ESTUDIOS DE POBLACIONES Y SUBPOBLACIONES

LINFOCITARIAS POR CMF

Dra. Mónica Saracco

Instituto de Investigaciones

Biomédicas en Retrovirus y SIDA (ex CNRS)

Aplicaciones Clínicas•• AnalisisAnalisis de subpoblaciones Linfocitariasde subpoblaciones Linfocitarias

Inmunodeficiencias congénitasInmunodeficiencias Adquiridas (HIV,farmacológica)

•• OncohematologOncohematologííaa: Fenotipos de leucemias y linfomas, EMR.•• TransplantesTransplantes: Cross Match, reconstitución, inmunosupresión,•• RecuentoRecuento de de celulascelulas progenitorasprogenitoras•• AnAnáálisislisis de de CicloCiclo CelularCelular y ploidías en tumores.•• RecuentoRecuento de de reticulocitosreticulocitos.•• ActivacionesActivaciones plaquetariasplaquetarias..•• ApoptosisApoptosis•• Sorting: Sorting: Separaciónes célulares

Morfología y Citometría

LINFOCITOS TLINFOCITOS T LINFOCITOS BLINFOCITOS B

CCÉÉLULAS NKLULAS NK CITOQUINASCITOQUINAS

Ciclo de multiplicación

El virus utiliza la molécula CD4 para entrar a la célula.Inserta su información genética y utiliza la maquinaria genética celular para multiplicarse y diseminar a otras células. LAS CÉLULAS SUSCEPTIBLES PERTENECEN AL SISTEMA INMUNOLÓGICO

Desrregulación Inmune

• Alteraciones funcionales de célulasCD4

• Cambios en el Inmunofenotipo de células HIV infectadas.

• Disminución progresiva de Linfocitos T CD4+

Pruebas de laboratorioDiagnóstico: Detección de anticuerposELISA Y WESTERN BLOT (WB)Cuando un ELISA es positivo debe confirmarse por WB

2 A 6 SEMANAS

Anticuerpos

CD4

Virus

Paciente HIV positivo:• Carga viral en sangre • Recuento de linfocitos TCD4(ambos sirven para decisiones terapéuticas)

• Estudios de resistencia al tratamiento

Pruebas de laboratorio

CD4

Virus

Requerimientos en Laboratorios

• Bioseguridad para el procesamiento de muestras• Contador hematológico• Citómetro de flujo• Equipos para lisis automática (no indispensable)

FACS Count

PIMA

FACSCanto II

FACSCalibur

BD FACSAriaTM Cell Sorter : Nuevo Concepto

Recolección de las Muestras

• Tubos Vacutainer, con K3EDTA, 5ml de sangre

• Temperatura Ambiente• Procesamiento dentro de las 48hs de la

extracción• Marcación 50 ul de sangre con 5ul MoAb,

incubación 15 minutos• Lisado de Glóbulos Rojos

CONCEPTO DE CONCEPTO DE CUANTIFICACICUANTIFICACIÓÓNN

• Medición de células presentes en el organismo normalmente, cuyo valor relativo y/o absoluto tendrá suma importancia para la toma de decisiones diagnósticas y/o terapéuticas

Metodologías • Plataforma Única• Puede utilizar uno o dos

tubos de marcación• Gate en Linfocitos o

CD45 vs. SSC• Utiliza Beads (10000)

permite realizar el cálculo matemático de valor absoluto

• Plataforma Doble• Puede utilizar uno o dos

tubos de marcación• Gate en Linfocitos o

CD45 vs. SSC• Siempre debe realizarse

el Hemograma para poder informar los valores absolutos

Subpoblaciones Linfocitarias CMF

• Selección de eventos

R1

LINFOCITOS T (CD3+) vs. LINFOCITOS B (CD19+)

LINFOCITOS T (CD3+) vs. CELULAS NK

Análisis de 3 colores

R1

Density Dot Plot Contour Plot

Los colores informan la Identificación de las frecuencia de los eventos poblaciones mediante

líneas de contorno

Recomendaciones de la CDC

• Plataforma Única• Doble Plataforma con gate en CD45• Repetición de por lo menos un MoAb• Controles Internos de Calidad• Controles Externos de Calidad• Coherencia interna de los resultados

Porcentaje y Variabilidad en los Resultados

• Gate de Linfocitos Recuperación 95%, Pureza >90% (mínima 85%)

• La suma de CD3/CD4 y CD3/CD8 variabilidad +/- 5% máximo <10%

• Las muestras con aumento de Linfocitos (Τγδ) presentan la mayor variabilidad

• La sumatoria de poblaciones B, T, NK deberá estar entre el 95%-105% (mínimo 90%-110%)

OBTENCIÓN DE BUENOS RESULTADOS

• CD3 menor de 50%

• CD3/CD4 + CD3/CD8menor o mayor a valores de CD3

• Evaluar estado de la muestra

• Evaluar metodología de marcación y de lisis

• Evaluar presencia de dobles positivas o dobles negativas

• Continuar estudio con CD19/ CD56+/16+

VALORES DE REFERENCIA• VALORES EN ADULTOS

SEXO, EDAD• VALORES PEDIATRICOS desde

el nacimiento a los12 años

Control de Calidad I

• Empleo de ensayos validados y estandarizados para obtener resultados reproducibles intra e inter-ensayo

• Manuales de procedimientos (GLP): procedimientos escritos para uso universal en los distintos laboratorios integrantes de la Red

CONTROLES DE CALIDAD II

• INTERNOS• Flow-check CMF

• 4CL para Contador Hematológico

• Frecuencia: 3 veces por semana

• EXTERNOS• Q-ASI Program

(Canadiense)• NE-QAS (Reino Unido)• CAP (USA)• GRCF (Argentina-

Uruguay)• Frecuencia: 4 anuales

PLATAFORMA ÚNICA

• Menos Tubos

• Mayor objetividad en la medición

• Utilización de un solo equipo

• Encarece el estudio

• Menor reproducibilidad

DOBLE PLATAFORMA

• Requiere Hemograma

• Requiere CMF

• Controles para ambos equipos

• N° de Tubos depende del protocolo utilizado

• Mas Económico

• Mayor reproducibilidad

PROTOCOLOS DE ANÁLISIS

• Región MorfológicaFSC vs. SSC

• Región en base a MoAb (CD45) vs, SSC

• TRI-Test CD8/CD4/CD3

• CD3/CD4/CD45• CD3/CD8/CD45

• Multi-ChekCD3/CD8/CD45/CD4

COMPARACIÓN DE CMF Y SOFTWARE

420 (312-625)837 (650-1076)1327 (1058-1658)CLTT

182 (154-280)236 (164-330)413 (307-623)894 (677-1076)1367 (1080-1691)CL45

195 (143-302)229 (157-341)408 (315-601)883 (654-1122)1375 (1057-1724)BDDP

187 (148-299)234 (175-323)437 (298-670)898 (662-1042)1361 (1038-1717)BDSP

CD56CD19CD8CD4CD3 CMFSOFT

TEST ESTADÍSTICO

• Los valores de correlación (Rho de Spearman) entre los distintos métodos para todos los tipos celulares oscilaron entre 0.902 y 0.987

Muchas Gracias