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i
Estudios sobre el crecimiento de Aspergillus niger sobre una
placa de agar.
Modelo simplificado y simulación.
PRESENTAN:
Iván Domenzain del Castillo Cerecer
Fayez Gabriel Mubarqui Guevara
Reporte de proyecto terminal
para obtener el grado de
Ingeniero en Energía
Asesores
Ing. Tristán Esparza Isunza
Dr. Felipe López Isunza
Departamento de Ingeniería de Procesos e Hidráulica
Universidad Autónoma Metropolitana – Iztapalapa.
Av. San Rafael Atlixco 186, Col. Vicentina, México 09340 D.F., México
Enero 2015
ii
Resumen
Se analiza el crecimiento del hongo Aspergillus niger sobre una placa de agar
utilizando un modelo muy reducido de su metabolismo con una cinética de cinética de
tipo Monod. La difusión a través de la placa de agar se describe con un modelo
Fickeano utilizando un coeficiente efectivo de difusión dependiente de la concentración
de la glucosa en el medio sólido. En la interfase entre el medio sólido y el
microorganismo se considera que todo el flujo de glucosa penetra la pared celular
semipermeable lo cual está asociado con el crecimiento de biomasa. Las predicciones
del modelo se comparan con una serie de experimentos realizados utilizando diferentes
concentraciones de glucosa en el medio sólido como fuente de carbono. Las mediciones
de biomasa, así como del CO2 producido y el O2 consumido, se realizaron en una caja
Petri modificada, para concentraciones de glucosa inicial en la placa de agar que van de
25 a 250 g/L por la Dra. Inés Reyes Ocampo como parte de sus estudios de doctorado.
iii
Agradecimientos
Al Big Bang (hasta que se demuestre lo contrario), a nuestras familias, a nuestros
profesores, a nuestros amigos y a las hortalizas.
iv
Contenido
Resumen .......................................................................................................................... ii
Agradecimientos ............................................................................................................ iii
Contenido ....................................................................................................................... iv
Índice de tablas .............................................................................................................. iv
Índice de figuras ............................................................................................................ iv
Nomenclatura ................................................................................................................. vi
I. Introducción ............................................................................................................. 7
II. Objetivos ................................................................................................................ 12
III. Materiales y Métodos ........................................................................................ 13
IV. Colocación ortogonal ......................................................................................... 17
V. Modelo de difusión no lineal acoplado al crecimiento microbiano de
Aspergillus Niger ........................................................................................................... 20
VI. Solución numérica ............................................................................................. 25
Conclusiones .................................................................................................................. 34
Referencias .................................................................................................................... 35
Índice de tablas
Tabla VI.1 Valores de las constantes usadas en la solución numérica del modelo de
crecimiento global de biomasa…………………………………………………………26
Índice de figuras
Figura III.1 La caja Petri modificada que permite la medición en línea del oxígeno
consumido y el dióxido de carbono producido durante el crecimiento de A. niger...14
v
Figura V.1 Diagrama del crecimiento global de biomasa sobre una placa sólida de
agar…………………………………………………………………………………..20
Figura VII.1 Dinámica experimental del crecimiento global de biomasa a distintas
concentraciones iniciales de glucosa………………………………………………..28
Figura VII.2 Dinámica de crecimiento global de biomasa para distintas
concentraciones iniciales de glucosa obtenidas mediante simulación con n=m=2…29
Figura VII.3 Dinámica de crecimiento global de biomasa a distintas combinaciones
de exponente con Cg, 0=100 g/L……………………………………………………..31
Figura VII.5 Dinámica simulada de la concentración promedio de glucosa en el
medio de agar para distintas concentraciones iniciales……………………………...32
vi
Nomenclatura
Concentración de glucosa (g/cm
3).
Concentración máxima de glucosa (g/cm3).
Concentración máxima de glucosa (g/cm3).
Difusividad efectiva de glucosa en agar (cm2/h).
Difusividad efectiva máxima (cm2/h).
Coeficiente de saturación media de glucosa (g/cm3).
Espesor de la placa de agar (cm).
Exponente para el modelo de crecimiento de biomasa.
Exponente para la dependencia de la difusividad con respecto a la
concentración de glucosa.
Puntos internos de colocación ortogonal.
Tiempo físico (h).
Tiempo característico de difusión (h).
Concentración superficial de biomasa adimensional.
Concentración superficial máxima de biomasa adimensional.
Concentración superficial de biomasa (g/cm2).
Concentración superficial máxima de biomasa (g/cm2).
Concentración superficial inicial de biomasa (g/cm2).
Concentración adimensional de glucosa en el sustrato sólido.
Concentración adimensional máxima de glucosa en el sustrato sólido.
Coordenada espacial para el sustrato sólido (cm).
Letras griegas
Coeficiente de rendimiento de glucosa.
Tasa específica de crecimiento microbiano máxima (1/h).
Coordenada espacial adimensional en la placa de agar.
Tiempo adimensional.
Módulo de Thiele.
7
I. Introducción
Los hongos, los filamentosos y el nuestro
El Reino Fungi se conforma por organismos que comparten una estructura
vegetativa: filamento hifal en el caso de los pluricelulares y célula de levadura o talo
quítrido en los unicelulares, cuya pared celular está esencialmente compuesta por
quitina. Les favorece un entorno ligeramente ácido y húmedo. En algunos ecosistemas
se distribuyen ampliamente y son necesarios para la descomposición y el desarrollo de
otros organismos por ende fundamentales para el funcionamiento del todo.
La humanidad se ha esforzado en explotar las características del reino fungi para su
propio beneficio. Los encontramos en la mayoría de los procesos industriales
alimenticios y farmacéuticos; nutricionalmente son valiosos dado su alto contenido de
proteínas, vitamina B y fibra, además de que son bajos en grasas. Por otra parte, el
alcohol, la mayoría de los antibióticos (incluyendo a la penicilina), los esteroides y el
ácido cítrico, son algunos de los productos de gran valor médico, que deben en parte su
fabricación a los hongos. Siendo este último de especial relevancia para la presente
investigación y también ampliamente utilizado en la industria alimenticia. Además,
buscando frenar el impacto negativo de origen antropogénico, los hongos han sido
utilizados para la biorremediación y el biocontrol ambiental.
Los hongos filamentosos son ampliamente utilizados por varias industrias en
importantes cantidades. Sus desechos, productos intermedios, enzimas o incluso toda su
biomasa, son ampliamente apreciados en el mercado. Dadas sus capacidades
fisiológicas y crecimiento por hifas, estos hongos son los más utilizados en el
procesamiento de sustancias sólidas. El cuerpo vegetativo, en contraste con la porción
reproductiva, consiste en hebras microscópicas llamadas hifas (cuyo principal
componente es un heteropolímero compuesto por dos bloques de N-Acetilglucosamina),
y la masa total de hifas que constituye el talo del hongo llamado micelio. Una analogía
ya antes usada sirve para ilustrar el crecimiento de este tipo de organismos. Si pensamos
en un bosque compuesto de árboles y estos a su vez de ramas el micelio se compone por
hifas y estas de tubos germinales.
8
Tras un periodo de crecimiento vegetativo llega la etapa de formación de esporas
mediante una reproducción que puede ser sexual (por medio de meiosis) o asexual (por
medio de mitosis). En términos ecológicos las esporas son una forma de vida altamente
exitosa: están extremadamente especializadas para la reproducción, supervivencia, y
dispersión. Los hongos filamentosos poseen una forma de crecimiento característico en
el cual la taza de mayor incremento se da en las puntas (ápices). Además de la habilidad
genética la reproducción y crecimiento se ven alterados por factores del entorno. Se
sabe desde finales del siglo XIX algo que Morton en 1967 enunció en términos
modernos de la siguiente forma: “Se requiere algún período mínimo de desarrollo
vegetativo antes de que el organismo se vuelve competente para producir cuerpos
reproductivos durante el cual se sintetizan metabolitos específicos, enzimas o sustancias
alimentarias esenciales para la reproducción. La reproducción a menudo se induce
cuando algún factor externo o interno, con frecuencia un nutriente, se vuelve limitante
para el desarrollo vegetativo. Las condiciones externas que inducen la reproducción
suelen ser más estrechas en rango y más específicas que las que permiten el crecimiento
vegetativo” (Smith & Berry, 1975). Experimentos muestran que incrementar la
concentración de glucosa en el medio el diámetro y longitud de los tubos germinales
disminuyen (Larralde Corona. C. P., 1997).
La pared celular de los hongos no es para nada simple, si bien sus funciones
fundamentales son proteger y separar al organismo del medio, se trata de una estructura
compleja y dinámica con una actividad enzimática diversa. Contiene las
macromoléculas estructurales de quitina (que se entretejen en microfibras) y celulosa,
junto con otros polisacáridos y cantidades específicas de proteínas y lípidos. Incluso se
ha encontrado que la composición de la pared celular caracteriza el grupo taxonómico al
que pertenece cualquier especie. De igual forma no se puede considerar la hifa como un
sistema heterogéneo sino más bien como “un complejo gradiente de cambios
citoquímicos que variarán dependiendo de las presiones ambientales” (Smith & Berry,
1975).
Teniendo en mente estos antecedentes, se sabe que el hongo Aspergillus niger produce
diversos compuestos de gran interés para las industrias farmacéutica y de alimentos
(enzimas, ácidos orgánicos), y es el principal productor del ácido cítrico a nivel
9
industrial por cultivo líquido. Se ha observado que se obtienen mayores rendimientos
cuando existe una alta acumulación de este ácido en el micelio, que puede estar
asociada con una alta concentración de glucosa y de oxígeno disuelto en el medio
líquido (Papagianni, 2007; Wolschek y col, 1999). Sin embargo, no es posible aún
conocer todos los factores ambientales y fisiológicos que originan esta acumulación, ni
saber cómo esto determina la morfología del micelio, la cual podría, en principio, usarse
como un indicador del nivel de producción de ácido cítrico, al realizar mediciones del
diámetro promedio de las madejas formadas por las hifas en el medio líquido, que se
cree corresponden a un medio con altas concentraciones de glucosa, oxígeno y ácido
cítrico, antes de que la difusión de sustrato y oxígeno sea deficiente cuando la madeja
alcance un tamaño crítico (Thiele, 1939; Hellendoorn y col, 1998).
Por otro lado, puede ser más fácil estudiar la morfología y fisiología de Aspergillus
niger en un medio sólido, y determinar el efecto de los diferentes nutrientes y de la
concentración inicial de glucosa, ya que no existen limitaciones por oxígeno en el aire
en la caja Petri. Sin embargo, es muy difícil realizar estudios dinámicos en éste sistema,
debido a que no es posible lograr cambios rápidos en la entrada al sistema cómo en el
caso del cultivo líquido, ya que en éste no se presenta el proceso difusivo de nutrientes y
sustrato como en un medio sólido. De estudios en medios sólidos se ha observado que
los valores promedio de la longitud y del diámetro de las hifas distales varían en
relación inversa con la concentración inicial de glucosa (Larralde Corona y col, 1997;
Reyes Ocampo, 2006), aunque es difícil diferenciar entre hifas aéreas, superficiales, y
las que penetran la placa de agar (Rahardjo, 2005). Esto complica la obtención de un
modelo confiable que describa la morfología de A. niger y permita predecir la
producción de ácido cítrico, ya sea éste modelo de tipo logístico, Monod o una
combinación de ellos (Reyes Ocampo, 2006); que hasta ahora han sido usados para
describir el crecimiento de la longitud promedio del micelio y su relación con la
producción de ácido cítrico usando un modelo de tipo Luedeking-Piret (1959). Ya que
en un medio sólido el transporte de masa se da por la difusión de los diversos nutrientes
a través de éste, los experimentos realizados no permite conocer fácilmente el papel que
juegan otros factores, como la concentración de diversos metales (Mn, Mg), de otras
fuentes de carbono y el pH, por la dificultad de medir estas variables en el medio sólido
durante el crecimiento, lo que no sucede en un medio líquido.
10
En el crecimiento en estado sólido, normalmente sobre una placa de agar en una caja
Petri, es fácil medir la cantidad de biomasa producida para diversas concentraciones
iniciales de glucosa, pero no es fácil la determinación de los productos excretados,
como en un medio líquido, por lo que solo se obtiene un conocimiento limitado a cerca
del metabolismo de Aspergillus niger. A la fecha, los estudios realizados en sustratos
sólidos no han incorporado ninguna información basada, por ejemplo, en el
conocimiento de las rutas metabólicas de este microorganismo. Hacerlo, nos permitiría
describir el crecimiento de A. niger de una forma precisa y quizá facilitaría el análisis de
los diversos procesos bioquímicos y ambientales que determinan el metabolismo de A.
niger, así como la producción de ácido cítrico y otros metabolitos.
Por todo lo anterior, en este trabajo se estudiará el crecimiento de Aspergillus niger
sobre un sustrato sólido en cajas Petri, midiendo la cantidad de biomasa producida a lo
largo del proceso. Adicionalmente, se analiza su crecimiento con base en un modelo
simplificado de las rutas metabólicas de este microorganismo, que será determinado
más adelante, y que nos permitirá estudiarlo como un sistema abierto, y medir su
respuesta a cambios controlados en algunas de las variables (concentración de glucosa)
que determinan el crecimiento y producción de metabolitos. Ya que el proceso de
crecimiento ocurre en contacto con un medio sólido y un medio gaseoso, la cinética de
crecimiento está acoplada a los fenómenos de difusión de masa en ambos medios y
estos procesos se incorporan en un modelo de difusión-reacción. Debido a la
diferenciación de funciones que existen en el micelio durante su crecimiento, el modelo
no incluye la descripción de la morfología del micelio.
La red metabólica publicada para Aspergillus niger está constituida por 1190 reacciones
y 1045 metabolitos, distribuidos en tres compartimentos: extracelular, citoplasmático y
mitocondrial (Andersen, 2008; Andersen y col, 2008), sin embargo, es físicamente
imposible poder medir simultáneamente a todas estas especies o conocer el
funcionamiento regulatorio de las diversas enzimas, por lo que aquí se utiliza un
esquema simplificado. Para obtener información del metabolismo de A. niger como un
sistema biológico abierto, es importante conocer la asimilación de la fuente de carbono
(glucosa), y por esto el estudio se realiza comparando las mediciones de consumo de
oxígeno y producción de CO2 en la fase gaseosa en la CPM, simultáneamente con las
mediciones del peso seco de la biomasa producida en la caja Petri, analizando las
11
respuestas de los diversos experimentos realizados, y comparándolas con las
predicciones del modelo.
12
II. Objetivos
Objetivo general
Formular y validar un modelo matemático que acople la difusión en el medio sólido con
el crecimiento de biomasa de Aspergillus niger.
Objetivos particulares
Desde el punto de vista didáctico, realizar el ejercicio de construir un modelo
matemático partiendo de principios fundamentales de conservación, tratando de dar
explicación a una serie de fenómenos físicos y biológicos observables.
De igual manera, adquirir la experiencia de la validación de un modelo matemático
mediante su implementación a través de la codificación en lenguaje informático y su
solución numérica.
13
III. Materiales y Métodos
Uno de los problemas en el estudio de hongos filamentosos creciendo en un sustrato
sólido es la medición de la biomasa, ya que el micelio se adhiere y penetra en la matriz
sólida, dificultando su separación. Para resolver este problema normalmente se coloca
una hoja de celofán sobre la superficie del agar, lo que facilita la separación del micelio
del soporte sólido, posteriormente se seca y se obtiene el peso de biomasa seca; sin
embargo esta práctica tiene una influencia importante en el crecimiento del hongo,
como se ha observado.
El microorganismo de estudio. En éste trabajo se emplea Aspergillus niger A10 de la
colección de la Universidad Autónoma Metropolitana - Iztapalapa. La conservación de
la cepa se lleva a cabo haciendo crecer hasta la esporulación a un cultivo de esporas de
dicha cepa en un medio sólido de Papa-Dextrosa-Agar (PDA) a una temperatura
controlada de 30ºC. Al cabo de cinco días de crecimiento, se cosechan las esporas de la
superficie de la colonia con un agitador magnético en una solución Tween 0.1% (v/v).
De la suspensión obtenida se toma una cierta concentración de esporas que se añade a
un recipiente con un medio adecuado para el crecimiento del microorganismo. Una vez
que el hongo ha esporulado, se añade glicerol que ha sido esterilizado previamente. El
recipiente se conservan en refrigeración (5 - 10 ºC), y se obtiene una viabilidad de la
cepa de un año.
La preparación del inóculo. Se deposita un volumen pequeño de la suspensión de
esporas en la superficie de un medio PDA. De aquí se obtiene un cultivo que, después
de 5 días de incubación a 30°C, ya ha esporulado. Las esporas se recolectan con un asa
de siembra y se almacenan en una solución Tween 0.1% (v/v). La concentración de
esporas se ajusta a 1x106 esporas, y ésta se mide utilizando una cámara de Neubauer.
El medio de cultivo. Consiste en 10 g/L de glucosa; 0.98 g/L (NH4)2SO4; 0.5 g/L
KH2PO4; 0.6 g/L MgSO4•7H2O; 0.1 g/L extracto de levadura; 2.0 ml/L solución de
oligoelementos: 2.5 g/L FeSO4•7H2O; 11.0 g/L ZnSO4•7H2O; 0.8 g/L CuSO4•5H2O;
2.15 g/L MnSO4•H2O; 5.5 g/L H3BO3; 0.55 g/L (NH4)6Mo7O24•4H2O; 25 g/L NaEDTA;
14
0.80 g/L CoCl2•5H2O. El medio se esteriliza durante 20 minutos a 121°C. En la
preparación del medio de cultivo se agrega sulfato de amonio, suficiente para obtener
una relación C/N de 12. Se agrega una concentración de elementos traza que asegure
que no existan limitaciones de estas especies durante el crecimiento del hongo. Para los
experimentos a diferentes concentraciones de glucosa, la proporción de los otros
componentes varía dependiendo su relación con la glucosa inicial.
El sistema experimental. Para llevar a cabo la evaluación de los cambios en la
producción de CO2 y el consumo de O2 durante el crecimiento de Aspergillus niger, se
construyó una caja Petri modificada de vidrio, de 12.5 cm de diámetro y 5 cm de altura,
como se muestra en la Fig. III.1. La tapa de la CPM soporta dos electrodos de medición
de CO2 y O2, y cuenta con un pequeño tubo adicional (2.0 cm de longitud y 0.3 cm de
diámetro) que permite el intercambio de estos gases con el medio ambiente externo.
Para la medición del peso seco de A. niger se utilizan cajas Petri de 9 cm de diámetro
con un volumen aproximado de 35 ml de sustrato sólido, que forman una placa de 0.6
cm de espesor sobre la cual se coloca una hoja de celofán para facilitar el
desprendimiento y medición de la biomasa. En los experimentos con la CPM se utiliza
un volumen de agar con glucosa de 150 ml.
Figura III.1 La caja Petri modificada que permite la medición en línea del oxígeno consumido y el
dióxido de carbono producido durante el crecimiento de A. niger.
15
El inóculo. En la inoculación de las cajas Petri se utilizan esporas recién cosechadas,
que se depositan en el centro de la caja, utilizando una punta de pipeta en un volumen
pequeño de la suspensión de aproximadamente 20 µL, obteniéndose así una colonia
circular.
La medición del peso seco. Las esporas inoculadas en la caja Petri crecen durante 5 días
a una temperatura constante de 30°C. Para la medición del peso seco de la biomasa, se
inocula la misma concentración de esporas sobre la hoja de papel celofán en 15 cajas
Petri que contienen al medio de cultivo. A diferentes tiempos se remueve de la
superficie del agar la hoja de celofán que contiene al micelio, lo que permite medir a la
cantidad de biomasa a diferentes tiempos, para cada condición del medio de cultivo. La
hoja de papel celofán, que ha sido previamente tratada y pesada y que contiene al
micelio, se seca en una estufa a 60ºC durante 24 horas, para después ser almacenada en
un desecador por una noche y ser pesada en la balanza analítica. El peso seco de la
muestra se obtiene de la diferencia del peso seco y el resultado se reporta como gramos
de peso seco de biomasa.
Los ensayos analíticos. La medición continua de la producción de CO2 y del consumo
de O2 durante el crecimiento de A. niger se realiza utilizando sensores Vernier para
estos gases. El sensor de CO2 mide los niveles de éste gas en el intervalo de 0 a 10,000
ppm (bajo rango) o de 0 a 100,000 ppm (alto rango), controlando la cantidad de
radiación infrarroja absorbida por las moléculas de dióxido de carbono. El sensor de O2
mide la concentración de éste gas en el intervalo de 0 a 27% en mol utilizando una celda
electroquímica que contiene un ánodo de plomo y un cátodo de oro en un electrolito.
Las moléculas de oxígeno que entran en la celda se reducen en el cátodo de oro; ésta
reacción genera una corriente que es proporcional a la concentración de oxígeno entre
los electrodos. El registro de los datos en línea se llevó a cabo usando la interfase
LabPro y el software LoggerPro de Vernier.
El diseño experimental. Los experimentos realizados tuvieron como objetivo obtener
información acerca del metabolismo de Aspergillus niger cuando se utilizan diversas
concentraciones de glucosa como fuente de carbono, midiéndose el peso seco de la
biomasa, la producción de CO2 y el consumo de O2 durante el crecimiento. Se compara
la producción de biomasa utilizando diferentes concentraciones de glucosa (25 a 250
16
g/L) con el objeto de analizar el mecanismo de asimilación a través de la pared del
hongo y saber si existe alguna limitación por inhibición de sustrato.
17
IV. Colocación ortogonal
Un método de residuos ponderados
Los métodos de residuos ponderados tienen una extensa tradición histórica, un referente
ampliamente conocido es el llamado método de mínimos cuadrados. En esencia, dado
un sistema de ecuaciones diferenciales suficientemente determinado, se propone una
solución prueba con una dependencia espacial conocida pero con funciones del tiempo
como incógnitas, las cuales se encuentran al forzar que la solución satisfaga el sistema
de forma expresa. En esta familia cada método se distingue de otro según los criterios
antes mencionados. Según la forma de la solución prueba, la dependencia funcional de
la posición, la forma de la obligación de la solución a satisfacer al sistema.
Para sistemas de ecuaciones diferenciales no lineales un método que ha probado su
éxito es el de colocación ortogonal desarrollado por Villadsen y Stewart (1967), pero
más detallado posteriormente en otros escritos (Ver Finlayson: Orthogonal Collocation
in Chemical Reaction Engineering y The Method of Weighted Residuals and
Variational Principles). Se dice que es el más simple de la familia aunque a nosotros no
nos pareció tan trivial. Con motivo facilitar la manipulación matemática estos puntos
son raíces de polinomios ortogonales, esta característica, en principio mejora la tasa de
convergencia al aumentar el número de puntos de colocación. En otras palabras, los
puntos de colocación se determinan a partir de polinomios ortogonales, entonces los
valores numéricos de los puntos serán idénticos si se usa la misma familia de
polinomios para obtener la misma cantidad de puntos. La colocación ortogonal se puede
pensar de dos formas, desde un punto de vista se trata de un método numérico cuyos
cálculos sucesivos se aproximan a la solución exacta y desde el otro se usa la primera
aproximación para ganar información del sistema. La colocación ortogonal es exitosa en
ambos sentidos y usualmente se hacen los dos análisis al resolver un problema
ingenieril.
Las funciones prueba se definen en todo el dominio: los puntos de colocación
determinan los coeficientes (o funciones) pero la solución es continua en el dominio.
18
Existen casos donde estos puntos tal vez no se encuentren en las regiones de mayor
interés, o dónde ocurre el cambio a mayor tasa. Es posible preservar las ventajas de la
colocación ortogonal pero seleccionando arbitrariamente los puntos de colocación
combinando este método con el de elemento finito, esta combinación posee una mayor
convergencia que el método de elemento finito. Hay una similitud evidente con las
diferencias finitas, dado que la ecuación diferencial se satisface en ciertos puntos, pero
con la diferencia de que las funciones prueba en la colocación ortogonal son continuas
en todo el dominio por lo tanto se evita la interpolación entre los puntos lo cual en teoría
mejora la tasa de convergencia.
Características generales
A continuación seguiremos el planteamiento de Finlayson para describir a grandes
rasgos el método de colocación ortogonal en una dimensión: La solución exacta se
aproxima con una función prueba la cual se expande en una serie de funciones
conocidas pero con coeficientes desconocidos de la siguiente forma
La función prueba se sustituye en la ecuación diferencial y el resultado es llamado
residuo. Los coeficientes son desconocidos y para determinarlos se exige que el residuo
en todos los puntos de colocación se desvanezca. Mientras más términos tenga la serie
más coeficientes indeterminados hay, por lo tanto más puntos de colocación. Se espera
que si N, el número de puntos de colocación, tiende a infinito la solución numérica
converja con la exacta, esto se puede probar para muchos problemas. Sin embargo, en la
aplicación se puede sacrificar la estabilidad del método aumentando el número de
puntos, en nuestro caso
De la ecuación se puede apreciar que conociendo los coeficientes se determina la
función prueba. Sin embargo por facilidad de código los programas usualmente se
escriben en términos de .
19
Es preferente saber a priori conocer la el orden de la funcionalidad con respecto a la
variable independiente de la solución exacta. Normalmente se usan polinomios en con
dependencia a dicha variable en forma lineal o cuadrática. En caso de no contar con
dicha información es posible expandir la solución y derivar una relación de recursión.
Tener conocimiento de esto nos permite predecir si la solución a la ecuación diferencial
es sujeta a alguna transformación de simetría que no la altere. El método se aplicará de
forma distinta según el caso.
Para algunos problemas que poseen la propiedad de simetría, se puede demostrar que la
solución será una función de la variable independiente solamente en potencias pares, y
al incluir la simetría en la función prueba el número de incógnitas se reduce a la mitad.
Cuando se carece de esta propiedad, como en este caso, hay que incluir potencias tanto
pares como impares en la expansión de la siguiente forma
1
Donde N es el número de puntos de colocación, los cuales como ya se había
mencionado son raíces de . Se pueden encontrar raíces de N=1,6 en el libro
de Finlayson. Esta solución prueba que será introducida en la ecuación diferencial que
en los puntos de colocación se obliga a desvanecer, entonces el residuo es idénticamente
cero. Las derivadas de la función prueba en los puntos de colocación se pueden
encontrar en función de los coeficientes y se expresan como una suma algebraica de
elementos de matrices distintas para cada derivada, usualmente una matriz A representa
la primera derivada y B la segunda (Ver capítulo VII). Estas matrices se calculan
siguiendo un algoritmo descrito por Finlayson, que a su vez fue programado y publicado
por Villadsen y Michelsen (Villadsen & Michelsen, 1978).
1 Compárese con la solución prueba para problemas con simetría:
20
V. Modelo de difusión no lineal acoplado al crecimiento
microbiano de Aspergillus Niger
El modelo que se presenta a continuación tiene por objetivo predecir el crecimiento
global de biomasa del micelio así como los perfiles de concentración en el sustrato
sólido con el fin de contrastar los resultados contra las mediciones experimentales de
biomasa.
Figura V.1 Diagrama del crecimiento global de biomasa sobre una placa sólida de agar.
En la Figura V.1 se muestra el crecimiento de biomasa sobre un medio sólido a partir de
la difusión de glucosa a través de este, la cual, al llegar a la interfase con el
microorganismo pasa a través de su pared celular para ser asimilada como fuente de
carbono.
Para el desarrollo del modelo matemático que describe la difusión de la glucosa a través
del medio sólido de agar acoplada al crecimiento del microorganismo se realizan las
siguientes consideraciones:
1.- Sistema isotérmico.
2.- La difusión de la glucosa en el sustrato sólido obedece a la ley de Fick.
3.- Coeficiente de difusividad efectiva dependiente de la concentración de glucosa en el
medio sólido, de la siguiente forma
21
4.- Tasa de crecimiento no lineal del microorganismo dependiente de la concentración
de glucosa en la interface con el medio sólido.
5.- Se desprecia la componente radial de la difusión de la glucosa en el agar.
6.- Se considera que el consumo de glucosa se debe solamente al crecimiento de
biomasa.
Partiendo de un balance de materia para la glucosa dentro de la caja de Petri se obtiene
la siguiente ecuación diferencial parcial (segunda ley de Fick)
Se considera que inicialmente la concentración de glucosa es homogénea en toda la
placa de agar por lo tanto
En
El material de la caja de Petri es impermeable al flujo de glucosa por lo que en la
frontera inferior del sistema (fondo de la caja) se considera que
La cantidad de glucosa que fluye a través de la interfase agar-microorganismo es igual a
la que es demandada por el microorganismo para su crecimiento. Para la cinética de
crecimiento se propone una funcionalidad de tipo Monod, dependiente de la
concentración de glucosa en la interfase y de la cantidad de biomasa a cada instante en
forma no lineal.
Debido a que la difusividad nos es constante en este modelo, desarrollando la ecuación
[V.1] se tiene
22
Donde
Sustituyendo en
Para adimensionar el modelo se proponen las siguientes variables definidas a partir de
parámetros de referencia
Sustituyendo en se obtiene
Reordenando y sustituyendo se tiene
En
23
Que tras un arreglo se convierte en
Donde
y
Como se indicó arriba la tasa de crecimiento de la biomasa está dada por:
Adimensionando se tiene:
Donde
En resumen, el modelo obtenido se expresa mediante el siguiente sistema de ecuaciones
diferenciales
24
Con las siguientes condiciones iniciales y de frontera
@
25
VI. Solución numérica
Para llevar a cabo la solución numérica del modelo se recurrió al método de
colocación ortogonal, lo cual simplifica el problema discretizando el dominio de
solución de la EDP [V.6b] a una serie de puntos internos de colocación. Mediante este
método es posible expresar a las derivadas espaciales que intervienen en el modelo
como una suma algebraica dependiente de cada uno los puntos de colocación.
Las matrices de coeficientes y se obtuvieron mediante polinomios desplazados
de Legendre con . El método se aplicó utilizando 7 puntos de colocación
internos (N=7). Por lo tanto el sistema de ecuaciones diferenciales a resolver se expresa
de la siguiente manera:
Con i=1,…., N+1.
Condiciones iniciales y de frontera
En
26
Los subíndices 1 y N+2 indican las fronteras inferior y superior del sistema,
respectivamente.
Con la aplicación del método de colocación ortogonal la ecuación diferencial parcial
para la concentración queda expresada como una ecuación diferencial ordinaria, por lo
que se procedió a integrar las ecuaciones [VI.6a] y [VI.6b] de manera simultánea
mediante el método de Runge-Kutta de cuarto orden. Para esto se utilizó un tamaño de
paso de tiempo de 1/1000 horas para simulaciones de 100 horas de crecimiento para la
biomasa.
Para cada paso de tiempo fueron resueltas las ecuaciones algebraicas [VI.7b] y [VI.7c]
mediante el método de Newton-Raphson, lo cual entrega el valor de las condiciones de
frontera a cada tiempo y completa el perfil espacial de concentración y la cantidad de
biomasa a cada paso. Los valores utilizados para las constantes involucradas en el
modelo fueron obtenidos a partir de datos experimentales (Reyes Ocampo, 2006) y se
enlistan en la tabla VI.1.
Tabla VI.1 Valores de las constantes usadas en la solución numérica del modelo de
crecimiento global de biomasa.
Constante Valor Unidades
0.5 g/cm3
0.05 - 0.25 g/cm3
0.0025 g/cm3
27
0.0054 cm2/h
0.04 g/cm2
0.25 g/cm2
0.1 1/h
0.6 cm
28
VII. Discusión de resultados
En esta sección se muestran los resultados experimentales del crecimiento global
de biomasa obtenidos por los métodos descritos en el capítulo III y, también, los que
fueron obtenidos mediante el modelo matemático propuesto. Así mismo, se establece
una comparación entre ambos conjuntos de datos con el objetivo de evaluar el
desempeño del modelo construido y la selección de valores para las constantes
experimentales que intervienen en el.
VII.1 Resultados experimentales
Para el desarrollo de los experimentos se emplearon concentraciones de glucosa de
50, 100, 150, 200 y 250 g/L en los medios de agar y se monitoreó el crecimiento de la
biomasa hasta por 120 horas.
La figura VII.1 muestra la evolución del crecimiento global de biomasa con respecto al
tiempo para las distintas concentraciones iniciales de biomasa. En todos los casos se
muestra un comportamiento similar, teniendo al comienzo una fase de adaptación del
microorganismo al medio que se prolonga hasta alrededor de las 20 horas para,
posteriormente iniciar una fase de crecimiento exponencial cuya duración muestra
marcada relación con la concentración inicial de glucosa. Finalmente se tiene una fase
asintótica de crecimiento de biomasa para todos los casos que se prolonga hasta el final
del experimento.
29
Figura VII.1 Dinámica experimental del crecimiento global de biomasa a distintas
concentraciones iniciales de glucosa.
En la misma figura puede apreciarse también una aparente inhibición del crecimiento
cuando la concentración inicial sobrepasa los 200 g/L de glucosa lo cual es probable
que se deba a cuestiones metabólicas del microorganismo más que al proceso
difusivo en sí.
VII.2 Resultados obtenidos mediante simulaciones
Las simulaciones del modelo, implementadas en el lenguaje de programación
FORTRAN 90, se realizaron para concentraciones iniciales de glucosa de 50, 100,
200 y 250 g/L para tiempos de simulación de 100 horas. En la figura VII.2 se
muestran los resultados obtenidos mediante dichas simulaciones.
Figura VII.2 Dinámica de crecimiento global de biomasa para distintas
concentraciones iniciales de glucosa obtenidas mediante simulación con n=m=2.
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.1
0.12
0.14
0.16
0.18
0.2
0 20 40 60 80 100
X(g
/cm
2)
Tiempo (hrs.)
50 g/L
100 g/L
200 g/L
250 g/L
30
A primera vista se observa que la forma de la dinámica de crecimiento es distinta a la
que se obtuvo de forma experimental. La fase de adaptación del microorganismo al
medio no está presente en estas curvas, lo cual es congruente con las consideraciones
hechas en el Capítulo V. La dinámica simulada comienza con una fase exponencial
de crecimiento de muy corta duración, la cual solo es apreciable a simple vista para
las concentraciones iniciales más altas. Salta también a la vista que en este caso no se
observa la condición de inhibición de crecimiento para altas concentraciones
iniciales de glucosa ya que esto no fue tomado en cuenta en el desarrollo del modelo.
La fase asintótica de crecimiento es evidente en todas las curvas de la Figura VII.2 y
los valores finales de biomasa obtenidos tras 100 horas de simulación concuerdan en
orden de magnitud con aquellos alcanzados en tiempo real de forma experimental
por el microorganismo. No obstante, se observa que la cantidad de biomasa
correspondiente a las 100 horas de experimentación alcanza valores de alrededor del
200% de aquellos obtenidos en la simulación para todas las concentraciones
iniciales.
Mediante una elección minuciosa de los valores para las constantes experimentales
involucradas para cada caso específico, el modelo propuesto podría llegar a brindar
resultados finales más cercanos a los valores experimentales. Sin embargo, para
realizar predicciones más certeras a lo largo de toda la dinámica de crecimiento sería
necesario realizar consideraciones que tomen en cuenta al metabolismo del
microorganismo.
La figura VII.3 muestra la comparación de la dinámica de crecimiento global de
biomasa para distintas combinaciones en los exponentes para el crecimiento
microbiano (m) y la difusión de glucosa en el medio (n). Las variaciones observadas
son de orden despreciable para valores entre 1 y 3. Por lo tanto es posible afirmar que
la forma de la dinámica de crecimiento es independiente de la elección de dichos
exponentes.
31
Figura VII.3 Dinámica de crecimiento global de biomasa a distintas combinaciones
de exponente con Cg, 0=100 g/L.
El modelo desarrollado acopla el proceso difusivo al crecimiento microbiano por lo
que brinda la oportunidad de estimar los perfiles de concentración de glucosa en el
medio de agar. Los perfiles de concentración obtenidos, mostrados en la Figura
VII.4 pueden ser de gran valor debido a que sería muy difícil obtenerlos mediante un
proceso experimental y, al refinar el modelo de crecimiento microbiano, podrían
brindar información valiosa con respecto a la modificación del gradiente de
concentración de glucosa en el medio con respecto al tiempo debido a la interacción
con el hongo.
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0.1
0 20 40 60 80 100
X(g
/cm
2)
Tiempo (hrs.)
N=1, M=1
N=2, M=2
N=3, M=2
N=3, m=3
32
Figura VII.4 Perfiles de concentración de glucosa en el medio de agar a distintos
tiempos con n=m=2.
No obstante, es posible medir concentraciones de glucosa promedio en todo el medio
de agar a distintos tiempos, para lo cual sería necesario iniciar experimentos
simultáneos bajo las mismas condiciones y, a cada tiempo de interés, desacoplar el
hongo de un medio de cultivo para poder obtener la cantidad de glucosa presente en
el agar. Esta información podría compararse con la dinámica de la concentración
promedio de glucosa en el medio que se muestra en la Figura VII.5 la cual fue
obtenida a partir de los perfiles de concentración en el tiempo y los pesos
correspondientes a cada punto de colocación proporcionados por el mismo método.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0.00E+00 2.00E-01 4.00E-01 6.00E-01 8.00E-01 1.00E+00
Y g
luco
sa
ξ
t=0
1 hora
2 horas
6 horas
12 horas
24 horas
48 horas
100 horas
33
Figura VII.5 Dinámica simulada de la concentración promedio de glucosa en el
medio de agar para distintas concentraciones iniciales.
La realización de la contrastación descrita en el párrafo anterior para experimentos
posteriores brindaría información de relevancia para la validación del acoplamiento entre
el fenómeno físico (difusión) y los fenómenos biológicos (crecimiento de
microorganismo) que ocurren durante el experimento y son tomados en cuenta por el
modelo desarrollado.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 20 40 60 80 100
Y P
rom
ed
io
Tiempo (hrs.)
50 g/L
100 g/L
250 g/L
200 g/L
34
Conclusiones
En el presente trabajo se construyó un modelo matemático que describe la
difusión de glucosa en un medio sólido de agar acoplado al crecimiento microbiano de
Aspergillus Niger en in la interfase medio de cultivo/organismo. Como resultado se
obtuvo un sistema de ecuaciones diferenciales no lineales cuyas condiciones de frontera
se encuentran descritas por un sistema de ecuaciones algebraicas no lineales.
La solución numérica del modelo se llevó a cabo mediante la discretización espacial del
dominio de solución a través del método de colocación ortogonal, con lo cual se
obtuvieron datos suficientes para ser contrastados con las mediciones experimentales
que se tenían del sistema en cuestión.
Si bien la comparación entre los datos experimentales y los arrojados por la solución
numérica no muestran una estrecha relación sí se encuentran dentro del mismo orden de
magnitud. El comportamiento de estos datos muestra una topología distinta. A partir de
esto pensamos que mediante una elección minuciosa de los valores para las constantes
experimentales involucradas para cada caso específico, el modelo propuesto podría
llegar a brindar resultados finales más cercanos a los valores experimentales. Sin
embargo, para realizar predicciones más certeras a lo largo de toda la dinámica de
crecimiento sería necesario realizar consideraciones que tomen en cuenta, de forma más
realista, al metabolismo y/o la morfología del microorganismo, sin embargo esto
presenta complicaciones experimentales que pueden llegar a ser infranqueables o por lo
menos rebasan el alcance del presente proyecto.
35
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