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Etapas de la transcripción

• El proceso de transcripción consta de tres etapas:

• Iniciación

• Elongación

• Terminación

• El RNA es transcripto desde un DNA molde después que las

bases del DNA son expuestas por desenrollado de la doble

hélice.

• En una dada región del DNA, solamente una de las dos hebras

puede actuar como molde para la transcripción del RNA.

Complejo de Pre‐Iniciación

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Complejo terciario estable:  Ez + DNA + RNA

La RNA polimerasa se une a la secuencia promotora en el DNA duplex. “Complejo cerrado”

La RNA polimerasa abre el DNA duplex cerca del sitio de inicio de la transcripción, formando una burbuja de transcripción.“Complejo abierto”

La RNA polimerasa cataliza la formación del enlace fosfodiéster entre los dos rNTPs iniciales.

INICIACIÓN

H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th ; 7th . Ed., Freeman W.H. & Co, 2004

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La RNA polimerasa avanza río abajo de la hebra molde, abriendo el DNA duplex y adicionando rNTPs al transcripto de RNA.

ELONGACIÓN

TERMINACIÓN

En el sitio de terminación de la transcripción la RNA polimerasa libera el RNA completo y se disocia del DNA.

H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th; 7th.  Ed., Freeman W.H. & Co, 2004

Unión de la TBP al DNA 

H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th; 7th.  Ed., Freeman W.H. & Co, 2004

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1. TFIIA y TFIIB son reclutados y TFIIB se unen a la caja BRE

2. Se recluta el complejo RNA Pol II‐TFIIF

3. TFIIE y TFIIH se unen río abajo de la RNA Pol II para formar el complejo de pre‐iniciación 

4. Fusión del Promotor usa la energía de la hidrólisis del ATP por TFIIH 

5. Escape del Promotor luego de la fosforilación de la cola de CTD

J.D. Watson, et al. Molecular Biology of the Gene (5th; 7th. Edition), 2004.

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Pausado y liberación de la RNA polimerasa II

NELF: factor de elongación negativo 

DSIF, NELF y la Ser 2 del CTD son fosforiladaspor la kinasa P‐TEFb

Ser 5

Ser 5 y Ser 2

Factor de elongación DSIF

Factor de pausado NELF

Pausa y liberación de la RNA Pol IIDespués de la fosforilación por TFIIH de Serina 5 en la "cola CTD", la polimerasa inicia latranscripción, pero, en algunos promotores, se detiene hasta que se logra una segundafosforilación en Serina 2 mediante el reclutamiento (por un activador) de la quinasa P‐TEFb(que se encuentra en el complejo SEC).La pausa está mediada por el complejo llamado NELF, que, junto con otros factores, seelimina al momento de la pausa.

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Etapas del ciclo de transcripción con el correspondiente estado de fosforilación de la CTD y los factores asociados.

P‐TEb kinasa

Cuatro pasos del ciclo de transcripción se representan con el correspondiente estadode fosforilación de la CTD y los factores asociados.

Etapa 1 representa el reclutamiento de la enzima central RNA Pol II para elpromotor con una CTD no fosforilada que interactúa con el complejo Mediador. Elcomplejo Mediador tiene una alta afinidad por CTD no fosforilada y tras lafosforilación de Ser5 del CTD por la quinasa 7 dependiente de ciclina (CDK7, nomostrado), esta afinidad se pierde y la RNA Pol II escapa del promotor.

Etapa 2 representa a la RNA Pol II durante la pausa proximal del promotor, queregula la transición a la elongación de la transcripción productiva en metazoos. Eneste paso, la RNA Pol II está altamente fosforilada en Ser5 y Ser7, se detiene despuésdel sitio de inicio de la transcripción (TSS) y está unido por el factor de elongaciónnegativa (NELF) y el factor inductor de la sensibilidad DRB (DSIF). La llegada del factorde elongación positivo B (P‐TEFb) conduce a la fosforilación de NELF, DSIF y Ser2.Estos eventos de fosforilación son seguidos por la liberación de NELF y la transición ala elongación de la transcripción productiva.

Etapa 3 durante la elongación productiva (etapa 3), el CTD contiene niveles másbajos de Ser5P y Ser7P y niveles más altos de Ser2P, lo que promueve elreclutamiento de muchos factores de transcripción, modulación de la cromatina yprocesamiento de RNA que regulan los procesos de co‐transcripción.

Finalmente, en la etapa 4, Pol II pasa del alargamiento de transcripción a laterminación. Los niveles de Ser2P y Thr4P alcanzan un pico, promoviendo así elreclutamiento de los factores de división y poliadenilación, así como los factores determinación que liberan Pol II del ADN.

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Las enzimas del procesamiento del RNA son reclutadas por la cola de CTD

• TFIIH Ser 5 Pi

• P‐TEFb Ser 2 Pi

Las tres RNA polimerasas de eucariotas emplean diferentes mecanismos de terminación 

• RNA polimerasa I requiere un factor de terminación polimerasa específico, elcual se fija corriente abajo de la unidad de transcripción

• La Terminación de la RNA pol II ocurre en una región 0.5‐2 kb del sitio de adiciónde la cola de poli(A), y la terminación está acoplada al proceso que corta ypoliadenila el 3 final del transcripto de la RNA polimerasa II

• RNA polimerasa III finaliza después de la polimerización en una serie deresiduos de U

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Modelos de terminación de la transcripción

Modelo torpedo

Modelo alostérico

Terminación PoliA dependiente

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Un factor llamado FACT facilita la transcripción a través de los nucleosomas.

FACT es un heterodímero de dos proteínas bien conservados, SPT16 y SSRP1.

FACT

Iniciación in vivo: Activador, Mediador y Proteínas modificadoras de la cromatina

H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th Ed., Freeman W.H. & Co, 2004

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Mediador complejo multiproteico

H. F. Lodish et al.Molecular Cell Biology 5th Ed., Freeman W.H. & Co, 2004

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Nuevo papel del mediador en el acoplamiento entre la transcripción y el procesamiento del pre‐mRNA.Nuevo papel del mediador en el acoplamiento entre la transcripción y el procesamiento del pre‐mRNA.

Fin 1era parte 2017 Bioq.

BBA 1577 : 308– 324 (2002)

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2da parte 2017 Bioq.

Procesamientos post‐transcripcionales Procesamientos post‐transcripcionales 

Capping

SplicingPoliadenilación

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En eucariotas, el RNA mensajero es procesado durante y después de la transcripción

Durante la elongación ocurren la modificaciones co‐ y post‐transcripcionales

Capping del extremo 5´

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Después de la formación de la caperuza se produce la desfosforilación del CTD en la posición Ser 5 que produce la 

disociación de la maquinaria del capping

Transferencia de las enzimas de lapoliadenilación al CTD una vezalcanzadas las secuenciasespecíficas de poliadenilación .

Estas secuencias son transcriptas yesto desencadena la poliadenilación

Escisión del mRNA

Poliadenilación del 3´

Terminación de la transcripción

Modificación en el extremo 3´ poliadenilación

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Cola de poliA 3’‐final

CTD transporta dos complejos proteicos:

CPSF: factor específico de poliadenilación y ruptura

CstF: factor estimulante del corte o ruptura

Enzima clave: 

PoliA polimerasa (PAP) añade 200 nt de adenina (ATP como precursor) sin molde

Poli A‐ binding protein

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Factores involucrados en la terminación dependiente de poliadenilación poli(A)c | En la terminación dependiente de poli (A) en seres humanos, la pausa de la Pol II se induce cuando , cuando CPSF unido al cuerpo de Pol II reconoce la señal AAUAAA que

emerge en el transcripto naciente (etapa 1). Tras la exposición del sitio de unión rico en GU, CstF desaloja a CPSF (etapa 2). Después de la escisión en el sitio poli (A),  XRN2:  5′–3′ exoribonuclease 2 degrada el producto downstream RNA , que puede desplazar a Pol II 

como se ha descrito anteriormente para Rat1 (etapa 3). CFIIm, mammalian CFII; DOM3Z, DOM‐3 homologue Z; Nab3, nuclear polyadenylated RNA‐binding 3; Rai1, Rat1‐interacting 1. Clivaje y factor de especificidad de poliadenilación

CPSF: Factor de corte y especificidad de poliAdenil.   CstF: Factor de estimulacion del corteXRN2: 5′–3′ exoribonucleasa 2  CF:  Factor de corteCPF: Factor de corte y polyadenilación

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Ruptura del 3' final del mRNA de las histonas puede requerir RNA pequeños

• mRNAs de las histonas NO son poliadenilados; los extremos 3' son generados por unaruptura que depende de la naturaleza del mRNA.• La reacción de ruptura requiere que SLBP (stem‐loop binding protein: proteína deunión al tallo‐burbuja) se fije a una estructura tipo tallo‐burbuja e interaccione con elRNA pequeño U7 snRNA (63nt) se aparea con la región simple hebra adyacente y con unset de algunas proteínas incluyendo Sm.

La formación del extremo 3´ final depende de una estructurasecundaria tipo tallo‐burbuja que es altamente conservada, con untallo de 6 bp nucleótidos y un loop. La ruptura ocurre 4‐5 basescorriente abajo del stem loop. Son requeridos dos factores para lareacción de ruptura: el stem‐loop binding protein (SLBP) quereconoce la estructura; y el snRNA U7 que se aparea con unasecuencia rica en purinas (HDE el elemento histona elementodownstream) localizado a ~10 nucleótidos downstream del sitiode corte.

Tallo 6 nt

Bibliografía sugerida

‐ H. F. Lodish et al. Molecular Cell Biology 5th, 6th and 7th Ed., 

Freeman W.H. & Co, 2004, 2013. 

‐H.F. Lodish et al. Biología Celular y Molecular  7ma edición, 

Editorial Panamericana, 2016, en castellano.

‐ J.D. Watson, T.A. Baker, S.P. Bell, A. Gann, M. Levine, R. Losick. 

Molecular Biology of the Gene (5th; 7th Editions), Pearson 

Education Inc. as Benjamin Cummings, 2004. 

‐ Biología Molecular del Gen, 5ta y 7ma ediciones, en castellano.

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MUCHAS GRACIAS