable 13C; el segundo vial se suplementó con
aproximadamente100 ppm de fenol no marcado 12C como experimento control y el
tercer vial se suplementó con una solución de fenol marcado con carbono
radioactivo 14C, para monitorear los momentos máximos de degradación de fenol
mediante analisis de scintilación liquida (Packard, U.S.A) en términos de
emisiones radioactivas por minuto o desintegraciones por minuto (DPM). La
cantidad de aproximadamente100 ppm de fenol suplementado a cada muestra de
suelo se decidió con base en los niveles de fenoles encontrados en el suelo y el
lixiviado en el morro de Moravia según Peñuela et al, 2009 et al (2009).
El ADN total de los viales 13C y 12C fue extraído utilizando el FAST ADN Spin KIt
(QUIAGEN, CA, U.S.A) según instrucciones del fabricante, en dos momentos de
degradación de fenol y donde se presumía monitorear una creciente actividad
metabólica (Días 2 y 4 para las muestras 0, 10 y 20m y días 10 y 18 para la
muestra a 30m). A continuación, 65 µl del ADN extraído (aproximadamente 10µg)
de las muestras incubadas con el fenol marcado 13C y el fenol NO marcado 12C
(control), se sometieron a ultracentrifugación en una solución de Tris-EDTA (pH 8)
y cloruro de cesio (CsCl) en tubos polialómeros Quick Seal (13 x 51mm, Beckman
Coulter, U.S.A) en ultracentrífuga Optima LE-80K (Beckman Instruments, U.S.A)
equipada con un rotor de tubo vertical VTi 65.2. La densidad boyante de la
solución de Tris-EDTA-CsCl (aproximadamente 1.77 g/ml), fue determinada antes
de la ultracentrifugación utilizando un refractómetro digital AR200 (Leica
Microsystems Inc; U.S.A).
40
La ultracentrifugación en la solución de cloruro de cesio permitió desplazar el ADN
marcado (más pesado) a una fase inferior en el tubo. La ultracentrifugación se
llevó a cabo por 48 horas, a 45,000 rpm y 20oC (Couples y Sims, 2007; Neufeld
et al, 2007). Seguidamente, se procedió a fraccionar el ADN en cada tubo para
separar las fracciones pesadas (ADN marcado) de las livianas utilizando una
bomba de precisión (PHD200 Harvard Apparatus, Holliston, MA, U.S.A), (ANEXO
6). Cada fracción resultante (aproximadamente 350µl) se almacenó en tubos
Ependorff de 1.5 ml y se determinó la densidad boyante como se ilustró
previamente. A continuación, se eliminó el CsCl y se concentró el ADN mediante
precipitación asistida por glicógeno-isopropanol. Cada fracción se sometió a
amplificación con los iniciadores 6-FAM y 1492R para efectuar un análisis T-RFLP
en las condiciones antes descritas.
El análisis de los fragmentos terminales obtenidos en cada fracción permitió
identificar los productos de PCR provenientes de las fracciones con fragmentos
terminales de interés (marcados) en los dos momentos de extracción de ADN
mediante comparación con los fragmentos obtenidos de las fracciones 12C (no
marcadas). El producto PCR resultante fue purificado y sometido a clonación
como se describe anteriormente. Los plásmidos provenientes de los clones
seleccionados (84 en total para todas las profundidades), se sometieron a una
nueva amplificación del gen 16s rRNA con los iniciadores 6-FAM - 1492R y
análisis T-RFLP adicional para identificar aquellos clones cuyas secuencias
mostraban fragmentos terminales de interés. Los clones seleccionados fueron
enviados a secuenciación en el centro W.M Keck de la Universidad de Illinois en
Urbana-Champaign, U.S.A y las secuencias obtenidas fueron editadas y
analizadas en las condiciones descritas anteriormente.
41
2.9 Cultivo y aislamiento de bacterias en hexadecano como única fuente de
Carbono.
2.9.1 Aislamiento de las bacterias.
La fracción de las bacterias cultivables capaces de utilizar hexadecano (Diesel)
como única fuente de carbono en condiciones aerobias para los dos piezómetros
(P1 y P2) y el inclinómetro 1, fue aislada utilizando el medio de cultivo Bushnell-
Haas (ANEXO 7). Se hizo diluciones seriadas hasta 10-9 a partir de un gramo de
suelo en tubos de 9 ml de medio BH previamente enriquecido con hexadecano a
razón de 1 % W/V (200 µl). Los tubos fueron incubados por 14 días en agitación
(130 rpm y 26 ºC) hasta observar crecimiento. Posteriormente se sembró 40 µl de
las diluciones que presentaron mejores crecimientos (10-3 – 10-7) en medio solido
BH y LB (Como control) por duplicado. Las placas se incubaron de 24 a 48 horas
para después realizar conteos de bacterias viables. Las colonias puras fueron
aisladas al menos 3 veces en medio solido BH; a estas se les evaluaron
características morfológicas particulares con base en tinción de Gram
(http://www.custombio.info/Hydrocarbon_Degraders_files/BioTreatexample.f,
Bragg and McMillen, 1990).
2.9.2 Caracterización molecular de los aislados
Las colonias aisladas en el medio selectivo que presentaron características
morfológicas particulares fueron identificadas molecularmente mediante extracción
de ADN, amplificación de secuencias espaciadoras intergénicas (ITS) (Ver párrafo
2.4) (Jensen, 1993) y por posterior amplificación y secuenciamiento del gen 16S
rADN (2.5.2) utilizando los iniciadores 27F y 1492R.
42
Tabla .2 Iniciadores utilizados en las reacciones de amplificación del gen 16S
rADN para las técnicas de detección de diversidad bacteriana a diferentes
profundidades en la matriz de residuos del morro de Moravia.
*Contiene en su extremo 5’ una secuencia extra de desoxinucleotidos fosfato GCG GGC
GGG GCG GGG GCA CGC GGG GCG CGG CGG GCG
INICIADOR SECUENCIA 5’-3’ Tamaño
Del
fragmento
(bp)
ADN BLANCO REFERENCIA
EUBAC 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 16S rADN
Bacteriano
Espejo et al, 1998
1492R GGTTACCTTGTTACGACT T 1500 16S rADN
Bacteriano
Espejo et al, 1998
341F-(GC)* CCTACGGGAGGCAGCAG 16S rADN
Bacteriano
Muyzer et al, 1993
357F CCTACGGGAGGCAGCAG 16S rADN
Bacteriano
Yu and Morrison, 2004
907R CCCCGTCAATTCATTTGAGTTT 586 16S rADN
Bacteriano
Yu and Morrison, 2004
G1 GAAGTCGTAACAAGG varios Región
espaciadora
16S-23S
Jensen et al, 1993
L1
CAAGGCATCCACCGT Región
espaciadora
16S-23S
Jensen et al, 1993
6-FAM
(5’-6-
carboxiflu-
orescein)
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1500 16S rADN
Bacteriano
Liu et al, 1997
43
CAPÍTULO 3. RESULTADOS
3.1. Determinación de carbono elemental
Los valores de carbono elemental aumentaron con la profundidad. Los mayores
valores se observaron a 20 m (11.12%), superando a las otras profundidades
entre un 30 y un 50% (TABLA 3).
Tabla 3. Valores de carbono elemental a diferentes profundidades.
Profundidad % Carbono elemental 0m 3.04 10m 4.67 20m 11.12 30m 5.88
3.2. Extracción de ADN y amplificación del 16S rADN
La extracción de ADN utilizando el kit PowerSoilTM muestra mayores
concentraciones en puntos cercanos a la superficie (0 y 5 m). En las muestras
provenientes de 20 y 30 m no se observan bandas (FIGURA 3). Sin embargo, una
vez se mezclaron los suelos de los seis puntos y se extrajo el ADN total a 0, 10, 20
y 30m para el análisis T-RFLP y SIP utilizando el FAST ADN spin Kit, se
observaron mayores concentraciones de ADN a todas las profundidades, con
mayor intensidad a 20m en coincidencia con los valores de carbono elemental
obtenidos a esta profundidad (FIGURA 4).
Adicionalmente, al determinar concentración por espectrofotometría
(espectrofotómetro Termo scientific, Fisher Scientific, MA USA), se observó que
los rangos de absorbancia A-260o, se encontraban fuera del rango de medición del
equipo, para las muestras de ADN obtenidas con el kit PowerSoil, por lo tanto se
determinó la concentración de forma cualitativa, por intensidad mediante
comparación con el fago lambda 1.5 Kb como marcador de referencia, arrojando
concentraciones aproximadas entre 6 y 80 ng/ µl. Las muestras obtenidas
mediante el FAST ADN spin kit fueron cuantificadas utilizando el ND-100
44
Nanodrop (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE, USA) mostrando entre
aproximadamente 55 y 250 ng/µl de ADN.
FIGURA
muestr
Labora
10 y 20
inclinóm
ADN pe
1
A 3. Electrof
reados a 0, 5,
atories, CA, US
0m. Carril 6-9: A
metro 3 a 0, 5 1
erteneciente al
2 3 4
foresis de ex
, 10, 20 y 30m
SA). Carril 1 y
ADN perteneci
10 y 20m. Carr
piezómetro 1 a
5 6 7
xtracción de
m. ADN aislad
14: Marcador 1
iente al inclinóm
il 15-18: ADN p
a 0, 10, 20 y 30
8 9 10
ADN de mu
do utilizando
100bp. Carril 2
metro 2 a 0, 5
perteneciente a
0m.
0 11 12 13
uestras de s
el PowerSoil™
2-5: ADN perten
10 y 20m. Car
al inclinómetro
3 14 15 1
suelo tomada
™ ADN extrac
neciente al inc
rril 10-13: ADN
4 a 0, 5 10 y 2
6 17 18 1
s de 5 punt
ction Kit (MoB
linómetro 1 a 0
N perteneciente
20m. Carril 19-
19 20 21 2
45
tos
Bio
0, 5
e al
22:
22
46
FIGURA 4. Electroforesis de Extracción de ADN de muestras de suelo tomadas a partir de la mezcla de
5 puntos muestreados a 0, 5, 10, 20 y 30m. ADN aislado utilizando el FAST ADN spin kit™ (QIAGEN,
CA, USA). Carril 1 y 2: Marcador 1.5 Kb. Carril 3-5: ADN perteneciente a tres extracciones de la muestra de
suelo a 0m. Carril 6-8: ADN perteneciente a tres extracciones de la muestra de suelo a 10m. Carril 9-11: ADN
perteneciente a tres extracciones de la muestra de suelo a 20m Carril 12-14: ADN perteneciente a tres
extracciones de la muestra de suelo a 30m.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
47
3.3 Análisis de clones del gen 16S rADN obtenidos en el Estudio piloto para
la recuperación del morro de Moravia fase I.
Dos clones obtenidos de cada cota de profundidad (C0, C5, C10, C20, A, B, C y
D), fueron sometidos a análisis de restricción con las enzimas AluI y RsaI para
seleccionar un total de 14 clones con patrones de restricción distintos (FIGURA
5). Las secuencias 16S de los plásmidos obtenidos fueron enviadas a
secuenciación según procedimiento previamente descrito. De los 14 clones, 6
mostraron secuencias de calidad que pudieron ser ensambladas adecuadamente
con cada iniciador y contrastadas contra la base de datos NCBI-GenBank. La
procedencia de cada clon junto con su símil más cercano se relaciona en la tabla
4.
FIGURA 5. Análisis de polimorfismo de fragmentos de restricción para 14 clones obtenidos con las
enzimas Alu I y Rsa I en el proyecto piloto para la recuperación del Morro de Moravia fase I. Carril 1.
Marcador molecular 100 pb (Fermentas). 2. Cota 0-clon 19, 3. Cota 5-clon 3. 4. Cota 5-clon 11. 5. Cota 10-
clon 20. 6. Cota 10-clon 12. 7. Cota 20-clon 15. 8. Cota 20-clon 18. 9. PZ-01superficial clon-1. 10. PZ-01
superficial clon-18. 11. PZ-01 profundo clon-24. 12. PZ-01 profundo clon-25. 13. PZ-02 superficial clon-1. 14.
PZ-02 profundo clon-1. 15. PZ-02 profundo clon-8.
48
Tabla 4. Identidad de los clones obtenidos durante el estudio piloto para la recuperación del morro de Moravia fase I.
Profundidad Clon AfiliaciónFilogenética
Identidad NCBI-GenBank No. De Acceso
0m C0-19 Desconocida Clon, No-Cultivado (99%) FJ985785 5m C5-11 Desconocida Clon, No-Cultivado (95%) FJ985792
10m C10-12 Firmicutes Amphibacillum Xilanus (89%) FJ985786 20m C20-18 Desconocida Clon, No-Cultivado (96%) FJ985788
0-10m (P1) A-1 Desconocida Clon, No-Cultivado (95%) FJ985789 20-25m (P2) D-18 Desconocida Clon, No-Cultivado (98%) FJ985790
3.4 Análisis de patrones de diversidad por TTGE
La evaluación de la diversidad de las poblaciones bacterianas a 0, 10, 20 y 30m
en la matriz de residuos de Moravia se llevo a cabo por la técnica TTGE, la cual
permitió separar los diferentes fragmentos del gen 16S rADN (585 bp)
amplificados por PCR con los iniciadores 341 F (GC) y 907 R. Los resultados de
la amplificación para cada una de las muestras fueron observados en diferentes
patrones de migración observándose poca cantidad de bandas en general
(FIGURA.6).
Sin embargo, el número de bandas amplificadas y su intensidad fue más alto en
las muestras pertenecientes al inclinómetro 3 a 20m. Se observan diferencias en
intensidad dentro de cada punto muestreado pero no entre profundidades. En
general, se observó un patrón de migración de bandas similar a lo largo de todos
los puntos; Inclinómetro 1, 2, 3, 4 y piezómetro 1 y 2, al igual que en las
profundidades muestreadas; 0, 10, 20 y 30. En todos los carriles se presentan las
bandas a, b y c. No obstante, la banda b se observa más intensa. Las bandas f y
e son comunes y más intensas a 10 y 20m. (FIGURA 6). En todos los carriles se
observan smears o manchas provenientes de todas las profundidades.
49
Cinco bandas de interés en la prueba TTGE realizada por puntos individuales
fueron escindidas, re-amplificadas y secuenciadas (FIGURA 6 bandas a, b, c, d y
f) Las secuencias obtenidas fueron analizadas usando los paquetes Bioedit (Halt,
T.A, 1998), Mega 4.0 (Tamura et al, 2007) y Blast (Altschul et al, 1990). A pesar de
que otras once bandas (Ver flechas–FIGURA 6), la mayoría provenientes del
punto 3 a 20m, fueron igualmente escindidas y re-amplificadas, estas no arrojaron
secuencias de calidad debido a la obtención de cromatogramas con ruido excesivo
y múltiples ambigüedades, evitando que estas pudieran ser ensambladas y
asociadas exitosamente a unidades taxonómicas operacionales en las bases de
datos del NCBI y RDP.
La identidad de cada una de las bandas que pudieron ser exitosamente
secuenciadas además de su asociación filogenética a grupos bacterianos
específicos se aprecian en la TABLA 5. La identidad de las bandas se asociaron al
género Acinetobacter con una identidad de 95 % y 99 % (Banda b y c
respectivamente), y Flavobacterium con una identidad de 98 % (Banda a)
(FIGURA 6). Otro patrón de banda exitosamente secuenciado se observó solo a
10 y 20 m en la mayoría de puntos muestreados. Esta banda mostró una identidad
del 99 % con Ralstonia sp (Banda e). Otra banda secuenciada y cuya presencia se
observa en todas las profundidades y la mayoría de puntos muestreados, mostró
una identidad de 91 % con Acinetobacter sp. (Banda f) (FIGURA 6). En general los
phyla λ-Proteobacteria y Bacteroidetes, representados por los géneros
Acinetobacter y Flavobacterium respectivamente, son los grupos dominantes en
todos los sitios muestreados seguido por el phylum β- Proteobacteria representado
por el género Ralstonia (FIGURA 7).
Los patrones de bandas en cada perfil se utilizaron para elaborar un dendograma
con el coeficiente de correlación de Pierson y el método de agrupamiento
Complete linkage utilizando el software Gelcompar II® (FIGURA 8). En el
dendograma se observa que las muestras provenientes de cada profundidad
forman 3 grupos definidos; grupo I: muestras provenientes de 0 m de profundidad,
50
grupo II: 10 m, grupo III: 20 m y 30 m. Sin embargo, una muestra obtenida a 10
metros se observa en el grupo I (P2-10) y otra forma un grupo a parte (I1-10). Las
muestras provenientes de la profundidad 0m difieren en aproximadamente un 90%
con aquellas provenientes de 10, 20 y 30m. A su vez las muestras obtenidas a
10m difieren en aproximadamente un 65% con aquellas obtenidas a profundidad
(20 y 30m).
El análisis TTGE complementario a partir del ADN extraído con el FAST ADN spin
kit y la mezcla de los seis puntos, mostró patrones similares de agrupación al
análisis realizado por puntos individuales (FIGURA 9 y 10). En este análisis
adicional no se efectuó escisión de bandas, sirviendo únicamente como punto de
comparación y referencia de patrones de bandas. En este gel, también se
observaron perfiles similares y las bandas obtenidas y analizadas en el análisis
inicial por puntos individuales (bandas a, b, c, d y f) (FIGURA 9).
51
FIGURA 5. Gel de electroforesis en gradiente de temperatura temporal
FIGURA 6. Gel de electroforesis en gradiente de temperatura temporal (TTGE) con los puntos
muestreados individualmente a 0 10, 20 y 30 m. El ADN extraído de los 4 inclinómetros (I1, I2, I3, I4) y 2
perforaciones centrales (P1 y P2) a 0,10, 20 y 30 m fue amplificado para el gen 16S rADN y sometido a
separación de fragmentos por TTGE. Los carriles 100 bp indican el marcador de peso molecular utilizado. Los
números 1, 2 y 3 indican las identidades de las tres bandas utilizadas como marcadores (M) 1.Tiobacillus
ferroxidans, 2. Shigella sonnei y 3. Bacillus subtilis. Las flechas indican las bandas escindidas y analizadas.
f
a
b c
e
100bp M I1-0 I2-0 I3-0 I4-0 P1-0 100bp I1-10 I2-10 I3-10 I4-10 P1-10 P2-10 M 100bp M I1-20 I2-20 I3-20 P1-20 P2-20 100bp P2-30
f
a
b
c
e
1 2 3
100bp M I1-0 I2-0 I3-0 I4-0 P1-0 100bp I1-10 I2-10 I3-10 I4-10 P1-10 P2-10 M 100bp M I1-20 I2-20 I3-20 P1-20 P2-20 100bp P2-30
f
a
b
c
e
1 2 3
100bp M I1-0 I2-0 I3-0 I4-0 P1-0 100bp I1-10 I2-10 I3-10 I4-10 P1-10 P2-10 M 100bp M I1-20 I2-20 I3-20 P1-20 P2-20 100bp P2-30
f
a
b
c
e
1 2 3
e
52
TABLA 5. Homologías de las secuencias de las bandas exitosamente obtenidas con individuos registrados en bases de datos en línea
Banda Secuencia
relacionada
Grupo Taxonomico %
similitud
Número de acceso
Genbank
a Flavobacterium
sp. sp. WB2.1-
66
Bacteroidetes 98 % AM934638.1
b Acinetobacter
sp. 7138
λ-Proteobacteria 95 % GU727737.1
c Acinetobacter
sp. 7138
λ-Proteobacteria 99 % GU727737.1
e Ralstonia sp.
Tinanjin P1
β- Proteobacteria 99 % GQ895735.1
f Acinetobacter
sp. PP-2
λ-Proteobacteria 91 % GQ174293.1
53
FIGURA 7. Dendograma construido para las secuencias del gen 16S rADN obtenidas en la técnica
TTGE. El dendograma fue elaborado mediante el método Neighbor joining. Los puntos negros indican las
secuencias obtenidas de cada banda. Sobre cada nodo se encuentra el porcentaje de réplica en el cual las
secuencias se agruparon juntas basado en un bootstrap de 1000. Las distancias evolutivas fueron calculadas
usando el método Jukes-Kantor y utilizando MEGA 4.0 (Tamura, Dudley, Nei, y Kumar 2007).
λ Proteobacteria
β Proteobacteria
Bacteroidetes
I2-10c
GU566324.1| Acinetobacter sp.
|GU574356.1| Uncultured Bacterium Clone
HM341779.1| Uncultured Bacterium Clone
GU727735.1| Acinetobacter sp.
HM567833.1Acinetobacter baumannii
EU162004.1| Acinetobacter sp
I3-10b
I3-10f
I3-20e
FJ828883.2| Ralstonia picketi
GU451066.1| Ralstonia sp.
HM117739.1| Uncultured bacterium isolate
I2-20a
FJ786049.1| Flavobacterium sp.
FN397666.1| Flavobacterium sp.
FN179365.1| Uncultured Flavobacterium
Crenarchaeote symbiont of Axinella sp.
47
71
100
100
9793
10069
85
62
0.05
54
FIGURA 8. Dendograma construido a partir de los fragmentos 16S rADN obtenidos en cada punto y
profundidad muestreadas. El dendogranma fue elaborado por el coeficiente de correlación de Pierson y el
método de agrupamiento Complete linkage. Los colores indican la profundidad de la cual proviene cada
muestra: 0m, 10m, 20m y 30m. Los números sobre cada nodo indican el porcentaje de similitud entre
muestras.
I
II
III
61.7
53.1
82.4
62.9
31.9
85.4
86.0
58.9
92.0
85.5
90.1
85.9
70.7
34.8
8.0
5.4
TTGE
100
80
60
40
20
I1-0
I3-0
I2-0
P1-0
P2-10
I4-0
I2-10
I3-10
I4-10
P1-10
I2-20
P1-20
I3-20
I1-20
P2-20
P2-30
I1-10
FIGURA
muestr
bp indic
cuatro
Putida.
identific
A 9. Gel de El
ras provenient
ca el marcador
bandas utiliza
4. Bacillus
cadas en el gel
ectroforesis e
tes de las mez
r de peso mole
das como ma
subtilis 5. In
TTGE por pun
21
5
3
M 100b
4
21
en gradiente d
zclas de los 6
ecular utilizado
arcadores (M)
trasporangium
ntos individuale
e
2 1
5
3
bp 0m 10
f
a
b c
e
4
2 1
de temperatura
6 puntos mues
o. Los números
1. Acinetoba
calvum. Las
es (FIGURA 6)
m 20m 30
a temporal co
streados a 0,
s 1, 2, 3, 4 y 5
cter sp. 2. Sh
s flechas indi
.
m 100bp
omplementario
10, 20 y 30 m
5 indican las id
higella sonnei.
ican las band
o (TTGE) con
. Los carriles 1
dentidades de
3. Pseudomo
das previame
55
las
100
las
ona
nte
56
FIGURA 10. Dendograma construido a partir de los fragmentos del gen 16S rADN obtenidos en las
mezclas de cada punto muestreado a 0, 10 20 y 30 m. El dendograma fué elaborado por el coeficiente de
correlación de Pierson y el método de agrupamiento Complete linkage.. Los colores indican la profundidad de
la cual proviene cada muestra: 0m, 10m, 20m, 30m. Los números sobre cada nodo indican el porcentaje de
similitud entre muestras.
97.5
96.7
90.4
TTGE
1999999999
10m
20m
30m
0m
57
3.5 Análisis de patrones de diversidad por T-RFLP
El análisis de fragmentos de restricción terminales utilizando las enzimas HhaI,
MspI y RsaI, se efectuó a partir de la mezcla del suelo de los seis puntos
mencionados, obteniendo cuatro muestras principales a 0, 10, 20 y 30m cuyo ADN
total fue extraído utilizando el FAST ADN spin kit. Este análisis arrojó un número
mayor de picos o unidades taxonómicas operacionales (UTO), sin importar la
enzima utilizada, a 20 y 30m, mientras que el menor número de fragmentos
terminales se observo a 0m. Los fragmentos terminales obtenidos para cada
profundidad se analizaron en términos de abundancia y presencia ó ausencia
comparando los cuatro perfiles mediante análisis de clústeres. Este análisis arrojó
tendencia a la agrupación para las muestras provenientes de mayores
profundidades en contraste con los perfiles de diversidad observados a nivel de
superficie con cualquiera de las tres enzimas utilizadas (FIGURA 11 A, B y C).
El objetivo del experimento T-RFLP, consistió en obtener y comparar patrones de
diversidad y abundancia en general entre las cuatro profundidades, sin embargo,
la comparación de los fragmentos terminales obtenidos con aquellos encontrados
en la base de datos en línea MiCA-virtual digest (Shyu et al, 2007) permitió
establecer posibles relaciones de identidad encontrando que los fragmentos
corresponden principalmente a individuos pertenecientes a los phylum,
Proteobacteria (subdivisiones gamma, beta y alfa) y Actinobacteria, géneros
Ralstonia, Brevundimonas, Alcaligenes, Arthrobacter y Thalassospira entre otros.
Varios fragmentos terminales se observaron con mayor abundancia (según área
de pico) a mayores profundidades (30-20m) disminuyendo en la superficie (10-
0m). Igualmente se observó que muchos fragmentos se observan exclusivamente
a 20 y/ó 30m, mientas que algunos se observan solo a 10 y/ó 0m. El análisis de
clústeres derivado de la técnica T-RFLP se observa en la FIGURA 10, cada banda
corresponde a un pico obtenido y la intensidad representa la abundancia relativa
de ese filotipo en particular.
58
A.
B.
C.
FIGURA 11. Dendograma construido a partir de los patrones de restricción
obtenidos mediante la técnica T-RFLP para las mezclas de cada punto
muestreado a 0, 10 20 y 30 m. El dendograma fue elaborado por el coeficiente
de correlación de Pierson y el método de agrupamiento Complete linkage. A.
Patrones de agrupamiento producto de la digestión con la enzima HhaI. B.
Patrones de agrupamiento producto de la digestión con la enzima MspI. C.
Patrones de agrupamiento producto de la digestión con la enzima HhaI. Los
valores sobre las bandas muestran la longitud de los fragmentos terminales
obtenidos. A la derecha se observan los rótulos de profundidad de arriba hacia
abajo; 0,10, 20 y 30 m. Las bandas azules representan cada una los fragmentos
terminales obtenidos.
59
3.6 Identificación de bacterias asociadas a la degradación de fenoles por SIP
(Stable Isotope Probing).
Con el fin de identificar miembros de la comunidad bacteriana directamente
involucrados en la evaluación de fenoles en cada profundidad, se utilizó la técnica
de marcación de sustratos con isotopos estables. La incorporación de dichos
isotopos en el ADN de bacterias presentes en cada profundidad después dio
cuenta de las bacterias responsables de la degradación de fenol en el morro de
Moravia. La biodegradación de fenol en cada muestra de suelo comenzó
rápidamente en el día 2 de incubación a 0,10 y 20 m, con mayor intensidad en
esta ultima profundidad. Sin embargo al cabo de cuatro días, las ratas de
degradación disminuyeron su nivel hasta una etapa ligeramente estacionaria
observada en el día 8. La muestra a 30 m, exhibió las ratas de degradación más
lentas llegando solo a un 31% de fenol degradado al cabo del día 18. En general
se observa que al cabo de 11 días, se degradó alrededor de un 40% del fenol
excepto para la muestra proveniente de 30m. En la TABLA 6 se muestran las ratas
de degradación para cada profundidad y se resaltan los días en los cuales se llevó
a cabo extracción de ADN.
Tabla 6. Porcentajes de degradación de fenol por días en cada profundidad y momentos en los cuales se extrajo ADN.
El ADN proveniente de las incubaciones enriquecidas con fenol marcado (13C), no
marcado (12C- control) se sometió a ultracentrifugación, fraccionamiento y
amplificación del gen 16S rADN por PCR. Los geles de agarosa de las
amplificaciones muestran con claridad cómo se obtienen bandas en las fracciones
pesadas 13C, y no en las fracciones 12C con similares densidades boyantes,
indicando una precipitación del ADN marcado con el isotopo estable durante la
0m 10m 20m 30m Dia 2 9.32 15.15 23.7 2.4 Dia 4 35.8 30.6 34.5 7 Dia 6 41.2 38 38.1 12.8 Dia 11 45 42 40.7 22.8 Dia 18 31
60
ultracentrifugación (FIGURA 12). El producto de la amplificación proveniente de
las fracciones pesadas fue luego sometido a análisis T-RFLP.
FIGURA 12. Electroforesis de la amplificación del gen 16S rADN en las fracciones obtenidas con el
ADN no marcado (A) y marcado con el isotopo estable 13C (B) para la segunda extracción de ADN (Día
6) en la muestra de suelo a 20m. Los números sobre los pozos indican el orden de las fracciones obtenidas.
Los números entre paréntesis indican los valores aproximados de densidad boyante para cada experimento
resaltando las densidades de las fracciones donde se encontraron los fragmentos enriquecidos. 1 Kb indica el
tipo de marcador utilizado y el signo + indica el control positivo para la reacción (Eschericha coli). El recuadro
muestra las fracciones sometidas a análisis T-RFLP.
B
1Kb + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ( 1.7832) (�1.7719) (�1.7632) (�1.7530) (�1.7469) (�1.7360) (�1.7306) (�1.7219) (�1.7132) (�1.7056) (�1.6958) (�1.6882) (�1.6817) (�1.6556)
A
B
1Kb + 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 ( 1.7834) (�1.7715) (�1.7633) (�1.7529) (�1.7470) (�1.7358) (�1.7304) (�1.7217) (�1.7133) (�1.7055) (�1.6957) (�1.6883) (�1 6815) (�1 6557)
61
Se observaron fragmentos T-RFLP a lo largo de todo el gradiente de densidad
boyante para ambos tratamientos (13C y 12C), sin embargo, se centró atención en
aquellos que aumentaron en abundancia (área y tamaño de pico) a mayores
densidades boyantes en las muestras incubadas con fenol 13C, en comparación
con las fracciones obtenidas con el control (12C fenol) a similares densidades. Este
fenómeno indicó la incorporación del isótopo en su ADN y por ende la
metabolización del fenol marcado. Este análisis se hizo para cada una de las
profundidades en los dos momentos de extracción de ADN y con tres enzimas de
restricción distintas (HhaI, MspI, RSaI).
En cada una de las profundidades se destacaron fragmentos dominantes
obtenidos con las tres enzimas de restricción (TABLA 7). Estos fragmentos se
observan enriquecidos en las fracciones pesadas (BD= aproximadamente1.742
g/ml) provenientes de las muestras incubadas con 13C, pero no en las fracciones
obtenidas de los controles no marcados 12C, con densidades boyantes similares.
La abundancia de los fragmentos terminales en términos de área de pico
obtenidos durante los dos días de extracción pareció seguir patrones de
incremento o decrecimiento (FIGURA 13); dichos patrones pudieron ser asociados
con características taxonómicas y ecológicas de clones obtenidos en cada
fracción. En la FIGURA 13 A, B, C y D se ilustran fragmentos terminales obtenidos
a 0, 10, 20 y 30 m con diferentes enzimas de restricción. Otros fragmentos
terminales fueron detectados en las fracciones pesadas obtenidas de la
incubación con fenol 13C, sin embargo, estos también se encontraban en las
fracciones pesadas 12C (control), razón por la cual fueron excluidos del análisis.
FIGURA
muestr
incubad
pico. Lo
A
D
D
A 13 A. Patro
ras de suelo
das con fenol m
os valores de d
ADN de suelo
Día 6
Día 4
ones T-RFLP d
a 0 m en 2
marcado y no m
densidad boya
a 0 m incubad
368 y 369 b
1500 1000
1000 500
de 368 y 369
momentos d
marcado. El ár
nte se muestra
1.731 g/
1.715 g/
do con fenol 13C
bp
bp del gen 16
e extracción
rea en la intens
an al costado d
/ml
/ml
C
6S rADN obte
de ADN (4 y
sidad fluoresce
derecho del cro
ADN de suelo
Día 4
Día 6
enidos con la
y 6 días).Las
ente se observa
omatograma.
o a 0 m incuba
enzima HhaI
muestras fuer
a al lado de ca
1.731
1.714 g
ado fenol no m
62
en
ron
ada
g/ml
/ml
arcado
FIGURA
de sue
fenol m
valores
ADN
200
4000
474 b
A 13 B. Patron
lo a 10 m en
marcado y no m
de densidad b
N de suelo a 0 m
bp
Día 4
Día 6
nes T-RFLP de
2 momentos
marcado. El á
boyante se mu
m incubado co
e 474 bp del g
de extracción
área en la inte
uestran al costa
n fenol 13C
1.724 g/m
1.737 g/m
gen 16S rADN
n de ADN (4 y
nsidad fluores
ado derecho de
A
ml
ml
Dí
Dí
obtenidos co
y 6 días).Las m
scente se obse
el cromatogram
ADN de suelo a
ía 4
ía 6
on la enzima R
muestras fuero
erva al lado de
ma.
a 0 m incubado
RsaI en muestr
on incubadas c
e cada pico. L
o fenol no marc
1.726 g/m
1.734 g/m
63
ras
con
Los
cado
ml
ml
FIGURA
de sue
fenol m
valores
A
Día
Día
A 13 C. Patron
lo a 20 m en
marcado y no m
de densidad b
5
1000
4000
ADN de suelo a
a 4
a 6
nes T-RFLP de
2 momentos
marcado. El á
boyante se mu
500 bp
0
0
a 0 m incubado
e 500 bp del g
de extracción
área en la inte
uestran al costa
1.751 g/m
1.746 g/m
con fenol 13C
gen 16S rADN
n de ADN (4 y
nsidad fluores
ado derecho de
ml
ml
ADN
D
obtenidos co
y 6 días).Las m
scente se obse
el cromatogram
N de suelo a 0 m
Día 4
Día 6
n la enzima M
muestras fuero
erva al lado de
ma.
m incubado fen
MspI en muestr
on incubadas c
e cada pico. L
1.753 g/ml
1.744 g/ml
nol no marcado
64
ras
con
Los
o
FIGURA
muestr
incubad
pico. Lo
2500
2500
422 bp
ADN
A 13 D. Patro
ras de suelo
das con fenol m
os valores de d
5500
2000
p 455 bp
N de suelo a 0
ones T-RFLP d
a 30 m en 2
marcado y no m
densidad boya
p
m incubado co
Día 4
Día 6
de 422 y 455
momentos d
marcado. El ár
nte se muestra
1.719 g/ml
1.711 g/m
on fenol 13C
bp del gen 16
de extracción
rea en la intens
an al costado d
l
ml
A
D
6S rADN obte
de ADN (4 y
sidad fluoresce
derecho del cro
ADN de suelo a
Día 4
Día 6
enidos con la
y 6 días).Las
ente se observa
omatograma.
a 0 m incubado
enzima RsaI
muestras fue
a al lado de ca
1.718 g/
1.711 g/
o fenol no marc
65
en
ron
ada
ml
/ml
cado
66
Tabla 7. Fragmentos dominantes obtenidos con tres enzimas de restricción
en ADN marcado con el Isotopo estable 13C mediante la técnica de marcación
con isotopos estables durante dos días de extracción de ADN (Días 4 y 6).
HhaI MspI RsaI
0m 173,174,330
368,369
161,489, 456,457,480,
830
10m 152,211,212,
235,237,330,
332,337,371,
439,474,475
161,162,164,
165,166,404,
405,436,438,
445,464,465,
494,499
102,422,435,
455,460,474,
646
20m 474,475,851 166,500 428,460
30m 232,233,234,
235,237,238,
239,241,242,
326,330,332,
573,575
143,144,146,
149,158,159,
165,166,167,
422,455,474,
476,484,830,
892,895
Los fragmentos resaltados representan los más abundantes en términos de
área de pico.
67
Los productos de PCR de las fracciones que mostraron los fragmentos
enriquecidos en cada profundidad, se clonaron en las condiciones descritas
anteriormente (Ver 2.5). Ochenta y cuatro clones positivos fueron sometidos a
análisis adicional T-RFLP para identificar bacterias representadas por los
fragmentos terminales de interés. En total, solo 21 clones arrojaron
cromatogramas de calidad debido a una pobre concentración del plásmido
enviado a secuenciación, y 11 mostraron patrones de restricción con los tres
fragmentos terminales de interés de forma simultánea. En algunos casos se
presentaron diferencias de una a dos pares de bases entre los patrones de
restricción de los clones y aquellos detectados en las fracciones marcadas (Tablas
6 y 7). La TABLA 8 muestra los clones seleccionados en cada profundidad, los
tres fragmentos de restricción obtenidos con cada uno y su afiliación taxonómica.
La FIGURA 14 muestra el análisis de relaciones filogenéticas entre los clones
obtenidos en todas las profundidades.
68
Tabla 8. Fragmentos terminales y afiliación taxonómica de los de los clones
seleccionados en cada profundidad, obtenidos mediante la técnica de
marcación de sustratos con isotopos estables (Continua en página
siguiente)
Profundidad Clon Patrones T-RFLP Identidad NCBI-GenBank y Afiliación
Taxonomica
0m B4 HhaI 367
MspI 161
RsaI 456
EU661379.1 Arthrobacter sp. 99%
(Actinobacteria)
10m d3
C3
C12
HhaI 337
MspI 162,164,436,438
RsaI 102
HhaI 211,212,371
MspI 166,494,499
RsaI 435
HhaI 209,328,371,439
MspI 161,162
Rsa 453
FM210786 Aquamicrobium sp. 100%
(α-Proteobacteria)
AB540010.1 Pseudomonadaceae
bacterium 94% (Λ- Proteobacteria)
HM222675.1| Dietzia sp. 99%
(Actinobacteria)
20m e5
E1
E6
HhaI 851
MspI 500
RsaI 428
HhaI 475
MspI 498
RsaI 460
HhaI 851
MspI 500
DQ168833.1 Uncultured Alcaligenes
sp.99% (β-Proteobacteria)
HM587937.1 Micrococcus sp. 99%
(Actinobacteria)
DQ168833.1 Uncultured Alcaligenes sp.
99% (β-Proteobacteria)
69
F10
RsaI 428
HhaI 851
MspI 500
RsaI 428
DQ168833.1 Uncultured Alcaligenes sp.
99% (β-Proteobacteria)
30m g7
G5
H2
HhaI 237,238,326,330,332
MspI 144,166
RsaI 422,454, 473,484
HhaI 234,235,237
MspI 144,159
RsaI 454,455
HhaI 237,238,239,241
MspI 166
RsaI 895
FJ544245.1 Brevundimonas sp. 99%
(α-Proteobacteria)
DQ177466.2 Xanthomonas sp. 99%
(λ-Proteobacteria)
FM872753.1 Uncultured bacterium 99%
(Affiliation filogenética no identificada)
70
FIGURA 14. Dendograma para las secuencias del gen 16s rADN de los clones caracterizados mediante
la prueba SIP. El dendograma fue elaborado por el método Neighbor Joining. Sobre cada nodo se encuentra
el porcentaje de réplica en el cual las secuencias se agruparon juntas basado en un bootstrap de 1000. Las
distancias evolutivas fueron calculadas usando el método jukes-Kantor y utilizando MEGA 4.0 (Tamura,
Dudley, Nei, y Kumar 2007). Las secuencias obtenidas en este estudio están marcadas según profundidad.
Círculos: 0 m, cuadrados: 10 m, triángulos: 20 m y rombos: 30 m.
Actinobacteria
Desconocido
λ-Proteobacteria
β-Proteobacteria
α-Proteobacteria
EU672426.1| Arthrobacter sp.
EU661379.1| Arthrobacter sp.
EU672427.1| Arthrobacter sp.
B4
AM110937.1| Bacillus subtilis
EU394442.1| Micrococcus sp.
E1
HM587937.1| Micrococcus sp.
C12
GQ870425.1| Dietzia maris
HM222675.1| Dietzia sp.
HM222663.1| Dietzia sp.
H2
AM183096.1| Uncultured bacterium
FM872753.1| Uncultured bacterium
EU660427.1Bacterium ID4395 16S
DQ177466.2| Xanthomonas sp.
EF575564.2| Pseudoxanthomonas sp.
AB245364.1| Pseudoxanthomonas sp.
G5
AB540010.1| Pseudomonadaceae bacterium
EF675623.1| Pseudomonas sp.
AM500852.1| Uncultured bacterium
C3
GQ417450.1| Uncultured Alcaligenes sp.
CU915108.1| Uncultured bacterium
FJ959394.1| Alcaligenes faecalis strain
E5-B
F10
DQ168833.1| Uncultured Alcaligenes sp.
E6
D3-B
FM210786.1| Aquamicrobium sp.
FJ671077.1| Uncultured bacterium clone
FN667522.1| Uncultured compost bacterium
FJ544245.1| Brevundimonas sp. BIO-TAS2-2
G7-B
EU545397.1| Brevundimonas diminuta st...
EU352761.1| Brevundimonas diminuta
Crenarchaeote symbiont of Axinella sp...
100
100
61
100
100
47
95
100
65
59
96
98
100
67
80
100
100
71
93
44
45100
100
100
100
100
0.05
71
3.7 Identificación y caracterización de bacterias aisladas en medios
suplementados con Hexadecano como única fuente de Carbono.
Con el fin de identificar la fracción de bacterias cultivables con potencial
degradador de hidrocarburos en el suelo de morro de Moravia, se aislaron
bacterias en medio suplementado con hexadecano como única fuente de carbono
en el punto 1 (I1) y las 2 perforaciones centrales (P1 y P2) a 0, 10 y 20 m. La
razón para la selección de estos puntos específicos es que en el punto 1 fueron
encontrados mayores niveles de contaminación con hidrocarburos según los
análisis químicos previamente ejecutados (Peñuela et al, 2009, 2007). Los conteos
de bacterias degradadoras de hexadecano variaron entre 2.4x103 y 1x105 UFC g-1,
aumentando conforme las muestras provenían de mayores profundidades (TABLA
9).
Un total de 48 colonias (tres a ocho potencialmente distintas por cota de
profundidad de acuerdo a parámetros como tinción de Gram y morfología en
placa) fueron aisladas en medio suplementado con hexadecano como única fuente
de carbono (ANEXO 8). Después de hacer una diferenciación morfológica (TABLA
10- ANEXO 9) y correr un análisis de regiones espaciadoras intergénicas (ITS), se
seleccionaron 2 aislamientos por cota de profundidad (4 para la cota 20) cuyos
patrones ITS diferían en más de 35 % según árboles con índices de similitud
generados con el software Gelcompare® (FIGURA 15). Al mismo tiempo, este
dendograma muestra la aparición de tres grupos definidos según la procedencia
de los aislados; inclinómetro 1 (Grupo I), perforación central 1 (Grupo II) y
perforación central 2 (Grupo III).
Las características taxonómicas de los aislamientos seleccionados para
secuenciación de acuerdo a diferencias en sus patrones ITS se muestran en la
TABLA 10. El análisis de secuencias mostro que el 50 % de los individuos
presentaban afiliación filogenética con el género Acinetobacter y el 25 % con el
género Bacillus. En síntesis, bacterias del phylum Proteobacteria, orden γ-
Proteobacteria (Acinetobacter sp.) predominaron en el análisis sobre bacterias del
phylum Firmicutes (Bacillus sp.) en una relación de 2:1 (ANEXO 8)
72
aproximadamente. Adicionalmente se identificaron aislados pertenecientes al
género Pseudomonas (P. putida) e Intrasporangiaceae (aún no cultivada)
perteneciente al Phylum Actinobacteria (FIGURA 16). Los números de acceso de
las secuencias obtenidas otorgados por el Genbank son HM583865-HM583880.
Tabla 9. Conteo de bacterias degradadoras de hidrocarburos en medio BH
(Bushnell-Haass) obtenidas de diferentes profundidades en la matriz de
residuos de Moravia.
Muestra UFCx g -1
I1-0 m 2.4 x 103
I1-10 m 1.1 x 104
I1-20 m 3 x 104
P1-0 m 7.3 x 103
P1-10 m 1 x 104
P1-20 m 1.1x 105
P2-0 m 2.1x103
P2-10 m 3.6 x 104
P2-20 m 5x 104
Los conteos se llevaron a cabo a los 7 días de siembra y a temperatura ambiente (25-30 oC) en
medio suplementado con hexadecano Diesel (1 %) y a partir de diluciones seriadas.
73
FIGURA 15. Dendograma construido con los patrones de regiones espaciadoras intergénicas (ITS) de
los individuos aislados en medio suplementado con hexadecano como única fuente de carbono. El
dendograma fue elaborado por el coeficiente de correlacion de Pierson y el método de agrupamiento
Complete linkage. Los colores indican la profundidad de la cual proviene cada aislado: 0m, 10m, 20m y 30m.
Los números sobre cada nodo indican el porcentaje de similitud entre los patrones ITS.
I
II
III
64.1
33.4
51.0
38.6
1.4
57.2
65.0
58.1
23.5
39.6
5.8
0.0
81.6
91.2
64.2
86.8
70.5
47.1
0.0
ITS
100
9080706050403020100
I1-0-1*
I1-20-2*
P1-0-2*
I1-10-4*
I1-20-4*
I1-10-2*
P1-10-2*
P1-20-9*
I1-0-5*
P2-20-7*
P1-20-2*
P1-0-9*
P1-10-1*
P2-20-73*
P2-20-9*
P2-0-1*
P2-0-7*
P2-10-1*
P2-10-5*
P2-20-2*
74
Tabla 10. Caracterización taxonómica de 17 aislamientos obtenidos en
medio suplementado con hexadecano como única fuente de carbono a
diferentes profundidades en la matriz de residuos de Moravia. (Continua en
página siguiente).
Aislamiento Origen
Morfologia de colonia
En medio BH
Tincion de
Gram y
morfología
No.
Espaciadores
intergénicos
detectados
Secuencia
relacionada
Afiliacion
Filogenetica
Porcentaje
similitud
(%)
No. De
basses
16S
rADN
para
identidad
I1-0-1 Inclinómetro 1
a 0 m
Punctiforme crema
Undulada alzada
- Bacilares 7 P. Putida WH3 Λ-Proteobacteria 99 1356
I1-0-5 Inclinómetro 1
a 0 m
Irregular opaca
alzada erosa
+ Bacilares 10 B. Subtilis RC24 Firmicutes 88 1352
I1-10-2 Inclinómetro 1
a 10 m
Irregulares color
cobre opaco
alazada lobada
+ Cocos 2 Clon de
Intrasporangiacea
e no cultivado aun
Actinobacteria 99 1340
I1-10-4 Inclinómetro 1
a 10 m
Punctiforme
amarilla-naranja
convexa entera
+ Bacilares 5 B. subtilis SB 3086 Firmicutes 99 1386
I1-20-2 Inclinómetro 1
a 20 m
punctiformes
blancas planas
irregulares
-Bacilares 2 Acinetobacter sp
43 JDE 2009
Λ-Proteobacteria 98 1380
P1-0-2 Perforación central
1 a 0 m
Punctiforme cremas
Amarillosas alzadas
enteras
-Bacilares 3 Acinetobacter sp
LUH 1469
Λ-Proteobacteria 100 1392
P1-0-9 Perforación central
1 a 0 m
Punctiforme cobre
(Convexa invertida)
entera
+ Bacilares 8 Bacillus sp. SA
071_2
Firmicutes 96 1379
P1-20-9 Perforación central
1 a 20 m
Punctiforme blanca
plana undulada
+Bacilares 5 B. subtilis BL10 Firmicutes 99 1406
P2-0-1 Perforación central
2 a 0 m
Punctiforme cremas
alzadas enteras
-Bacilares 4 Acinetobacter
Venetianus
ACI845
Λ-Proteobacteria 88 1431
P2-0-7 Perforación central
2 a 0 m
Irregulares cremas
alzada curlada
-Bacilares 1 Acinetobacter sp
MK5 2010
Λ-Proteobacteria 99 1364
75
P2-10-1
Perforación central
2 a 10 m
Punctiforme crema
alzada entera
-Bacilares
7
Acinetobacter sp
MK5 2010
Λ-Proteobacteria
98
1388
P2-10-5 Perforación central
2 a 10 m
Punctiforme crema
plana undulada
-Bacilares 9 Acinetobacter sp
MK5 2010
Λ-Proteobacteria 99 1387
P2-20-2 Perforación central
2 a 20 m
Punctiforme crema
plana entera
-Bacilares 7 Acinetobacter sp
MK5 2010
Λ-Proteobacteria 99 1389
P2-20-7 Perforación central
2 a 20 m
Filamentosa Café
alzada
+Filamentos
a
7 Clon de Bacteria
aun no cultivada
10
X 97 1390
P2-20-73 Perforación central
2 a 20 m
Punctiforme blancas
planas irregulares
+Bacilares 4 Bacillus sp. B18 Firmicutes 99 1401
P2-20-9 Perforación central
2 a 20 m
Punctiformes
blancas convexas
enteras
-Bacilares 9 Acinetobacter
calcoaceticus 7.3
Λ-Proteobacteria 99 1388
P1-10-2 Perforación central
2 a 20 m
Irregular opaca
alzada undulada
+Bacilares 6 X X X 1386
(El aislamiento P1-10-2 no arrojó ningún resultado de homología con las secuencias en bases de datos en línea)
76
FIGURA 16. Dendograma para las secuencias del gen 16s rADN de los aislamientos caracterizados. El
dendograma fue elaborado mediante el método Neighbor Joining. Sobre cada nodo se encuentra el porcentaje
de réplica en el cual las secuencias se agruparon juntas basado en un bootstrap de 1000. Las distancias
evolutivas fueron calculadas usando el método jukes-Kantor y utilizando MEGA 4.0 (Tamura, Dudley, Nei, y
Kumar 2007). Las secuencias obtenidas en este estudio están marcadas según profundidad. Círculos: 0 m,
cuadrados: 10 m, triángulos: 20 m y rombos: 30 m.
Λ-Proteobacteria
Actinobacteria
Firmicutes
P1-0-2
AJ301676.1 Acinetobacter sp. LUH1470
GU339300.1| Acinetobacter sp.
GU339280.1| Acinetobacter calcoaceticus
P2-20-9
GU201827.1| Acinetobacter sp.
FJ860870.1| Acinetobacter genomosp.
EU603516.1| Bacterium DR 206
I1-20-2
GQ158504.1| Acinetobacter sp.
GU977189.1| Acinetobacter sp.
FJ938120.1| Acinetobacter sp.
P2-0-7
P2-10-1
P2-20-7
EU124829.1| Uncultured Bacterium Clone
DQ463708.2| Uncultured Gamma Proteobacterium
HM047743.1| Acinetobacter sp.
P2-20-2
P2-10-5
DQ336974.1| Uncultured Bacterium Clone
P2-0-1
EU143354.1| Acinetobacter sp.
EF573849.1| Uncultured Bacterium Clone
AM909651.1| Acinetobacter venetianus
FJ416144.1| Pseudomonas sp.
I1-0-1
FJ976654.1| Pseudomonas sp.
EU446284.1| Pseudomonas putida
I1-0-5
P1-0-9
P1-20-9
EU852929.1| Bacillus subtilis.
GU258545.1| Bacillus subtilis.
HM107809.1| Bacillus amyloliquefaciens.
GQ867224.1| Bacillus subtilis....
HM224387.1| Bacillus subtilis.
FJ908753.1| Bacillus sp.
GQ153538.1|Bacillus subtilis.
GQ153538.1| Bacillus subtilis.
I1-10-4
FJ392727.1| Bacillus subtilis.
EU862314.1| Uncultured Bacterium Clon
AB374305.1| Bacillus sp.
EU709742.1|Bacillus subtilis.
GU143788.1| Bacillus subtilis.
GU191901.1 Bacillus subtilis
P2-20-73
AB374305.1| Bacillus subtilis.
AB523412.1| Humihabitans oryzae
I1-10-2
DQ125903.1| Uncultured Bacterium Clon
AJ566282.1| Intrasporangium calvum
Crenarchaeote symbiont of Axinella sp.
93
76
100
100
46
38
96
44
68
48
53
100
56
100
100
87
99
99
99
71
71
92
100
99
49
100
23
91
65
100
49
79
0.05
77
CAPÍTULO 4. DISCUSIÓN
4.1 Diversidad bacteriana a diferentes profundidades en el Morro de Moravia
En nuestro estudio se utilizaron técnicas de detección e identificación bacteriana
como la construcción de librerías de clones, TTGE, ITS y T-RFLP para determinar
las variaciones en las poblaciones bacterianas a través de perfiles de profundidad.
A nivel de suelos, estas diferencias están explicadas por parámetros
fisicoquímicos como pH, contenido de carbono orgánico, contenido de H2O, tipo
de agregados, distancia geográfica, grado de perturbación y tipo de suelo (Zhou et
al, 2001, Zhou et al, 2003; Hughes et al, 2006, Green et al, 2006; Buckley y
Schmidt, 2003; Dilly et al, 2003, Hansel et al, 2008; Brons et al, 2008; Hori et al,
2006; Girvan et al, 2002; Van Der Gaucht et al, 2007; Fierer and Jakson, 2005). En
estos estudios se reportan mayores contenidos de carbono orgánico a nivel de
superficie y una disminución de la diversidad y biomasa bacteriana a medida que
aumenta la profundidad en suelos de formación natural.
Los resultados de nuestro estudio muestran diferencias en el contenido de
carbono elemental entre los cuatro perfiles de la matriz de residuos (TABLA 3) La
muestra perteneciente a 20 m se destaca por tener contenidos de carbono que
superan en mas de 100% a aquellas obtenidas a las demás profundidades (0, 10 y
30 m). Estos resultados se reflejan en gran medida en los perfiles de diversidad;
tanto a través de la técnica TTGE como del análisis T-RFLP se observa una mayor
abundancia y diversidad de unidades taxonómicas operacionales a nivel de las
profundidades con mayor contenido de carbono elemental, demostrando que la
disponibilidad de nutrientes es tal vez el factor que determina los niveles de
diversidad y abundancia en distintos ecosistemas (Atlas y Barta, 2003, Philips y
Atlas, 2005).
78
A nivel de superficie, se observa una gran disminución de los perfiles de
diversidad y abundancia, particularmente a 0m. Estos resultados pueden estar
explicados no solo por el bajo contenido de carbono elemental si no por los niveles
de perturbación (Schimel, 2007; Atlas y Barta, 2003, Torsvik et al, 2002; Horner et
al, 2003). Allison y Martiny (2008) hacen un análisis interesante de cómo los
mecanismos de resiliencia microbiana y redundancia funcional en el ecosistema
salen a flote cuando las condiciones de presión y estrés externas se hacen
evidentes, de esta manera, los individuos capaces de sobreponerse a esos
cambios, mantienen la función del ecosistema. Esto cobra importancia en el caso
de Moravia en el sentido que la estructura y diversidad de las comunidades
bacterianas a superficie (0 y 10m) quizás sufrieron una disminución dramática con
los primeros signos de presión representados por el uso del suelo, en contraste,
los mayores perfiles de diversidad observados a profundidad (20m), reflejan un
ecosistema con bajos niveles de perturbación física externa, lo que posiblemente
beneficiaria los roles metabólicos de las comunidades bacterianas e a esta
profundidad.
Como se menciona anteriormente, la composición específica de las comunidades
bacterianas está determinada por la presencia de nutrientes, particularmente
contenido de carbono y presencia de aceptores terminales de electrones (Hansel
et al et al, 2008). En este caso, estos factores podrían estar representados por el
tipo y grado de contaminantes, en su mayoría, hidrocarburos alifáticos, aromáticos
y metales pesados (Penuela, 2007; Sanchez et al al, 2010). McNaughton y
colaboradores (1999) describen como durante procesos de biorremediación, los
perfiles de biomasa bacteriana aumentan con el grado de contaminación con
hidrocarburos, disminuyendo a medida que los contaminantes son degradados
las comunidades incapaces de metabolizar el contaminante como nutriente
durante estos procesos desaparecen a menos que reciban los estímulos
metabólicos apropiados. En el caso de Moravia, esto significa que a mayor
profundidad no solo es probable encontrar mayores niveles de contaminación si no
que, los amplios perfiles de abundancia y diversidad retratados por las técnicas
79
TTGE y T-RFLP pueden estar en su mayoría representados por bacterias con
potencial bioremediador.
4.1.1 Análisis de perfiles de diversidad por TTGE y T-RFLPs
Los resultados de los perfiles analizados derivados de la técnica TTGE (FIGURA
6), muestran dos grupos dominantes; Proteobacteria y Bacteroidetes, dentro de
los cuales encontramos géneros como; Acinetobacter, Flavobacterium y Ralstonia.
Las bandas representantes de estos grupos se observan con mayor intensidad a
20m, reforzando las ideas presentadas anteriormente. Comparando los resultados
de la prueba TTGE a partir de extracciones de ADN por puntos individuales con la
prueba derivada de las mezclas de suelo se observan patrones de bandeo y
agrupamiento similar (FIGURA 6, FIGURA 8, FIGURA 9 y FIGURA 10). En la
figura 8 se muestran amplias diferencias entre cada grupo de muestras por
profundidad (Grupo I, II y III). En la figura se observa más de un 90% entre las
muestras provenientes de 0m (Grupo I) y aquellas provenientes de 10, 20 y 30m
(Grupo II y Grupo III) y aproximadamente un 60% entre las muestras provenientes
de 10m (Grupo II) y las provenientes de 20 y 30m (Grupo III).
Estos patrones indican claramente las diferencias en diversidad bacteriana
reflejadas por la tecnica TTGE entre cada profundidad. Los perfiles de bandas
obtenidos representan las comunidades más representativas o dominantes
(Muyzer, 1993). Sin embargo, estos perfiles de bandeo, no alcanzan a representar
la riqueza total de las poblaciones bacterianas, adicionalmente una sola banda
detectada puede representar más de un taxón o una especie particular puede dar
pie a la formación de varias bandas como resultado de las limitaciones de la
técnica (Nakatsu, 2007; Hori et al, 2006, Singh et al, 2009; Nanipieri y Smalla,
2006). Por lo tanto, es necesario contemplar los sesgos que pueden representar
las técnicas moleculares basadas en la técnica PCR, principalmente, aquellas que
requieren obtener ADN representativo de todas las comunidades presentes y la
80
presencia de manchas o “smears” en algunos de los carriles que pueden
representar múltiples taxa en menores concentraciones pero con roles
fundamentales en el ecosistema, (Singh et al, 2009, Cummings, 2010, Kirk et al,
2004, Smalla, 2007). No obstante estas limitaciones, la técnica TTGE sigue
teniendo gran poder de resolución y reproducibilidad en comparación con otras
técnicas como el establecimiento de librerías de clones.
En el análisis de clones del gen 16S rADN llevado a cabo en el marco del proyecto
para la recuperación del morro de Moravia fase I, se obtuvieron 6 clones diferentes
cuyas secuencias mostraron afiliación taxonómica con bacterias aun no
cultivadas pertenecientes a las divisiones Proteobacteria, Actinobacteria y con
posible potencial bioremediador (TABLA 4). Dichas secuencias están asociadas a
bacterias involucradas en la degradación de residuos sólidos de diversa
composición en condiciones mesófilas, anaeróbicas, metanotróficas, oxido-
reductoras aeróbicas y sulfato reductoras de compuestos hidrocarbonados
(Artículos aun no publicados). Sin embargo, ninguna de las secuencia pudo ser
correlacionada con el análisis TTGE indicando que las unidades taxonómicas
operacionales detectadas por clonación, no reflejan la estructura que domina el
ecosistema, sobre todo en matrices como los suelos y con mayor relevancia en
esta matriz compleja de origen antrópico (Small y Tiedje, 2005). Así, la técnica
TTGE muestra una perspectiva de los individuos que dominan en esta matriz
sobre organismos poco abundantes a diferentes profundidades y quienes podrían
estar presentes en mayor numero según intensidad de bandas (FIGURA 5)
(Wintzingerode et al, 2007; Hughes et al, 2001; Nakatsu et al, 2000).
Los dendogramas obtenidos por el coeficiente de correlación mínima y el método
Pierson (FIGURA 8 y 10) muestran que los perfiles de las comunidades a 20 y 30
m forman un grupo separado de los perfiles obtenidos a superficie y soportando
las ideas expuestas anteriormente acerca de las diferencias en disponibilidad de
nutrientes, niveles de contaminación y de perturbación. En la TABLA 5, se
81
muestran las afiliaciones taxonómicas de las secuencias de los individuos
dominantes a través de todo el perfil del suelo. La banda a, tiene un porcentaje de
similitud en su secuencia del 98 % Flavobacterium sp. el cual ha sido reportado
anteriormente no solo como habitante natural del suelo, si no también relacionado
con mecanismos de remoción de metales pesados en procesos de
fitorremediación, degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos, productor
de biosurfactantes en la degradación de hidrocarburos y promotor de crecimiento
en plantas (Jing et al, 2007; Robles-Gonzales et al, 2008; Ellis et al, 2003; Bodour
et al, 2004). Esta secuencia se encuentra presente en todas las profundidades,
con mayor o menor abundancia en distintos puntos. Las secuencias de las bandas
b y c guardan una similitud del 95 y 99 % respectivamente con Acinetobacter sp. e
igual se encuentran en todas las profundidades a menor o mayor intensidad.
Llama la atención el hecho que ambas bandas hayan migrado en puntos muy
distintos en el gel, sin embargo el poco porcentaje de similitud (95 %) de la banda
b en contraste con la banda c (99 %), puede hacer pensar que la primera podría
representar la secuencia de un operón adicional del gen 16srRNA en
Acinetobacter (Nakatsu, 2007, Nanipieri, 2006) o que se trate de una especie aun
no caracterizada del género. La banda f guarda también similitud con
Acinetobacter sp. aunque en un bajo porcentaje (91 %) y en un punto muy lejano
de migración (Ver FIGURA 6). Esto espalda en cierta medida los argumentos
expuestos a cerca del carácter diverso en operones del 16S rADN o de la
diversidad de especies. Acinetobacter sp. es igualmente un habitante natural del
suelo y aguas y está estrechamente ligado a procesos de degradación en
ambientes con altos niveles de contaminación con hidrocarburos aromáticos y
alifáticos como agente catalizador mediante la absorción y conversión de estos
compuestos o como productor de biosurfactantes para facilitar la biodisponibilidad
de los hidrocarburos para sí mismo o para otros degradadores potenciales como
Pseudomona putida (Towner, 2006; Margesin et al, 2003; Kirkelund et al, 2007;
Onaca et al; Bordenave et al, 2007; Mattes et al, 2008; Koren et al, 2003; Barbe et
al, 2004). Adicionalmente, estos autores coinciden en resaltar la dominancia de
miembros del Phylum Proteobacteria sobre otros grupos, cuando los niveles de
82
sustrato en términos de hidrocarburos son particularmente altos mientras que
miembros representantes de los phyla Actinobacteria o Firmicutes, emergen una
vez los niveles de contaminación han disminuido. Estos hallazgos son
consecuentes con las observaciones de Atlas y Barta (2003) cuando coinciden en
caracterizar a miembros del phylum λ-Proteobacteria, particularmente P. putida y
Acinetobacter como estrategas r, los cuales crecen en número y predominan en
condiciones donde hay alto contenido de nutrientes (posiblemente representados
por los hidrocarburos en este caso).
Estos datos sugieren que las comunidades bacterianas en sitios contaminados
como el morro de Moravia, podrían actuar como sensores de la naturaleza y nivel
de contaminación, aportando datos de suma importancia al momento de diseñar
programas de remediación o recuperación de las matrices contaminadas (Singh et
al, 2009). Los resultados corroboran los datos obtenidos por Sánchez (2010) y,
Peñuela et al, 2009 y colaboradores (2009) que reportan el alto grado de
contaminación de la matriz del morro de Moravia, aun después de 12 años.
La banda e, (FIGURA 6) cuya secuencia guarda una similitud del 99 % con
individuos del género Ralstonia, solo se observo a 10 y 20 m, aunque la presencia
de manchas tenues en la misma posición a 0 m, puede también significar su
presencia en menor abundancia. Ralstonia es también miembro del phylum
Proteobacteria (clase β-Proteobacteria, orden Burkholderiales). Este género es
conocido por su batería enzimática compuesta por enzimas de la clase
dioxigenasas, capaces de degradar un sinnúmero de hidrocarburos aromáticos
policíclicos, bifenilos policlorados, hidrocarburos alifáticos y hasta metales
pesados (Ellis et al, 2003, Dionisi et al, 2004; Newton et al, 2004; Kleinsteuber et
al, 2006; Brennerova et al, 2009; Cebron et al, 2009; Uhlik et al, 2009).
Los resultados del análisis de poblaciones bacterianas agrupadas por el
coeficiente de correlación mínima y el método Pierson efectuado a partir de los
perfiles T-RFLP (FIGURA 11) son equivalentes a los resultados del TTGE y
muestran que los perfiles pertenecientes a profundidades mayores (10, 20 y 30m)
forman un grupo independiente del perfil obtenido a 0m (clúster único) (FIGURAS
83
8 y 10). Sin embargo, la cantidad de taxa, representados por el numero de picos
obtenidos mediante la técnica T-RFLP, es mucho mayor debido a la alta
sensibilidad de la técnica (Liu et al, 1997). Esto sucede con cualquiera de las tres
enzimas utilizadas (HhaI, MspI and RsaI).
Aunque el análisis T-RFLP fue efectuado para obtener un perfil de los niveles de
diversidad y abundancia en general, fue posible establecer posibles identidades
taxonomicas de los organismos más abundantes en cada profundidad
relacionando la longitud de los picos obtenidos con aquellos encontrados en la
base de datos MICA (Microbial community analysis), donde es posible encontrar
los fragmentos de restricción de clones ya identificados y reportados en bases de
datos afiliadas al GenBank (NCBI- National center for biotechnology) (Shyu et al,
2007). El tamaño de los fragmentos encontrados en la base de datos para los
géneros dominantes con la técnica TTGE concuerdan con algunos de los
fragmentos terminales más abundantes obtenidos por T-RFLP con diferencias de
1 a 5 bp, fenómeno observado anteriormente (Coupples y Sims, 2007).
La técnica T-RFLP detectó en gran mediada los fragmentos terminales de los taxa
dominantes detectados por la técnica TTGE (Acinetobacter, Flavobacterium y
Ralstonia); el género Acinetobacter, muestra fragmentos terminales en MiCA
correspondientes a 207-210, 491-494, 879-881 (HhaI, MspI y RsaI), todos
detectados por la técnica T-RFLP. Los fragmentos exhibidos en MICA para el
género Ralstonia, solo concuerdan con dos fragmentos abundantes encontrados;
436 y 479 (MspI y RsaI). En lo que se refiere al género Flavobacterium, solo dos
fragmentos encontrados corresponden a los más abundantes (HhaI =90 y 373).
Igual que en la prueba TTGE, la abundancia de todos estos fragmentos fue
mucho mayor a 20 y 30 m. Estos resultados sugieren que los dos métodos de
detección reflejan resultados similares (Smalla et al, 2007).
Sin embargo la técnica T-RFLP detecto otros fragmentos abundantes con posibles
coincidencias taxonómicas en la base de datos MiCA. Estos corresponden en su
mayoría a representantes de los géneros, Burkholderia, Pseudomonas y
Arthrobacter. Dichos géneros pertenecientes al los phylum Proteobacteria y
84
Actinobacteria, son bien conocidos por sus capacidades degradadoras
bioremediadoras (Van Hamme et al, 2003). Igualmente, entre los fragmentos de
restricción mas abundantes se encuentran aquellos pertenecientes al género
Brevundimonas sp. (332(HhaI), 403 (MspI), 422 (RsaI) y Thalassospira (92 (HhaI),
448 (MspI), 830 (RsaI)) ambas pertenecientes al Phylum α-Proteobacteria y
abundantes a 20 y 30m. Su presencia ha sido reportada en trabajos relacionados
con la degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos, metales pesados
como el cadmio e hidrocarburos en general (Viñas M et al, 2004; Zhao et al,
2010).
Estos resultados respaldan la idea de un posible mayor potencial bioremediador a
profundidad, características reportadas anteriormente (McNaughton et al, 1999;
Margesin et al, 2003; Viñas et al, 2005; Popp et al, 2006; Kaplan et al, 2003;
Bordenave et al, 2007) donde se correlacionan niveles de contaminantes con el
potencial genético-enzimático de las comunidades bacterianas presentes. Sin
embargo, hay que tener en cuenta que la base de datos MICA, constituye una
aproximación a una identificación taxonómica, lo cual significa que es necesario
caracterizar fragmentos terminales a partir de librerías de clones ya establecidas
para obtener datos más exactos de identidad. No obstante, es preciso anotar que
la posibilidad de aproximación a una posible identidad filogenética en la base de
datos es más exitosa con el uso de varias enzimas de restricción (Kent et al, 2003)
como ocurre en este caso (HhaI, MspI y RsaI).
4.2. Análisis de bacterias involucradas en la degradación de Fenoles
mediante la prueba SIP.
La técnica de marcación de sustratos con isotopos estables permite relacionar la
estructura de las comunidades bacterianas con su función en el ecosistema (Sims
y Coupples, 2007; Luo et al, 2010; Neufeld, 2007). Los resultados de la prueba
ADN-SIP mostraron que en las fracciones pesadas predominaron fragmentos
terminales no encontrados en las fracciones no marcadas (TABLA 7). Algunos de
estos fragmentos terminales pudieron ser observados en clones obtenidos de esas
85
fracciones (TABLA 8).La comparación de los fragmentos terminales provenientes
de las fracciones marcadas con (13C) y no marcadas (12C), permitió descartar
falsos resultados positivos puesto que los fragmentos terminales que también se
presentaron en las fracciones pesadas no marcadas no fueron tenidos en cuenta.
Llama la atención sin embargo, la cantidad de fragmentos obtenidos en las
fracciones pesadas, esto puede ser señal de un gran número de grupos
bacterianos involucrados en la degradación de fenol, especialmente a 10 y 20m.
En este caso, la identidad de los clones detectados coincide con secuencias
conocidas de organismos involucrados en procesos de degradación de
hidrocarburos (TABLA 8). Las extracciones de ADN se llevaron a cabo a los 4 y 6
días excepto para la muestra a 30m. Es interesante observar como la degradación
de fenol ocurrió rápidamente en el día 2, disminuyendo paulatinamente al cabo del
sexto día particularmente a 20 m. A 30m, debido a las condiciones de saturación
completa, los ratas máximas de degradación de fenol, en las cuales se extrajo el
ADN, ocurrieron a los días 11 y 18, casi de manera gradual (TABLA 6).
Estas observaciones podrían significar que a 0, 10 y 20m, el fenol es degradado
rápidamente, y que los procesos de biodegradación del fenol a estas
profundidades pueden estar ocurriendo bajo condiciones aeróbicas o anaeróbicas
facultativas, mas favorables desde el punto de vista energético; además, se podría
inferir que los procesos de degradación de fenol y de compuestos aromáticos en
general bajo condiciones anaerobias, ocurren de manera mucho más lentas
(Hansel et al, 2008).
Estos fenómenos están ligados no solo con el tipo y nivel de contaminación en el
morro de Moravia, si no, por supuesto, con el perfil taxonómico de las
comunidades bacterianas presentes; ya se ha mencionado que individuos
asociados al Phylum Proteobacteria, tienden a incrementar su biomasa en
condiciones de alto contenido de nutrientes (Estrategas r) (Margesin et al, 2003),
tales condiciones pueden estar representadas por los tiempos iniciales de
suplemento de fenol en el día 4). Es así como los fragmentos terminales
pertenecientes a miembros de este Phylum son mas abundantes en el día 4 de de
86
incubación con fenol; la FIGURA 13 C, muestra como el fragmento de 500 bp
perteneciente al genero Alcaligenes disminuye en abundancia desde el día 4 al 6,
igualmente, la figura 13 D, muestra como el fragmento de 455 bp asociado al
genero Xanthomonas obedece el mismo patrón decreciente. Ambos clones fueron
encontrados a 20 y 30 m respectivamente.
Los clones obtenidos en la prueba SIP pertenecen los phyla Proteobacteria,
divisiones alfa, beta y gama y Actinobacteria, observación consecuente con lo
encontrado en los perfiles de diversidad en general y con las observaciones que
ubican a estos dos grupos como los phyla principales en la degradación de
hidrocarburos alifáticos y aromáticos. En la TABLA 8 se relaciona la identidad de
los clones obtenidos para el experimento SIP.
A pesar de encontrar varios fragmentos enriquecidos, a 0m, se pudo detectar un
solo clon que mostraba los 3 fragmentos de forma simultánea (TABLA 8). El clon
B4, guarda una similitud del 99% con el género Arthrobacter sp, perteneciente al
phylum Actinobacteria. La secuencia más cercana esta reportada en un trabajo no
publicado relacionado con la degradación de atrizina, un herbicida usado
comúnmente, cuya estructura comprende anillos aromáticos. Ferreira et al, (2009);
Ferreira y Marchesi, 2008; Perry y Zylstra 2007 y Nordin et al (2005) reportan el
potencial remediador de Arthrobacter sp. contra compuestos complejos aromáticos
como cloro fenoles. Arthrobacter sp. también fue uno de los géneros detectados
en el perfil de comunidades en general por T-RFLP, indicando efectivamente que
la contaminación por compuestos complejos anillados derivados del fenol es
importante en el morro de Moravia. Otros clones detectados y secuenciados a esta
profundidad no presentaban los tres fragmentos enriquecidos de forma
simultánea.
A 10m, se detectaron igualmente una variedad de fragmentos enriquecidos, sin
embargo, tres clones mostraron coincidencia simultánea de los tres fragmentos y
secuencias de calidad. El clon d3 guarda un similitud de 100% con
Aquamicrobium sp. perteneciente al phylum α-Proteobacteria, este género ha sido
reportado en un solo trabajo relacionado con la degradación de hidrocarburos
87
aromáticos policíclicos (Andreoni et al, 2004) y en general muy pocos trabajos lo
reportan. El clon C3 guarda una identidad de 94% con el género Pseudomonas del
Phylum Λ- Proteobacteria. La habilidad de este género para metabolizar tanto
hidrocarburos alifáticos como aromáticos ha sido bien documentada (Van hamme
et al, 2003; Weidon y Nakatsu, 2009). El otro clon caracterizado a esta
profundidad, C12, guarda un 99% de similitud en su secuencia con genero
Dietzia, phylum Actinobacteria. Este género ha sido bien documentado en la
degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos y bifenilos policlorados (Leys
et al, 2003; Gutiérrez et al, 2009).
A pesar de encontrar mayores perfiles de diversidad y abundancia a 20 m según
los análisis T-RFLP y TTGE, solo se detectaron 2 fragmentos terminales
dominantes con cada enzima en la prueba SIP. Uno de los fragmentos pertenece
al género Alcaligenes, phylum β-Proteobacteria, el otro pertenece al género
Micrococcus, phylum Actinobacteria. Estos dos géneros dominaron en los
procesos de degradación de fenol a esa profundidad. Tres clones (e5, E6 y F10)
fueron identificados (99% de similitud) con el género Alcaligenes. Singleton et al
(2009) y Van hamme et al (2003) destacan la presencia de este género en los
procesos de degradación de hidrocarburos aromáticos policíclicos. Por otro lado,
Carmona et al (2009), resaltan el rol de este género en procesos de degradación
de benzoatos en condiciones anaeróbicas, lo que puede dar una idea del
ambiente en el cual se llevan a cabo los procesos y la rata a la cual la
biodegradación de compuestos más complejos toma lugar a 20m.
El clon E1 guarda una similitud en su secuencia del 99% con miembros del genero
Micrococcus. Van Hamme et al, (2003) y Beller et al, (2009) entre otros, relacionan
a miembros de este género con la producción de biosurfactantes e hidrocarburos
alifáticos de cadena larga, importantes en procesos de degradación de petróleo y
desde el punto de vista biotecnológico. No obstante, no se reportan trabajos que
relacionen el rol de miembros de este género en la degradación directa de
hidrocarburos aromáticos, fenoles o policíclicos.
88
El análisis in silico en MiCA derivado de los patrones T-RFLP para las mezclas de
suelos a 0, 10, 20 y 30m, indica que uno de los géneros probablemente más
abundantes a través de todo el perfil de la matriz de residuos de Moravia es
Brevundimonas sp. (phylum α-Proteobacteria), particularmente a 20 y 30m,
disminuyendo o desapareciendo a nivel de superficie (0 y 10). La probable
abundancia de este género pudo ser confirmada por su rol en la degradación de
fenoles a 30m a través de la prueba SIP mostrando que el clon g7, guarda una
similitud del 99% con Brevundimonas sp. El potencial remediador de este género
ha sido descrito anteriormente. (Chaineau et al,1999; Viñas et al, 2005; Jiajun et
al, 2010).
El clon G5 es 99% similar a miembros del genero Xanthomonas y
Pseudoxanthomonas, phylum λ-Proteobacteria. La coincidencia más similar en
BLAST pertenece a un miembro del genero, aislado de suelos contaminados con
BTEX (benzenos, toluenos, etilbenzenos y xilenos) (Lee et al, 2008; Manickam et
al, 2006; Van Hamme et al, 2003). Miembros de estos dos géneros se reportan
como estrictamente aerobios (Lee, 2008), esta observación llama la atención, ya
que estos clones fueron obtenidos de la muestra de suelo a 30m, muestra que fue
intencionalmente incubada en condiciones de completa saturación. Esto puede
deberse a vías metabólicas alternativas dependientes de proceso nitrato
reductores o a la presencia de micro poros o “bolsillos de aire” donde priman
condiciones aerobias, especialmente en esta matriz compleja altamente
heterogénea (Atlas y Philips, 2005; Atlas y Barta; 2003, Lee, 2008; Singh et al,
2009).
El clon H2 identificado también a 30m mostro una identidad del 99% con el clon de
una bacteria no cultivada aun (número de acceso GenBank FM872753.1),
relacionada con etapas de formación de compost a partir de desechos de la
industria porcina (Guo et al, 2006). Ninguna de las otras secuencias cercanas se
relaciona con procesos de degradación de contaminantes, Sin embargo, al
analizar el dendograma en la FIGURA 14, se observa que este clon esta cercano
al grupo compuesto por miembros del Phylum Actinobacteria, específicamente a
89
los géneros Arthrobacter, Micrcoccus y Dietzia, lo que podría dar cuenta de una
posible afiliación filogenética.
Estos resultados refuerzan el concepto ampliamente reportado acerca de los
principales phyla involucrados en procesos de degradación de hidrocarburos;
Proteobacteria y sus tres divisiones, particularmente división gamma, y
Actinobacteria. A excepción de los clones H2 y E1, (no cultivado aún y
Micrococcus sp.) no se reportan excepciones especiales o géneros nuevos en
procesos de degradación.
4.3. Análisis de la fracción cultivable degradadora de Hexadecano
Los resultados de este estudio sugieren un rango estrecho en cuanto a diversidad
de especies cultivables degradadoras de hexadecanos en este lugar, fenómeno
probablemente ligado a las características complejas fisicoquímicas a nivel de
profundidad y por supuesto a los sesgos potenciales que pueden representar los
estudios cultivo-dependientes (Van hamme et al, 2003). Llama la atención el
aumento de los conteos de degradadores de hidrocarburos a mayores
profundidades (TABLA 9) opuesto a lo que se reporta en cuanto a biomasa
bacteriana en la subsuperficie (Hansel et al, 2008; Holden y Fierer, 2005). Este
análisis refuerza las ideas expuestas anteriormente acerca de la correlación
directa entre la disponibilidad de nutrientes y la abundancia y diversidad
bacteriana, particularmente en esta matriz de residuos, y el concepto de
microbiodiversidad como sensor químico natural (Singh, 2009: Ellis et al, 2003).
Los resultados del aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos
respaldan los hallazgos de las pruebas moleculares. Los individuos detectados
como dominantes por la técnica TTGE, en este caso Acinetobacter sp; phylum
gamma Proteobacteria, se muestran como el género más dominante entre los
aislamientos que degradan hidrocarburos. Entre un total de 20 secuencias
obtenidas, 11 guardan similitudes en alto porcentaje (97-100 %) con este género.
Sin embargo, aunque el tamaño de la muestra es pequeño se puede hacer un
90
análisis de cuales patrones ITS en los 48 aislados obtenidos inicialmente
coinciden con los 20 aislados identificados por secuenciación (ANEXO 8).
Según este análisis, basados en un rango de 80 a 100% de similitud en patrones
ITS, miembros del genero Acinetobacter podrían constituir alrededor de 30% del
total de los aislamientos mientras que miembros de Bacillus sp; representarían
aproximadamente un 15%. El análisis morfológico muestra que la relación entre
bacterias Gram negativas y Gram positivas podría estar en el orden de 2 a 1
(ANEXO 8). Recordemos que miembros del Phylum gamma Proteobacteria son
Gram negativos por excelencia. No obstante este análisis debe ser considerado
con prudencia ya que las relaciones taxonómicas y/o filogenéticas solo desde el
punto de vista morfológico, pueden ejercer un sesgo significativo en métodos de
aislamiento en medios selectivos (Madigan et al, 2003; Baken 1997).
Un análisis interesante del dendograma obtenido con los patrones ITS (FIGURA
15) muestra como se forman tres grupos definidos entre bacterias aisladas del
inclinómetro 1 (Grupo I), la perforación central 1 (Grupo II) y la perforación central
2 (Grupo III). Si bien este trabajo se enfoca en diferencias en perfiles de diversidad
entre profundidades y no entre puntos adyacentes, vale la pena mencionar que el
análisis ITS y de secuencias del gen 16s rADN, muestran que individuos del
género Acinetobacter sp. predominan en las muestras provenientes del
inclinómetro 1 y la perforación central 2, obtenidas cerca a la parte interior de la
montaña de residuos (ANEXO 1), mientras que miembros del genero Bacillus sp.
predominan en la perforación central 1 más cerca a la periferia. No obstante, es
necesario obtener un mayor número de aislados para establecer diferencias
significativas.
Acinetobacter sp. es un género común en suelo como se menciono anteriormente
y ha sido caracterizado por su capacidad de degradar n-hexadecano (Van Hamme
et al, 2003, Singh et al 2009). El análisis de patrones ITS muestra que Bacillus sp,
específicamente Bacillus subtilis, representó aproximadamente 18 % de todos los
aislados obtenidos siendo detectado en todas las profundidades (ANEXO 8). Esta
91
especie es bien conocida por la producción de surfactina, biosurfactante que
posibilita la solubilidad y biodisponibilidad de hidrocarburos normalmente
insolubles en agua (Cooper et al, 1981; Janibani et al, 1994; Van Hame et al,
2004; Cubitto et al, 2004; Bodour et al, 2004). Bacillus subtilis no ha sido
reportado como degradador de hexadecano y no se ha caracterizado en esta
especie un sistema homólogo al AlkB (alkano monoxigensa) de Pseudomona
putida o un mecanismo similar. Van Hamme et al (2003) reportan el carácter móvil
del plásmido OCT que codifica el sistema AlkB, con posible transferencia lateral en
ambientes con altos niveles de contaminación. A este respecto, Lorenz y
Wackernagel (1994) reportan la transferencia de material. Por lo tanto el
aislamiento de esta bacteria en medios suplementados con hexadecano como
única fuente de carbono representa un tema de interés para futuras
investigaciones. Pseudomona putida ha sido reportado como un habitante natural
del suelo y un individuo altamente degradador de hexadecano por la vía AlkB. En
nuestros resultados solo se detectó una secuencia del gen 16S rRNA con similitud
del 99 % (I1-0-1) a 0 m adicionalmente, ninguno de los patrones ITS evaluados
mostro una relación con este aislamiento.
Como se presumía inicialmente, la secuencia del gen 16S rRNA de uno de los
individuos (I1-10-2) a 10 m, aparece en la base de datos NCBI como nunca antes
aislado, guardando una similitud del 99 % con un clon de una bacteria del genero
Intrasporangiaceae (phylum Actinobacteria) no cultivada y con el clon de una
bacteria aun no cultivada. Ambas secuencias han sido reportadas en trabajos
relacionados con la degradación aeróbica y anaeróbica de benzeno (Kanapuli et
al, 2007) y con la reducción de Uranio (Brody et al, 2006), adicionalmente
miembros de este phylum como Rodooccus y Mycobacterium, exhiben sistemas
de degradación de hexadecano con cierta homología a AlkB de Pseudomonas.
putida .
El análisis de polimorfismo de regiones espaciadoras intergénicas ITS, permite
establecer diferencias e identificar individuos a nivel de género y especie (Jensen
et al, 2003; Garcia Martinez et al, 1999). Sin embargo los mismos autores al igual
que Perez (1998), Chen (2000), Mora (2003); Boyer (2001), Ehrenstein (1996),
92
Sadeghifard (2006) y sus colaboradores, reconocen las complicaciones que se
podrían presentar en el análisis; por ejemplo especies iguales con patrones
polimórficos en regiones ITS y patrones iguales para 2 especies diferentes. Estos
problemas obedecen a las múltiples variaciones de los operones rRNA en cuanto
a número y secuencia, preferencia por operones específicos durante la
amplificación por PCR de las regiones intergénicas y problemas relacionados con
el análisis como ADN molde e interpretación de patrones en diferentes matrices
(poliacrilamida o agarosa) (Mora et al, 2003).
Estos fenómenos se han observado a nivel de géneros, especies y cepas. En este
caso particular 4 aislados (P2-0-7, P2-10-1 y 5 y P2-20-2) detectados a las 3
profundidades, presentan patrones ITS totalmente distintos (FIGURA 14) y
secuencias 16s rADN con la misma identidad Acinetobacter sp. MK5 (98-99 %). A
pesar de que los fragmentos para todas las especies del genero (hasta 33) están
entre 593 y 715 bp (Chang et al, 2005), los patrones de varios de los aislamientos
identificados como Acinetobacter sp, muestran múltiples fragmentos de menores y
mayores tamaños comparados con el rango mencionado. Los fragmentos
principales para las especies más estudiadas (A. calcoaceticus y A. baumanni)
muestran tamaños de 638 y 607 bp (Chang et al, 2005; Ranjard et al, 2000), sin
embargo, el aislado P2-20-9, que guarda una similitud del 99% con A.
calcoaceticus, presenta múltiples bandas menores de 638 bp. No obstante estas
dificultades, el análisis de ITS mostró gran poder de resolución entre especies de
un mismo género, detectando 5 especies distintas de Bacillus sp. y 6 especies
distintas de Acinetobacter sp. (FIGURA 15).
Con el fin de evitar las complicaciones antes mencionadas, el análisis ITS puede
ser complementado con el aislamiento, clonación y secuenciación o una
restricción de de los fragmentos obtenidos (Vaneechouete, 1995). A de haber
hecho un análisis morfológico, Gerner-Smidt y colaboradores (1990), reportan
datos de identificación insuficientes basados en parámetros fenotípicos, esto
debido principalmente a la gran similitud morfológica y metabólica que existe entre
especies de Acinetrobacter sp; por lo tanto es muy posible que se haya
desestimado en alguna medida la diversidad de la población cultivable al momento
93
de agrupar aislados por color de tinción y morfología durante los primeros
aislamientos.
94
CAPITULO 5. CONSIDERACIONES Y CONCLUSIONES FINALES
El presente trabajo constituye el primer reporte de caracterización de la dinámica
de distribución, diversidad, abundancia y función de las bacterias presentes en la
matriz de residuos del morro de Moravia de Antioquia, Colombia a diferentes
profundidades. Los perfiles de comunidades revelados por las técnicas cultivo
independiente utilizadas en este trabajo (TTGE, T-RFLP, clonación) y cultivo
dependiente, dan cuenta de la dinámica de distribución de las poblaciones
bacterianas a diferentes profundidades en la matriz de residuos de Moravia.
Adicionalmente, se logró correlacionar relaciones filogenéticas con la función de
individuos específicos en el ecosistema mediante la técnica de marcación con
isotopos estables SIP.
Los perfiles de identidad y función de las comunidades bacterianas entre la
superficie y las profundidades podrían definir como se llevan a cabo los procesos
de degradación de contaminantes en el morro, y permitirían hacer inferencias
sobre el nivel de contaminación presente. Estos resultados tienen un potencial
para ser empleados en medidas orientadas a implementar procesos de
biorremediación en una zona de alto riesgo para la población en esta ciudad y
sugieren un enfoque que cubra la matriz de residuos en su totalidad explotando la
función de las comunidades presentes. No obstante, es fundamental efectuar un
nuevo análisis in situ del perfil de las comunidades bacterianas con el objeto de
evaluar como el potencial bioremediador descrito en este trabajo cambia o se
mantiene a futuro. En este orden de ideas, surgen las siguientes conclusiones de
esta investigación:
Los altos perfiles de diversidad y abundancia en términos de profundidad
mediante las técnicas moleculares TTGE y T-RFLP, pueden significar alto
potencial metabólico a mayores profundidades. Estas diferencias podrían
estar regidas por parámetros fisicoquímicos complejos inherentes a los
procesos de formación del lugar y la matriz de residuos más que por los
parámetros que rigen en suelos de formación natural.
95
Los perfiles de diversidad y abundancia probablemente revelan los niveles
agudos de contaminación en la matriz de residuos a profundidad,
evidenciando como predominan géneros comúnmente presentes en
procesos iniciales de remediación biológica en los cuales se presentan las
más altas concentraciones de contaminantes y reforzando el concepto de
comunidades microbianas como sensores químicos del ecosistema.
Las comunidades detectadas como dominantes tanto por técnicas
moleculares como dependientes de cultivo muestran individuos
pertenecientes a géneros con gran potencial remediador; Phylum,
Proteobacteria (subdivisiones gamma, beta y alfa) y Actinobacteria.
Miembros de estos Phylum están reportados en la literatura en procesos de
recuperación de suelos contaminados con hidrocarburos y metales
pesados, los xenobióticos más comunes la matriz de residuos del morro de
Moravia. Sin embargo, no hay una distinción filogenética específica según
profundidad (ANEXO 10).
La prueba SIP y el aislamiento de bacterias capaces de metabolizar
hexadecano como única fuente de carbono, utilizadas para correlacionar la
composición de las comunidades bacterianas con su función, corroboran
que en efecto los individuos dominantes en la matriz de residuos a
diferentes profundidades, tienen un gran potencial bioremediador. Sin
embargo, es necesario adelantar ensayos bajo condiciones experimentales
en donde se evalué la acción de cepas individuales o consorcios
degradadores aislados en este trabajo sobre micro ambientes que simulen
en alguna medida las condiciones fisicoquímica presentes en la matriz de
residuos de Moravia.
El haber utilizado un enfoque metodológico polifásico permitió corregir las
potenciales desventajas que surgen de la utilización de técnicas
individuales en estudios de diversidad y ecología microbiana, de este modo
se logro tener un panorama más completo de las comunidades bacterianas
representativas en la matriz de residuos de Moravia.
96
Los resultados obtenidos en este estudio mediante las técnicas TTGE, T-
RFLP, SIP, ITS, clonación y los análisis dependientes de cultivo, dan luz
acerca del uso y la posible explotación de la microbiodiversidad presente en
la matriz de residuos para implementar futuros programas viables de
recuperación del suelo.
Debido a la complejidad de la matriz bajo estudio, los posibles altos niveles
de contaminación a profundidad y los costos asociados a técnicas
especificas de biorremediación (descritas en el capitulo uno), se
recomienda efectuar estudios de ecología y diversidad microbiana en
amplios lapsos de tiempo, estableciendo sistemas de monitoreo de
atenuación natural basados en la detección de las micro comunidades
activas (procariotas y eucariotas) y de los niveles de contaminación
presentes; pues ha sido comprobado que en ecosistemas subterráneos
contaminados, las reacciones llevadas a cabo por las comunidades
microbianas, contribuyen directamente a la recuperación de dichos
ecosistemas en función de tiempo (Yagi et al, 2010).
97
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119
ANEXOS
Anexo 1. Localización de los inclinómetros y piezómetros instalados en el
Morro de Moravia
120
Anexo 2. Extracción de ADN de bacterias aisladas en hexadecano como
única fuente de carbono (Adaptado de Sambrook y Russel, 2003).
Los aislados puros se reactivaron en medio Luria Beratni (LB) hasta observar
evidencia de crecimiento por turbidez (cercano a 600 nm=1); 600 ml de cultivo se
sometieron a centrifugación a 10,000 g. por 5 min. 2 veces para obtener una
cantidad suficiente de precipitado celular bacteriano; el pellet se lavó con 500 µl de
solución de buffer fosfato (PBS) y se centrifugó de nuevo a 10,000 g. por 5 min; el
pellet fue resuspendido en buffer de lisis (10mM NaCl, 25mMEDTA y 10mM Tris-
HCl) 500µl, y 100 µl SDS, mas adición de 4µl de proteinasa K (Bioline-Toronto,
Ca.); la solución fue incubada a 50ºC por 90 min realizando agitación en vórtice
periódicamente; luego se llevaron a cabo uno o dos lavados con un volumen de
fenol cloroformo seguido de lavado únicamente con cloroformo hasta no observar
impurezas en la interface (10,000 g-por 15 min.), el ADN en la interfase
recuperada se precipitó con 1/10 volúmenes de Acetato de Sodio 3 M y 2.5
volúmenes de etanol absoluto en frio; la solución se incubó a -80 ºC por 30 min y
se sometió a centrifugación a 12,500 g. por 15 min para después hacer un lavado
del pellet con 500 µl aproximadamente de etanol al 70 %; luego de una segunda
centrifugación, se permitió que secara el pellet al aire y se resuspendió en 100 µl
de buffer Tris-EDTA (TE).
121
Anexo 3. Protocolo de restricción con las enzimas HhaI, RsaI, MspI
MspI, RsaI, AluI HhaI
Buffer 4 2µl Buffer 4 2µl
Enzima 1µl Enzima 0.5µl
H2O 12µl H2O 12.3µl
Producto PCR 5 µl Producto PCR 5 µl
Bovine Serum Albumin 0.2 µl
Total 20 µl Total 20 µl
Las reacciones fueron incubadas a 37oC overnight.
Anexo 4. Tinción de geles de poliacrilamida con nitrato de plata
Los geles producto del análisis TTGE e ITS fueron sumergidos en una solución de
fijación (Etanol 10 %-acido acético 10%) por 20 min, seguida por una inmersión en
solución de tinción (Nitrato de Plata 1g/l) por 20 min. Luego se hizo un lavado con
agua bidestilada por 10 segundos seguida de una inmersión en solución
reveladora (hidróxido de sodio al 7.5% y formaldehido al 37%) por 20 min.
122
Anexo 5. Protocolo de elución de bandas en geles de poliacrilamida (Crush
and Soak Method, Sambrook y Russel, 2001).
Se preparó buffer de Elución (Acetato de Amonio 0.5M, Acetato de Mg 10mM,
EDTA pH 8.0 1mM, SDS 0.1%). Las bandas seleccionadas fueron cortadas,
pesadas y maceradas cuidadosamente en tubos de 2 ml utilizando un aza de
metal con extremo curvo. La maceración se hizo con buffer de elución a razón de
300 µl. El tubo con el macerado y el buffer de elusión se sometió a incubación a 37 oC de 4 a 24 hrs. Luego se centrifugó, máxima velocidad (4 oC) por 1 min. El
sobrenadante se paso a un tubo limpio evitando transferir fragmentos de
poliacrilamida. Se agregaron otros 0.5 volúmenes de buffer de elusión al pellet de
poliacrilamida y se centrifugo de nuevo mezclando los dos sobrenadantes. Se
agregaron 2 volúmenes de etanol frió y se incubaron los tubos en hielo (4 oC) por
30 min al cabo de los cuales se precipito el ADN en micro centrifuga a máxima
velocidad (4 oC) por 10 min. El pellet se disolvió en 200 µl TE pH 8.0 más 25 µl de
Acetato de Na pH 5.2 y se precipitó de nuevo el ADN con 2 volúmenes de etanol
como se ilustro en el paso anterior. El pellet se lavo cuidadosamente con etanol
frió al 70 % y se seco al aire por completo (24hrs). El pellet se resuspendió en 10
µl TE ph8.0 y se tomaron 5 ul para la reacción de PCR 16S-TTGE
123
Anexo 6. Ilustración del protocolo de fraccionamiento y separación del ADN
marcado con el isotopo estable 13C. La jeringa inyecta un liquido (Colorante
natural o aceite generalmente) en volumen y rata constante. El ADN
ultracentrifugado se colecta en tubos con diferente grado de marcación- 13C y un
volumen aproximado (Aprox 350 µl/ tubo). (Sims, 2007)
124
Anexo 7. Preparación de medio de cultivo Bh (Bushnell-Haas) para
aislamiento de bacterias degradadoras de hexadecano como única fuente de
carbono.
Para 1 L de agua bidestilada auto-clavada se pesaron 0.2 g MgSO4, 1.0 g,
K2HPO4, 1.0 g KH2PO4, 0.05 g FeCl3, 1.0 g NH4NO3, 0.02 g CaCl2, el pH se ajustó
a 7-7.2 y se esterilizó en autoclave a 15psi por 15 min.
125
Anexo 8. Listado de aislamientos en medios suplementados con
hidrocarburos como única fuente de carbono en la matriz de residuos de
Moravia. (Continua en la siguiente página).
Aislado Gram Test
Identidad % Posible identidad por ITS
%
I1-0m
In1-0-1 - P. Putida 99
In1-0-3 -
In1-0-4 +
In1-0-7 +
In1-0-5 + B. Subtilis 88
In1-0-6 -
I1-10m
I1-10-1 -
I1-10-2 + Clon de Intrasporangiaceae aun no cultivado
99
I1-10-4 + B. subtilis 99
I1-20m
I1-20-1 + B. subtilis 90
I1-20-2 - Acinetobacter sp 98
I1-20-3 -
I1-20-9 -
I1-20-10 -
P1-0m
P1-0-2 - Acinetobacter sp 100
P1-0-4 -
P1-0-5 -
P1-0-6 + Bacillus sp 86
P1-0-9 + Bacillus sp 96
P1-0-10 +
P1-10m
P1-10-1 -
P1-10-2 +
P1-10-5 +
126
P1-10-7 -
P1-10-8 -
P1-20m
P1-20-1 -
P1-20-2 +
P1-20-4 -
P1-20-9 + B. subtilis 99
P2-0m
P2-0-1 + Acinetobacter venetianus
88
P2-0-7 - Acinetobacter sp 99
P2-0-8 -
P2-10m
P2-10-1 - Acinetobacter sp 98
P2-10-5 - Acinetobacter sp 99
P2-10-9 -
P2-10-10
P2-20m
P2-20-2 - Acinetobacter sp. 99
P2-20-3 -
P2-20-4 -
P2-20-5 -
P2-20-7 + Clon de Bacteria aun no cultivada
97
P2-20-71 - Acinetobacter sp 92
P2-20-73 - Bacillus sp. 99
P2-20-74 + Bacillus sp 97
P2-20-8 - Acinetobacter calcoaceticus
90-95
P2-20-9 - Acinetobacter calcoaceticus
99
127
Anexo 9. Fotografías de morfología y tinción de Gram para los aislados
dominantes Acinetobacter sp y Bacillus sp en el análisis de bacterias
aisladas en hexadecano como única fuente de carbono.
Apariencia de un aislado del genero Bacillus sp. en medio BH suplementado con
hidrocarburo como única fuente de carbono e incubado a temperatura ambiente
por 24 hrs.
Tinción de Gram para un aislado del genero Bacillus sp.
128
Apariencia de un aislado del genero Acinetobacter sp. en medio BH suplementado
con hidrocarburo como única fuente de carbono e incubado a temperatura
ambiente por 24 hrs.
Tinción de Gram para un aislado del género Acinetobacter sp.
129
Anexo 10. Dendograma construido mediante el método Neighbor joining
para las secuencias 16s todas las secuencias obtenidas. Sobre cada nodo se
encuentra el porcentaje de réplica en el cual las secuencias se agruparon juntas
basado en un bootstrap de 1000. Las distancias evolutivas fueron calculadas
usando el método jukes-Kantor y utilizando MEGA 4.0 (Tamura, Dudley, Nei, y
Kumar 2007). Las secuencias marcadas con círculos rojos fueron obtenidas a 0m,
verdes a 10m, azules a 20m, amarillos a 30m y los puntos negros representan las
bandas TTGE para todo el perfil.
.
P1-0-2AISLADO
AJ301676.1 Acinetobacter sp. LUH1470
P2-20-9AISLADO
Banda c TTGE
GQ178055.1| Acinetobacter sp.
GQ174293.1 Acinetobacter sp. PP-2
Banda b TTGE
Banda f TTGE
I1-20-2AISLADO
P2-10-1AISLADO
P2-20-7AISLADO
P2-10-5AISLADO
P2-0-7AISLADO
P2-20-2AISLADO
P2-0-1AISLADO
G5 SIP
DQ177466.2| Xanthomonas sp.
I1-0-1 AISLADO
FJ416144.1| Pseudomonas sp.
C20-18 (Fase I)
C3 SIP
AB540010.1| Pseudomonadaceae bacterium
C0-19 (Fase I)
AB308365.1| Bacterium TG160
Banda e TTGE
FJ324254.1Ralstonia sp. Tianjin P1
E5-B SIP
F10 SIP
DQ168833.1| Uncultured Alcaligenes sp.
E6 SIP
Banda a TTGE
EF377791.1Uncultured Flavobacterium sp.
D3-B SIP
FM210786.1| Aquamicrobium sp.
G7-B SIP
FJ544245.1| Brevundimonas sp. BIO-TAS2-2
EU672426.1| Arthrobacter sp.
B4 SIP
E1 SIP
HM587937.1| Micrococcus sp.
I1-10-2AISLADO
AJ566282.1| Intrasporangium calvum 16...
C12 SIP
HM222675.1| Dietzia sp.
A1 (Fase I)
EU639336.1| Uncultured Symbiobacteriu...
C5-11 (Fase I)
AY918122.1| Desulfotomaculum salinum
C10-12 (Fase I)
DQ073394.1 Sporosarcina soli strain
H2 SIP
FM872753.1| Uncultured bacterium
I1-10-4AISLADO
P2-20-73AISLADO
GQ153538.1| Bacillus subtilis
P1-20-9AISLADO
I1-0-5 AISLADO
P1-0-9AISLADO
100
100
100
100
100
98
100
99
99
100
99
99
24
16
22
100
100
39
100
96
100
100
85
100
100
96
100
71
71
100
74
64
100
82
51
93
86
82
49
99
23
98
100
33
73
35
14
43
52
86
52
0.05